ES2280749T3 - FLOCULATION WITH BIVALENT SALT. - Google Patents
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Abstract
Description
Floculación con sal bivalente.Flocculation with bivalent salt.
La presente invención se refiere a un método simple y electivo para la floculación de una célula de Bacillus que produce un glicosaminoglucano de interés, tal como ácido hialurónico, de un caldo de fermentación.The present invention relates to a simple and elective method for flocculating a Bacillus cell that produces a glycosaminoglycan of interest, such as hyaluronic acid, from a fermentation broth.
El ácido hialurónico (AH) es un mucoide polisacárido de origen biológico, que está muy distribuido en la naturaleza. Por ejemplo, es sabido que el ácido hialurónico está presente en tejidos animales tales como el cordón umbilical, líquido sinovial, humor vítreo, cresta de gallo, y varios tejidos conjuntivos tales como la piel y el cartílago.Hyaluronic acid (AH) is a mucoid Polysaccharide of biological origin, which is widely distributed in the nature. For example, it is known that hyaluronic acid is present in animal tissues such as the umbilical cord, synovial fluid, vitreous humor, rooster crest, and various tissues conjunctives such as skin and cartilage.
El ácido hialurónico, con un peso molecular alto, es viscoso y capaz de mantener un estado gelatinoso, que actúa como un lubricante, impidiendo la invasión de bacterias y reteniendo agua.Hyaluronic acid, with a molecular weight high, it is viscous and capable of maintaining a jelly-like state, which acts as a lubricant, preventing the invasion of bacteria and holding water
Debido a las propiedades anteriormente mencionadas, el ácido hialurónico tiene usos técnicos y cosméticos, p. ej., el ácido hialurónico es capaz de conservar la tonicidad y la elasticidad de la piel. El uso farmacéutico del ácido hialurónico está muy descrito en la bibliografía, p. ej., como un ojo vítreo o como un medio de soporte en cirugía oftálmica o como un sustituto del líquido sinovial.Due to the properties above mentioned, hyaluronic acid has technical and cosmetic uses, p. e.g., hyaluronic acid is capable of preserving tonicity and The elasticity of the skin. The pharmaceutical use of acid Hyaluronic is very described in the bibliography, p. eg, as a vitreous eye or as a support medium in ophthalmic surgery or as a substitute for synovial fluid.
Gracias a su naturaleza altamente hidrofílica, el ácido hialurónico puede también ser usado en productos cosméticos tales como lociones y cremas.Thanks to its highly hydrophilic nature, hyaluronic acid can also be used in products Cosmetics such as lotions and creams.
El ácido hialurónico puede ser extraído y purificado de p. ej. cordones umbilicales, de crestas de gallo o de estreptococos de grupo A y C.Hyaluronic acid can be extracted and purified from p. ex. umbilical cords, rooster crests or group A and C streptococci.
El ácido hialurónico puede también ser producido por producción recombinante en una célula huésped tal como una célula bacteriana o una célula fúngica.Hyaluronic acid can also be produced. by recombinant production in a host cell such as a bacterial cell or a fungal cell.
Cuando el ácido hialurónico es producido por la fermentación de un microorganismo, la masa celular es retirada de forma convencional por filtración o centrifugado a una dilución elevada. La floculación permite una retirada celular más eficaz y también el uso de una gama más amplia de técnicas de retirada celular (p. ej. filtración de tambor, filtración frontal ("dead end"), centrifugado etc). No obstante, los productos químicos de floculación pueden afectar de forma inversa al producto o impedir estrategias de procesamiento de flujo descendente.When hyaluronic acid is produced by the fermentation of a microorganism, the cell mass is removed from conventional form by filtration or centrifugation at a dilution high. Flocculation allows more efficient cell withdrawal and also the use of a wider range of withdrawal techniques cellular (eg drum filtration, frontal filtration ("dead end "), centrifuged etc). However, the chemical products of flocculation can adversely affect the product or prevent downstream processing strategies.
Hemos encontrado que es posible flocular una célula de Bacillus que produce un glicosaminoglucano de interés, de una manera muy eficaz: La adición de una sal bivalente ha demostrado que crea pequeños icebergs que pueden ser fácilmente separados del caldo celular sin reducir el rendimiento del producto, o sin impedir operaciones de flujo descendente posteriores.We have found that it is possible to flocculate a Bacillus cell that produces a glycosaminoglycan of interest, in a very effective way: The addition of a bivalent salt has been shown to create small icebergs that can be easily separated from the cell broth without reducing the yield of the product, or without preventing subsequent downstream operations.
La presente invención proporciona un método para flocular una célula de Bacillus y/o para retirar los contaminantes de alto peso molecular de un caldo de fermentación, que comprende la adición de una sal bivalente al caldo de fermentación que comprende un glicosaminoglucano de interés tras lo cual la célula de Bacillus y/o los contaminantes de alto peso molecular son retirados, en el cual dicha célula de Bacillus produce el glicosaminoglucano de interés.The present invention provides a method for flocculating a Bacillus cell and / or for removing high molecular weight contaminants from a fermentation broth, which comprises adding a bivalent salt to the fermentation broth comprising a glycosaminoglycan of interest after which the Bacillus cell and / or high molecular weight contaminants are removed, in which said Bacillus cell produces the glycosaminoglycan of interest.
La presente invención proporciona un método para flocular una célula de Bacillus, que produce un glicosaminoglucano de interés, de un caldo de fermentación que comprende la adición de una sal bivalente al caldo de fermentación del cual se retirará más tarde la célula de Bacillus.The present invention provides a method for flocculate a Bacillus cell, which produces a glycosaminoglycan of interest, of a fermentation broth comprising the addition of a bivalent salt to the fermentation broth from which more will be removed late Bacillus cell.
Según la invención un glicosaminoglucano puede ser cualquier polímero de carbohidrato con un peso molecular de al menos 10.000 daltons; preferiblemente un peso molecular de al menos 20.000 daltons; más preferiblemente un peso molecular de al menos 30.000 daltons.According to the invention a glycosaminoglycan can be any carbohydrate polymer with a molecular weight of at minus 10,000 daltons; preferably a molecular weight of at least 20,000 daltons; more preferably a molecular weight of at least 30,000 daltons.
Los glicosaminoglicanos preferidos son el ácido hialurónico, chondroitin sulfato, heparina, sulfato de heparina, sulfato de dermatano, y sulfato de queratina. El ácido hialurónico está constituido mediante las unidades de alternación y repetición de ácido D-glucorónico y N-acetil-D-glucosamina, para formar una cadena lineal con un peso molecular de hasta 15.000.000 daltons.Preferred glycosaminoglycans are acid hyaluronic acid, chondroitin sulfate, heparin, heparin sulfate, dermatan sulfate, and keratin sulfate. Hyaluronic acid it is constituted by the alternation and repetition units of D-glucoronic acid and N-acetyl-D-glucosamine, to form a linear chain with a molecular weight of up to 15,000,000 daltons.
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Los glicosaminoglucanos preferidos según la invención son los glicosaminoglucanos con un peso molecular de 10.000 daltons a 15.000.000 daltons.Preferred glycosaminoglycans according to invention are glycosaminoglycans with a molecular weight of 10,000 Daltons to 15,000,000 Daltons.
Debe ser notado que el término "ácido hialurónico" en la presente solicitud y reivindicaciones puede significar indiferentemente ácido hialurónico en su forma acídica o en su forma de sal tal como por ejemplo hialuronato de sodio, hialuronato de potasio, hialuronato de magnesio, hialuronato de calcio, u otros.It should be noted that the term "acid hyaluronic "in the present application and claims may meaning indifferently hyaluronic acid in its acidic form or in its salt form such as for example sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, magnesium hyaluronate, hyaluronate calcium, or others.
El glicosaminoglucano puede ser obtenido a partir de cualquier caldo de fermentación. El glicosaminoglucano puede además ser producible por un método que comprenda el cultivo de una célula huésped.Glycosaminoglycan can be obtained at from any fermentation broth. Glycosaminoglycan it can also be producible by a method that includes cultivation of a host cell.
La célula huésped es una célula de Bacillus, p. ej., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliguefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, o Bacillus thuringiensis. En una forma de realización preferida, la célula huésped de Bacillus es una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus licheniformis, una célula de Bacillus stearothermophilus o una célula de Bacillus subtilis. Las células de Bacillus subtilis mutantes particularmente adaptadas para la expresión recombinante están descritas en WO 98/22898.The host cell is a Bacillus cell, e.g. g., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliguefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, or Bacillus thuringiensis. In a preferred embodiment, the Bacillus host cell is a Bacillus lentus cell, a Bacillus licheniformis cell, a Bacillus stearothermophilus cell or a Bacillus subtilis cell. Mutant Bacillus subtilis cells particularly adapted for recombinant expression are described in WO 98/22898.
La célula de Bacillus que produce el glicosaminoglucano de interés se cultiva en un medio nutritivo adecuado para la producción del glicosaminoglucano usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula de Bacillus puede ser cultivada por cultivo en frasco de agitación, fermentación a poca escala o a gran escala (incluyendo pero sin limitarse a, fermentaciones discontinuas (batch), alimentadas (fed-batch), o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y de carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles por proveedores comerciales b pueden ser preparados según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection).The Bacillus cell that produces the glycosaminoglycan of interest is grown in a nutrient medium suitable for the production of glycosaminoglycan using methods known in the art. For example, the Bacillus cell can be cultured by shaking jar culture, small-scale or large-scale fermentation (including but not limited to batch batch, fed-batch fermentation, or solid state) in laboratory or industrial fermenters. The culture is grown in a suitable nutrient medium comprising sources of nitrogen and carbon and inorganic salts, using methods known in the art. Suitable media are available by commercial suppliers b can be prepared according to published compositions (e.g., in catalogs of the American Type Culture Collection).
Los materiales sin glicosaminoglucano con el mismo rango de peso molecular o uno más elevado que el propio glicosaminoglucano de interés, tales como, pero no limitados a: levano, aditivos glutámicos, ácidos nucleicos, detrito celular y componentes etc.Materials without glycosaminoglycan with the same molecular weight range or one higher than one's own glycosaminoglycan of interest, such as, but not limited to: yeast, glutamic additives, nucleic acids, cell debris and components etc.
Usando el método según la invención es posible retirar contaminantes/impurezas de peso molecular elevado; es también posible retirar estas impurezas de las preparaciones sin células del glicosaminoglucano de interés.Using the method according to the invention it is possible remove contaminants / impurities of high molecular weight; is it is also possible to remove these impurities from the preparations without glycosaminoglycan cells of interest.
El método de la invención puede ser aplicado a un caldo de fermentación no tratado o a un caldo de fermentación que ha sido sometido primero, pero no limitado a, p. ej., una regulación del pH, una regulación de la temperatura, y/o una dilución del agua.The method of the invention can be applied to an untreated fermentation broth or a fermentation broth which has been submitted first, but not limited to, p. eg one pH regulation, a temperature regulation, and / or a water dilution
Según la invención se ha descubierto que la adición de una sal bivalente al caldo de fermentación resulta en una floculación con pequeños flóculos que pueden ser fácilmente separados del caldo celular.According to the invention it has been discovered that the adding a bivalent salt to the fermentation broth results in a flocculation with small flocs that can be easily separated from the cell broth.
La evaluación de los tamaños de los flóculos se hace normalmente mediante la comparación de los flóculos observados con una fotografía de varios tamaños de flóculos.The assessment of floc sizes is normally done by comparing the observed flocs with a photograph of various sizes of flocs.
Frecuentemente será una ventaja diluir el caldo de fermentación con agua antes, simultáneamente o después de la adición de la sal bivalente. Dependiendo del rendimiento del glicosaminoglucano y de la viscosidad deseada una dilución con el 100-500% (p/p) de agua del caldo de fermentación será apropiada; preferiblemente una dilución con el 100-400% (p/p) de agua del caldo de fermentación.It will often be an advantage to dilute the broth of fermentation with water before, simultaneously or after addition of bivalent salt. Depending on the performance of the glycosaminoglycan and of the desired viscosity a dilution with the 100-500% (w / w) of fermentation broth water will be appropriate; preferably a dilution with the 100-400% (w / w) of broth water fermentation.
Frecuentemente será ventajoso calentar el caldo
de fermentación antes, simultáneamente o después de la adición de
la sal bivalente, o calentar el caldo de fermentación antes,
simultáneamente o después de la dilución dependiendo del
rendimiento del glucosaminoglucano de interés y de la viscosidad
deseada. El caldo de fermentación es preferiblemente calentado a
una temperatura alrededor de los 10°C, en particular a una
temperatura entre 30°C y
60°C.It will often be advantageous to heat the fermentation broth before, simultaneously or after the addition of the bivalent salt, or to heat the fermentation broth before, simultaneously or after dilution depending on the yield of the glycosaminoglycan of interest and the desired viscosity. The fermentation broth is preferably heated to a temperature around 10 ° C, in particular at a temperature between 30 ° C and
60 ° C
Frecuentemente será ventajoso ajustar el pH del caldo de fermentación antes, simultáneamente o después de la adición de la sal bivalente y o la dilución. Preferiblemente el caldo de fermentación es ajustado a un pH entre 6.5 y 14, en particular a un pH entre 7.5 y 8.5.It will often be advantageous to adjust the pH of the fermentation broth before, simultaneously or after addition of the bivalent salt and or the dilution. Preferably the fermentation broth is adjusted to a pH between 6.5 and 14, in particular at a pH between 7.5 and 8.5.
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Según la invención un agente floculante sorprendentemente bueno es una sal bivalente, en particular una sal de calcio y/o de magnesio. Una sal preferida bivalente es un fosfato, un sulfato o un cloruro, p. ej., cloruro de calcio. Una forma de realización preferida es una sal de calcio.According to the invention a flocculating agent surprisingly good is a bivalent salt, particularly a salt of calcium and / or magnesium. A preferred bivalent salt is a phosphate, a sulfate or a chloride, e.g. eg calcium chloride. A Preferred embodiment is a calcium salt.
La cantidad mínima de una sal bivalente que floculará es dependiente del microorganismo del caldo de fermentación, de los constituyentes del caldo de fermentación y del tipo y de la concentración de la propia sal. Debería asimismo observarse que la sobredosificación de la sal bivalente puede reducir el rendimiento. La sal bivalente debería ser añadida a al menos 0,1 g de sal bivalente por gramo de masa seca del microorganismo del caldo de, fermentación, preferiblemente la sal bivalente puede ser añadida en una gama de 0,5-25 g de sal bivalente por gramo de masa seca del microorganismo del caldo de fermentación, más preferiblemente la sal bivalente puede ser añadida en una gama de 0,5-15 g de sal bivalente por gramo de masa seca del microorganismo del caldo de fermentación, más preferiblemente la sal bivalente puede ser añadida en una gama de 0,5-8 g de sal bivalente por gramo de masa seca del microorganismo del caldo de fermentación, en particular la sal bivalente puede ser añadida en una gama de 0,5-3,5 g de sal bivalente por gramo de masa seca del microorganismo del caldo de fermentación.The minimum amount of a bivalent salt that flocculate is dependent on the microorganism of the broth of fermentation, of the constituents of the fermentation broth and of the type and concentration of the salt itself. Should also it should be noted that overdosing of the bivalent salt can reduce performance Bivalent salt should be added to minus 0.1 g of bivalent salt per gram of dry mass of broth microorganism, fermentation, preferably salt Bivalent can be added in a range of 0.5-25 g of bivalent salt per gram of dry mass of the microorganism of the fermentation broth, more preferably the bivalent salt can be added in a range of 0.5-15 g of salt bivalent per gram of dry mass of the microorganism of the broth of fermentation, more preferably the bivalent salt can be added in a range of 0.5-8 g of bivalent salt per gram of dry mass of the fermentation broth microorganism, in particular bivalent salt can be added in a range of 0.5-3.5 g of bivalent salt per gram of dry mass of the fermentation broth microorganism.
La dosificación de la sal bivalente se hace normalmente bien directa o en un tanque de mezcla o por cualquier otro método conocido en la técnica.Dosing of bivalent salt is done normally either directly or in a mixing tank or by any Another method known in the art.
Puede ser ventajoso, además de la sal bivalente, añadir uno o más agentes floculantes tales como un aluminato, p. ej., NaAlO2, o un polímero catiónico o uno aniónico.It can be advantageous, in addition to the bivalent salt, add one or more flocculating agents such as an aluminate, e.g. eg, NaAlO2, or a cationic or an anionic polymer.
Después de la adición de la sal bivalente, y opcionalmente los demás agentes floculantes, los microorganismos son retirados por métodos conocidos en la técnica tales como, pero no limitados a, filtración, p. ej. filtración del tambor, filtración de la membrana, filtración frontal de filtro prensa, filtración de flujo transversal, o centrifugado.After the addition of the bivalent salt, and optionally other flocculating agents, microorganisms are removed by methods known in the art such as, but not limited to, filtration, p. ex. drum filtration, membrane filtration, front filter press filter, cross flow filtration, or centrifugation.
El glicosaminoglucano resultante puede ser aislado adicionalmente por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el glicosaminoglucano puede ser recuperado por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitados a, posterior filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, precipitación o cristalización. El glicosaminoglucano aislado puede luego ser adicionalmente purificado y/o modificado por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, cromatografía (p. ej., intercambio fónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque, y exclusión por tamaños), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación del sulfato amónico), o extracción.The resulting glycosaminoglycan can be further isolated by methods known in the art. By example, glycosaminoglycan can be recovered by conventional procedures including, but not limited to, subsequent filtration, extraction, spray drying, evaporation, precipitation or crystallization. Glycosaminoglycan isolated can then be further purified and / or modified by a variety of procedures known in the art including, but not limited to, chromatography (e.g., exchange phonic, affinity, hydrophobic, chromato focus, and exclusion by sizes), electrophoretic procedures (e.g., preparatory isoelectric focusing), differential solubility (e.g., precipitation of ammonium sulfate), or extraction.
La invención está posteriormente ilustrada con los ejemplos siguientes que no están destinados a ser de ninguna manera limitadores del objetivo de la invención como se reivindica.The invention is subsequently illustrated with the following examples that are not intended to be of any limiting ways of the object of the invention as vindicate
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Ejemplo 1Example one
Fuente: GMM B. subtilis que contiene el casete de ácido hialurónico producido como se describe en la solicitud divisional estadounidense: US 60/342644. Source : GMM B. subtilis containing the hyaluronic acid cassette produced as described in the US divisional application: US 60/342644.
Usamos una escala de 1500 litro; un medio definido utilizando nitrógeno inorgánico como la fuente de nitrógeno única y la dosificación de sacarosa como la fuente de carbono.We use a 1500 liter scale; a medium defined using inorganic nitrogen as the source of Single nitrogen and sucrose dosage as the source of carbon.
La masa celular seca final en el caldo de fermentación fue de aproximadamente 15 a 20 gl^{-1} en una base de peso celular seco. (Difícil de evaluar con precisión debido a la alta viscosidad del caldo).The final dry cell mass in the broth of fermentation was about 15 to 20 gl -1 on a base of dry cell weight. (Hard to evaluate accurately due to high viscosity of the broth).
El ácido hialurónico en el caldo de fermentación fue aproximadamente 10 gl^{-1} con un peso molecular promedio de aproximadamente 1.400.000 Da. (Medido por ELISA y GPC-MALLS respectivamente).Hyaluronic acid in the fermentation broth it was approximately 10 gl -1 with an average molecular weight of approximately 1,400,000 Da. (Measured by ELISA and GPC-MALLS respectively).
Dilución: 200% (1 en 3) dilución con aguaDilution: 200% (1 in 3) dilution with water
Temperatura: 10°CTemperature: 10 ° C
pH 7.0pH 7.0
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Floculación: 2% peso de cloruro de calcio con respecto al caldo de cultivo, o aproximadamente 1,0 a 1,3 g de cloruro de calcio por g de células secas.Flocculation: 2% weight of calcium chloride with with respect to the culture broth, or approximately 1.0 to 1.3 g of calcium chloride per g of dry cells.
Las células floculadas fueron fácilmente retiradas del caldo contenedor de ácido hialurónico bajo las condiciones de funcionamiento del equipo normales y flujos con pérdida pequeña de rendimiento por uno o más de los siguientes métodos:Flocculated cells were easily removed from the hyaluronic acid container broth under the normal operating conditions of the equipment and flows with small loss of performance by one or more of the following methods:
- 1. \bullet a:1. To:
- Filtración frontal "nutch". Condiciones de funcionamiento normales.Front filtration "nutch". Conditions of normal operation
- 2. \bullet b:2.? B:
- Centrifugado a escala de laboratorio en tubos centrifugadores de 50 ml. Condiciones de funcionamiento normales.Laboratory scale centrifuge in tubes 50 ml centrifuges. Funcionament condition normal.
- 3. \bullet c:3. c:
- Filtración del tambor (área de 2,5 m^{2}). Condiciones de funcionamiento normales.Filtration of the drum (area of 2.5 m 2). Normal operating conditions.
- 4. \bullet d:4. \ d:
- Centrifugado a escala piloto. Condiciones de funcionamiento normales.Centrifuged at pilot scale. Conditions of normal operation
Evaluamos (a)-(d), y en cada caso obtuvimos un líquido marcadamente claro, de color pajizo que contenía la mayoría del ácido hialurónico en el caldo de fermentación original.We evaluated (a) - (d), and in each case we obtained a sharply clear, straw colored liquid that contained most of hyaluronic acid in the original fermentation broth.
La facilidad de separación sugeriría que la separación celular también también sería mejorada en otro equipo de separación celular (p. ej. filtro prensa, microfiltración, etc).The ease of separation would suggest that the cell separation would also be improved in other equipment of cell separation (eg filter press, microfiltration, etc).
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Ejemplo 2Example 2
Fuente: GMM B. subtilis que contiene el casete del ácido hialurónico producido como se describe en la solicitud divisional estadounidense: US 60/342644. Source : GMM B. subtilis containing the hyaluronic acid cassette produced as described in the US divisional application: US 60/342644.
Usamos una escala de 1500 litros; un medio definido utilizando nitrógeno inorgánico como la fuente de nitrógeno única y la dosificación de sacarosa como la fuente de carbono.We use a scale of 1500 liters; a medium defined using inorganic nitrogen as the source of Single nitrogen and sucrose dosage as the source of carbon.
La masa celular seca final en el caldo de fermentación fue de aproximadamente 10 a 15 gl^{-1} en una base de peso celular seco. (Difícil de evaluar con precisión debido a la alta viscosidad del caldo).The final dry cell mass in the broth of fermentation was about 10 to 15 gl -1 on a base of dry cell weight. (Hard to evaluate accurately due to high viscosity of the broth).
El ácido hialurónico en el caldo de fermentación fue aproximadamente 12 gl^{-1} con un peso molecular promedio de aproximadamente 1.000.000 Da. (Medido por ELISA y GPC-MALLS respectivamente).Hyaluronic acid in the fermentation broth it was approximately 12 gl -1 with an average molecular weight of approximately 1,000,000 Da. (Measured by ELISA and GPC-MALLS respectively).
Dilución: 300% (1 en 4) dilución con aguaDilution: 300% (1 in 4) dilution with water
Temperatura 35°CTemperature 35 ° C
Floculación: 2% peso de cloruro de calcio con respecto al caldo de cultivo o 1,3 a 2,0 g de cloruro de calcio por g de células secas.Flocculation: 2% weight of calcium chloride with with respect to the culture broth or 1.3 to 2.0 g of calcium chloride per g of dry cells.
pH 6.5pH 6.5
Las células floculadas fueron fácilmente retiradas del caldo contenedor de ácido hialurónico bajo unas condiciones de funcionamiento del equipo normales y flujos con pérdida pequeña de rendimiento por uno o más de los siguientes métodos:Flocculated cells were easily removed from the hyaluronic acid container broth under some normal operating conditions of the equipment and flows with small loss of performance by one or more of the following methods:
- 1. \bullet a:1. To:
- Filtración frontal "nutch". Condiciones de funcionamiento normales.Front filtration "nutch". Conditions of normal operation
- 2. \bullet b:2.? B:
- Centrifugado a escala de laboratorio en tubos centrifugadores de 50 ml. Condiciones de funcionamiento normales.Laboratory scale centrifuge in tubes 50 ml centrifuges. Funcionament condition normal.
- 3. \bullet c:3. c:
- Filtración del tambor (área de 2,5 m^{2}). Condiciones de funcionamiento normales.Filtration of the drum (area of 2.5 m 2). Normal operating conditions.
- 4. \bullet d:4. \ d:
- Centrifugado a escala piloto. Condiciones de funcionamiento normales.Centrifuged at pilot scale. Conditions of normal operation
Evaluamos (a)-(d), y en cada caso obtuvimos un líquido marcadamente claro, de color amarillo pajizo que contenía la mayoría del ácido hialurónico en el caldo de fermentación original.We evaluated (a) - (d), and in each case we obtained a sharply clear, straw-yellow liquid containing most hyaluronic acid in the fermentation broth original.
La facilidad de separación sugeriría que la separación celular también sería mejorada en otro equipo de separación de celular (p. ej. filtro prensa, microfiltration, etc).The ease of separation would suggest that the cell separation would also be improved in other equipment cell separation (eg filter press, microfiltration, etc).
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Ejemplo 3Example 3
Fuente: GMM B. subtilis que contiene el casete del ácido hialurónico producido como se describe en la solicitud divisional estadounidense: US 60/342644. Source : GMM B. subtilis containing the hyaluronic acid cassette produced as described in the US divisional application: US 60/342644.
Usamos una escala de 20 000 litros; un medio definido utilizando nitrógeno inorgánico como la fuente de nitrógeno única y la dosificación de sacarosa como la fuente de carbono.We use a scale of 20,000 liters; a medium defined using inorganic nitrogen as the source of Single nitrogen and sucrose dosage as the source of carbon.
La masa celular seca final en el caldo de fermentación fue de aproximadamente 8 a 10 gl^{-1} en una base de peso celular seco.The final dry cell mass in the broth of fermentation was approximately 8 to 10 gl -1 on a basis of dry cell weight
Ácido hialurónico en el caldo de fermentación fue aproximadamente 10 gl^{-1} con un peso molecular promedio de aproximadamente 1.000.000 Da. (Medido por ELISA y GPC-MALLS respectivamente).Hyaluronic acid in the fermentation broth it was approximately 10 gl -1 with an average molecular weight of approximately 1,000,000 Da. (Measured by ELISA and GPC-MALLS respectively).
Dilución: 400% (1 en 5) dilución con aguaDilution: 400% (1 in 5) dilution with water
Temperatura 45°C45 ° C temperature
pH 8.0pH 8.0
Floculación: 2% peso cloruro de calcio con respecto al caldo de cultivo o aproximadamente 2,0 a 2,5 g de cloruro de calcio por g de células secas.Flocculation: 2% weight calcium chloride with with respect to the culture broth or approximately 2.0 to 2.5 g of calcium chloride per g of dry cells.
Las células floculadas fueron fácilmente eliminadas del caldo contenedor de ácido hialurónico bajo condiciones de funcionamiento del equipo normales y flujos con pérdida pequeña de rendimiento por uno o más de los siguientes métodos:Flocculated cells were easily removed from the low hyaluronic acid container broth normal operating conditions of the equipment and flows with small loss of performance by one or more of the following methods:
- 1. \bullet a:1. To:
- Filtración frontal "nutch". Condiciones de funcionamiento normales.Front filtration "nutch". Conditions of normal operation
- 2. \bullet b:2. \ bullet b:
- Centrifugado a escala de laboratorio en tubos centrifugadores de 50 ml. Condiciones de funcionamiento normales.Laboratory scale centrifuged in 50 ml centrifuge tubes. Funcionament condition normal.
- 3. \bullet C:3. \ bullet C:
- Filtración del tambor (escala del proceso). Condiciones de funcionamiento normales.Drum filtration (scale of process). Normal operating conditions.
- 4. \bullet d:4. \ bullet d:
- Filtro prensa (escala piloto). Condiciones de funcionamiento normales.Press filter (pilot scale). Normal operating conditions.
Evaluamos (a)-(d), y en cada caso obtuvimos un líquido marcadamente claro de color pajizo que contenía la mayoría del ácido hialurónico en el caldo de fermentación original. Los contaminantes de peso molecular alto (como se evaluó por análisis de GPC antes y después del tratamiento así como por digestión enzimática) fueron exhaustivamente retirados.We evaluated (a) - (d), and in each case we obtained a sharply clear straw colored liquid that contained most of hyaluronic acid in the original fermentation broth. The high molecular weight contaminants (as assessed by analysis of CPG before and after treatment as well as digestion enzymatic) were thoroughly removed.
La facilidad de separación sugeriría que la separación celular también sería mejorada en otro equipo de separación celular (p. ej. microfiltration, etc). El funcionamiento a esta dilución y temperatura redujo la viscosidad de manera que los índices del flujo fueron superiores a los de los ejemplos 1 ó 2. Además, la depuración celular y otra depuración de contaminantes (medida por recuento de células y turbidez) fueron también mayores que en los ejemplos 1 ó 2.The ease of separation would suggest that the cell separation would also be improved in other equipment cell separation (eg microfiltration, etc). The performance at this dilution and temperature it reduced the viscosity so that flow rates were higher than those in examples 1 or 2. In addition, cell clearance and other pollutant clearance (measured by cell count and turbidity) were also higher than in examples 1 or 2.
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Ejemplo 4Example 4
Fuente: GMM B. subtilis que contiene el casete del ácido hialurónico producido como se describe en la solicitud divisional estadounidense: US 60/342644. Source : GMM B. subtilis containing the hyaluronic acid cassette produced as described in the US divisional application: US 60/342644.
Usamos una escala de 1500 litros; un medio definido utilizando nitrógeno inorgánico como la fuente de nitrógeno única y la dosificación de sacarosa como la fuente de carbono.We use a scale of 1500 liters; a medium defined using inorganic nitrogen as the source of Single nitrogen and sucrose dosage as the source of carbon.
La masa celular seca final en el caldo de fermentación fue de aproximadamente 8 a 10 gl^{-1} en una base de peso celular seco.The final dry cell mass in the broth of fermentation was approximately 8 to 10 gl -1 on a basis of dry cell weight
El ácido hialurónico en el caldo de fermentación fue de aproximadamente 10 gl^{-1} con un peso molecular promedio de aproximadamente 1.000.000 Da. (Medido por ELISA y GPC-MALLS respectivamente).Hyaluronic acid in the fermentation broth it was about 10 gl -1 with an average molecular weight of approximately 1,000,000 Da. (Measured by ELISA and GPC-MALLS respectively).
Dilución: 300% (1 en 4) dilución con aguaDilution: 300% (1 in 4) dilution with water
Temperatura 15 a 60°CTemperature 15 to 60 ° C
pH 5.0 a 10.0pH 5.0 to 10.0
Floculación: 2% peso de cloruro de calcio con respecto al caldo de cultivo o aproximadamente 2,0 a 2,5 g de cloruro de calcio por g de células secas.Flocculation: 2% weight of calcium chloride with with respect to the culture broth or approximately 2.0 to 2.5 g of calcium chloride per g of dry cells.
Las células floculadas fueron fácilmente eliminadas del caldo contenedor de ácido hialurónico bajo condiciones de funcionamiento del equipo normales y flujos con pérdida pequeña de rendimiento por una filtración frontal "nutch". Condiciones de funcionamiento normales. Un control sin cloruro de calcio no consiguió filtrar o clarificar el caldo de cultivo tratado.Flocculated cells were easily removed from the low hyaluronic acid container broth normal operating conditions of the equipment and flows with small loss of performance due to frontal filtration "nutch" Normal operating conditions. A control without calcium chloride failed to filter or clarify the broth of treated crop.
La investigación de los productos filtrados recogidos por GPC-MALLS, digestión enzimática y otros análisis revelaron que el grado de retirada del contaminante de alto peso molecular podría ser controlado por el pH con el grado máximo de retirada estando por debajo de pH 5.5 y a pH > 7.5; siendo pH 8 el valor preferido para el funcionamiento del proceso. El grado de retirada del contaminante de alto peso molecular resultó ser independiente de la temperatura o dilución.The investigation of filtered products collected by GPC-MALLS, enzymatic digestion and Other analyzes revealed that the degree of removal of the contaminant High molecular weight could be controlled by pH with the degree maximum withdrawal being below pH 5.5 and at pH> 7.5; pH 8 being the preferred value for the operation of the process. The degree of removal of the high molecular weight contaminant It turned out to be independent of temperature or dilution.
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