ES2276735T3 - Anticuerpos fv multimericos de cadena sencilla en tandem. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo Fv multimérico, en el que cada monómero del anticuerpo Fv comprende las siguientes características: (a) dos dominios variables próximos que forman una unidad scFv VH-VL o VL-VH de unión al antígeno; estos dos dominios variables primero y segundo se unen mediante un enlazador peptídico de al menos 12 restos de aminoácidos; y (b) otros dos dominios variables próximos que están unidos no covalentemente a dos dominios variables de otro monómero del anticuerpo Fv, dando lugar a la formación de dos sitios de unión al antígeno adicionales para formar el motivo de multimerización; estos dos dominios variables tercero y cuarto de cada monómero se unen mediante un enlazador peptídico que consiste en un máximo de 10 restos de aminoácidos.
Description
Anticuerpos Fv multiméricos de cadena sencilla
en tándem.
La presente invención se refiere a
construcciones de anticuerpos Fv multiméricos, a vectores de
expresión que codifican dichas construcciones de anticuerpos Fv y a
usos de diagnóstico así como terapéuticos de dichas construcciones
de anticuerpos Fv multiméricos.
Los anticuerpos naturales son en sí mismos
dímeros y, por tanto, bivalentes. Si dos células de hibridomas que
producen anticuerpos diferentes se fusionan artificialmente, algunos
de los anticuerpos producidos por el hibridoma híbrido están
compuestos por dos monómeros con especificidades diferentes. Estos
anticuerpos biespecíficos también pueden producirse mediante
conjugación química de dos anticuerpos. Los anticuerpos naturales y
sus derivados biespecíficos son relativamente grandes y caros de
producir. Los dominios constantes de anticuerpos de ratón también
son la causa principal de la respuesta inmune humana
anti-ratón (HAMA), que impiden su uso en gran
medida como agentes terapéuticos. También pueden ocasionar efectos
no deseados debido a su unión a receptores Fc. Por estas razones,
los inmunólogos moleculares se han concentrado en la producción en
microorganismos de los fragmentos Fab y Fv mucho más pequeños.
Estos fragmentos más pequeños no sólo son más fáciles de producir
también son menos inmunogénicos, no tienen funciones efectoras y,
debido a su tamaño relativamente pequeño, están mas capacitados
para penetrar en tejidos y tumores. En el caso de los fragmentos
Fab, los dominios constantes adyacentes a los dominios variables
juegan un papel principal en la estabilización de los dímeros de
cadena pesada y ligera.
El fragmento Fv es mucho menos estable y, por
tanto, puede introducirse un enlazador peptídico entre los dominios
variables de la cadena pesada y ligera para aumentar la estabilidad.
Esta construcción se conoce como fragmento Fv de cadena única
(scFv). Algunas veces se introduce un puente disulfuro entre los dos
dominios para conseguir una estabilidad adicional. Hasta ahora, se
han producido anticuerpos tetravalentes basados en scFv mediante la
fusión de dominios adicionales de polimerización, tales como el
monómero de estreptavidina que forma tetrameros y hélices alfa
anfipáticas. Sin embargo, estos dominios adicionales pueden aumentar
la inmunogenicidad de la molécula tetravalente.
Pueden construirse anticuerpos bivalentes y
biespecíficos usando sólo dominios variables de anticuerpo. Un
procedimiento bastante eficaz y relativamente sencillo es hacer la
secuencia enlazadora entre los dominios V_{H} y V_{L} tan
corta que éstos no puedan plegarse sobre si mismos ni unirse uno con
el otro. La reducción de la longitud del enlazador a
3-12 restos evita la configuración monomérica de la
molécula scFv y favorece el apareamiento intermolecular
V_{H}-V_{L} con la formación de un dímero
"dianticuerpo" scFV no covalente de 60 kDa (Holliger y col.,
1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90,
6444-6448). El formato de dianticuerpo también
puede usarse para la generación de anticuerpos biespecíficos
recombinantes, que se obtienen mediante la asociación no covalente
de dos productos de fusión de cadena única, compuestos por el
dominio V_{H} de un anticuerpo conectado mediante un enlazador
corto al dominio V_{L} de otro anticuerpo. Si se reduce la
longitud del enlazador más todavía, por debajo de tres restos puede
dar lugar a la formación de trímeros ("trianticuerpo", \sim
90 kDa) o a tetrámeros ("tetranticuerpo", \sim 120 kDa) (Le
Gall y col., 1999, FEBS Letters 453, 164-168). Sin
embargo, el pequeño tamaño de los dianticuerpos biespecíficos
(50-60 kDa) lleva a su rápido aclaramiento del
torrente circulatorio a través de los riñones, lo que requiere, por
tanto, la aplicación de dosis relativamente altas para terapia.
Además, los dianticuerpos biespecíficos sólo tienen un dominio de
unión para cada especificidad. Sin embargo, la unión bivalente es un
medio importante para incrementar la afinidad funcional y la
posibilidad de la selectividad para tipos de células específicas que
llevan antígenos densamente agrupados.
Kipriyanov y col. (J. Mol. Biol., vol. 293,
páginas 41-56) describen un anticuerpo Fv
multimérico compuesto de cuatro dominios variables. Los cuatro
dominios se unen mediante tres enlazadores. Los enlazadores son
cortos (12 restos de aminoácidos), lo que lleva a una formación de
dianticuerpos en tándem (todos los sitios de unión al antígeno
están formados por los respectivos dominios V_{L} o V_{H} de dos
cadenas diferentes con cuatro dominios cada uno) o el enlazador
central es "largo" (27 restos de aminoácidos'') y los otros dos
enlazadores son "cortos" (12 restos de aminoácidos), lo que
lleva a la formación de un dianticuerpo de cadena sencilla (todos
los antígenos están formados por los respectivos dominios V_{L} y
V_{H} de la misma cadena). Igualmente se describe también en el
documento WO 99/57510. En el documento DE 198 16 141 se describe una
construcción similar que tiene un enlazador "largo" central y
2 enlazadores "cortos" externos. Una construcción de cadena
única en tándem compuesta por los cuatro dominios variables todos
unidos por un único aminoácido se describe en el documento DE 199
30 433. Por otro lado, en el documento US 6 025 165 describe un
anticuerpo de cadena única que consiste en cuatro dominios
variables unidos por un enlazador central que tiene un único
aminoácido y dos enlazadores externas que tiene 14 aminoácidos,
mientras que se forman en la misma cadena dos sitios de unión al
antígeno.
De este modo, el problema técnico que subyace a
la presente invención es proporcionar nuevos anticuerpos
multiméricos que superen las desventajas de los anticuerpos Fv de
la técnica anterior y proporcionar una manera general para formar
una molécula Fv multimérica con al menos cuatro dominios de unión,
que sea monoespecífica o multiespecífica.
La solución a dicho problema técnico se logra
proporcionando las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones.
La presente invención se basa en la observación
de que los dímeros, trímeros y tetrámeros de scFv pueden usarse
como motivos de multimerización para la construcción de moléculas Fv
multiméricas y que, para la producción de las moléculas Fv
multiméricos, el enlazador peptídico introducido entre los dominios
variables primero y segundo de un monómero y los dominios segundo y
tercero de un monómero deberá ser suficientemente largo para
permitir que la molécula se pliegue sobre sí misma, es decir, el
enlazador peptídico tendrá una longitud de al menos 12 aminoácidos,
preferiblemente de al menos 15 aminoácidos. De este modo, la
presente invención proporciona una manera general para formar una
molécula Fv multimérica con al menos cuatro dominios de unión que
sea monoespecífica o multiespecífica. Cada monómero de la molécula
Fv de la presente invención se caracteriza por una unidad
V_{H}/V_{L} de unión al antígeno y dos dominios variables de
anticuerpo que forman unidades V_{H}/V_{L} de unión al antígeno
tras la unión no covalente a los dominios variables de otros
monómeros (motivo de multimerización). Se forman dímeros, trímeros
o tetrámeros dependiendo de los dominios variables y de la longitud
de los enlazadores peptídicos entre los dominios variables que
comprenden los motivos de multimerización (véanse las Figuras 1, 2
y
3).
3).
Se espera que los anticuerpos Fv multiméricos de
la presente invención sean muy estables y tengan una mayor
capacidad de unión. También deberán ser especialmente útiles para
fines terapéuticos, puesto que los dianticuerpos diméricos usados
hasta el momento son pequeños y probablemente se eliminan fácilmente
del torrente circulatorio a través de los riñones. Además, el
formato de cadena única de los anticuerpos Fv multiméricos de la
presente invención permite que éstos se produzcan en organismos
eucariotas y no sólo en bacterias.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
un anticuerpo Fv multimérico, caracterizado por las siguientes
características:
(a) dos dominios variables próximos que forman
una unidad scFv V_{H}-V_{L} o
V_{L}-V_{H} de unión al antígeno; estos dos
dominios variables están unidos mediante un enlazador peptídico de
al menos 12 restos de aminoácidos; y
(b) otros dos dominios variables próximos que
están unidos no covalentemente a dos dominios variables de otro
monómero del anticuerpo Fv dando lugar a la formación de dos sitios
de unión a antígenos adicionales para formar el motivo de
multimerización; estos dos dominios variables de cada monómero se
unen mediante un enlazador peptídico compuesto de un máximo de 10
restos de aminoácidos.
Una característica adicional preferida es que la
unidad scFv V_{H}-V_{L} o
V_{L}-V_{H} de unión al antígeno formada por
los dos dominios próximos de un monómero se unen a los otros
dominios variables del motivo de multimerización mediante un
enlazador peptídico de al menos 15 restos de aminoácidos,
preferiblemente de al menos 20 restos de aminoácidos.
La expresión "anticuerpo Fv" se refiere a
un anticuerpo que contiene los dominios variables pero no los
dominios constantes.
La expresión "enlazador peptídico" se
refiere a cualquier péptido capaz de conectar dos dominios variables
con una longitud que depende de los tipos de dominios variables que
se van a conectar. El enlazador peptídico puede contener cualquier
resto de aminoácido, prefiriéndose los restos de aminoácidos
glicina, serina y prolina para el enlazador peptídico que une los
dominios variables segundo y tercero.
Un anticuerpo Fv multimérico de la presente
invención puede prepararse según procedimientos convencionales.
Preferiblemente, dicho anticuerpo Fv se prepara ligando secuencias
de ADN que codifican los enlazadores peptídicos con las secuencias
de ADN que codifican los dominios variables, de modo que los
enlazadores peptídicos conectan los dominios variables dando lugar
a la formación de una secuencia de ADN que codifica un monómero del
anticuerpo Fv multimérico y expresando las secuencias de ADN que
codifican los diversos monómeros en un sistema de expresión
adecuado como se describe a continuación en los Ejemplos.
Los anticuerpos Fv de la presente invención
pueden modificarse adicionalmente usando técnicas convencionales
conocidas en la materia, por ejemplo, usando deleciones,
inserciones, sustituciones, adiciones y/o recombinaciones y/o
cualesquiera otras modificaciones conocidas en la técnica, solas o
combinadas. Los procedimientos para introducir estas modificaciones
en la secuencia del ADN subyacente a la secuencia de aminoácidos de
un dominio variable o de un enlazador peptídico son bien conocidos
para los expertos en la materia, véase, por ejemplo, Sambrook,
Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
(1989) N.Y.
Los anticuerpos Fv de la presente invención
pueden comprender al menos un dominio proteico adicional, estando
unido dicho dominio proteico mediante enlaces covalentes o no
covalentes. La unión puede basarse en la fusión genética según los
procedimientos conocidos en la técnica y descritos anteriormente, o
puede realizarse, por ejemplo, mediante entrecruzamiento químico
como se describe, por ejemplo, en el documento WO 94/04686. El
dominio adicional presente en la proteína de fusión que comprende el
anticuerpo Fv empleado según la invención preferiblemente puede
estar unido mediante un enlazador flexible, de forma ventajosa a un
enlazador peptídico, en el que dicho enlazador peptídico comprende
aminoácidos unidos en un péptido plural e hidrófilo de longitud
suficiente para abarcar la distancia entre el extremo
C-terminal de dicho dominio proteico adicional y el
extremo N-terminal del anticuerpo Fv o viceversa. La
proteína de fusión descrita anteriormente puede comprender además
un enlazador susceptible de escisión o un sitio de escisión para
proteinasas. La proteína de fusión también puede comprender una
etiqueta, como una etiqueta de histidina, por ejemplo
(His)_{6}.
En una realización preferida de la presente
invención, los monómeros del anticuerpo Fv multimérico comprende
cuatro dominios variables y los dominios variables tercero y cuarto
de los monómeros están unidos mediante un enlazador peptídico de 10
restos de aminoácidos o menos, preferiblemente menos de cinco restos
de aminoácidos. Incluso en una realización más preferida, los
dominios tercero y cuarto están unidos directamente sin que
intervengan restos de aminoácidos.
En otra realización preferida del anticuerpo Fv
multimérico de la presente invención, los dominios variables
segundo y tercero de los monómeros del anticuerpo están unidos
mediante un enlazador peptídico de al menos 12 restos de
aminoácidos, preferiblemente de al menos 15 restos de aminoácidos.
Preferiblemente, el número máximo de restos de aminoácidos es 30.
En una realización incluso más preferida, dicho enlazador peptídico
tiene la secuencia de aminoácidos (Gly_{4}Ser)_{4}.
En otra realización preferida del anticuerpo Fv
multimérico de la presente invención, los dominios variables
tercero y/o cuarto son más cortos en al menos un resto de aminoácido
en sus extremos N y/o C-terminales. En algunas
circunstancias, como se describe en la solicitud de patente alemana
100 63 048.0, esta forma truncada aporta una mejor estabilidad de
la molécula.
En una realización especialmente preferida del
anticuerpo Fv multimérico de la presente invención, el orden de los
dominios de un monómero es V_{H}-V_{L}.
En algunos casos podría ser deseable potenciar
la asociación de dos dominios variables. Por lo tanto, en una
realización preferida adicional del anticuerpo Fv multimérico de la
presente invención, la unión de al menos un par de dominios
variables se potencia al menos mediante un puente disulfuro
intermolecular. Por lo tanto, esto puede lograrse modificando las
secuencias de ADN que codifican los dominios variables, por ejemplo,
introduciendo codones de cisteína. Los dos sitios más prometedores
para introducir enlaces disulfuro parecen ser
V_{H}44-V_{L}100 que conecta la región
estructural 2 de la cadena pesada con la región estructural 4 de la
cadena ligera y V_{H}105-V_{L}43 que une la
región estructural 4 de la cadena pesada con la región estructural 2
de la cadena ligera.
En una realización preferida adicional de la
presente invención, el anticuerpo Fv multimérico es un dímetro
tetravalente, trímero hexavalente o tetrámero octavalente. La
formación de estas formas esta determinada preferiblemente por
dominios V_{H} y V_{L} particulares que comprenden el motivo de
multimerización y por la longitud del enlazador.
En otra realización preferida de la presente
invención, el anticuerpo Fv multimérico es un anticuerpo
biespecífico, triespecífico o tetraespecífico.
La multimerización de las subunidades
monoméricas puede facilitarse mediante la presencia de un motivo de
dimerización en el extremo C-terminal del cuarto
dominio variable que, preferiblemente es un (poli)péptido
unido directamente a través de un enlace peptídico. Los expertos en
la materia conocen ejemplos de estos motivos que incluyen
estreptavidina y hélices alfa anfipáticas. Por lo tanto, en una
realización preferida adicional, se fusiona un motivo de
dimerización con el último dominio de al menos dos monómeros del
anticuerpo Fv multimérico de la presente invención.
Para aplicaciones terapéuticas en particular,
puede unirse covalente o no covalentemente al menos un monómero del
anticuerpo multimérico de la invención con una sustancia
biológicamente activa (por ejemplo, citocinas u hormonas de
crecimiento), un agente químico (por ejemplo, doxorrubicina,
ciclosporina), un péptido (por ejemplo,
\alpha-Amanitina), o una proteína (por ejemplo,
granzima A y B).
En una realización aún más preferida, el
anticuerpo Fv multimérico de la presente invención es (I) un
anticuerpo monoespecífico capaz de unirse específicamente al
antígeno CD19 de linfocitos B o al antígeno carcinoembrionario
(CEA); o (II) un anticuerpo biespecífico capaz de unirse
específicamente a (a) CD19 y al complejo CD3 del receptor de la
célula T, (b) CD19 y al complejo CD5 del receptor de la célula T,
(c) CD19 y al antígeno CD28 en los linfocitos T, (d) CD19 y CD16 en
células destructoras naturales, macrófagos y monocitos activados,
(e) CEA y CD3, (f) CEA y CD28,o (g) CEA y CD16. Las secuencias de
nucleótidos de los dominios variables ya se han obtenido y, en el
caso del anticuerpo anti-CD19, descrito (Kipriyanov
y col., 1996, J. Immunol. Methods 200,
51-62), anti-CD3 (Kipriyanov y col.,
1997, Protein Engeng. 10, 445-453),
anti-CD28 (Takemura y col., 2000, FEBS Lett.
476, 266-271), anti-CD16
(Solicitud de Patente Alemana DE 199 37 264 A1),
anti-CEA (Griffiths y col., 1993, EMBO J.
12, 725-734) y anti-CD5
(Better y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90,
457-461).
Otro objeto de la presente invención es un
procedimiento para la preparación de un anticuerpo Fv multimérico
según la presente invención, en el que (a) las secuencias de ADN que
codifican los enlazadores peptídicos se ligan con las secuencias de
ADN que codifican los dominios variables de modo que los enlazadores
peptídicos conectan los dominios variables dando lugar a la
formación de una secuencia de ADN que codifica un monómero del
anticuerpo Fv multimérico y (b) las secuencias de ADN que codifican
los diversos monómeros se expresan en un sistema de expresión
adecuado. Las diversas etapas de este procedimiento pueden
realizarse según procedimientos convencionales, por ejemplo,
procedimientos descritos en Sambrook y col., o descritos en los
Ejemplos a continuación.
La presente invención también se refiere a
secuencias de ADN que codifican el anticuerpo Fv multimérico de la
presente invención y a vectores, preferiblemente vectores de
expresión que contienen dichas secuencias de ADN.
Pueden utilizarse diversos sistemas vector de
expresión/hospedador para contener y expresar secuencias que
codifiquen un anticuerpo Fv multimérico. Estos incluyen, pero sin
limitaciones, microorganismos, tales como bacterias transformadas
con bacteriófagos recombinantes, plásmidos o vectores de expresión
de ADN de cósmidos; levaduras transformadas con vectores de
expresión de levaduras, sistemas de células de insectos infectadas
con vectores de expresión virales (por ejemplo, baculovirus);
sistemas de células vegetales transformadas con vectores de
expresión virales (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor,
CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de
expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322) o
sistemas de células animales. La invención no se limita a la célula
hospedadora empleada.
Los "elementos de control" o las
"secuencias reguladoras" son aquellas regiones no traducidas de
los vectores (potenciadores, promotores, regiones 5' y 3' no
traducidas) que interaccionan con proteínas de la célula hospedadora
para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Estos
elementos pueden variar en su potencia y especificidad. Dependiendo
del sistema de vector y hospedador utilizado, puede usarse
cualquiera de los diversos elementos de transcripción y traducción
adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por
ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse
promotores inducibles, tales como el promotor híbrido LacZ del
fagémido Bluescript^{TM}. (Stratagene, La Jolla, Calif.) o del
plásmido pSport1^{TM} (Gibco BRL) y similares. El promotor de la
polihedrina de baculovirus puede usarse en células de insecto. En el
vector pueden clonarse promotores o potenciadores derivados de los
genomas de células vegetales (por ejemplo, genes de choque térmico,
RUBISCO y de proteínas de almacenamiento) o de virus vegetales (por
ejemplo, promotores virales o secuencias líder). En sistemas de
células de mamíferos, se prefieren los promotores de genes de
mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una
línea celular que contenga copias múltiples de la secuencia de
nucleótidos que codifica el anticuerpo Fv multimérico, pueden usarse
vectores basados en los virus SV40 o EBV con un marcador
seleccionable apropiado.
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse
varios vectores de expresión dependientes del uso pretendido para
el anticuerpo Fv multimérico. Los vectores adecuados para su uso en
la presente invención incluyen, pero sin limitaciones, el vector de
expresión pSKK para la expresión en bacterias.
En la levadura Saccharomyces
cerevisiae, pueden usarse varios vectores que contienen
promotores constitutivos o inducibles, tales como el factor alfa,
la alcohol oxidasa y PGH. Para revisiones, véase Grant y col. (1987)
Methods Enzymol. 153:516-544.
En los casos en que se usan vectores de
expresión vegetales, la expresión de las secuencias que codifican
el anticuerpo Fv multimérico puede estar dirigida por cualquier de
los diversos promotores. Por ejemplo, pueden usarse promotores
virales, tales como los promotores 35S y 19S de CaMV solos o en
combinación con la secuencia líder omega del TMV (Takamatsu, N.
(1987) EMBO J. 6:307-311). Alternativamente, pueden
usarse promotores vegetales tales como los promotores de la
subunidad pequeña de RUBISCO o de choque térmico (Coruzzi, G. y col
(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. y col.
(1984) Science 224:838-843 y Winter, J. y col.
(1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105).
Estas construcciones pueden introducirse en células vegetales
mediante transformación directa de ADN o mediante transfección
mediada por patógeno. Estas técnicas se describen en varias
revisiones generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs, S.
o Murry, L. E. en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology
(1992) McGraw Hill, Nueva York, N.Y.; pág.
191-196.
También puede usarse un sistema de insecto para
expresar el anticuerpo Fv multimérico. Por ejemplo, en uno de estos
sistemas, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de
Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar
genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en
larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el
anticuerpo Fv multimérico pueden clonarse en una región no esencial
del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarse bajo el
control del promotor de la polihedrina. La inserción satisfactoria
del anticuerpo Fv multimérico hará que se inactive el gen de la
polihedrina y producirá virus recombinantes que carecen de la
proteína de la cubierta. A continuación, los virus recombinantes
pueden usarse para infectar, por ejemplo, células de S.
frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que puede
expresarse APOP (Engelhard, E. K. y col. (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:3224-3227).
En células hospedadoras de mamíferos, pueden
utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En los
casos en que se usa un adenovirus como vector de expresión, las
secuencias que codifican el anticuerpo Fv multimérico pueden
ligarse a un complejo de transcripción/traducción de adenovirus, que
consiste en las secuencias promotora tardía y líder tripartita.
Puede usarse la inserción en una región E1 o E3 no esenciales del
genoma del virus para obtener un virus viable que sea capaz de
expresar el anticuerpo Fv multimérico en células hospedadoras
infectadas (Logan, J. y Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
81:3655-3659). Además, pueden usarse potenciadores
de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma
de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células hospedadoras
de mamíferos.
También pueden usarse cromosomas artificiales
humanos (HAC) para suministrar fragmentos de ADN más grandes que
los que puede contener y expresar un plásmido. Se construyen HACs de
6 a 10 M y se suministran mediante procedimientos de suministro
convencionales (liposomas, polímeros amino policatiónicos o
vesículas) para fines terapéuticos.
También pueden usarse señales de iniciación
específicas para lograr una traducción más eficaz de las secuencias
que codifican el anticuerpo Fv multimérico. Estas señales incluyen
el codon de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos en
los que las secuencias que codifican el anticuerpo Fv multimérico,
su codon de iniciación y las secuencias antes del extremo 5' se
insertan en el vector de expresión adecuado, puede que no se
necesiten señales de control de la transcripción o de la traducción
adicionales. Sin embargo, en los casos en los que sólo se inserta
la secuencia codificadora, deberán proporcionarse señales exógenas
de control de la traducción que incluyan el codon de iniciación
ATG. Además, el codon de iniciación debe estar en la fase de
lectura correcta para asegurar la traducción de la inserción
completa. Los elementos exógenos de traducción y los codones de
iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como
sintéticos. La eficacia de expresión puede potenciarse mediante la
inclusión de potenciadores que sean apropiados para el sistema
celular en particular que se usa, tal como los descritos en la
bibliografía (Scharf, D. y col. (1994) Results Probl. Cell Differ.
20:125-162).
Además, puede elegirse una cepa de la célula
hospedadora por su capacidad para modular la expresión de las
secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada en la
forma deseada. También puede usarse un procesamiento
postraduccional que escinda una forma "prepro" de la proteína
para facilitar la inserción, el plegamiento y/o la función
correctos. En la American Type Culture Collection
(ATCC; Bethesda, Md.) están disponibles diferentes células
hospedadoras que tienen una maquinaria celular específica y
mecanismos característicos para las actividades postraduccionales
(por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138) y pueden elegirse de
modo que se asegure la correcta modificación y procesamiento de la
proteína extraña.
Para una producción de alto rendimiento a largo
plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable.
Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable el
anticuerpo Fv multimérico pueden transformase usando vectores de
expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o
elementos de expresión endógena y un gen marcador susceptible de
selección en el mismo vector o en un vector independiente. Tras la
introducción del vector, puede permitirse que las células crezcan
durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de
pasarlas a un medio selectivo. El propósito del marcador
seleccionable es conferir resistencia a la selección y su presencia
permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan
eficazmente las secuencias introducidas. Los clones resistentes de
las células transformadas estables pueden proliferar usando
técnicas de cultivos tisulares apropiadas para el tipo de
célula.
Para recuperar las líneas celulares
transformadas puede usarse cualquiera de los diversos sistemas de
selección. Estos incluyen, pero sin limitaciones, los genes de la
timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler, M. y col.
(1977) Cell 11:223-32) y de la adenina
fosforribosiltransferasa (Lowy, I. y col. (1980) Cell
22:817-23) que pueden emplearse en células tk^{-}
o aprt^{-}, respectivamente. También puede usarse la resistencia
a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como base para la
selección, por ejemplo, dhfr que confiere resistencia a metotrexato
(Wigler, M y col. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci.
77:3567-70); npt, que confiere resistencia a los
aminoglucosidos neomicina y G-418
(Colbere-Garapin, F. y col (1981) J. Mol. Biol.
150:1-14) y als o pat, que confieren resistencia a
clorsulfurona y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente
(Murry, supra). Se han descrito genes susceptibles de
selección adicionales, por ejemplo, trpB, que permite a las células
utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las
células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman, S. C. y
R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
85:8047-51).Recientemente, ha ganado popularidad el
uso de marcadores visibles, siendo marcadores como antrocianinas,
\beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y
luciferasa y su sustrato luciferina, ampliamente utilizados no sólo
para identificar transformantes sino también para cuantificar la
cantidad de expresión transitoria o estable de proteína atribuible a
un sistema de vector específico (Rhodes, C. A. y col. (1995)
Methods Mol. Biol. 55:121-131).
Un vector de expresión en especial es
pSKK2-scFv_{L18}anti-CD3-LL-scFv_{L10}anti-CD19(pSKK2-scFv3LL
Db19) (depositado en el DSMZ según el Tratado de Budapest como DSM
14470 el 22 de agosto de 2001 o
pSKK2-scFv_{L18}anti-CD19-LL-scFv_{L10}anti-CD3(pSKK2-scFv19LL
Db3) (depositado en el DSMZ según el Tratado de Budapest como DSM
14471 el 22 de agosto de 2001).
La presente invención también se refiere a una
composición farmacéutica que contiene un anticuerpo Fv multimérico
de la presente invención, una secuencia de ADN o un vector de
expresión, combinado preferiblemente con vehículos farmacéuticos
adecuados. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien
conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas
con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones aceite/agua,
diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc.
Estos vehículos pueden formularse mediante procedimientos
convencionales y pueden administrarse al sujeto a una dosis
adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede
llevarse a cabo a través de diversas medios, por ejemplo, mediante
administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea,
intramuscular, tópica o intradérmica. La vía de administración, por
supuesto, depende de la naturaleza de la enfermedad, por ejemplo,
un tumor, y del tipo de compuesto contenido en la composición
farmacéutica. El médico determinará el régimen de dosificación y
otros factores clínicos. Como es bien conocido en las técnicas
médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos
factores, incluyendo la talla del paciente, el área de superficie
corporal, la edad, el sexo, la composición en particular que se va
a administrar, el tiempo y la vía de administración, la clase de
trastorno, el estado de salud general y otros fármacos que se
administran simultáneamente.
Los usos médicos preferidos de los compuestos de
la presente invención son: (a) el tratamiento de una enfermedad
relacionada con un virus, una bacteria, un tumor o un prión, (b) la
aglutinación de células sanguíneas rojas, (c) la unión de células
citotóxicas del sistema inmune, por ejemplo, células T o citolíticas
naturales, a células tumorales o (d) la unión de citocinas de
activación, preferiblemente IL-1,
IL-2, IFN\gamma, TNF\alpha o
GM-CSF, sustancias citotóxicas (por ejemplo,
doxorrubicina, ciclosporina, \alpha-Amanitina o
una proteasa, preferiblemente Granzima B, a una célula diana.
Un objeto adicional de la presente invención es
el uso de un anticuerpo Fv multimérico de la presente invención
para diagnóstico. Para uso en la investigación diagnóstica, también
la presente invención proporciona kits, que comprenden un
anticuerpo multimérico de la presente invención. El anticuerpo Fv
puede estar marcado de forma detectable. En una realización
preferida, dicho kit permite el diagnóstico mediante un ELISA que
contiene el anticuerpo Fv unido a un soporte sólido, por ejemplo,
un disco de microvaloración de poliestireno o un papel de
nitrocelulosa, usando técnicas conocidas en la materia.
Alternativamente, dicho kit se basa en un RIA y contiene dicho
anticuerpo Fv marcado con un isótopo radiactivo. En una realización
preferida del kit de la invención, el anticuerpo se marca con
enzimas, compuestos fluorescentes, compuestos luminiscentes, sondas
ferromagnéticas o compuestos radiactivos.
La presente invención además se describe con
respecto a las figuras.
Figuras 1, 2 y
3
Abreviaturas L0: los dominios V_{H} y
V_{L} se conectan directamente sin intervención del péptido
enlazador; L1: secuencia enlazadora que codifica el resto Ser; L10:
secuencia enlazadora que codifica el polipéptido
SerAlaLysThrThr
ProLysLeuGlyGly que conecta los dominios V_{H} y V_{L}; LL: secuencia enlazadora que codifica el polipéptido (Gly_{4}Ser)_{4}
que conecta los fragmentos scFv híbridos; L18: secuencia enlazadora que codifica el polipéptido SerAlaLysThrThr
ProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArgVal que conecta los dominios V_{H} y V_{L}.
ProLysLeuGlyGly que conecta los dominios V_{H} y V_{L}; LL: secuencia enlazadora que codifica el polipéptido (Gly_{4}Ser)_{4}
que conecta los fragmentos scFv híbridos; L18: secuencia enlazadora que codifica el polipéptido SerAlaLysThrThr
ProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArgVal que conecta los dominios V_{H} y V_{L}.
Figuras 4 y
5
Abreviaturas c-myc:
secuencia que codifica un epítopo reconocido por el AcM 9E10; His:
secuencia que codifica seis restos de histidina en el extremo
C-terminal; PelB: secuencia del péptido señal de la
pectato liasa bacteriana (líder PelB); rbs: sitio de unión a
ribosoma; Stop: codon de parada (TAA); V_{H} y V_{L}: regiones
variables de la cadena pesada y ligera; L10: secuencia enlazadora
que codifica el polipéptido SerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGly que
conecta los dominios V_{H} y V_{L}; LL: secuencia enlazadora que
codifica el polipéptido (Gly_{4}Ser)_{4} que conecta los
fragmentos scFv híbridos; L18: secuencia enlazadora que codifica el
polipéptido
SerAlaLysThrThrProLysLeuGluGluGlyGluPheSer
GluAlaArgVal que conecta los dominios V_{H} y V_{L}; B: BamHI, Ea: EagI, E: EcoRI, Nc: NcoI; N: NotI, P: PvuII, X: XbaI.
GluAlaArgVal que conecta los dominios V_{H} y V_{L}; B: BamHI, Ea: EagI, E: EcoRI, Nc: NcoI; N: NotI, P: PvuII, X: XbaI.
Figura
6
Abreviaturas cola de His6: secuencia que
codifica seis restos de histidina en el extremo
C-terminal; \beta-lactamasa: gen
que codifica la \beta-lactamasa que confiere
resistencia a la ampicilina; pb: pares de bases; epítopo
c-myc: secuencia que codifica un epítopo reconocido
por el AcM 9E10; Lac P/0: promotor/operador del operon lac st;
líder Pel B: secuencia del péptido señal de la pectato liasa
bacteriana; V_{H} y V_{L}: regiones variables de la cadena
pesada y ligera; L10: secuencia enlazadora que codifica el
polipéptido SerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGly que conecta los dominios
V_{H} y V_{L}; LL: secuencia enlazadora que codifica el
polipéptido (Gly_{4}Ser)_{4} que conecta los fragmentos
scFv híbridos; L18: secuencia enlazadora que codifica el polipéptido
SerAlaLysThrThrProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArg
Val que conecta los dominios V_{H} y V_{L}; rbs: sitio de unión a ribosomas; V_{H} y V_{L}: regiones variables de la cadena pesada y ligera; hok-sok: locus de ADN estabilizador del plásmido; lacI: gen que codifica el represor lac; lac P/0: promotor/operador del operon lac st; lacZ': gen que codifica el péptido \alpha de la galactosidasa \beta; gen skp: gen que codifica el factor periplásmico bacteriano Skp/OmpH; tLPP: secuencia de nucleótidos del terminador de lipoproteína; M13 ori: origen de la replicación del ADN; pBR322ori: origen de la replicación del ADN; tHP: terminador potente de la transcripción; SD1: sitio de unión al ribosoma (Shine Dalgarno) derivado del gen lacZ de E. coli (lacZ); SD2 y SD3: secuencia de Shine Dalgarno para la proteína 10 del gen T7 fuertemente expresada (T7g10).
Val que conecta los dominios V_{H} y V_{L}; rbs: sitio de unión a ribosomas; V_{H} y V_{L}: regiones variables de la cadena pesada y ligera; hok-sok: locus de ADN estabilizador del plásmido; lacI: gen que codifica el represor lac; lac P/0: promotor/operador del operon lac st; lacZ': gen que codifica el péptido \alpha de la galactosidasa \beta; gen skp: gen que codifica el factor periplásmico bacteriano Skp/OmpH; tLPP: secuencia de nucleótidos del terminador de lipoproteína; M13 ori: origen de la replicación del ADN; pBR322ori: origen de la replicación del ADN; tHP: terminador potente de la transcripción; SD1: sitio de unión al ribosoma (Shine Dalgarno) derivado del gen lacZ de E. coli (lacZ); SD2 y SD3: secuencia de Shine Dalgarno para la proteína 10 del gen T7 fuertemente expresada (T7g10).
Figura
7
Abreviaturas cola de His6: secuencia que
codifica seis restos de histidina en el extremo
C-terminal; \beta-lactamasa: gen
que codifica la \beta-lactamasa que confiere
resistencia a la ampicilina; pb: pares de bases; epítopo
c-myc: secuencia que codifica un epítopo reconocido
por el AcM 9E10; Lac P/0: promotor/operador del operon lac
st; líder PelB: secuencia del péptido señal de la pectato liasa
bacteriana; V_{H} y V_{L}: regiones variables de la cadena
pesada y ligera; L10: secuencia enlazadora que codifica el
polipéptido SerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGly que conecta los dominios
V_{H} y V_{L}; LL: secuencia enlazadora que codifica el
polipéptido (Gly_{4}Ser)_{4} que conecta los fragmentos
scFv híbridos; L18: secuencia enlazadora que codifica el polipéptido
SerAlaLysThrThrProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArg
Val que conecta los dominios V_{H} y V_{L}; rbs: sitio de unión a ribosoma; hok-sok: locus de ADN estabilizador del plásmido; lacI: gen que codifica el represor lac; lac P/0: promotor/operador del operon lac st; lacZ': gen que codifica el péptido \alpha de la galactosidasa \beta; gen skp: gen que codifica el factor periplásmico bacteriano Skp/OmpH; tLPP: secuencia de nucleótidos del terminador de lipoproteína; M13 ori: origen de la replicación del ADN; pBR322ori: origen de la replicación del ADN; tHP: terminador potente de la transcripción; SD1: sitio de unión al ribosoma (Shine Dalgarno) derivado del gen lacZ de E. coli (lacZ); SD2 y SD3: secuencia de Shine Dalgarno para la proteína 10 del gen T7 fuertemente expresada (T7g10).
Val que conecta los dominios V_{H} y V_{L}; rbs: sitio de unión a ribosoma; hok-sok: locus de ADN estabilizador del plásmido; lacI: gen que codifica el represor lac; lac P/0: promotor/operador del operon lac st; lacZ': gen que codifica el péptido \alpha de la galactosidasa \beta; gen skp: gen que codifica el factor periplásmico bacteriano Skp/OmpH; tLPP: secuencia de nucleótidos del terminador de lipoproteína; M13 ori: origen de la replicación del ADN; pBR322ori: origen de la replicación del ADN; tHP: terminador potente de la transcripción; SD1: sitio de unión al ribosoma (Shine Dalgarno) derivado del gen lacZ de E. coli (lacZ); SD2 y SD3: secuencia de Shine Dalgarno para la proteína 10 del gen T7 fuertemente expresada (T7g10).
Figura
8
La electroforesis se realizó en condiciones
reductoras; Inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal
anti-c-myc, en el caso de las moléculas
scFv3 - Db19 (Figura 8A) y scFv 19 x Db3 (Figura 8B).
Figura
9
Se usó una columna Superdex 200 HR10/30
calibrada y el análisis de los contenidos de proteína de los picos
mediante inmunofluorescencia se realizó con un anticuerpo monoclonal
anti-c-myc, en el caso de las moléculas
scFv3 - Db19 (Figura 9A) y scFv19 - Db3 (Figura 9B).
Figura
10
Se usó una columna de Superdex 200 HR10/3
calibrada para las moléculas scFv3 - Db19, scFv19 - Db3, scFv19 -
scFv3 y scFv3 - scFv19.
Figura
11
Figura
12
Los Ejemplos siguientes ilustran la
invención.
Para la generación de construcciones Fv
multiméricas, se usaron los plásmidos pHOG_HD37, pHOG_Dia_HD37,
pHOG_mOKT3+NotI y pHOG_Dia_mOKT3 que codifican los fragmentos
derivados de anticuerpo del hibridoma HD37 específico del CD19
humano (Kipriyanov y col., 1996, J. Immunol. Meth. 196,
51-62; Le Gall y col., 1999, FEBS Lett., 453,
164-168) o del hibridoma OKT3 especifico para el
CD3 humano (Kipriyanov y col., 1997, Protein Eng. 10,
445-453).
El gen de scFvL_{10} anti-CD19
seguido de un segmento que codifica un epítopo de
c-myc y una cola hexahistidina se cortó con
PvuII/XbaI del plásmido pHOG Dia HD37 y se clonó de nuevo en el
vector pDISC-1 LL alineado con PvuII/XbaI
(Kipriyanov y col., 1999, J. Mol. Biol. 293, 41-56)
(Figura 4). Este plásmido híbrido se alineó con NcoI/NotI y se ligó
en este plásmido el gen que codifica scFv_{L10} cortado con
NcoI/NotI del plásmido pHOG mOKT3 + NotI. El plásmido obtenido es
el pHOG
scFv_{L18}\alphaCD3-LL-scFv_{L10}\alphaCD19
(scFv3 - Db19) (Figura 4).
También se usó el plásmido híbrido alineado con
NcoI/NotI para el ligamiento del gen que codifica
scFv_{L18}\alphaCD19 del plásmido pHOG HD37, el plásmido
obtenido es el pHOG
scFv_{L18}\alphaCD19-LL-scFv_{L10}\alphaCD19
(scFv19 x Db19) (Figura 4). Este plásmido se alineó con PvuII/XbaI
y el gen scFv_{L10} seguido por un segmento que codifica un
epítopo de c-myc y una cola hexahistidina se cortó
con PvuII/XbaI del plásmido pHOG mDia OKT3. El plásmido obtenido es
el pHOG
scFv_{L18}\alphaCD19-LL-scFv_{L10}\alphaCD3
(scFv19 - Db3) (Figura 5).
Para aumentar la producción de fragmentos
funcionales de anticuerpo en el periplasma bacteriano, se generó un
vector de expresión pSKK2 optimizado. Este vector se construyó sobre
el plásmido pHKK como base (Horn, 1996, Appl. Microbiol.
Biotechnol., 46, 524-532) que contiene el
sistema de suicidio celular sin plásmido, hok/sok (Thisted y col.,
1994, EMBO J., 13, 1950-1956). En primer
lugar, se amplificó por PCR el gen que codifica el híbrido scFv
V_{H}3-V_{L}19 a partir del plásmido
pHOG3-19 (Kipriyanov y col., 1998, Int. J. Cancer
77, 763-772) usando los cebadores
5-NDE,
5'-GATATACATATGAAATACCTATTGCCTACGGC, y
3-AFL,
5'-CGAATTCTTAAGTTAGCACAGGCCTC
TAGAGACACACAGATCTTTAG. El fragmento de PCR de 921 pb resultante se digirió con NdeI y AflII y se clonó en el plásmido pHKK alineado con NdeI/AflII, generando el vector pHKK3-19. Para delecionar un sitio XbaI adicional, se amplificó un fragmento del plásmido pHKK que contenía parte del extremo 3'-terminal del gen lacI (codifica el represor lac), el potente terminador de la transcripción t_{HP} y el promotor/operador de lac de tipo silvestre se amplificaron mediante PCR usando los cebadores 5-NAR, 5'-CACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCC y 3-NDE, 5'-GGTATTTCATATGTATATCTCCTTCTTCAGAAATTCGTAATCATGG. El fragmento de ADN resultante de 329 pb se digirió con NarI y NdeI y se clonó en el plásmido pHKK3-19 alineado NarI/NdeI generando el vector pHKK\BoxXba. Para introducir un gen que codifica el factor periplásmico Skp/OmpH para una mayor producción de anticuerpo recombinante (Bothmann y Plückthun, 1998, Nat. Biotechnol., 16, 376-380), se amplificó por PCR el gen skp con los cebadores skp-3, 5'-CGAATTCTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAAAGTGGTTATTAGCTGCAGG y skp-4, 5'-CGAATTCTCGAGCATTATTTAACCTGTTTCAGTACGTCGG usando como molde el plásmido pGAH317 (Holck y Kleppe, 1988, Gene, 67, 117-124). El fragmento de PCR resultante de 528 pb se digirió con AflII y XhoI y se clonó en el plásmido pHKK\BoxXba digerido con AflII/XhoI dando lugar al plásmido de expresión pSKK2.
TAGAGACACACAGATCTTTAG. El fragmento de PCR de 921 pb resultante se digirió con NdeI y AflII y se clonó en el plásmido pHKK alineado con NdeI/AflII, generando el vector pHKK3-19. Para delecionar un sitio XbaI adicional, se amplificó un fragmento del plásmido pHKK que contenía parte del extremo 3'-terminal del gen lacI (codifica el represor lac), el potente terminador de la transcripción t_{HP} y el promotor/operador de lac de tipo silvestre se amplificaron mediante PCR usando los cebadores 5-NAR, 5'-CACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCC y 3-NDE, 5'-GGTATTTCATATGTATATCTCCTTCTTCAGAAATTCGTAATCATGG. El fragmento de ADN resultante de 329 pb se digirió con NarI y NdeI y se clonó en el plásmido pHKK3-19 alineado NarI/NdeI generando el vector pHKK\BoxXba. Para introducir un gen que codifica el factor periplásmico Skp/OmpH para una mayor producción de anticuerpo recombinante (Bothmann y Plückthun, 1998, Nat. Biotechnol., 16, 376-380), se amplificó por PCR el gen skp con los cebadores skp-3, 5'-CGAATTCTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAAAGTGGTTATTAGCTGCAGG y skp-4, 5'-CGAATTCTCGAGCATTATTTAACCTGTTTCAGTACGTCGG usando como molde el plásmido pGAH317 (Holck y Kleppe, 1988, Gene, 67, 117-124). El fragmento de PCR resultante de 528 pb se digirió con AflII y XhoI y se clonó en el plásmido pHKK\BoxXba digerido con AflII/XhoI dando lugar al plásmido de expresión pSKK2.
Los plásmidos pHOG
scFv_{L18}\alphaCD3-LL-scFv_{L10}\alphaCD19
(scFv\cdot- Db19) y pHOG
scFv_{L18}\alphaCD19-LL-scFv_{L10}\alphaCD3
(scFv19 - Db3) se cortaron con NcoI/XbaI y se ligaron
en el plásmido pSKK2 alineado con NcoI/XbaI. Los
plásmidos resultantes son pSKK2
scFv_{L18}\alphaCD3-LL-scFv_{L10}\alphaCD19
y pSKK2
scFv_{L18}\alphaCD19-LL-scFv_{L10}\alphaCD3.
En las Figuras 6 y 7 se proporcionan las secuencias completas de
nucleótidos y de aminoácidos, respectivamente.
La cepa RV308 de E. coli K12 (Maurer y
col., 1980, J. Mol. Biol. 139, 147-161)
transformada con los plásmidos de expresión pSKK2
scFv_{L18}\alphaCD3-LL-scFv_{L10}\alphaCD19
y pSKK2
scFv_{L18}\alphaCD19-LL-scFv_{L10}\alphaCD3
se cultivó durante una noche en medio 2xYT con 50 \mug/ml de
ampicilina y glucosa 100 mM (2xYT_{GA}) a 28ºC. Se cultivaron
diluciones (1:50) de los cultivos de una noche en 2xYT_{GA} en
frascas de cultivo a 28ºC con agitación a 200 rpm. Cuando los
cultivos llegaban a una DO_{600} = 0,8, se sedimentaron las
bacterias mediante centrifugación a 5.000 x g durante 10 min y a
20ºC y se resuspendieron en el mismo volumen de medio YTBS nuevo
(2xYT que contenía sorbitol 1 M y glicina betaína 2,5 mM; Blacwell y
Horgan, 1991, FEBS Letters. 295, 10-12) que
contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Se añadió IPTG a una
concentración final de 0,2 mM y se continuó el crecimiento a 20ºC
durante 18-20 h. Las células se recogieron mediante
centrifugación a 9.000 x g durante 20 min y a 4ºC. Para aislar las
proteínas periplásmicas solubles, las bacterias se resuspendieron
en el 5% del volumen inicial de Tris-HCl 50 mM,
sacarosa al 20%, EDTA 1 M, pH 8.0, enfriado en hielo. Después de 1
h de incubación en hielo con agitación ocasional, los esferoblastos
se centrifugaron a 30.000 x g durante 30 min a 4ºC, dejando el
extracto periplásmico soluble con el sobrenadante y los
esferoblastos más el material periplásmico insoluble como el
sedimento. Las fracciones periplásmicas se dializaron frente al
tampón inicial (Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, imidazol
50 mM, pH 7.0) a 4ºC. La solución dializada que contenía el producto
recombinante se centrifugó a 30.000 x g durante 30 min a 4ºC. El
producto recombinante se concentró mediante precipitación con
sulfato amónico (concentración final al 70% de saturación). El
precipitado de proteínas se recogió por centrifugación (10.000 x g,
4ºC, 40 min) y se disolvió en el 10% del volumen inicial de
Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, pH 7,0. Se realizó una
cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC) a
4ºC usando una columna de Sefarosa quelante (Pharmacia) cargada con
Cu^{2+} y equilibrada con Tris-HCl 50 mM, NaCl 1
M, pH 7,0 (tampón inicial). La muestra se cargó pasando ésta por la
columna. A continuación se lavó con veinte volúmenes de columna de
tampón inicial seguido de tampón inicial con imidazol 50 mM hasta
que la absorbancia (280 nm) del eluido era mínima (aproximadamente
treinta volúmenes de columna). El material absorbido se eluyó con
Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, imidazol 250 mM, pH 7,0.
Las fracciones de elución que contenían las moléculas de Fv
multiméricas se identificaron mediante análisis por
inmunotransferencia usando el AcM anti-c-myc
9E10 realizado como se describe previamente (Kipriyanov y col.,
1994, Mol. Immunol. 31, 1047-1058) como se
ilustra en la Figura 8A para scFv3 - Db19 y en la Figura 8B para
scFv19 - Db3.
Las fracciones positivas se recogieron y se
concentraron en un dispositivo de filtración en centrífuga
Ultrafree-15 (Millipore Corporation, Eschborn,
Alemania) hasta 0,5 ml.
Se realizó una purificación adicional de las
moléculas Fv multiméricas mediante FPLC de exclusión molecular en
una columna de Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia) en PBSI (fosfato
sódico 15 mM, NaCl 0,15 M, imidazole 50 mM, pH 7,0). Los volúmenes
de la muestra para la cromatografía preparativa fueron de 500 \mul
y el flujo fue de 0,5 ml/min, respectivamente. La columna se
calibró con kits de calibración para filtración en gel de alto y
bajo peso molecular (Pharmacia). Las fracciones de elución que
contenían las moléculas de Fv multiméricas se identificaron
mediante análisis por inmunotransferencia usando el AcM
anti-c-myc 9E10 realizado como se describe
previamente (Kipriyanov y col., 1994, Mol. Immunol. 31,
1047-1058) y los resultados para las moléculas
scFv3 - Db19 y scFv19 - Db3 se presentan en la Figura 9A y 9B,
respectivamente. Las fracciones se recogieron y se conservaron
individualmente en hielo.
Las moléculas Fv generadas se compararon con dos
tándems scFv-scFv, scFv3 - scFv19 y scFv19 - scFv3
(Figura 10), producidos y purificados en las mismas condiciones. La
Figura 10 muestra claramente que se obtenían formas de mayor peso
molecular para scFv3 x Db19 y scFv19 x Db3 en comparación con scFv3
x scFv19 y scFv19 x scFv3. El pico principal para las moléculas
scFv3 - scFv19 y scFv19 - scFv3 corresponde a un peso molecular de
aproximadamente 67 kDa y para scFv3 - Db19 y scFv19 - Db3 de
aproximadamente 232 kDa. La presencia de los motivos de dimerización
en el extremo C-terminal de la molécula tiene un
efecto positivo para la multimerización de las moléculas.
Para la citometría de flujo se usaron la línea
Jurkat de leucemia aguda de células T CD3^{+}/CD19^{-} y la
línea JOK-1 de células B CD19^{+}/CD3^{-}.
Brevemente, se incubaron 5 x 10^{5} células en 50 \mul de medio
RPMI 1640 (GIBCO BRL, Eggenstein, Alemania) suplementado con STF al
10% y azida sódica al 0,1% (denominado medio completo) con 100
\mul de una preparación de moléculas Fv multiméricas durante 45
min en hielo. Después de lavar con medio completo, las células se
incubaron con 100 \mul del AcM anti-c-myc
9E10 a 10 \mug/ml (IC Chemikalien, Ismaning, Alemania) en el
mismo tampón durante 45 min en hielo. Después de un segundo ciclo
de lavado, las células se incubaron con 100 \mul de anticuerpo de
cabra anti-IgG de ratón marcado con FITC (GIBCO
BRL) en las mismas condiciones que antes. A continuación, las
células se lavaron de nuevo y se resuspendieron en 100 \mul de
solución de yoduro de propidio a 1 \mug/ml (Sigma, Deisenhofen,
Alemania) en medio completo para excluir las células muertas. La
fluorescencia relativa de las células teñidas se midió usando un
citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) o
sistemas de citómetro de flujo Epics XL (Beckman Coulter, Miami,
FL).
Los experimentos de citometría de flujo
demostraron interacciones específicas tanto con células Jurkat
CD3^{+} como con células JOK-1 CD19^{+} para
todas las moléculas Fv multiméricas (Figura 11).
Para las afinidades de unión a CD19 y CD3 se
decidió usar las fracciones correspondientes a los monómeros scFv3
x scFv19 y scFv19 - scFv3 y a los multímeros scFv3 x Db19 y scFv19 x
Db3.
Los ensayos de retención en la superficie
celular se realizaron a 37ºC, esencialmente como se ha descrito
(Adams y col, 1998, Cancer Res. 58, 485-490)
excepto porque la detección de los fragmento de anticuerpo retenidos
se realizó usando el AcM anti-c-myc 9E10
seguido de un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado
con FITC. Se dedujeron la constante cinética de disociación
(k_{d}) y la semivida (t_{1/2}) para la disociación de
moléculas Fv multiméricas a partir de un ajuste de la disminución
exponencial monofásica de los datos experimentales usando
"GraphPad" Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Como
control, se usó el anticuerpo biespecífico CD19 x CD3 (BsDb 19x3)
descrito previamente (Kipriyanov y col., 1998, Int. J. Cancer
77, 763-777; Cochlovius y col., 2000, J.
Immunol. 165, 888-895). Los resultados de los
experimentos se muestran en la Figura 12 y se resumen en la Tabla
1.
Sobre las células JOK-1
CD19^{+}, scFv3 - scFv19 tiene una semivida relativamente corta
(t_{1/2}) de casi dos veces menos que la t_{1/2} de BsDb 19x3
(Tabla 1). Por el contrario, scFv3 - Db19 se mantenía durante un
periodo más largo sobre la superficie de las células
JOK-1. Para scFv19 - scFv3 la t_{1/2} está en el
mismo intervalo que la t_{1/2} de BsDb 19x3. La retención de scFv3
- scFv19 es significativamente mayor, con una t_{1/2} = 65,71
min, en comparación con las otras moléculas (Tabla 1). Las semividas
de todas las moléculas Fv multiespecíficas sobre la superficie de
células Jurkat CD3^{+} eran relativamente cortas. La longitud del
enlazador parecía tener alguna influencia sobre la unión al
antígeno, puesto que scFv3 - Db19 y scFv19 - Db3 mostraron una
k_{d} significativamente más lenta a partir de células CD19
positivas que BsDb 19x3, scFv3 x scFv19 y scFv19 - scFv3.
Claims (23)
1. Un anticuerpo Fv multimérico, en el que
cada monómero del anticuerpo Fv comprende las siguientes
características:
(a) dos dominios variables próximos que forman
una unidad scFv V_{H}-V_{L} o
V_{L}-V_{H} de unión al antígeno; estos dos
dominios variables primero y segundo se unen mediante un enlazador
peptídico de al menos 12 restos de aminoácidos; y
(b) otros dos dominios variables próximos que
están unidos no covalentemente a dos dominios variables de otro
monómero del anticuerpo Fv, dando lugar a la formación de dos sitios
de unión al antígeno adicionales para formar el motivo de
multimerización; estos dos dominios variables tercero y cuarto de
cada monómero se unen mediante un enlazador peptídico que consiste
en un máximo de 10 restos de aminoácidos.
2. El anticuerpo Fv multimérico de la
reivindicación 1, en el que una característica adicional es que la
unidad scFv V_{H}-V_{L} o
V_{L}-V_{H} de unión al antígeno formada por los
dos dominios próximos de un monómero se une a los otros dominios
variables del motivo de multimerización mediante un enlazador
peptídico de al menos 15 restos de aminoácidos.
3. El anticuerpo Fv multimérico de la
reivindicación 1 ó 2, en el que dichos monómeros comprenden cuatro
dominios variables y en el que los dominios variables tercero y
cuarto de los monómeros se unen mediante un enlazador peptídico de
5 restos de aminoácidos o menos.
4. El anticuerpo Fv multimérico de la
reivindicación 3, en el que los dominios tercero y cuarto de los
monómeros se unen directamente sin intervención de restos de
aminoácidos.
5. El anticuerpo Fv multimérico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que los dominios
variables segundo y tercero de los monómeros están unidos mediante
un enlazador peptídico que consiste en al menos 20 restos de
aminoácidos.
6. El anticuerpo Fv multimérico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los dominios
variables tercero y/o cuarto de los monómeros se acortan en al menos
un resto de aminoácido en sus extremos N y/o C terminales.
7. El anticuerpo Fv multimérico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el orden de los
dominios de un monómero es V_{H}-V_{L}.
8. El anticuerpo Fv multimérico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el orden de los
dominios de un monómero es V_{L}-V_{H}.
9. El anticuerpo Fv multimérico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la unión no
covalente de al menos un par de dominios variables se potencia
mediante al menos un puente disulfuro.
10. El anticuerpo Fv multimérico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que es un dímero
tetravalente, trímero hexavalente o tetrámero octavalente.
11. El anticuerpo Fv multimérico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que es un anticuerpo
biespecífico o triespecífico o tetraespecífico.
12. El anticuerpo Fv multimérico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que al menos un
monómero se une a una sustancia biológicamente activa, un agente
químico, un péptido, una proteína o un fármaco.
13. El anticuerpo Fv multimético de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó 12, que es un anticuerpo
monoespecífico capaz de unirse específicamente al antígeno CD19 de
los linfocitos B o al antígeno CEA.
14. El anticuerpo Fv multimérico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que es un anticuerpo
biespecífico capaz de unirse específicamente a:
(a) CD19 y al complejo CD3 del receptor de la
célula T;
(b) CD19 y al complejo CD5 del receptor de la
célula T;
(c) CD19 y al antígeno CD28 en los linfocitos
T;
(d) CD19 y CD16 de células destructuras
naturales, macrófagos y monocitos activados;
(e) CEA y CD3;
(f) CEA y CD28; o
(g) CEA y CD16.
15. Un procedimiento para la preparación de un
anticuerpo Fv multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 14, en el que (a) las secuencias de ADN que codifican los
enlazadores peptídicos se ligan con las secuencias de ADN que
codifican los dominios variables de modo que los enlazadores
peptídicos conectan los dominios variables dando lugar a la
formación de una secuencia de ADN que codifica un monómero del
anticuerpo Fv multimérico multivalente y (b) las secuencias de ADN
que codifican los diversos monómeros se expresan en un sistema de
expresión adecuado.
16. Una secuencia de ADN que codifica un
anticuerpo Fv multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 14.
17. Un vector de expresión que contiene la
secuencia de ADN de la reivindicación 16.
18. El vector de expresión de la reivindicación
17, que es
pSKK2-scFv_{L18}anti-CD3-LL-scFv_{L10}anti-CD19
también denominado pSKK2-scFv3LL Db19 y depositado
como DSM 14470 o
pSKK2-scFv_{L18}anti-CD19-LL-scFv_{L10}anti-CD3
también denominado pSKK2-scFv19LL Db3 y depositado
como DSM 14471.
19. Una célula hospedadora que contiene el
vector de expresión de la reivindicación 16 ó 18.
20. Una composición farmacéutica que contiene
un anticuerpo Fv multimérico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14.
21. Un anticuerpo Fv multimérico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso como un
reactivo de diagnóstico.
22. Uso de un anticuerpo Fv multimérico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la preparación de
una composición farmacéutica para (a) el tratamiento de una
enfermedad relacionada con una virus, una bacteria, un tumor o un
prión, (b) la aglutinación de células sanguíneas rojas, (c) la unión
de células citotóxicas del sistema inmune con células tumorales, o
(d) la unión de citocinas activadoras, sustancias citotóxicas o una
proteasa a una célula diana.
23. Un kit diagnóstico que contiene un
anticuerpo Fv multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 14.
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| JP2008501621A (ja) * | 2003-05-31 | 2008-01-24 | マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト | Ｂ細胞関連疾患を処置するための二重特異性抗ｃｄ３、抗ｃｄ１９抗体構築物を含む薬学的組成物 |
| GB0510790D0 (en) | 2005-05-26 | 2005-06-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Anti-CD16 binding molecules |
| CN103172737A (zh) | 2005-06-30 | 2013-06-26 | Abbvie公司 | Il-12/p40结合蛋白 |
| SI1912675T1 (sl) | 2005-07-25 | 2014-07-31 | Emergent Product Development Seattle, Llc | zmanjšanje števila celic B z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na CD37 in CD20 |
| US10183986B2 (en) | 2005-12-15 | 2019-01-22 | Industrial Technology Research Institute | Trimeric collagen scaffold antibodies |
| US20070264687A1 (en) * | 2005-12-15 | 2007-11-15 | Min-Yuan Chou | Recombinant triplex scaffold-based polypeptides |
| WO2007109254A2 (en) | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Biogen Idec Ma Inc. | Stabilized polypeptide compositions |
| JP5082104B2 (ja) * | 2006-03-23 | 2012-11-28 | 国立大学法人東北大学 | 高機能性二重特異性抗体 |
| MX363905B (es) | 2006-06-12 | 2019-04-08 | Aptevo Res & Development Llc | Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora. |
| SI2059536T1 (sl) | 2006-08-14 | 2014-06-30 | Xencor, Inc. | Optimirana protitelesa, ki ciljajo CD19 |
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| CA2691075C (en) | 2007-06-15 | 2017-04-11 | Daniela Gast | Treatment of tumors using specific anti-l1 antibody |
| EP2535349A1 (en) | 2007-09-26 | 2012-12-19 | UCB Pharma S.A. | Dual specificity antibody fusions |
| US20090162359A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Christian Klein | Bivalent, bispecific antibodies |
| US9266967B2 (en) | 2007-12-21 | 2016-02-23 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
| US8227577B2 (en) * | 2007-12-21 | 2012-07-24 | Hoffman-La Roche Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
| EP2132228B1 (en) | 2008-04-11 | 2011-06-22 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof |
| EP2285397B1 (en) | 2008-04-18 | 2017-07-19 | The General Hospital Corporation | Immunotherapies employing self-assembling vaccines |
| DK2334705T3 (en) * | 2008-09-26 | 2017-03-27 | Ucb Biopharma Sprl | BIOLOGICAL PRODUCTS |
| US9260522B2 (en) | 2008-10-01 | 2016-02-16 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens |
| US8268314B2 (en) * | 2008-10-08 | 2012-09-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies |
| WO2010112194A1 (en) | 2009-04-02 | 2010-10-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antigen-binding polypeptides and multispecific antibodies comprising them |
| JP5501439B2 (ja) | 2009-04-02 | 2014-05-21 | ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト | 完全長抗体と単鎖Ｆａｂフラグメントとを含む多重特異的抗体 |
| EP2417159A1 (en) | 2009-04-07 | 2012-02-15 | Roche Glycart AG | Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies |
| MX2011010158A (es) | 2009-04-07 | 2011-10-17 | Roche Glycart Ag | Anticuerpos biespecificos anti-erbb-2/anti-c-met. |
| KR101456326B1 (ko) | 2009-04-07 | 2014-11-12 | 로슈 글리카트 아게 | 3가, 이중특이적 항체 |
| US9676845B2 (en) | 2009-06-16 | 2017-06-13 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bispecific antigen binding proteins |
| CN104945509A (zh) | 2009-09-16 | 2015-09-30 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 包含卷曲螺旋和/或系链的蛋白质复合体及其用途 |
| US20110206672A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-08-25 | Melvyn Little | Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof |
| TW201138821A (en) | 2010-03-26 | 2011-11-16 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
| AR080794A1 (es) * | 2010-03-26 | 2012-05-09 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2 |
| CN103068846B9 (zh) | 2010-08-24 | 2016-09-28 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体 |
| EP3974453A3 (en) | 2010-11-16 | 2022-08-03 | Amgen Inc. | Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression |
| EP2655413B1 (en) | 2010-12-23 | 2019-01-16 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery |
| EP2681240B1 (en) | 2011-02-28 | 2017-08-16 | F. Hoffmann-La Roche AG | Monovalent antigen binding proteins |
| EP2681239B8 (en) | 2011-02-28 | 2015-09-09 | F. Hoffmann-La Roche AG | Antigen binding proteins |
| BR112014019579A2 (pt) | 2012-02-10 | 2019-10-15 | Genentech, Inc | Anticorpo de cadeia única, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo de cadeia única, heteromultímero e método de produção do heteromultímero |
| BR112014024903A2 (pt) | 2012-04-05 | 2017-07-11 | Hoffmann La Roche | anticorpos biespecíficos contra tweak humanao e il17 humana e seus usos |
| US9062120B2 (en) | 2012-05-02 | 2015-06-23 | Janssen Biotech, Inc. | Binding proteins having tethered light chains |
| JP6628966B2 (ja) | 2012-06-14 | 2020-01-15 | 中外製薬株式会社 | 改変されたＦｃ領域を含む抗原結合分子 |
| RU2639287C2 (ru) | 2012-06-27 | 2017-12-20 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения |
| WO2014001325A1 (en) | 2012-06-27 | 2014-01-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof |
| EP3138578B1 (en) | 2012-07-04 | 2022-01-12 | F. Hoffmann-La Roche AG | Anti-theophylline antibodies and methods of use |
| CN104411725B (zh) | 2012-07-04 | 2018-09-28 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 抗生物素抗体及使用方法 |
| CN104428006B (zh) | 2012-07-04 | 2017-09-08 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 共价连接的抗原‑抗体缀合物 |
| JP6154900B2 (ja) | 2012-07-13 | 2017-06-28 | ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト | 二重特異性抗ｖｅｇｆ／抗ａｎｇ−２抗体及び眼血管疾患の処置におけるそれらの使用 |
| PL2953972T3 (pl) | 2013-02-05 | 2021-03-08 | Engmab Sàrl | Metoda wyboru przeciwciał przeciwko bcma |
| EP2762496A1 (en) | 2013-02-05 | 2014-08-06 | EngMab AG | Method for the selection of antibodies against BCMA |
| EP2968547B1 (en) * | 2013-03-15 | 2019-08-07 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Multimerization technologies |
| EP2789630A1 (en) | 2013-04-09 | 2014-10-15 | EngMab AG | Bispecific antibodies against CD3e and ROR1 |
| CN104341504B (zh) | 2013-08-06 | 2017-10-24 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 双特异性抗体 |
| WO2015052230A1 (en) | 2013-10-11 | 2015-04-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies |
| CN113307873A (zh) | 2013-11-11 | 2021-08-27 | 中外制药株式会社 | 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子 |
| SI3083680T1 (sl) | 2013-12-20 | 2020-06-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Humanizirana protitelesa proti beljakovini Tau(pS422) in postopki uporabe |
| WO2015101587A1 (en) | 2014-01-03 | 2015-07-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof |
| US10561737B2 (en) | 2014-01-03 | 2020-02-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles |
| CA2930046A1 (en) | 2014-01-03 | 2015-07-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates |
| JOP20200094A1 (ar) | 2014-01-24 | 2017-06-16 | Dana Farber Cancer Inst Inc | جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها |
| JOP20200096A1 (ar) | 2014-01-31 | 2017-06-16 | Children’S Medical Center Corp | جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها |
| ME03558B (me) | 2014-03-14 | 2020-07-20 | Novartis Ag | Molekuli anti-lag-3 antiтela i njihove upotrebe |
| EP3593812A3 (en) | 2014-03-15 | 2020-05-27 | Novartis AG | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor |
| AU2015243246B2 (en) | 2014-04-10 | 2018-09-06 | Obi Pharma Inc. | Antibodies, pharmaceutical compositions and uses thereof |
| RU2577226C2 (ru) * | 2014-04-10 | 2016-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью, "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") | Способ получения биспецифических антител против cd3*cd19 формата флексибоди в клетках млекопитающих |
| EP2930188A1 (en) | 2014-04-13 | 2015-10-14 | Affimed Therapeutics AG | Trifunctional antigen-binding molecule |
| RU2568910C2 (ru) * | 2014-04-18 | 2015-11-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") | Фармацевтические композиции на основе флексибоди против cd3*cd19 для лечения в-клеточных заболеваний |
| EP3148580B1 (en) | 2014-05-29 | 2021-01-20 | MacroGenics, Inc. | Tri-specific binding molecules that specifically bind to multiple cancer antigens and methods of use thereof |
| TWI693232B (zh) | 2014-06-26 | 2020-05-11 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法 |
| AR100978A1 (es) | 2014-06-26 | 2016-11-16 | Hoffmann La Roche | LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS |
| BR112016030740A2 (pt) | 2014-07-01 | 2018-02-20 | Pfizer Inc. | diacorpos heterodiméricos biespecíficos e seus usos |
| US9212225B1 (en) | 2014-07-01 | 2015-12-15 | Amphivena Therapeutics, Inc. | Bispecific CD33 and CD3 binding proteins |
| JP2017528433A (ja) | 2014-07-21 | 2017-09-28 | ノバルティス アーゲー | 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ |
| US10174095B2 (en) | 2014-07-21 | 2019-01-08 | Novartis Ag | Nucleic acid encoding a humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor |
| US9777061B2 (en) | 2014-07-21 | 2017-10-03 | Novartis Ag | Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor |
| WO2016014553A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Novartis Ag | Sortase synthesized chimeric antigen receptors |
| ES2781175T3 (es) | 2014-07-31 | 2020-08-31 | Novartis Ag | Subconjunto optimizado de células T que contienen un receptor de antígeno quimérico |
| EP2982693A1 (en) | 2014-08-07 | 2016-02-10 | Affimed Therapeutics AG | CD3 binding domain |
| AU2015301460B2 (en) | 2014-08-14 | 2021-04-08 | Novartis Ag | Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor |
| JP7084138B2 (ja) | 2014-08-19 | 2022-06-14 | ノバルティス アーゲー | 癌処置に使用するための抗ｃｄ１２３キメラ抗原受容体（ｃａｒ） |
| WO2016043577A1 (en) | 2014-09-16 | 2016-03-24 | Academisch Medisch Centrum | Ig-like molecules binding to bmp4 |
| CA2961636A1 (en) | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Boris ENGELS | Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy |
| AP2017009823A0 (en) | 2014-09-26 | 2017-03-31 | Macrogenics Inc | Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd19 and cd3, and uses thereof |
| EP3204415B1 (en) | 2014-10-09 | 2020-06-17 | EngMab Sàrl | Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1 |
| CU20170052A7 (es) | 2014-10-14 | 2017-11-07 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 |
| TWI831044B (zh) | 2014-11-11 | 2024-02-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗原結合分子、包含抗原結合分子的醫藥組合物以及製造及選擇抗原結合分子之方法 |
| US20180334490A1 (en) | 2014-12-03 | 2018-11-22 | Qilong H. Wu | Methods for b cell preconditioning in car therapy |
| ES2764111T3 (es) | 2014-12-03 | 2020-06-02 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos multiespecíficos |
| CN104829727B (zh) * | 2015-01-21 | 2019-03-12 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种双特异性抗体cd19×cd3的构建及应用 |
| CN104829726B (zh) * | 2015-01-21 | 2019-03-05 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种双特异性抗体cd19xcd3的构建及应用 |
| US10501552B2 (en) | 2015-01-26 | 2019-12-10 | Macrogenics, Inc. | Multivalent molecules comprising DR5-binding domains |
| RU2021121771A (ru) | 2015-04-08 | 2022-01-12 | Новартис Аг | Cd20 терапия, cd22 терапия и комбинированная терапия клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (car) к cd19 |
| WO2016168694A1 (en) * | 2015-04-15 | 2016-10-20 | Ohio State Innovation Foundation | Engineered calmodulin for treatment of ryanopathies |
| WO2016172583A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker |
| EP3302555A4 (en) | 2015-05-29 | 2018-07-11 | Amphivena Therapeutics, Inc. | Methods of using bispecific cd33 and cd3 binding proteins |
| TWI773646B (zh) | 2015-06-08 | 2022-08-11 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 結合lag-3的分子和其使用方法 |
| WO2016201282A2 (en) * | 2015-06-12 | 2016-12-15 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd | TGF-β3 SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS AND USES THEREOF |
| EA201890041A1 (ru) | 2015-06-15 | 2018-07-31 | Нумаб Инновейшн Аг | Гетеродимерный полиспецифичный формат антител |
| CN113929779A (zh) | 2015-06-24 | 2022-01-14 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 人源化的抗-Tau(pS422)抗体和使用方法 |
| WO2017019897A1 (en) | 2015-07-29 | 2017-02-02 | Novartis Ag | Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3 |
| SI3317301T1 (sl) | 2015-07-29 | 2021-10-29 | Novartis Ag | Kombinirane terapije, ki obsegajo molekule protitelesa na LAG-3 |
| PT3328419T (pt) | 2015-07-30 | 2021-11-26 | Macrogenics Inc | Moléculas de ligação pd-1 e métodos de utilização |
| KR20180042271A (ko) | 2015-08-03 | 2018-04-25 | 잉맵 에스에이알엘 | Bcma에 대응하는 단일클론 항체 |
| WO2017053469A2 (en) | 2015-09-21 | 2017-03-30 | Aptevo Research And Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
| EP3156417A1 (en) | 2015-10-13 | 2017-04-19 | Affimed GmbH | Multivalent fv antibodies |
| RU2651776C2 (ru) * | 2015-12-01 | 2018-04-23 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") | Биспецифические антитела против cd3*cd19 |
| SG11201804839WA (en) | 2015-12-14 | 2018-07-30 | Macrogenics Inc | Bispecific molecules having immunoreactivity with pd-1 and ctla-4, and methods of use thereof |
| WO2017106810A2 (en) | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Novartis Ag | Combination of c-met inhibitor with antibody molecule to pd-1 and uses thereof |
| JP2019503349A (ja) | 2015-12-17 | 2019-02-07 | ノバルティス アーゲー | Ｐｄ−１に対する抗体分子およびその使用 |
| CN108712908A (zh) * | 2016-01-08 | 2018-10-26 | 梅迪托普生物科学有限公司 | 自交联抗体 |
| US20210198368A1 (en) | 2016-01-21 | 2021-07-01 | Novartis Ag | Multispecific molecules targeting cll-1 |
| WO2017142928A1 (en) | 2016-02-17 | 2017-08-24 | Macrogenics, Inc. | Ror1-binding molecules, and methods of use thereof |
| BR112018067679A2 (pt) | 2016-03-04 | 2019-01-15 | Novartis Ag | células que expressam múltiplas moléculas do receptor de antígeno quimérico (car) e seu uso |
| CN109562154A (zh) | 2016-03-10 | 2019-04-02 | 爱普瑞希斯有限公司 | 带有修饰hsp70域的抗原结合融合蛋白 |
| WO2017165683A1 (en) | 2016-03-23 | 2017-09-28 | Novartis Ag | Cell secreted minibodies and uses thereof |
| HRP20230457T1 (hr) | 2016-04-15 | 2023-07-21 | Novartis Ag | Pripravci i postupci za selektivnu ekspresiju kimernih antigenskih receptora |
| SG11201808979UA (en) | 2016-04-15 | 2018-11-29 | Macrogenics Inc | Novel b7-h3 binding molecules, antibody drug conjugates thereof and methods of use thereof |
| EP3464375A2 (en) | 2016-06-02 | 2019-04-10 | Novartis AG | Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells |
| AU2017295886C1 (en) | 2016-07-15 | 2024-01-25 | Novartis Ag | Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor |
| US20190151365A1 (en) | 2016-07-28 | 2019-05-23 | Novartis Ag | Combination therapies of chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors |
| US20190161542A1 (en) | 2016-08-01 | 2019-05-30 | Novartis Ag | Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule |
| WO2018067992A1 (en) | 2016-10-07 | 2018-04-12 | Novartis Ag | Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer |
| MX2019004621A (es) | 2016-11-02 | 2019-11-28 | Engmab Sarl | Anticuerpo biespecifico contra bcma y cd3 y un farmaco inmunologico para uso combinado en el tratamiento del mieloma multiple. |
| CA3045857A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Universita Degli Studi Magna Graecia Catanzaro | A monoclonal antibody targeting a unique sialoglycosilated cancer-associated epitope of cd43 |
| BR112019012950A2 (pt) | 2016-12-23 | 2019-11-26 | Macrogenics Inc | molécula de ligação a adam9, composição farmacêutica, uso da molécula de ligação a adam9 e método para tratar uma doença ou condição associada ou caracterizada pela expressão de adam9 em um indivíduo |
| EP4043485A1 (en) | 2017-01-26 | 2022-08-17 | Novartis AG | Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy |
| AU2018224094A1 (en) | 2017-02-24 | 2019-09-19 | Macrogenics, Inc. | Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof |
| WO2018160731A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Novartis Ag | Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy |
| EP3615055A1 (en) | 2017-04-28 | 2020-03-04 | Novartis AG | Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor |
| US20200179511A1 (en) | 2017-04-28 | 2020-06-11 | Novartis Ag | Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor |
| ES2967739T3 (es) | 2017-06-05 | 2024-05-03 | Numab Therapeutics AG | Formato de anticuerpo heterodimérico multiespecífico dirigido al menos a CD3 y a HSA |
| WO2018237157A1 (en) | 2017-06-22 | 2018-12-27 | Novartis Ag | CD73 BINDING ANTIBODY MOLECULES AND USES THEREOF |
| CA3066747A1 (en) | 2017-06-27 | 2019-01-03 | Novartis Ag | Dosage regimens for anti-tim-3 antibodies and uses thereof |
| PE20200757A1 (es) | 2017-07-11 | 2020-07-27 | Compass Therapeutics Llc | Anticuerpos agonistas que se unen a cd137 humano y sus usos |
| CN111163798A (zh) | 2017-07-20 | 2020-05-15 | 诺华股份有限公司 | 用于抗lag-3抗体的给药方案及其用途 |
| US20210179709A1 (en) | 2017-10-31 | 2021-06-17 | Novartis Ag | Anti-car compositions and methods |
| WO2019089753A2 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Compass Therapeutics Llc | Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof |
| CA3081602A1 (en) | 2017-11-16 | 2019-05-23 | Novartis Ag | Combination therapies |
| EP3713961A2 (en) | 2017-11-20 | 2020-09-30 | Compass Therapeutics LLC | Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof |
| US11952422B2 (en) | 2017-12-05 | 2024-04-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137 |
| AU2018385409A1 (en) | 2017-12-12 | 2020-07-02 | Macrogenics Inc. | Bispecific CD 16-binding molecules and their use in the treatment of disease |
| US10561686B2 (en) | 2018-01-12 | 2020-02-18 | Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. | Modified cell expansion and uses thereof |
| WO2019140100A1 (en) * | 2018-01-11 | 2019-07-18 | Innovative Cellular Therapeutics Inc. | Modified cell expansion and uses thereof |
| CA3090249A1 (en) | 2018-01-31 | 2019-08-08 | Novartis Ag | Combination therapy using a chimeric antigen receptor |
| JP7337079B2 (ja) | 2018-02-15 | 2023-09-01 | マクロジェニクス，インコーポレーテッド | 変異型ｃｄ３結合ドメイン、及び疾患の治療のための併用療法におけるその使用 |
| US20210147547A1 (en) | 2018-04-13 | 2021-05-20 | Novartis Ag | Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof |
| US10869888B2 (en) | 2018-04-17 | 2020-12-22 | Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. | Modified cell expansion and uses thereof |
| EP3784351A1 (en) | 2018-04-27 | 2021-03-03 | Novartis AG | Car t cell therapies with enhanced efficacy |
| WO2019226658A1 (en) | 2018-05-21 | 2019-11-28 | Compass Therapeutics Llc | Multispecific antigen-binding compositions and methods of use |
| EP3797120A1 (en) | 2018-05-21 | 2021-03-31 | Compass Therapeutics LLC | Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by nk cells |
| US20210213063A1 (en) | 2018-05-25 | 2021-07-15 | Novartis Ag | Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies |
| WO2019232244A2 (en) | 2018-05-31 | 2019-12-05 | Novartis Ag | Antibody molecules to cd73 and uses thereof |
| EP3806962A1 (en) | 2018-06-13 | 2021-04-21 | Novartis AG | Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof |
| CA3104295A1 (en) | 2018-06-19 | 2019-12-26 | Atarga, Llc | Antibody molecules to complement component 5 and uses thereof |
| AR116109A1 (es) | 2018-07-10 | 2021-03-31 | Novartis Ag | Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos |
| WO2020021465A1 (en) | 2018-07-25 | 2020-01-30 | Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. | Method of treatment of neuroendocrine tumors |
| US20220348682A1 (en) | 2018-08-30 | 2022-11-03 | Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. | Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor |
| WO2020089437A1 (en) | 2018-10-31 | 2020-05-07 | Engmab Sàrl | Combination therapy |
| AU2019370339A1 (en) * | 2018-11-01 | 2021-06-10 | Shandong New Time Pharmaceutical Co., Ltd. | Bispecific antibody and use thereof |
| US11046769B2 (en) | 2018-11-13 | 2021-06-29 | Compass Therapeutics Llc | Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof |
| US10918667B2 (en) | 2018-11-20 | 2021-02-16 | Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. | Modified cell expressing therapeutic agent and uses thereof |
| JP2022514315A (ja) | 2018-12-20 | 2022-02-10 | ノバルティス アーゲー | ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与計画及び薬剤組み合わせ |
| AU2019400978A1 (en) | 2018-12-20 | 2021-06-24 | Novartis Ag | Extended low dose regimens for MDM2 inhibitors |
| KR20210129672A (ko) | 2019-02-15 | 2021-10-28 | 노파르티스 아게 | 치환된 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도 |
| US10871640B2 (en) | 2019-02-15 | 2020-12-22 | Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh | Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects |
| CA3124935A1 (en) | 2019-02-15 | 2020-08-20 | Novartis Ag | 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof |
| EP3927371A1 (en) | 2019-02-22 | 2021-12-29 | Novartis AG | Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors |
| MX2021011830A (es) | 2019-03-29 | 2022-01-24 | Atarga Llc | Anticuerpo anti fgf23. |
| EP3994170A1 (en) | 2019-07-01 | 2022-05-11 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Treatment and prevention of ischemic diseases and/or ischemic tissue damages |
| KR20220103947A (ko) | 2019-10-21 | 2022-07-25 | 노파르티스 아게 | 베네토클락스 및 tim-3 억제제를 사용한 조합 요법 |
| BR112022007179A2 (pt) | 2019-10-21 | 2022-08-23 | Novartis Ag | Inibidores de tim-3 e usos dos mesmos |
| CN114761037A (zh) | 2019-11-26 | 2022-07-15 | 诺华股份有限公司 | 结合bcma和cd19的嵌合抗原受体及其用途 |
| CN115052662A (zh) | 2019-12-20 | 2022-09-13 | 诺华股份有限公司 | 抗TGFβ抗体和检查点抑制剂用于治疗增殖性疾病的用途 |
| EP4090762A1 (en) | 2020-01-17 | 2022-11-23 | Becton, Dickinson and Company | Methods and compositions for single cell secretomics |
| MX2022008763A (es) | 2020-01-17 | 2022-07-27 | Novartis Ag | Combinacion que comprende un inhibidor de tim-3 y un agente hipometilante para usarse en el tratamiento del sindrome mielodisplasico o leucemia mielomonocitica cronica. |
| WO2021163364A1 (en) * | 2020-02-12 | 2021-08-19 | Abbvie Biotechnology Ltd. | Trispecific binding molecules |
| WO2021173995A2 (en) | 2020-02-27 | 2021-09-02 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
| CN115397866A (zh) | 2020-03-31 | 2022-11-25 | 中外制药株式会社 | 靶向dll3的多特异性抗原结合分子及其用途 |
| EP3892720A1 (en) * | 2020-04-06 | 2021-10-13 | Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. | Presenting cell and use thereof in cell therapy |
| CA3184351A1 (en) * | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Amgen Inc. | Bispecific binding constructs |
| JP2023531676A (ja) | 2020-06-23 | 2023-07-25 | ノバルティス アーゲー | ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピぺリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与レジメン |
| EP4175650A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-05-10 | Kiromic BioPharma, Inc. | Mesothelin isoform binding molecules and chimeric pd1 receptor molecules, cells containing the same and uses thereof |
| MX2023000547A (es) | 2020-07-16 | 2023-02-13 | Novartis Ag | Anticuerpos anti-betacelulina, fragmentos de los mismos, y moleculas de union multiespecificas. |
| WO2022026592A2 (en) | 2020-07-28 | 2022-02-03 | Celltas Bio, Inc. | Antibody molecules to coronavirus and uses thereof |
| CN116134027A (zh) | 2020-08-03 | 2023-05-16 | 诺华股份有限公司 | 杂芳基取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途 |
| KR102607909B1 (ko) | 2020-08-19 | 2023-12-01 | 젠코어 인코포레이티드 | 항-cd28 조성물 |
| WO2022043557A1 (en) | 2020-08-31 | 2022-03-03 | Advanced Accelerator Applications International Sa | Method of treating psma-expressing cancers |
| EP4204020A1 (en) | 2020-08-31 | 2023-07-05 | Advanced Accelerator Applications International S.A. | Method of treating psma-expressing cancers |
| WO2022097065A2 (en) | 2020-11-06 | 2022-05-12 | Novartis Ag | ANTIBODY Fc VARIANTS |
| CA3198447A1 (en) | 2020-11-13 | 2022-05-19 | Novartis Ag | Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells |
| WO2022108627A1 (en) | 2020-11-18 | 2022-05-27 | Kiromic Biopharma, Inc.Kiromic Biopharma, Inc. | Gamma-delta t cell manufacturing processes and chimeric pd1 receptor molecules |
| WO2022162569A1 (en) | 2021-01-29 | 2022-08-04 | Novartis Ag | Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof |
| TW202304979A (zh) | 2021-04-07 | 2023-02-01 | 瑞士商諾華公司 | 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途 |
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