ES2256842T4 - Vector de adenovirus recombinante y metodos de uso. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION PROPONE UN VECTOR RECOMBINANTE DE EXPRESION DE ADENOVIRUS CARACTERIZADO POR LA DELECION PARCIAL O TOTAL DE LA PROTEINA ADENOVIRAL IX ADN, QUE PRESENTA UN GEN QUE CODIFICA UNA PROTEINA EXTRAÑA O UN FRAGMENTO FUNCIONAL O UN MUTANTE DEL MISMO. LA INVENCION TAMBIEN INCLUYEN CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS Y UN METODO PARA PRODUCIR PROTEINAS RECOMBINANTES Y TERAPIA GENICA. ASI POR EJEMPLO, EL VECTOR ADENOVIRAL DE ESTA INVENCION PUEDE CONTENER UN GEN EXTRAÑO PARA EXPRESAR UNA PROTEINA EFICAZ PARA REGULAR EL CICLO CELULAR, COMO P53, RB O MITOSINA, O PARA INDUCIR LA MUERTE CELULAR, COMO EL GEN SUICIDA CONDICIONAL DE TIMIDINA QUINASA (ESTE ULTIMO DEBE UTILIZARSE JUNTO CON UN METABOLITO DE TIMIDINA QUINASA PARA QUE RESULTE EFICAZ).
Description
Vector de adenovirus recombinante y métodos de
uso.
Esta solicitud es una continuación en parte del
documento U.S. nº de serie 0,8/233.777, presentado el 19 de mayo de
1994, que es una continuación en parte del documento U.S. nº de
serie 0,8/142.669 presentado el 25 de octubre de 1993.
En toda esta solicitud, se alude a varias
publicaciones mediante citas entre paréntesis y en la descripción
bibliográfica, que precede inmediatamente a las
reivindicaciones.
La producción de adenovirus recombinantes útiles
para la terapia génica requiere la utilización de una línea celular
capaz de proporcionar en trans los productos génicos de la zona
vírica E1 que se eliminan en estos virus recombinantes. Actualmente
la única línea celular útil disponible es la línea celular 293
descrita originalmente por Graham et al. en 1977. Las células
293 contienen aproximadamente el 12% a la izquierda (4,3 kb) del
genoma del adenovirus tipo 5 (Aiello (1979) y Spector. (1983)).
Los vectores adenovíricos que están siendo
probados actualmente para aplicaciones en terapia génica normalmente
se eliminan para el ADN de Ad2 o Ad5 que se prolonga desde
aproximadamente 400 pares de bases desde el extremo 5' del genoma
vírico hasta aproximadamente 3,3 kb del extremo 5', para una
deleción total de E1 de 2,9 kb. Por consiguiente, existe una zona
limitada de homología de aproximadamente 1 kb entre la secuencia de
ADN del virus recombinante y el ADN de Ad5 en la línea celular. Esta
homología define una zona de recombinación potencial entre las
secuencias de adenovirus vírica y celular. Dicha recombinación
produce un virus con fenotipo natural que lleva la zona E1 de Ad5 de
las células 293. Este episodio de recombinación supuestamente se
tiene en cuenta para la detección frecuente del adenovirus natural
en las preparaciones de virus recombinante y se ha demostrado
directamente que es la causa de la contaminación natural del virus
Ad2/CFTR-1 recombinante a base de Ad2 (Rich et
al., (1993)).
Debido al alto grado de homología de la
secuencia dentro del subgrupo del adenovirus tipo C dicha
recombinación es probable que se produzca si el vector se basa en
cualquier adenovirus del grupo C (tipos 1, 2, 5 y 6).
En la producción a pequeña escala de los
adenovirus recombinantes, la generación del virus natural
contaminante puede ser gestionada por un proceso de identificación
que descarta aquellas preparaciones de virus que se observa que
están contaminadas. A medida que crece la escala de producción del
virus para satisfacer la demanda esperada de productos terapéuticos
genéticos, la probabilidad de que cualquier lote individual esté
contaminado con un virus natural también aumentará así como la
dificultad de proporcionar preparaciones recombinantes no
contaminadas.
Existirán más de un millón de nuevos casos de
cáncer diagnosticados este año y la mitad de esta cifra serán
muertes relacionadas con el cáncer (American Cáncer Society, 1993).
Las mutaciones p53 son las alteraciones genéticas más frecuentes
relacionadas con los cánceres humanos, que se producen en el 50 al
60% de los cánceres humanos (Hollstein et al. (1991); Bartek
et al. (1991); Levine (1993)). El objetivo de la terapia
génica en el tratamiento de los tumores con insuficiencia de p53,
por ejemplo, consiste en reinstalar una copia normal y operativa del
gen p53 natural de modo que se rehabilite este control de
proliferación celular. p53 desempeña una función central en la
evolución del ciclo celular, deteniendo el crecimiento de modo que
pueda tener lugar esta reparación o apoptosis en respuesta a la
alteración del ADN. Recientemente se ha identificado el p53 natural
como componente necesario para la apoptosis inducida por irradiación
o el tratamiento con algunos agentes quimioterapéuticos (Lowe et
al. (1993) A y B). Debido al gran número de casos de las
mutaciones de p53 en tumores humanos, es posible que los tumores que
se han vuelto refractarios a la quimioterapia y a los tratamientos
de irradiación puedan haberse vuelto así debido en parte a la falta
de p53 natural. Volviendo a suministrar p53 operativo a estos
tumores, es razonable que ahora sean sensibles a la apoptosis
normalmente asociada a la alteración del ADN inducida por radiación
y quimioterapia.
Uno de los puntos críticos en la terapia génica
lograda del supresor del tumor humano es la capacidad para afectar
una fracción significativa de células cancerosas. Se ha explorado en
gran medida la utilización de vectores retrovíricos con esta
finalidad en varios modelos de tumor. Por ejemplo, para el
tratamiento de cánceres hepáticos, se han empleado vectores
retrovíricos con poco éxito debido a que estos vectores no son
capaces de conseguir el alto nivel de transferencia génica requerido
para la terapia génica in vivo (Huber, B. E. et al.,
1991; Caruso M. et al., 1993).
Para conseguir una fuente más continua de
producción de virus, los investigadores han intentado resolver el
problema relacionado con el bajo nivel de transferencia génica
mediante la inyección directa de líneas celulares de empaquetamiento
retrovírico en tumores sólidos (Caruso, M. et al., 1993;
Ezzidine, Z. D. et al., 1991; Culver, K. W. et al.,
1992). Sin embargo, estos métodos son insatisfactorios para su
utilización en pacientes humanos porque el método es engorroso e
induce una respuesta inflamatoria contra la línea celular de
empaquetamiento en el paciente. Otro inconveniente de los vectores
retrovíricos es que requieren células en división para integrar y
expresar eficazmente el gen recombinante de interés (Huber, B. E.
1991). La integración estable en un gen huésped esencial puede
conducir al desarrollo o a la herencia de enfermedades
patógenas.
Los adenovirus recombinantes presentan distintas
ventajas sobre los métodos de administración retrovírica y otros de
administración génica (para estudios, véase Siegfried (1993)). Nunca
se ha demostrado que los adenovirus induzcan tumores en el hombre y
se han utilizado satisfactoriamente como vacunas atenuadas (Straus
(1984)). Los adenovirus recombinantes con replicación insuficiente
pueden producirse sustituyendo la zona E1 necesaria para la
replicación con el gen diana. Los adenovirus no se integran en el
genoma humano como consecuencia normal de la infección, reduciendo
de este modo en gran medida el riesgo de mutagénesis de inserción
posible con vectores víricos retrovíricos o adenoasociados (AAV).
Esta falta de integración estable conduce asimismo a una
característica de seguridad adicional en la que el efecto del gen
transferido será temporal, ya que el ADN extracromosómico se perderá
gradualmente con la división continua de las células normales. El
adenovirus estable, recombinante con título elevado puede producirse
a concentraciones no alcanzables con retrovirus o AAV, permitiendo
que se produzca suficiente material para tratar una gran población
de pacientes. Además los vectores son capaces de transferencia
génica in vivo muy eficaz en una amplia gama de tipos de
tejido y de células tumorales. Por ejemplo, otros han demostrado que
la administración del gen mediado por adenovirus presenta un fuerte
potencial para la terapia génica para enfermedades tales como la
fibrosis quística (Rosenfeld et al. (1992); Rich et
al. (1993)) y la insuficiencia en
\alpha_{1}-antitripsina (Lemarchand et
al. (1992)). Aunque otras alternativas para la administración el
gen, tales como los complejos de liposoma catiónico/ADN, se están
explorando también actualmente, ninguna todavía parece ser eficaz
como administración génica mediada por adenovirus.
Como en el tratamiento de los tumores con
insuficiencia de p53, el objetivo de la terapia génica para otros
tumores consiste en reinstalar el control de la proliferación
celular. En el caso del p53, la introducción de un gen operativo
reinstala el control del ciclo celular permitiendo la muerte de la
célula apoptósica inducida por agentes terapéuticos. Asimismo, es
igualmente aplicable la terapia génica a otros genes supresores del
tumor que pueden utilizarse solos o en combinación con agentes
terapéuticos para controlar la evolución del ciclo celular de las
células tumorales y/o inducir la muerte celular. Además, los genes
que no codifican las proteínas reguladoras del ciclo celular, pero
inducen directamente la muerte celular tales como los genes
suicidas o, los genes que son directamente tóxicos para la célula
pueden utilizarse en los protocolos de terapia génica para eliminar
directamente la evolución del ciclo celular de las células
tumorales.
Independientemente de qué gen se utilice para
reinstalar el control de la evolución del ciclo celular, la
aplicabilidad lógica y práctica de este método es idéntica. Es
decir, conseguir grandes eficacias de transferencia génica para
expresar cantidades terapéuticas del producto recombinante. La
elección de qué vector utilizar para permitir la transferencia
génica con gran eficacia con mínimo riesgo para el paciente es por
lo tanto importante en el contexto del éxito del tratamiento de la
terapia génica.
Por lo tanto, existe necesidad de vectores y
métodos que proporcionen eficacias de transferencia génica a alto
nivel y expresión proteica que proporcione tratamientos de terapia
génica seguros y eficaces. La presente invención satisface esta
necesidad y proporciona también ventajas relacionadas.
Esta invención proporciona un vector de
expresión de adenovirus recombinante caracterizado por una deleción
total del ADN adenovírico con proteína IX y que tiene un gen que
codifica una proteína extraña o un fragmento operativo o uno de sus
mutantes.
Por lo tanto, por ejemplo, el vector adenovírico
de esta invención puede contener un gen extraño para la expresión de
una proteína eficaz en la regulación del ciclo celular, tal como
p53, Rb o mitosina o en la inducción de la muerte celular, tal como
la timidina cinasa del gen suicida condicional. (Este último debe
ser utilizado junto con el metabolito de timidina cinasa para ser
eficaz).
La Figura 1 presenta un vector adenovírico
recombinante de esta invención. Este montaje se montó como se
muestra en la Figura 1. El virus resultante lleva una deleción 5' de
secuencias adenovíricas que se extienden desde el nucleótido 356 al
4.020 y elimina los genes E1a y E1b así como la secuencia de
codificación completa de la proteína IX, dejando la secuencia de
poliadenilación compartida por los genes E1b y pIX intactos para su
utilización en la transcripción de la terminación de cualquier gen
deseado.
La Figura 2 presenta la secuencia de aminoácidos
de p110^{RB}.
La Figura 3 presenta una secuencia de ADN que
codifica una proteína supresora del tumor retinoblastoma.
La Figura 4 presenta el esquema de los montajes
de p53 recombinante/adenovirus con el alcance de esta invención. Los
recombinantes p53 están basados en Ad5 y han tenido la zona E1 de
los nucleótidos 360 a 3.325 sustituida por un ADNc de p53 completo
de 1,4 kb dirigido por los activadores de Ad2 MLP (A/M/53) o CMV
humano (A/C/53) seguido del ADNc principal del tripartito Ad2. El
virus de referencia A/M presenta las mismas deleciones de Ad5 que el
virus A/M/53 pero carece de la inserción del ADNc de p53 de 1,4 kb.
La secuencia de E1b restante (705 nucleótidos), ha sido eliminada
para crear los montajes A/M/N/53 y A/C/N/53 eliminados de la
proteína IX. Estos montajes también tienen una deleción Xba I de 1,9
kb dentro de la zona E3 del adenovirus tipo 5.
Las Figuras 5A y 5B presentan la expresión de la
proteína p53 en las células tumorales infectadas con A/M/53 y
A/C/53. Figura 5A) Se infectaron células Saos-2
(osteosarcoma) a las multiplicidades de infección (MOI) indicadas
con el virus purificado A/M/53 o A/C/53 y se recogieron 24 horas
después. Se utilizó la pAb 1801 del anticuerpo p53 para teñir
inmunotransferencias de muestras cargadas a concentraciones iguales
de proteína total. Concentración igual de proteína de extractos
celulares SW480, que sobrexpresa la proteína mutante p53 se utilizó
como marcador para el tamaño de p53. "O" bajo el encabezamiento
A/C/53 indica una infección simulada que contiene el lisado sin
tratar de Saos-2. Figura 5B) Se infectaron células
Hep 3B (carcinoma hepatocelular) con virus de A/M/53 o A/C/53 a la
MOI indicada y se analizaron como en el apartado A). La flecha
indica la posición de la proteína p53.
Las Figuras 6A a 6C presentan el cambio de
morfología de Saos-2 dependiente de p53. Las células
Saos-2 subconfluentes (1 \times 10^{5}
células/placa de 10 cm) estaban sin infectar (A), infectadas a una
MOI = 50 con (B) el virus A/M de referencia o (C) el virus A/C/53.
Se fotografiaron las células 72 horas después de la infección.
La Figura 7 presenta la inhibición de la
síntesis del ADN dependiente de p53 en las líneas celulares de tumor
humano por A/M/N/53 y A/C/N/53. Se infectaron nueve líneas celulares
tumorales diferentes con adenovirus A/M (-x-x-) de
referencia, o virus A/M/N/53 (-\Delta-\Delta-) o
A/C/N53 (-O-O-) que expresan a p53 a MOI creciente
como se indica. Se indica el tipo de tumor y el estado de p53 para
cada línea celular (wt = tipo natural, nulo = ninguna proteína
expresada, mut = proteína mutante expresada). Se midió la síntesis
de ADN 72 horas después de la infección como se describe más
adelante en el Experimento nº II. Los resultados proceden de
mediciones por triplicado a cada dosis (media +/- SD) y se
representan como % de la referencia media frente a MOI. * Las
células H69 se probaron solamente con virus A/M y A/M/N53.
La Figura 8 presenta la tumorigenicidad de las
células Saos-2 infectadas con p53 en ratones
lampiños. Se infectaron células Saos-2 con el virus
A/M de referencia o el A/M/N/53 recombinante de p53 a MOI = 30. Se
inyectaron por vía subcutánea las células tratadas en los costados
de los ratones lampiños y se midieron las dimensiones del tumor
(como se describe en el Experimento nº II) dos veces a la semana
durante 8 semanas. Los resultados se representan como tamaño del
tumor frente a los días después de la implantación de la célula
tumoral para ambas células tratadas A/M de referencia
(-x-x-) y A/M/N/53
(-\Delta-\Delta-). Las barras de error
representan el tamaño del tumor medio =/- SEM para cada grupo de 4
animales en cada punto de tiempo.
La Figura 9 es la expresión del ARN de rAd/p53
en tumores demostrados. Se inyectaron por vía subcutánea células H69
(SCLC) en ratones lampiños y se dejaron desarrollar los tumores
durante 32 días hasta que alcanzaron un tamaño de aproximadamente 25
a 50 mm^{3}. Se distribuyeron al azar los ratones y se les inyectó
por vía peritumoral 2 \times 10^{9} pfu de virus
A/C/\beta-gal de referencia o A/C/53. Se
escindieron los tumores 2 y 7 días tras la inyección y se preparó
poliA ARN de cada muestra de tumor. Se realizó la
RT-PCR utilizando concentraciones iguales de ARN y
cebadores específicos para el mensaje de p53 recombinante. La
ampliación por PCR fue durante 30 ciclos a 94ºC 1 min., 55ºC 1,5
min., 72ºC 2 min. y un periodo de prolongación final de 10 min.,
72ºC en un ciclador térmico Omnigen (Hybaid). Los cebadores de PCR
utilizados fueron un ADN principal tripartito en 5'
(5'-CGCCACCGAGGGACCCTGAGC
GAGTC-3') y un cebador de p53 en 3' (5'-TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3'). Las bandas 1, 2, 4 y 5 son muestras tratadas con p53 escindidas el día 2 o 7 como se indica. Las bandas 3 y 6 son de tumores tratados con \beta-gal. Las bandas 7, 8 y 9 son réplicas de las bandas 4, 5 y 6 respectivamente, ampliadas con cebadores de actina para verificar la carga igual. La banda 10 es una referencia positiva que utiliza un plásmido que contiene tripartito/p53.
GAGTC-3') y un cebador de p53 en 3' (5'-TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3'). Las bandas 1, 2, 4 y 5 son muestras tratadas con p53 escindidas el día 2 o 7 como se indica. Las bandas 3 y 6 son de tumores tratados con \beta-gal. Las bandas 7, 8 y 9 son réplicas de las bandas 4, 5 y 6 respectivamente, ampliadas con cebadores de actina para verificar la carga igual. La banda 10 es una referencia positiva que utiliza un plásmido que contiene tripartito/p53.
Las Figura 10A y 10B presentan la supresión del
tumor in vivo y el aumento del tiempo de supervivencia con
A/M/N/53. Las células H69 (SCLC) del tumor se inyectaron por vía
subcutánea en ratones lampiños y se dejaron desarrollar durante 2
semanas. Se administraron dos veces a la semana durante un total de
8 dosis inyecciones peritumorales de tampón solo
(- - -), adenovirus A/M de referencia
(-x-x-) o A/M/N/53
(-\Delta-\Delta-), ambos virus (2 \times
10^{9} pfu/inyección). Se midieron las dimensiones del tumor dos
veces a la semana y se estimó el volumen del tumor como se describe
en el Experimento nº II. A) Se representa el tamaño del tumor para
cada virus frente al tiempo (días) después de la inoculación de
células H69. Las barras de error indican el tamaño medio del tumor
+/- SEM para cada grupo de 5 animales. Las flechas indican los días
de las inyecciones de virus. B) Se controló la supervivencia de los
ratones y se representa la fracción de ratones supervivientes por
grupo frente al tiempo tras la inoculación de células H69 tratadas
con tampón solo (- - - -), virus A/M de referencia
(\cdot \cdot \cdot
\hskip0.1cm\cdot \cdot \cdot
\hskip0.1cm\cdot \cdot \cdot) o A/M/N/53 (- - -).
Las Figuras 11A a 11C presentan cartografías de
los montajes del plásmido recombinante. Los plásmidos se
construyeron como se detalla a continuación. Las líneas en negrita
en los montajes indican los genes de interés mientras que el tipo en
negrita indica la zona de restricción utilizada para generar los
fragmentos que deben ligarse para formar el plásmido subsiguiente
como indican las flechas. En la Figura 11A, el plásmido pACNTK se
construyó subclonando el gen HSV-TK del pMLBKTK (nº
de ATCC 39369) en el polienlazador de un vector de clonación,
seguido de aislamiento del gen TK con los extremos deseados para la
clonación en el vector de pACN. El vector pACN contiene secuencias
adenovíricas necesarias para producir la recombinación in
vivo destinada a formar el adenovirus recombinante (véase la
Figura 12). En la Figura 11B, se presenta la construcción del
plásmido pAANTK empezando por los fragmentos ampliados por PCR que
codifican el potenciador de \alpha-fetoproteína
(AFP-E) y zonas del activador
(AFP-P) subclonadas a través de varias etapas en un
plásmido final en el que el potenciador y activador de AFP están
aguas arriba del gen HSV-TK seguido de las
secuencias del adenovirus Tipo 2 necesarias para que se produzca la
recombinación in vivo para formar el adenovirus recombinante.
En la Figura 11C, se presenta la construcción del plásmido pAANCAT
empezando por el aislamiento del gen de la cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT) de un plásmido disponible en el mercado y
subclonándolo en el plásmido pAAN (véase anteriormente), generando
el plásmido final pAANCAT en el que el potenciador/activador de AFP
dirige la transcripción del gen CAT en un fondo de la secuencia de
adenovirus.
La Figura 12 es una cartografía esquemática de
los adenovirus recombinantes ACNTK, AANTK y AANCAT. Para construir
adenovirus recombinantes a partir de los plásmidos descritos en la
Figura 11, se linealizaron 4 partes (20 \mug) del plásmido pACNTK,
pAANTK o pAANCAT con Eco R1 y se cotransfectaron con una parte (5
\mug) del fragmento grande de adenovirus recombinante digerido con
Cla 1 (rAC\beta-gal) que contenía una deleción de
la zona E3 (Wills et al., 1994). En los virus resultantes,
los nucleótidos 360 a 4.021 de Ad 5 se sustituyeron por el activador
de CMV y el ADNc principal tripartito (TPL) o por el potenciador de
\alpha-fetoproteína y el activador (AFP) que
dirige la expresión del gen TK o por CAT de HSV-1
como se indica. Los adenovirus recombinantes resultantes se digieren
con ACNTK, AANTK y AANCAT respectivamente.
La Figura 13 presenta la especificidad del
activador de la expresión de CAT en los vectores adenovíricos
recombinantes. Se infectaron dos (2) \times 10^{6} de las líneas
celulares diseñadas a las MOI = 30 o 100 del adenovirus recombinante
AANCAT como se indica o se dejaron sin infectar (UN). Las células
Hep G2 y Hep 3B expresan la \alpha-fetoproteína
mientras que las demás líneas celulares no. Después de tres días, se
recogieron las células, se ajustaron los volúmenes de extracto para
concentraciones de proteína totales iguales y se midió la actividad
de CAT como se describe en el apartado Métodos, más adelante. Un
número igual de células no infectadas sirvió como referencias
individuales para la actividad de fondo de CAT, mientras que el
cloranfenicol marcado con ^{14}C (solamente ^{14}C) y el
extracto de la línea celular estable (B21) que expresa la actividad
de CAT sirvió como referencias negativas y positivas
respectivamente. La conversión del porcentaje de acetil CoA está
indicada, demostrando que la expresión de CAT está limitada a
aquellas células que expresan la
\alpha-fetoproteína.
La Figura 14 presenta los efectos del
tratamiento de TK/GCV en las líneas celulares del carcinoma
hepatocelular y los efectos de la especificidad del activador. Se
infectaron las líneas celulares Hep-G2 (AFP
positiva) y HLF (AFP negativa) durante la noche con virus ACNTK [-
\Delta -], AANTK [- \ding{115} -], o ACN de referencia [- \Box
-] a una multiplicidad de infección de 30 y se trataron
sucesivamente con una sola dosis de ganciclovir a las
concentraciones indicadas. Se evaluó la proliferación celular
añadiendo ^{3}H-timidina a las células
aproximadamente 18 horas antes de la recogida. La incorporación de
^{3}H-timidina en el ácido nucleico celular se
midió 72 horas después de la infección (Top Count, Packard y se
expresó en porcentaje (media +/- S.D) de la referencia sin tratar.
Los resultados presentan una inhibición de la proliferación
dependiente de la dosis no selectiva con el montaje dirigido por
CMV, mientras TK dirigida por AFP inhibe selectivamente
Hep-G2.
La Figura 15 presenta la citotoxicidad de ACNTK
más ganciclovir en HCC. Se infectaron HLF a una MOI de 30 con ACNTK
[- \bullet -] o el virus de referencia ACN [- \Box -] y se
trataron con ganciclovir a las dosis indicadas. Setenta y dos (72)
horas después del tratamiento con ganciclovir, se midió por
colorimetría la cantidad de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada en
el sobrenadante celular y se representó (media +/- SEM) frente a la
concentración de ganciclovir para los dos grupos de virus
tratados.
Las Figuras 16A y 16B presentan el efecto de
ACNTK más ganciclovir sobre los tumores de carcinoma hepatocelular
(HCC) probados en ratones lampiños. Se inyectaron por vía subcutánea
uno (1) \times 10^{7} células Hep 3B en el costado de ratones
lampiños hembra y se dejaron desarrollar durante 27 días. Los
ratones recibieron a continuación inyecciones intratumorales y
peritumorales de virus ACNTK [- \bullet -] o ACN de referencia [-
\Box -] (1 \times 10^{9} ui en un volumen de 100 \mul) cada
dos días para un total de tres dosis (indicadas por flechas). Las
inyecciones de ganciclovir (100 mg/kg ip) comenzaron 24 horas
después de la dosis inicial de virus y continuaron durante un total
de 10 días. En la Figura 6A, se representan las dimensiones del
tumor para cada virus frente a los días después de la inyección
(media +/- SEM). En la Figura 6B, el peso corporal para cada grupo
animal tratado con virus se representa como media +/- SEM frente a
los días después de la infección.
Para reducir la frecuencia de la contaminación
con adenovirus natural, es deseable mejorar el virus o la línea
celular para reducir la probabilidad de recombinación. Por ejemplo,
un adenovirus de un grupo con baja homología con los virus del grupo
C podría utilizarse para modificar genéticamente virus recombinantes
con poca propensión a la recombinación con las secuencias Ad5 en
células 293. Sin embargo, un medio alternativo, más fácil de reducir
la recombinación entre las secuencias víricas y celulares consiste
en aumentar el tamaño de la deleción en el virus recombinante y
reducir de este modo la extensión de la secuencia compartida entre
él y los genes Ad5 en las células 293.
Las deleciones que se extienden más allá de 3,5
kb del extremo 5' del genoma adenovírico afectan al gen para la
proteína IX adenovírica y no se han considerado deseables en los
vectores adenovíricos (véase más adelante).
El gen de la proteína IX de los adenovirus
codifica un componente menor de la cápside adenovírica externa que
estabiliza el grupo de nuevo hexones que componen la mayoría de la
cápside vírica (Stewart (1993)). Basándose en el estudio de los
mutantes de la deleción del adenovirus, se consideró inicialmente
que la proteína IX no es un componente esencial del adenovirus,
aunque su ausencia se asociara a la inestabilidad térmica mayor que
la observada con el virus natural (Colby y Shenk (1981)). Más
recientemente se descubrió que la proteína IX es esencial para el
empaquetamiento del ADN vírico completo en cápsides y que en
ausencia de la proteína IX, solamente los genomas al menos 1 kb más
pequeños que los naturales podrían propagarse como virus
recombinantes (Ghosh-Choudhury et al.
(1987)). Dada esta limitación de empaquetamiento, las deleciones de
la proteína IX deliberadamente no se han considerado en el diseño de
los vectores adenovíricos.
Por ejemplo, el vector adenovírico dado a
conocer en Venkatesh L. K. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1990) vol. 87, págs. 8746-8750) contiene
una deleción en la zona E1a/E1b que se extiende desde la secuencia
de restricción PvuII a una secuencia de restricción BgIII, de modo
que el gen que codifica la proteína IX permanece intacto.
En esta solicitud, se hace referencia a los
libros de texto habituales de biología molecular que contienen
definiciones, métodos y medios para realizar las técnicas básicas,
comprendidas en la presente invención. Véase por ejemplo Sambrook
et al. (1989) y varias referencias citadas en la presente
memoria.
Al contrario de lo que se conoce en la técnica,
la presente invención reivindica la utilización de adenovirus
recombinantes que llevan deleciones del gen de la proteína IX como
un medio para reducir el riesgo de la contaminación por adenovirus
natural en preparaciones de virus para su utilización en
aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas tal como la terapia
génica. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término
"recombinante" pretende significar una descendencia formada
como resultado de la modificación genética. Estas deleciones puede
eliminar unos 500 a 700 pares de bases adicionales de la secuencia
del ADN que está presente en los virus eliminados de E1
convencionales y está disponible para la combinación con las
secuencias Ad5 integradas en las células 293. Los adenovirus
recombinantes basados en cualquier virus del grupo C serotipo 1, 2,
5 y 6, se incuban en la presente invención. Así mismo está
comprendido en esta invención un virus recombinante híbrido basado
en Ad2/Ad5 que expresa el ADNc de p53 humano procedente del
activador tardío principal del adnovirus tipo 2. Este montaje se
montó como se muestra en la Figura 1. El virus resultante lleva una
deleción en 5' de las secuencias adenovíricas que se extienden desde
aproximadamente el nucleótido 357 al 4.020 y elimina los genes E1a y
E1b así como la secuencia de codificación completa de la proteína
IX, dejando la secuencia de poliadenilación compartida por los
genes E1b y de la proteína IX íntegros para su utilización en la
terminación de la transcripción de cualquier gen deseado. En la
Figura 4 se presenta una forma de realización independiente. Como
alternativa, la deleción puede extenderse unos 30 a 40 pares de
bases adicionales sin afectar el gen adyacente a la proteína IVa2,
aunque en este caso se proporciona una señal de poliadenilación
exógena para terminar la transcripción de los genes insertados en el
virus recombinante. El virus inicial construido con esta deleción se
propaga fácilmente en las células 293 sin pruebas de contaminación
vírica natural y dirige la expresión de p53 robusta de la unidad de
transcripción insertada en el punto de la deleción.
La capacidad de inserción de los virus
recombinantes que llevan la deleción de la proteína IX descrita
anteriormente es aproximadamente de 2,6 kb. Ésta es suficiente para
muchos genes incluyendo el ADNc de p53. La capacidad de inserción
puede aumentarse introduciendo otras deleciones en el eje central
adenovírico, por ejemplo, deleciones en las zonas primarias 3 o 4
(para estudios véase: Graham y Prevec (1991)). Por ejemplo, la
utilización de un eje central adenovírico que contiene una deleción
de 1,9 kb de la secuencia no esencial en la región primaria 3. Con
esta deleción adicional, la capacidad de inserción del vector se
aumenta en aproximadamente 4,5 kb, suficientemente grande para
muchos ADNc mayores, incluyendo la del gen supresor del tumor de
retinoblastoma.
Un vector de expresión del adenovirus
recombinante caracterizado por una deleción total del ADN
adenovírico con la proteína IX y que tiene un gen que codifica una
proteína extraña o un fragmento operativo o uno de sus mutantes se
proporciona en esta invención. Estos vectores son útiles para la
producción recombinante segura de polipéptidos y proteínas para
diagnóstico y terapéuticos, y de mayor importancia, para la
introducción de genes en terapia génica. Por esta razón, por
ejemplo, el vector adenovírico de esta invención puede contener un
gen extraño para la expresión de una proteína eficaz para regular el
ciclo celular, tal como p53, Rb o mitosina, o para inducir la muerte
celular, tal como la timidina cinasa del gen suicida condicional.
(Esta última debe utilizarse junto con un metabolito de timidina
cinasa para que sea eficaz). En los vectores de esta invención puede
utilizarse cualquier casete de expresión. Un "casete de
expresión" significa una molécula de ADN que tiene un
activador/potenciador de transcripción tal como el potenciador
activador de CMV, etc., un gen extraño y en algunas realizaciones
definidas más adelante, una señal de poliadenilización. Tal como se
utiliza en la presente memoria, la expresión "gen extraño"
significa una molécula de ADN no presente en la orientación y
posición exactas como la molécula de ADN de contrapartida hallada en
el adenovirus natural. El gen extraño es una molécula de ADN de
hasta 4,5 kilobases. "Vector de expresión" significa un vector
que produce la expresión de las secuencias del ADN insertado cuando
se propagan en una célula huésped adecuada, es decir, la proteína o
polipéptido codificado por el ADN es sintetizada por el sistema del
anfitrión.
Los activadores inducibles también pueden
utilizarse en el vector adenovírico de esta invención. Estos
activadores iniciarán la transcripción solamente en presencia de
otra molécula. Ejemplos de activadores inducibles incluyen los que
pueden obtenerse a partir de un gen de interferón \beta, un gen de
choque térmico, un gen de metalotionina o los que pueden obtenerse
de los genes sensibles a la hormona esteroide. La expresión
específica del tejido ha sido bien caracterizada en el campo de la
expresión génica y los activadores específicos del tejido e
inducibles tales como éstos son muy bien conocidos en la materia.
Estos genes se utilizan para regular la expresión del gen extraño
una vez ha sido introducido en la célula diana.
Esta invención también proporciona un vector de
expresión de adenovirus recombinante, como el descrito
anteriormente, con deleciones menos extensas de la secuencia del gen
con la proteína IX que se extiende desde 3.500 bp de los terminales
víricos 5' hasta aproximadamente 4.000 bp, en una realización. En
una realización aparte, el vector de expresión de adenovirus
recombinante puede tener una deleción adicional de una secuencia de
ADN no esencial en la zona 3 y/o 4 inicial del adenovirus y/o una
deleción de las secuencias de ADN denominadas E1a y E1b del
adenovirus. En esta realización, el gen extraño es una molécula de
ADN de un tamaño de hasta 4,5 kilobases.
Una realización adicional tiene una deleción de
hasta 40 nucleótidos colocados en 3' con respecto a la deleción E1a
y E1b y pIX y una molécula de ADN extraña que codifica una señal de
poliadenilación insertada en el vector recombinante en una posición
con respecto al gen extraño para regular la expresión del gen
extraño.
Para los fines de esta invención, el vector de
expresión del adenovirus recombinante puede proceder de adenovirus
del grupo natural, serotipo 1, 2, 5 o 6.
En una realización, el vector de expresión del
adenovirus recombinante tiene un gen extraño que codifica una
proteína supresora del tumor operativa o uno de sus fragmentos
biológicamente activo. Tal como se utiliza en la presente memoria,
el término "operativo" referido a un gen supresor del tumor, se
refiere a los genes supresores del tumor que codifican las proteínas
supresoras del tumor que inhiben eficazmente una célula del
comportamiento como célula tumoral. Los genes operativos pueden
incluir, por ejemplo, genes naturales normales y modificaciones de
genes normales que conservan su capacidad para codificar proteínas
supresoras tumorales eficaces y otros genes antitumorales tal como
una proteína suicida condicional o una toxina.
Asimismo, "no operativo" tal como se
utiliza en la presente memoria es sinónimo de "inactivado". Los
genes no operativos o defectuosos pueden producirse mediante una
variedad de fenómenos incluyendo por ejemplo las mutaciones,
deleciones, metilación puntuales y otros conocidos por los expertos
en la materia.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
"fragmento activo" de un gen incluye las fracciones más
pequeñas del gen que conservan la capacidad de codificar proteínas
con actividad supresora del tumor. p56^{RB}, descrito con más
detalle más adelante, es solamente un ejemplo de un fragmento activo
de un gen supresor del tumor operativo. Las modificaciones de los
genes supresores del tumor se contemplan también dentro del
significado de un fragmento activo, tales como las adiciones,
deleciones o sustituciones, siempre que se conserve la actividad
funcional del gen no modificado.
Otro ejemplo de gen supresor del tumor es el
retinoblastoma (RB). Las secuencias completas del nucleótido del
ADNc de RB y las secuencias de aminoácidos previstas de la proteína
RB resultante (denominada p110^{RB}) se muestran en Lee et
al. (1987) y en la Figura 3. Asimismo es útil para expresar la
proteína del supresor del tumor retinoblastoma una molécula de ADN
que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 o
que tiene la secuencia de ADN mostrada en la Figura 3. También es
útil una versión truncada de p110^{RB}, denominada p56^{RB}.
Para la secuencia de p56^{RB}, véase Huang et al. (1991).
Pueden utilizarse otros genes del supresor tumoral en los vectores
de esta invención. A título de ilustración solamente, éstos pueden
ser la proteína p16 (Kamb et al. (1994)), la proteína p21, la
proteína WT1 del tumor de Wilms, mitosina, h-NUC o
la proteína DCC del carcinoma de colon. La mitosina se describe en
X. Zhu y W-H Lee, solicitud U.S. nº de serie
08/141.239, presentada el 22 de octubre de 1993 y una continuación
subsiguiente en parte por los mismos inventores, número de etiqueta
del apoderado P-CJ 1191, presentada el 24 de octubre
de 1994. Asimismo, h-NUC está descrita por
W-H Lee y P-L Chen, solicitud U.S.
nº de serie 08/170.586 presentada el 20 de diciembre de 1993.
Como es sabido por los expertos en la materia,
el término "proteína" significa un polímero lineal de
aminoácidos unido a una secuencia específica por enlaces peptídicos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término
"aminoácido" se refiere a una de las dos formas D o L del
estereoisómero del aminoácido, a menos que se designe
específicamente de otra manera. También están comprendidas las
proteínas o los péptidos equivalentes, p. ej., con actividad
biológica de la proteína supresora del tumor natural purificada.
"Proteínas equivalentes" y "polipéptidos equivalentes" se
refieren a los compuestos que parten de la secuencia lineal de las
proteínas o polipéptidos naturales, pero que tienen sustituciones de
aminoácidos que no cambian su actividad biológicamente. Estos
equivalentes pueden diferenciarse de las secuencias naturales por la
sustitución de uno o más aminoácidos con aminoácidos relacionados,
por ejemplo, asimismo aminoácidos con carga o la sustitución o
modificación de cadenas laterales o grupos funcionales.
Así mismo está comprendida dentro de la
definición de proteína operativa supresora del tumor cualquier
proteína cuya presencia reduzca la oncogenicidad, malignidad o
fenotipo hiperproliferante de la célula huésped. Ejemplos de
proteínas supresoras del tumor dentro de esta definición incluyen,
pero no se limitan a p110^{RB}, p56^{RB}, mitosina,
h-NUC y p53. "Oncogenicidad" significa que
tiene capacidad para formar tumores o que es capaz de producir
formación tumoral y es sinónimo de desarrollo neoplásico.
"Malignidad" pretende describir una célula tumorígena que tiene
capacidad de metastasizar y poner en riesgo la vida del organismo
anfitrión. "Fenotipo hiperproliferante" describe una célula que
crece y se divide a una velocidad más allá de los límites normales
de crecimiento para este tipo de célula. "Neoplásico" también
incluye las células que carecen de la proteína operativa endógena
supresora del tumor o la incapacidad de la célula para expresar el
ácido nucleico endógeno que codifica una proteína operativa
supresora del tumor.
Un ejemplo de un vector de esta invención es un
vector de expresión del adenovirus recombinante que tiene un gen
extraño que codifica la proteína p53 o uno de sus fragmentos activos
es proporcionado por esta invención. La secuencia de codificación
para el gen p53 se indica a continuación en la Tabla 1.
Cualquiera de los vectores de expresión
descritos en la presente memoria son útiles como composiciones para
diagnóstico o terapia. Pueden utilizarse vectores para cuya
identificación muchos genes supresores del tumor serían útiles en
terapia génica. Por ejemplo, una muestra de células sospechosas de
ser neoplásicas pueden eliminarse de un paciente y de un mamífero.
Las células pueden ponerse en contacto a continuación, en
condiciones adecuadas y con una cantidad eficaz de un vector
recombinante de esta invención que tiene insertado en el mismo un
gen extraño que codifica uno de los diversos genes operativos
supresores del tumor. Si la introducción de este gen invierte el
fenotipo maligno puede medirse mediante la formación de colonias en
agar-agar blando o mediante la formación del tumor
en ratones lampiños. Si el fenotipo maligno se invierte, entonces se
determina que este gen extraño es un candidato positivo para la
terapia génica lograda para el paciente o el mamífero. Cuando se
utilizan farmacéuticamente, pueden combinarse con uno o más
excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes
farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la materia e
incluyen soluciones acuosas tal como la solución salina
fisiológicamente tamponada u otros disolventes o vehículos tales
como glicoles, glicerol, aceites vegetales (p. ej., aceite de oliva)
o ésteres orgánicos inyectables. Puede utilizarse un excipiente
farmacéuticamente aceptable para administrar las composiciones
instantáneas a una célula in vitro o a un paciente in
vivo.
Un excipiente farmacéuticamente aceptable puede
contener un compuesto fisiológicamente aceptable que actúa, por
ejemplo, para estabilizar la composición o para aumentar o disminuir
la absorción del agente. Un compuesto fisiológicamente aceptable
puede incluir, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa,
sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o
glutatión, agentes quelantes, proteínas de peso molecular bajo u
otros estabilizantes o excipientes. Otros compuestos
fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes
emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes, que son
particularmente útiles para impedir el crecimiento o actuación de
los microorganismos. Varios conservantes son bien conocidos e
incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. Un experto en la
materia debe conocer que la elección de un excipiente
farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto
fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de
administración del polipéptido y de las características
fisicoquímicas determinadas del polipéptido específico. Por ejemplo,
un compuesto fisiológicamente aceptable tal como el monoestearato de
aluminio o la gelatina es particular útil como agente retardador,
que prolonga la velocidad de absorción de una composición
farmacéutica administrada a un paciente. Ejemplos adicionales de
excipientes, estabilizantes o adyuvantes pueden encontrarse en
Martín,, Remington's Pharm. Sci., 15ª ed. (Mack Publ. Co.,
Easton, 1975). La composición farmacéutica también puede
incorporarse, si se desea, en liposomas, microesferas u otras
matrices poliméricas (Gregoriadis, Liposome Technology, vol.
1 (CRC Press, Boca Ratón, Florida 1984)). Los liposomas, por
ejemplo, que consisten en fosfolípidos u otros lípidos, son
excipientes no tóxicos, fisiológicamente aceptables y metabolizables
que son relativamente fáciles de preparar y administrar.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"composición farmacéutica" se refiere a cualquiera de las
composiciones de materiales descritos en la presente memoria en
combinación con uno o más de los excipientes farmacéuticamente
aceptable anteriores. Las composiciones pueden administrarse a
continuación terapéutica o profilácticamente. Pueden ponerse en
contacto con la célula huésped in vivo, ex vivo o
in vitro, en una cantidad eficaz. Los medios in vitro
y ex vivo de poner en contacto las células huésped se
proporcionan más adelante. Cuando se ponen en práctica in
vivo, los métodos de administración de un producto farmacéutico
que contiene el vector de esta invención, son bien conocidos en la
técnica e incluyen pero no se limitan a, la administración oral,
intratumoral, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal. La
administración puede efectuarse en continuo o intermitentemente y
variará con el paciente y la enfermedad que deba tratarse, p. ej.,
como es el caso con otras composiciones terapéuticas (Landmann et
al. (1992); Aulitzky et al. (1991); Lantz et al.
(1990); Supersaxo et al. (1988); Demetri et al. (1989)
; y LeMaistre et al. (1991)).
Además esta invención proporciona una célula
huésped procariótica o eucariótica transformada, por ejemplo una
célula animal o una célula de mamífero, que tiene insertado un
vector de expresión de adenovirus recombinante descrito
anteriormente. Las células procarióticas adecuadas incluyen pero no
se limitan a las células bacterianas tales como las células de E.
coli. Los métodos de transformación de células huésped con
vectores retrovíricos son conocidos en la materia, véase Sambrook
et al. (1989) e incluyen, pero no se limitan a, la
transfección, electroporación y microinyección.
Tal como se utiliza en toda esta aplicación, el
término animal pretende ser sinónimo de mamífero e incluye, pero no
se limita a bovino, porcino, felino, simio, canino, equino, murino,
rata o humano. Las células huésped adicionales incluyen, pero no se
limitan a, cualquier célula neoplásica o tumoral, tal como
osteosarcoma, carcinoma de ovario, carcinoma de mama, melanoma,
hepatocarcinoma, cáncer pulmonar, cáncer cerebral, cáncer
colorrectal, célula hematopoyética, cáncer de próstata, carcinoma
cervical, retinoblastoma, carcinoma de esófago, cáncer de vejiga,
neuroblastoma o cáncer renal.
Además, cualquier línea celular eucariótica
capaz de expresar E1a y E1b o E1a, E1b y pIX es un anfitrión
adecuado para este vector. En una realización, una célula huésped
eucariótica adecuada es la línea celular 293 disponible en la
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland, U.S.A. 20231.
Cualquiera de las células huésped transformadas
descritas en la presente memoria son útiles como composiciones para
diagnóstico o terapia. Cuando se utilizan farmacéuticamente, pueden
combinarse con varios excipientes farmacéuticamente aceptables. Los
excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados son bien
conocidos por los expertos en la materia y, por ejemplo, están
descritos anteriormente. Las composiciones pueden administrarse a
continuación terapéutica o profilácticamente, en cantidades
eficaces, descritas con más detalle a continuación.
Se proporciona asimismo un método de
transformación de una célula huésped. Este método proporciona la
puesta en contacto de una célula huésped, es decir, una célula
huésped procariótica o eucariótica, con alguno de los vectores de
expresión descritos en la presente memoria y en condiciones
adecuadas. La puesta en contacto puede efectuarse in vitro,
in vivo o ex vivo, utilizando los métodos bien
conocidos en la materia (Sambrook et al. (1989)) y utilizando
cantidades eficaces de los vectores de expresión. En esta invención
se proporciona también un método de producción de una proteína
recombinante o de un polipéptido cultivando la célula huésped
transformada en condiciones adecuadas que favorezcan la
transcripción y la traducción del gen extraño insertado. Los métodos
de expresión recombinante en una variedad de células huésped, tales
como células de mamífero, levadura, insecto o bacterianas, son
ampliamente conocidos, incluyendo los descritos en Sambrook et
al., supra. El gen extraño traducido puede aislarse a
continuación por métodos convencionales, tal como la purificación en
columna o la purificación utilizando un anticuerpo antiproteína. La
proteína o polipéptido aislados también se pretende que esté dentro
del alcance de esta invención. Tal como se utiliza en la presente
memoria, purificado o aislado significa sustancialmente exento de
proteínas o ácidos nucleicos naturales normalmente asociados con la
proteína o el polipéptido en el medio natural o de la célula
huésped.
Esta invención también proporciona animales no
humanos que tienen insertados en ellos los vectores de expresión o
las células huésped transformadas de esta invención. Estos animales
"transgénicos" se preparan utilizando métodos bien conocidos
por los expertos en la materia, por ejemplo como los descritos en la
patente U.S. nº 5.175.384 o por técnicas convencionales de terapia
ex vivo, como las descritas en Culver et al.
(1991).
Como se muestra en detalle a continuación, los
adenovirus recombinantes que expresan una p53 natural del supresor
del tumor, como la descrita anteriormente, pueden inhibir
eficazmente la síntesis del ADN y suprimir el crecimiento de un
amplio espectro de tipos de células tumorales humanas, incluyendo
las dianas clínicas. Además, los adenovirus recombinantes pueden
expresar genes de supresión del tumor tales como p53 en un tumor
demostrado in vivo sin depender de la inyección directa en el
tumor o antes del tratamiento ex vivo de las células
cancerosas. La p53 expresada es operativa y suprime eficazmente el
crecimiento del tumor in vivo y aumenta significativamente el
tiempo de supervivencia en un modelo de ratón lampiño de cáncer
pulmonar humano.
De este modo, los vectores de esta invención son
particularmente adecuados para la terapia génica. Por consiguiente,
los métodos de terapia génica que utilizan estos vectores están
dentro del alcance de esta invención. El vector se purifica y a
continuación se administra al paciente una cantidad eficaz in
vivo o ex vivo. Los métodos de terapia génica son bien
conocidos en la materia, véase, por ejemplo Larrick, J. W. y Burck,
K. L. (1991) y Kreigler, M. (1990). "Paciente" significa
cualquier paciente animal, mamífero, rata, murino, bovino, porcino,
equino, canino, felino o humano. Cuando el gen extraño codifica un
gen supresor del tumor u otra proteína antitumoral, el vector es
útil para tratar o reducir las células hiperproliferantes en un
paciente, para inhibir la proliferación tumoral en un paciente o
para mejorar una patología específica relacionada. Las células
hiperproliferantes patológicas son características de las siguientes
enfermedades, hipertiroidismo-enfermedad de
Graves-Basedow, psoriasis, hipertrofia prostática
benigna, síndrome de Li-Fraumeni incluyendo el
cáncer de mama, sarcomas y otros neoplasmas, cáncer de vejiga,
cáncer de colon, cáncer pulmonar, varias leucemias y linfomas.
Ejemplos de células hiperproliferantes no patológicas se encuentran,
por ejemplo, en las células epiteliales del conducto durante el
desarrollo de la lactancia y también en las células asociadas a la
reparación de la herida. Las células hiperproliferantes patológicas
presentan de manera característica pérdida de inhibición de contacto
y una disminución de su capacidad para adherirse selectivamente que
implica un cambio en las propiedades superficiales de la célula y
una degradación adicional en la comunicación intercelular. Estos
cambios incluyen el estímulo para dividir y la capacidad para
segregar enzimas proteolíticas.
Además, la presente invención se refiere a un
método para reducir una muestra adecuada de células
hiperproliferantes patológicas de mamífero que contaminan los
precursores hematopoyéticos durante la reconstrucción de la médula
ósea mediante la introducción de un gen supresor del tumor natural
en una preparación celular que utiliza el vector de esta invención
(si procede de la sangre periférica autóloga o de la médula ósea).
Tal como se utiliza en la presente memoria, una "muestra
adecuada" se define como una preparación celular heterogénea
obtenida de un paciente, p. ej., una población mixta de células que
contienen células tanto fenotípicamente normales como patogénicas.
"Administrar" incluye, pero no se limita a, introducir en la
célula o en el paciente por vía intravenosa, mediante inyección
directa en el tumor, mediante inyección intratumoral, mediante
administración intraperitoneal, mediante administración de aerosol
en el pulmón o por vía tópica. Dicha administración puede combinarse
con un excipiente farmacéuticamente aceptado, descrito
anteriormente.
La expresión "oncogenicidad reducida"
significa las células tumorales que han sido transformadas en
células menos tumorígenas o no tumorígenas. Las células con
oncogenicidad reducida no forman tumores in vivo o presentan
un periodo de retraso prolongado de semanas a meses antes de la
aparición del crecimiento del tumor in vivo y/o de la masa
tumoral tridimensional con crecimiento más lento en comparación con
los tumores que tienen el gen supresor del tumor inactivado o no
operativo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "cantidad eficaz" significa la cantidad de vector o
proteína anticancerosa que consigue un resultado positivo en el
control de la proliferación celular. Una dosis contiene, por
ejemplo, desde aproximadamente 10^{8} a aproximadamente 10^{13}
unidades infecciosas. Un ciclo típico de tratamiento consistiría en
una de dichas dosis al día durante un periodo de cinco días. Una
cantidad eficaz variará con la patología o enfermedad en
tratamiento, por el paciente y su estado y otros factores bien
conocidos por los expertos en la materia. Las cantidades eficaces
son determinadas fácilmente por los expertos en la materia.
También está dentro del alcance de esta
invención un método de mejora de una patología caracterizada por
células hiperproliferantes o por el defecto genético en un paciente
mediante la administración al paciente de una cantidad eficaz de un
vector descrito anteriormente que contiene un gen extraño que
codifica un producto génico con capacidad para mejorar la patología,
en condiciones adecuadas. Tal como se utiliza en la presente
memoria, la expresión "defecto genético" significa cualquier
enfermedad o anomalía que proceda de factores hereditarios, tal como
la anemia depranocítica o la enfermedad de
Tay-Sachs.
Esta invención también proporciona un método
para reducir la proliferación de las células tumorales en un
paciente introduciendo en la masa tumoral una cantidad eficaz de un
vector de expresión adenovírico que contiene un gen antitumoral
aparte del gen supresor del tumor. El gen antitumoral puede
codificar, por ejemplo, la timidina cinasa (TK). Se administra a
continuación al paciente una cantidad eficaz de un agente
terapéutico, que en presencia del gen antitumoral es tóxico para la
célula. En el caso específico de la timidina cinasa, el agente
terapéutico es un metabolito de timidina cinasa tal como ganciclovir
(GCV), 6-metoxipurina arabinonucleósido (araM) o uno
de sus equivalentes operativos. Tanto el gen de timidina cinasa como
el metabolito de timidina cinasa deben utilizarse simultáneamente al
ser tóxicos para la célula huésped. Sin embargo, en su presencia,
GCV se fosforila y se convierte en un inhibidor potente de síntesis
de ADN mientras que araM se convierte en el anabolito citotóxico
araATP. Pueden utilizarse también otros genes antitumorales en
combinación con el correspondiente agente terapéutico para reducir
la proliferación de las células tumorales. Dichas otras
combinaciones del gen y del agente terapéutico son conocidos por los
expertos en la materia. Otro ejemplo sería el vector de esta
invención que expresa la enzima citosina desaminasa. Dicho vector se
utilizaría junto con la administración del fármaco
5-fluorouracilo (Austin y Huber, 1993) o el gen Deo
\Delta de E. coli descrito recientemente en comparación con
6-metil-purina-2'-desoxirribonucleósido
(Sorscher et al. 1994).
Como en la utilización de los genes supresores
del tumor descritos anteriormente, la utilización de otros genes
antitumorales, ya sea solos o en combinación con el agente
terapéutico apropiado proporciona un tratamiento para el crecimiento
incontrolado de las células o de la proliferación característica de
los tumores y cánceres. Así, esta invención proporciona una terapia
para interrumpir el crecimiento celular incontrolado en el paciente
aliviando de este modo los síntomas de la enfermedad o la caquexia
presente en el paciente. El efecto de este tratamiento incluye, pero
no se limita al tiempo de supervivencia prolongado del paciente, a
la reducción de la masa tumoral o sobrecarga, a la apoptosis de las
células tumorales o a la reducción del número de células tumorales
circulantes. Los medios para cuantificar los efectos beneficiosos de
esta terapia son bien conocidos por los expertos en la materia.
La invención proporciona un vector de expresión
de adenovirus recombinante caracterizado por la deleción total del
ADN adenovírico de la proteína IX y que tiene un gen extraño que
codifica una proteína extraña, en el que la proteína extraña es un
gen suicida o uno de sus equivalentes operativos. La TK del gen
anticanceroso, descrita anteriormente, es un ejemplo de un gen
suicida porque cuando se expresa, el producto génico es, o puede
prepararse para que sea letal a la célula. Para TK, la letalidad se
induce en presencia de GCV. El gen de TK procede del virus del
herpes simple por métodos bien conocidos por los expertos en la
técnica. El plásmido pMLBKTK en HB101 de E. coli (de ATCC nº
39369) es una fuente del gen de la timidina cinasa (TK) del virus
del herpes simple (HSV-1) para su utilización en
esta invención. Sin embargo, existen también muchas otras
fuentes.
El gen TK puede introducirse en la masa tumoral
combinando el vector de expresión adenovírica con un excipiente
farmacéuticamente aceptable adecuado. La introducción puede
realizarse, por ejemplo, mediante inyección directa del adenovirus
recombinante en la masa tumoral. Para el caso específico de un
cáncer tal como el carcinoma hepatocelular (HCC), la inyección
directa en la arteria hepática puede utilizarse para la
administración porque en la mayoría de los HCC su circulación
procede de esta arteria. Para controlar la proliferación del tumor,
se induce la muerte celular tratando a los pacientes con un
metabolito de TK tal como ganciclovir para conseguir la reducción de
la masa tumoral. El metabolito TK puede administrarse, por ejemplo,
por vía general, por inoculación local en el tumor o en el caso
específico de HCC, por inyección en la arteria hepática. El
metabolito TK se administra preferentemente por lo menos una vez al
día pero puede aumentarse o disminuirse según la necesidad. El
metabolito TK puede administrarse a la vez o después de la
administración del vector que contiene TK. Los expertos en la
materia conocen o pueden determinar la dosis y la duración que es
terapéuticamente eficaz.
Un método de administración específica para el
tumor de un gen supresor del tumor se realiza poniendo en contacto
el tejido diana en un animal con una cantidad eficaz del vector de
expresión adenovírico recombinante de esta invención. Se pretende
que el gen codifique un agente antitumoral, tal como un gen
operativo supresor del tumor o un gen suicida. "Poner en
contacto" pretende abarcar cualquier método de administración
para la transferencia eficaz del vector, tal como la inyección
intratumoral.
Esta invención proporciona además la utilización
del vector adenovírico de esta invención para preparar medicamentos
destinados al tratamiento o la terapia de una enfermedad.
Experimento nº
I
Para estas manipulaciones se utilizó como
material de partida el plásmido pAd/MLP/p53/E1b-. Este plásmido se
basa en el derivado pML2 de pBR322 (pBR322 se elimina para los pares
de bases 1.140 a 2.490) y contiene las secuencias del adenovirus
tipo 5 que se extienden desde el par de bases 1 al par de bases
5.788 excepto las que están eliminadas para los pares de bases 357 a
3.327 del adenovirus tipo 5. En el punto de la deleción 357/3.327 de
Ad5 se inserta una unidad de transcripción que está comprendida por
el activador tardío principal del adenovirus tipo 2, el ADNc
principal del tripartito del adenovirus tipo 2 y el ADNc de p53
humano. Es un vector de sustitución de E1 típico eliminado para los
genes E1a y E1b de Ad5 que contienen el gen de la proteína IX de Ad5
(para estudios de vectores de Adenovirus véase: Graham y Prevec
(1992)). El ADN de Ad2 se adquirió en Gibco BRL. Endonucleasas de
restricción y T4 ADN ligasa se adquirieron en New England Biolabs.
Células competentes DH5\alpha de E. coli se adquirieron en
Gibco BRL y células 293 se adquirieron en la American Type Culture
Collection (ATCC). La resina
Prep-A-Gene para la purificación del
ADN se adquirió en BioRad. El medio de cultivo bacteriano LB se
adquirió en Difco. Las columnas de purificación Qiagen del ADN se
adquirieron en Qiagen, Inc. Se adquirió dI327 de Ad5 en R. J.
Schneider, NYU. El kit para transfección cde ADN MBS se adquirió en
Stratagene.
Se digirió un (1) \mug de pAd/MLP/p53/E1b- con
20 unidades de cada una de las enzimas de restricción EcI 136II y
NgoMI según las recomendaciones del fabricante. Se digerieron cinco
(5) \mug de ADN de Ad2 con 20 unidades de cada una de las
endonucleasas de restricción DraI y NgoMI según las recomendaciones
del fabricante. Se cargaron las digestiones de restricción en bandas
independientes de un gel de agarosa al 0,8% y se realizó la
electroforesis a 100 voltios durante 2 horas. El fragmento de
restricción de 4.268 bp de la muestra Pad/MLP/p53/E1b y el fragmento
de 6.437 bp de la muestra Ad2 se aislaron del gel utilizando la
resina de extracción Prep-A-Gene de
ADN según las especificaciones del fabricante. Se mezclaron los
fragmentos de restricción y se trataron con T4 ADN ligasa en un
volumen total de 50 \mul a 16ºC durante 16 horas según las
recomendaciones de fabricante. Después de la ligadura, se utilizaron
5 \mul de la reacción para transformar las células DH5\alpha de
E. coli para resistencia a la ampicilina siguiendo el
procedimiento del fabricante. Se utilizaron seis colonias
bacterianas procedentes de este procedimiento para inocular 2 ml de
cultivos independientes de medio de cultivo LB y se incubaron
durante la noche a 37ºC con agitación. Se preparó ADN de cada
cultivo bacteriano utilizando procedimientos normalizados (Sambrook
et al. (1989)). Una cuarta parte del ADN del plásmido de cada
cepa se digirió con 20 unidades de endonucleasa de restricción XhoI
para identificar el recombinante correcto que contiene los
fragmentos de restricción de XhoI de 3.627, 3.167, 2.466 y 1.445
pares de bases. Cinco de las seis cepas identificadas contenían el
plásmido correcto. Una de éstas se utilizó a continuación para
aislar 1 litro de cultivo del medio de cultivo LB para aislamiento
de grandes cantidades de ADN del plásmido. Después de incubación
durante la noche se aisló el ADN del plásmido del cultivo de 1 litro
utilizando columnas Qiagen de purificación de ADN según las
recomendaciones del fabricante. El plásmido resultante se denominó
Pad/MLP/p53/PIX-. Las muestras de este plásmido se depositaron en la
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland, U.S.A., 12301, el 22 de octubre de 1993. El depósito se
realizó bajo las disposiciones del Tratado de Budapest en el
International Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent
Procedure. Al depósito se le concedido el nº de registro 75576 de la
ATCC.
Para construir un adenovirus recombinante, se
trataron 10 \mug de Pad/MLP/p53/PIX- con 40 unidades de
endonucleasa de restricción EcoRI para linealizar el plásmido. Se
digirió ADN de dI327 de adenovirus tipo 5 (Thimmappaya (1982)) con
endonucleasa de restricción CIaI y el fragmento grande
(aproximadamente 33 pares de kilobases) se purificó por
centrifugación en gradiente de sacarosa. Se mezclaron 10 \mug de
Pad/MLP/p53/Elb- y 2,5 \mug de Ad5 dl327 tratado con ClaI y se
utilizaron para transfectar aproximadamente 10^{6} células 293
utilizando el kit de transfección para mamíferos MBS siguiendo las
recomendaciones del fabricante. Ocho (8) días después de la
transfección, se dividieron las células 1 a 3 en medio fresco y dos
días después de esto los adenovirus que indujeron efecto citopático
se hicieron evidentes en las células transfectadas. A los 13 días
post-transfección se preparó ADN de las células
infectadas utilizando procedimientos normalizados (Graham y Prevec
(1991)) y se analizó mediante digestión de restricción con la
endonucleasa de restricción XhoI. La expresión de p53 dirigida por
el virus se verificó después de la infección de células de
osteosarcoma SaoS2 con un lisado viral y tinción de
inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal
anti-p53 denominado 1801 (Novocasta Lab. Ltd., Reino
Unido).
Experimento nº
II
Se hicieron crecer adenovirus recombinantes y se
propagaron en la línea celular de riñón embrionario humano 293 (ATCC
CRL 1573) mantenida en medio DME que contiene suero de ternera
definido enriquecido al 10% (Hyclone). Las células
Saos-2 se mantuvieron en medio de Kaighn enriquecido
con suero bovino fetal al 15%. Las células HeLa y Hep 3 B se
mantuvieron en medio DME enriquecido con suero bovino fetal al 10%.
Todas las demás líneas celulares se hicieron crecer en medio de
Kaighn enriquecido con suero bovino fetal al 10%. Las células
Saos-2 fueron suministradas gentilmente por el Dr.
Eric Stanbridge. Todas las demás líneas celulares se obtuvieron de
la ATCC.
Para construir los adenovirus Ad5/p53, se aisló
de pGEM1-p53-B-T
(suministrado gentilmente por el Dr. Wen Hwa Lee un fragmento
HindIII-SmaI de 1,4 kb que contenía el ADNc de
longitud completa de p53 y se insertó en el punto de clonación
múltiple del vector de expresión pSP72 (Promega) utilizando
procedimientos de clonación normalizados (Sambrook et al.
(1989)). Se recuperó la inserción de p53 de este vector tras
digestión con XhoI-BgIII y electroforesis en gel. Se
insertó a continuación la secuencia de codificación de p53 en
vectores de transferencia génica de adenovirus pNL3C o pNL3CMV
(proporcionados gentilmente por el Dr. Robert Schneider) que
contienen la repetición del terminal invertido en 5' de Ad5 y las
señales de empaquetamiento víricas y el potenciador E1a del
activador tardío principal Ad2 (MLP) o del activador del gen precoz
inmediato al citomegalovirus humano (CMV), seguido del ADNc
principal tripartito y la secuencia Ad 5 de 3.325 a 5.525 bp en un
fondo de PML2. Estos nuevos montajes sustituyen a la zona E1 (360 a
3.325 bp) de Ad5 con p53 conducido por MLP de Ad2 (A/M/53) o el
activador de CMV humano (A/C/53), ambos seguidos por el ADNc
principal tripartito (véase la Figura 4). Las inserciones de p53
utilizan el punto de poliadenilación E1b aguas abajo restante. Se
generaron recombinantes de p53 (A/M/N/53, A/C/N/53) dirigidos por
MLP y CMV adicionales que presentaban una deleción adicional de 705
nucleótidos de secuencia de Ad 5 para eliminar la zona de
codificación de la proteína IX (PIX). Como referencia, se generó un
adenovirus recombinante a partir del plásmido PNL3C precursor con
una inserción de p53 (A/M). Una segunda referencia consistió en un
adenovirus recombinante que codifica el gen de
beta-galactosidasa bajo el control del activador CMV
(A/C/\beta-gal). Se linealizaron los plásmidos con
Nru I o Eco RI y se cotransfectaron con un fragmento grande de los
mutantes d1309 o d1327 de Ad 5 digeridos con Cla I (Jones y Shenk
(1979)) utilizando el kit de transfección de Ca/PO_{4}
(Stratagene). Se aislaron placas víricas y se identificaron los
recombinantes tanto por análisis del digesto de restricción como por
PCR utilizando cebadores específicos recombinantes contra la
secuencia de ADNc principal tripartita con la secuencia de ADNc de
p53 aguas abajo. Se purificó más el virus recombinante limitando la
dilución y las partículas de virus se purificaron y se valoraron por
métodos normalizados (Graham y van der Erb (1973); Graham y Prevec
(1991)).
Se infectaron las células Saos-2
o Hep 3B (5 \times 10^{5}) con los adenovirus recombinantes
indicados durante un periodo de 24 horas a multiplicidades de
infección (MOI) crecientes de unidades formadoras de placa de
virus/célula. A continuación se lavaron las células una vez con PBS
y se recogieron en tampón de lisis (Tris-Hcl 50 mM
pH 7,5, NaCl 250 mM, NP40 al 0,1%, NaF 50 mM, EDTA 5 mM, 10
\mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de leupeptina y PMSF 1 mM). Se
separaron proteínas celulares (aproximadamente 30 \mug) mediante
SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a nitrocelulosa.
Se incubaron las membranas con anticuerpo Pab 1801 de
\alpha-p53 (Novocastro) seguido de IgG
anti-ratón de oveja conjugado con peroxidasa de
rábano picante. La proteína p53 se observó por quimioluminiscencia
(kit ECL, Amersham) en película Kodak XAR-5.
Se colocaron células (5 \times
10^{3}/pocillo) en placas (Costar) de valoración de 96 pocillos y
se dejaron adherir toda la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Se
infectaron a continuación las células durante 24 horas con
partículas de virus recombinante purificadas a las MOI que oscilan
entre 0, 3 y 100 como se indica. Se cambiaron los medios 24 horas
después de la infección, y se continuó la incubación durante un
total de 72 horas. Se añadió ^{3}H-timidina
(Amersham, 1 \muCi/pocillo) 18 horas antes de la recogida. Se
recogieron las células en filtros de fibra de vidrio y se midieron
los niveles de radioactividad incorporada en un contador beta de
centelleo. La incorporación de ^{3}H-timidina se
expresó como la media % (+/- SD) de la referencia del medio y se
representó frente a la MOI.
Se colocaron en placas en matraces T225
aproximadamente 2,4 \times 10^{8} células
Saos-2, se trataron con tampón de suspensión
(sacarosa al 1% en PBS) que contenía virus purificado A/M/N/53 o A/M
a una MOI de 3 o 30. Después de una infección durante la noche, se
inyectaron las células por vía subcutánea en los costados izquierdo
y derecho de ratones lampiños atímicos BALB/c (4 ratones por grupo).
Se inyectaron en un costado las células tratadas con A/M/N/53,
mientras que el costado contralateral se inyectaron las células
tratadas con A/M de referencia, sirviendo cada ratón como su
referencia propia. Los animales que recibieron inyección bilateral
de células tratadas con tampón sirvieron como referencias
adicionales. Se midieron a continuación las dimensiones del tumor
(longitud, anchura y altura) y los pesos corporales dos veces a la
semana durante un periodo de 8 semanas. Se estimaron los volúmenes
del tumor para cada animal suponiendo una geometría esférica con
radio igual a la mitad de la media de las dimensiones del tumor
medidas.
Se inyectaron por vía subcutánea ratones
lampiños atímicos BALB/c (aproximadamente de 5 semanas de vida) con
1 \times 10^{7} células H69 de carcinoma pulmonar microcítico
(SCLC) en sus costados derechos. Se dejaron evolucionar los tumores
durante 32 días hasta que fueron de aproximadamente 25 a 50
mm^{3}. Los ratones recibieron inyecciones peritumorales de
adenovirus recombinante A/C/53 o A/C/\beta-gal (2
\times 10^{9} unidades formadoras de placa (pfu)) en el espacio
subcutáneo debajo de la masa tumoral. Se escindieron los tumores de
los animales 2 y 7 días después del tratamiento con adenovirus y se
enjuagaron con PBS. Se homogeneizaron las muestras de tumor, y se
aisló el ARN total utilizando un kit TriReagent (Molecular Research
Center, Inc.). Se aisló poliA ARN utilizando el sistema de
aislamiento de ARNm PolyATract (Promega), y se utilizaron
aproximadamente 10 ng para la determinación por
RT-PCR de la expresión del ARNm de p53 (Wang et
al. (1989)). Se diseñaron cebadores para ampliar la secuencia
entre el ADNc principal tripartito del adenovirus y el ADNc de p53
aguas abajo, asegurándose que únicamente se ampliaría la p53
recombinante y no la endógena.
Se inyectaron por vía subcutánea aproximadamente
1 \times 10^{7} células H69 de tumor (SCLC) en volúmenes de 200
\mul en ratones lampiños atímicos BALB/c hembra. Se dejaron
desarrollar los tumores durante 2 semanas, en cuyo momento los
animales se distribuyeron al azar por tamaño de tumor (N=5/grupo).
Se administraron dos veces a la semana durante un total de 8
dosis/grupo inyecciones peritumorales de adenovirus A/M/N/53 o A/M
de referencia (2 \times 10^{9} pfu/inyección) o tampón solo
(sacarosa al 1% en PBS). Se midieron las dimensiones del tumor y los
pesos corporales dos veces a la semana durante 7 semanas y se estimó
el volumen del tumor como se describió anteriormente. A continuación
se hizo un seguimiento de los animales para observar el efecto del
tratamiento sobre la supervivencia de los ratones.
Se construyeron adenovirus de p53 sustituyendo
una parte de las zonas E1a y E1b del adenovirus tipo 5 con ADNc de
p53 bajo el control del activador Ad2 MLP (A/M/53) o CMV (A/C/53)
(esquematizado en la Figura 4). Esta sustitución de E1 comunica
rigurosamente la capacidad de los adenovirus recombinante para
replicarse, restringiendo su propagación a las células 293 que
suministran productos génicos Ad 5 E1 en trans (Graham et al.
(1977)). Después de la identificación del adenovirus recombinante de
p53 tanto por el digesto de restricción como por análisis de PCR, se
secuenció la secuencia completa del ADNc de p53 de uno de los
adenovirus recombinantes (A/M/53) para verificar que estaba exenta
de mutaciones. Después de esto, se utilizaron preparaciones
purificadas de los recombinantes de p53 para infectar células HeLa
para analizar la presencia de adenovirus con fenotipo natural. Las
células HeLa, que no permiten la réplica del adenovirus con E1
eliminado, se infectaron con 1-4 \times 10^{9}
unidades infecciosas de adenovirus recombinante, se cultivaron
durante 3 semanas y se observó el aspecto del efecto citopático
(CPE). Utilizando este análisis, no se detectó la réplica del
adenovirus recombinante o la contaminación natural, fácilmente
evidente por el CPE observado en las células de referencia
infectadas con adenovirus natural a un nivel de sensibilidad de
aproximadamente 1 en 10^{9}.
Para determinar si los adenovirus recombinantes
de p53 expresaban la proteína p53, se infectaron líneas celulares
tumorales que no expresan la proteína p53 endógena. Las líneas
celulares tumorales humanas Saos-2 (osteosarcoma) y
Hep 3B (carcinoma hepatocelular) se infectaron durante 24 horas con
los adenovirus A/M/53 o A/C/53 recombinantes de p53 a las MOI que
oscilan entre 0,1 y 200 pfu/célula. El análisis Western de los
lisados preparados a partir de las células infectadas demostró una
expresión de la proteína p53 dependiente de la dosis en ambos tipos
de células (Figura 5). Ambas líneas celulares expresaron niveles
mayores de la proteína p53 tras la infección con A/C/53 que con
A/M/53 (Figura 3). No se detectó proteína p53 en las células no
infectadas. Las concentraciones de p53 natural endógena son
normalmente muy bajas y casi indetectables por análisis Western de
los extractos celulares (Bartek et al. (1991)). Es evidente
sin embargo que las concentraciones de proteína p53 natural son
fácilmente detectables después de la infección con A/M/53 o A/C/53 a
las MOI inferiores (Figura 5), lo que sugiere que incluso dosis
bajas de adenovirus recombinantes de p53 pueden producir
concentraciones potencialmente eficaces de p53.
La reintroducción de p53 natural en la línea
celular del osteosarcoma negativa a p53, Saos-2,
produce un alargamiento característico y un aplastamiento de estas
células normalmente en forma de huso (Chen et al. (1990)). Se
infectaron células Saos-2 subconfluentes (1 \times
10^{5} células/10 cm de placa) a una MOI de 50 con el virus A/C/53
o el A/M de referencia y se incubaron a 37ºC durante 72 horas hasta
que las placas de referencia sin infectar fueron confluentes. En
este momento, el cambio morfológico esperado era evidente en la
placa tratada con A/C/53 (Figura 6, panel C) pero no en las placas
no infectadas (Figura 6, panel A) o en las placas infectadas con
virus de referencia (Figura 6, panel B). Este efecto no era función
de la densidad celular porque una placa de referencia sembrada
inicialmente a densidad inferior conservaba la morfología normal a
las 72 horas cuando su confluencia se aproximó a la de la placa
tratada con A/C/53. Los resultados anteriores han demostrado un
nivel elevado de expresión de la proteína p53 a una MOI de 50 en las
células Saos-2 (Figura 5A) y estos resultados
proporcionaron pruebas de que la proteína p53 expresada por estos
adenovirus recombinantes era biológicamente activa.
Para probar más la actividad de los adenovirus
recombinantes de p53, se analizó su capacidad para inhibir la
proliferación de las células tumorales humanas medidas por absorción
de ^{3}H-timidina. Se ha demostrado anteriormente
que la introducción de p53 natural en las células que no expresan a
p53 natural endógena puede detener las células en la transición
G_{1}/S, lo que conduce a la inhibición de la absorción de la
timidina marcada en el ADN recién sintetizado (Baker et al.
(1990); Mercer et al. (1990); Diller et al. (1990)).
Una variedad de líneas celulares tumorales con insuficiencia de p53
se infectaron con adenovirus recombinante A/M/N/53, A/C/N/53 o de
referencia (A/M) que no expresa a p53. Se observó una fuerte
inhibición dependiente de la dosis de la síntesis de ADN tanto por
los recombinantes A/M/N/53 como por A/C/N/53 en 7 de cada una de las
9 líneas celulares tumorales diferentes probadas (Figura 7). Ambos
montajes fueron capaces de inhibir la síntesis de ADN en estas
células tumorales humanas, a diferencia de si expresaban p53 mutante
o no podían expresar la proteína p53. Se observó también en este
ensayo, que el montaje A/C/N/53 era regularmente más potente que el
A/M/N/53. En las células Saos-2 (osteosarcoma) y
MDA-MB468 (cáncer de mama), casi se consiguió el
100% de inhibición de la síntesis de ADN con el montaje A/C/N/53 a
una MOI tan baja como 10. A las dosis en las que la inhibición por
el adenovirus de referencia en solamente 10 al 30%, se observó una
reducción del 50 al 100% en la síntesis del ADN utilizando uno de
los dos adenovirus recombinantes de p53. En cambio, no se observó
ningún efecto específico en p53 significativo con cualquier montaje
en comparación con el virus de referencia en las células G2 de HEP
(línea celular de hepatocarcinoma que expresa a p53 natural endógena
(Bressac et al. (1990)) ni en la línea celular leucémica K562
(p53 nula).
En una prueba más severa de la función para los
adenovirus recombinantes de p53, se infectaron células tumorales
ex vivo y a continuación se inyectaron las células en ratones
lampiños para evaluar la capacidad de los recombinantes para
suprimir el crecimiento del tumor in vivo. Las células
Saos-2 infectadas con virus A/M/N/53 o A/M de
referencia a una MOI de 3 o 30, se inyectaron en los costados
opuestos de ratones lampiños. Se midieron los tamaños de los tumores
a continuación dos veces a la semana durante un periodo de 8
semanas. A la MOI de 30, no se observó crecimiento del tumor en los
costados tratados con p53 en ninguno de los animales, mientras que
los tumores tratados con la referencia continuaron creciendo (Figura
8). El aumento progresivo de los tumores tratados con el virus de
referencia fue similar al observado en los animales de referencia
tratados con el tampón. Una diferencia clara en el crecimiento del
tumor entre el adenovirus de referencia y el recombinante p53 a la
MOI de 3, aunque los tumores de 2 de cada 4 ratones tratados con p53
comenzó a mostrar algún crecimiento después de aproximadamente 6
semanas. Por este motivo, el adenovirus recombinante A/M/N/53 es
capaz de mediar en la supresión del tumor específica de p53 en un
medio in vivo.
Aunque el tratamiento ex vivo de las
células cancerosas y la inyección posterior en animales proporcionó
una prueba crítica de la supresión de un tumor, un experimento
aplicable más clínicamente sirve para determinar y el adenovirus
recombinante de p53 inyectado podría infectar y expresar a p53 en
los tumores probados in vivo. Para estudiar esto, se
inyectaron células H69 (SCLC, p53^{nulo}) por vía subcutánea en
ratones lampiños, y se dejaron desarrollar los tumores durante 32
días. En ese momento, se inyectó una única inyección de 2 \times
10^{9} pfu de adenovirus A/C/53 o A/C/\beta-gal
en el espacio peritumoral que rodea el tumor. Se escindieron a
continuación los tumores el día 2 o el día 7 después de la inyección
de adenovirus y se aisló poliA ARN de cada tumor. Se utilizó a
continuación RT-PCR, utilizando cebadores
específicos de p53 recombinante, para detectar el ARNm de p53 en los
tumores tratados con p53 (Figura 9, bandas 1, 2, 4, 5). Ninguna
señal de p53 fue evidente en los tumores escindidos de los animales
tratados con \beta-gal (Figura 9, bandas 3 y 6).
La ampliación con cebadores de actina sirvió como referencia para la
reacción RT-PCR (Figura 9, bandas 7 a 9), mientras
que un plásmido que contenía la secuencia de p53 recombinante sirvió
como referencia positiva para la banda específica de p53
recombinante (Figura 9, banda 10). El experimento demuestra que un
adenovirus recombinante de p53 puede dirigir específicamente la
expresión del ARNm de p53 en los tumores probados tras una única
inyección en el espacio peritumoral. También demuestra la
persistencia vírica in vivo durante al menos una semana
después de la infección con un adenovirus recombinante de p53.
Para estudiar la viabilidad de la terapia génica
de tumores probados, se utilizó un modelo de ratón lampiño con
tumor. Se inyectaron células H69 en el espacio subcutáneo sobre el
costado derecho del ratón y se dejaron desarrollar los tumores
durante 2 semanas. Los ratones recibieron a continuación inyecciones
peritumorales de tampón o de virus recombinante dos veces a la
semana durante un total de 8 dosis. En los ratones tratados con
tampón o con virus A/M de referencia, los tumores continuaron
creciendo rápidamente durante todo el tratamiento, mientras que los
tratados con el virus A/M/N/53 crecieron a una velocidad muy
reducida (Figura 10A). Tras el cese de las inyecciones, los tumores
tratados con la referencia continuaron creciendo mientras que los
tumores tratados con p53 se crecieron poco o no crecieron durante al
menos una semana en ausencia de cualquier aporte adicional de p53
exógena (Figura 10A). Aunque los animales de referencia tratados con
tampón solo habían acelerado el crecimiento del tumor en comparación
con cualquier grupo tratado con virus, no se observó ninguna
diferencia significativa en el peso corporal entre los tres grupos
durante el periodo de tratamiento. La ulceración del tumor en
algunos animales limitó la relevancia de las mediciones del tamaño
del tumor después del día 42. Sin embargo, el control continuo de
los animales para determinar el tiempo de supervivencia demostró una
ventaja de la supervivencia para los animales tratados con p53
(Figura 10B). El último de los animales tratados con adenovirus de
referencia murió el día 83, mientras que las referencias tratadas
con tampón solo habían muerto todas el día 56. En cambio, los 5
animales tratados con el A/M/N/53 continuaron sobreviviendo (130
días tras la inoculación de las células) (Figura 10B). En conjunto,
estos datos demuestran un efecto específico de p53 tanto en el
crecimiento del tumor como en el tiempo de supervivencia en los
animales con tumores insuficientes en p53 demostrados.
Se construyeron vectores de adenovirus humano
recombinante que son capaces de expresar altos niveles de la
proteína p53 natural en función de la dosis. Cada vector contiene
deleciones en las zonas E1a y E1b que hacen insuficiente la réplica
del virus (Challberg y Nelly (1979); Horowitz, (1991)). De más
significado es que estas deleciones incluyen las secuencias que
codifican la proteína de E1b de 19 y 55 kd. Se ha publicado que la
proteína de 19 kd está implicada en la inhibición de la apoptosis
(White et al. (1992); Rao et al. (1992)), mientras que
la proteína de 55 kd es capaz de unirse a la proteína p53 natural
(Sarnow et al. (1982); Heuvel et al. (1990)).
Eliminando estas secuencias adenovíricas, se eliminaron los
inhibidores potenciales de la función de p53 mediante la unión
directa a p53 o la inhibición potencial de la apoptosis mediada por
p53. Se prepararon montajes adicionales que habían tenido la
secuencia E1b en 3' restante, incluyendo toda la secuencia de
codificación de la proteína IX, eliminada también. Aunque esto había
sido descrito para reducir la capacidad del tamaño de
empaquetamiento del adenovirus hasta aproximadamente 3 kb menos que
el virus natural (Ghosh-Choudhury et al.
(1987)), estos montajes están también eliminados de la zona E3 de
modo que los montajes de A/M/N/53 y de A/C/N/53 están dentro de este
intervalo de tamaños. Eliminando la zona pIX, las secuencias
adenovíricas homólogas a los contenidos en las células 293 se
reducen a aproximadamente 300 pares de bases, disminuyendo las
probabilidades de regenerar adenovirus natural con replicación
competente mediante recombinación. Los montajes que carecen de la
secuencia de codificación pIX parecen tener igual eficacia que los
que tienen pIX.
De acuerdo con una dependencia acusada de la
dosis para la expresión de la proteína p53 en las células
infectadas, se demostró una inhibición específica de p53 dependiente
de la dosis del crecimiento de las células tumorales. Se inhibió la
división celular, y se demostró mediante la inhibición de la
síntesis de ADN, en una amplia variedad de tipos de células
tumorales conocidas porque carecen de la expresión de la proteína
p53 natural. Bacchetti y Graham (1993) describieron recientemente la
inhibición específica de p53 de la síntesis del ADN en la línea
celular SKOV-3 del carcinoma de ovario por un
adenovirus recombinante de p53 en experimentos similares. Además del
carcinoma de ovario, se demostraron otras líneas celulares de tumor
humano, representativas de cánceres humanos clínicamente importantes
y que incluyen líneas que sobrexpresan la proteína p53 mutante,
puede también inhibirse el crecimiento por los recombinantes de p53
de esta invención. A las MOI en las que el recombinante A/C/N/53 es
del 90 al 100% eficaz en la inhibición de la síntesis del ADN en
estos tipos de tumor, el adenovirus de referencia medió la supresión
en menos del 20%.
Aunque Feinstein et al. (1992)
describieron que la reintroducción de p53 natural podría inducir la
diferenciación y aumentar la producción de células en G_{1} frente
a S+G_{2} para las células K563 leucémicas, no se observó ningún
efecto específico de p53 en esta línea. (Horvath y Weber (1988) han
descrito que los linfocitos humanos de la sangre periférica no
permiten apenas la infección del adenovirus. En experimentos
independientes, el recombinante infectó significativamente las
células K562 que no responden al tratamiento con adenovirus
A/C/\beta-gal recombinante, mientras que otras
líneas celulares, incluyendo la línea Hep G2 de referencia y las que
presentan un fuerte efecto de p53, fueron fácilmente infectables.
Por lo tanto, al menos parte de la variabilidad de la eficacia
parecería ser debida a la variabilidad de la infección, aunque
pueden estar implicados también otros factores.
Los resultados observados con el virus A/M/N/53
en la Figura 8 demuestran que la supresión completa es posible en un
medio in vivo. La reanudación del crecimiento tumoral en 2 de
cada 4 animales tratados con p53 a la MOI inferior más probablemente
procedía de un pequeño porcentaje de células no infectadas
inicialmente con el recombinante de p53 a esta dosis. La supresión
completa observada con A/M/N/53 a la dosis mayor, sin embargo,
demuestra que la capacidad de crecimiento del tumor para recuperarse
puede resolverse.
El trabajo presentado aquí y por otros grupos
(Chen et al. (1990); Takahashi et al. (1992)) han
demostrado que las células tumorales humanas que carecen de
expresión de p53 natural pueden ser tratadas ex vivo con p53
y producen la supresión del crecimiento del tumor cuando las células
tratadas se transfieren a un modelo animal. Los solicitantes
presentan la primera prueba de terapia génica del supresor tumoral
de un tumor probado in vivo, que produce tanto la supresión
del crecimiento del tumor como el aumento del tiempo de
supervivencia. En el sistema de los solicitantes, la administración
a las células del tumor no se basó en la inyección directa en la
masa tumoral. Más bien, se inyectó adenovirus recombinante de p53 en
el espacio peritumoral y se detectó la expresión del ARNm de p53
dentro del tumor. p53 expresada por los recombinantes era operativa
y suprimió de manera acusada el crecimiento del tumor en comparación
con la de referencia, tumores tratados con adenovirus que no
expresan a p53. Sin embargo, tanto los grupos con tumor tratados con
p53 como con virus de referencia presentaban supresión del tumor en
comparación con las referencias tratadas con tampón. Se ha
demostrado que la expresión local del factor de necrosis tumoral
(TNF), interferón (-\gamma), interleucina (IL)-2,
IL-4 o IL-7 pueden conducir a la
supresión temporal del tumor independiente de los linfocitos T en
ratones lampiños (Hoch et al. (1992)). La exposición de los
monocitos a viriones de adenovirus son también inductores débiles de
IFN-\alpha/\beta (reseñado en Gooding y Wold
(1990)). Por consiguiente, no es sorprendente que alguna supresión
del tumor no se observase en las células tumorales
Saos-2 tratadas con virus de referencia ex
vivo descritas al principio. La supresión del tumor in
vivo específica de p53 fue demostrada drásticamente por el
control continuo de los animales en la Figura 10. El tiempo de
supervivencia de los ratones tratados con p53 aumentó de forma
significativa, en 5 de cada 5 animales todavía vivos más de 130 días
después de la inoculación de las células en comparación con 0 de
cada 5 animales tratados con la referencia de adenovirus. Los
animales supervivientes presentan todavía tumores en desarrollo que
pueden reflejar células no infectadas inicialmente con el adenovirus
recombinante de p53. Los programas de dosificación superiores o más
frecuentes pueden estudiar esto. Además, la interrupción del
activador (Palmer et al. (1991)) o las mutaciones adicionales
pueden haber vuelto a estas células resistentes al tratamiento con
adenovirus recombinante de p53. Por ejemplo, las mutaciones en el
gen WAF1 descrito recientemente, un gen inducido por p53 natural que
inhibe posteriormente la evolución del ciclo celular en fase S
(El-Deiry et al. (1993); Hunter (1993))
pudieron producir un tumor resistente a p53.
Experimento nº
III
Este Ejemplo demuestra la utilización de genes
suicidas y la expresión específica en el tejido de dichos genes en
los métodos de terapia génica descritos en la presente memoria. Se
seleccionó el carcinoma hepatocelular como diana debido a que es uno
de los cánceres humanos más frecuentes que afectan al hombre, que
producen unas 1.250.000 muertes estimadas al año en todo el mundo.
La incidencia de este cáncer es muy alta en el sureste de Asia y
África donde está asociado a la infección por hepatitis B y C y a la
exposición a la aflatoxina. La cirugía es actualmente el único
tratamiento que ofrece potencial para curar el HCC, aunque menos del
20% de los pacientes se consideran candidatos para la extirpación
(Ravoet C. et al., 1993). Sin embargo, otros tumores aparte
del carcinoma hepatocelular son igualmente aplicables a los métodos
de reducción de su proliferación descritos en la presente
memoria.
Todas las líneas celulares excepto la línea
celular HLF se adquirieron en la American Type Tissue Culture
Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland. Los
números de registro de ATCC se indican entre paréntesis. Se utilizó
la línea celular 293 (CRL 1573) de riñón embrionario humano para
generar y propagar los adenovirus recombinantes descritos en la
presente memoria. Se mantuvieron en medio DME que contiene suero de
ternero enriquecido al 10% definido (Hyclone). Las líneas celulares
Hep 3B (HB 8064), Hep G2 (HB 8065) y HLF del carcinoma hepatocelular
se mantuvieron en medio DMF/F12 enriquecido con suero bovino fetal
al 10%, como lo fueron las líneas celulares
MDA-MB468 (HTB 132) y BT-549 (HTB
122) de carcinoma de mama. Se cultivaron células de hígado de Chang
(CCL 13) en medio MEM enriquecido con suero bovino fetal al 10%. La
línea celular HLF se obtuvo de los Drs. T. Morsaki y H. Kitsuki en
la Kyushu University School of Medicine en Japón.
Dos vectores de expresión adenovíricos
denominados en la presente memoria ACNTK y AANTK y desprovistos de
la función de la proteína IX (representados en la Figura 11) son
capaces de dirigir la expresión del gen suicida de TK en las células
tumorales. Se construyó un tercer vector de expresión adenovírico
denominado AANCAT para demostrar más la viabilidad de la expresión
génica con direccionamiento específico para los tipos de células
específicas que utilizan vectores adenovíricos. Estos montajes
adenovíricos se ensamblaron como se representa en las Figuras 11 y
12 y son derivados de los descritos anteriormente para la expresión
de los genes supresores del tumor.
Para la expresión del gen extraño, se han
insertado casetes de expresión que utilizan el activador/potenciador
precoz inmediato del citomegalovirus humano (CMV) (Boshart, M. et
al., 1985) o el activador potenciador de la fetoproteína alfa
humana (AFP) (Watanable, K. et al., 1987; Nakabayashi, H.
et al., 1989) para dirigir la transcripción del gen de TK o
el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El activador
potenciador de CMV es capaz de dirigir la expresión del gen
consistente en una amplia variedad de tipos de células mientras que
el montaje del potenciador/activador de AFP restringe la expresión a
las células de carcinoma hepatocelular (HCC) que expresa AFP en
aproximadamente el 70 al 80% de la población de HCC. En el montaje
que utiliza el activador/potenciador de CMV, la secuencia principal
tripartita del adenovirus tipo 2 se insertó también para potenciar
la traducción del transcrito de TK (Berkner, K. L. y Sharp, 1985).
Además de la deleción E1, ambos vectores de adenovirus son
eliminados adicionalmente por 1,9 kilobases (kb) de ADN en la zona
E3 vírica. El ADN eliminado en la zona E3 no es esencial para la
propagación del virus y su deleción aumenta la capacidad de
inserción del virus recombinante para el ADN extraño en una cantidad
equivalente (1,9 kb) (Graham y Prevec, 1991).
Para demostrar la especificidad del
activador/potenciador de AFP, se construyó también el virus AANCAT
donde la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) del gen marcador está
bajo el control del potenciador/activador de AFP. En el montaje
vírico ACNTK, la secuencia principal tripartita de Ad2 se colocó
entre el activador/potenciador de CMV y el gen con TK. Se ha
publicado que el principal tripartito aumenta la traducción de los
genes unidos. La sustitución E1 comunica la capacidad de los virus
recombinantes para replicar, restringir su propagación a las células
293 que suministran los productos génicos E1 de Ad5 en trans (Graham
et al., 1977).
Vector adenovírico ACNTK: Se utilizó el plásmido
pMLBKTK en HB101 de E. coli (de ATCC nº 39.369) como fuente
del gen de timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple
(HSV-1). Se extrajo TK de este plásmido como un
fragmento del gen de 1,7 kb con las enzimas de restricción Bgl II y
Pvu II y se subclonó en las enzimas de restricción EcoR V y Bam HI
compatibles del plásmido pSP72 (Promega) utilizando técnicas de
clonación normalizadas (Sambrook et al., 1989). La inserción
de TK se aisló a continuación como un fragmento de 1,7 kb de este
vector por digestión con Xba I y Bgl II y se clonó en el plásmido
pACN digerido con Xba I, BamHI (Wills et al. 1994). Veinte
(20) \mug de este plásmido denominado pACNTK se linealizaron con
Eco RI y se cotransfectaron en células 293 (ATCC CRL 1573) con 5
\mug de ACBGL digerido con Cla I (Wills et al., 1994
supra) utilizando el kit de transfección de CaPO_{4}
(Stratagene, San Diego, California). Se aislaron las placas víricas
y los recombinantes, denominados ACNTK, se identificaron por
análisis con digesto de restricción de ADN aislado con Xho I y
BsiWI. Los recombinantes positivos se purificaron más limitando la
dilución y se ampliaron y valoraron por métodos normalizados (Graham
y Prevec, 1991).
Vector adenovírico AANTK: Se clonaron el
activador (AFP-P) y el potenciador
(AFP-E) de \alpha-fetoproteína a
partir de un ADN genómico humano (Clontech) utilizando la ampliación
por PCR con cebadores que contienen secuencias de restricción en sus
extremos. Los cebadores utilizados para aislar el
AFP-E de 210 bp contenía la secuencia de restricción
Nhe I en el cebador 5' y un enlazador Xha I, Xho I, Kpn I en el
cebador 3'. La secuencia del cebador 5' fue 5'-CGC
GCT AGC TCT GCC CCA AAG AGC T-3. La secuencia del
cebador 5' fue 5'-CGC GGT ACC CTC GAG TCT AGA TAT
TGC CAG TGG TGG AAG-3'. Los cebadores utilizados
para aislar el fragmento AFE de 1763 bp contenían una secuencia de
restricción Not I en el cebador 5' y una secuencia Xba I en el
cebador 3'. La secuencia del cebador 5' fue 5'-CGT
GCG GCC GCT GGA GGA CTT TGA GGA TGT CTG TC-3'. La
secuencia del cebador en 3' fue 5'-CGC TCT AGA GAG
ACC AGT TAG GAA GTT TTC GCA-3'. Para la ampliación
por PCR, se desnaturalizó el ADN a 97ºC durante 7 minutos, seguido
de 5 ciclos de ampliación a 97ºC, 1 minuto, 53ºC, 1 minuto, 72ºC, 2
minutos y una ampliación final a 72ºC, 10 minutos. El AFE ampliado
se digirió con Not I y Xba I y se insertó en las secuencias Not I y
Xba I de un vector del plásmido (pA/ITR/B) que contenía las
secuencias 1 a 350 y 3.330 a 5.790 del adenovirus tipo 5 separadas
por un polienlazador que contenía las secuencias Not I, Xho I, Xba
I, Hind III, Kpn I, Bam HI, Nco I, Sma I y Bgl II. Se digirió el AFP
ampliado con Nhe I y Kpn I y se insertó en el montaje que contiene
AFP-E descrito anteriormente que había sido digerido
con Xba I y Kpn I. Este nuevo montaje se digirió más a continuación
con Xba I y NgoMI para eliminar las secuencias adenovíricas 3.370 a
5.780, que se sustituyeron posteriormente con un fragmento de
restricción Xba I, NgoMI del plásmido pACN que contenía los
nucleótidos 4.021 a 10.457 de adenovirus tipo 2 para construir el
plásmido pAAN que contiene tanto el potenciador como el activador de
la \alpha-fetoproteína. Este
montaje se digirió a continuación con Eco RI y Xba I para aislar un
fragmento de 2,3 kb que contiene la repetición terminal invertida de
Ad5, el AFP-E y el AFP-P que se ligó
posteriormente con un fragmento de 8,55 kb de pACNTK digerido con
Eco RI, Xba I descrito anteriormente para generar el pAANTK en el
que el gen TK es dirigido por el potenciador y el activador de la
\alpha-fetoproteína en un fondo de adenovirus.
Este plásmido se linealizó a continuación con Eco RI y se
cotransfectó con un fragmento grande de ALBGL digerido con Cla I
como anteriormente y recombinantes, denominados AANTK, en el que se
aislaron y purificaron como se describió anteriormente.
Vector adenovírico AANCAT: Se aisló el gen de
cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) del vector básico de pCAT
(Promega Corporation) mediante un digesto Xba I, Bam HI. Este
fragmento de 1,64 kb se ligó en pAAN digerido con Xba I, Bam HI
(descrito anteriormente) para crear pAANCAT. Este plásmido se
linealizó a continuación con Eco RI y se cotransfectó con el
fragmento grande de rA/C/\beta-gal digerido con
Cla I para crear AANCAT.
Se colocaron en placas a razón de 1 \times
10^{5} células/pocillo en una placa de cultivo tisular de 24
pocillos (Costar) y se dejaron adherir durante la noche (37ºC,
CO_{2} al 7%). Se realizaron infecciones durante la noche de ACBGL
a una multiplicidad de infección (MOI) de 30. Después de 24 horas,
se fijaron las células con formaldehído al 3,7%, PBS y se tiñeron
con 1 mg/ml de reactivo Xgal (USB). Se puntuaron los datos (+, ++,
+++) estimando el porcentaje de células teñidas positivamente para
cada MOI. [+=1-33%, ++=33-67% y
+++=>67%]
Se sembraron por triplicado dos (2) \times
10^{6} células (Hep G2, Hep 3B,HLF, Chang y
MDA-MB468) en placas de 10 cm y se incubaron durante
la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Se infectó a continuación cada
placa con AANCAT a una MOI=30 o 100 o no se infectaron y se dejaron
incubar durante 3 días. Las células se trataron a continuación con
tripsina y se lavaron con PBS y se volvieron a poner en suspensión
en 100 \mul de Tris 0,25 M pH 7,8. Las muestras se congelaron y
descongelaron 3 veces y se transfirió el sobrenadante a nuevos tubos
y se incubaron a 60ºC durante 10 minutos. Las muestras se
centrifugaron a continuación a 4ºC durante 5 minutos y en los
sobrenadantes se analizó la concentración de proteínas utilizando un
análisis Bradford (kit de análisis de proteínas de
Bio-Rad). Se ajustaron las muestras a
concentraciones de proteína iguales hasta un volumen final de 75
\mul utilizando Tris 0,25 M de acetil CoA 4 mM y 1 \mul de
^{14}C-cloranfenicol y se incubaron durante la
noche a 37ºC. Se añaden 500 \mul de acetato de etilo a cada
muestra y se mezclan agitando, seguido de centrifugación durante 5
minutos a temperatura ambiente. Se transfiere a continuación la fase
superior a un nuevo tubo y se evapora el acetato de etilo por
centrifugación a vacío. Los productos de reacción se redisuelven a
continuación en 25 \mul de acetato de etilo y se colocan juntos en
una placa de cromatografía en capa fina (TLC) y la placa se coloca a
continuación en una cámara para TLC equilibrada previamente
(cloroformo al 95%, metanol al 5%). Se deja el disolvente migrar a
continuación a la parte superior de la placa, a continuación se seca
la placa y se expone a una película de rayos X.
Se colocaron 5 \times 10^{3} células/pocillo
en una placa de microvaloración de 96 pocillos (Costar) y se dejaron
incubar durante la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Se diluyó en serie
virus ACN, ACNTK o AATK en DMEM; FBS al 15%; se utilizó glutamina al
1% para transfectar las células a una multiplicidad de infección de
30 durante toda la noche en cuyos puntos se dosificó por triplicado
ganciclovir (Cytovene) a intervalos log entre 0,001 y 100 mM
(micromolar). Se añadió 1 \muCi de
^{3}H-timidina (Amersham) a cada pocillo 12 a 18
horas antes de la recogida. A las 72 horas después de la infección
se recogieron las células en filtros de fibra de vidrio y se hizo el
recuento de la ^{3}H-timidina incorporada
utilizando centelleo líquido (TopCount, Packard). Los resultados se
representan en porcentaje de proliferación de la referencia no
tratada y se tabulan como dosis eficaz (ED_{50}±SD) para una
reducción del 50 por ciento de proliferación sobre las refe-
rencias del medio. Se estimaron los valores ED_{50} ajustando una ecuación logística a los datos de respuesta a la dosis.
rencias del medio. Se estimaron los valores ED_{50} ajustando una ecuación logística a los datos de respuesta a la dosis.
Se colocaron en placas células (HLF, de HCC
humano), se infectaron con ACN o ACNTK y se trataron con ganciclovir
para el ensayo de proliferación. A las 72 horas después de la
administración de ganciclovir, se centrifugaron las células, se
eliminó el sobrenadante. Las concentraciones de lactato
deshidrogenasa se midieron por colorimetría (Promega, Cytotox
96^{TM}). La liberación media (+/- S.D.) de LDH se representa
frente a M.O.I.
Se inyectaron por vía subcutánea células de
carcinoma hepatocelular humanas (Hep 3B) en diez (10) ratones nu/nu
atímicos hembra (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Cada animal
recibió aproximadamente 1 \times 10^{7} células en el costado
izquierdo. Se dejaron desarrollar los tumores durante 27 días antes
de distrubuir al azar los ratones por tamaño del tumor. Se trató a
los ratones con inyecciones intratumorales y peritumorales de ACNTK
o del virus ACN de referencia (1 \times 10^{9} ui en 100 \mul)
cada dos días durante un total de tres dosis. Comenzando 24 horas
después de la dosis inicial de adenovirus, se dosificó por vía
intraperitoneal a los ratones ganciclovir (100 mg/kg de Cytovene) al
día durante un total de 10 días. Se controló el tamaño del tumor y
el peso corporal de los ratones dos veces a la semana. Se hicieron
mediciones en los tumores en tres dimensiones utilizando
calibradores vernier y se calcularon los volúmenes utilizando la
fórmula 4/3 \pir^{3}, en la que r es la mitad de la dimensión
media del tumor.
Se utilizaron adenovirus recombinantes para
infectar tres líneas celulares de HCC (HLF, Hep3B y
Hep-G2). Se utilizaron como referencias una línea
celular de hígado humana (Chang) y dos líneas celulares de cáncer de
mama (MDAMB468 y BT549). Para demostrar la especificidad del
activador/potenciador de AFP, se construyó el virus AANCAT. Se
utilizó este virus para infectar las células que expresan (Hep 3B,
HepG2) o no (HLE, Chang, MDAMB468) la
alfa-fetoproteína (AFP) del marcador tumoral de HCC.
Como se muestra en la Figura 13, AANCAT dirige la expresión del gen
del marcador CAT solamente en aquellas células HCC que son capaces
de expresar AFP (Figura 13).
Se evaluó la eficacia de ACNTK y AANTK para el
tratamiento de HCC utilizando un ensayo de incorporación de
^{3}H-timidina para medir el efecto de la
combinación de la expresión de HSV-TK y del
tratamiento con ganciclovir en la proliferación celular. Se
infectaron las líneas celulares con ACNTK o AANTK o virus ACN de
referencia (Wills et al., 1994 supra), que no dirige
la expresión de HSV-TK y a continuación se trataron
con concentraciones crecientes de ganciclovir. Se evaluó el efecto
de este tratamiento en función de las concentraciones crecientes de
ganciclovir y se determinó la concentración de ganciclovir requerida
para inhibir la ^{3}H-timidina incorporada por el
50% (ED_{50}). Además, se determinó una medición relativa de la
transferencia y de la expresión del gen mediada por adenovirus de
cada línea celular utilizando un virus de referencia que dirige la
expresión de la beta-galactosidasa del gen marcador.
Los datos presentados en la Figura 14 y en la Tabla 1 a continuación
demuestran que el tratamiento de la combinación virus
ACNTK/ganciclovir fue capaz de inhibir la proliferación celular en
todas las líneas celulares examinadas en comparación con el
adenovirus ACN de referencia en combinación con ganciclovir. En
cambio, el vector vírico AANTK fue solamente eficaz en aquellas
líneas celulares de HCC que se ha demostrado que expresan la
\alpha-fetoproteína.
Además, la combinación AANTK/GCV fue más eficaz cuando las células se colocaron en placas a
Además, la combinación AANTK/GCV fue más eficaz cuando las células se colocaron en placas a
\hbox{altas densidades.}
| Línea celular | aFP | Expresión de \beta-gal | ACN | ED50 ACNTK | AANTK |
| MDAMB468 | - | +++ | >100 | 2 | >100 |
| BT549 | - | +++ | >100 | <0,3 | >100 |
| HLF | - | +++ | >100 | 0,8 | >100 |
| CHANG | - | +++ | >100 | 22 | >100 |
| HEP-3B | - | + | 80 | 8 | 8 |
| HEP-G2 BAJO | + | ++ | 90 | 2 | 35 |
| HEP-G2 ALTO | + | ++ | 89 | 0,5 | 4 |
Se trataron por vía intratumoral y peritumoral
ratones lampiños con tumores Hep3B (N=5/grupo) con dosis
equivalentes de ACNTK o ACN de referencia. Veinticuatro horas
después de la primera administración de adenovirus recombinante, se
inició el tratamiento diario de ganciclovir en todos los ratones.
Las dimensiones del tumor para cada animal se midieron dos veces a
la semana con calibradores y los tamaños medios del tumor se
representan en la Figura 16. El tamaño medio del tumor el día 58 fue
más pequeño en los animales tratados con ACNTK pero la diferencia no
alcanzó significancia estadística (p<0,09, prueba de la t para
datos independientes). Estos datos apoyan un efecto específico de
ACNTK en el crecimiento del tumor in vivo. No se detectaron
diferencias significativas en el peso corporal medio entre los
grupos.
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Claims (27)
1. Una composición farmacéutica que comprende un
vector de expresión de adenovirus recombinante, comprendiendo el
vector un gen que codifica una proteína extraña y una deleción total
de la secuencia de codificación de la proteína IX.
2. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, que comprende además la deleción de una secuencia
de ADN denominada adenovirus E1a y E1b.
3. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1 o 2, que comprende además la deleción de una
secuencia de ADN en la zona 3 inicial y/o en la zona 4 inicial.
4. La composición farmacéutica de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una deleción de
hasta cuarenta nucleótidos situados en 3' con respecto a la deleción
de la proteína IX y una molécula de ADN extraño que codifica una
señal de poliadenilación.
5. La composición farmacéutica de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el adenovirus es un
adenovirus del Grupo C seleccionado de un serotipo 1,2 5 o 6.
6. La composición farmacéutica de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el gen es una molécula de
ADN de hasta 2,6 kilobases.
7. La composición farmacéutica de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el gen es una molécula de
ADN de hasta 4,5 kilobases.
8. La composición farmacéutica de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el gen codifica una
proteína operativa, una proteína no operativa o uno de los
fragmentos de la proteína.
9. La composición farmacéutica de la
reivindicación 8, en la que la proteína operativa es una proteína
supresora del tumor.
10. La composición farmacéutica de la
reivindicación 8, en la que la proteína operativa es una proteína
suicida.
11. Un kit para reducir la proliferación de
células tumorales, comprendiendo dicho kit una composición
farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, un
agente terapéutico seleccionado del grupo consistente en
ganciclovir, 6-metoxipurina arabinonucleósido,
5-fluorouracilo,
6-metil-purina-2'-desoxirribo-nucleósido,
y sus combinaciones, y uno o más excipientes farmacéuticamente
aceptables.
12. Un vector de expresión de adenovirus
recombinante que comprende un gen que codifica una proteína extraña
y una deleción total de la secuencia de codificación de la proteína
IX.
13. El vector de expresión de adenovirus
recombinante de la reivindicación 12, que comprende además la
deleción de una secuencia de ADN denominada adenovirus E1a y
E1b.
14. El vector de expresión de adenovirus
recombinante de la reivindicación 12 o 13, que comprende además la
deleción de una secuencia de ADN en la zona 3 inicial y/o en la zona
4 inicial.
15. El vector de expresión del adenovirus
recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que
comprende además una deleción de hasta cuarenta nucleótidos situados
en 3' con respecto a la deleción de la proteína IX y una molécula de
ADN extraño que codifica una señal de poliadenilación.
16. El vector de expresión del adenovirus
recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en
la que el adenovirus es un adenovirus del Grupo C seleccionado de un
serotipo 1,2 5 o 6.
17. El vector de expresión del adenovirus
recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en
la que el gen es una molécula de ADN de hasta 2,6 kilobases.
18. El vector de expresión del adenovirus
recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en
la que el gen es una molécula de ADN de hasta 4,5 kilobases.
19. El vector de expresión del adenovirus
recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, en
la que el gen codifica una proteína operativa, una proteína no
operativa o uno de los fragmentos de la proteína.
20. El vector de expresión del adenovirus
recombinante de la reivindicación 19, en la que la proteína
operativa es una proteína supresora del tumor.
\newpage
21. El vector de expresión del adenovirus
recombinante de la reivindicación 19, en la que la proteína
operativa es una proteína suicida.
22. La utilización del adenovirus recombinante
de una cualquier de las reivindicaciones 20 a 21 para la preparación
de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del cáncer,
composición farmacéutica que comprende además uno o más excipientes
farmacéuticamente aceptables.
23. La utilización de la reivindicación 22, en
la que el cáncer está asociado a una carencia de proteína endógena
supresora del tumor.
24. La utilización de la reivindicación 23, en
la que el cáncer es el cáncer pulmonar no microcítico, cáncer es el
cáncer pulmonar microcítico, hepatocarcinoma, melanoma,
retinoblastoma, tumor de mama, carcinoma colorrectal, leucemia,
linfoma, tumor cerebral, crcinoma cervical, sarcoma, tumor de
próstata, tumor de vejiga, tumor de los tejidos
reticuloendoteliales, tumor de Wilms, astrocitoma, glioblastoma,
neuroblastoma, carcinoma de ovario, osteosarcoma y cáncer renal.
25. La utilización del adenovirus recombinante
de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21 para la
preparación de una composición farmacéutica destinada a inhibir la
proliferación de un tumor en un animal, composición farmacéutica que
comprende además uno o más excipientes farmacéuticamente
aceptables.
26. La utilización del adenovirus recombinante
de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21 para la
preparación de una composición farmacéutica destinada a reducir la
proliferación de células tumorales en un paciente, en la que la
composición farmacéutica comprende además una cantidad eficaz de un
agente terapéutico seleccionado del grupo consistente en
ganciclovir, arabinonucleósido de 6-metoxipurina,
5-fluorouracilo,
6-metil-purina-2'-desoxirribonucleósido,
y sus combinaciones, y uno o más excipientes farmacéuticamente
aceptables.
27. La utilización de la reivindicación 26, en
la que las células tumorales son el carcinoma hepatocelular.
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