EP1753868A2

EP1753868A2 - Fermentative herstellung von feinchemikalien unter verwendung eines fermentationsmediums, welches verflüssigte und verzuckerte stärke aus einer vermahlenen stärkequelle als zuckerquelle beinhaltet

Info

Publication number: EP1753868A2
Application number: EP05754405A
Authority: EP
Inventors: Markus Pompejus; Stephan Freyer; Markus Lohscheidt; Oskar Zelder; Matthias Boy
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2004-05-28
Filing date: 2005-05-27
Publication date: 2007-02-21
Also published as: TWI386488B; CN1981045B; DE102004026152A1; MXPA06013512A; MX291201B; ZA200610738B; PH12006502292B1; JP2008500823A; EA015492B1; US20090162892A1; AU2005248061A1; KR101317064B1; JP4659825B2; AR049122A1; US9109244B2; UA89785C2; CA2566475A1; WO2005116228A2; EA015492B9; TW200613557A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung wenigstens eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, umfassend: a) die Herstellung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-% aus einer Stärkequelle, wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch nicht-stärkehaltige feste Bestandteile der Stärkequelle umfasst; b) die Fermentation des zuckerhaltigen Flüssigmediums zur Produktion des(der) Stoffwechselprodukte(s); und c) Abreicherung oder Isolierung wenigstens eines Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe, wobei man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechselprodukt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm mit dem zuckerhaltigen Flüssigmedium kultiviert, welches man erhält durch: a1) Vermahlen der Stärkequelle; und a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man mindestens eine Teilmenge des Mahlguts durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe zur wässrigen Flüssigkeit verflüssigt.

Description

Fermentative Hersteilung von Feinchemikalien

Die vorliegende Erfindung betrifft die fermentative Herstellung von Feinchemikalien durch Vermählen, Verflüssigen und Verzuckern von Stärkequellen und den Einsatz der dadurch gewonnenen Zuckerlösung als Fermentationsmedium.

Fermentative Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien wie z.B. Aminosäuren, Vitaminen und Carotenoiden durch Mikroorganismen sind allgemein bekannt. In Abhängigkeit von den verschiedenen Verfahrensbedingungen werden dabei unterschied- liehe Kohlenstoffquellen genutzt. Diese reichen von reiner Saccharose über Rüben- und Zuckerrohrmelasse, sogenannten „high test molasses" (invertierte Zuckerrohrmelasse) bis hin zu Glucose aus Stärkehydrolysaten. Für die biotechnologische Herstellung von L-Lysin werden darüber hinaus Essigsäure und Ethanol als großtechnisch einsetzbare Co-Substrate genannt (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysi- ne, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-112).

Auf Basis der genannten Kohlenstoffquellen sind verschiedene Methoden und Vorgehensweisen zur zuckerbasierten, fermentativen Herstellung von Feinchemikalien etabliert. Am Beispiel des L-Lysins werden diese beispielsweise von Pfefferle et al. (a.a.O.) im Hinblick auf Stammentwicklung, Prozessentwicklung und großtechnische Produktion beschrieben.

Eine wichtige Kohlenstoffquelle für die durch Mikroorganismen vermittelte fermentative Herstellung von Feinchemikalien ist Stärke. Diese muss in vorgelagerten Reaktions- schritten zunächst verflüssigt und verzuckert werden, bevor sie als Kohlenstoffquelle in einer Fermentation genutzt werden kann. Hierzu wird die Stärke aus einer natürlichen Stärkequelle wie Kartoffeln, Cassava, Getreide, z.B. Weizen, Mais, Gerste, Roggen, Triticale oder Reis üblicherweise in vorgereinigter Form gewonnen und anschließend enzymatisch verflüssigt und verzuckert, um dann in der eigentlichen Fermentation zur Produktion der Feinchemikalien eingesetzt zu werden.

Neben dem Einsatz derartig vorgereinigter Stärkequellen ist auch die Verwendung nicht-vorbehandelter Stärkequellen zur Herstellung von Kohlenstoffquellen für die fermentative Produktion von Feinchemikalien beschrieben worden. Typischerweise wer- den die Stärkequellen dabei zunächst durch Mahlen zerkleinert. Das Mahlgut wird dann einer Verflüssigung und Verzuckerung unterworfen. Da dieses Mahlgut naturgemäß neben Stärke noch eine Reihe von nicht-stärkehaltigen Bestandteilen enthält, die die Fermentation nachteilig beeinflussen, werden diese Bestandteile üblicherweise vor der Fermentation abgetrennt. Die Entfernung kann entweder direkt nach dem Mahlen (WO 02/277252; JP 2001 -072701 ; JP 56-169594; CN 1218111 ), nach der Verflüssigung (WO 02/277252; CN 1173541 ) oder im Anschluss an die Verzuckerung (CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give eulture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229) erfolgen. In allen Varianten wird jedoch ein weitgehend reines Stärkehydrolysat in der Fermentation eingesetzt.

Neuere Techniken befassen sich insbesondere mit verbesserten Methoden, die vor der Fermentation eine Aufreinigung z.B. von verflüssigten und verzuckerten Stärkelösungen (JP 57159500) und von Fermentationsmedien aus erneuerbaren Ressourcen (EP 1205557) ermöglichen sollen.

Unaufbereitete Stärkequellen finden hingegen bekanntermaßen in großem Umfang Einsatz bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol. Dabei ist das als „Dry- milling" bekannte Verfahren des trockenen Vermahlens, Verflüssigens und Verzu- ckerns von Stärkequellen technisch in großem Maßstab etabliert. Entsprechende Prozessbeschreibungen finden sich z.B. in „The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques et al. (Hg.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1 -8977676-735, und in McAloon et al., „Determining the cost of producing ethanol from com starch and lignocellulosic feedstocks" ,NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.

Bei den Dry-milling-Verfahren werden im ersten Schritt ganze Getreidekörner fein ver- mahlen, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Hirse und Roggen. Im Gegensatz zum sogenannten „Wet-Milling"-Verfahren wird dabei keine zusätzliche Flüssigkeit zugesetzt. Das Zermahlen in feine Bestandteile dient dazu, die in den Körnern enthaltene Stärke in der nachfolgenden Verflüssigung und Verzuckerung der Einwirkung von Wasser und Enzymen zugänglich zu machen.

Da bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol das Wertprodukt durch Destillation gewonnen wird, stellt der Einsatz von Stärkequellen aus dem Dry-Milling-Prozess in nicht vorgereinigter Form kein spezielles Problem dar. Bei der Anwendung eines Dry- Milling-Verfahrens zur Produktion von Feinchemikalien ist jedoch der über die Zucker- lösung in die Fermentation eingetragene Feststoffstrom problematisch, da dieser sich sowohl negativ auf die Fermentation auswirken kann als auch die anschließende Aufarbeitung nicht unerheblich erschwert.

So ist für viele Fermentationen die Sauerstoffversorgung der eingesetzten Mikroorga- nismen, insbesondere wenn diese einen hohen Sauerstoffbedarf haben, ein limitierender Faktor. Über den Einfluss hoher Feststoffkonzentrationen auf den Sauerstoffübergang von der Gas- in die Flüssigphase und somit auf die Sauerstofftransferrate ist allgemein wenig bekannt. Es ist andererseits bekannt, dass eine mit zunehmender Feststoffkonzentration ansteigende Viskosität zu einer verminderten Sauerstofftransferrate führt. Werden darüber hinaus oberflächenaktive Substanzen mit den Feststoffen in das Fermentationsmedium eingetragen, so beeinflussen diese die Koalugationsneigung der Gasblasen. Die dadurch resultierende Blasengröße beeinflusst ihrerseits maßgeblich den Sauerstofftransfer (Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreac- tors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370). Durch den Feststoffeintrag kann in Bezug auf die Viskosität der verwendeten Medien bereits bei der Herstellung der stärkehaltigen Suspension ein kritischer Wert erreicht werden, weil z.B. eine Suspension mit mehr als 30 Gew.-% Maismehl in Wasser nicht mehr homogen mischbar ist (Industrial Enzymology, 2. Aufl., T. Godfrey, S. West, 1996). Dadurch ist bei herkömmlichem Vorgehen die Glucosekonzentration begrenzt. Aus verfahrensökonomischen Gründen ist es in der Regel nachteilig, mit Lösungen geringerer Konzentration zu arbeiten, weil dies zu einer überproportionalen Verdünnung der Fermentationsbrühe führt. Dadurch sinkt die erreichbare Endkonzentration der Zielprodukte, was zusätzliche Kosten bei deren Isolierung verursacht, und die Raum-Zeit-Ausbeute nimmt ab, was bei gleicher Produktionsmenge zu einem größeren Volumenbedarf, d.h. zu höheren Investitionskosten, führt.

Bei der Aufarbeitung können sich aus der erhöhten Feststoffkonzentration besondere Schwierigkeiten für den Einsatz spezieller Methoden ergeben. So ist z.B. bei der Aufreinigung der Fermentationsbrühe mittels lonenaustauschchromatographie die Neigung der eingesetzten Chromatographie-Säule zur Verblockung (d.h. Verstopfung) zu berücksichtigen.

Aufgrund dieser Schwierigkeiten eignen sich bisher bekannte Varianten des Dry- Milling-Verfahrens nicht zur Bereitstellung von Stärkequellen für die fermentative Herstellung von Feinchemikalien und sind daher ohne wesentliche wirtschaftliche Bedeutung. Versuche zur Übertragung des Dry-Milling-Konzepts und der mit diesem Verfahren verbundenen prinzipiellen Vorteile auf die großtechnische Herstellung von Fein- Chemikalien sind bisher lediglich unter Verwendung von Cassava als Stärkequelle beschrieben worden.

So beschreibt die JP 2001/275693 zwar ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, bei dem man als Stärkequelle geschälte Cassavaknollen einsetzt, die trocken vermählen wurden. Zur Durchführung des Verfahrens ist es jedoch erforderlich, eine Teilchengröße des Mahlgutes von ≤ 150 μm einzustellen. Bei der dazu angewendeten Filtration werden mehr als 10 Gew.-% des eingesetzten Mahlguts, einschließlich nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Verflüssigung/Verzuckerung der enthaltenen Stärke und der anschließenden Fermentation abgetrennt. Darüber hinaus stellt sich hier die Problematik des Abtrennens von nicht-stärkehaltigen Bestandteilen insofern nicht, als da die Fermentationsprodukte, z.B. Lysin, als Futtermittelzusatz bestimmt sind und daher die nicht-stärkehaltigen Bestandteile der Cassava im Wertprodukt verbleiben können.

Ein ähnliches Verfahren wird in der JP 2001/309751 zur Herstellung eines aminosäu- rehaltigen Futterzusatzes beschrieben. Entsprechend ist hier eine Aufreinigung bzw. Feststoffabtrennung nicht erforderlich. Cassava sollte jedoch im Vergleich zu anderen Stärkequellen für das Dry-Milling relativ unproblematisch sein. Während der Stärkeanteil der Cassavawurzel in trockenem Zustand typischerweise wenigstens 80 Gew.-% beträgt (Menezes et al., Fungal celluloses as an aid for the saccharification of Cassava, Biotechnology and Bioengineering, Bd. 20 (4), 1978, John Wiley and Sons, Inc., Tabelle 1 , Seite 558), liegt der Trockengehalt an Stärke im Vergleich dazu bei Getreide deutlich niedriger, in der Regel unterhalb 70 Gew.-%, z.B. bei Mais bei etwa 68 Gew.-% und bei Weizen bei etwa 65 Gew.-% (Jaques et al., The Alcohol Textbook, s.o.). Dementsprechend enthält die nach Verflüssigung und Verzuckerung erhaltene Glucoselösung bei Einsatz von trocken ver- mahlener Cassava weniger Fremdbestandteile und insbesondere weniger Feststoffe als bei Einsatz einer anderen trocken vermahlenen Stärkequelle.

Durch eine erhöhte Menge an Fremdbestandteilen wird die Viskosität der Reaktionsmischung erhöht. Stärke aus Cassava sollte jedoch relativ leicht zu verarbeiten sein. Zwar weist sie im Vergleich zu Maisstärke eine höhere Viskosität bei der Quellungstemperatur auf, dafür nimmt die Viskosität jedoch bei ansteigender Temperatur bei Cassava schneller ab als bei Maisstärke (Menezes, T.J.B. de, Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production, Process Biochemistry, 1978, Seite 24, rechte Spalte). Darüber hinaus sind die Quellungs- und Gelatinierungstemperaturen von Stärke aus Cassava niedriger als die von Stärke aus Getreide wie Mais, weshalb sie leichter für bakterielle -Amylase zugänglich ist als Getreidestärke (Menezes, T.J.B. de, a.a.O.).

Weitere Vorteile von Cassava gegenüber anderen Stärkequellen sind ihr geringer Cel- lulosegehalt und ihr niedriger Phytatgehalt. Cellulose und Hemicellulose können insbe- sondere unter sauren Verzuckerungsbedingungen in Furfurale umgewandelt werden (Jaques et al., The Alcohol Textbook, s.o.; Menezes, T.J.B. de, s.o.), die ihrerseits auf die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen eine inhibierende Wirkung haben können. Phytat inhibiert ebenfalls die für die Fermentation eingesetzten Mikroorganismen.

Während es somit technisch möglich ist, Cassava als Stärkequelle in einem dem Dry- milling entsprechenden Verfahren zu verarbeiten, so ist ein solches Verfahren auf Basis von Cassava dennoch komplex, nicht optimiert und daher nicht weit verbreitet.

Es war somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein effizientes Verfahren zur fermentativen Herstellung von Feinchemikalien bereitzustellen, das die Verwendung einer Vielzahl stärkehaltiger, weltweit lokal verfügbarer Pflanzen, z.B. Getreide oder Kartoffeln, als Stärkequelle erlaubt. Das Verfahren sollte sich durch eine leichte Handhabbarkeit der verwendeten Medien auszeichnen und insbesondere aufwändige Vor- oder Aufreinigungsschritte, wie etwa die Abtrennung fester nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Fermentation vermeiden. Außerdem sollte es eine leichte Aufarbeitung des Fermentationsgemisches ermöglichen. Im Rahmen der von der Anmelderin durchgeführten Arbeiten wurde überraschend gefunden, dass ein solches Verfahren trotz des inhärent erhöhten Feststoffeintrags effizient durchführbar ist. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung wenigstens eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, umfassend:

a) die Herstellung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosaccharid- gehalt von mehr als 20 Gew.-% aus einer Stärkequelle, wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch nicht-stärkehaltige feste Bestandteile der Stärkequelle um- f asst;

b) die Fermentation des zuckerhaltigen Flüssigmediums zur Produktion des(der) Stoffwechselprodukte(s); und

c) Abreicherung oder Isolierung wenigstens eines Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe,

dadurch gekennzeichnet, dass man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechselpro- dukt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm mit dem zuckerhaltigen Flüssigmedi- um kultiviert, welches man erhält durch:

a1 ) Vermählen der Stärkequelle; und

a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindes- tens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man mindestens eine Teilmenge des Mahlguts durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe zur wässrigen Flüssigkeit verflüssigt.

Als Stärkequelle kommen vor allem trockene Kornfrüchte oder Samen in Betracht, die in getrocknetem Zustand mindestens 40 Gew.-% und bevorzugt mindestens 50 Gew.- % Stärkeanteil aufweisen. Diese finden sich in vielen der heutzutage in großem Maßstab kultivierten Getreidepflanzen wie Mais, Weizen, Hafer, Gerste, Roggen, Triticale, Reis und verschiedenen Hirsesorten, z.B. Sorghum und Milo. Bevorzugt ist die Stärke- quelle unter Getreidekörnern, besonders bevorzugt unter Mais-, Roggen-, Triticale- und Weizenkörnern ausgewählt. Grundsätzlich lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit anderen Stärkequellen durchführen, wie beispielsweise Kartoffeln, Cassa- va/Tapioka oder einer Mischung verschiedener stärkehaltiger Früchte oder Samen.

Bei den in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltenen Zuckern handelt es sich vorzugsweise um Monosaccharide wie Hexosen und Pentosen, z.B. Glucose, Fructo- se, Mannose, Galactose, Sorbose, Xylose, Arabinose und Ribose, insbesondere um Glucose. Der Anteil an von Glucose verschiedenen Monosacchariden kann abhängig von der verwendeten Stärkequelle und den darin enthaltenen nicht-stärkehaltigen Be- standteilen variieren und durch die Verfahrensführung, beispielsweise durch Auf- schluss von Cellulosebestandteilen durch Zusatz von Cellulasen, beeinflusst werden. Vorteilhafterweise umfassen die Monosaccharide des zuckerhaltigen Flüssigmediums einen Anteil an Glucose von mindestens 60 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 80 Gew.-%, bezogen auf die in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltene gesamte Zuckermenge. Üblicherweise liegt der Gluco- seanteil im Bereich von 75 bis 99 Gew.-%, insbesondere von 80 bis 97 Gew.-% und speziell von 85 bis 95 Gew.-%, bezogen auf die in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltene gesamte Zuckermenge.

Erfindungsgemäß enthält das zuckerhaltige Flüssigmedium, mit welchem der die gewünschten Stoffwechselprodukte produzierende Mikroorganismenstamm kultiviert wird, zumindest einen Teil, vorzugsweise wenigstens 20 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-%, speziell wenigstens 90 Gew.-% und ganz speziell wenigstens 99 Gew.-% der in den vermahlenen Getreidekörnern enthaltenen nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile, entsprechend dem Ausmahlungsgrad. Bezogen auf die stärkehaltigen Bestandteile des Mahlguts (und damit auf die Menge an Monosaccharid im zuckerhaltigen Flüssigmedium) beträgt der Anteil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium vorzugsweise wenigstens 10 Gew.-% und insbesondere wenigstens 25 Gew.-%, z.B. zwischen 25 und 75 Gew.-% und speziell zwischen 30 und 60 Gew.-%.

Zur Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums wird im Schritt a1) die jeweilige Stärkequelle mit oder ohne Zusatz von Flüssigkeit, z.B. Wasser, vermählen, bevorzugt ohne Zusatz von Flüssigkeit. Es kann auch eine Trockenvermahlung mit einer anschließenden Nassvermahlung kombiniert werden. Zur trockenen Vermahlung werden typischerweise Hammermühlen, Rotormühlen oder Walzen-Schrotmühlen eingesetzt; zur Nassvermahlung eignen sich Rührmixer, Rührwerkskugelmühlen, Zirkulationsmühlen, Scheibenmühlen, Ringkammermühlen, Schwingmühlen oder Planetenmühlen. Grundsätzlich kommen auch andere Mühlen in Betracht. Die zur Nassvermahlung erforderliche Flüssigkeitsmenge kann der Fachmann in Routineexperimenten ermitteln. Üblicherweise wird sie so eingestellt, dass der Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 20 Gew.-% liegt.

Durch das Mahlen wird eine für die sich anschließenden Verfahrensschritte geeignete Korngröße eingestellt. Hierbei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das beim Vermählen, insbesondere bei trockener Vermahlung, im Schritt a1) erhaltene Mahlgut Mehlpartikel, d.h. teilchenförmige Bestandteile, mit einer Korngröße im Bereich von 100 bis 630 μm in einem Anteil von 30 bis 100 Gew.-%, bevorzugt 40 bis 95 Gew.-% und besonders bevorzugt 50 bis 90 Gew.-% aufweist. Vorzugsweise enthält das erhaltene Mahlgut 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 μm. In der Regel weisen mindestens 95 Gew.-% der ermahlenen Mehlpartikel eine Korngröße von weniger als 2 mm auf. Die Messung der Korngröße erfolgt dabei mittels Siebanalyse unter Verwendung einer Vibrations-Analysenmaschine. Eine geringe Korngröße ist grundsätzlich zur Erzielung einer hohen Produktausbeute vorteilhaft. Eine zu geringe Teilchengröße kann jedoch zu Problemen, insbesondere durch Klumpenbildung/Agglomeration, beim Anmaischen des Mahlguts während der Verflüssigung bzw. bei der Aufarbeitung, z.B. bei der Trocknung der Feststoffe nach dem Fermentati- onsschritt, führen.

Üblicherweise werden Mehle durch den Ausmahlungsgrad bzw. durch die Mehltype charakterisiert, wobei diese so miteinander korrelieren, dass mit zunehmendem Ausmahlungsgrad auch die Kennzahl der Mehltype zunimmt. Der Ausmahlungsgrad ent- spricht der Gewichtsmenge des gewonnenen Mehls bezogen auf 100 Gewichtsteile des eingesetzten Mahlguts. Während beim Mahlen zunächst reines, feinstes Mehl, z.B. aus dem Inneren des Getreidekorns, anfällt, nimmt beim weiteren Vermählen, also mit steigendem Ausmahlungsgrad, der Anteil an Rohfaser- und Schalengehalt im Mehl zu, der Stärkeanteil wird dabei geringer. Der Ausmahlungsgrad spiegelt sich daher auch in der sogenannten Mehltype wider, die als Zahlenangabe zur Klassifizierung von Mehlen, insbesondere von Getreidemehlen, verwendet wird und die auf dem Aschegehalt des Mehles beruht (sogenannte Ascheskala). Die Mehltype bzw. die Typenzahl gibt hierbei die Menge Asche (Mineralstoffe) in mg an, die beim Verbrennen von 100 g Mehltrockensubstanz zurück bleibt. Für Getreidemehle bedeutet eine höhere Typzahl einen höheren Ausmahlungsgrad, da der Kern des Getreidekorns in etwa 0,4 Gew.-%, die Schale hingegen etwa 5 Gew.-% Asche enthält. Bei niederem Ausmahlungsgrad bestehen die Getreidemehle also überwiegend aus dem zerkleinerten Mehlkörper, d.h. dem Stärkebestandteil der Getreidekörner; bei höherem Ausmahlungsgrad enthalten die Getreidemehle auch die zerkleinerte, eiweißhaltige Aleuronschicht der Getreide- körner, bei Schrot auch die Bestandteile des eiweiß- und fetthaltigen Keimlings sowie der rohfaser- und aschehaltigen Samenschalen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind grundsätzlich Mehle mit einem hohen Ausmahlungsgrad bzw. einer hohen Typzahl bevorzugt. Wird Getreide als Stärkequelle eingesetzt, so werden vorzugsweise die ganzen ungeschälten Körner vermählen und weiter verarbeitet.

Gegebenenfalls wird man die Stärkequelle vor dem Vermählen auf eine für das Vermählen geeignete Größe zerkleinern, beispielsweise bei Einsatz größerer Früchte wie Kartoffeln oder Cassava. Im Falle von Getreide kann dieser Zerkleinerungsschritt entfallen, und das ganze Korn wird eingesetzt und vermählen.

Zum Verflüssigen des Stärkeanteils im Mahlgut gibt man im Schritt a2) wenigstens eine Teilmenge des Mahlgutes, vorzugsweise wenigstens 40 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt wenigstens 55 Gew.-% im Verlauf der Verflüssigung, jedoch vor der Verzuckerung in den Reaktor. Häufig wird die zuge- gebene Menge 90 Gew.-%, insbesondere 85 Gew.-% und besonders bevorzugt 80 Gew.-% nicht überschreiten. Vorzugsweise wird die im Verlauf zugegebene Teilmenge an Mahlgut dem Reaktor unter Bedingungen zugeführt, wie sie bei der Verflüssigung vorliegen. Die Zugabe kann diskontinuierlich, d.h. portionsweise in mehreren Teilportionen, die vorzugsweise jeweils nicht mehr als 20 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10 Gew.-%, z.B. 1 bis 20 Gew.-% insbesondere 2 bis 10 Gew.-%, der Gesamtmenge des zu verflüssigenden Mahlgutes ausmachen, oder kontinuierlich erfolgen. Erfindungswesentlich ist, dass sich zu Beginn der Verflüssigung nur ein Teil des Mahlgutes, vorzugsweise nicht mehr als 60 Gew.-%, insbesondere nicht mehr als 50 Gew.-% und besonders bevorzugt nicht mehr als 45 Gew.-% des Mahlgutes, im Reaktor befindet und die Restmenge des Mahlgutes während des Verflüssigens zugegeben wird. Die Verflüssigung kann auch kontinuierlich, z.B. in einer mehrstufigen Reaktionskaskade, ausgeführt werden.

Erfindungsgemäß erfolgt das Verflüssigen in Schritt a2) in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms, das vorzugsweise unter α-Amylasen ausgewählt ist. Andere unter den Reaktionsbedingungen aktive und stabile Stärke verflüssigende Enzyme sind ebenfalls einsetzbar.

Die α-Amylase (bzw. das verwendete Stärke verflüssigende Enzym) kann im Reaktionsgefäß vorgelegt oder im Verlauf des Schrittes a2) zugegeben werden. Vorzugsweise gibt man eine Teilmenge der in Schritt a2) benötigten α-Amylase zu Beginn von Schritt a2) zu oder legt diese Teilmenge im Reaktor vor. Die Gesamtmenge an α- Amylase liegt üblicherweise im Bereich von 0,002 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 bis 1 ,5 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.

Die Verflüssigung kann oberhalb oder unterhalb der Gelierungstemperatur durchgeführt werden. Vorzugsweise erfolgt die Verflüssigung in Schritt a2) zumindest zeitweise oberhalb der Gelierungstemperatur der eingesetzten Stärke (sogenannter Cooking Prozess). In der Regel wird eine Temperatur im Bereich zwischen 70 und 165°C, bevorzugt zwischen 80 und 125 °C und besonders bevorzugt zwischen 85 und 1 15 °C gewählt, wobei die Temperatur vorzugsweise mindestens 5°C und besonders bevorzugt mindestens 10°C oberhalb der Gelierungstemperatur liegt.

Für eine optimale Wirkung der α-Amylase wird Schritt a2) vorzugsweise zumindest zeitweise bei einem pH-Wert im schwach sauren Bereich, vorzugsweise zwischen 4,0 und 7,0, besonders bevorzugt zwischen 5,0 bis 6,5 durchgeführt, wobei üblicherweise vor oder zu Beginn von Schritt a2) die pH-Einstellung vorgenommen wird; dieser pH- Wert wird während der Verflüssigung vorzugsweise kontrolliert und gegebenenfalls nachgestellt. Die Einstellung des pH-Werts erfolgt vorzugsweise mit verdünnten Mineralsäuren wie H₂SO₄ oder H₃PO₄ bzw. mit verdünnten Alkalilaugen wie NaOH oder KOH.

In einer bevorzugten Ausführungsform führt man Schritt a2) des erfindungsgemäßen Verfahrens so durch, dass zunächst eine Teilmenge von höchstens 60 Gew.-%, bevorzugt höchstens 50 Gew.-% und besonders bevorzugt höchstens 45 Gew.-%, z.B. 10 bis 60 Gew.-%, insbesondere 15 bis 50 Gew.-% und besonders bevorzugt 20 bis 45 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge des Mahlguts, in einer wässrigen Flüssigkeit, z.B. Frischwasser, rückgeführtes Prozesswasser, z.B. aus der Fermentation oder der Aufarbeitung, oder in einer Mischung dieser Flüssigkeiten suspendiert wird und anschließend die Verflüssigung durchgeführt wird.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die zur Erzeugung der Suspension verwendete Flüssigkeit auf eine leicht erhöhte Temperatur, z.B. im Bereich von 40 bis 60°C, vorzutemperieren. Es ist jedoch bevorzugt, die Flüssigkeiten bei Raumtemperatur einzusetzen.

Zu dieser Suspension wird dann das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugsweise eine α-Amylase, gegeben. Wird eine α-Amylase verwendet, so gibt man vorteilhafterweise nur eine Teilmenge der α-Amylase zu, z.B. 10 bis 70 Gew.-% und insbesondere 20 bis 65 Gew.-%, bezogen auf die insgesamt in Schritt a2) eingesetzte α-Amylase. Die zu diesem Zeitpunkt zugegebene Menge an α-Amylase richtet sich nach der Aktivität der jeweiligen α-Amylase in Bezug auf die verwendete Stärkequelle unter den Reaktionsbedingungen und liegt üblicherweise im Bereich von 0,0004 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 bis 1 ,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,3 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle. Alternativ kann die Teilmenge der α-Amylase vor dem Ansetzen der Suspension mit der verwen- deten Flüssigkeit vermengt werden.

Hierbei wird vorzugsweise die Teilmenge an α-Amylase vor dem Beginn des Aufheizens auf die zur Verflüssigung angewendete Temperatur, insbesondere bei Raumtemperatur oder nur leicht erhöhter Temperatur, z.B. im Bereich von 20 bis 30 °C, zu der Suspension gegeben.

Vorteilhafterweise werden die Mengen an α-Amylase und Mahlgut so ausgewählt sein, dass die Viskosität während des Gelierungsvorgangs ausreichend reduziert ist, um eine effektive Durchmischung der Suspension, z.B. mittels Rühren, zu ermöglichen. Bevorzugt beträgt die Viskosität der Reaktionsmischung während des Gelierens maximal 20 Pas, besonders bevorzugt maximal 10 Pas und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Pas. Die Messung der Viskosität erfolgt in der Regel mit einem Haake Viskosi- meter Type Roto Visko RV20 mit Messsystem M5 und Messeinrichtung MVDIN bei einer Temperatur von 50 °C und einer Schergeschwindigkeit von 200 s^"1.

Die so angesetzte Suspension wird dann vorzugsweise auf eine Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur der verwendeten Stärke erhitzt. In der Regel wird eine Temperatur im Bereich zwischen 70 und ^"165°C, bevorzugt zwischen 80 und 125 °C und besonders bevorzugt zwischen 85 und 115 °C gewählt, wobei die Temperatur vor- zugsweise mindestens 5°C und besonders bevorzugt mindestens 10°C oberhalb der Gelierungstemperatur liegt. Unter Kontrolle der Viskosität werden nach und nach weitere Teilmengen der Stärkequelle, z.B. jeweils 2 bis 20 Gew.-% und insbesondere 5 bis 10 Gew.-% bezogen auf die gesamte eingesetzte Stärkemenge, zu der stärkehaltigen Suspension zugegeben. Es ist bevorzugt, die im Verlauf der Verflüssigung zuzugeben- de Teilmenge des Mahlgutes in mindestens 2, bevorzugt mindestens 4 und besonders bevorzugt mindestens 6 Teilportionen der Reaktionsmischung zuzugeben. Alternativ kann die Zugabe der beim Ansetzen der Suspension nicht eingesetzten Teilmenge des Mahlgutes kontinuierlich während der Verflüssigung erfolgen. Die Temperatur sollte bei der Zugabe vorteilhafterweise oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke gehalten werden.

Nach vollständiger Zugabe des Mehls wird das Reaktionsgemisch üblicherweise noch eine Zeit, z.B. 30 bis 60 Minuten oder länger, sofern erforderlich, bei der oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke eingestellten Temperatur gehalten, d.h. verkocht. Die Reaktionsmischung wird dann in der Regel auf eine etwas geringere Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur, z.B. 75 bis 90°C, abgekühlt, bevor eine weitere Teilmenge an α-Amylase, vorzugsweise die Hauptmenge, zugesetzt wird. Je nach Aktivität der verwendeten α-Amylase unter den Reaktionsbedingungen beträgt die Menge an zu diesem Zeitpunkt zugegebener α-Amylase vorzugsweise 0,002 bis 2,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,01 bis 1 ,0 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,4 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.

Bei diesen Temperaturen wird die granuläre Struktur der Stärke zerstört (Gelieren), wodurch deren enzymatischer Abbau ermöglicht wird. Zum vollständigen Abbau der Stärke zu Dextrinen wird das Reaktionsgemisch so lange bei der eingestellten Temperatur gehalten oder gegebenenfalls weiter erhitzt, bis der Stärkenachweis mit Jod oder gegebenenfalls ein anderer Test zum Nachweis von Stärke negativ oder mindestens im Wesentlichen negativ ausfällt. Gegebenenfalls können hierbei noch eine oder meh- rere weitere Teilmengen α-Amylase, z.B. im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew.-% und bevorzugt 0,002 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zu der Reaktionsmischung gegeben werden.

Nach abgeschlossener Verflüssigung der Stärke wird eine Verzuckerung der in dem Flüssigmedium enthaltenen Dextrine, d. h. deren Abbau zu Glucose, kontinuierlich o- der diskontinuierlich durchgeführt, bevorzugt kontinuierlich. Das verflüssigte Medium kann in einem speziellen Verzuckerungstank vollständig verzuckert werden, bevor es dem Fermentationsschritt b) zugeführt wird. Es hat sich andererseits als vorteilhaft erwiesen, vor der Fermentation nur eine teilweise Verzuckerung vorzunehmen. Bei- spielsweise kann man so vorgehen, dass man eine Teilmenge der in dem Flüssigmedium enthaltenen Dextrine, z.B. im Bereich von 10 bis 90 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 20 bis 80 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Dextrine (bzw. der ursprünglichen Stärke), verzuckert und das resultierende zuckerhaltige Flüssigmedium in der Fermentation einsetzt. Im Fermentationsmedium kann dann eine weitere Verzuckerung in situ erfolgen. Die Verzuckerung kann des Weiteren unter Wegfall eines separaten Verzuckerungstanks direkt im Fermenter (in situ) durchgeführt werden. Vorteile der in-situ-Verzuckerung, d.h. einer teilweise oder vollständig im Fermenter erfolgenden Verzuckerung, sind einerseits reduzierte Investitionskosten, andererseits kann durch eine retardierte Freisetzung der Glucose gegebenenfalls eine höhere Glu- cosekonzentration im Ansatz (Batch) vorgelegt werden, ohne dass eine Inhibierung oder Stoffwechseländerung der eingesetzten Mikroorganismen auftritt. Bei E.coli führt eine zu hohe Glucosekonzentration z.B. zur Bildung von organischen Säuren (Acetat), während Saccharomyces cerevisae in diesem Fall z.B. auf Vergärung umschaltet, obwohl in belüfteten Fermentern ausreichend Sauerstoff vorhanden ist (Crabtree-Effekt). Eine retardierte Freisetzung von Glucose ist durch die Regelung der Glucoamylase- konzentration einstellbar. Hierdurch können die vorgenannten Effekte unterdrückt werden und es kann mehr Substrat vorgelegt werden, so dass die aus dem zugeführten Feed-Strom resultierende Verdünnung reduziert werden kann.

Im Fall der Verzuckerung in einem Verzuckerungstank wird die verflüssigte Stärkelö- sung üblicherweise auf das Temperaturoptimum des verzuckernden Enzyms oder leicht darunter, z.B. auf 50 bis 70 °C, bevorzugt 60 bis 65 °C abgekühlt bzw. temperiert und anschließend mit Glucoamylase versetzt.

Sofern man die Verzuckerung im Fermenter durchführt, wird man die verflüssigte Stär- kelösung in der Regel auf Fermentationstemperatur, d. h. 32 bis 37°C, abkühlen, bevor man sie dem Fermenter zuführt. Die Glucoamylase (bzw. das mindestens eine verzuckernde Enzym) zur Verzuckerung wird in diesem Fall der Fermentationsbrühe direkt zugesetzt. Die Verzuckerung der verflüssigten Stärke gemäß Schritt a2) erfolgt hierbei parallel zur Verstoffwechselung des Zuckers durch die Mikroorganismen gemäß Schritt b).

Vorteilhafterweise wird vor Zugabe der Glucoamylase der pH-Wert des Flüssigmediums auf einen Wert im optimalen Wirkungsbereich der eingesetzten Glucoamylase, vorzugsweise im Bereich zwischen 3,5 und 6,0; besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,5 und ganz besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,0 eingestellt. Es ist jedoch auch möglich, insbesondere bei Durchführung der Verzuckerung direkt im Fermenter, den pH-Wert außerhalb der vorgenannten Bereiche einzustellen, z.B. im Bereich von 6,0 bis 8,0. Dies kann z.B. bei der Herstellung von Lysin, Panthothenat und Vitamin B₂ trotz der eingeschränkten Aktivität von Standard-Glucoamylasen in diesem pH-Bereich insgesamt vorteilhaft oder aufgrund der einzustellenden Fermentationsbedingungen erforderlich sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verzuckerung in einem speziellen Verzuckerungstank. Dazu wird die verflüssigte Stärkelösung auf eine für das Enzym optimale Temperatur oder leicht darunter temperiert und der pH-Wert in der oben beschriebenen Weise auf einen für das Enzym optimalen Wert eingestellt. Die Glucoamylase wird dem dextrinhaltigen Flüssigmedium üblicherweise in einer Menge von 0,001 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,005 bis 3,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,01 bis 1 ,0 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zugesetzt. Nach Zugabe der Glucoamylase wird die dextrinhaltige Suspension vorzugsweise für einen Zeitraum von z.B. 2 bis 72 Stunden oder länger, sofern erforderlich, insbesondere von 5 bis 48 Stunden bei der eingestellten Temperatur gehalten, wobei die Dextrine zu Monosacchariden verzuckert werden. Der Fortschritt der Verzuckerung kann mit dem Fachmann bekannten Methoden, z.B. HPLC, Enzym- tests oder Glucose-Teststäbchen, verfolgt werden. Die Verzuckerung ist abgeschlossen, wenn die Konzentration der Monosaccharide nicht mehr wesentlich ansteigt oder wieder fällt.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die diskontinuierliche oder kontinuierli- ehe, bevorzugt die diskontinuierliche und insbesondere portionsweise Zugabe des Mahlguts in Gegenwart der mindestens einen α-Amylase sowie der mindestens einen Glucoamylase im Schritt a2) derart, dass die Viskosität des Flüssigmediums maximal 20 Pas, bevorzugt maximal 10 Pas und besonders bevorzugt maximal 5 Pas beträgt. Zur Unterstützung der Viskositätskontrolle hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn mindestens 25 Gew.-%, bevorzugt mindestens 35 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 50 Gew.-% der Gesamtmenge des zugegebenen Mahlguts bei einer Temperatur oberhalb der Gelatinierungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke zugegeben werden. Die Kontrolle der Viskosität kann des Weiteren dadurch beeinflusst werden, dass das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugsweise eine α-Amylase, oder/und das mindestens eine verzuckernde Enzym, vorzugsweise eine Glucoamylase, selbst portionsweise zugegeben werden.

Durch Anwendung der Schritte a1) und a2) ist es möglich, die zuckerhaltige Flüssigkeit mit einem Monosaccharidgehalt von vorzugsweise mehr als 30 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 35 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt mehr als 40 Gew.-% herzustellen.

Zur Verflüssigung des Stärkeanteils im Mahlgut können grundsätzlich alle α-Amylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.1) eingesetzt werden, insbesondere α-Amylasen, die aus Bacillus lichenformis oder Bacillus staerothermophilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verflüssigen von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bioethanol verwendet werden. Die zum Verflüssigen geeigneten α-Amylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novozy- mes unter der Bezeichnung Termamyl 120 L, Typ L; oder von Genencor unter der Be- Zeichnung Spezyme. Es kann auch eine Kombination verschiedener α-Amylasen zur Verflüssigung eingesetzt werden.

Zur Verzuckerung der Dextrine (d.h. Oligosaccharide) in der verflüssigten Stärkelösung können grundsätzlich alle Glucoamylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.3) eingesetzt wer- den, insbesondere Glucoamylasen, die aus Aspergilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verzuckern von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bioethanol verwendet werden. Die zum Verzuckern geeigneten Glucoamylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novo- zymes unter der Bezeichnung Dextrozyme GA; oder von Genencor unter der Bezeichnung Optidex. Es kann auch eine Kombination verschiedener Glucoamylasen verwendet werden.

Zur Stabilisierung der eingesetzten Enzyme kann gegebenenfalls die Konzentration an Ca²⁺-lonen, z.B. mit CaCI₂, auf einen enzymspezifischen optimalen Wert eingestellt werden. Geeignete Konzentrationswerte können vom Fachmann in Routineexperimenten bestimmt werden. Wird z.B. Termamyl als α-Amylase eingesetzt, so ist es vorteilhaft, eine Ca²⁺-Konzentration von z.B. 50 bis 100 ppm, bevorzugt 60 bis 80 ppm und besonders bevorzugt etwa 70 ppm im Flüssigmedium einzustellen.

Da zur Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums gemäß a) die ganze Stärkequelle, z.B. im Falle von Getreide das ganze Korn, vermählen wird, umfasst diese auch die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle. Dies bedingt oftmals den Eintrag eines nicht zu vernachlässigenden Anteils an Phytat aus der Kornfrucht. Um die daraus resultierende inhibierende Wirkung zu vermeiden, wird vorteilhafterweise in Schritt a2) dem Flüssigmedium mindestens eine Phytase zugesetzt, bevor das zuckerhaltige Flüssigmedium dem Fermentationsschritt b) zugeführt wird.

Die Zugabe der Phytase kann vor, während oder nach der Verflüssigung oder der Ver- zuckerung erfolgen, sofern sie die jeweils erforderliche Hitzestabilität aufweist.

Es können beliebige Phytasen eingesetzt werden, soweit deren Aktivität unter den Reaktionsbedingungen jeweils höchstens unwesentlich eingeschränkt ist. Bevorzugt sind Phytasen mit einer Temperaturstabilität (T50) > 50 °C und besonders bevorzugt > 60 °C.

Die Menge an Phytase beträgt üblicherweise 1 bis 10000 Units/kg Stärkequelle und insbesondere 10 bis 2000 Units/kg Stärkequelle.

Zur Erhöhung der Gesamtzuckerausbeute bzw. zur Gewinnung freier Aminosäuren können dem Reaktionsgemisch während der Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums außerdem weitere Enzyme, zum Beispiel Pullulanasen, Cellulasen, Hemicel- lulasen, Glucanasen, Xylanasen, Glucosidasen oder Proteasen, zugesetzt werden. Der Zusatz dieser Enzyme kann die Viskosität positiv beeinflussen, d.h. herabsetzen (z.B. durch Spaltung längerkettiger Glucane und/oder von (Arabino-)Xylanen), die Freisetzung metabolisierbarer Glucoside und die Freisetzung von (Rest-)Stärke bewirken. Der Einsatz von Proteasen hat analoge positive Effekte, wobei zusätzlich Aminosäuren als Wachstumsfaktoren für die Fermentation freigesetzt werden können. Das zuckerhaltige Flüssigmedium kann vorteilhaft zur fermentativen Herstellung eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom verwendet werden. Dazu wird das in Schritt a) hergestellte zuckerhaltige Flüssigmedium einer Fermentation gemäß b) zugeführt. In der Fermentation werden Feinchemikalien, d. h. Verbindungen mit mindestens 3 C- Atomen und/oder mindestens einem N-Atom und mindestens 2 C-Atomen, von den Mikroorganismen produziert. Die Durchführung des Fermentationsverfahrens kann in der Regel in der dem Fachmann bekannten üblichen Art und Weise erfolgen. Dabei liegt das Volumenverhältnis von zugeführtem zuckerhaltigen Flüssigmedium zu dem vorgelegten und die Mikroorganismen enthaltenden Flüssigmedium im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 :10 bis 10:1 , z.B. bei etwa 1 :2 oder etwa 2:1 und insbesondere bei etwa 1 :1. Insbesondere über die Zufuhrgeschwindigkeit des zuckerhaltigen Flüssigmediums kann der Zuckergehalt in der Fermentationsbrühe reguliert werden. In der Regel wird man die Zufuhrgeschwindigkeit so einstellen, dass der Monosaccharidgehalt in der Fermentationsbrühe im Bereich von ≥ 0 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% liegt; die Fermentation kann jedoch auch bei deutlich höheren Monosaccharidgehalten in der Fermentationsbrühe, z.B. etwa 10 bis 20 Gew.-%, durchgeführt werden.

Sofern die Verzuckerung und die Fermentation separat durchgeführt wird, kann das in Schritt a) erhaltene, zuckerhaltige Flüssigmedium vor der Fermentation gegebenenfalls sterilisiert werden, wober man die Mikroorganismen durch thermische, chemische oder mechanische Verfahren abtötet. Hierbei heizt man die Brühe üblicherweise auf Temperaturen oberhalb 80°C auf. Die Abtötung bzw. Lyse der Zellen kann unmittelbar vor der Fermentation erfolgen. Hierzu wird die gesamte zuckerhaltige Flüssigmedium der Lyse bzw. Abtötung zugeführt. Diese kann thermisch, mechanisch oder chemisch erfolgen. Es hat sich jedoch im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens als nicht notwendig erwiesen, vor der Fermentation einen Sterilisierungsschritt wie hier beschrieben durchzuführen, sondern es hat sich vielmehr als vorteilhaft erwiesen, keinen solchen Sterilisierungsschritt durchzuführen. Dementsprechend betrifft eine bevorzugte Ausführungs- form der Erfindung ein Verfahren, bei dem das in Schritt a) erhaltene Flüssigmedium unmittelbar, d.h. ohne vorherige Sterilisation, der Fermentation zugeführt oder eine zumindest teilweise in-situ-Verzuckerung durchgeführt wird.

Bei der Fermentation resultiert ein Flüssigmedium, das neben dem gewünschten nicht- flüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukt im Wesentlichen die während der Fermentation erzeugte Biomasse, die nicht verstoffwechselten Bestandteile der verzuckerten Stärkelösung und insbesondere die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle, wie z.B. Fasern und nicht verwertete Zucker, sowie nicht verwertete Pufferund Nährsalze enthält. Dieses Flüssigmedium wird in der vorliegenden Anmeldung auch als Fermentationsbrühe bezeichnet, wobei der Ausdruck Fermentationsbrühe auch das (zuckerhaltige) Flüssigmedium umfasst, bei dem eine erst teilweise oder unvollständige fermentative Umsetzung der darin enthaltenen Zucker, d.h. eine teilweise oder unvollständige mikrobielle Verstoffwechselung der Monosaccharide, erfolgt ist. Der Begriff Feinchemikalie umfasst im Folgenden insbesondere organische, gegebenenfalls 1 oder mehrere, z. B. 1 , 2, 3 oder 4 Hydroxylgruppen tragende Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen, z.B. Weinsäure, Itaconsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, 2,5-Furandicarbonsäure, 3- Hydroxypropionsäure, Glutarsäure, Lävulinsäure, Milchsäure, Propionsäure, Glucon- säure, Aconitsäure und Diaminopimelinsäure, Zitronensäure; proteinogene und nicht- proteinogene Aminosäuren, z.B. Lysin, Glutamat, Methionin, Phenylalanin, Asparagin- säure und Threonin; Purin- und Pyrimidinbasen; Nukleoside und Nukleotide, z.B. Niko- tinamidadenindinukleotid (NAD) und Adenosin-5'-monophosphat (AMP); Lipide; gesät- tigte und ungesättigte Fettsäuren mit vorzugsweise 10 bis 22 C-Atomen, z.B. y- Linolensäure, Dihomo-γ-Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Do- cosahexaensäure; Diole mit vorzugsweise 3 bis 8 C-Atomen, z.B. Propandiol und Bu- tandiol; höherwertige Alkohole mit 3 oder mehr, z.B. 3, 4, 5 oder 6 OH-Gruppen, z.B. Glycerin, Sorbitol, Manitol, Xylitol und Arabinitol; längerkettige Alkohole mit wenigstens 4 C-Atomen, z.B. mit 4 bis 22 C-Atomen, z.B. Butanol; Kohlenhydrate, z.B. Hyaluron- säure und Trehalose; aromatische Verbindungen, z.B. aromatische Amine, Vanillin und Indigo; Vitamine und Provitamine, z.B. Ascorbinsäure, Vitamin B₆, Vitamin B₁₂ und Ri- boflavin, Cofaktoren und sogenannte Nutrazeutika; Proteine wie Enzyme, z. B. Phytasen, Xylanasen und Glucanasen; Carotenoide, z.B. Lycopin, ß-Carotin, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxanthin; Ketone mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen und gegebenenfalls 1 oder mehreren Hydroxylgruppen, z.B. Aceton und Acetoin; Lactone, z.B. γ-Butyrolacton, Cyclodextrine, Biopolymere, z.B. Polyhydroxyacetat, Polyester, Polysaccharide, Polyisoprenoide, Polyamide, Polyhydroxyalkanoate, z.B. Poly-3- hydroxybuttersäure und Copolyester mit anderen organischen Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyvaleriansäure, 4-Hydroxybuttersäure und anderen, die in Steinbüchel (Hg.), Biopolymers, 1. Aufl., 2003, Wiley-VCH, Weinheim und der dort zitierten Literatur beschrieben sind; sowie Vorstufen und Derivate der vorgenannten Verbindungen. Weitere als Feinchemikalien in Frage kommende Verbindungen sind von Gutcho in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086 beschrie- ben.

Der Begriff "Cofaktor" umfasst nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise orga- nisch. Beispiele solcher Moleküle sind NAD und Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP); die Vorstufe dieser Cofaktoren ist Niacin.

Der Begriff "Nutrazeutikum" umfasst Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Mole- küle sind Vitamine, Antioxidantien und bestimmte Lipide, z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren.

Insbesondere sind die hergestellten Stoffwechselprodukte unter Enzymen, Aminosäuren, Vitaminen, Disacchariden, aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen, Alkandiolen mit 3 bis 8 C-Atomen und Polyhydroxyalkanoaten ausgewählt.

Es versteht sich für den Fachmann, dass die erfindungsgemäß auf fermentativem Weg hergestellten Verbindungen jeweils in der von den eingesetzten Mikroorganismen produzierten Enantiomerenform erhalten werden (sofern unterschiedliche Enantiomere existieren). So erhält man z.B. von den Aminosäuren in der Regel das jeweilige L- Enantiomer.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt zur Herstellung nicht-flüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte eingesetzt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter nicht-flüchtigen Stoffwechselprodukten Verbindungen verstanden, die sich im Allgemeinen auf destillativem Weg nicht unzersetzt aus der Fermentationsbrü- he entfernen lassen. Diese Verbindungen weisen in der Regel einen Siedepunkt oberhalb des Siedepunktes von Wasser, häufig oberhalb 150 °C und insbesondere oberhalb 200 °C bei Normaldruck auf. In der Regel handelt es sich um Verbindungen, die bei Normalbedingungen (298 K, 101 ,3 kPa) in festem Zustand vorliegen.

Es ist jedoch auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte einzusetzen, die bei Normaldruck einen Schmelzpunkt unterhalb des Siedepunktes von Wasser oder/und eine ölige Konsistenz aufweisen. In diesem Fall wird man in der Regel während der Aufarbeitung, insbesondere während der Trocknung die maximale Temperature kontrollieren. Vorteilhaft kön- nen diese Verbindungen auch dadurch hergestellt werden, dass man sie in quasi fester Form (pseudofester Form) auf Adsorbentien formuliert. In der Regel wird man in diesem Fall vor der Abreicherung oder Isolierung des Wertprodukts gemäß Schritt c) die festen Bestandteile der Fermentationsbrühe abtrennen.

Zu dem vorgenannten Zweck geeignete Adsorbentien sind z.B. Aktivkohlen, Aluminiumoxide, Kieselgele, Kieselsäure, Ton, Ruße, Zeolithe, anorganische Alkali- und Erdalkalimetallsalze wie Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Calciumhydroxide, - carbonate, -Silikate, -sulfate, -phosphate, insbesondere Magnesium- und Calciumsalze, z.B. Mg(OH)₂, MgCO₃, MgSiO , CaSO₄, CaCO₃₎ Erdalkalimetalloxide, z.B. MgO und CaO, andere anorganische Phosphate und Sulfate, z.B. ZnSO , Salze organischer Säuren, insbesondere deren Alkali- und Erdalkalimetallsalze und speziell deren Natrium- und Kaliumsalze, z.B. Natrium- und Kaliumacetat, -formiat, -hydrogenformiate und -citrat, sowie höhermolekulare organische Träger wie Kohlenhydrate, z.B. Zucker, gegebenenfalls modifizierte Stärken, Cellulose, Lignin, sowie allgemein die weiter unten im Zusammenhang mit der Produktformulierung genannten Trägermaterialien. In der Regel werden die genannten Trägermaterialien keine oder nur geringe Anteile, insbesondere lediglich Spuren an Halogenen wie Chloridionen und an Nitraten aufweisen. Beispiele für Verbindungen, die bei Normaldruck einen Schmelzpunkt unterhalb des Siedepunktes von Wasser oder/und eine ölige Konsistenz aufweisen und die vorteilhaft auf diese Weise durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden können, sind γ-Linolensäure, Dihomo-γ-Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure, weiterhin Propionsäure, Milchsäure, Propandiol, Butanol und Aceton. Auch diese Verbindungen in pseudofester Formulierung werden im Sinne der vorliegenden Erfindung als nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte in fester Form verstanden.

Die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen richten sich in an sich bekannter Weise nach den jeweiligen Feinchemikalien, wie unten im einzelnen erläutert. Sie können natürlichen Ursprungs oder genetisch modifiziert sein. Beispiele für geeignete Mikroorganismen und Fermentationsverfahren sind die in der folgenden Tabelle A angegeben:

Tabelle A:

Bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens betreffen die Herstellung von Enzymen wie Phytasen, Xylanasen, Glucanasen; Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Threonin; Vitaminen wie Pantothensäure und Riboflavin; Vorläufern und Folgeprodukten davon; sowie die Herstellung von den vorgenannten Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, insbesondere aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Propionsäure und Bernsteinsäure, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure; von den vorgenannten längerkettigen Alkano- len, insbesondere Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen wie Butanol; von den vorgenannten Diolen, insbesondere Alkandiolen mit 3 bis 8 C-Atomen wie Propandiol; von den vorgenannten Ketonen, insbesondere Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton; von den vorgenannten Kohlehydraten, insbesondere Disacchariden wie Trehalose; und von Polyhydroxyalkanoaten .

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen daher ausgewählt unter natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte produzieren: Enzyme wie Phytase, Xylanase, Glucanase; Aminosäuren wie Lysin, Threonin und Methionin; Vitamine wie Pantothensäure und Riboflavin; Vorläufer und/oder Folgeprodukte davon; Disaccharide wie Trehalose; aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C- Atomen wie Propionsäure und Bernsteinsäure; aliphatische Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure; Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton; Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen wie Butanol; Alkandiole mit 3 bis 8 C-Atomen wie Propandiol; und Polyhydroxyalkanoate.

Insbesondere sind die Mikroorganismen ausgewählt unter den Gattungen Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium und Clostridium, insbesonde- re unter Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger oder Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propioni- bacterium freudenreichii, Clostridium propionicum und Clostridium acetobutlicum.

In einer speziellen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Lysin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehenswei- sen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in Pfefferle et al., a.a.O. und US 3,708,395. Prinzipiell kommen sowohl eine kontinuierliche als auch eine diskontinuierliche (Batch oder Fed-Batch) Betriebsweise in Betracht, bevorzugt ist die Fed-Batch Betriebsweise.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Methionin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in WO 03/087386 und WO 03/100072.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Pantothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen be- schrieben wurden, z.B. in der WO 01/021772.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Po- lyhydroxyalkanoate wie Poly-3-hydroxybutyrat und Copolyester mit anderen organi- sehen Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyvaleriansäure, 4-Hydroxybuttersäure und anderen, die in Steinbüchel (a.a.O.) beschrieben sind, z.B. auch längerkettige Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxydecansäure und 3- Hydroxytetradecansäure, sowie Mischungen davon. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in S. Y. Lee, Plastic Bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Bd. 14, (1996), S. 431-438.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Riboflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this ri- boflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um eine Phytase. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 98/55599.

Vor der weiteren Verarbeitung der Fermentationsbrühe (d.h. vor Schritt c) wird gege- benenfalls ein Sterilisierungsschritt in der oben beschriebenen Weise durchgeführt.

Die Isolierung oder Abreicherung des Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe gemäß Schritt c) erfolgt in der Regel derart, dass man wenigstens ein Stoffwechselprodukt so aus der Fermentationsbrühe abreichert oder isoliert, dass der Gehalt dieses Stoffwechselprodukts in der verbleibenden Fermentationsbrühe höchstens 20 Gew.-%, insbesondere höchstens 10 Gew.-%, speziell höchstens 5 Gew.-% und ganz speziell höchstens 2,5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der verbleibenden Fermentationsbrühe, beträgt.

Die Isolierung oder Abreicherung von Feinchemikalien (d.h. des mikrobiellen Stoffwechselprodukts) aus der Fermentationsbrühe gemäß Schritt c) kann in einem oder mehreren Schritten erfolgen. Ein wesentlicher Schritt dabei ist die Abtrennung der festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe. Diese kann entweder vor oder nach der Isolierung des Wertprodukts durchgeführt werden. Sowohl zur Isolierung von Wertstof- fen als auch zur Abtrennung von Feststoffen, d.h. Fest-Flüssig-Phasenseparation, sind im Fachgebiet übliche Methoden bekannt, die auch Schritte zur Grob- und Feinreinigung der Wertstoffe sowie zur Konfektionierung umfassen (z.B. beschrieben in Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wi- ley-VCH).

Zur Isolierung des Wertprodukts kann man vorteilhafterweise so vorgehen, dass man zunächst die festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe entfernt, z.B. mittels Zentrifugation oder Filtration, und anschließend das Wertprodukt aus der flüssigen Phase isoliert, z.B. durch Kristallisation, Fällung, Adsorption oder Destillation. Alternativ kann das Wertprodukt auch direkt aus der Fermentationsbrühe isoliert werden, z.B. durch Einsatz chromatographischer Verfahren oder von Extraktions-Verfahren. Als chromatographisches Verfahren ist insbesondere die lonenaustauschchromatographie zu nennen, bei der das Wertprodukt selektiv auf der Chromatographiesäule isoliert werden kann. In diesem Fall erfolgt die Abtrennung der Feststoffe aus der verbleibenden Fermentationsbrühe vorteilhafterweise z.B. durch Dekantieren, Eindampfen o- der/und Trocknung. Übliche Filtrations-Verfahren sind z.B. die Kuchen- und Tiefenfiltration (z.B. beschrieben in A. Rushton, A. S. Ward, R. G. Holdich: Solid - Liquid Filtration and Separation Technology, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1996, pp. 177ff., K. J. Ives, in A. Rushton (Hg.): Mathematical Models and Design Methods in Solid-Liquid Separation, NATO ASI series E Nr. 88, Martinus Nijhoff, Dordrecht 1985, pp. 90ff.) und Cross-flow- Filtrationen, insbesondere die Mikrofiltration zur Abtrennung von Feststoffen > 0,1 μm (z.B. beschrieben in J. Altmann, S. Ripperger, J. Membrane Sei. 124 (1997) 119 — 128.).

Übliche Zentrifugations-Verfahren sind z.B. in G. Hultsch, H. Wilkesmann, "Filtering Centrifuges," in D.B. Purchas, Solid - Liquid Separation, Upland Press, Croydon 1977, pp. 493 - 559; und H. Trawinski, Die äquivalente Klärfläche von Zentrifugen, Chem. Ztg. 83 (1959) 606-612 beschrieben. Verschiedene Bauformen wie Röhren- und Korbzentrifugen sowie im speziellen Schub-, Stülpfilterzentrifugen und Tellerseparatoren können eingesetzt werden.

Übliche Extraktions-Verfahren umfassen batch-weise bzw. stufenweise und differentiel- le kontinuierliche Verfahren im Gleich- oder Gegenstrom. Dabei kann mit zwei oder einer beweglichen Phasen gearbeitet werden. Die Löslichkeit der Wertstoffe und der abzutrennenden Nebenkomponenten in beiden Phasen kann unter Anderem durch die Wahl des Lösungsmittels, durch Variation der Gegenionen und durch Variation des pH- Wertes beeinflusst werden (Treybal, R.E., Mass Transfer Operations, 3. Aufl., New York, Mc Graw-Hill, 1979; Kula, M., Kroner, K.H., Hustedt, H. und Schutee, H., Technical aspects of extractive enzyme purification, Ann. N.Y. Acad. Sei., 341 (1981 ); Robin- son, R.G., and Cha, D.Y., Controlled pH extraction in the Separation of weak acids and bases, Biotech. Progress, 1 (1), 18 (1985)).

Übliche Adsorptions-Verfahren sind z.B. in D. M. Ruthven: Principles of Adsorption and Adsorption Processes, J. Wiley & Sons, New York 1984.; G. Wedler: Adsorption, Ver- lag Chemie, Weinheim 1970.) beschrieben. Festbett-, Moving-bed- und Fluidized-bed- Adsorber können zur Anwendung kommen. Die Adsorption kann batchweise oder kontinuierlich durchgeführt werden (K. Hauffe, S. R. Morrison: De Gruyter Studienbuch "Adsorption," De Gruyter, Berlin 1974.; W. Käst: Adsorptionstechnik, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1988.). Neben vielen anderen Adsorbentien können aktivierte Kohlen, lonenaustauscherharze, natürliche oder synthetische Zeolithe und aktivierte Aluminiumoxide eingesetzt werden. Daneben können auch Verfahren zur Affinitätsadsorption zur Anwendung kommen (z.B. beschrieben in Arnold, F.H., Blanch, H.W., and Wilke, C.R., Analysis of Affinity separations. Chem. Engr. J., 30, B9 (1985)).

Insbesondere zur Reinigung der Feinchemikalien können z.B. Chromatographie, Fällung, Ultra-, Mikro- und Nanofiltration, Reversosmose, Elektrophorese, Elektrodialyse und isoelektrische Fokussierung eingesetzt werden. Chromatographische Verfahren können batchweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Zur kontinuierlichen Chromatographie zählen z.B. ein Continuous Rotating Annular Chromatograph (CRAC) (z.B. beschrieben in A. J. P. Martin, Discuss. Farra- day Soc. 7 (1949)), ein True Moving Bed Chromatograph (TMBC) (z.B. beschrieben in K. Takeuchi, T. Miyauchi, Y. Uraguchi, J. Chem. Eng. Japan 11 (1978) 216-220.) und ein Simulated Moving Bed Chromatograph (SMB) (z.B. beschrieben in D. B. Brough- ton, Universal Oil Products Co., US 2,985,589, 1961). Als Festphase werden z.B. aktivierte Aluminiumoxide, Silikagele, glykolimprägnierte Diatomerenerden, Dextrane, Polymere sulfonierter Stryene, Polyacrylamide sowie polymergebundene Proteine einge- setzt (Arnold, F.H., Blanch, H.W., und Wilke, C.R., Analysis of Affinity separations. Chem. Engr. J., 30, B9 (1985); Gibbs, S.J., und Lightfoot, E.N., Scaling up gradient elution chromatography, IEC Fund., 25, 490 (1986); King, C.J., Separation Processes, 2. Aufl., New York, McGraw-Hill (1979); Yau, W. W., Kirlland, J.J., und Bly, D.D., Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography, Wiley, New York (1979)).

Bei einer Fällung können entweder die Wertstoffe oder die Nebenkomponenten ausgefällt werden (J. W. Mullin: Crystallization, 3rd ed., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993). Die Fällung kann z.B. eingeleitet werden durch Zugabe eines weiteren Lösungsmittels, Zugabe von Salzen und die Variation der Temperatur. Der entstehende Niederschlag kann durch die oben beschriebenen üblichen Verfahren zur Abtrennung von Feststoffen von der Brühe separiert werden.

Bei der Mikro-, Ultra-, Nanofiltration und der Reversosmose können z.B. mikroporöse (A. S. Michaels: "Ultrafiltration," in E. S. Perry (ed.): Progress in Separation and Purifi- cation, vol. 1 , Interscience Publ., New York 1968.), homogene (J. Crank, G. S. Park (eds.): Diffusion in Polymers, Academic Press, New York 1968; S. A. Stern: "The Separation of Gases by Selective Permeation," in P. Meares (ed.): Membrane Separation Processes, Elsevier, Amsterdam 1976.), asymetrische (R. E. Kesting: Synthetic Poly- meric Membranes, A Structural Perspective, Wiley-Interscience, New York 1985.) und elektrisch geladene (F. Helfferich: Ion-Exchange, McGraw-Hill, London 1962.) Membranen eingesetzt werden, die nach verschiedenen Verfahren erzeugt werden (R. Zsig- mondy, US 1 421 341 , 1922; D. B. Pall, US 4 340 479, 1982; S. Loeb, S. Sourirajan, US 3 133 132, 1964.). Typische Werkstoffe sind Celluloseester, Nylon, Polyvinylchlorid, Acrylnitril, Polypropylen, Polycarbonat und Keramik. Der Einsatz dieser Membra- nen erfolgt als Plattenmodul (R. F. Madsen, Hyperfiltration and Ultrafiltration in Plate- and-Frame Systems, Elsevier, Amsterdam 1977), Spiralmodul (US 3 417 870, 1968 (D. T. Bray)), Rohrbündel bzw. Hohlfasermodul (H. Strathmann: "Synthetic Membranes and their Preparation," in M. C. Porter (ed.): Handbook of Industrial Membrane Technology, Noyes Publication, Park Ridge, NJ 1990, pp. 1 - 60). Daneben ist die Ver- wendung flüssiger Membranen möglich (N. N. Li: "Permeation Through Liquid Surfac- tant Membranes," AlChE J. 17 (1971) 459; S. G. Kimura, S. L. Matson, W. J. Ward III: "Industrial Applications of Facilitated Transport," in N. N. Li (ed.): Recent Developments in Separation Science, Bd. V, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1979, pp. 11-25). Der gewünschte Wertstoff kann sowohl feedseitig angereichert und über den Retentatstrom abgeführt als auch feedseitig abgereichert und über den Filtrat-/Permeatstrom abgeführt werden.

Elektrophoretische Verfahren sind z.B. in Rudge, S.R., Ladisch, M.R., Process consid- erations for scale-up of liquid chromatography and electrophoresis, in Separation Re- covery and Purification in Biotechnology, J. Asenjo und J. Hong, Hg., ACS Symposium Series, 314, 122 (1986) beschrieben. Zahlreiche Varianten wie z.B. isoelektrische Fo- kussierung in granulierten Gelschichten, kontinuierliche isoelektrische Fokussierung mit Recycling, die „Rotofor-„Zelle, die Freifluss-Fokussierung mit Recycling und die multi-kompartimentierte Elektrolyse mit isoelektrischen Membranen finden Anwendung. Als Matrixmaterialien kommen u.a. Celluloseacetat, Agarosegele und Polyacrylamid- gele zum Einsatz.

Übliche Kristallisations-Verfahren sind z.B. in Janeic, S.J., Grootscholten, P.A., Indus- trial Crystallization, New York, Academic, 1984; A. W. Bamforth: Industrial Crystallization, Leonard Hill, London 1965; G. Matz: Kristallisation, 2. Aufl., Springer Verlag, Berlin 1969; J. Nyvlt: Industrial Crystallization —State of the Art. VCH Verlagsges., Weinheim 1982; S. J. Janeic^', P. A. M. Grootscholten: Industrial Crystallization, Reidel, Dordecht 1984; O. Söhnel, J. Garside: Precipitation, Butterworth-Heinemann, Oxford, 1992; A. S. Myerson (Hg.): Handbook of Industrial Crystallization, Butterworth-Heineman, Boston 1993; J. W. Mullin: Crystallization, 3. Aufl., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993; A. Mersmann (Hg.): Crystallization Technology Handbook, Marcel Dekker, New York 1995 beschrieben. Eine Kristallisation kann z.B. durch Kühlung, Verdampfung, Vakuumkristallisation (adiabate Kühlung), Reaktionskristallisation oder Aussalzen initiiert werden. Die Kristallisation kann z.B. in gerührten und ungerührten Kesseln, im Direkt- Kontakt-Verfahren, in Verdampfungskristallisatoren (R. K. Multer, Chem Eng. (N.Y.) 89 (1982) March, 87-89), in Vakuumkristallisatoren absatzweise oder kontinuierlich, z.B. in Zwangsumlauf-Kristallisatoren (Swenson forced-circulation crystaller) oder Wirbelschicht-Kristallisatoren (Oslo-type) (A. D. Randolph, M. A. Larson: Theory of Particulate Processes, 2. Aufl. Academic Press, New York 1988; J. Robinson, J. E. Roberts, Can. J. Chem. Eng. 35 (1957) 105-112; J. Nyvlt: Design of Crystallizers, CRC Press, Boca Raton, 1992) durchgeführt werden. Auch fraktionierte Kristallisation ist möglich (L. Gordon, M. L. Salutsky, H. H. Willard: Precipitation from Homogeneous Solution, Wiley-Interscience, New York 1959). Ebenso können Enantiomere und Racemate getrennt werden (J. Jacques, A. Collet, S. H. Willen: Enantiomers, Racemates and Resolutions, Wiley, New York 1981 ; R. A. Sheldon: Chirotechnology, Marcel Dekker, New York 1993; A. N. Collins, G. N. Sheldrake, J. Crosby (Hg.): Chirality in Industry, Wiley, New York 1985).

Übliche Verfahren zur Trocknung sind z.B. in O. Krischer, W. Käst: Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik, 3. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; R. B. Keey: Drying: Principles and Practice, Pergamon Press, Oxford 1972; K. Kröll: Trockner und Trocknungsverfahren, 2. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; Williams-Gardener, A.: Industrial Drying, Houston, Gulf, 1977; K. Kröll, W. Käst: Trocknen und Trockner in der Produktion, Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1989 beschrieben. Zu den Beispielen für Trocknungsverfahren zählen Verfahren zur Konvektionstrocknung, z.B. in einem Trockenofen, Tunneltrockner, Bandtrockner, Scheibentrockner, Jettrockner, Wirbelschichttrockner, belüftete sowie rotierende Trommeltrockner, Sprühtrockner, Stromtrockner, Zyklontrockner, Mischertrockner, Pasten-Mahltrockner, Mahltrockner, Ringtrockner, Schachttrockner, Drehrohrtrockner, Ka- russeltrockner. Weitere Verfahren nutzen die Kontakttrocknung, z.B. Schaufeltrockner; Vakuum- bzw. Gefriertrocknung, Konustrockner, Nutschtrockner, Scheibentrockner, Dünnschicht-Kontakttrockner, Walzentrockner, Zähphasen-Trockner, tellertrockner, Wendelfördertrockner, Doppelkonustrockner; oder Wärmestrahlung (Infrarot, z.B. Infrarot-Drehrohrtrockner) oder dielektrische Energie (Mikrowellen) zur Trocknung. Die für thermische Trocknungsverfahren verwendeten Trocknungsapparate werden meist durch Dampf, Öl, Gas oder elektrischen Strom beheizt und können, je nach Auslegung, zum Teil unter Vakuum betrieben werden.

Neben der Trocknung können auch Formulierungsverfahren zum Einsatz kommen, wie sie weiter unten für die Herstellung der Proteinzusammensetzung beschrieben sind. Diese umfassen auch die Zugabe von Formulierungshilfsstoffen, wie unten angegeben.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Isolierung der Feinchemikalien aus der Fermentationsbrühe gemäß c) mittels lonenaustausch-Chromatographie. Die allgemeinen Bedingungen und Vorgehensweisen dabei sind dem Fachmann bekannt und z.B. in Römpp Lexikon der Chemie, 10. Auflage,1997, Georg Thieme Verlag, Stuttgart; Weis, Handbuch der lonenchromatographie, 1991 , VCH Verlagsgesellschaft, Wein- heim, beschrieben. Im Allgemeinen wird man so vorgehen, dass die durch die Mikroorganismen produzierte Verbindung selektiv auf dem Ionenaustauscher gebunden wird und der Ionenaustauscher vor der Elution der durch die Mikroorganismen produzierten Verbindung gewaschen wird, z.B. mit Wasser.

Vor Aufgabe der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe auf die lonenaustauschchro- matographiesäule können die Feststoffe gegebenenfalls mittels dem Fachmann bekannter üblicher Verfahren, z.B. Filtration und Zentrifugation, abgetrennt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt keine Abtrennung der Fest- Stoffe vor der Aufgabe der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe auf die lone- naustauchchromatographiesäule. In diesem Fall wird der Ionenaustauscher vorteilhafterweise entgegen der Schwerkraft mit der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe angeströmt, so dass die enthaltenen Feststoffe nicht zu einer Verblockung (d.h. Verstopfung) der lonenaustauschersäule führen.

Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um eine basische Aminosäure, so kann diese vorteilhaft durch lonenaustauschchroma- tographie aus der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, indem eine saure Kationenaustauschersäule eingesetzt wird. In diesem Fall wird die basische Aminosäure, z.B. Lysin, auf der lonenaustauschersäule selektiv gebunden. Vor der Elution ist eine Aufreinigung durch Waschen, insbesondere mit Wasser, möglich. Die Elution der basischen Aminosäure erfolgt dann mit einem geeigneten Elutionsmittel, z.B. Ammoniakwasser, bevorzugt mit 5 Vol.-%igem Ammoniakwasser.

Die Anwendung der lonenaustauschchromatographie zur Abtrennung oder Aufreinigung basischer Aminosäuren wie Lysin ist z.B. in der WO 01/072689 und Lee et al., The use of ion exclusion chromatography as approved to the normal ion exchange chromatography to achieve a more efficient lysine recovery from fermentation broth, Enzyme and Microbial Technology 30 (2002), 798-303 beschrieben.

Der verbleibende Fermentationsrückstand kann in analoger Weise wie im Folgenden beschrieben aufgearbeitet, d.h. behandelt bzw. verarbeitet werden, wobei man ein pro- teinhaltiges Nebenprodukt erhält.

Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Methionin, so erfolgt die Isolierung des Wertprodukts vorteilhafterweise durch Zentrifugation oder Filtration. Dabei können analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen z.B. in der früheren Anmeldung DE 10359668.2 beschrieben wurden. Nach Ende der Fermentation wird die erzeugte Fermentationsbrühe aufgeheizt, um das gesamte Methionin in Lösung zu bringen. Anschließend werden die Feststoffe durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird vorzugsweise durch teilweises oder vollständiges Eindampfen aufkonzentriert, wobei das Methionin auskristallisiert. Ab- schließend erfolgt eine Trocknung des Methionins, gegebenenfalls nach einem vorherigen weiteren Filtrationsschritt.

Die durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennten Feststoffe enthalten im Wesentlichen die während der Fermentation erzeugte Biomasse und die nicht verstoffwechsel- ten Bestandteile der verzuckerten Stärkelösung, z.B. Fasern. Dieser verbleibende Fermentationsrückstand kann in analoger Weise, wie unten beschrieben, behandelt bzw. verarbeitet werden, so dass ein proteinhaltiges Nebenprodukt erhalten wird.

Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Pantothensäure, so erfolgt die Isolierung des Wertprodukts vorteilhafterweise gleichfalls durch Zentrifugation oder Filtration. Dabei können analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der EP 1050219 und WO 01/83799. Im Übrigen kann die Aufarbeitung in entsprechender Weise, wie zuvor für Methionin beschrieben, erfolgen. Vorzugsweise führt man im Falle der Pantothensäure zusätzlich eine Pasteurisierung der gesamten Fermentationsbrühe vor der Abtrennung der Feststoffe durch. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird vorzugsweise teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Calciumchlorid versetzt und getrocknet, bevorzugt sprühgetrocknet. Zur Gewinnung der Pantothensäure kann man auch so vorgehen, dass nach Schritt c) eine Abtrennung der Zellen und der ungelösten bzw. festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile mittels Dekanter, Zentrifugen, Filtertechnik oder Membrantechnik (Mikrofiltra- tion, Ultrafiltration, Nanofiltration) und/oder einer Kombination dieser Verfahren vorge- nommen wird. Der feststoffarme bzw. -freie Strom enthält die Pantothensäure. Dieser Strom kann z.B. weiter auf konzentriert werden und/oder einer Trocknung bzw. Formulierung zugeführt werden. Der feststoffhaltige Strom kann, analog wie unten beschrieben, zu einem proteinhaltigen Nebenprodukt aufgearbeitet werden.

Gegebenenfalls führt man eine Lyse bzw. Abtötung der Zellen durch. Diese kann unmittelbar nach der Fermentation erfolgen. Hierzu wird die gesamte Fermentationsbrühe der Lyse bzw. Abtötung zugeführt. Diese kann thermisch, mechanisch oder chemisch erfolgen. Eine Lyse der Zellen kann auch nach der Abtrennung der Feststoffe erfolgen. Hierbei wird nur der feststoffreiche Strom der vorgenannten Lyse zugeführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform geht man bei der Aufarbeitung der Pantothensäure so vor, dass man nach der Fermentation eine thermische Abtötung der Zellen vornimmt und die Zellen und die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile mittels Dekanter, Zentrifugen, Filtertechnik oder Membrantechnik und/oder einer Kombination davon abtrennt. Der feststoffarme bzw. -freie Strom enthält die Pantothensäure. Dieser Strom kann z.B. weiter aufkonzentriert werden. Vor, während oder nach der Aufkonzentrierung werden vorteilhafterweise Hilfsstoffe wie die weiter unten genannten zu der feststoffarmen Brühe gegeben. Hierdurch kann eine potentielle Schaumbildung und/oder Belagbildung reduziert werden. Der aufkonzentrierte Strom wird dann direkt der Trock- nung bzw. Formulierung zugeführt. Auch hierbei können vor, während oder nach der Trocknung bzw. Formulierung die unten genannten Hilfsstoffe zugegeben werden. Hierdurch kann die Hygroskopizität des Produkts reduziert, das Fließverhalten des Produktes verbessert und/oder die Lagerstabilität erhöht werden. Der feststoffhaltige Strom wird in diesem Fall vorzugsweise, analog wie unten beschrieben, zu einem pro- teinhaltigen Nebenprodukt verarbeitet.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform zur Aufarbeitung der Pantothensäure sieht vor, dass Hilfsstoffe mit speziellen Kationen auch bereits während der Fermentation zugegeben werden können. Dies ist z.B. in der WO 02/072857 beschrieben.

Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform zur Aufarbeitung der Pantothensäure mittels Zentrifugation, Dekantierung, Ultrafiltration und/oder Diafiltration ist in der WO 05/028659 beschrieben.

Eine Abtrennung der Pantothensäure aus der Fermentationsbrühe mittels Elektrodialy- se oder lonenaustausch ist ebenfalls möglich. Diese Verfahren sind jedoch nicht bevorzugt, da hierbei gegebenenfalls Probleme zu erwarten sind. Der nach Isolierung oder Abreicherung der Pantothensäure verbleibende Fermentationsrückstand, d.h. insbesondere die abgetrennten Feststoffe, kann allgemein in analoger Weise, wie unten beschrieben, behandelt oder verarbeitet werden, so dass ein proteinhaltiges Nebenprodukt erhalten wird.

Handelt es sich bei dem von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Polyhydroxyalkanoate, so erfolgt die Isolierung des Wertproduktes vorteilhafterweise durch Extraktion mit einem Lösungsmittel, wie z. B in der US 4310684 oder EP 355307 beschrieben. Die übrigen Feststoffe können in üblicher Weise, z. B. durch Filt- ration oder Zentrifugation, abgetrennt werden. Im Übrigen kann die Aufarbeitung der Feststoffe in entsprechender Weise, wie zuvor für Methionin beschrieben, erfolgen. Vorzugsweise führt man im Falle der Polyhydroxyalkanoate zusätzlich eine Pasteurisierung der gesamten Fermentationsbrühe vor der Abtrennung der Feststoffe durch. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird vorzugsweise teilweise eingedampft, gege- benenfalls mit Caiciumchlorid versetzt und getrocknet, bevorzugt sprühgetrocknet. Die weitere Auf reinigung der Polyhydroxyalkanoate erfolgt in an sich bekannter Weise, wie z.B. in der US 4310684 oder EP 355307 beschrieben.

Der verbleibende Fermentationsrückstand, d.h. insbesondere die abgetrennten Fest- Stoffe, kann in analoger Weise, wie unten beschrieben, behandelt oder verarbeitet werden, so dass ein proteinhaltiges Nebenprodukt erhalten wird.

Die nach Abtrennung des Wertprodukts, z.B. einer basischen Aminosäure wie Lysin, verbleibende Fermentationsbrühe enthält im Wesentlichen die während der Fermenta- tion erzeugte Biomasse, die nicht verstoffwechselten Bestandteile der verzuckerten Stärkelösung, wie z.B. Fasern und nicht verwertete Zucker, sowie nicht verwertete Puffer- und Nährsalze. Diese Feststoffe können aus der verbleibenden Fermentationsbrühe ähnlich wie das bei der Herstellung von Bioethanol anfallende Nebenprodukt (das dort „Distiller's Dried Grains with Solubles (DDGS)" genannt und als solches vermarktet wird) gewonnen werden. Hierbei kann eine im Wesentlichen vollständige oder nur teilweise Abtrennung der Fermentationsbrühe von den Feststoffen erfolgen. Das auf diese Weise erhaltene proteinhaltige Nebenprodukt, im Folgenden auch als Proteinzusammensetzung bezeichnet, kann sowohl vor als auch nach weiteren Be- bzw. Verarbeitungsschritten als Futtermittel oder Futtermitteladditiv zur Fütterung von Tieren, be- vorzugt von landwirtschaftlichen Nutztieren, besonders bevorzugt von Rindern, Schweinen und Geflügel, ganz besonders bevorzugt von Rindern verwendet werden.

Die Aufarbeitung, bzw. Ver- und Bearbeitung der Fermentationsbrühe zu einer Proteinzusammensetzung kann nach dem Fachmann bekannten Methoden, insbesondere durch Veränderung des Trockensubstanzgehaltes (z.B. durch Trocknen oder Eindampfen), Mahlen und Formulieren (z.B. Zugabe von Additiven, formgebende Verfahren wie Pelletieren und Extrudieren) erfolgen. Ferner umfasst die Ver- und Bearbeitung des Nebenproduktes auch die Vermischung mit anderen Futtermitteln bzw. Futterzusatzstoffen, z.B. um die Gehalte an Nährstoffen zu standardisieren. Die Proteinzusammensetzung wird in der Regel hergestellt, indem man im Anschluss an die Abreicherung oder Isolierung wenigstens eines Stoffwechselprodukts gemäß Schritt c) die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe wenigstens teilweise ent- fernt. Hierbei erhält man eine Proteinzusammensetzung in fester oder halbfester Form. Der Gehalt des abgereicherten oder isolierten Stoffwechselprodukts in der verbleibenden Fermentationsbrühe beträgt in der Regel höchstens 20 Gew.-%, insbesondere höchstens 15 Gew.-%, speziell höchstens 10 Gew.-% und ganz speziell höchstens 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der verbleibenden Fermentations- brühe.

Zur Gewinnung der Proteinzusammensetzung nach Abtrennung des Wertprodukts wird üblicherweise die gesamte verbleibende Brühe entweder in einer in der Regel mehrstufigen Verdampfung teilweise eingedampft und die enthaltenen Feststoffe anschließend z.B. mit einem Dekanter abgetrennt oder die Feststoffabtrennung erfolgt direkt aus der gesamten Fermentationsbrühe. Zur Abtrennung der Feststoffe können Zentrifugation, Filtration, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration, Umkehrosmose oder eine Kombination dieser Verfahren, z.B. in einer mehrstufigen Anlage, eingesetzt werden. Die hierbei abgetrennten Feststoffe weisen in der Regel einen Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 80 Gew.-%, bevorzugt 15 bis 60 Gew.-% und besonders bevorzugt 20 bis 50 Gew.-% auf. Die durch weitere Be- bzw. Verarbeitung erhaltene fertige Proteinzusammensetzung weist vorteilhafterweise einen Gehalt von etwa 90 Gew.-% Trockensubstanz auf, so dass die Gefahr von Verderb bei einer Lagerung reduziert ist.

Die Proteinzusammensetzung kann auch durch Aufkonzentrierung der festen Bestandteile der nach Schritt c) verbleibenden Fermentationsbrühe mittels thermischer Verfahren (z.B. Eindampfung), mechanischer Verfahren (z.B. unter Einsatz von Filtern, De- kantern, Zentrifugen) und der für den Fachmann üblichen Kombinationen der genannten einzelnen Verfahren gewonnen werden. Durch die Aufkonzentrierung der Brühe erhält man einen festen oder halbfesten, z.B. pastösen, Rückstand, welcher das erfindungsgemäß hergestellte Stoffwechselprodukt noch in geringen Mengen, in der Regel im Bereich von 0 bis 10 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 0 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Rückstands, und die nichtflüchtigen, in der Regel festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile der Stärkequelle oder zumindest große Teile davon, häufig wenigstens 90 Gew.-% oder die Gesamtmenge der festen nichtstärkehaltigen Bestandteile der Stärkequelle sowie die Biomasse aus der Fermentation enthält. Dieser halbfeste oder feste Rückstand kann in gleicher Weise wie die nicht aufkonzentrierte, nach Schritt c) verbleibende Fermentationsbrühe direkt einer Trocknung oder Formulierung zugeführt werden.

Die bei der Gewinnung des Nebenprodukts abgetrennte flüssige Phase kann teilweise als Prozesswasser zurückgeführt werden. Dieser rückgeführte Teil der flüssigen Phase kann vorteilhaft z.B. ganz oder teilweise bei der Herstellung der zuckerhaltigen Flüssigkeit nach Schritt a) eingesetzt werden oder zum Ansetzen von Puffer- bzw. Nähr- Salzlösungen für den Einsatz in der Fermentation verwendet werden. Bei der Zumi- schung von rückgeführtem Prozesswasser in Schritt a) ist zu berücksichtigen, dass ein zu hoher Anteil die Fermentation durch ein Überangebot an bestimmten Mineralstoffen und Ionen, z.B. Natrium- und Lactationen, negativ beeinflussen kann. Vorzugsweise ist der Anteil an rückgeführtem Prozesswasser beim Ansetzen der Suspension zur Stärkeverflüssigung erfindungsgemäß daher auf maximal 75 Gew.-%, bevorzugt maximal 60 Gew.-% und besonders bevorzugt maximal 50 Gew.-%, jeweils bezogen auf das gesamte zum Ansetzen der Suspension eingesetzte Wasser, beschränkt. Vorteilhafterweise liegt der Anteil an Prozesswasser beim Ansetzen der Suspension in der be- vorzugten Ausgestaltung von Schritt a2) im Bereich von 5 bis 60 Gew.-% und bevorzugt von 10 bis 50 Gew.-%, jeweils bezogen auf das gesamte zum Ansetzen der Suspension eingesetzte Wasser.

Der Anteil der nicht in den Prozess zurückgeführten flüssigen Phase kann in einer mehrstufigen Eindampfung zu einem Sirup auf konzentriert werden. Der so erhaltene Sirup weist in der Regel einen Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 20 bis 90 Gew.-%, bevorzugt 30 bis 80 Gew.-% und besonders bevorzugt 40 bis 70 Gew.-% auf. Dieser Sirup kann mit den beim Dekantieren (oder auf andere Weise) abgetrennten Feststoffen vermischt und anschließend getrocknet werden. Die Trocknung kann z.B. mittels Trommeltrockner, Sprühtrockner oder Schaufeltrockner erfolgen, bevorzugt wird ein Trommeltrockner eingesetzt. Die Trocknung wird bevorzugt so durchgeführt, dass der erhaltene Feststoff einen Gehalt an Restfeuchte von maximal 30 Gew.-%, bevorzugt maximal 20 Gew.-% und besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% aufweist.

Durch Zugabe von Formulierungshilfsmitteln wie Träger- und Coatingmaterialien, Bindemitteln sowie anderer Additive können die Eigenschaften des getrockneten und zusammen mit den festen Bestandteilen der Fermentation vorliegenden Nebenproduktes (d.h. der Proteinzusammensetzung) gezielt hinsichtlich verschiedener Parameter wie Korngröße, Partikelform, Neigung zum Stauben, Hygroskopizität, Stabilität, insbeson- dere Lagerstabilität, Farbe, Geruch, Fließverhalten, Agglomerationsneigung, elektrostatischer Aufladung, Licht- und Temperaturempfindlichkeit, mechanischer Stabilität und Redispergierbarkeit in an sich bekannter Weise konfektioniert werden.

Zu den üblicherweise verwendeten Formulierungshilfsmitteln gehören z.B. Bindemittel, Trägermaterialien, Puderungs-/Fließhilfsmittel, ferner Farbpigmente, Biozide, Dispergiermittel, Antischaummittel, Viskositätsregulierende Mittel, Säuren, Laugen, Antioxidantien, Enzymstabilisatoren, Enzyminhibitoren, Adsorbate, Fette, Fettsäuren, Öle o- der Mischungen hieraus. Derartige Formulierungshilfsmittel werden vorteilhaft insbesondere bei Anwendung von Formulierungs- und Trocknungsverfahren wie Sprüh-, Wirbelschicht- und Gefriertrocknung als Trocknungshilfsmittel eingesetzt.

Beispiele für Bindemittel sind Kohlenhydrate, insbesondere Zucker wie Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide, z.B. Dextrine, Trehalose, Glucose, Glucosesirup, Maltose, Saccharose, Fructose und Lactose; kolloidale Substanzen wie tierische Proteine, z.B. Gelatine, Casein, insbesondere Natriumcaseinat, pflanzliche Proteine, z.B. Sojaprotein, Erbsenprotein, Bohnenprotein, Lupin, Zein, Weizenprotein, Maisprotein und Reisprotein, synthetische Polymere, z.B. Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol und insbesondere die Kollidon-Marken der Fa. BASF, gegebenenfalls modifizierte Biopolymere, z.B. Lig- nin, Chitin, Chitosan, Polylactid und modifizierte Stärken, z.B. Octenylsuccinatanhydrid (OSA); Gummen, z.B. Gummi acacia; Cellulosederivate, z.B. Methylcellulose, Ethylcel- lulose, (Hydroxyethyl)methylcellulose (HEMC), (Hydroxypropyl)methylcellulose (HPMC), Carboxymethylcellulose (CMC); Mehle, z.B. Maismehl, Weizenmehl, Roggenmehl, Gerstenmehl und Reismehl.

Beispiele für Trägermaterialien sind Kohlenhydrate, insbesondere die als Bindemittel vorgenannten Zucker sowie Stärken, z.B. aus Mais, Reis, Kartoffel, Weizen und Cassava; modifizierte Stärken, z.B. Octenylsuccinatanhydrid; Cellulose und mikrokristalline Cellulose; anorganische Mineralien oder Lehm, z.B. Ton, Kohle, Kieselgur, Kieselsäu- re, Talg und Kaolin; Gries, z.B. Weizengries, Kleie, z.B. Weizenkleie, die als Bindemittel vorgenannten Mehle; Salze wie Metallsalze, insbesondere Alkali- und Erdalkalimetallsalze organischer Säuren, z.B. Mg-, Ca-, Zn-, Na-, K-citrat, -acetat, -formiat und -hydrogenformiate, anorganische Salze, z.B. Mg-, Ca-, Zn-, Na-, K-sulfate, -carbonate, -Silikate oder -phosphate; Erdalkalimetalloxide wie CaO und MgO; anorganische Puffe- rungsmittel wie Alkalimetallhydrogenphosphate, insbesondere Natrium- und Kalium- hydrogenphosphate, z.B. K₂HPO , KH₂PO₄ und Na₂HPO₄; sowie allgemein die im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Herstellung von Stoffwechselprodukten mit niedrigem Schmelzpunkt bzw. öliger Konsistenz genannten Adsorbentien.

Beispiele für Puderungsmittel bzw. Fließhilfsmittel sind Kieselgur, Kieselsäure, z.B. die Sipernat-Marken der Fa. Degussa; Ton, Kohle, Talg und Kaolin; die als Trägermaterialien vorgenannten Stärken, modifizierten Stärken, anorganischen Salze, Salze organischer Säuren und Pufferungsmittel; Cellulose und mikrokristalline Cellulose.

Hinsichtlich sonstiger Additive seien als Beispiele genannt Farbpigmente wie TiO₂; Bi- ozide; Dispergiermittel; Antischaummittel; Viskositätsregulierende Mittel; anorganische Säuren wie Phosphorsäuren, Salpetersäure, Salzsäure, Schwefelsäure; organische Säuren wie gesättigte und ungesättigte Mono- und Dicarbonsäuren, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Maleinsäure und Fumarsäure; Laugen wie Alkalimetallhydroxide, z.B. NaOH und KOH; Antioxidantien; Enzymstabilisatoren; Enzyminhibitoren; Adsorbate; Fette; Fettsäuren und Öle.

Der Anteil an den vorgenannten Zusatzstoffen und gegebenenfalls weiteren Zusatzstoffen wie Coatingmaterialien kann je nach den speziellen Erfordernissen des jeweiligen Stoffwechselprodukts sowie in Abhängigkeit von den Eigenschaften der eingesetzten Zusatzstoffe stark variieren und z.B. im Bereich von 0,1 bis 80 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 5 bis 70 Gew.-% und speziell im Bereich von 10 bis 60 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des fertig formulierten Produkts bzw. jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des fertig formulierten Produkts bzw. Stoffge- mischs, liegen.

Die Zugabe von Formulierungshilfsmitteln kann vor, während oder nach der Aufarbei- tung der Fermentationsbrühe (auch als Produktformulierung oder Feststoffdesign bezeichnet) und insbesondere während der Trocknung erfolgen. Eine Zugabe von Formulierungshilfsmitteln vor Aufkonzentrierung der nach Schritt c) verbleibenden Fermentationsbrühe kann insbesondere vorteilhaft sein, um die Prozessierbarkeit der aufzuarbeitenden Stoffe bzw. Produkte zu verbessern. Die Formulierungshilfsmittel können sowohl dem in fester Form erhaltenen Nebenprodukt als auch einer dieses enthaltenden Lösung oder Suspension zugegeben werden, z.B. nach Schritt c) direkt zu der Fermentationsbrühe oder zu einer im Verlauf der Aufarbeitung erhaltenen Lösung oder Suspension vor dem abschließenden Trocknungsschritt.

So können die Hilfsstoffe z.B. in eine durch Aufkonzentrierung der nach Schritt c) verbliebenen Fermentationsbrühe erhaltene Suspension eingemischt werden; eine solche Suspension kann auch auf ein Trägermaterial gegeben werden, z.B. durch Untermischen. Insbesondere nach der Trocknung erfolgt eine Zugabe von Formulierungshilfsmitteln z.B. beim Aufbringen von Überzügen bzw. Coatings/Coatingschichten auf ge- trocknete Partikel. Sowohl nach dem Trocknen als auch nach einem eventuellen Coa- tingschritt können dem Produkt weitere Hilfsmittel zugegeben werden. Die durch Formulierungsverfahren gewonnen Partikel können durch die oben beschriebenen Trocknungsverfahren bis auf den gewünschten Restfeuchtigkeitsgehalt getrocknet werden.

Alle in fester Form erhaltenen Nebenprodukte, z.B. Partikel, Granulate und Extrudate, können mit einem Überzug bzw. einem Coating beschichtet werden, d.h. mit mindestens einer weiteren Stoffschicht überzogen werden. Das Coaten erfolgt z.B. in Mischern oder Wirbelschichten, in denen die zu beschichtenden Teilchen aufgewirbelt bzw. „fluidisiert" werden und dann mit dem Überzugs- bzw. Coatingmaterial besprüht werden. Das Coatingmaterial kann trocken, z.B. als Pulver, oder in Form einer Lösung, Dispersion, Emulsion oder Suspension in einem Lösungsmittel, z.B. Wasser, organische Lösungsmittel und Mischungen davon, insbesondere in Wasser, vorliegen. Sofern vorhanden, wird das Lösungsmittel während oder nach dem Aufsprühen auf die Teilchen durch Verdampfen entfernt. Des Weiteren können Coatingmaterialien wie Fette auch als Schmelzen aufgebracht werden.

Coatingmaterialien, die als wässrige Dispersion oder Suspension aufgesprüht werden können sind z.B. in der WO 03/059087 beschrieben. Hierzu gehören insbesondere Polyolefine wie Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenwachse, Wachse, anorganische und organische Salze, Acronale, z.B. Butylacrolat-Methylacrolat-Copolymer, die Styro- fan-Marken der Fa. BASF, z.B. auf Basis von Styrol und Butadien, und hydrophobe Substanzen wie in der WO 03/059086 beschrieben. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoff gehalt des Coatingmaterials typischerweise im Bereich von 0,1 bis 20 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,2 bis 10 Gew.-% und speziell im Be- reich von 0,4 bis 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.

Coatingmaterialien, die als Lösungen aufgesprüht werden können sind z.B. Polyethy- lenglykole, Cellulosederivate wie Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Ethylcellulose, Polyvinylalkohol, Proteine wie Gelatine, anorganische und organische Salze, Kohlenhydrate wie Zucker, z.B. Glucose, Lactose, Fructose, Saccharose und Trehalose; Stärken und modifizierte Stärken. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoff gehalt des Coatingmaterials typischerweise im Bereich von 0,1 bis 20 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,2 bis 10 Gew.-% und speziell im Bereich von 0,4 bis 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.

Coatingmaterialien, die als Schmelze aufgesprüht werden können sind z.B. in der DE 199 29 257 und WO 92/12645 beschrieben. Hierzu gehören insbesondere Polyethy- lenglykole, synthetische Fette und Wachse, z.B. Polygen WE^® der Fa. BASF, natürliche Fette wie tierische Fette, z.B. Bienenwachs, und pflanzliche Fette, z.B. Candelila- wachs, Fettsäuren, z.B. tierische Wachse, Taigfettsäuren, Palmitinsäure, Stearinsäure, Triglyceride, Edenor-Produkte, Vegeole-Produkte, Montanesterwachse, z.B. Luwax E^® der Fa. BASF. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoffgehalt des Coatingmaterials typischerweise im Bereich von 1 bis 25 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 2 bis 25 Gew.-% und speziell im Bereich von 3 bis 20 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.

Nach der Trocknung und/oder Formulierung können dem Nebenprodukt bzw. der Proteinzusammensetzung ganze oder gemahlene Getreidekörner, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Hirse und/oder Roggen zugegeben werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit eine Proteinzusammensetzung aus einer erfindungsgemäß durchgeführten zuckerbasierten mikrobiellen Fermentation zur Herstellung eines Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom, das wie zuvor beschrieben erhältlich ist. Diese Proteinzusammensetzung enthält üblicherweise Proteinmaterial, d.h. Biomasse aus der Fermentation, nicht-stärkehaltige Bestandteile der Stärkequelle, insbesondere Fasern, und Fermentaionsprodukt (Metabolit). Insbesondere enthält die Proteinzusammensetzung im Wesentlichen die folgenden Trockenmasse-Bestandteile:

a) 1 bis 90 Gew.-%, insbesondere 5 bis 85 Gew.-% und speziell 10 bis 75 Gew.-% Biomasse aus der Fermentation;

b) 1 bis 90 Gew.-%, insbesondere 5 bis 85 Gew.-%, speziell 10 bis 80 Gew.-% und ganz speziell 15 bis 75 Gew.-% nicht-stärkehaltige Bestandteile der Stärkequelle, insbesondere Fasern; c) 0,01 bis 10 Gew.-%, insbesondere 0,1 bis 5 Gew.-%, speziell 0,2 bis 5 Gew.-% und ganz speziell 0,3 bis 5 Gew.-% eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N- Atom;

d) 0 bis 90 Gew.-%, insbesondere 5 bis 80 Gew.-% und speziell 10 bis 70 Gew.-% übliche Formulierungshilfsstoffe; und

e) 0 bis 40 Gew.-%, insbesondere 0,5 bis 30 Gew.-% und speziell 1 bis 20 Gew.-% nicht metabolisierte weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe, insbesondere Reste an Zucker, Stärke, Nährsalzen und/oder Puffersalzen;

wobei sich die Komponenten a) bis e) zu 100 Gew.-% an Trockenmasse addieren. Der Ausdruck „im Wesentlichen" bedeutet hier, dass der Anteil weiterer, von a) bis e) ver- schiedener Bestandteile gering ist, in der Regel wird dieser Anteil 10 Gew.-% und insbesondere 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf die gesamte Trockenmasse der Proteinzusammensetzung, nicht überschreiten; speziell beträgt dieser Anteil weniger als 1 Gew.- %, insbesondere etwa 0 Gew.-%.

Zur Biomasse (Komponente a)) zählt insbesondere der Anteil an Rohprotein in der Proteinzusammensetzung. Dieser Anteil beträgt üblicherweise mindestens 40 Gew.-%, und liegt insbesondere im Bereich von 40 bis 90 Gew.-%, speziell im Bereich von 45 bis 85 Gew.-% und speziell im Bereich von 50 bis 80 Gew.-%, jeweils bezogen auf die gesamte Trockenmasse der Proteinzusammensetzung.

Die erfindungsgemäßen Proteinzusammensetzungen enthalten üblicherweise eine oder mehrere essentielle Aminosäuren, insbesondere wenigstens eine unter Lysin, Methionin, Threonin und Tryptophan ausgewählte Aminosäure. Die essentiellen Aminosäuren, insbesondere die genannten, liegen in der Regel jeweils in einer Menge vor, die gegenüber einem herkömmlichen DDGS-Nebenprodukt, das bei einer fermentativen Bioethanolproduktion anfällt, um einen Faktor von wenigstens 1 ,5 erhöht ist. Sofern die jeweilige Aminosäure in der Proteinzusammensetzung enthalten ist, weist diese in der Regel einen Gehalt an Lysin von wenigstens 1 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 1 bis 5 Gew.-%, einen Gehalt an Methionin von wenigstens 0,8 Gew.-%, ins- besondere im Bereich von 0,8 bis 5 Gew.-%, einen Gehalt an Threonin von wenigstens 1 ,5 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 1 ,5 bis 5 Gew.-% und/oder einen Gehalt an Tryptophan von wenigstens 0,4 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,4 bis 5 Gew.- %, jeweils bezogen auf die gesamte Trockenmasse der Proteinzusammensetzung, auf.

Die erfindungsgemäßen Proteinzusammensetzungen enthalten üblicherweise noch einen geringen Anteil Wasser, häufig im Bereich von 0 bis 25 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,5 bis 15 Gew.-%, speziell im Bereich von 1 bis 10 Gew.-% und ganz speziell im Bereich von 1 bis 5 Gew.-% Wasser, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Proteinzusammensetzung. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, wie oben beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass man

(i) dem in Schritt a) erhaltenen zuckerhaltigen Flüssigmedium, das die nichtstärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält, eine Teilmenge von nicht mehr als 50 Gew.-% entnimmt und mit der Restmenge eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines ersten Stoffwechselprodukts (A) durchführt; und

(ii) von dieser Teilmenge die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle ganz oder teilweise abtrennt und mit dieser eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines zweiten Stoffwechselprodukts (B), das mit dem Stoffwechselprodukt (A) identisch oder davon verschieden ist, durchführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile gemäß (ii) so, dass der Feststoffgehalt des verbleibenden Anteils des zuckerhaltigen Flüssigmediums maximal 50 Gew.-%, bevorzugt maximal 30 Gew.- %, besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-% beträgt.

Diese Vorgehensweise ermöglicht es, in der separaten Fermentation gemäß (iii) Mikroorganismen einzusetzen, für die bestimmte Mindestanforderungen erfüllt sein müssen, z.B. bezüglich der Sauerstofftransferrate. Für solche in der separaten Fermentation gemäß (iii) eingesetzten Mikroorganismen kommen z.B. Bacillus species, bevorzugt Bacillus subtilis in Betracht. Die durch derartige Mikroorganismen in der separaten Fermentation produzierten Verbindungen sind insbesondere unter Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleosiden und Nukleotiden, Lipi- den, gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, aromatischen Verbindungen, Proteinen, Carotenoiden, speziell unter Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika, Proteinen und Carotenoiden und ganz speziell unter Riboflavin und Calciumpantothenat ausgewählt.

Insbesondere ermöglicht diese Vorgehensweise, das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft auch dann einzusetzen, wenn die produzierte Feinchemikalie bei der Fermentation als Feststoff anfällt.

Eine bevorzugte Ausgestaltung dieser Vorgehensweise betrifft die parallel betriebene Herstellung gleicher Stoffwechselprodukte (A) und (B) in zwei separaten Fermentationen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn für verschiedene Anwendungen des gleichen Stoffwechselprodukts unterschiedliche Anforderungen an die Reinheit zu stel- len sind. Demnach wird das erste Stoffwechselprodukt (A), z.B. eine als Futtermitteladditiv zu verwendende Aminosäure, z.B. Lysin, unter Einsatz der feststoffhaltigen Fermentationsbrühe und das gleiche zweite Stoffwechselprodukt (B), z.B. die gleiche als Nahrungsmitteladditiv zu verwendende Aminosäure, hier z.B. Lysin, unter Einsatz der gemäß (ii) feststoffabgereicherten Fermentationsbrühe hergestellt. Durch die vollstän- dige oder teilweise Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile kann der Reinigungsaufwand bei der Aufarbeitung des Stoffwechselprodukts, dessen Anwendungsbereich eine höhere Reinheit erfordert, z.B. als Nahrungsmitteladditiv, reduziert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Riboflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlen- stoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.

Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie folgt vorgegangen werden. Man implementiert eine vorzugsweise großvolumige Fermentation zur Herstellung von Stoffwechselprodukten A, z.B. von Feinchemikalien wie Lysin, entsprechend den erfindungsgemäßen Verfahrensschritten a) bis c). Gemäß (i) wird ein Teil des nach Schritt a) erhaltenen, zuckerhaltigen Flüssigmediums entnommen und gemäß (ii) durch übliche Verfahren, z.B. Zentrifugation oder Filtration, vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreit. Das daraus gewonnene, im Wesentlichen vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird gemäß (ii) einer Fermentation zur Produktion eines Stoffwechselprodukts B, z.B. Riboflavin, zugeführt. Der gemäß (ii) abgetrennte Feststoffstrom wird vorteilhafterweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums der großvolumigen Fermentation zurück gegeben.

Die auf diese Art und Weise gemäß (ii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in DE 4037441, EP 464582, EP 438767 und DE 3819745. Nach Lyse der Zellmasse erfolgt die Abtren- nung des kristallin vorliegenden Riboflavins vorzugsweise durch Dekantieren. Andere Arten der Feststoffabtrennung, z.B. Filtration, sind ebenfalls möglich. Anschließend wird das Riboflavin getrocknet, bevorzugt mittels Sprüh- und Wirbelschichttrocknern. Alternativ dazu kann das gemäß (ii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsgemisch nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie z.B. in der EP 1048668 und EP 730034 beschrieben. Nach Pasteurisierung wird die Fermentationsbrühe hier zentrifugiert und die zurückbleibende feststoffhaltige Fraktion mit einer mineralischen Säure behandelt. Das gebildete Riboflavin wird aus dem wässrig- sauren Medium filtriert, gegebenenfalls gewaschen und anschließend getrocknet.

Die abgetrennten Feststoffe können im Rahmen des parallel betriebenen, großvolumigen Fermentationsverfahrens wie bereits zuvor beschrieben zu einem Nebenprodukt verarbeitet werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Pantothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Koh- lenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/021772.

Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie oben für Riboflavin beschrieben vorgegangen werden. Das gemäß (ii) vorgereinigte, vorzugsweise im Wesentlichen von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird einer Fer- mentation gemäß (ii) zur Produktion von Pantothensäure zugeführt. Dabei ist die im Vergleich zum feststoffhaltigen Flüssigmedium verringerte Viskosität besonders vorteilhaft. Der abgetrennte Feststoffstrom wird vorzugsweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums der großvolumigen Fermentation zurückgegeben.

Die gemäß (ii) erzeugte, Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der EP 1050219 und WO 01/83799. Nach Pasteurisieren der gesamten Fermentationsbrühe werden die verbleibenden Feststoffe z.B. durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Fest- Stoffabtrennung wird teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Caiciumchlorid versetzt und getrocknet, insbesondere sprühgetrocknet.

Die abgetrennten Feststoffe können im Rahmen des parallel betriebenen, großvolumigen Fermentationsverfahrens wie bereits zuvor beschrieben zu einem Nebenprodukt verarbeitet werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Polyhydroxyalkanoate. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in S. Y. Lee, Plastic Bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Bd. 14, (1996), S. 431-438.

Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie oben für Riboflavin beschrieben vorgegangen werden. Das gemäß (ii) vorgereinigte, vorzugsweise im Wesentlichen von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird einer Fermentation gemäß (ii) zur Produktion von Polyhydroxyalkanoaten zugeführt. Der abgetrennte Feststoffstrom wird vorzugsweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmedi- ums der großvolumigen Fermentation zurückgegeben.

Die gemäß (ii) erzeugte, Polyhydroxyalkanoat-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der US 4310684 und EP 355307. Nach Pasteurisieren der gesamten Fermentationsbrühe werden die verbleibenden Feststoffe z.B. durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Caiciumchlorid versetzt und getrocknet, insbesondere sprühgetrocknet. Die weitere Aufreinigung der Polyhydroxyal- kanoate erfolgt in an sich bekannter Weise, wie z.B. in der US 4310684 oder EP 355307 beschrieben.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung einzelner Aspekte der vorliegenden Erfindung, sie sind jedoch in keiner Weise als einschränkend zu verstehen. Beispiele

I. Vermählen der Stärkequelle

Die im folgenden eingesetzten Mahlgüter wurden wie folgt hergestellt. Ganze Maiskörner wurden unter Verwendung einer Rotormühle vollständig vermählen. Unter Einsatz unterschiedlicher Schlägerwerke, Mahlbahnen bzw. Siebeinbauten wurden dabei drei verschiedene Feinheiten erzielt. Eine Siebanalyse des Mahlgutes mittels Labor- Vibrationssieb (Vibrations-Analysenmaschine: Retsch Vibrotronic Typ VE1 ; Siebzeit 5 min; Amplitude: 1 ,5 mm) ergab die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse.

Tabelle 1

II. Enzymatische Stärkeverflüssigung und -Verzuckerung

11.1. Ohne Phytase im Verzuckerungsschritt

II.1 a) Enzymatische Stärkeverflüssigung Aus 320 g trocken vermahlenem Maismehl (T71/03) wurde unter stetem Rühren eine Suspension in 480 g Wasser angesetzt und mit 310 mg Caiciumchlorid versetzt. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H₂SO₄ auf 6,5 und Erhitzen auf 35 °C wurden 2,4 g Termamyl 120L Typ L (Novozymes A/S) zugegeben. Über 40 min wurde das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur von 86,5 °C erhitzt, wobei der pH gegebenenfalls mit NaOH auf den zuvor eingestellten Wert nachjustiert wurde. Innerhalb von 30 min wurden weitere 400 g des trocken vermahlenen Maismehls (T71/03) zugegeben, wobei die Temperatur auf 91 °C erhöht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde ca. 100 min bei dieser Temperatur gehalten. Anschließend wurden weitere 2,4 g Termamyl 120L zugegeben und die Temperatur ca. 100 min gehalten. Der Fortschritt der Verflüssigung wurde während der Durchführungsdauer mit der Jod-Stärke-Reaktion verfolgt. Die Temperatur wurde abschließend auf 100 °C erhöht und das Reaktionsgemisch weitere 20 min gekocht. Zu diesem Zeitpunkt war keine Stärke mehr nachzuweisen. Der Reaktor wurde auf 35 °C abgekühlt.

11.1 b) Verzuckerung

Die aus 11.1 a) erhaltene Reaktionsmischung wurde unter stetem Rühren auf 61 °C er- hitzt. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H₂SO₄ auf 4,3 wurden 10,8 g (9,15 ml) Dextrozy- me GA (Novozymes A/S) zugegeben. Die Temperatur wurde ca. 3 h gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion mit Glucoseteststäbchen (S-Glucotest von Boehringer) verfolgt wurde. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 2 aufgeführt. An- schließend wurde das Reaktionsgemisch auf 80 °C erhitzt und danach abgekühlt. Es wurden ca. 1180 g flüssiges Produkt mit einer Dichte von ca. 1 ,2 kg/l und einem mittels Infrarottrockner bestimmten Gehalt an Trockenmasse von etwa 53,7 Gew.-% erhalten. Der Gehalt an Trockenmasse (ohne wasserlösliche Inhaltsstoffe) betrug nach Waschen mit Wasser etwa 14 Gew.-%. Der durch HPLC bestimmte Anteil an Glucose im Reaktionsgemisch betrug 380 g/l (vgl. Tab. 2, Probe Nr. 7).

Tabelle 2

11.2. Mit Phytase im Verzuckerungsschritt

ll.2a) Stärkeverflüssigung

Eine trocken vermahlene Maismehlprobe wird entsprechend 11.1 a) verflüssigt.

II.2b) Verzuckerung

Die aus II.2a) erhaltene Reaktionsmischung wird unter stetem Rühren auf 61 °C erhitzt. Das Rühren wird während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H₂SO₄ auf 4,3 werden 10,8 g (9,15 ml) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) und 70 μl Phytase (700 Units Phytase, Natuphyt Liquid 10000L von der BASF Aktiengesellschaft) zugegeben. Die Temperatur wird ca. 3 h gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion mit Glucoseteststäbchen (S-Glucotest von Boehringer) verfolgt wird. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf 80 °C erhitzt und danach abgekühlt. Das erhaltene Produkt wird mittels Infrarottrockner getrocknet und mit Wasser gewaschen. Der Anteil an Glucose im Reaktionsgemisch wird durch HPLC bestimmt.

II.3 Weitere Arbeitsvorschriften zur enzymatischen Stärkeverflüssigung und -Verzuckerung

ll.3a) Maismehl

360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. 1 ,54 ml CaCI₂ Stammlösung (100 g CaCI₂ x 2 H₂O / 1) werden bis zu einer Endkonzentration von etwa 70 ppm Ca²⁺ in der Maische zugegeben. Unter stetem Rühren lässt man 240 g Maismehl langsam in das Wasser einrieseln. Nach Einstellung des pH auf 6,5 mit 50 Gew.- %iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 4,0 ml (= 2 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Termamyl 120 L Typ L (Novozymes A/S) zu. Die Maische wird dann schnell auf bis zu 85 °C erhitzt. Hierbei muss der pH fortwährend kontrolliert und gegebenenfalls ange- passt werden.

Nach Erreichen der endgültigen Temperatur beginnt man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst von 50 g Mehl. Zusätzlich gibt man der Maische 0,13 ml CaCI₂ Stammlösung zu, um die Ca²⁺-Konzentration bei 70 ppm zu halten. Während der Zugabe hält man die Temperatur konstant bei 85 °C. Man wartet mindestens 10 min ab, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten, bevor man eine weitere Portion (50 g Mehl und 0,13 ml CaCI₂ Stammlösung) zugibt. Nach Zugabe von zwei Portionen gibt man 1 ,67 ml Termamyl zu; anschließend gibt man zwei weitere Portionen (jeweils 50 g Mehl und 0,13 ml CaCI₂ Stammlösung) zu. Es wird ein Gehalt an Trockenmasse von 55 Gew.-% erreicht. Nach der Zugabe erhöht man die Temperatur auf 100 °C und kocht die Maische 10 min. Man entnimmt eine Probe und kühlt diese auf Raumtemperatur. Nach Verdünnung der Probe mit deionisiertem Wasser (etwa 1 :10) gibt man einen Tropfen konzentrierte Lu- golsche Lösung (Mischung von 5 g I und 10 g Kl pro Liter) zu. Eine tiefblaue Färbung zeigt einen Gehalt an verbleibender Stärke an; eine Braunfärbung tritt ein, wenn die Stärke vollständig hydrolysiert wurde. Wenn der Test einen Anteil verbleibender Stärke anzeigt, wird die Temperatur erneut auf 85 °C erniedrigt und konstant gehalten. Man gibt weitere 1 ,67 ml Termamyl zu, bis die lod-Stärke-Reaktion negativ ausfällt.

Die negativ auf Stärke getestete Mischung wird dann für die folgende Verzuckerungs- reaktion auf 61 °C gebracht. Der pH wird durch Zugabe von 50 %iger Schwefelsäure auf 4.3 eingestellt. Im Verlauf der Reaktion wird der pH bei diesem Wert gehalten. Die Temperatur wird bei 61 °C gehalten. 5,74 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozym GA (Novozymes A/S) werden zugegeben, um die verflüssigte Stärke in Glucose umzuwandeln. Man lässt die Reaktion eine Stunde fortschreiten. Zur Inaktivie- rung des Enzyms erhitzt man die Mischung auf 85 °C. Die heiße Mischung füllt man in sterile Behälter und lagert diese nach Abkühlung bei 4 °C.

II.3b) Roggenmehl (inklusive Cellulase/Hemicellulase-Vorbehandlung)

360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Unter stetem Rühren lässt man 155 g Roggenmehl langsam in das Wasser einrieseln. Die Temperatur wird konstant bei 50 °C gehalten. Nach Einstellung des pH auf 5,5 mit 50 Gew.- %iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 3,21 ml (= 2,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Viscozyme L (Novozymes A/S) zu. Nach 30 min startet man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst gibt man 55 g Mehl zu. Nach weiteren 30 min gibt man erneut 50 g Mehl hinzu; 30 min später noch einmal 40 g Mehl. 30 min nach der letzten Zugabe kann mit der Verflüssigung begonnen werden.

1 ,7 ml CaCI₂ Stammlösung (100 g CaCI₂ x 2 H₂O / 1) werden zugegeben. Nach Einstel- lung des pH auf 6,5 mit 50 Gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 5,0 ml (= 2 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Termamyl 120 L Typ L (Novozymes A/S) zu. Die Maische wird dann schnell auf 85 °C erhitzt. Hierbei wird der pH fortwährend kontrolliert und gegebenenfalls angepasst.

Nach Erreichen der endgültigen Temperatur beginnt man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst von 60 g Mehl. Zusätzlich gibt man der Maische 0,13 ml CaCI₂ Stammlösung zu, um die Ca²⁺-Koncentration bei 70 ppm zu halten. Während der Zugabe hält man die Temperatur konstant bei 85 °C. Man wartet mindestens 10 min ab, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten, bevor man eine weitere Portion (40 g Mehl und 0,1 ml CaCI₂ Stammlösung) zugibt. Man gibt 1 ,1 ml Termamyl zu; anschließend gibt man eine weitere Portionen (40 g Mehl und 0,1 ml CaCI₂ Stammlösung) zu. Es wird ein Gehalt an Trockenmasse von 55 Gew.-% erreicht. Nach der Zugabe erhöht man die Temperatur auf 100 °C und kocht die Maische 10 min. Man entnimmt eine Probe und kühlt diese auf Raumtemperatur. Nach Verdünnung der Probe mit deionisiertem Wasser (etwa 1 :10) gibt man einen Tropfen konzentrierte Lu- golsche Lösung (Mischung von 5 g I und 10 g Kl pro Liter) zu. Eine tiefblaue Färbung zeigt einen Gehalt an verbleibender Stärke an; eine Braunfärbung tritt ein, wenn die Stärke vollständig hydrolysiert wurde. Wenn der Test einen Anteil verbleibender Stärke anzeigt, wird die Temperatur erneut auf 85 °C erniedrigt und konstant gehalten. Man gibt weitere 1 ,1 ml Termamyl zu, bis die lod-Stärke-Reaktion negativ ausfällt.

Die negativ auf Stärke getestete Mischung wird dann für die folgende Verzuckerungsreaktion auf 61 °C gebracht. Der pH wird durch Zugabe von 50 %iger Schwefelsäure auf 4.3 eingestellt. Im Verlauf der Reaktion wird der pH bei diesem Wert gehalten. Die Temperatur wird bei 61 °C gehalten. 5,74 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) werden zugegeben, um die verflüssigte Stärke in Glucose umzuwandeln. Man lässt die Reaktion eine Stunde fortschreiten. Zur Inaktivie- rung des Enzyms erhitzt man die Mischung auf 85 °C. Die heiße Mischung füllt man in sterile Behälter und lagert diese nach Abkühlung bei 4 °C.

ll.3c) Weizenmehl (inklusive Xylanase-Vorbehandlung)

360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Das Wasser wird auf 55 °C erhitzt und der pH mit 50 Gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung auf 6,0 eingestellt. Nach Einstellung von Temperatur und pH gibt man 3,21 ml (= 2,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Shearzyme 500L (Novozymes A/S) zu. Unter stetem Rühren lässt man 155 g Weizenmehl langsam in die Lösung einrieseln. Die Temperatur und der pH werden konstant gehalten. Nach 30 min startet man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst gibt man 55 g Mehl zu. Nach weiteren 30 min gibt man 50 g Mehl hinzu; 30 min später noch einmal 40 g Mehl. 30 min nach der letzten Zugabe kann mit der Verflüssigung begonnen werden.

Die Verflüssigung und Verzuckerung werden wie unter ll.3b beschrieben durchgeführt.

III. Konstruktion eines Lysin überproduzierenden C. glutamicum Stamms ATCC13032 lysC ^r

II 1.1 Konstruktion des Plasmids pCIS lysC

Im ersten Schritt der Stammkonstruktion wurde ein allelischer Austausch des für das Enzym Aspartatkinase kodierenden Wildtypgens (lysC) in C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Dabei wurde im lysC Gen ein Nukleotidaustausch vorgenommen, so dass im resultierenden Protein die Aminosäure Thr an der Position 311 durch ein lle ausgetauscht wurde. Ausgehend von der chromosomalen DNA aus ATCC13032 als Template für eine PCR Reaktion wurde mit den Oligonukleotidprimern 5'-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC -3' (SEQ ID NO:1) und 5'-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3' (SEQ ID NO:2) lysC mit Hilfe des Pfu-Turbo PCR Systems (Stratagene, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert. Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde nach Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 oder Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828 präpariert. Das amplifizierte Fragment wird an seinem 5'-Ende von einer Sall Restriktionsschnittstelle und an seinem 3'-Ende von einer Mlul Restriktionsschnittstelle flankiert. Vor der Klonierung wurde das amplifizierte Fragment durch diese beiden Restriktionsenzyme verdaut und mit GFX™PCR, DNA and Gel Band Purificati- on Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) aufgereinigt.

Das erhaltene Polynukleotid wurde über die Sall und Mlul Restriktionsschnitte in pCLIKδ MCS integrativ SacB, im folgenden pCIS genannt, (SEQ ID NO: 3) kloniert und in E.coli XL-1 blue transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20μg/ml) haltigem LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 :190) erreicht. Das Plasmid wurde isoliert und durch Sequenzierung die erwartete Nukleotidsequenz bestätigt. Die Präparation der Plasmid DNA wurde nach Methoden und mit Materialien der Firma Quiagen durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467 durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und ausgewertet. Das erhaltene Plasmid wurde als pCIS lysC (SEQ ID NO:4) bezeichnet. Es umfasst folgende wesentliche Teilbereiche:

III.2 Mutagenese des lysC Gens aus C. glutamicum

Die gerichtete Mutagenese des lysC Gens aus C. glutamicum wurde mit dem Quick- Change Kit (Stratagene, USA) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Muta- genese wurde im Plasmid pCIS lysC (SEQ ID NO:4) durchgeführt. Für den Austausch von thr 311 nach 311 ile mit Hilfe der Quickchange Methode (Stratagene) wurden folgende Oligonukleotidprimer synthetisiert: 5'-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG -3' (SEQ ID NO:5)

5'-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG -3' (SEQ ID NO:6)

Der Einsatz dieser Oligonukleotidprimer in der Quickchange Reaktion führt in dem lysC Gen (SEQ ID NO:7) zu einem Austausch des Nukleotids in Position 932 (von C nach T). Der resultierende Aminosäureaustausch Thr3111le im lysC Gen wurde nach Transformation in E.coli XL1 -blue und Plasmidpräparation durch eine Sequenzierungsreaktion bestätigt. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pCIS lysC thr311 ile (SEQ ID NO:8). Es umfasst folgende wesentliche Teilbereiche:

III.3 Transformation von pCIS lysC thr311 ile in C. glutamicum (Stamm ATCC13032)

Das Plasmid pCIS lysC thr311 ile wurde in C. glutamicum ATCC13032 mittels Elektro- poration, wie bei Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 53:299-303 (1989) beschrieben, transformiert. Modifikationen des Protokolls sind in der DE 10046870 beschrieben. Die chromosomale Anordnung des lysC-Lokus einzelner Transformanten wurde mit Standardmethoden durch Southernblot und Hybridisierung, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989), beschrieben, ü- berprüft. Dadurch wurde sichergestellt, dass es sich bei den Transformanten um solche handelt, die das transformierte Plasmid durch homologe Rekombination am lysC- Lokus integriert haben. Nach Wachstum solcher Kolonien über Nacht in Medien, die kein Antibiotikum enthalten, werden die Zellen auf ein Saccharose-CM-Agarmedium (10% Saccharose) ausplattiert und 24 Stunden bei 30°C inkubiert.

Da das im Vektor pCIS lysC thr311 ile enthaltende sacB Gen Saccharose in ein toxisches Produkt umwandelt, können nur solche Kolonien anwachsen, die das sacB Gen durch einen zweiten homologen Rekombinationsschritt zwischen dem Wildtypgen lysC und dem mutierten Gen lysC thr311ile deletiert haben. Während der homologen Rekombination kann entweder das Wildtypgen oder das mutierte Gen zusammen mit dem sacB Gen deletiert werden. Wenn das sacB Gen zusammen mit dem Wildtypgen entfernt wird, resultiert eine mutierte Transformante.

Anwachsende Kolonien wurden gepickt und auf einen Kanamycin-sensitiven Phänotyp hin untersucht. Klone mit deletiertem SacB Gen müssen gleichzeitg Kanamycin- sensitives Wachstumsverhalten zeigen. Solche Kanamycin-sensitiven Klone wurden in einem Schüttelkolben auf ihre Lysin-Produktivität hin untersucht. Zum Vergleich wurde der nicht behandelte C. glutamicum ATCC13032 angezogen. Klone mit einer gegenüber der Kontrolle erhöhten Lysin-Produktion wurden selektiert, chromosomale DNA gewonnen und der entsprechende Bereich des lysC Gens durch eine PCR-Reaktion (Pfu-Turbo PCR Systems; Stratagene, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert und sequenziert (nach Sanger et al., a.a.O.). Ein solcher Klon mit der Eigenschaft er- höhter Lysin-Synthese und nachgewiesener Mutation in lysC an Position 932 wurde mit ATCC13032 lysC^fbr bezeichnet.

Beispiel 1 a) Enzymatische Stärkeverflüssigung und -Verzuckerung

500 g trocken vermahlenes Maismehl wurden in 750 ml Wasser suspendiert und in einem Rührmixer erneut fein vermählen. Die Suspension wurde in 4 Proben Nr. 1 bis 4 geteilt, die jeweils mit ca. 3 g hitzestabiler α-Amylase (Proben Nr. 1 und 2: Termamyl L; Proben Nr. 3 und 4: Spezyme) behandelt wurden. Die Proben Nr. 2 und 4 wurden nachfolgend mit ca. 7 g/l Glucoamylase (Probe Nr. 2: Dextrozyme GA; Probe Nr. 4: Optidex) behandelt. Es wurden gelbliche, viskose Proben erhalten, deren Feststoffanteil jeweils durch Zentrifugation abgetrennt wurde, wobei über der klaren Flüssigphase eine Schicht hydrophober Feststoffe aufschwamm.

Von den so erhaltenen Proben wurde unter Vernachlässigung bzw. unter Einbeziehung des abzentrifugierten Pellets jeweils der klare Überstand in konzentrierter Form und in 10-facher Verdünnung mittels HPLC analysiert. Bei Berücksichtigung des Pellets wurde ein Gehalt an Trockenmasse für das Pellet von 50 Gew.-% angenommen. Die Er- gebnisse, bezogen auf die Ausgangsprobe, sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

b) Fermentation

Zwei gemäß Beispiel 11.1 erhaltene Maismehlhydrolysate wurden in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Corynebacterlum glutamicum eingesetzt (Kolben 4-9). Außerdem wurde parallel ein analog Beispiel 11.1 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 1 -3) verwendet.

1 b.1 ) Herstellung des Inokulums

Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 4; 20 min bei 121°C) 48 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD₆₀₀ = 1 bei 600 nm erreicht.

Tabelle 4: Zusammensetzung des CM-Agar

1 b.2) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5: Kolbenmedien

mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen Glucosekonzentration im Hydrolysat ^* Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Zuckern und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC wurde mit einem 1100 Series LC System von Agilent durchgeführt. Eine Vorsäulenderivatisierung mit ortho-Phthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäure, die Auftrennung des Produktgemischs erfolgt mit einer Hypersil AA-Säule von Agilent. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt.

Tabelle 6

In allen Kolben wurde Lysin in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 30 bis 40 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute. Beispiel 2: Fermentation

Unter Verwendung eines gemäß Beispiel 11.1 erhaltenen Maismehlhydrolysats wird eine Fermentation analog Beispiel 1 b) durchgeführt, wobei der unter III. beschriebene Stamm ATCC13032 lysC^fbr verwendet wurde. Die Zellen werden auf sterilem CM-Agar (Zusammensetzung Tabelle 4; 20 min bei 121 °C) 48 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums 1 bzw. 2 (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD₆₁₀ = 1 bei 610 nm erreicht. Die Proben werden dann bei 200 Upm und 30 °C in einem befeuchteten Schüttelschrank (85% rel. Luftfeuchte) 48 h inkubiert. Die Konzentration des Lysins in den Medien wird mittels HPLC bestimmt. In allen Fällen wurden annähernd gleiche Mengen an Lysin produziert.

Beispiel 3

Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Corynebacterlum glutamicum (ATCC13032 lysC^fbr) eingesetzt (Kolben 1+2). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 3+4) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 5+6) ver- wendet.

3.1) Herstellung des Inokulums

Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+CaAc-Agar (Zusammen- setzung: siehe Tabelle 7; 20 min bei 121°C) 48 h bei 30 °C inkubiert, dann auf eine neue Platte überimpft und über Nacht bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 23 ml des Mediums (siehe Tabelle 8) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD₆₁₀ = 0,5 bei 610 nm erreicht.

Tabelle 7: Zusammensetzung der CM+CaAc-Agarplatten

3.2) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 6 sind in Tabelle 8 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselö- sung verwendet.

Tabelle 8: Kolbenmedien

mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen ^* Glucosekonzentration im Hydrolysat ^** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Aminosäurebestimmung erfordert eine Vorsäulenderivatisierung mit ortho-Phthalaldehyd, die Auftrennung erfolgt auf einer Zorbax Extend C18 Säule von Agilent. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengestellt.

Tabelle 9

In allen Kolben wurde Lysin in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 10 bis 12 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute. ι

3.3) Isolierung des Lysin

Zur Isolierung des Lysin werden in einem ersten Schritt üblicherweise die Feststoffe aus der Fermentationsbrühe durch Zentrifugation abgetrennt. Alternativ zur Zentrifugation können auch Filtrationsverfahren wie z.B. Membranfiltrationen eingesetzt werden. Die feststofffreie Fermentationsbrühe wird dann angesäuert (z.B. mit Schwefelsäure), wodurch Lysin in ein- oder zweifach protonierter Form vorliegt. Anschließend wird diese angesäuerte Brühe dann über einen Kationentauscher geleitet, so dass das Lysin am lonentauscher bindet. Nach Spülen mit Wasser wird dann Ammoniakwasser zur Elution des Lysins über den lonentauscher geleitet. Das Eluat wird eingedampft; anschließend wird das im Eluat als freie Base vorliegende Lysin durch Zugabe von Salzsäure in Lysinhydrochlorid überführt und auskristallisiert. Die Abtrennung der Kristalle aus der Kristallsuspension erfolgt durch Zentrifugation, bevor sie abschließend getrocknet werden. Durch dieses Vorgehen wird ein kristallines Lysin hoher Reinheit (> 98,5 Gew.-% Lysin^*HCI) erzeugt. Detaillierte Beschreibungen dieses Vorgehens wie auch alternativer Methoden zur Lysinaufarbeitung finden sich in „Ikeda, M.: Amino Acid Production Processes. Advances in Biochemical Engineering /Biotechnology, Vol. 79 (2003), 1-35" und "Hermann, T.: Industrial production of amino acids by coryneform bacteria. Journal of Biotechnology 104 (2003), 155-172".

Beispiel 4

Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen verwendet (Kolben 1-3). Als Panthothenat-produzierender Stamm wurde Bacillus PA824 eingesetzt (genaue Beschreibung in WO 02/061108). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet. 4.1) Herstellung des Inokulums

42 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 10) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 0,4 ml einer Gefrierkultur angeimpft und 24 h bei 43 °C unter Bewegen (250 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.

Tabelle 10: Zusammensetzung des Vorkulturmediums

mit verdünnter wässriger KOH-Lösung einzustellen 42 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 11 ) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 1 ml Vorkultur angeimpft.

4.2) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 11 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselö- sung verwendet. Tabelle 1 1 : Kolbenmedien

* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen ** Glucosekonzentration im Hydrolysat *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 24 h bei 43 °C und unter Bewegen (250 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Pantothensäure per HPLC bestimmt. Die Bestimmung der Glucose erfolgte mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule der Firma Bio-Rad. Die Bestimmung der Pantothensäurekonzentration erfolgte mittels Auftrennung auf einer Aqua C18-Säule der Firma Phenomenex. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengestellt. Tabelle 12

In allen Kolben wurde Pantothensäure in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 1 ,5 bis 2 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute.

Eine Aufarbeitung des Produkts kann z.B. wie in der WO 02/24001 , WO 02/072857 und WO 05/028659 beschrieben erfolgen.

Beispiel 5

Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Aspergillus niger eingesetzt (Kolben 1 -3). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4- 6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.

5.1 ) Stämme

Ein Aspergillus niger Phytase-Produktionsstamm mit 6 Kopien des phyA-Gens aus Aspergillus ficuum unter der Kontrolle des glaA-Promotors wurde analog zur im Detail in WO98/46772 beschriebenen Herstellung von NP505-7 erzeugt. Als Kontrolle wurde ein Stamm mit 3 modifizierten glaA Ampikons (analog ISO505), jedoch ohne integrierte phyA-Expressionskassetten verwendet.

5.2) Herstellung des Inokulums

20 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 13) in 100 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 100 μl einer Gefrierkultur angeimpft und 24 h bei 34 °C unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Tabelle 13: Zusammensetzung des Vorkulturmediums

* mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen

50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 14) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 5 ml Vorkultur angeimpft

5.3) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 14 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet. Tabelle 14: Kolbenmedien

* mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen ** Glucosekonzentration im Hydrolysat *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 34 °C und unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Hilfe eines Assays bestimmt. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Phytinsäure als Substrat und auf einem geeignetem Phytaseaktivitätsniveau (Standard: 0,6 U/ml) in 250 mM Essigsäure / Natriumacetat / Tween 20 (0,1 Gew.-%), pH 5,5 Puffer bestimmt. Der Assay wurde standardisiert für die Anwendung in Mikrotiterplatten (MTP). 10 μl der Enzymlösung wurden mit 140 μl 6,49 mM Phytatlösung in 250 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,5 (Phy- tat: Dodecanatriumsalz der Phytinsäure) gemischt. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe des gleichen Volumens (150 μl) Trichloressig- säure gestoppt. Ein Aliquot dieser Mischung (20 μl) wurde überführt in 280 μl einer Lösung, die 0,32 N H₂SO₄, 0,27 Gew.-% Ammoniummolybdat und 1 ,08 Gew.-% As- corbinsäure enthält. Anschließend erfolgte eine 25-minütige Inkubation bei 50°C. Die Absorption der blau gefärbten Lösung wurde bei 820 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 zusammengestellt.

Tabelle 15

) FTU = Formazin-Turbidity-Einheit

Das Produkt kann aufgearbeitet werden wie in der WO 98/55599 beschrieben.

Beispiel 6

Ein gemäß Beispiel ll.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Ashbya gossypii eingesetzt (Kolben 1-4). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 5- 8) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 9-12) verwendet. 6.1) Stamm

Bei dem eingesetzten Riboflavin-produzierenden Stamm handelt es sich um Ashbya gossypii ATCC 10895 (s.a. Schmidt G , et al. Inhibition of purified isocitrate lyase identified itaconate and oxalate as potential antimetabolites for the riboflavin overproducer Ashbya gossypii. Microbiology 142: 411 -417, 1996).

6.2) Herstellung des Inokulums Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem HMG-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 16; 20 min bei 121 °C) 72 h bei 28 °C inkubiert.

Tabelle 16: Zusammensetzung der HMG-Agarplatten

Anschließend werden 50 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 17) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen jeweils mit einer Impföse voll Zellen angeimpft und 24 h bei 28 °C unter Bewegen (180 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.

Tabelle 17: Zusammensetzung des Vorkulturmediums

* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen 50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 18) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 5 ml Vorkultur angeimpft

6.3) Herstellung der Fermentationsbrühe Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 12 sind in Tabelle 18 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.

Tabelle 18: Kolbenmedien

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 28 °C und unter Bewegen (180 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Vitamin B₂ per HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 zusammengestellt.

Tabelle 19

Das Produkt kann aufgearbeitet werden wie in der EP 00345717 beschrieben.

Beispiel 7

Ein gemäß Beispiel ll.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Corynebacterlum glutamicum eingesetzt (Kolben 1-3). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.

7.1 ) Stämme Stämme von Corynebacterium, die Methionin produzieren, sind dem Fachmann bekannt. Die Herstellung solcher Stämme ist z.B. in Kumar D. Gomes J. Biotechnology Advances, 23(1):41-61 , 2005; Kumar D. et al., Process Biochemistry, 38:1165-1171 , 2003; WO 04/024933 und WO 02/18613 beschrieben.

7.2) Herstellung des Inokulums

Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+Kan-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 20; 20 min bei 121°C) 24 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD₆₁₀ = 0,5 bei 610 nm erreicht. garplatten

7.3) Herstellung der Fermentationsbrühe Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 21 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.

Tabelle 21 : Kolbenmedien

* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen

** Glucosekonzentration im Hydrolysat

*** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert, bis die Glucose aufgebraucht war. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Methionin per HPLC bestimmt (Säule: Agilent ZORBAX Eclipse AAA; Methode It. Eclipse AAA protocol, Technical Note 5980-1193). Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 zusammengestellt.

Tabelle 22

Die Aufarbeitung des Produkts kann z.B. wie in der WO 05/007862 und der früheren Anmeldung DE 10359668.2 beschrieben erfolgen. Beispiel 8

Ein gemäß Beispiel ll.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Bacterium 130Z eingesetzt. 8.1 ) Stamm

Als Succinat-produzierender Stamm wurde Bacterium 130Z eingesetzt (ATCC No. 55618). 8.2) Herstellung der Fermentationsbrühe

50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 23) in 120 ml Serumflaschen werden jeweils mit 1 ml einer Gefrierkultur angeimpft. Vor dem Verschließen wird auf die Serumflaschen CO₂ aufgepresst (0,7 bar).

Die Zusammensetzung des Mediums ist in Tabelle 23 aufgeführt (vgl. US 5,504,004). Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet (Endkonzentration Glucose: 100 g/l). Tabelle 23: Medium*

* begast mit und abgefüllt unter C0₂/N₂ ^** Glucosekonzentration im Hydrolysat ^**^* Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Serumflaschen 46 h bei 37 °C und unter Bewegen (160 Upm) in einem Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Succinat per HPLC bestimmt. Die Bestimmung erfolgte mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule von Bio-Rad. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 zusammengestellt.

Tabelle 24

Beispiel 9

Ein gemäß Beispiel ll.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wird in Schüttelkolbenversu- chen unter Verwendung von Escherichia coli eingesetzt (Kolben 1 -3). Ebenso werden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.

9.1) Stamm

Escherichia co/-Stämme, die L-Threonin produzieren, sind dem Fachmann bekannt. Die Herstellung solcher Stämme ist z.B. in der EP 1013765 A1 , EP 1016710 A2, US 5,538,873 beschrieben.

9.2) Herstellung des Inokulums

Die Zellen werden auf sterilem LB-Agar ausgestrichen. Dem LB-Agar werden Antibioti- ka zugefügt, wenn geeignete Resistenz-Gene als Marker in dem entsprechenden Stamm existieren. Hierfür können z.B. Kanamycin (40 μg/mL) oder Ampicillin (100 mg/l) verwendet werden. Die Stämme werden 24 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 25) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD₆₁₀ = 0,5 bei 610 nm erreicht. 9.3) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 25 aufgeführt. Im Kontrollmedium wird statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.

Tabelle 25: Kolbenmedien

* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen ** Glucosekonzentration im Hydrolysat

*** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen werden die Kolben bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert, bis die Glucose aufgebraucht ist. Nach dem Abbruch der Fermentation kann der Gehalt an L-Threonin durch reversed-phase- HPLC bestimmt werden, wie von Lindroth et al., Analytical Chemistry 51 : 1167-1174, 1979 beschrieben.

Anschließend kann die Fermentationsbrühe geerntet werden und das in der Fermenta- tionsbrühe enthaltene L-Threonin isoliert, gereinigt oder anderweitig verarbeitet werden, wie z.B. in der US 5,538,873 und von Okamoto et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 61 (11), 1877-1882, 1997 beschrieben.

Beispiel 10

In analoger Weise wie in Beispiel 9 beschrieben werden durch Einsatz entsprechender Stämme die weiteren L-Aminosäuren Glutamat, Lysin, Histidin, Prolin und Arginin hergestellt. Die jeweiligen Stämme sind z.B. in der EP 1016710 beschrieben. Beispiel 11

Ein analog Beispiel II.3 erhaltenes Cassavamehlhydrolysat wurde in Schüttelkolben- versuchen unter Verwendung des unter 11.2) beschriebenen Lysin-produzierenden Stamms von Corynebacterlum glutamicum eingesetzt (Kolben 1 -4). Das eingesetzte Mehl wies folgende Größenverteilung auf: 45 % < 100 μm, 56 % < 200 μm, 79 % < 630 μm.

Bereits zu Beginn des Verflüssigungsschritts war die Viskosität der Suspension relativ hoch, so dass anfangs Cassavamehl in einer Menge eingesetzt wurde, die einem Trockenmassegehalt von 35 Gew.-% entsprach. Es erfolgte eine entsprechend vermehrte Zugabe von Mehl, um letztlich einen Trockenmassegehalt von 55 Gew.-% zu erreichen. Die Viskosität der Suspension blieb während der gesamten Verflüssigung und Verzuckerung relativ hoch. Des Weiteren neigte das Cassavamehl zur Verklumpung; die Klümpchen lösten sich im weiteren Verlauf nur zum Teil wieder auf. Vorhandene Klümpchen färbten sich im lod-Stärke-Test nach einigen Minuten tiefblau; dies deutet darauf hin, dass die verklumpte Stärke trotz mehrfachem Aufkochen und längerer Wartezeit nicht vollständig umgesetzt werden konnte. 11.1 ) Stamm

Es wurde der unter III. beschriebene modifizierte Wildtyp mit feedback-deregulierter Aspartokinase ATCC13032 lysC^fbr verwendet. 1 1.2) Herstellung des Inokulums

Die Zellen wurden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+CaAc-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 26; 20 min bei 121°C) 24 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 23 ml des Mediums (siehe Tabelle 27) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen wurden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD₆₁₀ = 0,5 bei 610 nm erreichte.

Tabelle 26: Zusammensetzung der CM+CaAc-AgarpIatten

11.3) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzung des Kolbenmediums ist in Tabelle 27 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.

Tabelle 27: Kolbenmedien

* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen ** Glucosekonzentration im Hydrolysat *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Glucose wurde mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule von Bio-Rad bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einer Agilent 1100 Series LC System HPLC. Eine Vorsäulenderivatisierung mit Ortho- Pthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäuren, die Auftrennung des Aminosäuregemisches findet auf einer Hypersil AA-Säule (Agilent) statt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 28 zusammengestellt.

Tabelle 28

In allen Kolben wurde Lysin in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 10 bis 14 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute.

Beispiel 12

Ein teilverzuckertes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Aspergillus niger eingesetzt.

12.1) Verflüssigung und (Teil-) Verzuckerung

Die Verflüssigung wurde analog Beispiel II.3a durchgeführt. Nach Abkühlung der Suspension auf 61 °C und Einstellung des pH auf 4,3 wurden 5,38 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) zugegeben. Jeweils 10, 15, 20, 30, 45 und 60 Minuten nach Zugabe des Enzyms wurden 50 g Probe entnommen und in 25 ml sterilem, eisgekühltem VE-Wasser suspendiert. Die Proben wurden in ein Eisbad gestellt und sofort im Kolbentest eingesetzt. Es erfolgte keine Inaktivierung des Enzyms.

12.2) Fermentation

Es wurde der in Beispiel 5.1) verwendete Stamm eingesetzt. Die Herstellung des Ino- kulums erfolgte wie in Beispiel 5.2) beschrieben. Zur Herstellung der Fermentationsbrühe wurden die in Tabelle 29 aufgeführten Zusammensetzungen des Kolbenmediums verwendet. Aus jeder Probe wurden zwei Kolben angesetzt.

Tabelle 29: Kolbenmedien

* mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen *** Einwaage an teilverzuckertem Hydrolysat pro Liter Medium Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 34 °C und unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Hilfe eines Assays (wie in Beispiel 5.3 beschrieben) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 30 zusammengestellt. Tabelle 30

Beispiel 13

Ein teilverzuckertes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Corynebacterlum glutamicum eingesetzt.

13.1) Verflüssigung und (Teil-) Verzuckerung

Die Verflüssigung wurde analog Beispiel Il.3a durchgeführt. Nach Abkühlung der Suspension auf 61 °C und Einstellung des pH auf 4,3 wurden 5,38 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) zugegeben. Jeweils 10, 15, 20, 30, 45 und 60 Minuten nach Zugabe des Enzyms wurden 50 g Probe entnommen und in 25 ml sterilem, eisgekühltem VE-Wasser suspendiert. Die Proben wurden in ein Eis- bad gestellt und sofort im Kolbentest eingesetzt. Es erfolgte keine Inaktivierung des Enzyms.

13.2) Fermentation

Es wurde der in Beispiel 3) verwendete Stamm eingesetzt. Die Herstellung des Inoku- lums erfolgte wie in Beispiel 3.1) beschrieben.

Zur Herstellung der Fermentationsbrühe wurden die in Tabelle 31 aufgeführten Zusammensetzungen des Kolbenmediums verwendet. Aus jeder Probe wurden drei Kolben angesetzt.

Tabelle 31 : Kolbenmedien

mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen ** Einwaage an teilverzuckertem Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Glucose wurde mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule von Bio-Rad bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einer Agilent 1100 Series LC System HPLC. Eine Vorsäulenderivatisierung mit Ortho- Pthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäuren, die Auftrennung des Aminosäuregemisches findet auf einer Hypersil AA-Säule (Agilent) statt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 32 zusammengestellt.

Tabelle 32

Beispiel 14 Bei einer analog Beispiel 3 durchgeführten Fermentation zur Herstellung von Lysin wurde nach Abreicherung des Lysins aus der Fermentationsbrühe gemäß Schritt c) als getrockneter Fermentationsrückstand eine Proteinzusammensetzung erhalten. In Tabelle 33 sind wesentliche Bestandteile der Zusammensetzung mit ihren Gewichtsanteilen angegeben und mit einer herkömmlichen DDGS-Zusammensetzung verglichen. Tabelle 33: Analysenergebnisse bezogen auf Trockenmasse in Gew.-% **

* für DDGS (Distiller's dried grain with solubles, das Nebenprodukt aus der Bioethanol- Herstellung) nach National Research Council (NRC), Nutrient Requirements for Dairy Cattle, Seventh Revised Edition, National Academy Press, 2001 (bzw. Spiehs M.J., Whitney M.H. and Shurson G.G.: Nutrient database for distiller's dried grains with solu- bles produced from new ethanol plants in Minnesota and South Dakota, Journal of Animal Science 80, 2002, 2639-2645)

** die genannten Parameter und die dazu erforderlichen Analysenmethoden sind dem Fachmann bekannt

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung wenigstens eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 5 N-Atom durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, umfassend: a) die Herstellung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosac- charidgehalt von mehr als 20 Gew.-% aus einer Stärkequelle, wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch nicht-stärkehaltige feste Bestandteile o der Stärkequelle umfasst; b) die Fermentation des zuckerhaltigen Flüssigmediums zur Produktion des(der) Stoffwechselprodukte(s); und 5 c) Abreicherung oder Isolierung wenigstens eines Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrühe, dadurch gekennzeichnet, dass man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechsel- produkt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm mit dem zuckerhaltigen Flüs-0 sigmedium kultiviert, welches man erhält durch: a1 ) Vermählen der Stärkequelle; und a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart5 mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man mindestens eine Teilmenge des Mahlguts durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe zur wässrigen Flüssigkeit verflüssigt. 0

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das zuckerhaltige Flüssigmedium mindestens 20 Gew.-% der gesamten nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das mindes-5 tens eine Stärke verflüssigende Enzym unter α-Amylasen und das mindestens eine verzuckernde Enzym unter Glucoamylasen ausgewählt ist.

4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stärkequelle Getreidekörner verwendet.0

5. Verfahren nach Anspruch 4, -dadurch gekennzeichnet, dass das Getreide ausgewählt ist unter Mais-, Roggen-, Triticale- und Weizenkörnern.

6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das beim Vermählen im Schritt a1 ) erhaltene Mahlgut mindestens 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 μm enthält.

7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verflüssigen und Verzuckern des Mahlguts im Schritt a2) derart erfolgt, dass die Viskosität des Flüssigmediums maximal 20 Pas beträgt.

8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 25 Gew.-% der Gesamtmenge des während der Verflüssigung zugegebenen Mahlguts bei einer Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke zugegeben werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt a2) eine Teilmenge der mindestens einen α-Amylase während des Ver- flüssigens zu der wässrigen Flüssigkeit zugegeben wird.

10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zuckerhaltiges Flüssigmedium mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 40 Gew.-% erhält.

11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man dem zuckerhaltigen Flüssigmedium vor dem Fermentationsschritt b) mindestens eine Phytase zusetzt.

12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten Stoffwechselprodukte unter nicht-flüchtigen Stoffen ausgewählt sind.

13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten Stoffwechselprodukte unter organischen, gegebenenfalls Hydroxylgruppen tragenden Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit 3 bis 10 C- Atomen, proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Purinbasen, Py- rimidinbasen, Nukleosiden, Nukleotiden, Lipiden, gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, Diolen mit 3 bis 10 C-Atomen, höherwertigen Alkoholen mit 3 oder mehr Hydroxylgruppen, längerkettigen Alkoholen mit wenigstens 4 C-Atomen, Kohlenhydraten, aromatischen Verbindungen, Vitaminen, Provitaminen, Cofakto- ren, Nutrazeutika, Proteinen, Carotenoiden, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Lac- tonen, Biopolymeren und Cyclodextrinen ausgewählt sind.

14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten Stoffwechselprodukte ausgewählt sind unter Enzymen, Aminosäuren, Vitaminen, Disacchariden, aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen, Alkandiolen mit 3 bis 8 C-Atomen und Polyhydroxyalkanoaten.

15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind unter natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte produzieren: Enzyme, Aminosäuren, Vitamine, Disaccharide, aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatische Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanole mit 4 bis 10 C- Atomen, Alkandiole mit 3 bis 8 C-Atomen und Polyhydroxyalkanoate.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganis- men ausgewählt sind unter den Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium und Clostridium, insbesondere unter Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger oder Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum und Clostridium acetobutlicum.

17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abreicherung oder Isolierung der Stoffwechselprodukte aus der Fermentationsbrühe gemäß Schritt c) mittels lonenaustauschchromatographie durchführt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Stoffwechsel- produkt selektiv auf dem Ionenaustauscher gebunden wird und gegebenenfalls der Ionenaustauscher vor der Elution des Produkts gewaschen wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionenaustauscher entgegen der Schwerkraft mit der feststoffbeladenen Fer- mentationsbrühe angeströmt wird.

20. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man (i) dem in Schritt a) erhaltenen zuckerhaltigen Flüssigmedium, das die nichtstärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält, eine Teilmenge von nicht mehr als 50 Gew.-% entnimmt und mit der Restmenge eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines ersten Stoffwechselprodukts (A) durchführt; und

(ii) von dieser Teilmenge die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle ganz oder teilweise abtrennt und mit dieser eine Fermentation gemäß b) zur Herstellung eines zweiten Stoffwechselprodukts (B), das mit dem Stoffwechselprodukt (A) identisch oder davon verschieden ist, durch- führt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile gemäß (ii) so erfolgt, dass der Feststoffgehalt des verbleibenden Anteils der zuckerhaltigen Flüssigkeit maximal 50 Gew.-% beträgt.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Stoffwechselprodukt (B) unter Phytase, Riboflavin, Pantothensäure und Polyhydroxy- alkanoaten ausgewählt ist.

23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man im Anschluss an die Abreicherung oder Isolierung des Stoffwechselprodukts gemäß Schritt c) die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe wenigstens teilweise entfernt, wobei man eine feste oder halbfeste Proteinzusammensetzung erhält.

24. Proteinzusammensetzung, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 23.

25. Proteinzusammensetzung nach Anspruch 24, im Wesentlichen enthaltend die folgenden Trockenmasse-Bestandteile: a) 1 bis 90 Gew.-% Biomasse aus der Fermentation; b) 1 bis 90 Gew.-% nicht-stärkehaltige Bestandteile der Stärkequelle; c) 0,01 bis 10 Gew.-% eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N- Atom; d) 0 bis 90 Gew.-% übliche Formulierungshilfsstoffe; und e) 0 bis 40 Gew.-% nicht metabolisierte weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe; wobei sich die Komponenten a) bis e) zu 100 Gew.-% an Trockenmasse addieren.

26. Proteinzusammensetzung nach Anspruch 24 oder 25 mit einem Gehalt an Rohprotein im Bereich von 40 bis 90 Gew.-%, bezogen auf die Trockenmasse der Proteinzusammensetzung.

27. Proteinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, die wenigstens eine unter Lysin, Methionin, Threonin und Tryptophan ausgewählte essentielle Aminosäure aufweist.

28. Verwendung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 22 zur fermentativen Herstellung eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C- Atomen und mindestens 1 N-Atom.