EA044429B1

EA044429B1 - AKKERMANSIA GLYCANIPHILUS STRAIN, COMPOSITION CONTAINING THE STRAIN, APPLICATION OF THE STRAIN AND COMPOSITION, METHOD FOR INCREASING THE LEVEL OF AKKERMANSIA GLYCANIPHILUS STRAIN IN THE GASTROINTESTINAL TRACT

Info

Publication number: EA044429B1
Application number: EA201800564
Authority: EA
Inventors: Вос Виллем Мейндерт Де; Клара Белзер
Original assignee: Вагенинген Университет
Priority date: 2016-04-11
Filing date: 2017-04-11
Publication date: 2023-08-25

Description

Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates

Изобретение относится к профилактике и/или лечению метаболических нарушений, таких как метаболические нарушения, связанные с избыточной массой тела и ожирением, например сахарный диабет 2 типа и высокий уровень холестерина. Изобретение относится также к способу модулирования и/или стимуляции функции иммунной системы слизистой оболочки кишечника и/или поддержанию, и/или восстановлению, и/или повышению физической целостности мукозального барьера кишечника у млекопитающего, например у человека или домашнего либо сельскохозяйственного животного.The invention relates to the prevention and/or treatment of metabolic disorders, such as metabolic disorders associated with overweight and obesity, such as type 2 diabetes and high cholesterol. The invention also relates to a method for modulating and/or stimulating the function of the intestinal mucosal immune system and/or maintaining and/or restoring and/or increasing the physical integrity of the intestinal mucosal barrier in a mammal, such as a human or a domestic or farm animal.

Предшествующий уровень техникиPrior Art

Ожирение является, главным образом, последствием вредных пищевых и физических привычек, развивающимся на неблагоприятном генетическом фоне. Оно имеет серьезные последствия для здоровья, включая повышенный риск сахарного диабета 2 типа, сердечно-сосудистую патологию, легочную гипертензию, синдром апноэ во сне и несколько типов рака и тесно взаимосвязано с повышенным риском смерти.Obesity is mainly a consequence of bad eating and physical habits, developing against an unfavorable genetic background. It has serious health consequences, including an increased risk of type 2 diabetes, cardiovascular disease, pulmonary hypertension, sleep apnea and several types of cancer, and is strongly associated with an increased risk of death.

Для кишечного тракта человека характерно широкое разнообразие микроорганизмов, среди которых наиболее многочисленными и разнообразными являются бактерии. В целом, микробном более чем 100-кратно превышает геном человека. Таким образом, кишечную микробиоту можно рассматривать как внешний орган, который участвует в общем метаболизме и играет важную роль в превращении пищи в питательные вещества и энергию. В сообществе, насчитывающем не менее 10¹⁴ бактерий, преобладают анаэробные бактерии, и оно состоит из нескольких тысяч видов, из которых 1000 в настоящее время выращиваются в культуре (Rajilic Stojanovic and de Vos, 2014, FEMS Microbiol Rev 38: 996-1047).The human intestinal tract is characterized by a wide variety of microorganisms, among which bacteria are the most numerous and diverse. Overall, the microbiome is more than 100 times larger than the human genome. Thus, the gut microbiota can be considered as an external organ that participates in general metabolism and plays an important role in converting food into nutrients and energy. The community of at least 10 ¹⁴ bacteria is dominated by anaerobic bacteria and consists of several thousand species, of which 1000 are currently cultivated (Rajilic Stojanovic and de Vos, 2014, FEMS Microbiol Rev 38: 996-1047).

Появляется все больше фактов, демонстрирующих роль кишечной микробиоты в метаболизме организма хозяина. В настоящее время полагают, что гомеостаз бактерий кишечника зависит от характеристик хозяина (возраста, пола, генетического фона и т.д.), условий окружающей среды (стресса, применения лекарственных средств, хирургических вмешательств на желудочно-кишечном тракте и т.д.) и также от диеты.More and more evidence is emerging demonstrating the role of intestinal microbiota in host metabolism. Currently, it is believed that the homeostasis of intestinal bacteria depends on the characteristics of the host (age, gender, genetic background, etc.), environmental conditions (stress, drug use, surgical interventions on the gastrointestinal tract, etc.) and also from diet.

На фоне лечения пребиотиками у мышей с алиментарным ожирением и диабетом наблюдалось улучшение метаболизма глюкозы и липидов, снижение концентрации липополисахаридов в плазме и улучшение барьерной функции кишечника (например, уменьшение воспаления), повышение численности аргентаффинных L-клеток и улучшение чувствительности к лептину и гомеостаза глюкозы (Everard et al., Diabetes, 2011, vol. 60(11):2775-86). Лечение пребиотиками существенно изменяло состав кишечной микробиоты у этих мышей, в том числе существенно повышало численность Akkermansia muciniphila.When treated with prebiotics, nutritionally obese diabetic mice showed improvements in glucose and lipid metabolism, decreased plasma lipopolysaccharide concentrations and improved intestinal barrier function (e.g., decreased inflammation), increased numbers of argentaffin L cells, and improved leptin sensitivity and glucose homeostasis ( Everard et al., Diabetes, 2011, vol 60(11):2775-86). Prebiotic treatment significantly altered the composition of the gut microbiota in these mice, including a significant increase in the abundance of Akkermansia muciniphila.

Обнаружено, что пероральное введение A. muciniphila мышам, которым скармливали контрольный рацион или рацион с высоким содержанием жиров (ВСЖ), приводило к нормализации алиментарной метаболической эндотоксемии, жировых отложений и маркера жировой ткани D11c без каких-либо изменений в потреблении корма (WO2014/075745). Более того, лечение A. muciniphila приводило к снижению массы тела и улучшению состава тела (т.е. соотношения жировой/мышечной массы). Обнаружено, что в условиях рациона ВСЖ лечение A. muciniphila, не оказывая влияния на липогенез, повышало уровень экспрессии мРНК маркеров дифференцировки адипоцитов и окисления липидов. Обнаружено также, что колонизация кишечника A. muciniphila полностью устраняла алиментарную гипергликемию в крови натощак, и после лечения аналогичным образом снижался индекс резистентности к инсулину. Наконец, выяснилось, что A. muciniphila усиливает барьерную функцию кишечника (J. Reunanen et al. 2015, Appl Environ Microbiol. 81:3655-62.). Именно кишечный барьер защищает нас от патогенов и вредных компонентов содержимого кишечника, тогда как сниженная функция кишечника сопровождается различными нарушениями и заболеваниями, включая СРК, ВЗК и другими нарушениями, связанными со здоровьем кишки. Недавно было определено, что кишечный барьер является функциональной структурой, отделяющей просвет кишечника от внутренних органов хозяина и состоящей из механических, гуморальных, иммунологических, мышечных и неврологических элементов (SC Bishoff et al., 2014, BMC Gastroenterol. 14:189). Таким образом, улучшение проницаемости кишечника, которую можно определить, как измеряемую характеристику кишечного барьера, является важным фактором, влияющим на здоровье кишечника.Oral administration of A. muciniphila to mice fed a control diet or a high-fat diet (HFD) was found to normalize nutritional metabolic endotoxemia, body fat, and the adipose tissue marker D11c, without any change in feed intake (WO2014/075745 ). Moreover, treatment with A. muciniphila resulted in decreased body weight and improved body composition (i.e., fat/muscle ratio). It was found that under conditions of the VSG diet, treatment with A. muciniphila, without affecting lipogenesis, increased the level of mRNA expression of markers of adipocyte differentiation and lipid oxidation. It was also found that intestinal colonization with A. muciniphila completely eliminated nutritional hyperglycemia in the fasting blood, and the insulin resistance index similarly decreased after treatment. Finally, A. muciniphila has been shown to enhance intestinal barrier function (J. Reunanen et al. 2015, Appl Environ Microbiol. 81:3655-62.). It is the intestinal barrier that protects us from pathogens and harmful components of the intestinal contents, while reduced intestinal function is accompanied by various disorders and diseases, including IBS, IBD and other disorders related to gut health. The intestinal barrier was recently identified as a functional structure separating the intestinal lumen from the host viscera and is composed of mechanical, humoral, immunological, muscular and neurological elements (SC Bishoff et al., 2014, BMC Gastroenterol. 14:189). Thus, improving intestinal permeability, which can be defined as a measurable characteristic of the intestinal barrier, is an important factor influencing intestinal health.

Для того чтобы пробиотическая бактерия приносила пользу в кишечном тракте, она должна быть активной в соответствующем месте кишечного тракта. Кишечный тракт человека и других животных имеет сложную архитектуру, для которой, в частности, характерны очень большие различия в величине pH. В просвете кишечного тракта человека в двенадцатиперстной кишке, которая находится после кишечника с кислой средой, кислотность составляет приблизительно pH 6, повышается в тонком кишечнике от pH 6 до pH 7,4 в терминальном отделе подвздошной кишки, падает до pH 5,7 в слепой кишке и постепенно повышается, достигая pH 6,7 в прямой кишке. У некоторых животных значения pH характеризуются высокой изменчивостью, и у собак pH обычно выше, чем у человека и достигает pH 7,3, тогда как у кошек, в зависимости от породы, pH кишечника может быть ниже 6,6. pH кишечника может меняться в зависимости от рациона питания, возраста и наличия заболеваний. pH представляет собой десятичный логарифм концентрации протонов, поэтому изменение pH на одну единицу отражает 10-кратное различие в концентрации протонов. Поэтому было бы интересно иметь пробиотики, активные при разных зна- 1 044429 чениях pH, для применения как у человека, так и у домашних и сельскохозяйственных животных.In order for a probiotic bacterium to be beneficial in the intestinal tract, it must be active in the appropriate location in the intestinal tract. The intestinal tract of humans and other animals has a complex architecture, which, in particular, is characterized by very large differences in pH values. In the lumen of the human intestinal tract in the duodenum, which is located after the intestine with an acidic environment, the acidity is approximately pH 6, increases in the small intestine from pH 6 to pH 7.4 in the terminal ileum, drops to pH 5.7 in the cecum and gradually increases, reaching a pH of 6.7 in the rectum. In some animals, pH values are characterized by high variability, and in dogs the pH is usually higher than in humans and reaches a pH of 7.3, while in cats, depending on the breed, the intestinal pH can be lower than 6.6. Intestinal pH can change depending on diet, age and the presence of diseases. pH is the tenth logarithm of proton concentration, so a one unit change in pH represents a 10-fold difference in proton concentration. Therefore, it would be interesting to have probiotics active at different pH values for use in humans as well as in domestic and farm animals.

Цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить инновационный пробиотик, который может применяться для профилактики и/или лечения метаболических нарушений и/или улучшения барьерной функции кишечника.The purpose of the present invention is to provide an innovative probiotic that can be used to prevent and/or treat metabolic disorders and/or improve intestinal barrier function.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Настоящее изобретение относится к выделенному штамму Akkermansia glycaniphilus, который предпочтительно способен к росту на муцине, как на единственном источнике углерода и азота, и который предпочтительно дополнительно способен к росту на N-ацетилглюкозамине, Nацетилгалактозамине, глюкозе, лактозе, мальтозе или галактозе в качестве единственного источника углерода. В одном варианте осуществления изобретения данный штамм представляет собой штамм, который зарегистрирован и хранится в депозитарии штаммов института Centraalbureau voor Schimmelcultures, как CBS141023, или производный от него штамм.The present invention relates to an isolated strain of Akkermansia glycaniphilus which is preferably capable of growth on mucin as the sole source of carbon and nitrogen, and which is preferably additionally capable of growth on N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, glucose, lactose, maltose or galactose as the sole source carbon. In one embodiment of the invention, the strain is a strain that is registered and stored in the strain depository of the Centraalbureau voor Schimmelcultures as CBS141023, or a strain derived therefrom.

В изобретении также предлагается композиция, содержащая выделенный штамм Akkermansia glycaniphilus и физиологически приемлемый носитель. Такая композиция может быть фармацевтической композицией, предпочтительно, представленная твердой лекарственной формой, такой как капсула, таблетка или порошок. В одном варианте осуществления изобретения указанный штамм Akkermansia glycaniphilus присутствует в лиофилизированной или микроинкапсулированной форме. Указанный штамм Akkermansia glycaniphilus может присутствовать в количестве от приблизительно 10⁴ до приблизительно 10¹⁵ клеток. Изобретение дополнительно относится к выделенному штамму Akkermansia glycaniphilus или композиции, предназначенным для использования в качестве лекарственного средства, пробиотика и/или симбиотика или для использования в качестве косметического средства. Штамм или композиция могут, например, использоваться для стимуляции функции иммунной системы слизистой оболочки кишечника, для поддержания, восстановления и/или повышения физической целостности мукозального барьера кишечника у млекопитающего, для содействия снижению массы тела и/или для профилактики и/или лечения нарушения, выбранного из группы, включающей метаболический синдром, ожирение, недостаточность инсулина или нарушения, связанные с резистентностью к инсулину, сахарный диабет 2 типа, сахарный диабет 1 типа, воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), синдром раздраженного кишечника (СРК), нарушение толерантности к глюкозе, аномальный метаболизм липидов, атеросклероз, гипертензию, патология сердца, инсульт, неалкогольный жировой гепатоз, алкогольный жировой гепатоз, гипергликемию, жировой гепатоз, дислипидемии, сопровождающуюся ожирением (увеличением массы тела) дисфункцию иммунной системы, аллергию, астму, аутизм, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, нейродегенеративные заболевания, депрессию, другие заболевания, связанные со сниженной барьерной функцией кишечника, (нарушение) заживление ран, нарушения поведения, алкогольную зависимость, сердечнососудистые заболевания, высокое содержание холестерина, повышенное содержание триглицеридов, атеросклероз, апноэ во сне, остеоартрит, заболевание желчного пузыря, рак и состояния, изменяющие физическую целостность мукозального барьера кишечника, такие как пищевые аллергии, незрелость кишечника, например, вследствие недоношенности, воздействия ионизирующей радиации, химиотерапии и/или токсинов, аутоиммунные нарушения, недостаточность питания и сепсис.The invention also provides a composition containing an isolated strain of Akkermansia glycaniphilus and a physiologically acceptable carrier. Such a composition may be a pharmaceutical composition, preferably in a solid dosage form such as a capsule, tablet or powder. In one embodiment of the invention, said Akkermansia glycaniphilus strain is present in lyophilized or microencapsulated form. Said Akkermansia glycaniphilus strain may be present in an amount of from about 10 ⁴ to about 10 ¹⁵ cells. The invention further relates to an isolated Akkermansia glycaniphilus strain or composition intended for use as a drug, probiotic and/or symbiotic, or for use as a cosmetic. The strain or composition may, for example, be used to stimulate the function of the intestinal mucosal immune system, to maintain, restore and/or enhance the physical integrity of the intestinal mucosal barrier in a mammal, to promote weight loss and/or to prevent and/or treat a disorder of choice from the group consisting of metabolic syndrome, obesity, insulin deficiency or disorders associated with insulin resistance, type 2 diabetes mellitus, type 1 diabetes mellitus, inflammatory bowel disease (IBD), irritable bowel syndrome (IBS), impaired glucose tolerance, abnormal lipid metabolism, atherosclerosis, hypertension, heart pathology, stroke, non-alcoholic fatty liver disease, alcoholic fatty liver disease, hyperglycemia, fatty liver disease, dyslipidemia, accompanied by obesity (weight gain), immune system dysfunction, allergies, asthma, autism, Parkinson's disease, multiple sclerosis, neurodegenerative diseases, depression, other diseases associated with decreased gut barrier function, (impaired) wound healing, behavioral disorders, alcohol dependence, cardiovascular disease, high cholesterol, elevated triglycerides, atherosclerosis, sleep apnea, osteoarthritis, gallbladder disease, cancer and conditions that alter the physical integrity of the intestinal mucosal barrier, such as food allergies, intestinal immaturity such as due to prematurity, exposure to ionizing radiation, chemotherapy and/or toxins, autoimmune disorders, malnutrition and sepsis.

В настоящем изобретении также предложен способ повышения уровня Akkermansia glycaniphilus в желудочно-кишечном (ЖК) тракте млекопитающего, предпочтительно, человека, включающий стадии: введения выделенного штамма Akkermansia glycaniphilus или композиции согласно настоящему изобретению указанному млекопитающему; и стимуляции роста указанного штамма Akkermansia glycaniphilus в ЖК тракте млекопитающего путем введения соединения, которое выбирают из группы, включающей соединения, содержащие в качестве структурных звеньев глюкозамин или производные глюкозамина, такие как N-ацетилглюкозамин, и полифенолы.The present invention also provides a method of increasing the level of Akkermansia glycaniphilus in the gastrointestinal (GI) tract of a mammal, preferably a human, comprising the steps of: administering an isolated strain of Akkermansia glycaniphilus or a composition according to the present invention to said mammal; and stimulating the growth of said strain of Akkermansia glycaniphilus in the gastrointestinal tract of a mammal by administering a compound selected from the group consisting of compounds containing glucosamine or glucosamine derivatives such as N-acetylglucosamine, and polyphenols as structural units.

ОпределенияDefinitions

Термин пробиотический или пробиотические продукты, используемые в настоящей заявке, относятся к микроорганизмам, таким как кишечные бактерии, которые при введении или проглатывании в эффективных количествах приносят пользу хозяину (т.е. людям или млекопитающим). Предпочтительно, чтобы пробиотики были живыми или жизнеспособными при введении их субъекту, для того чтобы они смогли колонизировать толстый кишечник хозяина. Однако в определенных условиях пробиотики могут быть также мертвыми при введении при условии, что образованные пробиотиками вещества попрежнему оказывают благотворное пробиотическое воздействие на хозяина. Большинство пробиотиков или пробиотических продуктов состоят из молочнокислых бактерий, таких как лактобациллы или бифидобактерии. Специалисту, хорошо ориентирующемуся в области пробиотиков, известно, как выбирать молочнокислые бактерии, обладающие пробиотической активностью.The term probiotic or probiotic products as used herein refer to microorganisms, such as gut bacteria, that when administered or ingested in effective amounts provide a benefit to the host (i.e., humans or mammals). Preferably, the probiotics are live or viable when administered to a subject so that they can colonize the host's colon. However, under certain conditions, probiotics may also be dead upon administration, provided that the substances produced by the probiotics still exert beneficial probiotic effects on the host. Most probiotics or probiotic products are made up of lactic acid bacteria, such as lactobacilli or bifidobacteria. One skilled in the art of probiotics will know how to select lactic acid bacteria that have probiotic activity.

Вид Akkermansia glycaniphilus согласно изобретению является тем же самым видом, который имеет название Akkermansia glycaniphila, например, в публикации Ouwerkerk et al. (2016. Int J of Syst Evol Microbiol 66:1-7). Таким образом, эти названия являются взаимозаменяемыми (синонимами).The species Akkermansia glycaniphilus according to the invention is the same species that has the name Akkermansia glycaniphila, for example, in the publication of Ouwerkerk et al. (2016. Int J of Syst Evol Microbiol 66:1-7). Thus, these names are interchangeable (synonyms).

Термин пребиотический или пребиотические продукты, используемые в настоящей заявке, относятся к соединениям, которые стимулируют рост и/или активность микроорганизмов, населяющих ЖК тракт и способствующих благополучию организма хозяина. Пребиотики или пребиотические продуктыThe term prebiotic or prebiotic products as used herein refer to compounds that stimulate the growth and/or activity of microorganisms that inhabit the gastrointestinal tract and contribute to the well-being of the host. Prebiotics or prebiotic foods

- 2 044429 состоят, главным образом, из сбраживаемой клетчатки или неусваиваемых углеродов. Сбраживание этой клетчатки пробиотиками способствует образованию полезных конечных продуктов, таких как короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), в частности бутираты. Специалисту, хорошо ориентирующемуся в области пробиотиков, известно, как выбирать ингредиенты, обладающие пребиотической активностью.- 2 044429 consist mainly of fermentable fiber or indigestible carbons. Fermentation of this fiber with probiotics promotes the formation of beneficial end products such as short-chain fatty acids (SCFAs), particularly butyrates. One skilled in the art of probiotics will know how to select ingredients that have prebiotic activity.

Термин симбиотический или симбиотические продукты, используемые в настоящей заявке, в целом, относятся к композициям и/или пищевым добавкам, в которых в одном продукте объединены пробиотики и одно или несколько соединений, способствующих росту и/или активности ЖК микроорганизмов, например, пребиотики. Симбиотик оказывает благоприятное влияние на организм хозяина, улучшая выживаемость и колонизацию пробиотика в ЖКТ, выборочно стимулируя рост и/или активируя метаболизм пробиотика, и, тем самым, улучшая здоровье хозяина. Специалисту, хорошо ориентирующемуся в области пробиотиков, известно, как выбирать ингредиенты, которые могут быть объединены в составе симбиотика.The term symbiotic or symbiotic products as used herein generally refer to compositions and/or dietary supplements that combine probiotics and one or more compounds that promote the growth and/or activity of FA microorganisms, such as prebiotics, in a single product. The symbiotic has a beneficial effect on the host by improving the survival and colonization of the probiotic in the gastrointestinal tract, selectively stimulating growth and/or activating the metabolism of the probiotic, and thereby improving the health of the host. One skilled in the art of probiotics will know how to select ingredients that can be combined to form a symbiotic.

Термин полезные виды кишечных бактерий относится к виду бактерий, который населяет (т.е. является естественным) кишечник млекопитающего (например, человека) и оказывает благоприятное воздействие (например, осуществляет защиту от патогенных видов бактерий, образование масляной кислоты и/или бутирата и их производных, и т.д.) на желудочно-кишечные, метаболические и другие аспекты здоровья млекопитающего, в котором он обитает. Не имеющие ограничительного характера примеры полезных видов кишечных бактерий включают молочнокислые бактерии, принадлежащие к родам Lactobacillus and Bifidobacterium. Другие, не имеющие ограничительного характера примеры полезных видов кишечных бактерий включают бутиратобразующие виды бактерий, которые используют ацетил-КоА для образования масляной кислоты и/или бутирата и их производных, такие, как бактериальные штаммы, предложенных в патентах US2014/0242654, WO 2014/150094 или WO2013032328 A1. Аналогично, пропионатобразующие виды могут рассматриваться, как пробиотики, потому что пропионат, например, бутират, контролирует массу тела и чувствительность к инсулину, передает сигналы иммунной системе, используя для этого, помимо прочего, регуляторные T-лимфоциты, и оказывает влияние на нейронные цепи через рецептор FFAR2 (Canfora et al., 2015. Nature Reviews Endocrinology 11:577-591; Smith et al., 2013. Science 341:569-573: Erny et al., 2015, Nat Neurosci 18:965-977). Пропионат является субстратом для глюконеогенеза в печени, подавляет синтез липидов и холестерина и оказывает защитное воздействие при воспалении и канцерогенезе (Hosseini et al., 2011. Nutrition Reviews 69:245-258). Применение диеты у человека показало, что пропионат также усиливает чувство сытости и регулирует аппетит, что приводит к поддержанию массы тела у взрослых с избыточной массой тела (Chambers et al 2015. Gut 64:1744-1754).The term beneficial gut bacteria species refers to a species of bacteria that inhabits (i.e., is naturally occurring in) the gut of a mammal (e.g., human) and has beneficial effects (e.g., protection against pathogenic bacterial species, production of butyric acid and/or butyrate and their derivatives, etc.) on the gastrointestinal, metabolic and other aspects of the health of the mammal in which it lives. Non-limiting examples of beneficial species of intestinal bacteria include lactic acid bacteria belonging to the genera Lactobacillus and Bifidobacterium. Other non-limiting examples of beneficial gut bacteria include butyrate-forming bacterial species that use acetyl-CoA to produce butyric acid and/or butyrate and their derivatives, such as the bacterial strains proposed in US2014/0242654, WO2014/150094 or WO2013032328 A1. Likewise, propionate-forming species can be considered probiotics because propionate, such as butyrate, controls body weight and insulin sensitivity, signals the immune system using, among other things, regulatory T cells, and influences neural circuits through FFAR2 receptor (Canfora et al., 2015. Nature Reviews Endocrinology 11:577-591; Smith et al., 2013. Science 341:569-573: Erny et al., 2015, Nat Neurosci 18:965-977). Propionate is a substrate for gluconeogenesis in the liver, inhibits lipid and cholesterol synthesis, and has protective effects against inflammation and carcinogenesis (Hosseini et al., 2011. Nutrition Reviews 69:245-258). Dietary use in humans has shown that propionate also enhances satiety and regulates appetite, leading to weight maintenance in overweight adults (Chambers et al 2015. Gut 64:1744-1754).

Термин патогенные виды бактерий относится к бактерии, которая населяет (т.е. является естественной) кишечник млекопитающего (например, человека) и оказывает вредное воздействие (например, вызывает инфекцию) на здоровье ЖКТ млекопитающего, в котором она обитает. Не имеющим ограничительного характера примером пользующегося дурной славой патогенного вида бактерий является токсинообразующая бактерия Clostridium difficile.The term pathogenic bacterial species refers to a bacterium that inhabits (ie, is naturally occurring in) the intestine of a mammal (eg, a human) and has a detrimental effect (eg, causes infection) on the gastrointestinal health of the mammal in which it resides. A non-limiting example of a notorious pathogenic bacterial species is the toxin-producing bacterium Clostridium difficile.

Термин эффективное количество относится к количеству, необходимому для достижения эффекта, указанного в настоящем документе. Специалист обычной квалификации может легко определить эффективное количество, не выполняя излишних экспериментов.The term effective amount refers to the amount required to achieve the effect specified herein. One of ordinary skill in the art can easily determine the effective amount without unnecessary experimentation.

Термин производный от него штамм относится к штаммам, полученным в результате использования депонированного штамма, как исходного материала. Производный от него штамм может быть мутантным штаммом, который может быть получен из штамма согласно изобретению посредством, использования, например, генной инженерии, ионизирующей радиации, УФ-излучения, химической обработки. Альтернативно, такой производным или мутантным штаммом может быть штамм, производный от хранящегося в депозитарии штамма, описанного в настоящей заявке, адаптированный к росту в определенных условиях, которые обеспечили дополнительные преимущества производному штамму, такие как более быстрый рост, улучшенная выживаемость в кишечнике и т.д., предпочтительно, чтобы производный или мутантный штамм был эквивалентен депонированному штамму согласно изобретению. Предпочтительный производный или мутантный штамм обладает, по существу, такой же активностью или функцией, как депонированный штамм. Производный или мутантный штамм эффективно обеспечивает млекопитающему (например, человеку или другим животным), которому вводят указанный производный или мутантный штамм, такие же преимущества, которые обеспечивало бы введение депонированного штамма. Производный или мутантный штамм может также быть спонтанно производным или мутировавшим штаммом, обладающим такими же характеристиками, которые описаны в настоящей заявке для депонированного штамма.The term derivative strain refers to strains obtained by using the deposited strain as starting material. The strain derived therefrom may be a mutant strain, which can be obtained from the strain according to the invention through the use of, for example, genetic engineering, ionizing radiation, UV radiation, chemical treatment. Alternatively, such a derivative or mutant strain may be a strain derived from the deposited strain described herein, adapted to grow under certain conditions that provide additional benefits to the derivative strain, such as faster growth, improved intestinal survival, etc. etc., it is preferable that the derivative or mutant strain be equivalent to the deposited strain according to the invention. The preferred derivative or mutant strain has substantially the same activity or function as the deposited strain. The derivative or mutant strain effectively provides a mammal (eg, human or other animal) to which the derivative or mutant strain is administered the same benefits that would be provided by administration of the deposited strain. The derived or mutant strain may also be a spontaneously derived or mutated strain having the same characteristics as described herein for the deposited strain.

Термин пригодный для употребления внутрь или питательно приемлемый относится к ингредиентам или веществам, общепризнанно безопасными для употребления человеком (и другими млекопитающими).The term ingestible or nutritionally acceptable refers to ingredients or substances generally recognized as safe for human (and other mammalian) consumption.

Термины содержащий или содержать означает, что содержащиеся элементы не ограничиваются перечисленными после указанных терминов.The terms containing or contain means that the items contained are not limited to those listed after the specified terms.

Термины увеличивать (повышать) и увеличенный (повышенный) уровень и термины снижать и сниженный уровень относятся к способности значимо увеличивать или значимо снижать либо к зна- 3 044429 чимо увеличенному уровню или значимо сниженному уровню. Как правило, уровень является увеличенным или сниженным, если он, по меньшей мере, на 5%, например, на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%,The terms increase and increased level and the terms decrease and reduced level refer to the ability to significantly increase or significantly reduce or to a significantly increased level or a significantly reduced level. Typically, a level is increased or decreased if it is at least 5%, for example 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%,

40%, 45%, 50% выше или ниже, соответственно, чем соответствующий уровень в контроле или варианте сравнения. Уровень в образце может быть повышенным или сниженным, если он является статистически значимо повышенным или сниженным по сравнению с уровнем в контроле или сравнительном варианте.40%, 45%, 50% higher or lower, respectively, than the corresponding level in the control or comparison variant. The level in a sample may be increased or decreased if it is statistically significantly increased or decreased compared to the level in the control or comparison.

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

Бактерии.Bacteria.

Выделен новый вид рода Akkermansia, штамм Pyt^T, из кишечника сетчатого питона.A new species of the genus Akkermansia, strain Pyt ^T , was isolated from the intestines of the reticulated python.

Это грамотрицательная, неподвижная, строго анаэробная, неспорообразующая бактерия, имеющая овальную форму. Эта бактерия способна использовать муцин в качестве единственного источника углерода, энергии и азота, таким же свойством обладает присутствующий у человека штамм Akkermansia muciniphila Muc^T Штамм Pyt^T может расти на ограниченном количестве моносахаров, включая Nацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, глюкозу, лактозу, мальтозу и галактозу, но лишь при обеспечении в избыточном количестве источника белка.It is a Gram-negative, nonmotile, strictly anaerobic, non-spore-forming bacterium, oval in shape. This bacterium is able to use mucin as a sole source of carbon, energy and nitrogen, a property similar to that of the human strain Akkermansia muciniphila Muc T. The Pyt ^T strain can grow on a limited amount of monosaccharides, including N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, glucose ^, lactose, maltose and galactose, but only when provided in excess of the protein source.

Филогенетический анализ, основанный на секвенировании гена 16S рРНК, показал, что штамм Pyt^Tпринадлежит к классу I Verrucomicrobiae, семейству Akkermansiaceae, роду Akkermansia, и его ближайшим родственным видом является вид Akkermansia muciniphila Muc^T (сходство последовательностей составляет 94.4%). Основываясь на фенотипических, филогенетических и генетических характеристиках, штамм Pyt^T представляет собой новый вид рода Akkermansia, для которого предложено название Akkermansia glycaniphilus sp. nov., и типовым штаммом является Pyt^T Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequencing showed that the Pyt ^T strain belongs to class I Verrucomicrobiae, family Akkermansiaceae, genus Akkermansia, and its closest relative is the species Akkermansia muciniphila Muc ^T (sequence similarity is 94.4%). Based on phenotypic, phylogenetic and genetic characteristics, strain Pyt ^T represents a new species of the genus Akkermansia, for which the name Akkermansia glycaniphilus sp. nov., and the type strain is Pyt ^T

Таким образом, изобретение относится к штамму вида Akkermansia glycaniphilus, например, типовому штамму Pyt^T, который хранится в депозитарии штаммов Вагенингенского университета, Нидерланды, где 24 февраля 2016 г. ему был присвоен номер CBS141023; или к производному от него штамму.Thus, the invention relates to a strain of the species Akkermansia glycaniphilus, for example the type strain Pyt ^T , which is deposited in the strain depository of Wageningen University, the Netherlands, where it was assigned the number CBS141023 on February 24, 2016; or to a strain derived from it.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный штамм способен к росту на муцине, являющемся единственным источником углерода и азота. Гликаны муцина состоят, в основном, из галактозы, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилгалактозамина, и штамм A. glycaniphilus Pyt^T способен использовать все эти соединения в качестве питательного субстрата. В отличие от штамма A. muciniphila MucT, штамм A. glycaniphilus Pyt^T способен использовать галактозу в качестве единственного источника углерода, образуя, в основном, пропионат, ацетат и в небольшом количестве сукцинат.In one embodiment of the invention, said strain is capable of growth on mucin, which is the only source of carbon and nitrogen. Mucin glycans consist mainly of galactose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, and the A. glycaniphilus Pyt ^T strain is able to use all of these compounds as a nutrient substrate. Unlike the A. muciniphila MucT strain, the A. glycaniphilus Pyt ^T strain is able to use galactose as the sole carbon source, producing mainly propionate, acetate and a small amount of succinate.

Хотя для штамма A. glycaniphilus strain Pyt^T возможен оптимальный рост в широком диапазоне pH, оптимальный pH для роста этого штамма приблизительно на 0,5 единиц pH ниже, чем для A. muciniphila Muc^T.Although A. glycaniphilus strain Pyt ^T is capable of optimal growth over a wide pH range, the optimal pH for growth of this strain is approximately 0.5 pH units lower than that of A. muciniphila Muc ^T.

Показано, что в кишечнике субъектов с ожирением или избыточной массой тела уровень Akkermansia muciniphila резко снижен, и что введение в рацион Akkermansia muciniphila приводило к нормализации алиментарной метаболической эндотоксемии, жировых отложений и маркера жировой ткани D11c без каких-либо изменений в потреблении корма (WO2014/075745). Более того, лечение A. muciniphila приводило к снижению массы тела и улучшению состава тела (т.е. соотношения жировой/мышечной массы). При рассмотрении сходства с видом Akkermansia muciniphila предполагается, что Akkermansia glycaniphilus способен предотвращать и/или лечить метаболические нарушения таким же образом, как и Akkermansia muciniphila. Аналогично, ожидается, что Akkermansia glycaniphilus будет усиливать барьерную функцию, которую стимулирует Akkermansia muciniphila, поскольку обнаружено, что Akkermansia glycaniphilus является единственным представителем Akkermansia spp. на стенке кишечника питона. Подобно A. muciniphila, содержание Akkermansia в кишечнике увеличивается при голодании, которое является частью нормального жизненного цикла питона (Belzer and de Vos, 2012, ISME J 6:1449-58).It was shown that Akkermansia muciniphila levels were dramatically reduced in the intestines of obese or overweight subjects, and that dietary supplementation with Akkermansia muciniphila resulted in normalization of nutritional metabolic endotoxemia, body fat, and the adipose tissue marker D11c, without any change in feed intake (WO2014/ 075745). Moreover, treatment with A. muciniphila resulted in decreased body weight and improved body composition (i.e., fat/muscle ratio). When considering the similarity to the species Akkermansia muciniphila, it is assumed that Akkermansia glycaniphilus is capable of preventing and/or treating metabolic disorders in the same way as Akkermansia muciniphila. Likewise, Akkermansia glycaniphilus is expected to enhance the barrier function stimulated by Akkermansia muciniphila since Akkermansia glycaniphilus is found to be the only member of Akkermansia spp. on the python intestinal wall. Like A. muciniphila, gut abundance of Akkermansia increases during fasting, which is part of the normal python life cycle (Belzer and de Vos, 2012, ISME J 6:1449-58).

В одном варианте осуществления изобретения, указанный штамм дополнительно способен к росту на N-ацетилглюкозамине, N-ацетилгалактозамине, глюкозе, лактозе, мальтозе или галактозе, являющихся единственным источником углерода, и частично способен к росту в основной питательной среде на Nацетилглюкозамине, N-ацетилгалактозамине, D-глюкозе, D-лактозе или D-галактозе в присутствии подходящего источника азота, такого как триптон с необязательно добавленным треонином, например, в базальной среде на N-ацетилглюкозамине, N-ацетилгалактозамине, D D-глюкозе, D-лактозе или Dгалактозе в присутствии триптона в концентрации 16 г/л и треонина в концентрации 4 г/л. Триптон представляет собой протеолитический гидролизат казеина, и вместо него могут быть использованы другие источники белка, например, полученные из сои или гороха и других растительных белков.In one embodiment of the invention, said strain is additionally capable of growth on N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, glucose, lactose, maltose or galactose as the sole carbon source, and is partially capable of growth in basal nutrient medium on Nacetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, D-glucose, D-lactose or D-galactose in the presence of a suitable nitrogen source such as tryptone with optionally added threonine, for example, in a basal medium of N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, D-glucose, D-lactose or D-galactose in the presence of tryptone at a concentration of 16 g/l and threonine at a concentration of 4 g/l. Tryptone is a proteolytic hydrolysate of casein, and other protein sources, such as those derived from soy or pea and other plant proteins, can be used instead.

КомпозицияComposition

Настоящее изобретение относится также к композиции, содержащей выделенный штамм Akkermansia glycaniphilus и физиологически приемлемый носитель.The present invention also relates to a composition containing an isolated strain of Akkermansia glycaniphilus and a physiologically acceptable carrier.

В одном варианте осуществления изобретения физиологические приемлемым носителем может быть любой носитель, который подходит для поддержания жизнеспособности описанного в настоящем документе штамма бактерии до употребления его субъектом (например, человеком и/или животным). Так, не имеющие ограничительного характера примеры приемлемых носителей, пригодные для этой цели, включают любой из хорошо известных физиологических или фармацевтических носителей, буферов и вспомогательных веществ. Понятно, что выбор подходящего физиологического или фармацевтическо- 4 044429 го носителя будет зависеть от предполагаемого способа введения композиции, описанной в данном документе (например, перорально), и предполагаемой формы композиции (например, жидкий напиток, йогурт, порошок, капсулы и т.д.). Специалисту известно, как выбирать физиологический или фармацевтический носитель, который подходит для композиций, описанных в данном документе.In one embodiment of the invention, the physiologically acceptable carrier may be any carrier that is suitable for maintaining the viability of the bacterial strain described herein prior to consumption by a subject (eg, human and/or animal). Thus, non-limiting examples of acceptable carriers suitable for this purpose include any of the well known physiological or pharmaceutical carriers, buffers and excipients. It will be understood that the selection of a suitable physiological or pharmaceutical carrier will depend on the intended route of administration of the composition described herein (eg, orally) and the intended form of the composition (eg, liquid beverage, yogurt, powder, capsules, etc. .). One skilled in the art will know how to select a physiological or pharmaceutical carrier that is suitable for the compositions described herein.

В одном из вариантов осуществления изобретения композиция может быть в форме пищевой композиции, кормовой композиции, композиции кормовой добавки, композиции пищевой добавки или фармацевтической композиции. Композиция предпочтительно пригодна для употребления млекопитающим, например, человеком, домашним или сельскохозяйственным животным.In one embodiment, the composition may be in the form of a food composition, a feed composition, a feed additive composition, a nutritional supplement composition, or a pharmaceutical composition. The composition is preferably suitable for consumption by a mammal, such as a human, domestic or farm animal.

В одном из вариантов осуществления изобретения композиция представляет собой пищевую композицию или композицию пищевой добавки. Пищевая композиция или композиция пищевой добавки может быть выбрана из группы, включающей жидкость, жидкий напиток (включая молочный напиток и полученный при брожении напиток), йогурт, сыр, гель, желатин, желатиновую капсулу, порошок, пасту, прессованную таблетку и гелевую капсулу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция представляет собой жидкость, предпочтительно жидкий напиток (например, молочный напиток). Пищевая композиция или композиция пищевой добавки может быть предпочтительно сброженным молочным продуктом, предпочтительно йогуртом или йогуртовым напитком.In one embodiment of the invention, the composition is a food composition or a nutritional supplement composition. The food or nutritional supplement composition may be selected from the group consisting of liquid, liquid drink (including milk drink and fermented drink), yogurt, cheese, gel, gelatin, gelatin capsule, powder, paste, compressed tablet and gel capsule. In a preferred embodiment of the invention, the composition is a liquid, preferably a liquid drink (eg a milk drink). The food or nutritional supplement composition may preferably be a fermented dairy product, preferably yogurt or a yogurt drink.

В ещё одном варианте осуществления изобретения композиция может быть пробиотической композицией. Такая пробиотическая композиция может содержать любой выделенный бактериальный штамм согласно изобретению или производный от него штамм.In yet another embodiment of the invention, the composition may be a probiotic composition. Such a probiotic composition may contain any isolated bacterial strain according to the invention or a strain derived therefrom.

В ещё одном варианте осуществления изобретения композиция дополнительно включает один или несколько дополнительных полезных выделенных штаммов кишечных бактерий.In yet another embodiment of the invention, the composition further includes one or more additional beneficial isolated strains of intestinal bacteria.

В ещё одном варианте осуществления изобретения композиция может быть симбиотической композицией. Могут быть добавлены один или несколько пребиотических ингредиентов в композицию, например, чтобы усилить эффекты (например, образование масляной кислоты и/или бутирата или их производного) штамма кишечной бактерии согласно изобретению.In yet another embodiment of the invention, the composition may be a symbiotic composition. One or more prebiotic ingredients may be added to the composition, for example, to enhance the effects (eg, butyrate and/or butyrate or derivative thereof) of the intestinal bacterium strain of the invention.

В одном варианте осуществления изобретения один или несколько пребиотических ингредиентов могут быть пребиотическими ингредиентами, которые подходят для усиления активности и/или стимуляции роста выделенной кишечной бактерии или производного от нее штамма согласно изобретению. В частности, примеры подходящих пребиотических ингредиентов включают клетчатку, целлобиозу, мальтозу, маннозу, салицин, трегалозу, амигдалин, арабинозу, мелибиозу, рамнозу и/или ксилозу.In one embodiment of the invention, one or more prebiotic ingredients may be prebiotic ingredients that are suitable for enhancing the activity and/or stimulating the growth of the isolated intestinal bacterium or its derivative strain according to the invention. In particular, examples of suitable prebiotic ingredients include fiber, cellobiose, maltose, mannose, salicin, trehalose, amygdalin, arabinose, melibiose, rhamnose and/or xylose.

В ещё одном варианте осуществления изобретения композиция может включать один или несколько ингредиентов, подходящих для поддержки выживания и/или жизнеспособности бактериального штамма или производного от него штамма, описанного в данном документе, во время хранения и/или во время воздействия желчи и/или во время прохождения через ЖКТ млекопитающего (например, человека). В частности, примеры таких ингредиентов включают кишечнорастворимую оболочку и агентов, обеспечивающих контролируемое высвобождение, позволяющих пройти через желудок. Специалисту известно, как выбирать подходящие ингредиенты для поддержания бактериального штамма жизнеспособным и функциональным, т.е. способным выполнять предполагаемую функцию(и).In yet another embodiment, the composition may include one or more ingredients suitable for supporting the survival and/or viability of a bacterial strain or a derivative strain thereof described herein during storage and/or during exposure to bile and/or during passing through the gastrointestinal tract of a mammal (for example, a human). In particular, examples of such ingredients include enteric coating and controlled release agents allowing passage through the stomach. One skilled in the art will know how to select suitable ingredients to maintain the bacterial strain viable and functional, i.e. capable of performing the intended function(s).

В одном варианте осуществления изобретения композиции могут дополнительно содержать один или несколько ингредиентов, которые дополнительно повышают пищевую ценность и/или терапевтическую ценность описанных в данном документе композиций. Например, могут быть добавлены один или несколько ингредиентов (например, пищевые ингредиенты, лекарственные агенты для ветеринарного или медицинского применения и т.д.), которые выбирают из белков, аминокислот, ферментов, солей неорганических кислот, витаминов (например, тиамина гидрохлорид, рибофлавин, пиридоксина гидрохлорид, ниацин, инозит, холина хлорид, кальция пантотенат, биотин, фолиевая кислота, аскорбиновая кислота, витамин B12, п-аминобензойная кислота, витамина A ацетат, витамин K, витамин D, витамин E и т.д.), сахара и комплексных углеводов (например, водорастворимые и водонерастворимые моносахариды, дисахариды и полисахариды), лекарственных соединений (например, антибиотики), антиоксидантов, ингредиентов, представляющих собой микроэлементы (например, соединения кобальта, меди, марганца, железа, цинка, олова, никеля, хрома, молибдена, йода, хлора, кремния, ванадия, селена, кальция, магния, натрия и калия и т.п.). Специалисту известны способы и ингредиенты, подходящие для повышения питательной и/или терапевтической ценности описанных в данном документе композиций.In one embodiment, the compositions may further contain one or more ingredients that further enhance the nutritional value and/or therapeutic value of the compositions described herein. For example, one or more ingredients may be added (e.g., food ingredients, medicinal agents for veterinary or medical use, etc.) selected from proteins, amino acids, enzymes, inorganic acid salts, vitamins (e.g., thiamine hydrochloride, riboflavin , pyridoxine hydrochloride, niacin, inositol, choline chloride, calcium pantothenate, biotin, folic acid, ascorbic acid, vitamin B12, p-aminobenzoic acid, vitamin A acetate, vitamin K, vitamin D, vitamin E, etc.), sugars and complex carbohydrates (e.g., water-soluble and water-insoluble monosaccharides, disaccharides and polysaccharides), medicinal compounds (e.g., antibiotics), antioxidants, micronutrient ingredients (e.g., cobalt, copper, manganese, iron, zinc, tin, nickel, chromium compounds , molybdenum, iodine, chlorine, silicon, vanadium, selenium, calcium, magnesium, sodium and potassium, etc.). One skilled in the art will know methods and ingredients suitable for enhancing the nutritional and/or therapeutic value of the compositions described herein.

Бактериальный штамм согласно изобретению может быть включен в композицию в лиофилизированной форме, микроинкапсулированной форме (рассмотренной, например, в публикации Solanki et al. BioMed Res. Int. 2013, Статья № 620719), или любой другой форме, сохраняющей активность и/или жизнеспособность бактериального штамма.The bacterial strain of the invention may be included in the composition in lyophilized form, microencapsulated form (discussed, for example, in Solanki et al. BioMed Res. Int. 2013, Article No. 620719), or any other form that retains the activity and/or viability of the bacterial strain.

Композиция согласно изобретению может быть фармацевтической композицией. Фармацевтическая композиция может быть предназначена для использования в форме добавки. Обычно в дополнение к бактериальному штамму, фармацевтическая композиция будет содержать фармацевтический носитель. Носителем предпочтительно является инертный носитель. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и (терапевтического) применения. Фармацевтическим носителем может быть любое совместимое, нетоксичное вещество, пригодное для доставки бактерий, принадлежащих кThe composition according to the invention may be a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition may be for use in supplement form. Typically, in addition to the bacterial strain, the pharmaceutical composition will contain a pharmaceutical carrier. The carrier is preferably an inert carrier. The preferred form depends on the intended route of administration and (therapeutic) use. The pharmaceutical carrier may be any compatible, non-toxic substance suitable for the delivery of bacteria belonging to

- 5 044429 описанному в данном документе штамму, в ЖКТ субъекта. Например, в качестве носителя могут быть использованы стерильная вода или инертные твердые вещества, обычно с добавлением фармацевтически приемлемого адъюванта, буферного агента, диспергирующего агента и т.п. Фармацевтическая композиция может быть в жидкой форме, например, в форме стабилизированной суспензии бактерий, принадлежащих к штамму согласно изобретению, или в твердой форме, например, порошкообразные или лиофилизированные бактерии, принадлежащие к штамму согласно изобретению. В случае, когда бактериальный штамм является лиофилизированным, может быть использован криопротектор, такой как лактоза, трегалоза или гликоген. Например, в случае перорального введения бактерии, принадлежащие к штамму согласно изобретению, могут быть назначены в виде твердых лекарственных форм, например, капсул, таблеток и порошков, содержащих лиофилизированные бактерии, или в виде жидких лекарственных форм, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Бактерии в лиофилизированной форме, могут быть заключены в капсулы, например, желатиновые капсулы, вместе с неактивными ингредиентами и порошкообразными носителями, например, глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, крахмалом, целлюлозой или производными целлюлозы, стеаратом магния, стеариновой кислотой, натрия сахарином, тальком, карбонатом магния и т.п.- 5 044429 to the strain described herein, in the gastrointestinal tract of the subject. For example, the carrier may be sterile water or inert solids, usually with the addition of a pharmaceutically acceptable adjuvant, buffering agent, dispersing agent, or the like. The pharmaceutical composition may be in liquid form, for example, in the form of a stabilized suspension of bacteria belonging to the strain according to the invention, or in solid form, for example, powdered or lyophilized bacteria belonging to the strain according to the invention. In the case where the bacterial strain is lyophilized, a cryoprotectant such as lactose, trehalose or glycogen can be used. For example, in the case of oral administration, bacteria belonging to the strain according to the invention can be administered in the form of solid dosage forms, for example, capsules, tablets and powders containing lyophilized bacteria, or in the form of liquid dosage forms, such as elixirs, syrups and suspensions. The bacteria in lyophilized form may be enclosed in capsules, for example gelatin capsules, together with inactive ingredients and powdered carriers, for example glucose, lactose, sucrose, mannitol, starch, cellulose or cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, sodium saccharin, talc, magnesium carbonate, etc.

В ещё одном варианте осуществления изобретения кишечная бактерия или производный от нее штамм, согласно изобретению, могут входить в состав композиции в эффективном количестве, например, от около 10⁴ до около 10¹⁵ клеток или колониеобразующих единиц (КОЕ). Например, кишечные бактерии могут содержаться в композиции в количестве от около 10⁶ или 10⁷ клеток или КОЕ до около 10¹⁴клеток или КОЕ, предпочтительно от около 10⁸ клеток или КОЕ до около 10¹³ клеток или КОЕ, предпочтительно от около 10⁹ клеток или КОЕ до около 10¹² клеток или КОЕ, более предпочтительно от около 10¹⁰ клеток или КОЕ до около 10¹² клеток или КОЕ.In yet another embodiment, the intestinal bacterium or its derivative strain according to the invention can be included in the composition in an effective amount, for example, from about 10 ⁴ to about 10 ¹⁵ cells or colony forming units (CFU). For example, enteric bacteria may be contained in the composition in an amount from about 10 ⁶ or 10 ⁷ cells or CFU to about 10 ¹⁴ cells or CFU, preferably from about 10 ⁸ cells or CFU to about 10 ¹³ cells or CFU, preferably from about 10 ⁹ cells or CFU up to about 10 ¹² cells or CFU, more preferably from about 10 ¹⁰ cells or CFU to about 10 ¹² cells or CFU.

Для получения композиций согласно изобретению могут быть использованы любые стандартные способы.To obtain the compositions according to the invention, any standard methods can be used.

Способы и применение бактериальных штаммов и композиций.Methods and use of bacterial strains and compositions.

Другой аспект настоящего изобретения касается бактериального штамма или композиции для использования в качестве лекарственного средства, пищевого продукта или пищевой добавки или для использования в качестве пробиотика и/или симбиотика.Another aspect of the present invention relates to a bacterial strain or composition for use as a drug, food product or dietary supplement, or for use as a probiotic and/or symbiotic.

Настоящее изобретение также относится к выделенному штамму Akkermansia glycaniphilus или композиции для использования в профилактике и/или лечении нарушения, выбранного из группы, включающей метаболический синдром, ожирение, недостаточность инсулина или нарушения, связанные с резистентностью к инсулину, сахарный диабет 2 типа, сахарный диабет 1 типа, воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), синдром раздраженного кишечника (СРК), нарушение толерантности к глюкозе, аномальный метаболизм липидов, атеросклероз, гипертензию, патология сердца, инсульт, неалкогольный жировой гепатоз, алкогольный жировой гепатоз, гипергликемию, жировой гепатоз, дислипидемии, сопровождающуюся ожирением (увеличением массы тела) дисфункцию иммунной системы, аллергию, астму, аутизм, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, нейродегенеративные заболевания, депрессию, другие заболевания, связанные со сниженной барьерной функцией кишечника, (нарушение) заживление ран, нарушения поведения, алкогольную зависимость, сердечнососудистые заболевания, высокое содержание холестерина, повышенное содержание триглицеридов, атеросклероз, апноэ во сне, остеоартрит, заболевание желчного пузыря, рак и состояния, изменяющие физическую целостность мукозального барьера кишечника, такие как пищевые аллергии, незрелость кишечника, например, вследствие недоношенности, воздействия ионизирующей радиации, химиотерапии и/или токсинов, аутоиммунные нарушения, недостаточность питания и сепсис, и использования для симуляции противовоспалительной активности в кишечнике млекопитающего.The present invention also provides an isolated strain of Akkermansia glycaniphilus or a composition for use in the prevention and/or treatment of a disorder selected from the group consisting of metabolic syndrome, obesity, insulin deficiency or insulin resistance disorders, type 2 diabetes mellitus, type 1 diabetes mellitus type, inflammatory bowel disease (IBD), irritable bowel syndrome (IBS), impaired glucose tolerance, abnormal lipid metabolism, atherosclerosis, hypertension, heart disease, stroke, non-alcoholic fatty liver disease, alcoholic fatty liver disease, hyperglycemia, fatty liver disease, dyslipidemia, accompanied obesity (weight gain) immune system dysfunction, allergies, asthma, autism, Parkinson's disease, multiple sclerosis, neurodegenerative diseases, depression, other diseases associated with decreased intestinal barrier function, (impaired) wound healing, behavioral disorders, alcohol dependence, cardiovascular diseases, high cholesterol, elevated triglycerides, atherosclerosis, sleep apnea, osteoarthritis, gallbladder disease, cancer and conditions that alter the physical integrity of the intestinal mucosal barrier, such as food allergies, intestinal immaturity, for example due to prematurity, exposure to ionizing radiation, chemotherapy and/or toxins, autoimmune disorders, malnutrition and sepsis, and use to simulate anti-inflammatory activity in the mammalian intestine.

В настоящем изобретении также предлагается способ модуляции и/или стимуляции функции иммунной системы слизистой оболочки кишечника и/или поддержания, и/или восстановления, и/или повышения физической целостности мукозального барьера кишечника у млекопитающего, например, человека, указанный способ включает стадию введения штамма Akkermansia glycaniphilus или композиции нуждающемуся в ней млекопитающему, например человеку.The present invention also provides a method of modulating and/or stimulating the function of the intestinal mucosal immune system and/or maintaining and/or restoring and/or enhancing the physical integrity of the intestinal mucosal barrier in a mammal, such as a human, which method comprises the step of administering a strain of Akkermansia glycaniphilus or the composition to a mammal in need thereof, such as a human.

В одном из вариантов осуществления изобретения бактериальный штамм или композицию вводят не реже одного раза в неделю, предпочтительно, не реже двух раз в неделю, более предпочтительно, не реже одного раза в сутки и даже более предпочтительно не реже двух раз в сутки.In one embodiment, the bacterial strain or composition is administered at least once a week, preferably at least twice a week, more preferably at least once a day, and even more preferably at least twice a day.

В одном варианте осуществления изобретения введенное за сутки количество Akkermansia glycaniphilus составляет от около 10⁴ до около 10¹⁵ клеток или колониеобразующих единиц (КОЕ). Например, кишечные бактерии можно вводить в количестве от около 10⁶ или 10⁷ клеток или КОЕ до около 10¹⁴ клеток или КОЕ в сутки, предпочтительно от около 10⁸ клеток или КОЕ до около 10¹³ клеток или КОЕ в сутки, предпочтительно от около 10⁹ клеток или КОЕ до около 10¹² клеток или КОЕ в сутки, более предпочтительно от около 10¹⁰ клеток или КОЕ до около 10¹² клеток или КОЕ в сутки.In one embodiment of the invention, the amount of Akkermansia glycaniphilus administered per day is from about 10 ⁴ to about 10 ¹⁵ cells or colony forming units (CFU). For example, enteric bacteria can be administered in an amount of from about 10 ⁶ or 10 ⁷ cells or CFU to about 10 ¹⁴ cells or CFU per day, preferably from about 10 ⁸ cells or CFU to about 10 ¹³ cells or CFU per day, preferably from about 10 ⁹ cells or CFU to about 10 ¹² cells or CFU per day, more preferably from about 10 ¹⁰ cells or CFU to about 10 ¹² cells or CFU per day.

В одном из вариантов осуществления изобретения, бактериальный штамм или композицию вводят субъекту с избыточной массой тела или субъекту с ожирением. В одном варианте осуществления изобретения у субъекта диагностирован метаболический синдром, например, метаболическое нарушение, свя- 6 044429 занное с избыточной массой тела и/или ожирением. В другом варианте осуществления изобретения для указанного субъекта существует риск развития метаболического нарушения, например, метаболического нарушения, связанного с избыточной массой тела и/или ожирением. Например, такой риск может быть связан с фактом избыточной массы тела или ожирением у субъекта.In one embodiment of the invention, the bacterial strain or composition is administered to an overweight or obese subject. In one embodiment of the invention, the subject is diagnosed with metabolic syndrome, for example, a metabolic disorder associated with overweight and/or obesity. In another embodiment, the subject is at risk of developing a metabolic disorder, for example a metabolic disorder associated with overweight and/or obesity. For example, such risk may be associated with the fact that the subject is overweight or obese.

Альтернативно или дополнительно указанный риск соответствует предрасположенности, например, наследственной предрасположенности к метаболическому нарушению, например, метаболическому нарушению, связанному с избыточной массой тела и/или ожирением.Alternatively or additionally, said risk corresponds to a predisposition, for example a hereditary predisposition, to a metabolic disorder, for example a metabolic disorder associated with overweight and/or obesity.

Субъект может принадлежать к любой возрастной группе (например, дети первых двух лет жизни, взрослые, пожилые) и любому полу (мужчина и женщина). В одном варианте осуществления изобретения млекопитающим является ребенок первых двух лет жизни (например, новорожденный, ребенок до года, ребенок от года до 2 лет и т.п.), в частности, родившийся преждевременно ребенок моложе 2 лет.The subject can belong to any age group (for example, children in the first two years of life, adults, the elderly) and any gender (male and female). In one embodiment of the invention, the mammal is a child in the first two years of life (eg, a newborn, a child under one year old, a child between one year and two years old, etc.), in particular, a prematurely born child under 2 years of age.

В одном варианте осуществления изобретения уровень штамма Akkermansia muciniphila в микробиоте кишечника субъекта резко снижен. Например, процент Akkermansia muciniphila в микробиоте кишечника субъектов может составлять менее 1%, более предпочтительно, менее 0,5%, более предпочтительно, менее 0,1% от общей численности бактериальных клеток в кишечнике.In one embodiment of the invention, the level of the Akkermansia muciniphila strain in the subject's gut microbiota is dramatically reduced. For example, the percentage of Akkermansia muciniphila in the gut microbiota of subjects may be less than 1%, more preferably less than 0.5%, more preferably less than 0.1% of the total bacterial cell population in the intestine.

Настоящее изобретение также относится к косметическому применению Akkermansia glycaniphilus для содействия снижению массы тела субъекта.The present invention also relates to the cosmetic use of Akkermansia glycaniphilus to promote weight loss in a subject.

Таким образом, в настоящем изобретении также предложены косметическая композиция, содержащая косметически эффективное количество Akkermansia glycaniphilus, и использование этой композиции для содействия снижению массы тела субъекта. В контексте настоящего изобретения термин косметически эффективное количество относится к количеству косметической композиции, необходимому и достаточному для содействия косметическому эффекту, например, стимуляции снижения массы тела субъекта.Thus, the present invention also provides a cosmetic composition containing a cosmetically effective amount of Akkermansia glycaniphilus, and the use of this composition to promote weight loss in a subject. In the context of the present invention, the term cosmetically effective amount refers to an amount of a cosmetic composition necessary and sufficient to promote a cosmetic effect, for example, promoting weight loss in a subject.

В одном варианте осуществления изобретения косметически эффективное количество Akkermansia glycaniphilus составляет от около 10⁴ до около 10¹⁵ клеток или колониеобразующих единиц (КОЕ). Например, кишечные бактерии могут быть введены в количестве от около 10⁶ или 10⁷ клеток или КОЕ до около 10¹⁴ клеток или КОЕ в сутки, предпочтительно от около 10⁸ клеток или КОЕ до около 10¹³ клеток или КОЕ в сутки, предпочтительно от около 10⁹ клеток или КОЕ до около 10¹² клеток или КОЕ в сутки, более предпочтительно от около 10¹⁰ клеток или КОЕ до около 10¹² клеток или КОЕ в сутки.In one embodiment, the cosmetically effective amount of Akkermansia glycaniphilus is from about 10 ⁴ to about 10 ¹⁵ cells or colony forming units (CFU). For example, enteric bacteria may be administered in an amount of from about 10 ⁶ or 10 ⁷ cells or CFU to about 10 ¹⁴ cells or CFU per day, preferably from about 10 ⁸ cells or CFU to about 10 ¹³ cells or CFU per day, preferably from about 10 ⁹ cells or CFU to about 10 ¹² cells or CFU per day, more preferably from about 10 ¹⁰ cells or CFU to about 10 ¹² cells or CFU per day.

В ещё одном варианте осуществления изобретения косметическую композицию вводят не реже одного раза в неделю, предпочтительно, не реже двух раз в неделю, более предпочтительно, не реже одного раза в сутки и даже более предпочтительно не реже двух раз в сутки.In yet another embodiment of the invention, the cosmetic composition is administered at least once a week, preferably at least twice a week, more preferably at least once a day, and even more preferably at least twice a day.

В изобретении также предложен способ повышения уровня Akkermansia glycaniphilus в желудочнокишечном тракте млекопитающего, предпочтительно, человека, и указанный способ включает стадии:The invention also provides a method for increasing the level of Akkermansia glycaniphilus in the gastrointestinal tract of a mammal, preferably a human, which method comprises the steps of:

введения выделенного штамма Akkermansia glycaniphilus по любому из пп.1-4 формулы изобретения, или композиции по любому из пп.5-8 формулы изобретения, указанному млекопитающему; и стимуляции роста указанного штамма Akkermansia glycaniphilus в ЖКТ указанного млекопитающего путем введения млекопитающему соединения, которое выбирают из группы, включающей соединения, содержащие в качестве структурных звеньев глюкозамин или производные глюкозамина, такие как N-ацетилглюкозамин, и полифенолы.administering an isolated strain of Akkermansia glycaniphilus according to any of claims 1-4, or a composition according to any of claims 5-8, to said mammal; and stimulating the growth of said strain of Akkermansia glycaniphilus in the gastrointestinal tract of said mammal by administering to the mammal a compound selected from the group consisting of compounds containing glucosamine or glucosamine derivatives, such as N-acetylglucosamine, and polyphenols as structural units.

В частности, примером соединения, содержащего глюкозамин или производные глюкозамина, является хитин. Полифенолы могут, например, содержаться в клюкве, винограде или других описанных продуктах растительного происхождения (см. публикацию Anhe FF et al. Gut Microbes. 2016 Feb 22:0. [электронная публикация до выхода в печать]).In particular, an example of a compound containing glucosamine or glucosamine derivatives is chitin. Polyphenols may, for example, be found in cranberries, grapes or other described plant products (see Anhe FF et al. Gut Microbes. 2016 Feb 22:0. [electronic publication ahead of print]).

На основании описания и приведённых ниже примерах специалист в данной области, используя существенные характеристики настоящего изобретения, без отступления от существа и объема настоящего изобретения, сможет внести разнообразные изменения и модификации в изобретение, чтобы адаптировать его к разнообразным применениям и условиям. Таким образом, из предшествующего описания специалисту будут очевидны разнообразные модификации изобретения в дополнение к показанным и описанным в данном документе. Предполагается, что такие модификации также входят в объем формулы изобретения.Based on the description and examples below, one skilled in the art, using the essential characteristics of the present invention, without departing from the spirit and scope of the present invention, will be able to make various changes and modifications to the invention to adapt it to a variety of applications and conditions. Thus, from the foregoing description, various modifications of the invention will be apparent to those skilled in the art in addition to those shown and described herein. It is intended that such modifications also be included within the scope of the claims.

ПримерыExamples

Материалы и методы.Materials and methods.

Источник и выращивание микроорганизма.Source and cultivation of the microorganism.

Штамм Pyt^T был получен во время выделения муколитических бактерий из свежих фекалий сетчатого питона (Malayopython reticulatus), размещенного в зоопарке Бергерс (Арнем, Нидерланды), при использовании анаэробной основной среды, содержащей 0,5% муцина в качестве единственного источника углерода и энергии, ранее описанной как муциновой среды (Derrien, Vaughan, Plugge & de Vos, 2004. Int J Syst Evol Microbiol 54:1469-1476). В целях сравнения использовали штамм A. muciniphila Muc^T (CIP 107961^T). Для выделения штамма Pyt^T использовали разведение до приближения к экстинкции на муциновой среде с последующим пересевом штрихом на чашки с муциновым агаром, представлявшим собой муциновую среду с добавлением 0,8% агара (Agar noble; Difco). Отбирали одиночные колонии, перено- 7 044429 сили их для выращивания в муциновую среду и пересевали штрихом на чашки с муциновым агаром до получения чистой культуры.Strain Pyt ^T was obtained during the isolation of mucolytic bacteria from fresh feces of a reticulated python (Malayopython reticulatus) housed at Bergers Zoo (Arnhem, the Netherlands), using an anaerobic basal medium containing 0.5% mucin as the sole source of carbon and energy, previously described as a mucin environment (Derrien, Vaughan, Plugge & de Vos, 2004. Int J Syst Evol Microbiol 54:1469-1476). For comparison purposes, the A. muciniphila strain Muc ^T (CIP 107961 ^T ) was used. To isolate the Pyt ^T strain, dilution was used to approach extinction on mucin medium, followed by streaking on mucin agar plates, which was mucin medium with the addition of 0.8% agar (Agar noble; Difco). Single colonies were selected, transferred to mucin medium for cultivation, and streaked onto mucin agar plates until a pure culture was obtained.

Генетические методы: Филогенетический и геномный анализ.Genetic methods: Phylogenetic and genomic analysis.

Проведен анализ нуклеотидной последовательности клонированного гена 16S рРНК, чтобы определить филогенетическую принадлежность штамма Pyt^T. Для выделения общей ДНК использовали набор грамположительной ДНК для очистки (Epicenter), и последовательности гена 16S рРНК амплифицировали методом ПЦР, используя универсальные праймеры 27F и 1492R (Suzuki, Taylor & DeLong, 2000. Appl Environ Microbiol 66:4605-4614), и для очистки продуктов ПЦР использовали набор для получения особо чистых продуктов ПЦР High Pure PCR Cleanup Micro (Roche Diagnostics). Для того чтобы получить почти полноразмерную последовательность гена 16S рРНК rRNA штамма Pyt^T, очищенные продукты ПЦР клонировали в клетках Escherichia coli XL 1-blue, используя простую векторную систему pGEM-T (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Плазмидную ДНК выделяли из 44 культур трансформантов с помощью набора QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) и использовали в качестве матрицы для анализа последовательности методом Сэнгера (выполненного по технологии GATC) с использованием примеров к промоторам T7 и SP6, фланкирующим вставку (Promega). Для выравнивания последовательностей использовали DNABaser, и выравнивание было исправлено вручную, чтобы гарантировать перекрывающиеся последовательности. Было обнаружено, что все клонированные вставки являются производными идентичного гена 16S рРНК, и получена последовательность, содержащая 1439 п.н. Последовательности гена 16S рРНК штамма Pyt^T и других представителей типа Verrucomicrobia были выровнены при использовании программы SINA (http://www.arb-silva.de/aligner/: Pruesse. Peplies & Glockner, 2012. Bioinformatics 28:1823-1829). Для реконструкции филогенетических деревьев использовали программное обеспечение ARB (Ludwig, Strunk, Westram et al., 2004. Nucleic Acids Res 32:1363-1371). Для определения расстояний и кластеризации методами присоединения соседа и максимальной экономии использовали бутстреп-значения, основанные на 1000 репликаций.The nucleotide sequence of the cloned 16S rRNA gene was analyzed to determine the phylogenetic affiliation of the Pyt ^T strain. A Gram-positive DNA purification kit (Epicenter) was used to isolate total DNA, and 16S rRNA gene sequences were amplified by PCR using universal primers 27F and 1492R (Suzuki, Taylor & DeLong, 2000. Appl Environ Microbiol 66:4605-4614), and for To purify PCR products, we used the High Pure PCR Cleanup Micro kit for obtaining highly pure PCR products (Roche Diagnostics). To obtain a nearly full-length sequence of the 16S rRNA rRNA gene of strain Pyt ^T , purified PCR products were cloned into Escherichia coli XL 1-blue cells using the simple pGEM-T vector system (Promega) according to the manufacturer's instructions. Plasmid DNA was isolated from 44 transformant cultures using the QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen) and used as a template for Sanger sequence analysis (performed using GATC technology) using examples to the T7 and SP6 promoters flanking the insert (Promega). DNABaser was used to align the sequences, and the alignments were manually corrected to ensure overlapping sequences. All cloned inserts were found to be derivatives of an identical 16S rRNA gene, and a sequence containing 1439 bp was obtained. The 16S rRNA gene sequences of strain Pyt ^T and other members of the phylum Verrucomicrobia were aligned using the SINA program (http://www.arb-silva.de/aligner/: Pruesse. Peplies & Glockner, 2012. Bioinformatics 28:1823-1829). ARB software was used to reconstruct phylogenetic trees (Ludwig, Strunk, Westram et al., 2004. Nucleic Acids Res 32:1363–1371). Bootstrap values based on 1000 replications were used to determine distances and clustering by neighbor joining and maximum parsimony methods.

Для дополнительного подтверждения филогенетического положения штамма Pyt^T и изучения его геномных взаимосвязей была частично определена геномная последовательность этого штамма. Общую ДНК, выделенную, как описано выше, использовали для получения библиотеки MiSeq, которую подвергали секвенированию нового поколения на персональном секвенаторе Illumina MiSeq с парноконцевыми прочтениями фрагментов размером 250 п.н. и размером вставки 500 п.н. Для сбора прочтений использовали Ray (k-мер 101) (Boisvert, Raymond, Godzaridis et al., 2012. Genome Biol 13:R122).To further confirm the phylogenetic position of the Pyt ^T strain and study its genomic relationships, the genomic sequence of this strain was partially determined. Total DNA isolated as described above was used to generate a MiSeq library, which was subjected to next-generation sequencing on an Illumina MiSeq personal sequencer with paired-end reads of 250-bp fragments. and insert size 500 bp. Ray (k-mer 101) was used to assemble reads (Boisvert, Raymond, Godzaridis et al. 2012. Genome Biol 13:R122).

Аннотацию выполняли с использованием внутреннего биоинформционного конвейера, включающего Prodigal v2.5 для прогнозирования кодирующих белок последовательностей ДНК (CDS) (Hyatt, Chen, Locascio et al., 2010. BMC bioinformatics 11:119), InterProScan 5RC7 для аннотации белков (Hunter, Jones, Mitchell et al., 2012. Nucleic Acids Res 40:D306-312), tRNAscan-SE v1.3.1 для прогнозирования тРНК (Lowe & Eddy, 1997. Nucleic Acids Res 25:955-964) и RNAmmer v1.2 для прогнозирования тРНК (Lagesen, Hallin, Rodland et al., 2007. Nucleic Acids Res 35:3100-3108). Дополнительные прогнозы функции белка получали с помощью BLAST-идентификации посредством сравнения с базами данных UniRef50 (Suzek, Huang, McGarvey et al., 2007. Bioinformatics 23:1282-1288) и Swissprot (UniProtConsortium, 2014) (загруженными в августе 2013). Впоследствии аннотация была дополнительно усилена в результате добавления EC-номеров из версии PRIAM 2013-03-06 (Claudel-Renard, Chevalet, Faraut et al., 2003. Nucleic Acids Res 31:6633-6639). При использовании базы данных RFAM, версия 11.0, rfam_scan.pl v1.04 кодирующие ДНК не обнаружены (Burge, Daub, Eberhardt et al., 2013. Nucleic Acids Res 41:D226232).Annotation was performed using an in-house bioinformatics pipeline including Prodigal v2.5 for protein coding DNA sequence (CDS) prediction (Hyatt, Chen, Locascio et al., 2010. BMC bioinformatics 11:119), InterProScan 5RC7 for protein annotation (Hunter, Jones , Mitchell et al., 2012. Nucleic Acids Res 40:D306-312), tRNAscan-SE v1.3.1 for tRNA prediction (Lowe & Eddy, 1997. Nucleic Acids Res 25:955-964) and RNAmmer v1.2 for prediction tRNA (Lagesen, Hallin, Rodland et al., 2007. Nucleic Acids Res 35:3100-3108). Additional protein function predictions were obtained using BLAST identification by comparison with the UniRef50 (Suzek, Huang, McGarvey et al., 2007. Bioinformatics 23:1282–1288) and Swissprot (UniProtConsortium, 2014) databases (downloaded August 2013). The annotation was subsequently further strengthened by the addition of EC numbers from PRIAM version 2013-03-06 (Claudel-Renard, Chevalet, Faraut et al., 2003. Nucleic Acids Res 31:6633-6639). No coding DNAs were detected using the RFAM database version 11.0, rfam_scan.pl v1.04 (Burge, Daub, Eberhardt et al., 2013. Nucleic Acids Res 41:D226232).

Для экспериментов по ДНК-ДНК-гибридизации (DDH; ДДГ) клетки штаммов Pyt^T и Muc^T были выращены и собраны в стационарной фазе, после чего осадок был ресуспендирован в H2O:изо-пропаноле (1:1). Далее эксперименты методом DDH проводились сотрудниками Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) института Лейбница (Брауншвейг, Германия), как было описано ранее (Cashion, Holder-Franklin, McCully et al., 1977. Anal Biochem 81:461-466; Deley, Cattoir & Reynaert.A, 1970. Eur J Biochem 12:133; Huss, Festl & Schleifer, 1983. Syst Appl Microbiol 4:184-192).For DNA-DNA hybridization (DDH) experiments, cells of the Pyt ^T and Muc ^T strains were grown and collected in stationary phase, after which the pellet was resuspended in H2O:iso-propanol (1:1). Further experiments using the DDH method were carried out by employees of the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) of the Leibniz Institute (Braunschweig, Germany), as previously described (Cashion, Holder-Franklin, McCully et al., 1977. Anal Biochem 81:461-466; Deley , Cattoir & Reynaert.A, 1970. Eur J Biochem 12:133; Huss, Festl & Schleifer, 1983. Syst Appl Microbiol 4:184-192).

Выраженное в процентах содержание Г+Ц в геномной ДНК штамма Pyt^T определяли сотрудники Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) института Лейбница (Cashion, Holder-Franklin, McCully & Franklin, 1977. Anal Biochem 81:461-466; Mesbah, Premachandran & Whitman, 1989. Int J Syst Bacteriol 39:159-167, Tamaoka & Komagata, 1984. FEMS Microbiol Lett 25:125-128).The percentage of G+C content in the genomic DNA of the Pyt ^T strain was determined by employees of the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) of the Leibniz Institute (Cashion, Holder-Franklin, McCully & Franklin, 1977. Anal Biochem 81:461-466; Mesbah, Premachandran & Whitman, 1989. Int J Syst Bacteriol 39:159-167, Tamaoka & Komagata, 1984. FEMS Microbiol Lett 25:125-128).

Определение фанотипических характеристик: морфология, физиология и хемотаксономия.Determination of phanotypic characteristics: morphology, physiology and chemotaxonomy.

Окрашивание по Граму проводили по известной методике (Plugge, Zoetendal & Stams, 2000. Int J Syst Evol Microbiol 50 Pt 3:1155-1162). Для наблюдения за морфологией, подвижностью и способностью к образованию спор использовали фазово-контрастную микроскопию, клетки выращивали в течение 2 суток при 37°C на муциновой среде. Для определения присутствия капсулы клетки, выращенные на муциновой среде, окрашивали суспензией угольных частиц.Gram staining was performed according to a known procedure (Plugge, Zoetendal & Stams, 2000. Int J Syst Evol Microbiol 50 Pt 3:1155-1162). Phase contrast microscopy was used to observe the morphology, motility and ability to form spores, and the cells were grown for 2 days at 37°C in mucin medium. To determine the presence of a capsule, cells grown in mucin medium were stained with a suspension of carbon particles.

Для анализа методом сканирующей электронной микроскопии клетки фиксировали в 2%-ном растворе глютарового альдегида в 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.4) в течение 2 ч при комнатной температуре и затем дополнительно в течение 30-60 минут в 2% тетроксиде осмия. После этого выполняли обез- 8 044429 воживание клеток в серии растворов спирта разной концентрации (50%, 70%, 96% и 100%), и в заключение обрабатывали гексаметилдисилазаном, наносили на алюминиевую основу и покрывали платиной.For analysis by scanning electron microscopy, cells were fixed in a 2% solution of glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) for 2 hours at room temperature and then for an additional 30-60 minutes in 2% osmium tetroxide. After this, the cells were dehydrated in a series of alcohol solutions of different concentrations (50%, 70%, 96% and 100%), and finally treated with hexamethyldisilazane, applied to an aluminum base and coated with platinum.

После этого клетки изучали с помощью сканирующего электронного микроскопа FEI Quanta 250 FEG.The cells were then examined using an FEI Quanta 250 FEG scanning electron microscope.

Эксперименты по росту клеток выполняли в двух повторностях для каждого штамма, используя флаконы с сывороткой вместимостью 30 мл. Газовая фаза представляла собой N₂/CO₂ (80:20, отношение объемов), 1,5 атм. Общие условия выращивания: pH 6,5, температура 37°C, если не указано иное. Мониторинг роста осуществляли, измеряя на спектрофотометре (Ultraspec 10, Biosciences) оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD600). Содержание короткоцепочечных жирных кислот измеряли на оборудовании для ВЭЖХ со спектральной системой Thermo Electron, оснащенной колонкой Agilent Metacarb.Cell growth experiments were performed in duplicate for each strain using 30-mL serum vials. The gas phase was N ₂ /CO ₂ (80:20, volume ratio), 1.5 atm. General growing conditions: pH 6.5, temperature 37°C unless otherwise noted. Growth was monitored by measuring optical density at a wavelength of 600 nm (OD600) using a spectrophotometer (Ultraspec 10, Biosciences). SCFA content was measured using HPLC equipment with a Thermo Electron spectral system equipped with an Agilent Metacarb column.

Оптимальную температуру и pH измеряли в двух повторностях на бульоне с сердечно-мозговым экстрактом (BHI; Difco) с добавлением 0,5% (отношение массы к объему) муцина из желудка свиньи (тип III, Sigma) и 0.05% (отношение массы к объему) цистеина. Протестированные температуры составляли от 10 до 55°C с инкрементом 5°C; рост определяли при pH 3,5-0, повышая на 0,5 единиц pH (при использовании для коррекции pH HCl или NaOH) при 37°C. Культуры инкубировали не менее 1 месяца.Optimal temperature and pH were measured in duplicate in brain heart infusion broth (BHI; Difco) supplemented with 0.5% (w/v) porcine gastric mucin (Type III, Sigma) and 0.05% (w/v) porcine gastric mucin (type III, Sigma). ) cysteine. Temperatures tested ranged from 10 to 55°C in 5°C increments; growth was determined at pH 3.5-0, increasing by 0.5 pH units (using HCl or NaOH for pH adjustment) at 37°C. Cultures were incubated for at least 1 month.

Рост на D-маннозе, D-глюкозе, L-фукозе, D-фруктозе, D-галактозе, N-ацетилглюкозамине, Nацетилгалактозамине, D-целлобиозе тестировали в двух повторностях при концентрации 10 мМ в ранее описанное основной среде (Derrien, Vaughan, Plugge & de Vos, 2004. Int J Syst Evol Microbiol 54:14691476), с добавлением триптона в концентрации 16 г/л и треонина 4 г/л. Рост на D-глюкозе, D-мальтозе, D-лактозе, D-манните, D-сахарозе, салицине, D-ксилозе, L-арабинозе, глицероле, D-целлобиозе, Dманнозе, D-мелезитозе, D-раффинозе, D-сорбите, L-рамнозе и D-трегалозе определяя при использовании API® 20A (bioMerieux, Франция) в соответствии с инструкциями производителя с одним изменением: для инокуляции API® 20A в качестве основной среды использовали описанную ранее (Derrien, Vaughan, Plugge & de Vos, 2004. Int J Syst Evol Microbiol 54:1469-1476) с добавлением триптона в концентрации 16 г/л и треонина в концентрации 4 г/л. Затем определяли каталазную активность, проводя реакцию с 3% (отношение массы к объему) раствором H2O2. Для определения образования индола и уреазы и также гидролиза желатина и эскулина также использовали полоски API® 20A (bioMerieux, Франция).Growth on D-mannose, D-glucose, L-fucose, D-fructose, D-galactose, N-acetylglucosamine, Nacetylgalactosamine, D-cellobiose was tested in duplicate at a concentration of 10 mM in a previously described basic medium (Derrien, Vaughan, Plugge & de Vos, 2004. Int J Syst Evol Microbiol 54:14691476), with the addition of tryptone at a concentration of 16 g/l and threonine 4 g/l. Growth on D-glucose, D-maltose, D-lactose, D-mannitol, D-sucrose, salicin, D-xylose, L-arabinose, glycerol, D-cellobiose, D-mannose, D-melesitose, D-raffinose, D- sorbitol, L-rhamnose and D-trehalose determined using API® 20A (bioMerieux, France) in accordance with the manufacturer's instructions with one change: for inoculation of API® 20A, the base medium used was that previously described (Derrien, Vaughan, Plugge & de Vos , 2004. Int J Syst Evol Microbiol 54:1469-1476) with the addition of tryptone at a concentration of 16 g/L and threonine at a concentration of 4 g/L. Catalase activity was then determined by reacting with 3% (w/v) H2O2 solution. API® 20A strips (bioMerieux, France) were also used to determine the formation of indole and urease and also the hydrolysis of gelatin and esculin.

Для определения резистентности к антибиотикам использовали метод Etest для ампициллина и ванкомицина (bioMerieux, Marcy l'Etoile, Франция). Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли после 48-часовой инкубации. Более подробно, штамм PytT выращивали на муциновой среде, и после достижения стационарной фазы 100 мкл высевали на чашки со средой BHI с добавлением 0.5% (отношение объемов) муцина из желудка свиньи (тип III, Sigma), и 0.05% (отношение объемов) цистеина гидрохлорида (Sigma-ALdrich). Чашки инкубировали в течение 24-48 часов в строго анаэробных условиях. Для интерпретации МИК грамотрицательных анаэробных бактерий определяли уровень резистентности, используя таблицу предельных значений чувствительности Европейского комитета по тестированию на антимикробную чувствительность EUCAST (версия 5.0, действительна с 01-01-2015).To determine antibiotic resistance, the Etest method for ampicillin and vancomycin (bioMerieux, Marcy l'Etoile, France) was used. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined after 48 hours of incubation. In more detail, the PytT strain was grown on mucin medium, and after reaching the stationary phase, 100 μl was plated on BHI medium plates supplemented with 0.5% (volume ratio) porcine stomach mucin (type III, Sigma), and 0.05% (volume ratio) cysteine hydrochloride (Sigma-ALdrich). The dishes were incubated for 24-48 hours under strictly anaerobic conditions. To interpret the MICs of gram-negative anaerobic bacteria, the level of resistance was determined using the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing table EUCAST (version 5.0, valid from 01-01-2015).

Для определения хемотаксономических характеристик штаммы PytT и MucT выращивали и собирали в стационарной фазе с последующей лиофилизацией. Анализ жирных кислот в клетке выполняли сотрудники Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) института Лейбница по описанной ранее методике (Kampfer & Kroppenstedt, 1996. Can J Microbiol 42:989-1005).To determine chemotaxonomic characteristics, PytT and MucT strains were grown and collected in stationary phase, followed by lyophilization. Analysis of cellular fatty acids was performed by members of the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) of the Leibniz Institute according to a previously described method (Kampfer & Kroppenstedt, 1996. Can J Microbiol 42:989-1005).

Результаты.Results.

Филогенетические и геномные характеристики.Phylogenetic and genomic characteristics.

Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК штамма PytT включала непрерывный фрагмент длиной 1437 п.н. Расчеты сходства последовательностей, выполненные после анализа методом присоединения соседа, показали, что ближайшим родственным штамму PytT является штамм A. muciniphila MucT (94,4%). Сходство последовательностей 16S рРНК существенно меньше применяемого в настоящее время порога отсечения для видов, равного 97% (Tindall, Rossello-Mora, Busse et al., 2010. Int J Syst Evol Microbiol 60:249-266). Примечательно, что последовательность гена 16S рРНК штамма PytT продемонстрировала 99,7% сходства с диким клоном, выделенным из фекалий морского млекопитающего дюгоня (AB264081). С представителями всех достоверно описанных родов, принадлежащих к типу Verrucomicrobiae, включая семейства Rubritaleaceae, Akkermansiceae, and Verrucomicrobiacea степень сходства последовательностей оказалась меньше (<90,0%).The nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of strain PytT included a continuous fragment of 1437 bp in length. Sequence similarity calculations performed after neighbor-joining analysis indicated that the closest relative of the PytT strain is the A. muciniphila strain MucT (94.4%). 16S rRNA sequence similarity is well below the currently used species cutoff of 97% (Tindall, Rossello-Mora, Busse et al. 2010. Int J Syst Evol Microbiol 60:249–266). Notably, the 16S rRNA gene sequence of strain PytT showed 99.7% similarity to a wild clone isolated from the feces of the marine mammal dugong (AB264081). With representatives of all reliably described genera belonging to the phylum Verrucomicrobiae, including the families Rubritaleaceae, Akkermansiceae, and Verrucomicrobiacea, the degree of sequence similarity was lower (<90.0%).

Штамм.Strain.

В экспериментах DDH продемонстрировано относительно небольшое сходство штамма PytT с типовым штаммом MucT (28,3% ± 5,2). Содержание пары ГЦ составило 58,2 мол.%.DDH experiments demonstrated relatively little similarity between the PytT strain and the type strain MucT (28.3% ± 5.2). The content of the GC pair was 58.2 mol.%.

При определении полного генома штамма PytT методом одномолекулярного секвенирования PacBio было обнаружено, что геном состоит из одной хромосомы длиной 3 074 121 п.н. при содержании пары ГЦ 57.6%. Геном штамма PytT на 400 т.п.н. длиннее генома штамма MucT (2,66 млн п.н.). Расчетное содержание (в %) пары Г+Ц в ДНК штамма PytT, равное 57,6 %, хорошо согласуется с определенным в эксперименте значением (58.2 %), но несколько выше значения, полученного для штамма MucT (56,0 %). Установленное с использованием программного обеспечения Blast сходство (>5 т.п.н.) генома штаммаWhen determining the complete genome of the PytT strain using PacBio single-molecule sequencing, it was found that the genome consists of a single chromosome with a length of 3,074,121 bp. with a GC pair content of 57.6%. The genome of strain PytT is 400 kb. longer than the genome of strain MucT (2.66 million bp). The calculated content (in %) of the G+C pair in the DNA of the PytT strain, equal to 57.6%, is in good agreement with the experimentally determined value (58.2%), but is slightly higher than the value obtained for the MucT strain (56.0%). Similarity (>5 kb) of the strain genome determined using Blast software

- 9 044429- 9 044429

Pyt^T и генома штамма Muc^T составило 82,0%. При использовании метода средней нуклеотидной подлинность (ANI) сходство генома штамма Pyt^T с геномом штамма Muc^T составило 79,7%. Высказано предположение, что метод ANI может быть точной заменой метода ДДГ (Goris, Konstantinidis, Klappenbach et al., 2007. Int J Syst Evol Microbiol 57:81-91). Представленные данные подтверждают истинность этого предположения для типа Verrucomicobia и показывают, что значения, полученные при определении степени сходства методами ANI и DDH, существенно меньше применяемого в настоящее время порога отсечения для видов, равного 70% для DDH и 95% для ANI.Pyt ^T and the genome of the Muc ^T strain amounted to 82.0%. Using the average nucleotide identity (ANI) method, the similarity of the genome of the Pyt ^T strain with the genome of the Muc ^T strain was 79.7%. It has been suggested that the ANI method can be an exact replacement for the FGD method (Goris, Konstantinidis, Klappenbach et al., 2007. Int J Syst Evol Microbiol 57:81-91). The presented data confirm the validity of this assumption for the phylum Verrucomicobia and show that the values obtained when determining the degree of similarity by the ANI and DDH methods are significantly less than the currently used cut-off threshold for species of 70% for DDH and 95% for ANI.

Геном штамма Pyt^T отражает способность этого штамма вызывать разложение муцина, и, согласно прогнозам, кодирует 55 гликозидгидролаз, 28 из которых предположительно являются секретируемыми, 5 фукозидаз, 3 из которых предположительно являются секретируемыми, и 7 сиалидаз, 6 из которых предположительно являются секретируемыми. Для разложения муцинового гликопротеина необходимо отщепить сульфатные группы, которые могут присоединяться в конце гликановых цепей. Согласно прогнозам штамм Pyt^T кодирует 14 сульфатаз, 9 из которых предположительно являются секретируемыми. Геном штамма PytT также содержит гены цитохром bd убихинолоксидазы и Ni-зависимой гидрогеназы, что указывает на потенциальное аэробное дыхание, которое штамм может использовать на аэробноанаэробной границе раздела муцинового слоя кишечника.The Pyt ^T strain genome reflects the strain's ability to cause mucin degradation and is predicted to encode 55 glycoside hydrolases, 28 of which are predicted to be secreted, 5 fucosidases, 3 of which are predicted to be secreted, and 7 sialidases, 6 of which are predicted to be secreted. To degrade mucin glycoprotein, it is necessary to cleave off sulfate groups that can be attached to the ends of glycan chains. Strain Pyt ^T is predicted to encode 14 sulfatases, 9 of which are predicted to be secreted. The genome of strain PytT also contains genes for cytochrome bd ubiquinol oxidase and Ni-dependent hydrogenase, indicating potential aerobic respiration that the strain may utilize at the aerobic-anaerobic interface of the intestinal mucin layer.

Муциновые гликаны состоят, в основном, из галактозы, N-ацетилглюкозамина, Nацетилгалактозамина, и штамм Pyt^T способен использовать все эти вещества в качестве питательного субстрата. В отличие от штамма A. muciniphila Muc^T штамм Pyt^T способен использовать галактозу в качестве единственного источника углерода, образуя при этом, главным образом, пропионат, ацетат и небольшое количество сукцината. На галактозе штамм растет относительно медленно (> 1 недели) по сравнению с ростом на муцине (<16 часов). Прогнозирование генома показало, что штамм Pyt^T кодирует только ферменты метаболизма Leloir галактокиназу (GalK) и УДФ-глюкозо-4-эпимеразу (GalE). Согласно прогнозам, эти ферменты кодирует также штамм Muc^T (van Passel, Kant, Zoetendal, Plugge, Derrien, Malfatti, Chain, Woyke, Palva, de Vos & Smidt, 2011. Plos one 6:e16876). Однако мы смогли идентифицировать в геноме штамма Pyt^T 8 генов, отсутствующих в геноме штамма Muc^T, которые кодируют белки со связывающим галактозу доменом, и 7 из этих 8 белков являются секретируемыми. Вероятно, штамм Pyt^T осуществляет метаболизм галактозы по пока еще неизвестному пути, и эти гены могут быть участниками системы связывания и транспортировки галактозы.Mucin glycans consist mainly of galactose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, and the Pyt ^T strain is able to use all of these substances as a nutrient substrate. Unlike the A. muciniphila Muc ^T strain, the Pyt ^T strain is able to use galactose as the sole carbon source, producing mainly propionate, acetate and a small amount of succinate. The strain grows relatively slowly on galactose (>1 week) compared to growth on mucin (<16 hours). Genome prediction revealed that strain Pyt ^T encodes only the metabolic enzymes Leloir galactokinase (GalK) and UDP-glucose-4-epimerase (GalE). The Muc ^T strain is also predicted to encode these enzymes (van Passel, Kant, Zoetendal, Plugge, Derrien, Malfatti, Chain, Woyke, Palva, de Vos & Smidt, 2011. Plos one 6:e16876). However, we were able to identify 8 genes in the genome of the Pyt ^T strain that are absent in the genome of the Muc ^T strain, which encode proteins with a galactose binding domain, and 7 of these 8 proteins are secreted. It is likely that the Pyt ^T strain metabolizes galactose through an as yet unknown pathway, and these genes may be participants in the galactose binding and transport system.

Морфология.Morphology.

Клетки штамма имеют овальную форму, неподвижные и негативные при окрашивании по Граму. Размер по длинной оси одиночной клетки, выросшей на муциновой среде, составляет 0,6-1,0 мкм. Встречаются одиночные клетки, пары клеток, короткие цепочки и агрегаты клеток. После выращивания на муциновом агаре при 37°C в течение 48 штамм Pyt^T представляет собой небольшие белые колонии с диаметром колонии 0,7 мм. СЭМ продемонстрировала существование нитевидных структур, соединяющих отдельные бактериальные клетки. Клетки штамма Pyt^T могут не включать угольные частицы, что характерно для бактерий, обладающих капсулой.The cells of the strain are oval in shape, nonmotile and negative on Gram staining. The long axis size of a single cell grown on mucin medium is 0.6-1.0 µm. There are single cells, pairs of cells, short chains and aggregates of cells. After growth on mucin agar at 37°C for 48 years, the Pyt ^T strain presents small white colonies with a colony diameter of 0.7 mm. SEM demonstrated the existence of thread-like structures connecting individual bacterial cells. Cells of the Pyt ^T strain may not include carbon particles, which is typical for bacteria with a capsule.

Физиология.Physiology.

Штамм Pyt^T являлся строгим анаэробом, растущим в присутствии восстановителей L-цистеин и/или сульфида. Рост наблюдался при 15-40°C и pH 5,0-7,5, при этом оптимальные условия для роста составляли 25-30°C и pH 6,0. По сравнению со штаммом Muc^T штамм Pyt^T растет при несколько более низких температурах и значениях pH (таблица). Оптимальная температура 30°C соответствует естественной среде обитания штамма Pyt^T, так как питон является холоднокровным животным, у которого регуляция температуры тела зависит от внешних источников тепла, и поэтому температура тела питона ниже, чем у человека или мелких млекопитающих, которые являются его кормовым объектом (Wang, Zaar, Arvedsen et al., 2002. Comp Biochem Physiol A Mol Itegr Physiol 133:519-527). У вида Python bivittatus, родственного виду Malayopython reticulatus, pH в желудочно-кишечном тракте варьирует от 6.5 (желудок) до 7.6 (слепая кишка) во время голодания, и от pH 2-3 (желудок), 7-8 (пищевод, дистальный отдел тонкого кишечника, слепая кишка и проксимальный отдел толстого кишечника) до 5-6,7 (дистальный отдел пищевода, проксимаьлный отдел желудка и дистальный отдоел толстого кишечника) после приема пищи (Secor, Boback & Lignot, 2006. Integr Comp Biol 46). Эти данные показывают, что оптимальный pH штамма Pyt^T(приблизительно pH 6,0) может соответствовать колонизации дистального отдела толстого кишечника.Strain Pyt ^T was a strict anaerobe, growing in the presence of the reducing agents L-cysteine and/or sulfide. Growth was observed at 15-40°C and pH 5.0-7.5, with optimal growth conditions being 25-30°C and pH 6.0. Compared to strain Muc ^T, strain Pyt ^T grows at slightly lower temperatures and pH values (table). The optimal temperature of 30°C corresponds to the natural habitat of the Pyt ^T strain, since the python is a cold-blooded animal in which the regulation of body temperature depends on external heat sources, and therefore the body temperature of the python is lower than that of humans or small mammals that are its food source (Wang, Zaar, Arvedsen et al., 2002. Comp Biochem Physiol A Mol Itegr Physiol 133:519-527). In the species Python bivittatus, a relative of Malayopython reticulatus, the pH in the gastrointestinal tract varies from 6.5 (stomach) to 7.6 (cecum) during fasting, and from pH 2-3 (stomach), 7-8 (esophagus, distal small intestine, cecum and proximal colon) to 5-6.7 (distal esophagus, proximal stomach and distal colon) after meals (Secor, Boback & Lignot, 2006. Integr Comp Biol 46). These data indicate that the optimal pH of the Pyt ^T strain (approximately pH 6.0) may correspond to colonization of the distal colon.

Демонстрирующий наилучший рост в муциновой среде и способный использовать муцин в качестве источника углерода, энергии и азота, штамм Pyt^T образовывал ацетат, пропионат и 1,2-пропандиол. Штамм Pyt^T был способен расти без витаминов на муциновой среде, но также был способен медленно расти на бульоне с сердечно-мозговым экстрактом и в основной среде на N-ацетилглюкозамине, Nацетилгалактозамине, D-глюкозе, D-лактозе и D-галактозе в присутствии триптона в концентрации 16 г/л и треонина в концентрации 4 г/л. На D-маннозе, L-фукозе, D-целлобиозе или D-фруктозе в основной среде с добавлением триптона в концентрации 16 г/л и треонина в концентрации 4 г/л рост отсутствовал.Showing the best growth in a mucin environment and being able to use mucin as a source of carbon, energy and nitrogen, the Pyt ^T strain produced acetate, propionate and 1,2-propanediol. Strain Pyt ^T was able to grow without vitamins on mucin medium, but was also able to grow slowly on brain heart broth and in basal medium on N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, D-glucose, D-lactose and D-galactose in the presence of tryptone at a concentration of 16 g/l and threonine at a concentration of 4 g/l. There was no growth on D-mannose, L-fucose, D-cellobiose or D-fructose in basal medium supplemented with tryptone at a concentration of 16 g/l and threonine at a concentration of 4 g/l.

При использовании полосок API® 20A (bioMerieux, Франция) с основной средой с добавлением триптона в концентрации 16 г/л и треонина в концентрации 4 г/л рост штамма Pyt^T наблюдался на Dглюкозе, D-мальтозе и слабый рост на D-лактозе при отсутствии роста на D-манните, D-сахарозе, сали- 10 044429 цине, D-ксилозе, L-арабинозе, глицероле, D-целлобиозе, D-маннозе, D-мелезитозе, D-раффинозе, Dсорбите, L-рамнозе, D-трегалозе. Присутствовала каталазная активность.When using API® 20A strips (bioMerieux, France) with a basic medium supplemented with tryptone at a concentration of 16 g/l and threonine at a concentration of 4 g/l, growth of the Pyt ^T strain was observed on D-glucose, D-maltose and weak growth on D-lactose at no growth on D-mannitol, D-sucrose, salicine, D-xylose, L-arabinose, glycerol, D-cellobiose, D-mannose, D-melesitose, D-raffinose, D-sorbitol, L-rhamnose, D -trehalose. Catalase activity was present.

Результаты тестов на образование индола и уреазы были негативными, на желатин и гидролиз эскулина - позитивными.The results of tests for indole and urease formation were negative, and for gelatin and esculin hydrolysis - positive.

Штамм Pyt^T способен также использовать лактозу в качестве единственного источника углерода, образуя при этом, в основном, пропионат и ацетат. Рост на лактозе более медленный (Td приблизительно 4 часа), чем на муцине (Td приблизительно 1 час). При количественном определении продуктов сбраживания методом ВЭЖХ было обнаружено, что вначале происходит расщепление лактозы с образованием глюкозы и галактозы. Затем и глюкоза, и галактоза превращались, главным образом, в пропионат и ацетат и небольшое количество сукцината. Сетчатый питон не является лактирующим млекопитающим, поэтому способность штамма Pyt^T использовать лактозу в качестве питательного субстрата оказалась неожиданной. Однако в молекуле муцинового гликопротеина имеются многочисленные β4гликолитические связи (Linden, Sutton, Karlsson et al., 2008. Mucosal Immunol 1:183-197). В молекуле лактозы имеется аналогичная 34-связь между глюкозой и галактозой. Таким образом, для того чтобы использовать муцин в качестве питательного субстрата, штамму Pyt^T нужно быть способным к расщеплению гликановой связи, и, вероятно, что штамм Pyt^T может разлагать лактозу, используя тот же фермент, который он обычно использует для разложения муцина.The Pyt ^T strain is also capable of using lactose as the sole carbon source, producing mainly propionate and acetate. Growth on lactose is slower (Td approximately 4 hours) than on mucin (Td approximately 1 hour). When quantifying fermentation products using HPLC, it was found that lactose is first broken down to form glucose and galactose. Both glucose and galactose were then converted mainly to propionate and acetate and a small amount of succinate. The reticulated python is not a lactating mammal, so the ability of the Pyt ^T strain to use lactose as a nutrient substrate was unexpected. However, the mucin glycoprotein molecule contains numerous β4-glycolytic linkages (Linden, Sutton, Karlsson et al., 2008. Mucosal Immunol 1:183-197). In the lactose molecule there is a similar 34-bond between glucose and galactose. Thus, in order to use mucin as a nutritional substrate, the Pyt ^T strain needs to be capable of glycan bond cleavage, and it is likely that the Pyt ^T strain can degrade lactose using the same enzyme that it normally uses to degrade mucin.

Анализ с использованием метода Etest (bioMerieux, Франция) показал относительную резистентность штамма Pyt^T к ампициллину (минимальная ингибирующая концентрация (МИК) составила 32 мкг/мл) и ванкомицину (МИК 24 мкг/мл), при чувствительности ко всем другим клинически значимым антибиотикам, включая цефалоспорины, фторхинолоны, аминогликозиды, макролиды, тетрациклины, метронидазол, хлорамфеникол, рифампицин и колистин.Analysis using the Etest method (bioMerieux, France) showed the relative resistance of the Pyt ^T strain to ampicillin (minimum inhibitory concentration (MIC) was 32 μg/ml) and vancomycin (MIC 24 μg/ml), with sensitivity to all other clinically significant antibiotics, including cephalosporins, fluoroquinolones, aminoglycosides, macrolides, tetracyclines, metronidazole, chloramphenicol, rifampicin and colistin.

Результаты определения физиологических характеристик штамма Pyt^T представлены в описании вида и показаны в таблице в сравнении с другими представителями типа Verrucomicrobiae.The results of determining the physiological characteristics of the Pyt ^T strain are presented in the description of the species and shown in the table in comparison with other representatives of the type Verrucomicrobiae.

Физиологические характеристики типовых штаммов вида Akkermansia в сравнении с характеристиками представителей других родов семейства Verrucomicrobiae (подсемейство I).Physiological characteristics of type strains of the Akkermansia species in comparison with the characteristics of representatives of other genera of the family Verrucomicrobiae (subfamily I).

Характеристика Characteristic 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 Морфология клетки Cell morphology Овальные Oval Овальные Oval Кокковидные или палочковидные Coccoid or rod-shaped Веретеновидные палочковидные Fusiform rod-shaped Веретеновидные палочковидные Fusiform rod-shaped Размер клетки (мкм) Cell size (µm) 0,6-1,0 0.6-1.0 0,6-1,0 0.6-1.0 0,5-1,0 или 0,5-1,Ох 0,81,5 0.5-1.0 or 0.5-1.0x 0.81.5 0,5x2,0 - 8,0 0.5x2.0 - 8.0 0,8-1,0 х 1,0-3,8 0.8-1.0 x 1.0-3.8 Аэробный рост Aerobic growth - - - - + + + + + + Температурный диапазон для роста (°C) Temperature range for growth (°C) 15-37 15-37 20-40 20-40 4-37$ 4-37$ 1-40$ 1-40$ 26-34 26-34 Оптимальная температура (°C) Optimal temperature (°C) 30 thirty 37 37 30-37$ 30-37$ н.о. But. 26-33 26-33 Диапазон pH для роста pH Range for Growth 5,0-7,5 5.0-7.5 5,5-8,0 5.5-8.0 6,5-8,5$ 6.5-8.5$ н.о. But. Н.О. BUT. Оптимальный pH для роста Optimal pH for growth 6,0 6.0 6,5 6.5 н.о. But. н.о. But. Н.О. BUT. Капсула Capsule + + + + н.о. But. н.о. But. Н.О. BUT. Рост на: Height by: глюкозе glucose +1 +1 +t +t + + + + + + галактозе galactose +1 +1 - - +/-$ +/-$ + + + + фукозе fucose - - + + фруктозе fructose - - - - + + + + целлобиозе cellobiose - - - - +/-$ +/-$ + + + + N- ацетилглюкозамине N- acetylglucosamine +$ +$ +t +t +/ +/ +/-$ +/-$ + + N- ацетилгалактозамине N- acetylgalactosamine +$ +$ +t +t +/ +/ н.о. But. н.о. But. муцине mucin + + + + н.о. But. н.о. But. н.о. But. Содержание Г+Ц в ДНК (моль%) G+C content in DNA (mol%) 58,2 58.2 47,6 47.6 47,7-52,4 47.7-52.4 54,6-60,1 54.6-60.1 57,9-59,3 57.9-59.3

- 11 044429- 11 044429

Источник данных: Hedlund, 2О1О.Тип XXIII. Verrucomicrobia phyl. nov. (Справочник по систем атической бактериологии Берджи. 2-е издание: Springer-Verlag, New York).Data source: Hedlund, 2O1O.Type XXIII. Verrucomicrobia phyl. nov. (Burgee's Handbook of Systems of Atic Bacteriology. 2nd edition: Springer-Verlag, New York).

Штаммы: 1-А. glycanophilus Ρυί^ύ; 2-A. muciniphila Muc^t; 3- Rubritalea (основанный ha Λ marina, R. sabuli, R.Strains: 1-A. glycanophilus Ρυί ^ύ ; 2-A. muciniphila Muc ^t ; 3- Rubritalea (founded by ha Λ marina, R. sabuli, R.

SPONGIAE, R. SQUALENIFACIENS И R. TANGERINA)’, 4- PROSTHECOBACTER (ОСНОВАННЫЙ HA P. DEBONTII, P. DEJONGEII, P.SPONGIAE, R. SQUALENIFACIENS AND R. TANGERINA)’, 4- PROSTHECOBACTER (BASED HA P. DEBONTII, P. DEJONGEII, P.

FUSIFORMISM P. VANNEERVENII)·, 5- (ОСНОВ HNVERRUCOMICROBIUM SPINOSUNi)·, + позитивный; - НЕГАТИВНЫЙ; (+) СЛАБО позитивный; t в ПРИСУТСТВИИ ТРИПТОНА В КОНЦЕНТРАЦРИИ 16 г/л и ТРЕОНИНА 4 Г/Л; t В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИДА.FUSIFORMISM P. VANNEERVENII)·, 5- (BASIS HNVERRUCOMICROBIUM SPINOSUNi)·, + positive; - NEGATIVE; (+) WEAKLY positive; t in the PRESENCE OF TRYPTONE IN A CONCENTRATION of 16 g/l and threonine 4 g/l; t DEPENDING ON THE STYLE.

Все штаммы неподвижные и негативные в отношении потребности в витаминах. Все штаммыAll strains are nonmotile and negative in terms of vitamin requirements. All strains

ЧУВСТВИТЕЛЬНЫ К АМПИЦИЛЛИНУ.SENSITIVE TO AMPICILLIN.

Н.О. ИЕ ОПРЕДЕЛЕНО.BUT. IE DEFINED.

Описание штама Akkermansia glycanophilus sp. nov.Description of the strain Akkermansia glycanophilus sp. nov.

Akkermansia glycanophilus (гликанофил, полученный из гликана; гликанофильный - адаптированный к гликанам).Akkermansia glycanophilus (glycanophilic, derived from glycan; glycanophilic - adapted to glycans).

Клетки овальной формы, неподвижные и негативные при окрашивании по Граму. Размер по длинной оси одиночной клетки, выросшей на муциновой среде, составляет 0,6-1,0 мкм. Встречаются одиночные клетки, пары клеток, короткие цепочки и агрегаты клеток. Клетки покрыты филаментами. После выращивания на мягком муциновом агаре штамм представляет собой небольшие белые колонии с диаметром колонии 0,7 мм. Клетки штамма Pyt^T не включают угольные частицы, что характерно для бактерий, обладающих капсулой. Рост наблюдается при температуре 15-40°C и pH 5,0-7,5, оптимальные условия роста - температура 25-30°C и pH 6,0. Строго анаэробные или микроаэрофильные бактерии. Способны расти на желудочном муцине и бульоне с сердечно-мозговым экстрактом, и в основной среде с добавлением триптона в концентрации 16 г/л и треонина в концентрации 4 г/л на N-ацетилглюкозамине, Nацетилгалактозамине, глюкозе, лактозе и галактозе. На L-фукозе, D-целлобиозе или D-фруктозе в основной среде с добавлением триптона в концентрации 16 г/л и треонина в концентрации 4 г/л рост отсутствовал. В эксперименте с использованием API® 20A (bioMerieux, Франция) на такой же основной среде с добавлением триптона в концентрации 16 г/л и треонина в концентрации 4 г/л наблюдался рост на Dглюкозе, D-мальтозе и слабый рост на D-лактозе при отсутствии роста на D-манните, D-сахарозе, салицине, D-ксилозе, L-арабинозе, глицероле, D-целлобиозе, D-маннозе, D-мелезитозе, D-раффинозе, Dсорбите, L-рамнозе, D-трегалозе. положительный результат теста на каталазную активность. Результаты тестов на образование индола и уреазы были негативными, на желатин и гидролиз эскулина позитивными. Штамм способен использовать муцин в качестве единственного источника углерода, энергии и азота. Растет в отсутствие витаминов. Содержание нуклеотидов Г+Ц в ДНК 58,2 мол.%. Жирные кислоты в клетке представлены, главным образом, антеизо-жирными кислотами C_15:0, C_15:0 и C_16:0. Выделен из фекалий сетчатого питона в Вагенингене, Нидерланды. Типовой штамм Pyt^T (=DSM 100705= CIP 110913T).The cells are oval, nonmotile and negative on Gram stain. The long axis size of a single cell grown on mucin medium is 0.6-1.0 µm. There are single cells, pairs of cells, short chains and aggregates of cells. Cells are covered with filaments. After growth on soft mucin agar, the strain appears as small white colonies with a colony diameter of 0.7 mm. Cells of the Pyt ^T strain do not include carbon particles, which is typical for bacteria with a capsule. Growth is observed at a temperature of 15-40°C and pH 5.0-7.5, optimal growth conditions are a temperature of 25-30°C and pH 6.0. Strictly anaerobic or microaerophilic bacteria. Capable of growing on gastric mucin and broth with brain heart extract, and in basic medium supplemented with tryptone at a concentration of 16 g/l and threonine at a concentration of 4 g/l on N-acetylglucosamine, Nacetylgalactosamine, glucose, lactose and galactose. There was no growth on L-fucose, D-cellobiose or D-fructose in basal medium supplemented with tryptone at a concentration of 16 g/l and threonine at a concentration of 4 g/l. In an experiment using API® 20A (bioMerieux, France) on the same basic medium with the addition of tryptone at a concentration of 16 g/l and threonine at a concentration of 4 g/l, growth was observed on D-glucose, D-maltose and weak growth on D-lactose at lack of growth on D-mannitol, D-sucrose, salicin, D-xylose, L-arabinose, glycerol, D-cellobiose, D-mannose, D-melesitose, D-raffinose, Dsorbitol, L-rhamnose, D-trehalose. positive test result for catalase activity. The results of tests for indole and urease formation were negative, and positive for gelatin and esculin hydrolysis. The strain is capable of using mucin as the sole source of carbon, energy and nitrogen. Grows in the absence of vitamins. The content of G+C nucleotides in DNA is 58.2 mol.%. Fatty acids in the cell are represented mainly by anteiso-fatty acids C _15:0 , C _15:0 and C _16:0 . Isolated from reticulated python feces in Wageningen, the Netherlands. Type strain Pyt ^T (=DSM 100705=CIP 110913T).

Claims

CLAIM

1. The isolated bacterium Akkermansia glycaniphilus, deposited under the number CBS141023 at the Central Bureau of Mold Cultures, the Netherlands, for stimulating the function of the intestinal mucosal immune system and maintaining, restoring and/or enhancing the physical integrity of the intestinal mucosal barrier in a mammal.

2. A composition comprising the isolated bacterium Akkermansia glycaniphilus according to claim 1 and a physiologically acceptable carrier for stimulating the function of the intestinal mucosal immune system and maintaining, restoring and/or enhancing the physical integrity of the intestinal mucosal barrier in a mammal.

3. The composition according to claim 2, which is a pharmaceutical composition, preferably in the form of a solid dosage form such as a capsule, tablet or powder.

4. The composition according to claim 2 or 3, where the specified strain of the bacterium Akkermansia glycaniphilus is present in lyophilized or microencapsulated form.

5. The composition according to any one of claims 2-4, where the specified strain of Akkermansia glycaniphilus is present in an amount of from 10 ⁴ to 10 ¹⁵ cells.

6. Use of a composition according to any one of claims 2 to 5 for the prevention and/or treatment of a disorder selected from the group consisting of metabolic syndrome, obesity, insulin deficiency or disorders associated with insulin resistance, irritable bowel syndrome, impaired glucose tolerance, abnormal lipid metabolism, hyperglycemia, dyslipidemia accompanied by obesity, dysfunction of the intestinal mucosal immune system, high cholesterol and elevated triglycerides.

7. Use of the isolated bacterium Akkermansia glycaniphilus according to claim 1 for the prevention and/or treatment of a disorder selected from the group consisting of metabolic syndrome, obesity, abnormal lipid metabolism, hyperglycemia, dyslipidemia accompanied by obesity, dysfunction of the intestinal mucosal immune system, high cholesterol and elevated triglyceride levels.

- 12 044429

8. Use of the isolated bacterium Akkermansia glycaniphilus according to claim 1 as a probiotic or symbiotic.

9. Use of the composition according to any one of claims 2-5 as a probiotic or symbiotic.

10. Use of the isolated bacterium Akkermansia glycaniphilus according to claim 1 to promote weight loss.

11. Use of a composition according to any one of claims 2 to 5 to promote weight loss.

12. A method for increasing the level of the Akkermansia glycaniphilus bacterium in the gastrointestinal tract of a mammal, comprising the steps of: administering the isolated Akkermansia glycaniphilus bacterium according to claim 1 to said mammal; and stimulating the growth of said strain of Akkermansia glycaniphilus in the gastrointestinal tract of a mammal by administering to said mammal a compound selected from the group consisting of compounds containing glucosamine or glucosamine derivatives such as N-acetylglucosamine, and polyphenols as structural units.

13. A method for increasing the level of the bacterium Akkermansia glycaniphilus in the gastrointestinal tract of a mammal, comprising the steps of:

administering the composition according to any one of claims 2 to 5 to said mammal; and administering to said mammal a compound that is selected from the group consisting of glucosamine or glucosamine derivatives such as N-acetylglucosamine, and polyphenols.

14. A composition comprising the isolated bacterium Akkermansia glycaniphilus according to claim 1 and a compound selected from the group consisting of glucosamine or glucosamine derivatives such as N-acetylglucosamine, and polyphenols, for increasing the level of the bacterium Akkermansia glycaniphilus in the gastrointestinal tract (GIT) of a mammal and stimulating the growth of said bacterium Akkermansia glycaniphilus in the gastrointestinal tract of a mammal.

15. The composition according to any one of claims 2 to 5, further containing a compound that is selected from the group consisting of glucosamine or glucosamine derivatives such as N-acetylglucosamine, and polyphenols, for increasing the level of the bacterium Akkermansia glycaniphilus in the gastrointestinal tract of a mammal and stimulating growth of said bacterium Akkermansia glycaniphilus in the gastrointestinal tract of a mammal.