EA008007B1

EA008007B1 - Noval lipases and uses thereof

Info

Publication number: EA008007B1
Application number: EA200500391A
Authority: EA
Inventors: Рихард Альбанг; Ульрике Фолькерс; Андреас Фритц; Беатрикс Герхард; Оливер Хайнрих; Хильмар Ильгенфритц; Дитер Майер; Фабио Спреафико; Кристиан Вагнер; Де Лекс Бур; Рульф Бернхард Мейма
Original assignee: ДСМ Ай Пи ЭССЕТС Б.В.
Priority date: 2002-08-19
Filing date: 2003-08-15
Publication date: 2007-02-27
Also published as: ES2527924T3; WO2004018660A2; CA2495198A1; AR042417A1; PL214792B1; WO2004018660A3; MXPA05001978A; US8216586B2; US20090232936A1; US20060281080A1; AU2003270088A1; US7550280B2; EA200601823A1; EP2338986A1; JP2005535352A; EP2338986B1; EA200500391A1; EP1530630A2; CN1675355A; PL375355A1

Abstract

The invention relates to a newly identified polynucleotide sequence comprising a gene that encodes a novel lipolytic enzyme from Aspergillus niger. The invention features the full length nucleotide sequence of the novel gene, the cDNA sequence comprising the full length coding sequence of the novel lipolytic enzyme as well as the amino acid sequence of the full-length functional protein and functional equivalents thereof. The invention also relates to methods of using these enzymes in industrial processes and methods of diagnosing fungal infections. Also included in the invention are cells transformed with a polynucleotide according to the invention and cells wherein a lipolytic enzyme according to the invention is genetically modified to enhance its activity and/or level of expression.

Description

Изобретение относится к недавно идентифицированной полинуклеотидной последовательности, содержащей ген, кодирующий новый липолитический фермент из АкретдШик шдет. Признаками настоящего изобретения являются нуклеотидная последовательность нового гена полной длины, кДНК последовательность, содержащая полную длину последовательности, кодирующей новый липолитический фермент, а также аминокислотная последовательность липолитического фермента полной длины и его функциональные эквиваленты. Настоящее изобретение также относится к способам использования этих ферментов в промышленных процессах и способах диагностики грибковых инфекций. В настоящее изобретение также включены клетки, трансформированные полинуклеотидом согласно настоящему изобретению, и клетки, в которых липолитический фермент согласно настоящему изобретению является генетически модифицированным для усиления активности и/или уровня экспрессии.The invention relates to a newly identified polynucleotide sequence containing a gene encoding a new lipolytic enzyme from Accret Shik sdel. The features of the present invention are the nucleotide sequence of a new full-length gene, the cDNA sequence containing the full-length sequence encoding a new lipolytic enzyme, and the amino acid sequence of a full-length lipolytic enzyme and its functional equivalents. The present invention also relates to methods for using these enzymes in industrial processes and methods for diagnosing fungal infections. Also included in the present invention are cells transformed with the polynucleotide of the present invention and cells in which the lipolytic enzyme of the present invention is genetically modified to enhance activity and / or expression level.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Печеные изделия, такие как хлеб, готовят из теста, которое обычно изготавливают из основных ингредиентов (пшеничной) муки, воды и необязательно соли. В зависимости от печеных изделий другими добавленными ингредиентами могут быть сахар и прочие вкусовые добавки. Для продуктов с применением разрыхлителей, в основном используют хлебопекарные дрожжи наряду с химическими разрыхляющими системами, такими как комбинация кислот (генерирующее соединение) и бикарбонатов.Baked products, such as bread, are made from dough, which is usually made from the main ingredients of (wheat) flour, water and optionally salt. Depending on the baked goods, the other added ingredients may be sugar and other flavors. For products using disintegrants, baker's yeast is mainly used along with chemical disintegrating systems, such as a combination of acids (generating compound) and bicarbonates.

Для улучшения свойств разделки теста и/или конечных свойств печеных изделий осуществляют непрерывные попытки развития вспомогательных веществ обработки с улучшенными свойствами. Вспомогательные вещества обработки в настоящем описании определены как соединения, которые улучшают свойства разделки теста и/или конечные свойства печеных изделий. Свойства теста, которые могут быть улучшены, включают способность механической обработки, способность аккумулировать газ, уменьшенную липкость, эластичность, растяжимость, пластичность и т.д. Свойства печеных изделий, которые могут быть улучшены, включают объем батона, жесткость корочки, текстуру и мягкость хлебного мякиша, привкус, связанный с несвежестью и сроком хранения. Такие вспомогательные вещества, улучшающие обработку теста и/или печеных изделий, можно подразделить на две группы: химические добавки и ферменты (также упоминаемые как хлебопекарные ферменты).To improve the properties of cutting dough and / or the final properties of baked products, continuous attempts are made to develop processing auxiliary substances with improved properties. Processing aids are defined herein as compounds that improve the cutting properties of the dough and / or the final properties of baked products. Properties of the test that can be improved include machining ability, gas storage ability, reduced stickiness, elasticity, extensibility, ductility, etc. Properties of baked products that can be improved include loaf volume, crust hardness, texture and softness of bread crumb, flavor associated with stale and shelf life. Such excipients that improve the processing of dough and / or baked products can be divided into two groups: chemical additives and enzymes (also referred to as baking enzymes).

Дрожжи, ферменты и химические добавки обычно добавляют в тесто отдельно. Дрожжи могут быть добавлены в виде жидкой суспензии, в прессованном виде или в виде сухих активных (ΑΌΥ) или сухих неактивных дрожжей (ΙΌΥ). Различием между такими составами дрожжей является содержание воды и сухого вещества дрожжей. Жидкие дрожжи имеют содержание сухого вещества дрожжей менее чем 25% (веса к объему). Дрожжи в виде пасты имеют содержание сухого вещества дрожжей от 17 до 23% (веса к объему). Прессованные дрожжи имеют содержание сухого вещества дрожжей между 25-35% (веса к объему), в то время как составы сухих дрожжей имеют содержание сухого вещества дрожжей между 92-98% (веса к объему).Yeast, enzymes and chemical additives are usually added to the dough separately. Yeast can be added as a liquid suspension, in compressed form, or as dry active (ΑΌΥ) or dry inactive yeast (ΙΌΥ). The difference between such yeast compositions is the water and dry matter content of the yeast. Liquid yeast has a dry matter content of yeast of less than 25% (weight to volume). The yeast in the form of a paste has a dry matter content of yeast from 17 to 23% (weight to volume). Compressed yeast has a dry matter content of yeast between 25-35% (w / v), while dry yeast compositions have a dry matter content of yeast between 92-98% (w / v).

Ферменты могут быть добавлены в сухом, например гранулированном, виде или в жидком виде. Химические добавки в большинстве случаев добавляют в виде порошка. Также композиции вспомогательных веществ, которые разработаны для специфических применений выпечки, могут быть составлены из специально предназначенных смесей химических добавок и ферментов.Enzymes can be added in a dry, for example granular, form or in liquid form. Chemical additives in most cases are added in powder form. Also, excipient compositions that are formulated for specific baking applications can be composed of specially formulated mixtures of chemical additives and enzymes.

Приготовление теста из ингредиентов и вспомогательных веществ, описанных выше, хорошо известно специалистам в данной области техники и содержит смешивание упомянутых ингредиентов и вспомогательных веществ и один или несколько этапов формования и ферментации.The preparation of the dough from the ingredients and excipients described above is well known to those skilled in the art and comprises mixing said ingredients and excipients and one or more molding and fermentation steps.

Приготовление печеных изделий из такого теста также хорошо известно специалистам в данной области техники и может содержать формование и придание формы и дополнительное брожение теста, с последующей выпечкой при необходимых температурах и времени выпечки.The preparation of baked products from such a dough is also well known to specialists in this field of technology and may contain molding and shaping and additional fermentation of the dough, followed by baking at the required temperatures and baking times.

Химические добавки с улучшенными свойствами содержат окисляющие агенты, такие как аскорбиновую кислоту, броматы и азодикарбонаты, восстанавливающие агенты, такие как Ь-цистеин и глутатион, эмульгаторы, действующие как улучшители свойств теста, такие как эфиры моно- и диглицеридов диацетилвинной кислоты (ΌΑΤΕΜ), стеароиллактилат натрия (88Ь) или стеароиллактилат калия (С8Ь), или действующие как размягчители хлебного мякиша, такие как моностеарат глицерина (ΟΜ8) и т.д., жирные вещества, такие как триглицериды (жир) или лецитин и др.Chemical additives with improved properties contain oxidizing agents such as ascorbic acid, bromates and azodicarbonates, reducing agents such as L-cysteine and glutathione, emulsifiers acting as improvers of the test properties, such as diacetyl tartaric acid esters of mono- and diglycerides (ΌΑΤΕΜ), sodium stearoyl lactylate (88b) or potassium stearoyl lactylate (C8b), or acting as bread crumb softeners, such as glycerol monostearate (ΟΜ8), etc., fatty substances such as triglycerides (fat) or lecithin, etc.

В результате из-за диктуемой потребителем необходимости замещения химических добавок более натуральными продуктами, разработаны некоторые хлебопекарные ферменты со свойствами, улучшающими тесто и/или печеные изделия, и, которые могут быть использованы во всевозможных комбинациях, в зависимости от специфических условий применения выпечки. Подходящие ферменты включают ферменты, разрушающие крахмал, ферменты, разрушающие арабиноксилан и другую гемицеллюлозу, ферменты, разрушающие целлюлозу, ферменты окисления, ферменты, расщепляющие жирные вещества, ферменты, разрушающие, модифицирующие или сшивающие белки.As a result, due to the need dictated by the consumer to replace chemical additives with more natural products, some baking enzymes have been developed with properties that improve the dough and / or baked goods, and which can be used in all kinds of combinations, depending on the specific conditions of baking. Suitable enzymes include starch degrading enzymes, arabinoxylan and other hemicellulose degrading enzymes, cellulose degrading enzymes, oxidation enzymes, fatty degrading enzymes, enzymes degrading, modifying or crosslinking proteins.

Ферментами, разрушающими крахмал, являются, например, ферменты, действующие внутри, такие как альфа-амилаза, мальтогенная амилаза, пуллуланаза, или другие ферменты расщепления разветвленной структуры, и ферменты, действующие снаружи, которые расщепляют до глюкозы (амилоглюкозидаза), мальтозы (бета-амилаза), мальтотриозы, мальтотетрозы и более высокие олигосахариды.Starch-degrading enzymes are, for example, internally acting enzymes such as alpha-amylase, maltogenic amylase, pullulanase, or other branched-structure cleavage enzymes, and externally acting enzymes that break down to glucose (amyloglucosidase), maltose (beta amylase), maltotrioses, maltotetrosis and higher oligosaccharides.

- 1 008007- 1 008007

Ферментами, разрушающими арабиноксилан- и другую гемицеллюлозу, являются, например, ксиланазы, пентозаназы, гемицеллюлаза, арабинофуранозидаза, глюконаза и др.Enzymes that destroy arabinoxylan and other hemicelluloses are, for example, xylanases, pentosanases, hemicellulases, arabinofuranosidases, gluconases, etc.

Ферментами, разрушающими целлюлозу, являются, например, целлюлаза, целлобиогидролаза и бета-глюкозидаза.Cellulose degrading enzymes are, for example, cellulase, cellobiohydrolase and beta-glucosidase.

Ферментами окисления являются, например, глюкозооксидаза, гексозооксидаза, пиранозоксидаза, сульфгидрил-оксидаза, липоксигеназа, лакказа, полифенолоксидаза и др.Oxidation enzymes are, for example, glucose oxidase, hexose oxidase, pyranosoxidase, sulfhydryl oxidase, lipoxygenase, laccase, polyphenol oxidase, etc.

Ферментами, расщепляющими жирные вещества, являются, например, липолитические ферменты, такие как триацилглицероллипазы, фосфолипазы (такие как А_ь А₂, В, С и Ό) и галактолипазы.Fatty-degrading enzymes are, for example, lipolytic enzymes such as triacylglycerolipases, phospholipases (such as A _b A ₂ , B, C and Ό) and galactolipases.

Ферментами, разрушающими, модифицирующими или сшивающими белки, являются, например, эндопротеазы (серинпротеазы, металлопротеазы, аспартилпротеазы, тиолпротеазы), экзопептидазы, которые расщепляют до одной аминокислоты или дипептида, трипептида и т.д. с Ν-терминального (аминопептидазы) или С-терминального (карбоксипептидазы) концов полипептидной цепи, ферменты, разрушающие глутамин или аспарагины, такие как деамидаза и пептидоглутаминаза, или сшивающие ферменты, такие как трансглютаминаза.Enzymes that break down, modify or cross-link proteins are, for example, endoproteases (serine proteases, metalloproteases, aspartyl proteases, thiol proteases), exopeptidases that cleave to one amino acid or dipeptide, tripeptide, etc. from the Ν-terminal (aminopeptidase) or C-terminal (carboxypeptidase) ends of the polypeptide chain, enzymes that destroy glutamine or asparagines, such as deamidase and peptidoglutaminase, or crosslinking enzymes, such as transglutaminase.

Хлебопекарные ферменты как правило могут производиться микроорганизмами. Микробные хлебопекарные ферменты являются доступными из различных источников; ВасШик крес. являются обычным источником ферментов бактерий, несмотря на то, что ферменты грибов обычно производят АкретдШик крес.Bakery enzymes can usually be produced by microorganisms. Microbial baking enzymes are available from various sources; VasShik kres. are a common source of bacterial enzymes, despite the fact that fungal enzymes usually produce AccretedShik Cres.

Хлебопекарные ферменты могут быть использованы в многообразии хлебопекарных изделий. Термин хлебопекарные изделия в настоящем описании определен как содержащий хлебные изделия, такие как хлеб, батоны хлеба, французский батон, а также булочки, пирожные, пирожки, горячая сдоба, пончики из дрожжевого и недрожжевого теста и т. п.Bakery enzymes can be used in a variety of bakery products. The term bakery products in the present description is defined as containing bread products, such as bread, bread loaves, French loaf, as well as rolls, cakes, pies, hot buns, donuts from yeast and non-yeast dough, etc.

В процессах, упомянутых выше, существует преимущество использования хлебопекарных ферментов, которые получены при помощи ДНК-рекомбинантных технологий. Такие рекомбинантные ферменты имеют некоторые преимущества перед традиционно очищенными аналогами. Рекомбинантные ферменты могут быть созданы по низкой себестоимости, с высоким выходом, свободными от загрязняющих агентов, подобных бактериям или вирусам, а также свободными от бактериальных токсинов или других загрязняющих ферментативных активностей.In the processes mentioned above, there is the advantage of using baking enzymes that are obtained using DNA recombinant technologies. Such recombinant enzymes have some advantages over traditionally purified analogues. Recombinant enzymes can be created at low cost, in high yield, free of contaminants like bacteria or viruses, and free of bacterial toxins or other contaminating enzymatic activities.

Задача изобретенияObject of the invention

Задачей настоящего изобретения является предоставление новых полинуклеотидов, кодирующих новые липолитические ферменты с улучшенными свойствами. Дополнительной задачей является предоставление липолитических ферментов, продуцируемых естественным путем и рекомбинантным способом, а также рекомбинантных штаммов, их продуцирующих. Также частью настоящего изобретения являются слитые полипептиды, а также способы создания и использования полинуклеотидов и полипептидов согласно настоящему изобретению.The present invention is the provision of new polynucleotides encoding new lipolytic enzymes with improved properties. An additional objective is the provision of lipolytic enzymes produced naturally and recombinantly, as well as recombinant strains producing them. Also part of the present invention are fusion polypeptides, as well as methods for creating and using polynucleotides and polypeptides according to the present invention.

Задачей настоящего изобретения также является предоставление новых липолитических ферментов, которые решают по меньшей мере одну из вышеупомянутых проблем или предоставляют новые липолитические ферменты, которые имеют одно или несколько улучшенных свойств при использовании в тесте и/или печеных изделиях, выбранных из группы увеличенной прочности теста, увеличенной эластичности теста, увеличенной стабильности теста, уменьшенной черствости теста, улучшенной растяжимости теста, улучшенной способности теста к механической обработке, увеличенного объема печеного изделия, улучшенной структуры хлебного мякиша печеного изделия, улучшенной мягкости печеного изделия, улучшенного вкуса печеного изделия, улучшенной устойчивости к черствлению печеного изделия, улучшенного цвета печеного изделия, улучшенной корки печеного изделия или которые имеют особенность хлебного субстрата.An object of the present invention is also to provide new lipolytic enzymes that solve at least one of the above problems or provide new lipolytic enzymes that have one or more improved properties when used in dough and / or baked products selected from the group of increased dough strength, increased elasticity of the dough, increased stability of the dough, reduced callousness of the dough, improved extensibility of the dough, improved ability of the dough to be machined, velichennogo volume of the baked product, improved crumb structure of the baked product, improved softness of the baked product, improved flavor of the baked product, improved resistance to cherstvleniyu baked product, improved color of the baked product, improved crust of the baked product or which have a characteristic grain substrate.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение предоставляет новые полинуклеотиды, кодирующие новые липолитические ферменты. Более конкретно, настоящее изобретение предоставляет полинуклеотиды, имеющие нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется предпочтительно при условиях высокой жесткости с последовательностью, выбранной из группы, состоящую из БЕЦ ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38. Следовательно, изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, которые являются более чем на 40%, такие как примерно 60%, предпочтительно 65%, более предпочтительно 70%, даже более предпочтительно 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичными последовательностям, выбранным из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38.The present invention provides novel polynucleotides encoding novel lipolytic enzymes. More specifically, the present invention provides polynucleotides having a nucleotide sequence that hybridizes preferably under high stringency conditions with a sequence selected from the group consisting of Betz Е N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 and 38. Therefore, the invention provides nucleic acids that are more than 40%, such as about 60%, preferably 65%, more preferably 70%, even more preferably 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 or 99% homologous to characteristics selected from the group consisting of 8EC ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 and 38.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет такие выделенные полинуклеотиды, получаемые из мицельных грибов, в частности АкретдШик шдет является предпочтительным.In a more preferred embodiment, the present invention provides such isolated polynucleotides derived from mycelial fungi, in particular, Accrett Schick is preferred.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов.In one embodiment, the present invention provides an isolated polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide with an amino acid sequence selected from the group consisting of 8EC ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39 or their functional equivalents.

- 2 008007- 2 008007

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один функциональный домен полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов.In an additional embodiment, the present invention provides an isolated polynucleotide encoding at least one functional domain of a polynucleotide selected from the group consisting of 8EO ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 , 36 and 39 or their functional equivalents.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет ген липолитического фермента, выбранный из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34 и 37. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид, предпочтительно кДНК, кодирующую липолитический фермент АкретдШик шдет, чью аминокислотную последовательность выбирают из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или варианты или фрагменты такого полипептида. В предпочтительном варианте осуществления кДНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35 и 38 или их функциональных эквивалентов.In a preferred embodiment, the present invention provides a lipolytic enzyme gene selected from the group consisting of 8EO ΙΌ N0: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34 and 37. In another aspect the present invention provides a polynucleotide, preferably cDNA, encoding the Acretd Schick lipolytic enzyme, whose amino acid sequence is selected from the group consisting of 8E0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39 or variants or fragments of such a polypeptide. In a preferred embodiment, the cDNA has a sequence selected from the group consisting of 8E0 ΙΌ N0: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, and 38 or their functional equivalents.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид, содержащий кодирующую последовательность полинуклеотидов согласно настоящему изобретению, причем предпочтительной является полинуклеотидная последовательность, выбранная из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35 и 38.In another preferred embodiment, the present invention provides a polynucleotide comprising the coding sequence of polynucleotides according to the present invention, with a polynucleotide sequence selected from the group consisting of 8E0 ΙΌ N0: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23 being preferred. , 26, 29, 32, 35, and 38.

Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим полинуклеотидную последовательность согласно настоящему изобретению, и праймерам, зондам и фрагментам, которые могут быть использованы для амплификации или обнаружения ДНК согласно настоящему изобретению.The present invention also relates to vectors containing a polynucleotide sequence according to the present invention, and primers, probes and fragments that can be used to amplify or detect DNA according to the present invention.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления предоставляют вектор, в котором полинуклеотидная последовательность согласно настоящему изобретению является функционально связанной с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии кодируемой аминокислотной последовательности в подходящей клетке хозяина, такой как ЛкретдШик шдет или ЛкретдШик огухае. Настоящее изобретение также предоставляет способы приготовления полинуклеотидов и векторов согласно настоящему изобретению.In a further preferred embodiment, a vector is provided in which the polynucleotide sequence of the present invention is operably linked to regulatory sequences suitable for expressing the encoded amino acid sequence in a suitable host cell, such as Lkretdshik shdet or Lkretdshik oguhahe. The present invention also provides methods for preparing polynucleotides and vectors according to the present invention.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантно продуцируемым клеткам хозяина, которые содержат гетерологичные или гомологичные полинуклеотиды согласно настоящему изобретению.The present invention also relates to recombinantly produced host cells that contain heterologous or homologous polynucleotides according to the present invention.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет рекомбинантные клетки хозяина, в которых экспрессия липолитического фермента согласно настоящему изобретению существенно увеличена или в которых увеличена активность липолитического фермента.In another embodiment, the present invention provides recombinant host cells in which the expression of the lipolytic enzyme according to the present invention is significantly increased or in which the activity of the lipolytic enzyme is increased.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет клетку хозяина продуцируемую рекомбинантным способом, которая содержит гетерологичный или гомологичный полинуклеотид согласно настоящему изобретению и, где клетка способна продуцировать функциональный липолитический фермент согласно настоящему изобретению, предпочтительно клетка способна к чрезмерной экспрессии липолитического фермента согласно настоящему изобретению, например штамм АкретдШик, содержащий увеличенное количество копий гена или кДНК в настоящем изобретении.In another embodiment, the present invention provides a host cell produced by a recombinant method that contains a heterologous or homologous polynucleotide according to the present invention and, where the cell is capable of producing a functional lipolytic enzyme according to the present invention, preferably the cell is capable of overexpressing the lipolytic enzyme according to the present invention, for example, the AkretdShik strain containing an increased number of copies of a gene or cDNA is currently invention.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предоставлен очищенный полипептид. Полипептиды согласно настоящему изобретению включают полипептиды, кодируемые полинуклеотидами согласно настоящему изобретению. Особенно предпочтительным является полипептид, выбранный из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов.In yet another aspect of the present invention, a purified polypeptide is provided. Polypeptides of the present invention include polypeptides encoded by polynucleotides of the present invention. Particularly preferred is a polypeptide selected from the group consisting of 8E0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, and 39 or their functional equivalents.

Следовательно, в одном из аспектов настоящее изобретение предоставляет композицию липолитического фермента, содержащую в качестве активного ингредиента фермент, выбранный из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов.Therefore, in one aspect, the present invention provides a lipolytic enzyme composition comprising, as an active ingredient, an enzyme selected from the group consisting of 8E0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39 or their functional equivalents.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ получения печеных изделий, в котором в тесто включены используемые для изготовления печеных изделий один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов.In another aspect, the present invention provides a method for producing baked goods, in which one or more enzymes selected from the group consisting of 8E0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, used for making baked goods, are included in the dough. 24, 27, 30, 33, 36 and 39 or their functional equivalents.

Слитые белки, содержащие полипепти, согласно настоящему изобретению также находятся в объеме настоящего изобретения. Настоящее изобретение также предоставляет способы получения полипептидов согласно настоящему изобретению.Fusion proteins containing the polypeptides of the present invention are also within the scope of the present invention. The present invention also provides methods for producing the polypeptides of the present invention.

Настоящее изобретение также относится к использованию липолитического фермента согласно настоящему изобретению в любом промышленном процессе как изложено в настоящем описании.The present invention also relates to the use of the lipolytic enzyme according to the present invention in any industrial process as described herein.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Липолитический фермент определен в настоящем описании как фермент, проявляющий себя, по меньшей мере, как один, а предпочтительно два, или три, или четыре, или более из следующих липолитических активностей: триацилглицерол липазы, фосфолипазы А₁, фосфолипазы А₂, фосфолипазы В, фосфолипазы С, фосфолипазы Ό, лизофосфолипазы и галактолипазы.A lipolytic enzyme is defined in the present description as an enzyme that manifests itself as at least one, and preferably two, or three, or four, or more of the following lipolytic activities: triacylglycerol lipases, phospholipases A ₁ , phospholipases A ₂ , phospholipases B, phospholipase C, phospholipase Ό, lysophospholipase and galactolipase.

ПолинуклеотидыPolynucleotides

Настоящее изобретение представляет нуклеотиды, кодирующие липолитические ферменты, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12,The present invention provides nucleotides encoding lipolytic enzymes having an amino acid sequence selected from the group consisting of 8E0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12,

- 3 008007- 3 008007

15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов. Последовательности семи генов, кодирующих липолитические ферменты ΝΒΕ028, ΝΒΕ029, ΝΒΕ030, ΝΒΕ031, ΝΒΕ032, ΝΒΕ033, ΝΒΕ034, ΝΒΕ036, ΝΒΕ038, ΝΒΕ039, ΝΒΕ043, ΝΒΕ045 и ΝΒΕ042 соответственно были определены путем секвенирования геномных клонов, полученных из ЛзрегдШиз шдег. Настоящее изобретение представляет полинуклеотидные последовательности, содержащие гены, кодирующие липолитические ферменты ΝΒΕ028, ΝΒΕ029, ΝΒΕ030, ΝΒΕ031, ΝΒΕ032, ΝΒΕ033, ΝΒΕ034, ΝΒΕ036, ΝΒΕ038, ΝΒΕ039, ΝΒΕ043, ΝΒΕ045 и ΝΒΕ042, а также их полные последовательности кДНК и их кодирующие последовательности (табл. 1). Следовательно, настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, содержащим нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из 8Ε0 ΙΟ ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 или их функциональных эквивалентов.15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, and 39 or their functional equivalents. Sequences of seven genes encoding the lipolytic enzymes ΝΒΕ028, ΝΒΕ029, ΝΒΕ030, ΝΒΕ031, ΝΒΕ032, ΝΒΕ033, ΝΒΕ034, ΝΒΕ036, ΝΒΕ038, ΝΒΕ039, ΝΒΕ043, ΝΒΕ045 and ΝΒΕ042, respectively, were determined by sequencing of genomic clones obtained from Lreg. The present invention provides polynucleotide sequences containing genes encoding the lipolytic enzymes ΝΒΕ028, ΝΒΕ029, ΝΒΕ030, ΝΒΕ031, ΝΒΕ032, ΝΒΕ033, ΝΒΕ034, ΝΒΕ036, ΝΒΕ038, ΝΒΕ039, ΝΒΕ043, ΝΒΕ045 and ΝΒΕ042, as well as their full cDNA sequences and their cDNA sequences and table . 1). Therefore, the present invention relates to isolated polynucleotides containing nucleotide sequences selected from the group consisting of 8Ε0 ΙΟ ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20 , 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37, and 38 or their functional equivalents.

Таблица 1Table 1

Липолитический фермент Lipolytic enzyme Последовательность (ЗЕО Ю N0) Sequence (Zeo Yu N0) ΝΒΕχχχ ΝΒΕχχχ геномная genomic кДНК cDNA аминокислотная amino acid ΝΒΕ028 ΝΒΕ028 1 1 2 2 3 3 ΝΒΕ029 ΝΒΕ029 4 4 5 5 6 6 ΝΒΕ030 ΝΒΕ030 7 7 8 8 9 9 ΝΒΕ031 ΝΒΕ031 10 10 11 eleven 12 12 ΝΒΕ032 ΝΒΕ032 13 thirteen 14 14 15 fifteen ΝΒΕ033 ΝΒΕ033 16 16 17 17 18 18 ΝΒΕ034 ΝΒΕ034 19 19 20 20 21 21 ΝΒΕ036 ΝΒΕ036 22 22 23 23 24 24 ΝΒΕ038 ΝΒΕ038 25 25 26 26 27 27 ΝΒΕ039 ΝΒΕ039 28 28 29 29th 30 thirty ΝΒΕ043 ΝΒΕ043 31 31 32 32 33 33 ΝΒΕ045 ΝΒΕ045 34 34 35 35 36 36 ΝΒΕ042 ΝΒΕ042 37 37 38 38 39 39

Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, гибридизуемому в жестких условиях, предпочтительно в условиях высокой жесткости, в полинуклеотиды, выбранные из группы, состоящей из 8Ш Ш ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38. Преимущественно, такие полинуклеотиды могут быть получены из мицельных грибов, в частности из ЛзрегдШиз шдег. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ΕΌ Ю ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38.More specifically, the present invention relates to an isolated polynucleotide hybridizable under stringent conditions, preferably under high stringency conditions, to polynucleotides selected from the group consisting of 8III W ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 and 38. Advantageously, such polynucleotides can be obtained from mycelium fungi, in particular from LzregdShiz Shdeg. More specifically, the present invention relates to an isolated polynucleotide having a nucleotide sequence selected from the group consisting of 8 ΕΌ S ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 and 38.

Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере один функциональный домен полинуклеотида, имеющего аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из 8ЕО ΙΟ ΝΟ: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или их функциональных эквивалентов.The present invention also relates to an isolated polynucleotide encoding at least one functional domain of a polynucleotide having amino acid sequences selected from the group consisting of 8EO ΙΟ ΝΟ: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 , 33, 36 and 39 or their functional equivalents.

Как используется в настоящем описании, термины ген и рекомбинантный ген относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК, которая включает открытую рамку считывания, кодирующую белок, например, липолитический фермент ЛзрегдШиз шдег. Ген может включать в себя кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Более того, ген относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем описании.As used in the present description, the terms gene and recombinant gene refer to nucleic acid molecules that can be isolated from chromosomal DNA, which includes an open reading frame encoding a protein, for example, the lipolytic enzyme Lzregdis schizdeus. A gene may include coding sequences, non-coding sequences, introns, and regulatory sequences. Moreover, a gene refers to an isolated nucleic acid molecule, as defined herein.

Молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, такая как молекула нуклеиновой кислоты, имеющая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Ε0 ΙΟ ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 или их функциональных эквивалентов, может быть выделена с использованием стандартных техник молекулярной биологии и информации последовательностей, предоставленной настоящим описанием. Например, используя всю или часть последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из 8Ε0 ΙΟ ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 в качестве гибридизационного зонда, молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут быть выделеныA nucleic acid molecule of the present invention, such as a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence selected from the group consisting of 8Ε0 ΙΟ ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37, and 38 or their functional equivalents, can be isolated using standard molecular biology techniques and sequence information provided by this description. For example, using all or part of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of 8Ε0 ΙΟ ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 and 38 as a hybridization probe, nucleic acid molecules of the present invention can be isolated

- 4 008007 с использованием стандартных техник гибридизации и клонирования (например, как описано у 8атЬгоок, ί.. ЕтйкЬ, Е.Е. и МапаШ, Т. Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога1огу Мапиа1. 2'¹. еб., Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота1огу Рге55. Со1б 8ртшд НагЬог, ΝΥ, 1989).- 4 008007 using standard hybridization and cloning techniques (e.g., as described in 8atgook, ί .. Etyk, EE and MapaSh, T. Mo1esi1ag S1oshid: A aoga1ogu Mapia1 2 ^'1 eb, So1b 8rtshd Nagog aoga1ogu... , S1b 8prtsd Nagbog Laota1ogu Prge55. S1b 8rtsdg Nagbog, V, 1989).

Более того, молекула нуклеиновой кислоты, охватывающая всю или часть последовательности нуклеиновой кислоты из группы, состоящей из 8Ер ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38, может быть выделена полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров, разработанных на основании информации о последовательности, содержащейся в последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из 8ЕР ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38.Moreover, a nucleic acid molecule encompassing all or part of a nucleic acid sequence from the group consisting of 8Er GO N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20 , 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37, and 38, can be isolated by polymerase chain reaction (PCR) using synthetic oligonucleotide primers designed based on sequence information contained in the sequence nucleic acid selected from the group consisting of 8EP GO N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28 , 29, 31, 32, 34, 35, 37, and 38.

Нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть амплифицирована с использованием кДНК, мРНК или, в качестве альтернативы, геномной ДНК, в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров согласно стандартным техникам ПЦР амплификации. Нуклеиновая кислота, амплифицированная таким образом, может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована при помощи анализа последовательности ДНК.The nucleic acid of the present invention can be amplified using cDNA, mRNA, or, alternatively, genomic DNA, as a template and suitable oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques. A nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.

Более того, олигонуклеотиды, соответствующие или гибридизуемые с нуклеотидными последовательностями согласно настоящему изобретению, могут быть приготовлены при помощи стандартных техник синтеза, например, используя автоматизированный ДНК синтезатор.Moreover, oligonucleotides corresponding to or hybridizable to nucleotide sequences of the present invention can be prepared using standard synthesis techniques, for example, using an automated DNA synthesizer.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в 8ЕР ГО N0:2. Последовательность 8ЕР ГО N0:2 соответствует области кодирования гена АкретдШик шдет, представленного в 8ЕР ГО N0:1. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NΒЕ028 АкретдШик шдет, как показано в 8ЕР ГО N0:3.In one preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention comprises the nucleotide sequence shown in 8EP GO N0: 2. The sequence of 8EP GO N0: 2 corresponds to the coding region of the gene Acredet Schick, presented in 8ER GO N0: 1. Such a cDNA contains a sequence coding for the N0E028 AccretDic Schick polypeptide, as shown in 8EP GO N0: 3.

Во втором предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в 8 Ер ГО N0:5. Последовательность 8ЕР ГО N0:5 соответствует области кодирования гена АкретдШик шдет, предоставленного в 8ЕР ГО N0:4. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NΒЕ029 АкретдШик шдет, как показано в 8ЕР ГО N0:6.In a second preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention contains the nucleotide sequence shown in 8 Ep GO N0: 5. The sequence of 8EP GO N0: 5 corresponds to the coding region of the gene AkretdShik shdes provided in 8ER GO N0: 4. Such a cDNA contains a sequence encoding the NΒE029 AccretDic Schick polypeptide, as shown in 8EP GO N0: 6.

В третьем предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в 8Ер ГО N0:8. Последовательность 8Ер ГО N0:8 соответствует области кодирования гена АкретдШик шдет, предоставленного в 8Ер ГО N0:7. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NΒЕ030 АкретдШик шдет, как показано в 8Ер ГО N0:9.In a third preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention contains the nucleotide sequence shown in 8Er GO N0: 8. The sequence of 8 Ep GO N0: 8 corresponds to the coding region of the gene AcrektShik shdes provided in 8 Ep GO N0: 7. Such a cDNA contains a sequence encoding the NΒE030 AccretDish Schick polypeptide, as shown in 8Er GO N0: 9.

В четвертом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в 8Ер ГО N0:11. Последовательность 8Ер ГО N0:11 соответствует области кодирования гена АкретдШик пре г, предоставленного в 8Ер ГО N0:10. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NΒЕ031 АкретдШик шдет, как показано в 8Ер ГО N0:12.In a fourth preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention contains the nucleotide sequence shown in 8Er GO N0: 11. The sequence of 8Er GO N0: 11 corresponds to the coding region of the AkretdShik gene r provided in 8Er GO N0: 10. Such a cDNA contains a sequence encoding the NΒE031 polypeptide of Accretum Schick, as shown in 8Er GO N0: 12.

В пятом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в 8Ер ГО N0:14. Последовательность 8Ер ГО N0:14 соответствует области кодирования гена АкретдШик шдет, предоставленного в 8Ер ГО N0:13. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NΒЕ032 АкретдШик шдет, как показано в 8Ер ГО N0:15.In a fifth preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention contains the nucleotide sequence shown in 8Er GO N0: 14. The sequence of 8 Ep GO N0: 14 corresponds to the coding region of the gene AcrektShik shdes provided in 8 Ep GO N0: 13. Such a cDNA contains a sequence encoding the NΒE032 AccretDic Schick polypeptide, as shown in 8Er GO N0: 15.

В шестом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в 8Ер ГО N0:17. Последовательность 8Ер ГО N0:17 соответствует области кодирования гена АкретдШик шдет, предоставленного в 8Ер ГО N0:16. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NΒЕ033, АкретдШик шдет, как показано в 8Ер ГО N0:18.In a sixth preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention contains the nucleotide sequence shown in 8Er GO N0: 17. The sequence of 8 Ep GO N0: 17 corresponds to the coding region of the gene AcrektShik shdes provided in 8 Ep GO N0: 16. Such a cDNA contains a sequence encoding an NΒE033 polypeptide; Ancredean Schick is shown as shown in 8Er GO N0: 18.

В седьмом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в 8Ер ГО N0:20. Последовательность 8Ер ГО N0:20 соответствует области кодирования гена АкретдШик шдет, предоставленного в 8Ер ГО N0:19. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NΒЕ034 АкретдШик шдет, как показано в 8Ер ГО N0:21.In a seventh preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention contains the nucleotide sequence shown in 8Er GO N0: 20. The sequence of 8 Ep GO N0: 20 corresponds to the coding region of the gene AcrektShik shdes provided in 8 Ep GO N0: 19. Such a cDNA contains a sequence encoding the NΒE034 polypeptide of Accretum Schick, as shown in 8Er GO N0: 21.

В восьмом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в 8Ер ГО N0:23. Последовательность 8Ер ГО N0:23 соответствует области кодирования гена АкретдШик шдет, предоставленного в 8Ер ГО N0:22. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NΒЕ034 АкретдШик шдет, как показано в 8Ер ГО N0:24.In an eighth preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention contains the nucleotide sequence shown in 8Er GO N0: 23. The sequence of 8 Ep GO N0: 23 corresponds to the coding region of the gene AcrektShik shdes provided in 8 Ep GO N0: 22. Such a cDNA contains a sequence encoding the NΒE034 AccretDic Schick polypeptide, as shown in 8Er GO N0: 24.

В девятом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов, представленную в 8Ер ГО N0:265. Последовательность 8Ер ГО N0:26 соответствует области кодирования гена АкретдШик шдет, предоставленного в 8Ер ГО N0:25. Такая кДНК содержит последовательность, кодирующую полипептид NΒЕ034In a ninth preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention contains the nucleotide sequence shown in 8Er GO N0: 265. The sequence of 8 Ep GO N0: 26 corresponds to the coding region of the gene AcretdShik shdes provided in 8 Ep GO N0: 25. Such a cDNA contains a sequence encoding an NΒE034 polypeptide

- 5 008007- 5 008007

ЛзрегдШиз шдег. как показано в 8ЕЦ Ш N0:27.LzregdShiz Shdeg. as shown in 8EC W N0: 27.

В десятом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов. представленную в 8ЕО Ш N0:29. Последовательность 8Е0 Ш N0:29 соответствует области кодирования гена ЛзрегдШиз шдег. предоставленного в 8Е0 Ш N0:28. Такая кДНК содержит последовательность. кодирующую полипептид ΝΒΕ034 ЛзрегдШиз шдег. как показано в 8ЕЦ Ш N0:30.In a tenth preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention comprises a nucleotide sequence. presented in 8EO W N0: 29. The sequence 8E0 W N0: 29 corresponds to the coding region of the Lzregd Schiz gene gene. provided in 8E0 W N0: 28. Such a cDNA contains a sequence. the coding polypeptide ΝΒΕ034 Lzregd Schiz shdeg. as shown in 8EC W N0: 30.

В одиннадцатом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов. представленную в 8Е0 Ш N0:32. Последовательность 8Е0 Ш N0:32 соответствует области кодирования гена ЛзрегдШиз шдег. предоставленного в 8Е0 Ш N0:31. Такая кДНК содержит последовательность. кодирующую полипептид ПВЕ034 ЛзрегдШиз шдег. как показано в 8ЕЦ Ш N0:33.In an eleventh preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention comprises a nucleotide sequence. presented in 8E0 W N0: 32. The sequence 8E0 W N0: 32 corresponds to the coding region of the Lzregd Schiz gene gene. provided in 8E0 W N0: 31. Such a cDNA contains a sequence. the coding polypeptide PVE034 LzregdShiz shdeg. as shown in 8EC W N0: 33.

В двенадцатом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов. представленную в 8Е0 Ш N0:35. Последовательность 8Е0 Ш N0:35 соответствует области кодирования гена ЛзрегдШиз шдег. предоставленного в 8Е0 Ш N0:34. Такая кДНК содержит последовательность. кодирующую полипептид NΒЕ034 ЛзрегдШиз шдег. как показано в 8ЕЦ Ш N0:36.In a twelfth preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention comprises a nucleotide sequence. presented in 8E0 W N0: 35. The sequence 8E0 W N0: 35 corresponds to the coding region of the Lzregd Schiz gene gene. provided in 8E0 W N0: 34. Such a cDNA contains a sequence. the coding polypeptide NΒE034 Lzregschiz schdeg. as shown in 8EC W N0: 36.

В тринадцатом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеотидов. представленную в 8Е0 Ш N0:38. Последовательность 8Е0 Ш N0:38 соответствует области кодирования гена ЛзрегдШиз шдег. предоставленного в 8Е0 Ш N0:37. Такая кДНК содержит последовательность. кодирующую полипептид NΒЕ034 ЛзрегдШиз шдег. как показано в 8ЕЦ Ш N0:39.In a thirteenth preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention contains a nucleotide sequence. presented in 8E0 W N0: 38. The sequence 8E0 W N0: 38 corresponds to the coding region of the Lzregd Schiz gene gene. provided in 8E0 W N0: 37. Such a cDNA contains a sequence. the coding polypeptide NΒE034 as shown in 8EC W N0: 39.

В другом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит молекулу нуклеиновой кислоты. которая комплементарна нуклеотидной последовательности. выбранной из группы. состоящей из 8Е0 Ш N0: 1. 2. 4. 5. 7. 8. 10. 11. 13. 14. 16. 17. 19. 20. 22. 23. 25. 26. 28. 29. 31. 32. 34. 35. 37 и 38 или функциональных эквивалентов таких нуклеотидных последовательностей. Молекула нуклеиновой кислоты. которая комплементарна другой нуклеотидной последовательности. является молекулой. которая достаточно комплементарна другой нуклеотидной последовательности так. что она может гибридизоваться с другой нуклеотидной последовательностью. таким образом. образуя стабильный дуплекс.In another preferred embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention comprises a nucleic acid molecule. which is complementary to the nucleotide sequence. selected from the group. consisting of 8Е0 Ш N0: 1. 2. 4. 5. 7. 8. 10. 11. 11. 14. 16. 17. 19. 20. 22. 23. 25. 26. 28. 29. 31. 32. 34. 35. 37 and 38 or functional equivalents of such nucleotide sequences. Nucleic acid molecule. which is complementary to another nucleotide sequence. is a molecule. which is quite complementary to another nucleotide sequence like that. that it can hybridize to a different nucleotide sequence. thus. forming a stable duplex.

Один из аспектов настоящего изобретения имеет отношение к выделенным молекулам нуклеиновых кислот. которые кодируют полипептид настоящего изобретения или его функциональный эквивалент. такой как биологически активный фрагмент или домен. а также к молекулам нуклеиновых кислот. достаточным для использования в качестве гибридизационных зондов для идентификации молекул нуклеиновых кислот. кодирующих полипептид настоящего изобретения. и к фрагментам таких молекул нуклеиновых кислот. подходящих для использования в качестве праймеров ПЦР для амплификации или мутации молекул нуклеиновых кислот. Выделенный полинуклеотид или выделенная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК. которая не является непосредственно граничащей с обеими кодирующими последовательностями. с которыми она непосредственно граничит (одна на 5' и одна на 3' концах) в природном геноме организма. из которого получена. Таким образом. в одном из вариантов осуществления выделенная нуклеиновая кислота включает в себя несколько или все 5' некодирующие (например. промотор) последовательности. которые непосредственно примыкают к кодирующей последовательности. Следовательно. термин включает в себя. например. рекомбинантную ДНК. которая включена в вектор. в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус. или в геномную ДНК прокариота или эукариота. или которая существует как отдельная молекула (например. кДНК или фрагмент геномной ДНК. полученной при помощи ПЦР или обработкой рестрикционными эндонуклеазами) независимо от других последовательностей. Она также включает в себя рекомбинантную ДНК. которая является частью гибридного гена. кодирующего дополнительный полипептид. который является по существу свободным от клеточного вещества. вирусного вещества или культуральной среды (при продуцировании ДНК при помощи ДНК-рекомбинантных техник). или химических предшественников. или других химических веществ (при химическом синтезе). Более того. выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты является фрагментом нуклеиновой кислоты. который не является природным. как фрагмент. и не может быть найден в природном состоянии.One aspect of the present invention relates to isolated nucleic acid molecules. which encode the polypeptide of the present invention or its functional equivalent. such as a biologically active fragment or domain. as well as to nucleic acid molecules. sufficient for use as hybridization probes to identify nucleic acid molecules. encoding the polypeptide of the present invention. and fragments of such nucleic acid molecules. suitable for use as PCR primers for amplification or mutation of nucleic acid molecules. An isolated polynucleotide or an isolated nucleic acid is DNA or RNA. which is not directly adjacent to both coding sequences. with which it directly borders (one at 5 'and one at 3' ends) in the natural genome of the body. from which is derived. Thus. in one embodiment, the isolated nucleic acid comprises some or all 5 'non-coding (e.g., promoter) sequences. which are directly adjacent to the coding sequence. Consequently. The term includes. eg. recombinant DNA. which is included in the vector. into an autonomously replicating plasmid or virus. or into the genomic DNA of a prokaryote or eukaryote. or which exists as a separate molecule (for example, a cDNA or a fragment of genomic DNA obtained by PCR or restriction endonuclease treatment) independently of other sequences. It also includes recombinant DNA. which is part of a hybrid gene. encoding an additional polypeptide. which is essentially free of cellular matter. viral substance or culture medium (when producing DNA using DNA recombinant techniques). or chemical precursors. or other chemicals (in chemical synthesis). Moreover. an isolated nucleic acid fragment is a nucleic acid fragment. which is not natural. like a fragment. and cannot be found in its natural state.

Как используются в настоящем описании. термины полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты включают в себя молекулы ДНК (например. кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например. мРНК) и аналоги ДНК или РНК. созданные с использованием нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной. но предпочтительно. является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием аналогов олигонуклеотидов или производных (например. нуклеотидов инозина или фосфоротиоата). Такие олигонуклеотиды могут быть использованы. например. для приготовления нуклеиновых кислот. которые имеют измененные способности спаривания оснований. или увеличенную устойчивость к нуклеазам.As used in the present description. the terms polynucleotide or nucleic acid molecule include DNA molecules (eg. cDNA or genomic DNA) and RNA molecules (eg. mRNA) and DNA or RNA analogs. created using nucleotide analogues. The nucleic acid molecule may be single-stranded or double-stranded. but preferably. is double stranded DNA. A nucleic acid can be synthesized using oligonucleotide analogues or derivatives (e.g., inosine or phosphorothioate nucleotides). Such oligonucleotides may be used. eg. for the preparation of nucleic acids. which have altered base pairing abilities. or increased resistance to nucleases.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты. которая является антисмысловой к молекуле нуклеиновой кислоты согласно настояAnother embodiment of the present invention provides an isolated nucleic acid molecule. which is antisense to the nucleic acid molecule according to the present

- 6 008007 щему изобретению. Также включенными в объем настоящего изобретения являются комплементарные нити молекул нуклеиновых кислот, изложенные в настоящем описании.- 6 008007 to the present invention. Also included within the scope of the present invention are the complementary strands of nucleic acid molecules described herein.

Ошибки секвенированияSequencing Errors

Информацию о последовательности, представленную в настоящем описании, не следует толковать настолько узко, чтобы не требовать включения ошибочно идентифицированных оснований. Определенные последовательности, раскрытые в настоящем описании, могут быть легко использованы для выделения полного гена из мицельных грибов, в частности ЛкретдШик гиде г, который, в свою очередь, может быть легко подвергнут дополнительному анализу последовательности, таким образом, идентифицируя ошибки секвенирования.The sequence information presented in the present description should not be construed so narrowly as not to require the inclusion of erroneously identified bases. Certain sequences disclosed herein can be easily used to isolate a complete gene from mycelial fungi, in particular the Lkretdshik guide g, which, in turn, can be easily subjected to additional sequence analysis, thereby identifying sequencing errors.

Если не оговорено иное, все нуклеотидные последовательности, определенные путем секвенирования молекулы ДНК, в настоящем описании определены с использованием автоматизированного ДНК секвенатора, и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодированные молекулами ДНК, определенными в настоящем описании, были предсказаны при помощи трансляции последовательности ДНК, определенной как упомянуто выше. Следовательно, как известно в данной области техники, для любой последовательности ДНК, определенной при помощи такого автоматизированного способа, любая нуклеотидная последовательность, определенная в настоящем описании, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, определенные при помощи автоматов, обычно являются по меньшей мере на примерно 90% идентичными, более обычно по меньшей мере от примерно 95% до по меньшей мере примерно 99,9% идентичными реальной нуклеотидной последовательности молекулы секвенированной ДНК. Реальная последовательность может быть более точно определена при помощи других способов, включающих в себя способы секвенирования ДНК вручную, хорошо известные в данной области техники. Как известно в данной области техники, единичная вставка или делеция в определенной нуклеотидной последовательности по сравнению с реальной последовательностью может вызвать сдвиг рамки при трансляции нуклеотидной последовательности таким образом, что предсказанная аминокислотная последовательность, кодированная определенной нуклеотидной последовательностью, может полностью отличаться от аминокислотной последовательности, действительно кодируемой молекулой секвенированной ДНК, начиная с точки такой вставки или делеции.Unless otherwise specified, all nucleotide sequences determined by sequencing a DNA molecule in the present description are determined using an automated DNA sequencer, and all amino acid sequences of the polypeptides encoded by the DNA molecules defined in the present description were predicted by translation of the DNA sequence defined as mentioned above. Therefore, as is known in the art, for any DNA sequence determined by such an automated method, any nucleotide sequence defined in the present description may contain some errors. The nucleotide sequences determined by the machines are usually at least about 90% identical, more usually at least about 95% to at least about 99.9% identical to the actual nucleotide sequence of the sequenced DNA molecule. The actual sequence can be more accurately determined using other methods, including methods for manually sequencing DNA, well known in the art. As is known in the art, a single insertion or deletion in a specific nucleotide sequence compared to a real sequence can cause a frame shift during translation of the nucleotide sequence so that the predicted amino acid sequence encoded by a specific nucleotide sequence can be completely different from the amino acid sequence actually encoded a sequenced DNA molecule, starting at the point of insertion or deletion.

Специалист в данной области техники способен идентифицировать такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как откорректировать такие ошибки.A person skilled in the art is able to identify such erroneously identified bases and knows how to correct such errors.

Фрагменты нуклеиновых кислот, зонды и праймерыNucleic acid fragments, probes, and primers

Молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может содержать только часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38, например фрагмент, который может быть использован в качестве зонда или праймера, или фрагмент, кодирующий часть белка, согласно настоящему изобретению. Нуклеотидная последовательность, определенная из клонирования гена липолитического фермента и кДНК, позволяет создавать зонды и праймеры, разработанные для использования при идентификации и/или клонировании других членов семейства липолитических ферментов, а также гомологов липолитического фермента из других видов. Зонд/праймер обычно содержит по существу очищенный олигонуклеотид, который обычно содержит область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется предпочтительно в условиях высокой жесткости до, по меньшей мере, примерно 12 или 15, предпочтительно примерно 18 или 20, предпочтительно примерно 22 или 25, более предпочтительно примерно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 75, или более следующих друг за другом нуклеотидов нуклеиновой последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 или их функциональных эквивалентов.The nucleic acid molecule according to the present invention may contain only a part or fragment of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of 8EO ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37, and 38, for example, a fragment that can be used as a probe or primer, or a fragment encoding part of a protein according to the present invention. The nucleotide sequence determined from the cloning of a lipolytic enzyme gene and cDNA allows the creation of probes and primers designed for use in the identification and / or cloning of other members of the lipolytic enzyme family, as well as homologs of the lipolytic enzyme from other species. The probe / primer typically contains a substantially purified oligonucleotide that typically contains a region of a nucleotide sequence that hybridizes, preferably under high stringency, to at least about 12 or 15, preferably about 18 or 20, preferably about 22 or 25, more preferably about 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, or 75, or more consecutive nucleotides of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of 8EO ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 and 38, or x functional equivalents.

Зонды, основанные на нуклеотидных последовательностях, предоставленных в настоящем описании, могут быть использованы для обнаружения транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих одни и те же или гомологичные белки, например, в других организмах. В предпочтительных вариантах осуществления зонд дополнительно содержит группу-метку, прикрепленную к нему, например, группа-метка может быть радиоизотопом, флуоресцентным соединением, ферментом или кофактором фермента. Такие зонды также могут быть использованы в качестве части набора диагностического теста для идентификации клеток, которые экспрессируют липолитический ферментативный белок.Probes based on the nucleotide sequences provided herein can be used to detect transcripts or genomic sequences encoding the same or homologous proteins, for example, in other organisms. In preferred embodiments, the probe further comprises a tag group attached to it, for example, the tag group can be a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme, or an enzyme cofactor. Such probes can also be used as part of a diagnostic test kit to identify cells that express a lipolytic enzymatic protein.

Идентичность и гомологияIdentity and homology

Термины гомология или процент идентичности в настоящем описании используются взаимозаменяемо. Для цели настоящего изобретения в настоящем описании определено, что для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности совмещают с целью оптимального сравнения (например, могут быть введены пробелы в последовательность первой аминокислоты или последовательность нуклеиновой кислоты для оптимального совмещения со второй последовательностью амино- или нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают остатки аминокислоты или нуклеотиды в соответствующих позициях аминокислоты или позициях нуклеотидов. Если позиция в первой последовательности занята таким же остатком аминокислоты или нуклеотида, как соответствующая позиция второй последовательности, то моThe terms homology or percent identity are used interchangeably herein. For the purpose of the present invention, in the present description, it is determined that to determine the percent identity of two amino acid sequences or two nucleic acid sequences, the sequences are combined for optimal comparison (for example, spaces can be entered in the sequence of the first amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment with the second sequence amino or nucleic acid). The amino acid residues or nucleotides at the corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. If the position in the first sequence is occupied by the same amino acid or nucleotide residue as the corresponding position of the second sequence, then

- 7 008007 лекулы являются идентичными в этой позиции. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных позиций, присутствующих в двух последовательностях (т.е. % идентичности=количество идентичных позиций/общее количество позиций (т.е. перекрывающихся позиций) х100). Предпочтительно, две последовательности имеют одинаковую длину.- 7 008007 patterns are identical in this position. The percentage of identity between two sequences is a function of the number of identical positions present in two sequences (i.e.,% identity = number of identical positions / total number of positions (i.e. overlapping positions) x100). Preferably, the two sequences have the same length.

Специалисту в данной области техники известен факт, что некоторые различные компьютерные программы являются пригодными для определения гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может сопровождаться использованием математического алгоритма. В предпочтительном варианте осуществления процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют, используя алгоритм №еб1етап апб ХУипксй (1. Μοί. ΒίοΙ. (48): 444-453 (1970)), который встроен в программу САР в пакете программного обеспечения ССС (доступного на 1Шр://\\л\л\7дсд.со1п). используя либо матрикс В1о8§от 62, либо матрикс РАМ250, и вес пробела 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалисту в данной области техники очевидно, что все указанные различные параметры могут приводить к незначительно различающимся результатам, но что общий процент идентичности двух последовательностей значимо не изменяется при использовании разных алгоритмов.One skilled in the art will recognize that several different computer programs are useful for determining homology between two sequences. For example, comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences may be accompanied by the use of a mathematical algorithm. In a preferred embodiment, the percentage of identity between two amino acid sequences is determined using algorithm No. eb1etap apb HUipksy (1. ίοί. ΒίοΙ. (48): 444-453 (1970)), which is built into the CAP program in the CCC software package (available on 1Wr: // \\ l \ l \ 7dd.so1n). using either a B1o8§ot 62 matrix or a PAM250 matrix, and a space weight of 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4 and a weight of length 1, 2, 3, 4, 5, or 6. It will be apparent to those skilled in the art that all these various parameters can lead to slightly different results, but that the overall percentage of identity of the two sequences does not significantly change when using different algorithms.

В другом варианте осуществления процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием САР программы в пакете программного обеспечения ССС (доступного на 1Шр://\\л\л\7дсд.со1п) , используя матрикс Ы^8дарбпа.СМР и вес пробела 40, 50, 60, 70 или 80 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом варианте осуществления процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеотидов определяют с использованием алгоритма Е. Меуега апб ХУ.МШег (САВЮ8, 4: 11-17 (1989)), который встроен в АЫСЫ программу (версия 2,0) (доступный на: Ьбр://уедаддб.спгк.1г/Ь1п/а11дп-диекк.сд1), используя таблицу весов остатков РАМ120, штраф длины пробела 12 и штраф пробела 4.In another embodiment, the percentage of identity between two nucleotide sequences is determined using the CAP program in the CCC software package (available at 1Bp: // \\ l \ l \ 7dd.co1n), using the matrix L ^ 8 darbpa. CMP and a gap weight of 40, 50, 60, 70, or 80 and a weight of length 1, 2, 3, 4, 5, or 6. In another embodiment, the percentage of identity of two amino acid or nucleotide sequences is determined using the E. Meueg apb X.M. algorithm (SAVU8, 4: 11-17 (1989)), which is built into ASYS programs (Version 2.0) (available at: br: //uedaddb.spgk.1g/1p/a11dp-diekk.sd1) using a weighting table RAM120 residues fine gap length penalty of 12 and gap 4.

Последовательности нуклеиновых кислот и белков настоящего изобретения дополнительно могут быть использованы в качестве последовательности-запроса для выполнения поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такие типы поиска могут быть выполнены с использованием программ Β6Α8ΤΝ и ВЬА8ТХ (версия 2,0) АбксЬи1 и др. (1990) I. Μοί. Βίοί. 215: 403-10. ВЬА8Т поиски нуклеотидов могут быть выполнены программой ΒΕ-Λ8ΤΝ, объем=100, длина слова=12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам РЬР03 нуклеиновых кислот настоящего изобретения. ВЬА8Т поиски белков могут быть выполнены ВЬА8ТХ программой, объем=50, длина слова=3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам РЬР03 настоящего изобретения. Для получения совмещений, содержащих пробелы, с целью сравнения, может быть использована Сарреб ВЬА8Т, описанная АЙксби1 и др. (1997) №с1ею АДбк Век. 25(17):3389-3402. При использовании программ ВЬА8Т и Сарреб ВЬА8Т могут быть применены параметры по умолчанию соответствующих программ (например, Β^Λ8ΤN и ВЬА8ТХ). См. Ьбр://^^^.ηсЬ^.η^т.η^Ь.дον.The nucleic acid and protein sequences of the present invention can further be used as a query sequence to search public databases, for example, to identify other family members or related sequences. Such types of searches can be performed using the programs Β6Α8ΤΝ and ВАА8ТХХ (version 2.0) Abxiu1 et al. (1990) I. Μοί. Βίοί. 215: 403-10. BAB8T nucleotide searches can be performed using the ΒΕ-Λ8ΤΝ program, volume = 100, word length = 12 to obtain nucleotide sequences homologous to the PbP03 nucleic acid molecules of the present invention. The BAB8T protein searches can be performed by the BAB8TX program, volume = 50, word length = 3 to obtain amino acid sequences homologous to the Pb03 protein molecules of the present invention. To obtain combinations containing spaces, for comparison, the Sarreb BAB8T described by Aixby1 et al. (1997) No. s1eyu ADbk Vek can be used. 25 (17): 3389-3402. When using the BAB8T and Sarreb BAB8T programs, the default settings of the respective programs can be applied (for example, Β ^ Λ8ΤN and BAB8TX). See bbr: //^^^.ηсЬ^.η^т.η^Ь.дον.

ГибридизацияHybridization

Как используется в настоящем описании, термин гибридизация предназначен для описания условий гибридизации и промывки, при которых нуклеотидные последовательности по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, даже более предпочтительно по меньшей мере примерно от 85 до 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичные друг другу обычно остаются гибридизованными друг с другом.As used herein, the term hybridization is intended to describe hybridization and washing conditions under which the nucleotide sequences are at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, more preferably at least about 80%, even more preferably at least about 85 to 90%, more preferably at least 95%, homologous to each other usually remain hybridized to each other.

Предпочтительным, не ограничивающим примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6х растворе хлорида натрия/цитрата натрия (88С) при примерно 45°С, с последующей одной или двумя промывками в 1-кратном 88С, 0,1% 8Ό8 при 50°С, предпочтительно при 55°С, предпочтительно при 60°С, даже более предпочтительно при 65°С.A preferred, non-limiting example of such hybridization conditions is hybridization in a 6x solution of sodium chloride / sodium citrate (88 ° C) at about 45 ° C, followed by one or two washes in 1x 88 ° C, 0.1% 8-8 at 50 ° C, preferably at 55 ° C, preferably at 60 ° C, even more preferably at 65 ° C.

Условия высокой жесткости включают в себя, например, гибридизацию при 68°С в 5-кратном 88С/5-кратном растворе Денхарда/1,0% 8Ό8 и промывкой в 0,2-кратном 88С/0,1% 8Ό8 при комнатной температуре. В качестве альтернативы промывка может быть выполнена при 42°С.High stringency conditions include, for example, hybridization at 68 ° C in a 5-fold 88C / 5-fold Denhard solution / 1.0% 8Ό8 and washing in a 0.2-fold 88C / 0.1% 8Ό8 at room temperature. Alternatively, washing may be performed at 42 ° C.

Специалисту в данной области техники известно, какие условия применяются в жестких и условиях высокой жесткости гибридизации. Дополнительным руководством относительно таких условий является легко доступное в данной области техники, например, в ЗатЬгсюк и др., 1989, ΜοΕαιΕίΓ Οοηίη§, А ΕηόοгаЮгу Мапиа1, Со1б 8рппд ΗπιΓογ Ргекк, Ν.Υ.; и АикиЬе1 и др. (ебк.), 1995, Ситтеп! Р^οΐοсο1κ ίη ΜοΕαιΕίΓ ВюЕду, (.^кп \УПеу & δο^, Ν.Υ.).One skilled in the art knows which conditions apply under stringent and high stringency hybridization conditions. Additional guidance on such conditions is readily available in the art, for example, in Zatgsiuk et al., 1989, ΜοΕαιΕίΓ Οοηίη§, and ΕηόοгаУгу Мапия1, Со1б 8рппд ΗπιΓογ Регекк, Ν.Υ .; and AikiLe1 et al. (ebk.), 1995, Sittep! P ^ οΐοсο1κ ίη ΜοΕαιΕίΓ VyuEdu, (. ^ Kp \ UPeu & δο ^, Ν.Υ.).

Конечно, полинуклеотид, который гибридизуется только с поли(А) последовательностью (такой как 3' терминальный поли(А) участок мРНК), или с комплементарным фрагментом Т (И) остатков, не может быть включен в полинуклеотид настоящего изобретения, используемый для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, поскольку такой нуклеотид будет гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей фрагмент поли(А) или комплементарный ему (например, практически любой клон двухцепочечной ДНК).Of course, a polynucleotide that hybridizes only with a poly (A) sequence (such as a 3 'terminal poly (A) mRNA region), or with a complementary fragment of T (I) residues, cannot be included in the polynucleotide of the present invention used for specific hybridization with a part of the nucleic acid of the present invention, since such a nucleotide will hybridize with any nucleic acid molecule containing a poly (A) fragment or complementary to it (for example, almost any double-stranded DNA clone).

- 8 008007- 8 008007

Получение ДНК полной длины из других организмовObtaining full-length DNA from other organisms

В обычном подходе кДНК библиотеки конструируют из других организмов, например, мицельных грибов, в частности может быть проведен скрининг из видов АкрегдШик.In the usual approach, cDNA libraries are constructed from other organisms, for example, mycelium fungi, in particular, screening from AkregdShik species can be carried out.

Например, штаммы АкретдШик могут быть скринированы для гомологичных полинуклеотидов Нозерн-блот анализом. При обнаружении транскриптов, гомологичных полинуклеотидам согласно настоящему изобретению, кДНК библиотеки могут быть сконструированы из РНК, выделенной из подходящего штамма с использованием стандартных техник, хорошо известных специалистам в данной области техники. В качестве альтернативы может быть скринирована полная библиотека геномной ДНК с использованием зонда, гибридизуемого с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению.For example, Accret Shik strains can be screened for homologous polynucleotides by Northern blot analysis. Upon detection of transcripts homologous to the polynucleotides of the present invention, cDNA libraries can be constructed from RNA isolated from a suitable strain using standard techniques well known to those skilled in the art. Alternatively, a complete library of genomic DNA can be screened using a probe hybridizable to the polynucleotide of the present invention.

Гомологичные последовательности генов могут быть выделены, например, путем выполнения ПЦР с использованием двух пулов праймеров вырожденных олигонуклеотидов, разработанных на основе нуклеотидных последовательностей в качестве примера настоящего описания.Homologous gene sequences can be isolated, for example, by performing PCR using two primer pools of degenerate oligonucleotides developed on the basis of nucleotide sequences as an example of the present description.

Матрицей для реакции может быть кДНК, полученная при помощи обратной транскрипции мРНК, приготовленной из штаммов известных или предполагаемых как экспрессирующие полинуклеотид согласно настоящему изобретению. Продукт ПЦР может быть субклонирован и секвенирован для гарантии, что амплифицированные последовательности представляют собой последовательности новой РЬР03 последовательности нуклеиновой кислоты или ее функциональный эквивалент.The matrix for the reaction may be cDNA obtained by reverse transcription of mRNA prepared from strains known or suspected of expressing a polynucleotide according to the present invention. The PCR product can be subcloned and sequenced to ensure that the amplified sequences are the sequences of the new PbP03 nucleic acid sequence or its functional equivalent.

Затем может быть использован ПЦР фрагмент для выделения кДНК клона полной длины при помощи множества известных способов. Например, амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга бактериофага или космидной кДНК библиотеки. В качестве альтернативы, может быть использован меченый фрагмент для скрининга геномной библиотеки.Then, a PCR fragment can be used to isolate the full length clone cDNA using a variety of known methods. For example, an amplified fragment can be labeled and used for screening a bacteriophage or cosmid cDNA library. Alternatively, a labeled fragment can be used to screen the genomic library.

Технология ПЦР может быть использована для выделения последовательностей кДНК полной длины из других организмов. Например, РНК может быть выделена следующими ниже стандартными процедурами из подходящего клеточного или тканевого источника. Реакция обратной транскрипции может быть выполнена на РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфичного для наибольшего 5' конца амплифицированного фрагмента для праймирования первого стандартного синтеза.PCR technology can be used to isolate full-length cDNA sequences from other organisms. For example, RNA can be isolated by the following standard procedures from a suitable cellular or tissue source. The reverse transcription reaction can be performed on RNA using an oligonucleotide primer specific for the largest 5 ′ end of the amplified fragment to prime the first standard synthesis.

Полученный в результате гибрид РНК/ДНК затем может быть терминирован (например, гуанинами) с использованием стандартной реакции терминальной трансферазы, гибрид может быть расщеплен РНКазой Н, и затем может быть праймирован вторым стандартным синтезом (например, поли-С праймером). Таким образом, последовательности кДНК выше амплифицированного фрагмента могут быть легко выделены. Для обзора пригодных стратегий клонирования см., например, 8ашЬтоок и др., указаного выше; и Лн5нЬе1 и др., указанного выше.The resulting RNA / DNA hybrid can then be terminated (e.g. with guanines) using a standard terminal transferase reaction, the hybrid can be digested with RNase H, and then primed with a second standard synthesis (e.g. poly-C primer). Thus, cDNA sequences above the amplified fragment can be easily isolated. For a review of suitable cloning strategies, see, for example, Sambox et al., Cited above; and Ln5nbe1 et al., supra.

ВекторыVectors

Другой аспект настоящего изобретения имеет отношение к векторам, предпочтительно векторам экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок согласно настоящему изобретению или его функциональный эквивалент. Как используется в настоящем описании, термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, к которой она присоединена. Один тип вектора является плазмидой, которая относится к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть вшиты дополнительные ДНК сегменты. Другой тип вектора является вирусным вектором, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть вшиты в вирусный геном. Некоторые векторы способны автономно реплицироваться в клетке хозяина, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный источник репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируют в геном клетки хозяина при введении в клетку хозяина, и таким образом, реплицируют в направлении генома хозяина. Более того, некоторые векторы способны к направленной экспрессии генов, к которым они оперативно присоединены. Такие векторы относятся в настоящем описании к векторам экспрессии. В общем случае, векторы экспрессии, полезные в рекомбинантных техниках ДНК, часто находятся в виде плазмид. Термины плазмида и вектор могут быть использованы взаимозаменяемо в настоящем описании, поскольку плазмида является наиболее обычно используемой формой вектора. Однако настоящее изобретение включает в себя другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, ретровирусы с поврежденной репликацией, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые служат эквивалентным функциям.Another aspect of the present invention relates to vectors, preferably expression vectors, containing a nucleic acid encoding a protein of the present invention or a functional equivalent thereof. As used herein, the term vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is attached. One type of vector is a plasmid, which refers to a loop of circular double-stranded DNA into which additional DNA segments can be inserted. Another type of vector is a viral vector in which additional segments of DNA can be inserted into the viral genome. Some vectors are capable of autonomously replicating in the host cell into which they are introduced (for example, bacterial vectors having a bacterial replication source and episomal mammalian vectors). Other vectors (e.g., non-episomal mammalian vectors) integrate into the genome of the host cell when introduced into the host cell, and thus replicate towards the host genome. Moreover, some vectors are capable of directed expression of the genes to which they are operatively linked. Such vectors are referred to herein as expression vectors. In general, expression vectors useful in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids. The terms plasmid and vector can be used interchangeably in the present description, since the plasmid is the most commonly used form of the vector. However, the present invention includes other forms of expression vectors, such as viral vectors (e.g., damaged replication retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses) that serve equivalent functions.

Рекомбинантные векторы экспрессии настоящего изобретения содержат нуклеиновую кислоту настоящего изобретения в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке хозяина, что означает, что рекомбинантный вектор экспрессии включает в себя одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных из оснований клеток хозяина, предназначенных для экспрессии, которые оперативно связываются с нуклеиновой последовательностью, предназначенной для экспрессии. В пределах рекомбинантного вектора экспрессии эффективно связанный предназначен для обозначения, что интересующая нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью(последовательностями) способом, который позволяет экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в ίη νίίτο системе транскрипции/трансляции или в клетке хозяина, если вектор введен в клетку хозяина). Термин регуляторная последовательность включает в себя промоторы, энхансеры иThe recombinant expression vectors of the present invention contain the nucleic acid of the present invention in a form suitable for expression of the nucleic acid in the host cell, which means that the recombinant expression vector includes one or more regulatory sequences selected from the bases of the host cells for expression, which are operatively bind to a nucleic acid sequence for expression. Within a recombinant expression vector, efficiently linked is intended to indicate that the nucleotide sequence of interest is linked to the regulatory sequence (s) in a manner that allows expression of the nucleotide sequence (for example, in the transcription / translation system or in the host cell, if the vector is introduced into the host cell ) The term regulatory sequence includes promoters, enhancers and

- 9 008007 другие элементы управления экспрессией (например, сигнал полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Соеббе1; Сепе Ехргекк1оп ТесЬпокду: МеШобк ίη Епхутокду 185, Асабетк Ргекк, 8аи О|едо. СА (1990). Регуляторные последовательности включают в себя такие, которые управляют конститутивной или индуцируемой экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток хозяина, и такими, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в некоторых клетках хозяина (например, тканеспецифические регуляторные последовательности).- 9 008007 other expression control elements (e.g., polyadenylation signal). Such regulatory sequences are described, for example, in Soebbe1; Sepe Exrgekkop Tespokdu: Mesobk ίη Ephutokdu 185, Asabetk Rgekk, 8ai and | CA (1990). Regulatory sequences include those that control the constitutive or inducible expression of the nucleotide sequence in many types of host cells, and those that control the expression of the nucleotide sequence in only certain host cells (e.g., tissue-specific regulatory sequences).

Специалистам в данной области техники будет очевидно, что разработка вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки хозяина, предназначенной для трансформации, уровня экспрессии желаемого белка и т.п. Векторы экспрессии настоящего изобретения могут быть введены в клетку хозяина, таким образом, для продуцирования белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, как изложено в настоящем описании (например, липолитических ферментов, мутированных липолитических ферментов, их фрагментов, вариантов или их функциональных эквивалентов, слитых белков и т.п.).It will be apparent to those skilled in the art that the development of an expression vector may depend on factors such as the choice of host cell to be transformed, the expression level of the desired protein, and the like. The expression vectors of the present invention can be introduced into the host cell, thus, for the production of proteins or peptides encoded by nucleic acids, as described herein (for example, lipolytic enzymes, mutated lipolytic enzymes, fragments thereof, variants or functional equivalents thereof, fusion proteins etc.).

Рекомбинантные векторы экспрессии настоящего изобретения могут быть разработаны для экспрессии липолитических ферментов в прокариотических или эукариотических клетках. Например, белок согласно настоящему изобретению может быть экспрессирован в бактериальных клетках, таких как Е. сой и ВасШик крескк, клетках насекомых (с использованием векторов экспрессии бакуловируса), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Соответствующие клетки хозяина дополнительно обсуждены в Соеббе1, Сепе Ехргекккп Тес1по1оду: Мебюбк ίη Епхуто1оду 185, Асабетк Ргекк, 8ап Экдо, СА (1990). В качестве альтернативы рекомбинантный вектор экспрессии может быть транскрибирован и транслирован ίη νίϋΌ, например, с использованием Т7 регуляторных последовательностей промотора и Т7 полимеразы.Recombinant expression vectors of the present invention can be designed to express lipolytic enzymes in prokaryotic or eukaryotic cells. For example, the protein of the present invention can be expressed in bacterial cells, such as E. soy and Vaschik kraskk, insect cells (using baculovirus expression vectors), yeast cells, or mammalian cells. Corresponding host cells are further discussed in Soebbe1, Sep Exhrkkkp Tes1poodu: Mebubk ίη Ephutoodu 185, Asabetk Rgekk, 8ap Ekdo, CA (1990). Alternatively, the recombinant expression vector can be transcribed and translated ίη νίϋΌ, for example, using the T7 regulatory sequences of the promoter and T7 polymerase.

Векторы экспрессии, пригодные в настоящем изобретении, включают хромосомные, эписомные и вирусные векторы, например, векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофага, эписомы дрожжей, хромосомных элементов дрожжей, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы, полученные из их комбинаций, таких как полученные из плазмиды и генетических элементов бактериофага, таких как космиды и фагемиды.Expression vectors suitable in the present invention include chromosomal, episomal and viral vectors, for example, vectors derived from bacterial plasmids, bacteriophage, yeast episomes, chromosomal yeast elements, viruses such as baculoviruses, papovaviruses, vaccinia viruses, adenoviruses, smallpox viruses birds, pseudorabies viruses and retroviruses, and vectors derived from combinations thereof, such as those derived from plasmids and bacteriophage genetic elements such as cosmids and phagemids.

Вставка ДНК должна быть оперативно связана с подходящим промотором, таким как РЬ промотор лямбда фага, 1ас Е.сой, промоторы 1гр и 1ас, 8У40 ранний и поздний промоторы и промоторы ЬТК ретровируса, что приведено в качестве некоторых примеров. Специалисту в данной области техники хорошо известны другие подходящие промоторы. В определенном варианте осуществления промоторы предпочтительно являются такими, которые способны управлять высоким уровнем экспрессии липолитических ферментов в мицельных грибах. Такие промоторы известны в данной области техники. Конструкции экспрессии могут содержать сайты инициации транскрипции, терминации, а в транскрибируемых областях - сайт связывания с рибосомой для трансляции. Часть кодирования зрелых транскриптов, экспрессируемых при помощи конструкции, включает в себя АИС, инициирующий трансляцию, в начале и кодон терминации, расположенный соответственно в конце полипептида, предназначенного для трансляции.The DNA insert should be operatively linked to a suitable promoter, such as the Pb lambda phage promoter, 1ac E. coi, 1gr and 1ac promoters, 8Y40 early and late promoters and LTK retrovirus promoters, which are given as some examples. Other suitable promoters are well known to those skilled in the art. In a specific embodiment, the promoters are preferably those that are capable of controlling the high level of expression of lipolytic enzymes in mycelial fungi. Such promoters are known in the art. Expression constructs may contain transcription, termination, and, in transcribed regions, a ribosome binding site for translation. Part of the coding for mature transcripts expressed by the construct includes an AIS that initiates translation at the beginning and a termination codon located respectively at the end of the translation polypeptide.

Вектор ДНК может быть введен в прокариотические или эукариотические клетки посредством обычных техник трансформации или трансфекции. Как использовано в настоящем описании, термины трансформация и трансфекция предназначены для обозначения различных техник, известных в данной области техники, для введения чужой нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку хозяина, включающую в себя преципитацию фосфатом кальция или хлоридом кальция, ЭЕАЕ-декстранопосредованную трансфекцию, трансдукцию, инфекцию, липофекцию, трансфекцию с катионными липидами, или электропорацию. Подходящие способы для трансформации или трансфекции клеток хозяина могут быть найдены в 8атЬгоок и др. (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаГогу Мапиа1, 2^пб, еб. Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогакгу, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогакгу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ, 1989), ΟπνΕ и др., Вакк Мебюбк ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1986) и в других лабораторных руководствах.The DNA vector can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells using conventional transformation or transfection techniques. As used herein, the terms transformation and transfection are intended to refer to various techniques known in the art for introducing foreign nucleic acid (e.g., DNA) into a host cell, including precipitation with calcium phosphate or calcium chloride, EEAE-dextran-mediated transfection transduction, infection, lipofection, transfection with cationic lipids, or electroporation. Suitable methods for transforming or transfecting host cells can be found in 8atgook et al (Mo1esi1ag S1oshpd: A aogaGogu Mapia1, 2 ^pb, ee So1b 8rppd Nagog aogakgu, So1b 8rgshd Nagog aogakgu Rgekk, So1b 8rppd Nagog, ΝΥ, 1989.)., ΟπνΕ et al., Wack Mebubk ίη Mo1eci1ag Vu1odu (1986) and other laboratory manuals.

Для стабильной трансфекции клеток млекопитающих известно, что в зависимости от используемых вектора экспрессии и техники трансфекции, только небольшая фракция клеток может интегрировать чужую ДНК в свой геном. Для идентификации и отбора таких интегрантов, обычно в клетки хозяина вместе с интересующим геном вводят ген, кодирующий селектируемый маркер (например, устойчивый к антибиотикам). Предпочтительные селектируемые маркеры включают такие, которые предоставляют устойчивость к лекарственным веществам, таким как С418, гигромицин и метатриксат. Нуклеиновую кислоту, кодирующую селектируемый маркер, предпочтительно вводят в клетку хозяина на тот же самый вектор, который кодирует белок согласно настоящему изобретению или могут ввести на отдельный вектор. Клетки, стабильно трансфецируемые введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы при помощи отбора лекарственным препаратом (например, клетки, которые имеют встроенный ген селектируемого маркера, будут выживать, в то время как другие клетки вымрут).For stable transfection of mammalian cells, it is known that, depending on the expression vector and transfection technique used, only a small fraction of cells can integrate foreign DNA into its genome. To identify and select such integrants, usually a gene encoding a selectable marker (for example, resistant to antibiotics) is introduced into the host cells with the gene of interest. Preferred breeding markers include those that provide resistance to drug substances such as C418, hygromycin and metatrixate. A nucleic acid encoding a selectable marker is preferably introduced into the host cell on the same vector that encodes a protein according to the present invention or can be introduced on a separate vector. Cells stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified by drug selection (for example, cells that have an integrated selectable marker gene will survive while other cells die out).

Экспрессию белков в прокариотах часто осуществляют в векторах Е. сой, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, управляющие экспрессией либо слитых, либо неслитых белков.The expression of proteins in prokaryotes is often carried out in E. soy vectors containing constitutive or inducible promoters that control the expression of either fusion or non-fusion proteins.

- 10 008007- 10 008007

Слитые векторы добавляют некоторое количество аминокислот в белок, кодируемый ими, например, к амино концу рекомбинантного белка. Такие слитые векторы обычно служат для трех целей: 1) для увеличения экспрессии рекомбинантного белка; 2) для увеличения растворимости рекомбинантного белка; и 3) с целью очистки рекомбинантного белка путем воздействия в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто, в слитых векторах экспрессии сайт протеолитического расщепления вводят в место соединения слитой группы и рекомбинантного белка для возможного отделения рекомбинантного белка от слитой группы после очистки слитого белка. Такие ферменты, и их родственные узнаваемые последовательности, включают в себя фактор Ха, тромбин и энтерокиназу.Fusion vectors add a certain amount of amino acids to the protein encoded by them, for example, to the amino terminus of a recombinant protein. Such fusion vectors usually serve three purposes: 1) to increase the expression of a recombinant protein; 2) to increase the solubility of the recombinant protein; and 3) for the purification of a recombinant protein by exposure as a ligand in affinity purification. Often, in fusion expression vectors, the proteolytic cleavage site is introduced at the junction of the fusion group and the recombinant protein to possibly separate the recombinant protein from the fusion group after purification of the fusion protein. Such enzymes, and their related recognizable sequences, include factor Xa, thrombin, and enterokinase.

Как указано, векторы экспрессии предпочтительно могут содержать селектируемые маркеры. Такие маркеры включают дигидрофолат редуктазу или устойчивость к неомицину для культуры эукариотических клеток и устойчивость к тетрацилину или ампициллину для культивирования в Е. сой и других бактериях. Представленные примеры подходящих хозяев включают в себя бактериальные клетки, такие как Е. сой, 8!гер!отусек и 8а1топе11а !урй1тигшт; клетки грибов, таких как дрожжи; клетки насекомых, таких как Эгокорййа 82 и 8робор!ега 8Г9; клетки животных, такие как СНО, С08 и меланомы Вотек; и клетки растений. Подходящие культуральные среды и условия для выше описанных клеток хозяина известны специалистам в данной области техники.As indicated, expression vectors may preferably contain selectable markers. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture and tetracycline or ampicillin resistance for cultivation in E. soybean and other bacteria. Presented examples of suitable hosts include bacterial cells, such as E. soy, 8! Ger! Otus and 8a1top11a! Urty1sht; fungal cells such as yeast; insect cells such as Egokoryya 82 and 8boron! ega 8G9; animal cells such as CHO, C08 and Votek melanoma; and plant cells. Suitable culture media and conditions for the host cells described above are known to those skilled in the art.

Среди векторов предпочтительными для использования в бактериях являются рЦЕ70, рЦЕ60 и РОЕ-9, доступные от Ц1адеп; рВ8 векторы, Рйадекспр! векторы, В1иекспр! векторы, рNΗ8А, рNΗ16А, рNΗ18А, рNΗ46А, доступные от 8!га!адепе; и р!гс99а рКК223-3, рКК233-3, рЭЯ540, рЯГГ5, доступные от РНагтааа. Среди предпочтительных эукариотических векторов - Р\\'ЪКР0 р8У2САТ р0044 р2Т1 и р8О, доступные от 8!га!адепе; и р8УК3, рВРУ, рМ8О и р8УЪ, доступные от Рйагташа. Другие подходящие векторы могут быть легко очевидными для специалистов в данной области техники.Among the vectors, pCE70, pCEE60 and POE-9, available from C1adep, are preferred for use in bacteria; RV8 vectors, Ryadekspr! vectors, B1expr! vectors, pNΗ8A, pNΗ16A, pNΗ18A, pNΗ46A, available from 8! ha! adepe; and r! gs99a rKK223-3, rKK233-3, rEYA540, rYAGG5, available from RNagtaaa. Among the preferred eukaryotic vectors are P \\ bKP0 p8U2CAT p0044 p2T1 and p8O, available from 8! Ha! Adepe; and p8UK3, pVRU, pM8O and p8U3, available from Ryagtash. Other suitable vectors may be readily apparent to those skilled in the art.

Известные бактериальные промоторы для использования в настоящем изобретения включают в себя 1ас1 и 1ас2 промоторы Е.сой, Т3 и Т7 промоторы, др! промотор, лямбда РЯ, РЬ промоторы и !рг промотор, промотор тимидин киназы Η8ν, 8У40 ранние и поздние промоторы, ЬТЯ промоторы ретровируса, такого как вируса саркомы Рауса ('Έ8ν), промоторы металлотионина, такие как промотор металлотионина-Ι мыши.Known bacterial promoters for use in the present invention include the 1ac1 and 1ac2 E.soy promoters, T3 and T7 promoters, etc. the promoter, lambda Pb, Pb promoters and! pg promoter, thymidine kinase promoter Η8ν, 8У40 early and late promoters, bTH promoters of retrovirus, such as Routh sarcoma virus (Έ Έ8ν), metallotionin promoters, such as mouse metallothionine promoter.

Вставка энхансерной последовательности в вектор может увеличить транскрипцию ДНК, кодирующую полипептиды настоящего изобретения у высших эукариот. Энхансеры являются цисдействующими элементами ДНК, обычно примерно от 10 до 300 п.н., которые действуют для увеличения транскрипционной активности промотора в данном типе клетки хозяина. Примеры энхансеров включают 8ν40 энхансер, который расположен на дальней по отношению к началу репликации стороне на от п. н. 100 до 270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на дальней по отношению к началу репликации стороне и энхансеры аденовирусов.The insertion of an enhancer sequence into a vector can increase the transcription of DNA encoding the polypeptides of the present invention in higher eukaryotes. Enhancers are cis-acting DNA elements, usually from about 10 to 300 bp, which act to increase the transcriptional activity of a promoter in a given type of host cell. Examples of enhancers include the 8ν40 enhancer, which is located on the side furthest from the start of replication. 100 to 270, enhancer of the early promoter of cytomegalovirus, enhancer of the polyoma on the far side with respect to the beginning of replication, and enhancers of adenoviruses.

Для секреции транслированного белка в просвет эндоплазматического ретикулума, в пространство периплазмы или в окружающую среду вне клетки, в эспрессируемый полипептид может быть вставлен подходящий сигнал секреции. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида или они могут быть гетерологичными сигналами.For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasm space or into the environment outside the cell, a suitable secretion signal can be inserted into the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

Полипептид может быть экспрессирован в модифицированном виде, таком как слитый белок, и может включать в себя не только сигналы секреции, а также дополнительные гетерологичные функциональные области. Таким образом, например, область дополнительных аминокислот, частично измененных аминокислот, может быть добавлена к Ν-концу полипептида для улучшения стабильности и персистенции в клетке хозяина, во время очистки или во время последующей обработки и хранения. Также для облегчения очистки к полипептиду могут быть добавлены пептидные группы.The polypeptide may be expressed in a modified form, such as a fusion protein, and may include not only secretion signals, but also additional heterologous functional regions. Thus, for example, a region of additional amino acids, partially altered amino acids, can be added to the Ν-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell, during purification or during subsequent processing and storage. Also, peptide groups can be added to the polypeptide to facilitate purification.

Полипептиды согласно настоящему изобретениюPolypeptides of the Invention

Настоящее изобретение представляет выделенные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, аминокислотную последовательность, получаемую путем экспрессии полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 34, 35, 37 и 38 в подходящем хозяине. Также пептид или полипептид, содержащий функциональный эквивалент выше указанных полипептидо, включен в настоящее изобретение. Выше указанные полипептиды совместно включены в термин полипептиды согласно настоящему изобретению.The present invention provides isolated polypeptides having an amino acid sequence selected from the group consisting of 8EO ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, and 39, the amino acid sequence obtained by expression of a polynucleotide selected from the group consisting of 8EO ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 34, 35, 37 and 38 in a suitable host. Also, a peptide or polypeptide containing a functional equivalent of the above polypeptides is included in the present invention. The above polypeptides are collectively included in the term polypeptides of the present invention.

Термины пептид и олигопептид считаются синонимами (что является общепризнанным) и каждый термин может быть использован взаимозаменяемо, как требуется по контексту, для указания цепи, по меньшей мере, из двух аминокислот, связанных пептидными связями. Слово полипептид используется в настоящем описании для цепей, содержащих более семи аминокислотных остатков. Все формулы или последовательности олигопептидов и пептидов в настоящем описании написаны слева направо и в направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Однобуквенный код аминокислот, используемый в настоящем описании, обычно известен специалистам в данной области техники и может быть найден в 8атЬгоок и др. (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2^пб, еб. Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8ргшд НагЬог, NΥ, 1989).The terms peptide and oligopeptide are considered synonyms (which is universally recognized) and each term can be used interchangeably, as required by context, to indicate a chain of at least two amino acids linked by peptide bonds. The word polypeptide is used in the present description for chains containing more than seven amino acid residues. All formulas or sequences of oligopeptides and peptides in the present description are written from left to right and in the direction from the amino terminus to the carboxyl end. The one-letter code of amino acids used herein is commonly known to those skilled in the art and can be found in 8atgook et al (Mo1esi1ag S1oshpd:.! A aoga OSU Mapia1, 2 ^pb, ee So1b 8rgshd Nagog aoga OSU, So1b 8rgshd Nagog.! Lebogo ogu Rheck, Co1b 8rgd Nagbog, NΥ, 1989).

Под выделенным полипептидом или белком подразумевается полипептид или белок, удаленныйBy an isolated polypeptide or protein is meant a polypeptide or protein deleted

- 11 008007 из его естественного окружения. Например, рекомбинантно продуцируемые полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках хозяина, считаются выделенными для цели настоящего изобретения, поскольку являются природными или рекомбинантными полипептидами, которые были по существу очищены любым подходящим способом, таким как, например, способ одноэтапной очистки, описанный в διηίΐΐι и 1ойп8оп, Сепе 67:31-40 (1988) .- 11 008007 from its natural surroundings. For example, recombinantly produced polypeptides and proteins expressed in host cells are considered isolated for the purpose of the present invention because they are natural or recombinant polypeptides that have been essentially purified by any suitable method, such as, for example, the one-step purification method described in διηίΐΐι and 1пп8оп Sepe 67: 31-40 (1988).

Липолитический фермент согласно настоящему изобретению может быть восстановлен и очищен из рекомбинантных клеточных культур при помощи хорошо известных способов, включающих в себя преципитацию сульфатом аммония или спиртом, экстракцию кислотой, анион- или катион-обменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобных взаимодействий, афинную хроматографию, хроматографию с гидроксиапатитом и хроматографию на лектине. Наиболее предпочтительно для очистки используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).The lipolytic enzyme according to the present invention can be restored and purified from recombinant cell cultures using well-known methods, including precipitation with ammonium sulfate or alcohol, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, chromatography on phosphocellulose, chromatography of hydrophobic interactions, affinity chromatography hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography. Most preferably, high performance liquid chromatography (HPLC) is used for purification.

Полипептиды настоящего изобретения включают очищенные естественным путем продукты, продукты способов химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными техниками от прокариотического или эукариотического хозяина, включающего, например, бактериальные дрожжевые клетки, клетки высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от используемого хозяина в способе получения рекомбинанта полипептиды настоящего изобретения могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Дополнительно, полипептиды настоящего изобретения могут также включать исходно модифицированный остаток метионина, в некоторых случаях, как результат процессов опосредованных хозяином.The polypeptides of the present invention include naturally purified products, products of chemical synthesis methods and products obtained by recombinant techniques from a prokaryotic or eukaryotic host, including, for example, bacterial yeast cells, cells of higher plants, insects and mammals. Depending on the host used in the recombinant production method, the polypeptides of the present invention may be glycosylated or may be non-glycosylated. Additionally, the polypeptides of the present invention may also include an initially modified methionine residue, in some cases, as a result of host-mediated processes.

Липолитический фермент согласно настоящему изобретению может быть преимущественно использован в хлебопекарных процессах. Количество фермента, которое должно быть добавлено в тесто, определяют эмпирически. Это может зависеть от качества используемой муки, степени улучшения, которая требуется, вида хлеба или печеных изделий, способа приготовления теста, пропорции других ингредиентов и т. д.The lipolytic enzyme according to the present invention can be advantageously used in baking processes. The amount of enzyme to be added to the dough is determined empirically. This may depend on the quality of the flour used, the degree of improvement that is required, the type of bread or baked goods, the method of preparation of the dough, the proportion of other ingredients, etc.

Фрагменты белковProtein fragments

Отличительными особенностями настоящего изобретения являются биологически активные фрагменты полипептидов согласно настоящему изобретению.Distinctive features of the present invention are biologically active fragments of the polypeptides according to the present invention.

Биологически активные фрагменты полипептида согласно настоящему изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, в достаточной степени идентичные или полученные из аминокислотной последовательности липолитического фермента (например, аминокислотная последовательность, выбранная из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39), которая включает в себя меньше аминокислот, чем белок полной длины, и проявляет по меньшей мере одну биологическую активность соответствующего белка полной длины. Обычно биологически активные фрагменты содержат домен или основу по меньшей мере одной с активностью соответствующего белка полной длины.Biologically active fragments of the polypeptide according to the present invention include polypeptides containing amino acid sequences that are sufficiently identical or derived from the amino acid sequence of a lipolytic enzyme (for example, an amino acid sequence selected from the group consisting of 8EO GO N0: 3, 6, 9, 12, 15 (18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, and 39), which includes less amino acids than the full-length protein, and exhibits at least one biological activity of the corresponding full-length protein. Typically, biologically active fragments contain a domain or base of at least one with the activity of the corresponding full-length protein.

Биологически активный фрагмент белка согласно настоящему изобретению может быть полипептидом, который, например, представляет собой в длину 10, 25, 50, 100 или более аминокислот. Более того, другие биологически активные части, в которых удалены другие области белка, могут быть приготовлены при помощи рекомбинантных техник и оценены для одной или более биологических активностей природной формы полипептида настоящего изобретения.The biologically active fragment of the protein according to the present invention may be a polypeptide, which, for example, is a length of 10, 25, 50, 100 or more amino acids. Moreover, other biologically active parts in which other regions of the protein have been removed can be prepared using recombinant techniques and evaluated for one or more biological activities of the natural form of the polypeptide of the present invention.

Отличительными особенностями настоящего изобретения также являются фрагменты нуклеиновых кислот, которые кодируют выше описанные биологически активные фрагменты липолетического ферментативного белка.Distinctive features of the present invention are also nucleic acid fragments that encode the above-described biologically active fragments of a lipolytic enzymatic protein.

Слитые белкиFusion proteins

Белки настоящего изобретения или их функциональные эквиваленты, например, их биологически активные части, могут быть эффективно присоединены к нелиполитическому ферментативному полипептиду (например, гетерологичные аминокислотные последовательности) для образования слитых белков. Как используется в настоящем описании, химерный белок или слитый белок липолитического фермента содержит липолитический ферментативный белок, оперативно связанный с нелиполитическим ферментативным белком. Липолитический ферментативный полипептид относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, тогда как нелиполитический ферментативный полипептид относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую белку, который не является по существу гомологичным липолитическому ферменту, например, белку, который отличается от липолитического фермента и который получен из того же самого или другого организма. В липолитическом ферментативном слитом белке липолитический ферментативный полипептид может соответствовать всему или части липолитического ферментативного белка. В предпочтительном варианте осуществления липолитический ферментативный слитый белок содержит по меньшей мере один биологически активный фрагмент липолитического ферментативного белка. В другом предпочтительном варианте осуществления липолитический ферментативный слитый белок содержит по меньшей мере две биологически активные части липолитического ферментативного белка. В слитом белке термин эффекThe proteins of the present invention or their functional equivalents, for example, their biologically active parts, can be efficiently attached to a non-lipolytic enzymatic polypeptide (for example, heterologous amino acid sequences) to form fusion proteins. As used herein, a chimeric protein or lipolytic enzyme fusion protein comprises a lipolytic enzymatic protein operably linked to a non-lipolytic enzymatic protein. A lipolytic enzymatic polypeptide refers to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of 8EO GO N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39, while non-political Enzymatic polypeptide refers to a polypeptide having an amino acid sequence corresponding to a protein that is not substantially homologous to a lipolytic enzyme, for example, a protein that is different from a lipolytic enzyme and which is derived from the same or another organism. In a lipolytic enzymatic fusion protein, the lipolytic enzymatic polypeptide may correspond to all or part of the lipolytic enzymatic protein. In a preferred embodiment, the lipolytic enzymatic fusion protein comprises at least one biologically active fragment of the lipolytic enzymatic protein. In another preferred embodiment, the lipolytic enzymatic fusion protein comprises at least two biologically active parts of the lipolytic enzymatic protein. In fusion protein, the term effec

- 12 008007 тивно связанный предназначен для обозначения того, что липолитический ферментативный полипептид и нелиполитический ферментативный полипептид соединены друг с другом с сохранением рамки считывания. Нелиполитический ферментативный полипептид может быть присоединен к Ν-концу или С-концу липолитического ферментативного полипептида.- 12 008007 active binding is intended to indicate that the lipolytic enzymatic polypeptide and the non-lipolytic enzymatic polypeptide are connected to each other while maintaining the reading frame. The non-lipolytic enzymatic polypeptide may be attached to the Ν-terminus or C-terminus of the lipolytic enzymatic polypeptide.

Например, в одном из вариантов осуществления слитый белок является С8Т липолитическим ферментативным слитым белком, в котором липолитическая ферментативная последовательность присоединена к С-концу С8Т последовательности. Такие слитые белки могут облегчить очистку рекомбинантного липолитического фермента(ферментов). В другом варианте осуществления слитый белок является липолитическим ферментативным белком, содержащим гетерологичную сигнальную последовательность на Ν-конце. В некоторых клетках хозяина (например, клетках хозяина млекопитающих и дрожжей) экспрессия и/или секреция липолитического фермента может быть увеличена путем использования гетерологичной сигнальной последовательности.For example, in one embodiment, the fusion protein is a C8T lipolytic enzymatic fusion protein in which the lipolytic enzymatic sequence is attached to the C-terminus of the C8T sequence. Such fusion proteins may facilitate the purification of the recombinant lipolytic enzyme (s). In another embodiment, the fusion protein is a lipolytic enzymatic protein containing a heterologous signal sequence at the конце-terminus. In some host cells (e.g., mammalian and yeast host cells), expression and / or secretion of a lipolytic enzyme can be increased by using a heterologous signal sequence.

В другом примере др67 секреторная последовательность белка оболочки бакуловируса может быть использована в качестве гетерологичной сигнальной последовательности (Ситгеи! Рто1оео18 ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν. Ли8иЬе1 и др., 1о1ш \Убеу & 8оп5. 1992). Другие примеры гетерологичной сигнальной последовательности эукариот включают в себя секреторные последовательности мелиттина и плацентарной алкалин фосфатазы человека (81та1адепе; Ьа 1о11а, Калифорния). В еще одном примере пригодные гетерологичные сигнальные последовательности прокариот включают в себя р1юА секреторный сигнал (8ашЬтоок и др., указанный выше) и секреторный сигнал протеина А (Рйатшаша Вю1ес11; Р18са1а^ау, Νο\ν 1ет§еу).In another example, d67, the secretory sequence of the baculovirus envelope protein can be used as a heterologous signal sequence (Sitgei! Ptoleo18 ίη Mo1eci1ag Βίοίοβν. Li8uBe1 et al., 1o1sh \ Ubeu & 8op5. 1992). Other examples of the heterologous eukaryotic signal sequence include the secretory sequences of human melittin and placental alkaline phosphatase (81ta1 adepe; La 1-11a, California). In yet another example, suitable heterologous prokaryotic signal sequences include a p1yuA secretory signal (8AbOtok et al., Above) and a protein A secretory signal (Ryatshasha Vy1es11; P18ca1a ^ ay, \ο \ ν 1еtееу).

Сигнальная последовательность может быть использована для облегчения секреции и выделения белка или полипептида настоящего изобретения. Сигнальная последовательность обычно характеризуется кором гидрофобных аминокислот, которые обычно отрезаются от белка во время секреции за одно или несколько отрезаний. Такие сигнальные пептиды содержат сайты процессинга, которые позволяют отрезать сигнальную последовательность от созревших белков, пока они проходят путь секреции. Сигнальная последовательность управляет секрецией белка, такого как из эукариотической клетки хозяина, в которую трансформируют вектор экспрессии, и сигнальная последовательность последовательно или одновременно отрезается. Затем белок может быть быстро очищен от внеклеточной среды при помощи известных в данной области техники способов. В качестве альтернативы, сигнальная последовательность может быть присоединена к интересующему белку с использованием последовательности, которая легко очищается, к такой как с С8Т доменом. Таким образом, например, последовательность, кодирующая полипептид, может быть слита с последовательностью маркера, такой как последовательность, кодирующая пептид, который облегчает очистку слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления такого аспекта настоящего изобретения последовательность маркера является пептидом гексагистидина, таким как 1ад, предоставляемый в рЦЕ векторе (Ц1адеп, 1пс), который является одним из многих, которые коммерчески доступны. Как описано в Сеп1х и др., Ргос. №И. Асаб. 8с1 И8А 86:821-824 (1989), например, гексагистидин предоставлен для обычной очистки слитого белка. Например, НА метка является другим пептидом, пригодным для очистки, который соответствует эпитопу полученного белка гриппа гемаглютинина, который описан ^йкоп и др., Се11 37:767 (1984).The signal sequence can be used to facilitate the secretion and isolation of the protein or polypeptide of the present invention. The signal sequence is usually characterized by a core of hydrophobic amino acids, which are usually cut off from the protein during secretion in one or more cuts. Such signal peptides contain processing sites that allow the signal sequence to be cut off from mature proteins as they pass the secretion path. The signal sequence controls the secretion of a protein, such as from a eukaryotic host cell into which the expression vector is transformed, and the signal sequence is sequentially or simultaneously cut off. Then the protein can be quickly purified from the extracellular medium using methods known in the art. Alternatively, the signal sequence can be attached to the protein of interest using a sequence that is easily purified, such as with a C8T domain. Thus, for example, a sequence encoding a polypeptide can be fused to a marker sequence, such as a sequence encoding a peptide, which facilitates purification of the fusion polypeptide. In some embodiments of such an aspect of the present invention, the marker sequence is a hexahistidine peptide, such as 1 ad, provided in the pCE vector (C1adep, 1ps), which is one of many that are commercially available. As described in Sep1x et al., Proc. No. And. Asab. 8c1 I8A 86: 821-824 (1989), for example, hexahistidine is provided for routine purification of a fusion protein. For example, the HA tag is another peptide suitable for purification that corresponds to the epitope of the obtained hemaglutinin flu protein, which is described by JCop et al., Ce11 37: 767 (1984).

Предпочтительно химерный или слитый белок настоящего изобретения получают при помощи стандартных ДНК-рекомбинантных техник. Например, ДНК фрагменты, кодирующие различные полипептидные последовательности, соединены вместе с сохранением рамки считывания согласно обычным техникам, например, путем использования тупых или выступающих концов для сшивки, расщепления рестриктазами для обеспечения подходящих концов, соответственно заполнения липких концов, обработки алкалин фосфатазой для исключения нежелательных соединений и ферментативной сшивки. В другом варианте осуществления слитый белок может быть синтезирован обычными способами, включающими в себя автоматизированные ДНК синтезаторы. В качестве альтернативы, ПЦР амплификация генных фрагментов может быть осуществлена с использованием праймеров якорей, которые повышают комплементарность выступов между двумя последовательными генными фрагментами, которые затем могут быть гибридизованы и снова амплифицированы для создания химерной генной последовательности (см., например, Сштеп! РтоФсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, еб§. Аи8иЬе1 и др. 1о1ш \Убеу & 8оп§: 1992). Более того, многие векторы экспрессии являются коммерчески доступными, которые уже кодируют слитые компоненты (например, С8Т полипептид). Липолитические нуклеиновые кислоты, кодирующие фермент, могут быть клонированы в такие векторы экспрессии из условия, чтобы слитый компонент являлся связанным с сохранением рамки считывания с липолитическим ферментативным белком.Preferably, the chimeric or fusion protein of the present invention is obtained using standard DNA recombinant techniques. For example, DNA fragments encoding various polypeptide sequences are linked together with a reading frame according to conventional techniques, for example, by using blunt or protruding ends for crosslinking, restriction enzyme cleavage to provide suitable ends, respectively filling sticky ends, treating alkaline phosphatase to eliminate undesired compounds and enzymatic crosslinking. In another embodiment, the fusion protein can be synthesized by conventional methods, including automated DNA synthesizers. Alternatively, PCR amplification of gene fragments can be carried out using anchor primers that increase the complementarity of the protrusions between two consecutive gene fragments, which can then be hybridized and amplified again to create a chimeric gene sequence (see, for example, Stp! RtoFsok ίη Mo1esi1ag Wuodu, ebg. Ai8bie1 et al. Moreover, many expression vectors are commercially available that already encode fusion components (e.g., C8T polypeptide). Lipolytic nucleic acids encoding an enzyme can be cloned into expression vectors such that the fusion component is associated with maintaining a reading frame with a lipolytic enzymatic protein.

Функциональные эквивалентыFunctional Equivalents

Термины функциональные эквиваленты и функциональные варианты используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Функциональные эквиваленты ДНК, кодирующей липолитический фермент, являются выделенными фрагментами ДНК, которые кодируют полипептид, проявляющий конкретную функцию липолитического фермента АхрегдШих шдет, как изложено в настоящем описании. Функциональный эквивалент липолитического ферментативного полипептида согласно настоящему изобретению является полипептидом, который проявляет по меньшей мере одну функцию липолитического фермента АкретщПик шдет, как изложено в настоящем описании. Следовательно, функциональные эквиThe terms functional equivalents and functional variants are used interchangeably herein. The functional equivalents of the DNA encoding the lipolytic enzyme are isolated DNA fragments that encode a polypeptide that exhibits the specific function of the lipolytic enzyme Aggregdell, as described herein. The functional equivalent of the lipolytic enzymatic polypeptide according to the present invention is a polypeptide that exhibits at least one function of the lipolytic enzyme AkretchPik sits, as described in the present description. Therefore, functional equi

- 13 008007 валенты также охватывают активные фрагменты.- 13 008007 valents also cover active fragments.

Функциональные эквиваленты белка или полипептида могут содержать только консервативные замены одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях, выбранных из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 или замен, вставок или делеций несущественных аминокислот. Следовательно, несущественная аминокислота является остатком, который может быть замещен в аминокислотных последовательностях, выбранных из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 без существенных изменений биологической функции. Например, считается, что аминокислотные остатки, которые сохранены среди липолитических ферментативных белков настоящего изобретения, являются особенно устойчивыми к изменениям. Помимо этого, аминокислоты, сохраненные среди липолитических ферментативных белков согласно настоящему изобретению и других липолитических ферментов, не являются легко подверженными изменению.Functional equivalents of a protein or polypeptide may contain only conservative substitutions of one or more amino acids in amino acid sequences selected from the group consisting of 8EC ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39, or substitutions, insertions, or deletions of non-essential amino acids. Therefore, the non-essential amino acid is a residue that can be substituted in amino acid sequences selected from the group consisting of 8EC ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39 without significant changes in biological function. For example, it is believed that amino acid residues that are stored among the lipolytic enzymatic proteins of the present invention are particularly resistant to changes. In addition, amino acids stored among the lipolytic enzymatic proteins of the present invention and other lipolytic enzymes are not readily susceptible to change.

Термин защитная замена предназначен для обозначения такой замены, при которой аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, имеющим такую же боковую цепь. Такие семейства известны в данной области техники и включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин и гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспартановая кислота, глутаминовая кислота), боковыми цепями с неизмененной полярностью (например, глицин, аспарагины, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-ответвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).The term protective substitution is intended to mean a substitution in which the amino acid residue is replaced by an amino acid residue having the same side chain. Such families are known in the art and include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine and histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), unchanged polarity side chains (e.g., glycine, asparagines , glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic E side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).

Функциональные эквиваленты нуклеиновых кислот обычно могут содержать молчащие мутации или мутации, которые не изменяют биологическую функцию кодируемого полипептида. Следовательно, настоящее изобретение предоставляет молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие липолитические ферментативные белки, которые содержат изменения в аминокислотных остатках, которые не являются существенными для конкретной биологической активности. Такие липолитические ферментативные белки различаются в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 все еще сохраняя по меньшей мере одну биологическую активность. В одном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, причем белок содержит по существу гомологичную аминокислотную последовательность по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39.Functional equivalents of nucleic acids can usually contain silent mutations or mutations that do not alter the biological function of the encoded polypeptide. Therefore, the present invention provides nucleic acid molecules encoding lipolytic enzymatic proteins that contain changes in amino acid residues that are not essential for a particular biological activity. Such lipolytic enzymatic proteins differ in the amino acid sequence selected from the group consisting of 8EC ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39 while still retaining at least one biological activity. In one embodiment, the isolated nucleic acid molecule contains a nucleotide sequence encoding a protein, the protein containing a substantially homologous amino acid sequence of at least 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 % or more homologous to the amino acid sequence selected from the group consisting of 8EC ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39.

Например, руководство, относительно того, как создавать фенотипически молчащие аминокислотные замены, предоставлено в Всшае, ТИ. и др., 8с1епсе 247:1306-1310 (1990), в котором авторы указывают, что существует два основных подхода для изучения толерантности аминокислотной последовательности к изменению. Первый способ относится к процессу эволюции, в котором мутации являются либо допускаемыми, либо отбракованными естественным отбором. Второй подход использует генетическую инженерию для введения аминокислотных изменений в определенных позициях клонированного гена и отбирает или проводит скрининг для идентификации последовательностей, которые поддерживают функциональность. Как утверждают авторы, такие исследования установили, что белки являются удивительно толерантными аминокислотными веществами. Дополнительно авторы указали, какие изменения являются возможными, чтобы быть разрешенными в некоторых позициях белка. Например, для большинства внутренних аминокислотных остатков требуются неполярные боковые цепи, тогда как некоторые признаки поверхностных боковых цепей, как правило, сохраняются. Другие такие фенотипически молчащие замены описаны в Во\\зе и др., указанный выше, и ссылках упомянутых в настоящем описании.For example, guidance on how to create phenotypically silent amino acid substitutions is provided in United States, TI. et al., 8c1epse 247: 1306-1310 (1990), in which the authors indicate that there are two main approaches for studying the tolerance of the amino acid sequence to change. The first method relates to an evolutionary process in which mutations are either permissible or rejected by natural selection. The second approach uses genetic engineering to introduce amino acid changes at specific positions of the cloned gene and selects or screening to identify sequences that support functionality. According to the authors, such studies have found that proteins are surprisingly tolerant amino acids. In addition, the authors indicated what changes are possible in order to be allowed in some positions of the protein. For example, most internal amino acid residues require non-polar side chains, while some signs of surface side chains tend to persist. Other such phenotypically silent substitutions are described in Woj et al., Supra, and references cited in the present description.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, гомологичный белку, выбранному из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39 может быть создана путем введения одной или более нуклеотидных замен, вставок или делеций в соответствующие кодирующие нуклеотидные последовательности (табл. 1) таким образом, что одну или несколько аминокислотных замен, делеций или вставок вводят в кодируемый белок. Такие мутации могут быть введены стандартными техниками, такими как сайт-направленный мутагенез и мутагенез при помощи ПЦР.An isolated nucleic acid molecule encoding a protein homologous to a protein selected from the group consisting of 8EC ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39 can be created by introducing one or more nucleotide substitutions, insertions, or deletions into the corresponding coding nucleotide sequences (Table 1) such that one or more amino acid substitutions, deletions, or insertions are introduced into the encoded protein. Such mutations can be introduced by standard techniques, such as site-directed mutagenesis and mutagenesis using PCR.

Термин функциональные эквиваленты также охватывает ортологи липолитических ферментов АкрегдШик шдег, предоставленных в настоящем описании. Ортологи липолитических ферментов АкрегдШик шдег являются белками, которые могут быть выделены из других штаммов или видов и обладают похожей или идентичной биологической активностью. Такие ортологи могут быть легко идентифицированы, как содержащие аминокислотную последовательность, которая по существу гомологична аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39.The term functional equivalents also encompasses the orthologs of the lipolytic enzymes AkregdSchik Schdeg provided in the present description. Orthologs of lipolytic enzymes AkregdShik Schdeg are proteins that can be isolated from other strains or species and have similar or identical biological activity. Such orthologs can be easily identified as containing an amino acid sequence that is substantially homologous to amino acid sequences selected from the group consisting of 8EC ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 , 36 and 39.

Как определено в настоящем описании, термин по существу гомологичный относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальAs defined herein, the term substantially homologous refers to a first amino acid or nucleotide sequence that contains sufficient or minimal

- 14 008007 ное количество идентичных или эквивалентных (например, с такой же боковой цепью) аминокислот или нуклеотидов второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности таким образом, что первая и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют общий домен. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые содержат общий домен, имеющий примерно 60%, предпочтительно 65%, более предпочтительно 70, даже более предпочтительно 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность или более, определены в настоящем описании как достаточно идентичные.- 14 008007 the number of identical or equivalent (for example, with the same side chain) amino acids or nucleotides of the second amino acid or nucleotide sequence so that the first and second amino acid or nucleotide sequences have a common domain. For example, amino acid or nucleotide sequences that contain a common domain having about 60%, preferably 65%, more preferably 70, even more preferably 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or 99% identity or more, defined in the present description as quite identical.

Также, нуклеиновые кислоты, кодирующие другие члены семейства липолитических ферментов, которые, таким образом, имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 находятся в объеме настоящего изобретения. Более того, нуклеиновые кислоты, кодирующие липолитические ферментативные белки из других видов, которые, таким образом, имеют нуклеотидную последовательность, которая отличается от нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 находятся в объеме настоящего изобретения.Also, nucleic acids encoding other members of the lipolytic enzyme family, which thus have a nucleotide sequence different from the nucleotide sequence selected from the group consisting of 8EC GO N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 and 38 are within the scope of the present invention. Moreover, nucleic acids encoding lipolytic enzymatic proteins from other species, which, therefore, have a nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequence selected from the group consisting of 8ES GO N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 and 38 are within the scope of the present invention.

Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие вариантам (например, природные аллельные варианты), и гомология полинуклеотидов настоящего изобретения могут быть выделены, основываясь на их гомологии с нуклеиновыми кислотами, раскрытыми в настоящем описании, с использованием кДНК, раскрытой в настоящем описании, или ее подходящего фрагмента, в качестве гибридизационного зонда согласно стандартным гибридизационным техникам предпочтительно в условиях высокой жесткости гибридизации.Variant nucleic acid molecules (e.g., natural allelic variants) and polynucleotide homology of the present invention can be isolated based on their homology with the nucleic acids disclosed herein, using the cDNA disclosed herein, or a suitable fragment thereof, as a hybridization probe according to standard hybridization techniques, preferably under conditions of high stringency hybridization.

Дополнительно к природным аллельным вариантам последовательностей АкрегдШик шдет, предоставленным в настоящем описании, специалистам в данной области техники будет очевидно, что изменения могут быть введены при помощи мутации в нуклеотидных последовательностях, выбранных из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38, таким образом, приводя к изменениям в аминокислотной последовательности липолитического ферментативного белка без существенных изменений функции этого белка.In addition to the natural allelic variants of the AkregdShik sequence shown in the present description, it will be apparent to those skilled in the art that changes can be introduced by mutation in nucleotide sequences selected from the group consisting of 8ES GO N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 and 38, thus leading to changes in the amino acid sequence of the lipolytic enzymatic protein without significant changes in the function of this protein.

В другом аспекте настоящего изобретения представляют улучшенные липолитические ферменты. Улучшенные липолитичекие ферменты являются белками, в которых по меньшей мере одна биологическая активность является улучшенной. Такие белки могут быть получены путем случайного введения мутаций во всей или части последовательности, кодирующей липолитический фермент, таким как мутагенез, и полученные в результате мутации могут быть рекомбинантно экспрессированы, и скринированы для биологической активности. Например, в существующем уровне техники имеются способы стандартного анализа для измерения ферментативной активности биологических ферментов и, таким образом, с легкостью могут быть выбраны улучшенные белки.In another aspect of the present invention, improved lipolytic enzymes are provided. Improved lipolytic enzymes are proteins in which at least one biological activity is improved. Such proteins can be obtained by randomly introducing mutations in all or part of the sequence encoding a lipolytic enzyme, such as mutagenesis, and the resulting mutations can be recombinantly expressed and screened for biological activity. For example, in the state of the art there are standard assay methods for measuring the enzymatic activity of biological enzymes, and thus improved proteins can be easily selected.

В предпочтительном варианте осуществления липолитический фермент имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39. В другом варианте осуществления липолитический фермент является по существу гомологичным аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность полипептида, выбранного из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, еще отличается аминокислотной последовательностью вследствие естественного изменения или мутагенеза, как описано выше.In a preferred embodiment, the lipolytic enzyme has an amino acid sequence selected from the group consisting of 8EC GO N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, and 39. In another embodiment the lipolytic enzyme is essentially homologous to an amino acid sequence selected from the group consisting of 8EC GO N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, and 39, and retains at least one biological activity of a polypeptide selected from the group consisting of 8ES GO N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39, the amino acid is still different otnoy sequence due to natural variation or mutagenesis as described above.

В дополнительном варианте осуществления липолитический фермент имеет аминокислотную последовательность, кодируемую при помощи выделенного фрагмента нуклеиновой кислоты, способного к гибридизации с нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38 предпочтительно при условиях высокой жесткости гибридизации.In a further embodiment, the lipolytic enzyme has an amino acid sequence encoded by an isolated nucleic acid fragment capable of hybridization with a nucleic acid selected from the group consisting of 8EC GO N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11 , 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 and 38, preferably under conditions of high stringency hybridization.

Следовательно, липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, и сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность полипептида, выбранного из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39.Therefore, a lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least about 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous to an amino acid sequence selected from the group consisting of 8ES GO N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39, and retains at least one functional activity of the polypeptide selected from the group consisting of 8ES GO N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39.

Более конкретно, липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕС ГО N0: 3, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕС ГО N0: 6, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕСMore specifically, a lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least about 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous the amino acid sequence shown in 8EC GO N0: 3, or the lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least about 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous to the amino acid sequence shown in 8EC GO N0: 6, or the lipolytic enzyme is a protein that win amino acid sequence at least about 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous to the amino acid sequence shown in 8ES

- 15 008007- 15 008007

ΙΌ N0: 9, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 12, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 15, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 18, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 21, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 24, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 27, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 30, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 33, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 36, или липолитический фермент является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 39.ΙΌ N0: 9, or the lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least about 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous to the amino acid sequence shown in 8EC GO N0: 12, or the lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least about 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 , 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous to the amino acid sequence shown in 8EC GO N0: 15, or the lipolytic enzyme is a protein that the fifth contains an amino acid sequence of at least about 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous to the amino acid sequence shown in 8EC GO N0: 18, or the lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least about 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous to the amino acid sequence shown in 8EC GO N0: 21, or the lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least approximately 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous to the amino acid sequence shown in 8EC GO N0: 24, or a lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least about 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous the amino acid sequence shown in 8EC GO N0: 27, or the lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least about 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% sludge more homologous to the amino acid sequence shown in 8EC GO N0: 30, or the lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least about 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous to the amino acid sequence shown in 8EC GO N0: 33, or the lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least about 40, 45, 50, 55, 60, 65 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous to the amino acid sequence, shown in 8EC GO N0: 36, or the lipolytic enzyme is a protein that contains an amino acid sequence of at least about 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 , 98, 99% or more homologous to the amino acid sequence shown in 8EC GO N0: 39.

Функциональные эквиваленты белка согласно настоящему изобретению также могут быть идентифицированы, например, при помощи комбинаторных библиотек скрининга мутантов, например мутантов процессинга, белка настоящего изобретения для активности липолитического фермента. В одном из вариантов настоящего изобретения создают смешанную библиотеку вариантов путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновых кислот. Смешанная библиотека вариантов может быть получена, например, ферментативной сшивкой смеси синтетических олигонуклеотидов в последовательностях генов таким образом, что вырожденный набор потенциальных белковых последовательностей экспрессируют как отдельные полипептиды, или в качестве альтернативы, как набор больших слитых белков (например, для обнаружения фага). Существуют различные способы, которые могут быть использованы для получения библиотек потенциальных вариантов полипептидов настоящего изобретения из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны специалистам в данной области техники (см., например, №1гап§ (1983) Тейайебгои 39:3; Йакига и др. (1984) Апп. Неу. Вюсйега. 53:323; Йакига и др. (1984) 8с1еисе 198:1056; П<е и др. (1983) №.1с1е1с АсИ Нез. 11:477).The functional equivalents of the protein according to the present invention can also be identified, for example, using combinatorial screening libraries of mutants, for example processing mutants, the protein of the present invention for lipolytic enzyme activity. In one embodiment of the present invention, a mixed library of variants is created by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level. A mixed library of variants can be obtained, for example, by enzymatic crosslinking of a mixture of synthetic oligonucleotides in gene sequences in such a way that a degenerate set of potential protein sequences is expressed as separate polypeptides, or alternatively, as a set of large fusion proteins (for example, to detect phage). There are various methods that can be used to obtain libraries of potential variants of the polypeptides of the present invention from a degenerate oligonucleotide sequence. Methods for the synthesis of degenerate oligonucleotides are known to those skilled in the art (see, for example, No. 1gap§ (1983) Teyayebgoy 39: 3; Yakiga et al. (1984) App. Neu. Vusyega. 53: 323; Yakiga et al. (1984 ) 8c1eise 198: 1056; P <e et al. (1983) No. 1c1e1s AcI Nez. 11: 477).

Дополнительно, библиотеки фрагментов кодирующих последовательностей полипептидов настоящего изобретения могут быть использованы для создания смешанной популяции полипептидов для скрининга последовательностей вариантов. Например, библиотека фрагментов кодирующих последовательностей может быть создана путем обработки двухнитевого ПЦР фрагмента интересующей кодирующей последовательности нуклеазой в условиях, при которых происходит однонитевой разрыв только примерно один раз на молекулу, денатурируя двухнитевую ДНК, ренатурируя ДНК для образования двунитевой ДНК, которая может включать в себя смысловые/антисмысловые пары из различных продуктов с однонитевым разрывом, удаляя однонитевые части из снова образованных дуплексов путем обработки 81 нуклеазой, и сшивая полученную в результате библиотеку фрагментов в вектор экспрессии. При помощи такого способа может быть получена библиотека экспрессии, которая кодирует №концевые и внутренние фрагменты разных размеров белка настоящего изобретения.Additionally, libraries of fragments of the coding sequences of the polypeptides of the present invention can be used to create a mixed population of polypeptides for screening sequences of variants. For example, a library of fragments of coding sequences can be created by processing a double-stranded PCR fragment of a nuclease of interest to the coding sequence under conditions in which a single-strand break occurs only about once per molecule, denaturing double-stranded DNA, renaturing DNA to form double-stranded DNA, which can include semantic / antisense pairs from various products with single-stranded rupture, removing single-stranded parts from newly formed duplexes by processing 81 nuclei oh and stitching the resulting fragment library into an expression vector. Using this method, an expression library that encodes the N-terminal and internal fragments of different sizes of the protein of the present invention can be obtained.

В данной области техники известны некоторые способы для скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, созданных при помощи точечных мутаций процессинга, и для скрининга кДНК библиотек для генных продуктов, имеющих выбранное свойство. Наиболее широко используемые способы, которые обеспечивают высокую производительность анализа, для скрининга больших генных библиотек обычно включают в себя клонирование генной библиотеки в реплицируемые векторы экспрессии, трансформацию подходящих клеток полученной в результате библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, при которых обнаружение желаемой активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был обнаружен. Мутагенез рекурентного множества (НЕМ), техника, которая усиливает частоту функциональных мутаций в библиотеках, может быть использован в сочетании с анализом скрининга для идентификации разновидностей белка настоящего изобретенияSeveral methods are known in the art for screening gene products of combinatorial libraries created using point mutations in processing, and for screening cDNA libraries for gene products having a selected property. The most widely used methods that provide high analysis performance for screening large gene libraries typically include cloning a gene library into replicable expression vectors, transforming suitable cells into the resulting vector library, and expressing combinatorial genes under conditions in which the detection of the desired activity facilitates the isolation a vector encoding a gene whose product has been detected. Recurrent Set Mutagenesis (HEM), a technique that enhances the frequency of functional mutations in libraries, can be used in conjunction with screening analysis to identify protein varieties of the present invention.

- 16 008007 (Аткт и Уоигуап (1992) Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 89:7811-7815; Эе1дгауе и др. (1993) Рго1еш Бпдшеегтд 6(3):327-331).- 16 008007 (Attct and Woiguap (1992) Proc. No. 11. Asab. 8c1. I8A 89: 7811-7815; E1dgaue et al. (1993) Prgoesh Bpdsheegtd 6 (3): 327-331).

Специалистам в данной области техники очевидно, что полиморфизм последовательности ДНК, который может приводить к изменениям в аминокислотной последовательности липолитического фермента, может существовать внутри данной популяции. Такой генетический полиморфизм может существовать в клетках из разных популяций или внутри популяции вследствие природного аллельного варианта. Аллельные варианты также могут включать функциональные эквиваленты.It will be apparent to those skilled in the art that DNA sequence polymorphism, which can lead to changes in the amino acid sequence of a lipolytic enzyme, can exist within a given population. Such genetic polymorphism may exist in cells from different populations or within a population due to a natural allelic variant. Allelic variants may also include functional equivalents.

Фрагменты полинуклеотидов согласно настоящему изобретению также могут содержать полинуклеотиды, не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут работать как зонды или праймеры для ПЦР реакции.Fragments of polynucleotides according to the present invention may also contain polynucleotides that do not encode functional polypeptides. Such polynucleotides can work as probes or primers for the PCR reaction.

Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению безотносительно, кодируют ли они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут быть использованы в качестве гибридизационных зондов или праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применение молекул нуклеиновых кислот настоящего изобретения, которые не кодируют полипептиды, имеющие липолитическую ферментативную активность, включают, между прочим, (1) выделение гена, кодирующего липолитический ферментативный белок, или его аллельные варианты из библиотеки кДНК, например, из других организмов, а не из АкрегдШш шдег; (2) гибридизацию ίη Ши (например, ΕΙ8Η) для митофазных хромосомных препаратов для обеспечения точного хромосомного положения гена липолитического фермента, как описано в Уегта и др., Нитап Сйтотокотек: а Мапиа1 οί Ба51с Тес11пк.|ие5. Регдатоп Рге§8, Нью Йорк (1988); (3) Нозерн-блот анализ для обнаружения экспрессии мРНК липолитического фермента в определенных тканях и/или клетках и (4) зонды или праймеры, которые могут быть использованы в качестве диагностического инструмента для анализа наличия нуклеиновой последовательности, гибридизуемой с зондом липолитического фермента в данном биологическом (например, ткани) образце.Nucleic acids according to the present invention, regardless of whether they encode functional or non-functional polypeptides, can be used as hybridization probes or primers for polymerase chain reaction (PCR). The use of nucleic acid molecules of the present invention that do not encode polypeptides having lipolytic enzymatic activity include, among other things, (1) isolation of a gene encoding a lipolytic enzymatic protein or its allelic variants from a cDNA library, for example, from other organisms, and not from AkregdShsh shdeg; (2) ίη Shi hybridization (e.g., ΕΙ8Η) for mitophase chromosome preparations to ensure the exact chromosomal position of the lipolytic enzyme gene, as described in Wegta et al. Regdatop Rge§8, New York (1988); (3) Northern blot analysis to detect expression of lipolytic enzyme mRNA in certain tissues and / or cells; and (4) probes or primers that can be used as a diagnostic tool to analyze the presence of a nucleic sequence that hybridizes with a lipolytic enzyme probe in a given biological (e.g. tissue) sample.

Также охваченным настоящим изобретением является способ получения функционального эквивалента гена или кДНК, кодирующих липолитический фермент. Такой способ определяет порядок получения меченного зонда, который включает в себя выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует всю или часть последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, или их варианты; проведение скрининга библиотеки фрагментов нуклеиновой кислоты меченным зондом в условиях, которые позволяют гибридизацию настоящего зонда с фрагментами нуклеиновой кислоты в библиотеке, таким образом образуя дуплексы нуклеиновых кислот, и приготовление последовательности гена полной длины из фрагментов нуклеиновой кислоты в любом меченном дуплексе для получения гена, имеющего отношение к липолитическому ферменту.Also covered by the present invention is a method of obtaining a functional equivalent of a gene or cDNA encoding a lipolytic enzyme. This method determines the procedure for obtaining a labeled probe, which includes an isolated nucleic acid that encodes all or part of a sequence selected from the group consisting of 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 , 30, 33, 36, and 39, or variants thereof; screening a library of nucleic acid fragments with a labeled probe under conditions that allow hybridization of the present probe with nucleic acid fragments in the library, thereby forming nucleic acid duplexes, and preparing a full-length gene sequence from nucleic acid fragments in any labeled duplex to obtain a gene related to lipolytic enzyme.

В одном из вариантов настоящего изобретения нуклеиновая кислота настоящего изобретения является, по меньшей мере, на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11,13, 14,16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 и 38, или их дополнения.In one embodiment of the present invention, the nucleic acid of the present invention is at least 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, or more homologous nucleic acid sequence selected from the group consisting of 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11,13, 14,16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 and 38, or their additions.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения полипептид настоящего изобретения является по меньшей мере на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичным аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39.In another preferred embodiment of the present invention, the polypeptide of the present invention is at least 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% or more homologous to the amino acid a sequence selected from the group consisting of 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, and 39.

Клетки хозяинаHost cells

Отличительной особенностью в другом варианте настоящего изобретения являются клетки, например, трансформированные клетки хозяина или рекомбинантные клетки хозяина, которые содержат нуклеиновые кислоты, охваченные настоящим изобретением. Трансформированная клетка или рекомбинантная клетка является клеткой, в которую (или в предшественника которой) введена, при помощи ДНК-рекомбинантных техник, нуклеиновая кислота настоящего изобретения. Включены как прокариотические, так и эукариотические клетки, например бактериальные, грибные, дрожжевые и т. п., особенно предпочтительными являются клетки из мицельных грибов, более конкретно АкрегдШик шдег.A distinctive feature in another embodiment of the present invention are cells, for example, transformed host cells or recombinant host cells that contain the nucleic acids encompassed by the present invention. A transformed cell or recombinant cell is a cell into which (or in a precursor of which) a nucleic acid of the present invention has been introduced, using DNA recombinant techniques. Both prokaryotic and eukaryotic cells are included, for example, bacterial, fungal, yeast, etc., cells from mycelial fungi, more particularly AkregdShik Schdeg, are particularly preferred.

Клетка хозяина может быть выбрана таким образом, чтобы модулировать экспрессию интересующих последовательностей, или модификации и процессы генного продукта в определенной, желаемой форме. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, разрезание) белковых продуктов можно облегчить оптимальным функционированием белка.The host cell can be selected in such a way as to modulate the expression of the sequences of interest, or modifications and processes of the gene product in a specific, desired form. Such modifications (e.g., glycosylation) and processing (e.g., cutting) of protein products can be facilitated by the optimal functioning of the protein.

Различные клетки хозяина имеют характерные и определенные механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Подходящие клеточные линии или системы хозяина, хорошо знакомые специалистам в данной области молекулярной биологиии/или микробиологии, могут быть выбраны с гарантией желательной и правильной модификации и процессинга экспрессии чужеродного белка. С этой целью могут быть использованы эукариотические клетки хозяина, которые обладают клеточным механизмом подходящего процессинга первичной транскрипции, гликолизирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки хозяина хорошо известны в данной области техники.Various host cells have characteristic and specific mechanisms for post-translational processing and modification of proteins and gene products. Suitable cell lines or host systems that are well known to those skilled in the field of molecular biology / or microbiology can be selected to guarantee the desired and correct modification and processing of the expression of a foreign protein. For this purpose, eukaryotic host cells that possess the cellular mechanism of suitable processing of the primary transcription, glycolization and phosphorylation of the gene product can be used. Such host cells are well known in the art.

Клетки хозяина также включают, но не ограничивают, линии клеток млекопитающих, такие как СНО, ΥΕΡΌ, ΒΗΚ, НеЬа, ОД8, МОСК, 293, 3Т3, ^138 и линии клеток хориоидного сплетения.Host cells also include, but are not limited to, mammalian cell lines, such as CHO, ΥΕΡΌ, ΒΗΚ, HeLa, OD8, MOSC, 293, 3T3, ^ 138, and choroid plexus cell lines.

- 17 008007- 17 008007

При желании полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть продуцированы при помощи стабильно трансфецируемой клеточной линии. Некоторые векторы, подходящие для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, являются доступными, способы для конструирования клеточных линий также являются хорошо известными, например в Ли8иЬе1 и др. (указанный выше).If desired, the polypeptides of the present invention can be produced using a stably transfected cell line. Some vectors suitable for stable transfection of mammalian cells are available, methods for constructing cell lines are also well known, for example, in Li8iLe1 et al. (Mentioned above).

АнтителаAntibodies

Дополнительной особенностью настоящего изобретения являются антитела, такие как моноклональные или поликлональные антитела, которые специфически связывают липолитические ферментативные белки согласно настоящему изобретению.An additional feature of the present invention are antibodies, such as monoclonal or polyclonal antibodies, which specifically bind the lipolytic enzymatic proteins of the present invention.

Как используется в настоящем описании, термин антитело (АЬ) или моноклональное антитело (МаЬ) включает в себя интактные молекулы, а также фрагменты антител (таких как, например, фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')₂), которые способны специфически связываться с липолитическим ферментативным белком. Фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')₂ не имеют Ес фрагмента интактного антитела, более быстро выводятся из кровообращения и могут иметь меньшее неспецифично-тканевое связывание интактного антитела (\Уа111 и др., 1. Ыис1. Мед., 24:316-325 (1983)). Таким образом, такие фрагменты являются предпочтительными.As used herein, the term antibody (AB) or monoclonal antibody (MAb) includes intact molecules as well as antibody fragments (such as, for example, fragments EaB and E (ab ') ₂ ) that are capable of specifically binding to a lipolytic enzymatic protein. Fragments EaB and E (ab ') ₂ do not have an Ec fragment of an intact antibody, are more rapidly excreted from the blood circulation, and may have less nonspecific tissue binding of an intact antibody (\ Ba111 et al., 1. Liis. Med., 24: 316-325 (1983)). Thus, such fragments are preferred.

Антитела настоящего изобретения могут быть приготовлены любым из множества способов. Например, клетки, экспрессирующие липолитический ферментативный белок или его антигенный фрагмент, могут быть введены в животное, чтобы вызвать продуцирование сыворотки, содержащей поликлональные антитела. В предпочтительном способе препарат липолитического ферментативного белка готовят и очищают, чтобы предоставить его по существу свободным от природных загрязнений. Такой препарат затем вводят в животное для продуцирования поликлональных антисывороток более высокой специфичной активности.Antibodies of the present invention can be prepared by any of a variety of methods. For example, cells expressing a lipolytic enzymatic protein or antigenic fragment thereof can be introduced into an animal to induce the production of serum containing polyclonal antibodies. In a preferred method, a lipolytic enzymatic protein preparation is prepared and purified to provide it substantially free of natural contaminants. Such a preparation is then administered to an animal to produce polyclonal antisera of higher specific activity.

В наиболее предпочтительном способе антитела настоящего изобретения являются моноклональными антителами настоящего изобретения (или их фрагментами, связывающимися с липолитическим ферментативным белком). Такие моноклональные антитела могут быть приготовлены с использованием технологии гибридомы (КоЫег и др., Ыа1иге 256:495 (1975); КоЫег и др., Еиг. 1. 1ттипо1. 6: 511 (1976); Наттег1шд и др., в: Мопос1опа1 АпдЬоФек апд Т-Се11 НуЬпдотак, ЕЫеуег.НУ.. стр. 563-681 (1981)). В общем случае, такие процедуры включают в себя иммунизацию животного (предпочтительно мышь) антигеном липолитического ферментативного белка или клеткой, экспрессирующей липолитический ферментативный белок. Спленоциты таких мышей экстрагируют и сливают с подходящей клеточной линией миеломы. Может быть использована любая подходящая линия клеток миеломы согласно настоящему изобретению; однако предпочтительна для использования родительская линия клеток миеломы (8Р₂О), доступная из американской коллекции типов культур, ВоскуШе, Мэрилэнд. После слияния полученные в результате клетки гибридомы избирательно поддерживают в среде НАТ и затем клонируют путем предельного разбавления, как описано \Уапд5 и др. (6а81то-еп1его1оду 80: 225-232 (1981)). Клетки гибридомы, полученные путем такого отбора, затем анализируют для идентификации клонов, которые секретируют антитела, способные к связыванию антигена липолитического ферментативного белка. В общем случае, полипептиды могут быть соединены с белком носителем, таким как КЕН, как описано в Аи8иЬе1 и др., указанный выше, смешены с адъювантом и инъецированы в млекопитающее хозяина.In a most preferred method, the antibodies of the present invention are monoclonal antibodies of the present invention (or fragments thereof binding to a lipolytic enzymatic protein). Such monoclonal antibodies can be prepared using hybridoma technology (CoGeer et al., LaGeig 256: 495 (1975); CoGeg et al., Eig. 1. 1tipo1. 6: 511 (1976); Nuttegd et al., In: Mopos1op1 Updofekd up T-Ce11 NuPdotak, Eeebeg. NU .. p. 563-681 (1981)). In general, such procedures include immunizing an animal (preferably a mouse) with an antigen of a lipolytic enzyme protein or a cell expressing a lipolytic enzyme protein. The splenocytes of such mice are extracted and fused to a suitable myeloma cell line. Any suitable myeloma cell line according to the present invention may be used; however, the parental myeloma cell line (8P ₂ O), available from the American collection of culture types, Wosco She, Maryland, is preferred. After fusion, the resulting hybridoma cells are selectively maintained in NAT medium and then cloned by limiting dilution, as described by Wapd5 et al. (6a81to-epolego 80: 225-232 (1981)). Hybridoma cells obtained by this selection are then analyzed to identify clones that secrete antibodies capable of binding the antigen of a lipolytic enzymatic protein. In general, the polypeptides can be coupled to a carrier protein, such as KEN, as described in Au8b1e et al., Supra, mixed with an adjuvant and injected into the host mammal.

Более конкретно, различные животные хозяева могут быть иммунизированы путем инъекции интересующего полипептида. Примеры подходящих животных хозяев включают кроликов, мышей, морских свинок и крыс. Могут быть использованы различные адьюванты для увеличения иммунологического ответа, в зависимости от вида хозяина включающие в себя, без ограничений, адъювант Фрейнда (полный и неполный), адьювантные минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, поверхностно-активные полиолы, полианионы, пептиды, масляные имульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол, ВСС (бацилла Калметта-Герена) и СотупеЬас1етшт ратуит.More specifically, various animal hosts can be immunized by injection of the polypeptide of interest. Examples of suitable animal hosts include rabbits, mice, guinea pigs and rats. Various adjuvants can be used to increase the immunological response, depending on the type of host, including, without limitation, Freund's adjuvant (complete and incomplete), adjuvant mineral gels, such as aluminum hydroxide, surfactants, such as lysolecithin, surfactants active polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, cochlear lymphocytes hemocyanin, dinitrophenol, BCC (Kalmett-Guerin bacillus), and Sotupas acinensis.

Поликлональные антитела являются гетерогенными популяциями молекул антител, полученных из сывороток иммунизированных животных.Polyclonal antibodies are heterogeneous populations of antibody molecules derived from the sera of immunized animals.

Такие антитела могут быть любым классом иммуноглобулина, включая 1дС, 1дМ, 1дЕ, 1дА, 1дЭ и любым его подклассом. Гибридомы, продуцирующие тАЬ§ настоящего изобретения, могут быть культивированы 1п У11то или 1п У1Уо.Such antibodies can be any class of immunoglobulin, including 1dC, 1dM, 1dE, 1dA, 1dE and any subclass thereof. Hybrids producing the TAB3 of the present invention can be cultured with 1n U11to or 1n Y1Uo.

После продуцирования поликлональные или моноклональные антитела тестируют для специфического определения белка согласно настоящему изобретению или его функционального эквивалента иммуноанализом, таким как Вестерн-блот или анализ иммунопреципитации с использованием стандартных техник, например, как описано в Аи8иЬе1 и др., указанный выше. Антитела, которые специфически связываются с белком согласно настоящему изобретению или его функциональным эквивалентом, являются пригодными в настоящем изобретении. Например, такие антитела могут быть использованы в иммуноанализе для обнаружения белка согласно настоящему изобретению в патогенных или непатогенных штаммах АкретдШик (например, в АкретдШик ех1тас18).After production, polyclonal or monoclonal antibodies are tested to specifically determine the protein of the present invention or its functional equivalent by an immunoassay, such as Western blot or immunoprecipitation analysis using standard techniques, for example, as described in Au8e1 et al., Supra. Antibodies that specifically bind to a protein of the present invention or its functional equivalent are useful in the present invention. For example, such antibodies can be used in an immunoassay to detect the protein of the present invention in pathogenic or non-pathogenic strains of AkretdShik (for example, in AkretdShik ex1tac18).

Предпочтительно, антитела настоящего изобретения продуцируют, используя фрагменты белка согласно настоящему изобретению, который проявляет себя как антигенный, при помощи критерия, такого как высокая частота измененных остатков. Например, такие фрагменты могут быть созданы при помощиPreferably, the antibodies of the present invention are produced using fragments of a protein according to the present invention, which manifests itself as antigenic, using criteria such as a high frequency of altered residues. For example, such fragments can be created using

- 18 008007 стандартных техник ПЦР и затем клонированы в рСЕХ вектор экспрессии (АикиЬе1 и др., указанный выше). Затем слитые белки могут быть экспрессированы в Е. сой и очищены с использованием матрикса сродства с глутатион агарозой, как описано в ЛикиЬе1 и др., указанный выше. При желании некоторые (например, два или три) слияния могут быть созданы для каждого белка, и каждое слияние может быть инъецировано по меньшей мере в двух крыс. Антисыворотка может быть увеличена путем серий инъекций, обычно включающих в себя по меньшей мере три бустер-инъекции. Обычно антисыворотки исследуют на их способность к иммунопреципитации белка согласно настоящему изобретению или его функциональных эквивалентов, тогда как неродственные белки могут быть полезными в качестве контроля на специфичность иммунной реакции.- 18 008007 standard PCR techniques and then cloned into the pXEX expression vector (AikLe1 et al., Supra). Fusion proteins can then be expressed in E. soybean and purified using a matrix of affinity for glutathione agarose, as described in Lycie1 et al., Supra. If desired, some (for example, two or three) fusions can be created for each protein, and each fusion can be injected in at least two rats. The antiserum can be increased by a series of injections, usually including at least three booster injections. Typically, antisera are tested for their ability to immunoprecipitate the protein of the present invention or its functional equivalents, while unrelated proteins may be useful as a control on the specificity of the immune response.

В качестве альтернативы, техники, описанные для продуцирования одноцепочечных антител (патенты США 4946778 и 4704692), могут быть адаптированы для продуцирования одноцепочечных антител к белку согласно настоящему изобретению или его функциональных эквивалентов. Наборы для создания и скрининга библиотек обнаружения фага являются коммерчески доступными, например, от Рйатшае1а.Alternatively, the techniques described for the production of single chain antibodies (US Pat. Nos. 4,946,778 and 4,704,692) can be adapted to produce single chain antibodies to a protein of the present invention or functional equivalents thereof. Kits for the creation and screening of phage detection libraries are commercially available, for example, from Ryatschae.

Дополнительно, примеры способов и реагентов, особенно пригодных для использования при создании и скрининге библиотеки обнаружения антител, могут быть найдены, например, в патенте США 5223409; заявке РСТ №092/18619; заявке РСТ №091/17271, заявке РСТ №020791; заявке РСТ №092/20791; заявке РСТ №092/15679; заявке РСТ №093/01288; заявке РСТ №092/01047; заявке РСТ №092/09690; заявке РСТ №090/02809; Еиейк и др. (1991) Вю/Теейпо1оду 9:370-1372; Нау и др. (1992) Нит. ЛпИЬоб. НуЬпботак 3:81-85; Нике и др. (1989) 8е1епее 246: 1275-1281; Οτίίϊϊΐκ и др. (1993) ЕМВ0 1. 12: 725-734.Additionally, examples of methods and reagents particularly suitable for use in the creation and screening of an antibody detection library can be found, for example, in US Pat. No. 5,223,409; PCT Application No. 092/18619; PCT application No. 091/17271, PCT application No. 020791; PCT Application No. 092/20791; PCT Application No. 092/15679; PCT Application No. 093/01288; PCT Application No. 092/01047; PCT Application No. 092/09690; PCT Application No. 090/02809; Eiyek et al. (1991) Vyu / Teeypoodod 9: 370-1372; Nau et al. (1992) Nit. Lob. Well done 3: 81-85; Nike et al. (1989) 8e1eeee 246: 1275-1281; Οτίίϊϊΐκ et al. (1993) EMB0.1.12: 725-734.

Поликлональные и моноклональные антитела, которые специфично связываются с белком настоящего изобретения или его функциональными эквивалентами, например, могут быть использованы для обнаружения экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению или его функциональные эквиваленты, например, в другом штамме АкретдШик. Например, белок согласно настоящему изобретению может быть быстро обнаружен при обычном иммуноанализе клеток АкретдШик или экстрактах. Примеры подходящего анализа включают в себя, без ограничений, Вестерн-блоттинг, ЕЙ18А, радиоиммунный анализ и т. п.Polyclonal and monoclonal antibodies that specifically bind to the protein of the present invention or its functional equivalents, for example, can be used to detect the expression of a gene encoding the protein of the present invention or its functional equivalents, for example, in another Accret Shik strain. For example, the protein of the present invention can be quickly detected by routine immunoassay of AccretDish cells or extracts. Examples of suitable assays include, but are not limited to, Western blotting, E18A, radioimmunoassay, and the like.

Под специфически связывает имеется в виду, что антитело узнает и связывает конкретный антиген, например, белок согласно настоящему изобретению, но не предназначен по существу для узнавания и связывания других неродственных молекул в образце.By specifically binds, it is meant that the antibody recognizes and binds to a particular antigen, for example, a protein according to the present invention, but is not intended to essentially recognize and bind other unrelated molecules in the sample.

Антитела могут быть очищены, например, при помощи способов аффинной хроматографии, в которых антиген полипептида иммобилизуют на смоле.Antibodies can be purified, for example, using affinity chromatography methods in which a polypeptide antigen is immobilized on a resin.

Антитело, направленное против полипептида настоящего изобретения (например, моноклональное антитело), может быть использовано для выделения полипептида стандартными техниками, такими как аффинная хроматография или иммунопреципитация. Помимо этого, такое антитело может быть использовано для обнаружения белка (например, в клеточном лизате или супернатанте клеток) для оценки большого количества и образца экспрессии полипептида. Антитела также могут быть использованы диагностически для контролирования уровней белка в клетках или ткани в качестве части процедуры клинического тестирования, например, для, к примеру, определения эффективности данного режима обработки или при диагностике АкретдШоДк.An antibody directed against the polypeptide of the present invention (e.g., a monoclonal antibody) can be used to isolate the polypeptide by standard techniques, such as affinity chromatography or immunoprecipitation. In addition, such an antibody can be used to detect protein (for example, in a cell lysate or cell supernatant) to evaluate a large number and sample expression of a polypeptide. Antibodies can also be used diagnostically to monitor protein levels in cells or tissue as part of a clinical testing procedure, for example, for example, to determine the effectiveness of a given treatment regimen or in the diagnosis of AccretDioCa.

Обнаружение может быть облегчено путем присоединения антитела к обнаружимому веществу. Примеры обнаружимых веществ включают в себя различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, биолюминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают в себя пероксидазу хрена, алкалин фосфатазу, βгалактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают в себя умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоционат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, хлорид дансила или фикоэритрин; пример подходящего люминесцентного вещества включает в себя люминол; примеры подходящих биолюминесцентных веществ включают в себя луциферазу, луциферин и акворин, примеры подходящих радиоактивных веществ включают в себя ¹²⁵1, ¹³¹1, ³⁵8 или ³Н.Detection can be facilitated by attaching an antibody to a detectable substance. Examples of detectable substances include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent substances, luminescent substances, bioluminescent substances and radioactive substances. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase or acetylcholinesterase; examples of suitable fluorescent substances include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansil chloride or phycoerythrin; an example of a suitable luminescent substance includes luminol; examples of suitable bioluminescent substances include luciferase, luciferin and aquorin, examples of suitable radioactive substances include ¹²⁵ 1, ¹³¹ 1, ³⁵ 8 or ³ N.

Предпочтительные эпитопы, охваченные антигенными пептидами, являются областями, которые размещены на поверхности белка, например, гидрофильные области. Точки гидрофобности белка настоящего изобретения могут быть использованы для идентификации гидрофильных областей.Preferred epitopes encompassed by antigenic peptides are regions that are located on the surface of a protein, for example, hydrophilic regions. The hydrophobicity points of a protein of the present invention can be used to identify hydrophilic regions.

Антигенный пептид белка настоящего изобретения содержит 7 (предпочтительно 10, 15, 20 или 30) следующих друг за другом аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39, и охватывает эпитоп белка таким образом, что антитело против белка образовывало специфический иммунный комплекс с белком.The antigenic peptide of the protein of the present invention contains 7 (preferably 10, 15, 20 or 30) successive amino acid residues of an amino acid sequence selected from the group consisting of 8E0 W N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, and 39, and encompasses an epitope of the protein such that the anti-protein antibody forms a specific immune complex with the protein.

Предпочтительные эпитопы, охваченные антигенным белком, являются областями белка настоящего изобретения, которые расположены на поверхности белка, например, гидрофильные области, гидрофобные области, альфа области, бета области, кольцевые области, измененные области и гибкие области.Preferred epitopes encompassed by the antigenic protein are regions of the protein of the present invention that are located on the surface of the protein, for example, hydrophilic regions, hydrophobic regions, alpha regions, beta regions, ring regions, altered regions and flexible regions.

- 19 008007- 19 008007

ИммуноанализImmunoassay

Качественное или количественное определение полипептида согласно настоящему изобретению в биологическом образце можно проводить с использованием любого хорошо известного в данной области техники способа. Техники, основанные на антителах, обеспечивают ряд преимуществ для анализа уровней определенного полипептида в биологическом образце.Qualitative or quantitative determination of the polypeptide according to the present invention in a biological sample can be carried out using any method well known in the art. Antibody-based techniques provide several advantages for analyzing levels of a particular polypeptide in a biological sample.

В связи с этим, специфическое узнавание обеспечивают при помощи первичного антитела (поликлонального или моноклонального), но система вторичного обнаружения может использовать флуоресцентные, ферментативные или другие связанные вторичные антитела. В результате получают иммунокомплекс.In this regard, specific recognition is provided using a primary antibody (polyclonal or monoclonal), but the secondary detection system can use fluorescent, enzymatic or other related secondary antibodies. The result is an immunocomplex.

Следовательно, изобретение представляет способ для диагностирования, инфицирован ли определенный организм ЛкрегдШик, содержащий этапы, на которых выделяют биологический образец из упомянутого организма, подозреваемого в том, что он инфецирован ЛкрегдШш;Therefore, the invention provides a method for diagnosing whether a specific LkregdSik organism is infected, comprising the steps of isolating a biological sample from said organism suspected of being infected with LgregsSh;

проводят реакцию упомянутого образца с антителом согласно настоящему изобретению; определяют, образовался ли иммунокомплекс.carrying out a reaction of said sample with an antibody according to the present invention; determine if an immunocomplex has formed.

Ткани также могут быть экстрагированы, например мочевиной и нейтральным детергентом, для выделения белка для Вестерн-блоттинга или дот/слот блотов. Такая техника также может быть применима для жидкостей тела.Tissues can also be extracted, for example with urea and a neutral detergent, to isolate protein for Western blotting or dot / slot blots. This technique may also be applicable to body fluids.

Другие способы, основанные на антителах, пригодные для определения белка согласно настоящему изобретению, включают в себя иммуноанализ, такой как связанный с ферментом иммуносорбент (ЕЬ18Л) и радиоиммуноанализ (ИЛ). Например, моноклональные антитела к белку согласно настоящему изобретению могут быть использованы как в качестве иммуносорбента, так и в качестве зонда, меченного ферментом, для обнаружения и качественного определения белка согласно настоящему изобретению. Количество белка, присутствующего в образце, может быть вычислено по количеству, присутствующему в стандартном препарате, используя компьютерный алгоритм линейной регрессии. В другом анализе ЕЫ8Л могут быть использованы два вида разных специфических моноклональных антител для обнаружения в биологической жидкости белка согласно настоящему изобретению. В таком анализе одно из антител используют в качестве иммуно-абсорбента, а другое в качестве зонда, меченого ферментом.Other antibody-based methods suitable for determining the protein of the present invention include immunoassays, such as enzyme-linked immunosorbent (EL18L) and radioimmunoassay (IL). For example, monoclonal antibodies to a protein according to the present invention can be used both as an immunosorbent and as an enzyme-labeled probe for the detection and qualitative determination of a protein according to the present invention. The amount of protein present in a sample can be calculated from the amount present in a standard preparation using a linear regression computer algorithm. In another analysis of E8L, two kinds of different specific monoclonal antibodies can be used to detect the protein of the present invention in the biological fluid. In such an assay, one of the antibodies is used as an immuno-absorbent, and the other as an enzyme labeled probe.

Выше описанные техники могут быть проведены как одноэтапное или двухэтапное исследование. Одноэтапное исследование включает контактирование белка согласно настоящему изобретению с иммобилизованным антителом и, без промывки, контактирование смеси с меченым антителом. Двухэтапное исследование включает промывку перед контактированием смеси с меченым антителом. Другие обычные способы могут быть использованы, соответственно. Обычно желательно иммобилизовать один компонент системы анализа на подложке, таким образом, позволяя другим компонентам системы войти в контакт с компонентом и быть легко извлеченными из образца.The techniques described above can be carried out as a one-stage or two-stage study. One-step research involves contacting the protein of the present invention with an immobilized antibody and, without washing, contacting the mixture with a labeled antibody. A two-step study involves washing before contacting the mixture with a labeled antibody. Other conventional methods may be used, respectively. It is usually desirable to immobilize one component of an analysis system on a substrate, thereby allowing other components of the system to come into contact with the component and be easily removed from the sample.

Подходящие ферментативные метки включают, например, метки из группы оксидаз, которые катализируют продуцирование перекиси водорода путем реакции с субстратом. Активность оксидазной метки может быть проанализирована путем измерения концентрации перекиси водорода, образованного реакцией антитело, меченное ферментом/субстрат.Suitable enzyme labels include, for example, oxidase labels that catalyze the production of hydrogen peroxide by reaction with a substrate. The activity of the oxidase tag can be analyzed by measuring the concentration of hydrogen peroxide formed by the reaction of an enzyme-labeled antibody / substrate.

По сравнению с ферментами, другие подходящие метки включают в себя радиоизотопы, такие как йод (¹²⁶Ι, ¹²⁵Ι), углерод (¹⁴С), серу (³⁵8), тритий (³Н), индий (¹¹²Ιη) и технеций (^99тТс) и флуоресцентные метки, такие как флуоресцин, родамин и биотин.Compared to enzymes, other suitable labels include radioisotopes such as iodine ( ¹²⁶ Ι, ¹²⁵ Ι), carbon ( ¹⁴ C), sulfur ( ³⁵ 8), tritium ( ³ N), indium ( ¹¹² Ιη) and technetium ( ^99t Tc) and fluorescent labels such as fluorescein, rhodamine and biotin.

Специфическое связывание вещества теста с белком согласно настоящему изобретению может быть обнаружено, например, ίη νίίτο путем обратимой и необратимой иммобилизации белка согласно настоящему изобретению на субстрате, например, поверхности лунки 96-луночного микротитровального планшета из полистирола. Способы иммобилизации полипептидов и других небольших молекул хорошо известны в данной области техники. Например, микротитровальные планшеты могут быть покрыты белком согласно настоящему изобретению путем добавления белка в раствор (обычно, концентрацией от 0,05 до 1 мг/мл в объеме 1-100 мкл) в каждую лунку, и инкубирования планшетов при комнатной температуре до 37°С в течение от 0,1 до 36 ч. Белки, которые не связались с планшетом при комнатной температуре, могут быть удалены путем встряхивания избытка раствора из планшета, и затем промывкой планшета (один раз или неоднократно) водой или буфером. Обычно белок содержат в воде или буфере. Затем планшет промывают буфером, который не имеет связанного белка. Для блокирования на планшете свободных участков, связывающих белок, планшеты блокируют белком, который не является родственным связанному белку. Например, являются подходящими 300 мкл альбумина бычьей сыворотки (В8А) при концентрации 2 мг/мл в Трис-НС1. Подходящие субстраты включают такие субстраты, которые содержат определенные химические соединения с поперечными сшивками (например, пластиковые субстраты, такие как полистироловые, стироловые или полипропиленовые субстраты из Сотшпд СоЧаг Согр. (СашЬпбде. МА), например). При желании в качестве субстрата могут быть использованы частицы в виде шариков, например шарообразная агароза или шарообразная сефароза.Specific binding of the test substance to the protein of the present invention can be detected, for example, ίη νίίτο by reversibly and irreversibly immobilizing the protein of the present invention on a substrate, for example, the surface of a well of a 96-well polystyrene microtiter plate. Methods for immobilizing polypeptides and other small molecules are well known in the art. For example, microtiter plates can be coated with the protein of the present invention by adding protein to the solution (typically from 0.05 to 1 mg / ml in a volume of 1-100 μl) to each well, and incubating the plates at room temperature up to 37 ° C. within 0.1 to 36 hours. Proteins that did not contact the plate at room temperature can be removed by shaking the excess solution from the plate, and then washing the plate (once or repeatedly) with water or buffer. Typically, the protein is contained in water or buffer. The plate is then washed with a buffer that does not have a bound protein. To block free protein binding sites on a tablet, the tablets are blocked with a protein that is not related to the bound protein. For example, 300 μl of bovine serum albumin (B8A) at a concentration of 2 mg / ml in Tris-HC1 are suitable. Suitable substrates include those substrates that contain certain crosslinked chemical compounds (for example, plastic substrates such as polystyrene, styrene or polypropylene substrates from Sotpd Cohag Coag. (Sachpbde. MA), for example). If desired, particles in the form of spheres, for example spherical agarose or spherical sepharose, can be used as a substrate.

Связывание вещества теста с полипептидами согласно настоящему изобретению может быть обнаружено любым из множества способов, известных в данной области техники. Например, в иммуноаналиThe binding of the test substance to the polypeptides of the present invention can be detected by any of a variety of methods known in the art. For example, in the immunoassay

- 20 008007 зе может быть использовано специфическое антитело. При желании, антитело может быть меченым (например, флуоресцентно или радиоизотопом) и сразу обнаружено (см., например, \Уе51 и МсМакоп, 1. Се11 Βίο1. 74:264, 1977). В качестве альтернативы, для обнаружения может быть использовано второе антитело (например, меченое антитело, которое связывает Ес часть анти-А№97 антитела). При альтернативном способе обнаружения метят белок согласно настоящему изобретению, и обнаруживают метку (например, при помощи мечения белка согласно настоящему изобретению радиоизотопом, флуорофором, хромофором или т.п.). В еще одном способе белок согласно настоящему изобретению продуцируют как слитый белок с белком, который может быть визуально обнаружен, например, зеленым флуоресцентным белком (который может быть обнаружен под УФ светом). В альтернативном способе белок согласно настоящему изобретению может быть ковалентно связан с ферментом, имеющим обнаружимую ферментативную активность, или слит с ним, таким как пероксидаза хрена, алкалин фосфатаза, альфа-галактозидаза или глюкозооксидаза. Гены, кодирующие все эти ферменты, клонированы и легко доступны для использования специалистами в данной области техники. При желании, слитый белок может включать в себя антиген, и такой антиген может быть обнаружен и измерен поликлональным или моноклональным антителом, используя обычные способы. Подходящие антигены включают в себя ферменты (например, пероксидазу хрена, алкалин фосфатазу и альфа-галактозидазу) и неферментативные полипептиды (например, белки сыворотки, такие как В8А и глобины, и молочные белки, такие как казеины).- 20 008007 the specific antibody can be used. If desired, the antibody can be labeled (for example, fluorescently or with a radioisotope) and immediately detected (see, for example, \ Ge51 and McMacak, 1. Ce11 1ο1. 74: 264, 1977). Alternatively, a second antibody can be used for detection (for example, a labeled antibody that binds the Ec part of the anti-A # 97 antibody). In an alternative detection method, the protein of the present invention is labeled and a label is detected (for example, by labeling the protein of the present invention with a radioisotope, fluorophore, chromophore or the like). In yet another method, the protein of the present invention is produced as a fusion protein with a protein that can be visually detected, for example, by a green fluorescent protein (which can be detected under UV light). In an alternative method, the protein of the present invention may be covalently linked to or fused to an enzyme having detectable enzymatic activity, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, alpha-galactosidase or glucose oxidase. Genes encoding all of these enzymes are cloned and readily available for use by those skilled in the art. If desired, a fusion protein may include an antigen, and such an antigen can be detected and measured by a polyclonal or monoclonal antibody using conventional methods. Suitable antigens include enzymes (e.g., horseradish peroxidase, alkaline phosphatase and alpha-galactosidase) and non-enzymatic polypeptides (e.g., serum proteins, such as B8A and globins, and milk proteins, such as caseins).

Эпитопы, антигены и иммуногеныEpitopes, antigens and immunogens

В другом аспекте настоящее изобретение представляет пептид или полипептид, содержащий часть, несущую эпитоп, полипептида настоящего изобретения. Эпитоп такой части полипептида является иммуногенным или антигенным эпитопом полипептида настоящего изобретения. Иммуногенный эпитоп определен как часть белка, которая вызывает ответ антитела, если весь белок является иммуногеном. Предполагается, что такие иммуногенные эпитопы должны быть ограничены некоторыми локусами на молекуле. С другой стороны, область белковой молекулы, к которой может присоединиться антитело, определен как антигенный эпитоп. Количество иммуногенных эпитопов белка обычно меньше, чем количество антигенных эпитопов. См., например, Сеуъеп. Н.М. и др. Ргос. №111. Асаб. 8с1. США 81:39984002 (1984).In another aspect, the present invention provides a peptide or polypeptide comprising an epitope-bearing moiety of a polypeptide of the present invention. The epitope of such a portion of the polypeptide is an immunogenic or antigenic epitope of the polypeptide of the present invention. An immunogenic epitope is defined as the part of a protein that elicits an antibody response if the entire protein is an immunogen. It is contemplated that such immunogenic epitopes should be limited to certain loci on the molecule. On the other hand, the region of a protein molecule that an antibody can attach to is defined as an antigenic epitope. The number of immunogenic protein epitopes is usually less than the number of antigenic epitopes. See, for example, Seup. N.M. and others. Rgos. No. 111. Asab. 8s1. U.S. 81: 39984002 (1984).

В отношении выбора пептидов или полипептидов, несущих антигенный эпитоп (т.е. такое содержание области молекулы белка, с которой может связаться антитело), специалистам в данной области техники хорошо известно, что относительно короткие синтетические пептиды, которые имитируют часть последовательности белка, способны обычным способом активировать антисыворотку, которая реагирует с частично имитированным белком. См., например, 8и1с11ГГе, 1.6. и др. 8с1епсе 219:660-666 (1984). Пептиды, способные активировать сыворотки, реагирующие с белком, зачастую представлены в первичной последовательности белка, могут быть охарактеризованы при помощи набора правил химических образцов, и не ограничены ни иммунодоминантными областями интактных белков (т.е. иммуногенными эпитопами), ни аминными или карбоксильными концами. Пептиды, которые являются чрезвычайно гидрофобными, и пептиды шести или менее остатков обычно являются неэффективными при индуцировании антител, которые связываются с имитированным белком; более длинные растворимые пептиды, особенно такие, которые содержат остатки пролина, обычно являются эффективными. 8н1с11ГГе и др., указанный выше, на 661. Например, 18 из 20 пептидов, разработанных согласно таким рекомендациям, содержащие 8-39 остатков, покрывающих 75% цепи полипептида гемагглютинина НА1 вируса гриппа, стимулировали антитела, которые прореагировали с НА1 белком или интактным вирусом; и 12/12 пептидов из МиЬУ полимеразы и 18/18 из гликопротеина вируса бешенства стимулировали антитела, которые преципитировали соответствующие белки.With respect to the selection of peptides or polypeptides carrying an antigenic epitope (i.e., the content of a region of a protein molecule that an antibody can bind to), those skilled in the art are well aware that relatively short synthetic peptides that mimic part of a protein sequence are capable of conventional a way to activate an antiserum that reacts with a partially simulated protein. See, for example, 8i1s11GGe, 1.6. et al. 8c1epse 219: 660-666 (1984). Peptides capable of activating serums that react with a protein are often presented in the primary protein sequence, can be characterized using a set of rules for chemical samples, and are not limited to immunodominant regions of intact proteins (i.e., immunogenic epitopes), nor to amine or carboxyl ends. Peptides that are extremely hydrophobic and peptides of six or less residues are usually ineffective in inducing antibodies that bind to a mimic protein; longer soluble peptides, especially those that contain proline residues, are usually effective. 8n1c11GGe et al., Supra, at 661. For example, 18 of 20 peptides designed according to such recommendations, containing 8-39 residues covering 75% of the influenza hemagglutinin HA1 polypeptide chain, stimulated antibodies that reacted with the HA1 protein or intact virus ; and 12/12 peptides from MiLU polymerase and 18/18 from rabies virus glycoprotein stimulated antibodies that precipitated the corresponding proteins.

Следовательно, пептиды и полипептиды, несущие антигенный эпитоп, настоящего изобретения пригодны для индуцирования антител, включающих в себя моноклональные антитела, которые связываются специфически с полипептидом настоящего изобретения. Таким образом, высокое соотношение гибридов, полученных слиянием клеток селезенки от донора, иммунизированного пептидом, несущим эпитоп антигена, как правило, секретируют антитело, реагирующее с природным белком. 8и1с11ГГе и др., указанный выше, на 663. Антитела, индуцированные пептидами, несущими антигенный эпитоп, или полипептиды являются пригодными для обнаружения имитированного белка, а антитела к различным пептидам могут быть использованы для отслеживания судьбы различных областей предшественника белка, который подвергнут процессингу после трансляции. Пептиды и антитела к пептидам могут быть использованы во множестве количественных или качественных исследований имитированного белка, например, в сравнительном анализе, так как показано, что даже короткие пептиды (например, около 9 аминокислот) могут связываться и замещать большие пептиды в анализе иммунопреципитации. См., например, ^Шоп, 1.А. и др. Се11 37:767-778 на 777 (1984). Антитела к пептидам настоящего изобретения также являются пригодными для очистки имитированного белка, например, путем адсорбционной хроматографии, используя способы, хорошо известные в данной области техники.Therefore, the peptides and polypeptides bearing the antigenic epitope of the present invention are suitable for inducing antibodies including monoclonal antibodies that bind specifically to the polypeptide of the present invention. Thus, a high ratio of hybrids obtained by fusion of spleen cells from a donor immunized with a peptide carrying an antigen epitope, as a rule, secrete an antibody that reacts with a natural protein. 8i1c11GGe et al., Supra, at 663. Antibodies induced by peptides carrying an antigenic epitope or polypeptides are useful for detecting a mimic protein, and antibodies to different peptides can be used to track the fate of various regions of a protein precursor that is processed after translation . Peptides and antibodies to peptides can be used in many quantitative or qualitative studies of a simulated protein, for example, in a comparative analysis, since it has been shown that even short peptides (for example, about 9 amino acids) can bind and replace large peptides in an immunoprecipitation assay. See, for example, ^ Shop, 1.A. et al. Ce11 37: 767-778 at 777 (1984). Antibodies to the peptides of the present invention are also suitable for purification of a simulated protein, for example, by adsorption chromatography, using methods well known in the art.

Пептиды и полипептиды, несущие антигенный эпитоп, настоящего изобретения, разработанные согласно выше описанным рекомендациям, предпочтительно содержат последовательность по меньшей мере семь, более предпочтительно по меньшей мере девять и наиболее предпочтительно по меньшейPeptides and polypeptides bearing the antigenic epitope of the present invention, developed according to the above recommendations, preferably contain a sequence of at least seven, more preferably at least nine and most preferably at least

- 21 008007 мере от примерно 15 до примерно 30 аминокислот, находящихся внутри аминокислотной последовательности полипептида настоящего изобретения. Однако пептиды или полипептиды, содержащие большую часть аминокислотной последовательности полипептида настоящего изобретения, содержащие от примерно 30 до примерно 50 аминокислот, или любую длину до, включая всю аминокислотную последовательность полипептида настоящего изобретения, также считаются пептидами или полипептидами настоящего изобретения, несущими эпитоп, и также являются пригодными для стимулирования антител, которые реагируют с имитированным белком. Предпочтительно аминокислотную последовательность пептида, несущего эпитоп, выбирают для обеспечения существенной растворимости в водных растворителях (т.е. последовательность включает в себя относительно гидрофильные остатки, а высоко гидрофобные последовательности предпочтительно устраняют); и последовательности, содержащие остатки пролина, являются особенно предпочтительными.- 21 008007 from at least about 15 to about 30 amino acids within the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention. However, peptides or polypeptides containing most of the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention, containing from about 30 to about 50 amino acids, or any length up to, including the entire amino acid sequence of the polypeptide of the present invention, are also considered to be peptides or polypeptides of the present invention carrying an epitope, and are also suitable for stimulating antibodies that react with a simulated protein. Preferably, the amino acid sequence of the epitope-bearing peptide is selected to provide substantial solubility in aqueous solvents (i.e., the sequence includes relatively hydrophilic residues, and highly hydrophobic sequences are preferably eliminated); and sequences containing proline residues are particularly preferred.

Пептиды и полипептиды настоящего изобретения, несущие эпитоп, могут быть продуцированы при помощи любого обычного способа создания пептидов или полипептидов, включая рекомбинантные способы, использующие молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Например, короткая аминокислотная последовательность, несущая эпитоп, может быть слита с более большим полипептидом, который действует в качестве носителя во время продуцирования и очистки рекомбинанта, а также во время иммунизации для продуцирования антител к пептиду.The peptides and polypeptides of the present invention carrying an epitope can be produced using any conventional method for creating peptides or polypeptides, including recombinant methods using the nucleic acid molecules of the present invention. For example, a short amino acid sequence carrying an epitope can be fused to a larger polypeptide, which acts as a carrier during the production and purification of the recombinant, as well as during immunization to produce antibodies to the peptide.

Пептиды, несущие эпитоп, также могут быть синтезированы с использованием известных способов химического синтеза. Например, НоидЫеп описал простой способ синтеза большого количества пептидов, таких как 10-20 мг 248 различных пептидов из 13 остатков, представляющих собой единичные варианты аминокислот сегмента НА1 полипептида, который приготовили и охарактеризовали (при помощи исследований, связывающих ЕЫ8А тип) менее чем за четыре недели. НоидЫеп. К.А., Ргос. №111. Асаб. 8с1. США 82:5131-5135 (1985). Такой процесс одновременного синтеза множества пептидов (8МР8) дополнительно описан в патенте США 4631211 НоидЫеп и др. (1986). В этой процедуре отдельные смолы для синтеза в твердой фазе различных пептидов содержат в отдельных пакетах, проницаемых для растворителя, способствующих оптимальному использованию многих идентичных повторяющихся этапов, включенных в твердофазные способы.Peptides bearing an epitope can also be synthesized using known chemical synthesis methods. For example, NoIDEP described a simple method for the synthesis of a large number of peptides, such as 10-20 mg of 248 different peptides from 13 residues, which are single amino acid variants of the HA1 segment of the polypeptide, which was prepared and characterized (using studies linking the E8A type) in less than four weeks. Noidep. K.A., Rgos. No. 111. Asab. 8s1. US 82: 5131-5135 (1985). Such a process for the simultaneous synthesis of multiple peptides (8MP8) is additionally described in US Pat. No. 4,631,211 to Noid et al. (1986). In this procedure, individual resins for the synthesis in the solid phase of the various peptides are contained in separate solvent-permeable bags that facilitate the optimal use of many identical repeating steps included in the solid phase methods.

Полностью ручная процедура позволяет проводить одновременно 500-1000 или более синтезов. НоидЫеп и др., указанный выше, на 5134.A completely manual procedure allows 500-1000 or more syntheses to be performed simultaneously. Noidep et al., Cited above, at 5134.

Пептиды и полипептиды настоящего изобретения, несущие эпитоп, используют для индуцирования антител согласно способам, хорошо известным в данной области техники. См., например, 8и1с11йе и др., указанный выше; ^бкоп и др., указанный выше; Сйоте, М. и др., Ргос. №111. Асаб. США 82:910-914; и ВИПе, Р.1. и др. 1. Сеп. У1го1. 66:2347-2354 (1985).The peptides and polypeptides of the present invention carrying an epitope are used to induce antibodies according to methods well known in the art. See, for example, 8i1s11ye and others, indicated above; ^ bcop et al. above; Cioté, M. et al., Proc. No. 111. Asab. US 82: 910-914; and VIP, R.1. et al. 1. Sep. U1go1. 66: 2347-2354 (1985).

Обычно животные могут быть иммунизированы свободными пептидами; однако может быть усилен титр антител к белку путем присоединения пептида к носителю-макромолекуле, такому как гемоцианин лимфы улитки (КЬН) или столбнячный анатоксин. Например, пептиды, содержащие цистеин, могут быть соединены с носителем с использованием линкера, такого как малеимидобензоил-№гидроксисукцинимидовый эфир (МВ8), в то время как другие пептиды могут быть соединены с носителем с использованием более обычного связывающего агента, такого как глутаральдегид.Typically, animals can be immunized with free peptides; however, the titer of antibodies to the protein can be enhanced by attaching the peptide to a macromolecule carrier such as cochlear lymphocyte hemocyanin (KHN) or tetanus toxoid. For example, cysteine-containing peptides can be coupled to a carrier using a linker, such as maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MB8), while other peptides can be coupled to the carrier using a more conventional binding agent, such as glutaraldehyde.

Животных, таких как кролики, крысы и мыши, иммунизируют либо свободными, либо связанными с носителем пептидами, например при помощи интраперитонеального и/или интрадермального введения инъекции эмульсии, содержащей примерно 100 мкг пептида или белка-носителя и адъюванта Фрейнда. Для некоторых инъекций может потребоваться повторная иммунизация, например, с интервалом в две недели, для обеспечения пригодного титра антитела к белку, который может быть обнаружен, например, при помощи ЕЫ8А анализа с использованием свободного белка, адсорбированного на твердой поверхности. Титр антител к белку в сыворотке из иммунизированного животного может быть увеличен путем отбора антител к пептиду, например, путем адсорбции пептида на твердой подложке и элюции отобранных антител согласно способам, хорошо известным в данной области техники.Animals, such as rabbits, rats, and mice, are immunized with either free or carrier-bound peptides, for example, by intraperitoneal and / or intradermal injection of an emulsion containing about 100 μg of peptide or carrier protein and Freund's adjuvant. For some injections, re-immunization may be required, for example, at two-week intervals, to provide a suitable titer of an antibody to a protein that can be detected, for example, by an E8A assay using free protein adsorbed on a solid surface. The serum antibody titer of a protein from an immunized animal can be increased by selecting antibodies to the peptide, for example, by adsorbing the peptide on a solid support and eluting the selected antibodies according to methods well known in the art.

Иммуногенные пептиды настоящего изобретения, несущие эпитоп, т.е. такие части белка, которые вызывают ответ антитела, когда весь белок является иммуногеном, идентифицируют согласно способам, хорошо известным в данной области техники. Например, у Сеукеп и др., 1984, указанный выше, раскрыта процедура быстрого конкурентного синтеза на твердых подложках сотен пептидов достаточной очистки для реакции в исследовании иммуносорбента, подобного ферменту. Взаимодействие синтезированных пептидов с антителами затем легко обнаруживают без удаления их с подложки. В таком способе пептиды, несущие иммуногенный эпитоп желаемого белка, могут быть просто идентифицированы специалистом в данной области техники. Например, иммунологически важный эпитоп в белке оболочки вируса ящура был локализован Сеукеп и др. анализом нескольких аминокислот при помощи синтеза покрывающего набора всех 208 возможных гексапептидов, покрывающих полностью 213 аминокислотную последовательность белка. Затем был синтезирован полный набор замещений пептидов, в котором все 20 аминокислот были заменены, в свою очередь, в каждой позиции эпитопа и были определены конкретные аминокислоты, представляющие специфичность для реакции с антителом. Таким образом, пептиды, аналоги пептидов, несущих эпитоп, настоящего изобретения могут быть без затруднения созданы такимThe immunogenic peptides of the present invention carrying an epitope, i.e. such portions of a protein that elicit an antibody response when the entire protein is an immunogen are identified according to methods well known in the art. For example, Seukep et al., 1984, cited above, disclose a procedure for the rapid competitive synthesis on solid substrates of hundreds of peptides of sufficient purification for a reaction in an immunosorbent-like enzyme assay. The interaction of the synthesized peptides with antibodies is then easily detected without removing them from the substrate. In such a method, peptides carrying the immunogenic epitope of the desired protein can simply be identified by a person skilled in the art. For example, the immunologically important epitope in the FMD virus envelope protein was localized by Seucep et al. By analysis of several amino acids using the synthesis of a covering set of all 208 possible hexapeptides covering the entire 213 amino acid sequence of the protein. Then, a complete set of peptide substitutions was synthesized, in which all 20 amino acids were replaced, in turn, at each position of the epitope and specific amino acids that were specific for the reaction with the antibody were determined. Thus, peptides, analogues of peptides bearing the epitope of the present invention can be created without difficulty by such

- 22 008007 способом. Патент США 4708781 Сеукеп (1987) дополнительно раскрывает способ идентификации пептида, несущего иммунологический эпитоп желаемого белка.- 22 008007 way. US Patent 4,708,781 Seucep (1987) further discloses a method for identifying a peptide carrying an immunological epitope of a desired protein.

Более того, патент США 5194392 Сеукеп (1990) раскрыл обычный способ обнаружения или определения последовательности мономеров (аминокислот или других соединений), которая является топологическим эквивалентом пептида (т.е. имитирующим эпитопом), который комплементарен конкретному паратопу (сайту, связывающему антиген) интересующего антитела. В более общих выражениях, патент США 4433092 Сеукеп (1989) раскрыл способ обнаружения или определения последовательности мономеров, которая является топографическим эквивалентом лиганда, который является комплементарным лиганду, связывающему сайт конкретного интересующего рецептора. Подобным способом, патент США 5480971 НоидЫеп и др. (1996) на смесях пералкилированных аминопептидов раскрыл линию С1-С7алкил пералкилированных олигопептидов и наборы, и библиотеки таких пептидов, а также способы для использования таких наборов и библиотек пептидов для определения последовательности пералкилированного олигопептида, который предпочтительно связывается с интересующей молекулой акцептора. Таким образом, непептиды, аналоги пептидов, несущих эпитоп, настоящего изобретения также могут быть без затруднения изготовлены такими способами.Moreover, US Pat. No. 5,194,392 to Seukep (1990) disclosed a conventional method for detecting or determining a sequence of monomers (amino acids or other compounds) that is the topological equivalent of a peptide (i.e., an imitating epitope) that is complementary to a particular paratope (antigen binding site) of interest antibodies. In more general terms, US Pat. No. 4,433,092 to Seucup (1989) disclosed a method for detecting or determining the sequence of monomers, which is the topographic equivalent of a ligand, which is complementary to the ligand that binds the site of a particular receptor of interest. In a similar manner, US Pat. No. 5,480,971 to NoidEp et al. (1996), on mixtures of peralkylated amino peptides, disclosed a line of C1-C7 alkyl peralkylated oligopeptides and kits and libraries of such peptides, as well as methods for using such kits and peptide libraries to determine the sequence of a peralkylated oligopeptide, which is preferably binds to the acceptor molecule of interest. Thus, non-peptides, analogues of peptides bearing the epitope of the present invention can also be made without difficulty by such methods.

Использование липолитических ферментов в промышленных процессахThe use of lipolytic enzymes in industrial processes

Настоящее изобретение также относится к использованию липолитического фермента согласно настоящему изобретению в определенных промышленных процессах. Несмотря на длительный опыт, приобретенный в таких процессах, липолитический фермент согласно настоящему изобретению имеет несколько отличительных существенных преимуществ по сравнению с ныне используемыми ферментами. В зависимости от конкретного применения такие преимущества могут включать в себя аспекты, подобно более низкой цене производства, более высокой специфичности в отношении субстрата, меньшей аллергенности, меньшего количества нежелательных побочных активностей, более высокое получение при продуцировании в подходящем микроорганизме, более подходящий рН и температурные режимы, улучшенный вкус и конечное изделие, а также аспекты качества пищи и чистоты продукта.The present invention also relates to the use of the lipolytic enzyme according to the present invention in certain industrial processes. Despite the long experience gained in such processes, the lipolytic enzyme according to the present invention has several distinct significant advantages over the currently used enzymes. Depending on the specific application, such advantages may include aspects like a lower production price, higher specificity for the substrate, less allergenicity, less undesirable side activities, higher production when produced in a suitable microorganism, more suitable pH and temperature conditions , improved taste and final product, as well as aspects of food quality and product purity.

Настоящее изобретение также относится к способам приготовления теста или печеного изделия, содержащего включенное в тесто эффективное количество липолитического фермента настоящего изобретения, которое улучшает одно или несколько свойств теста или печеного изделия, полученного из этого теста относительно теста или печеного изделия, в которые не включен полипептид.The present invention also relates to methods for preparing a dough or a baked product containing an effective amount of a lipolytic enzyme included in the dough of the present invention, which improves one or more properties of the dough or baked product obtained from this test with respect to the dough or baked product, in which the polypeptide is not included.

Фраза включен в тесто определена в настоящем описании как добавка липолитического фермента согласно настоящему изобретению в тесто, любой ингредиент, из которого может быть сделано тесто, и/или любую смесь ингредиентов теста, из которых может быть сделано тесто. Другими словами, липолитический фермент согласно настоящему изобретению может быть добавлен на любом этапе приготовления теста и может быть добавлен в один, два или несколько этапов. Липолитический фермент согласно настоящему изобретению добавляют в ингредиенты теста, которые замешивают и пекут для изготовления печеного изделия с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. См., например, патент США 4567046, ЕР-А-426,211, ДР-А-60-78529, ХР-А-62-111629 и ДР-А-63-258528.The phrase included in the dough is defined herein as the addition of the lipolytic enzyme according to the present invention to the dough, any ingredient from which the dough can be made, and / or any mixture of dough ingredients from which the dough can be made. In other words, the lipolytic enzyme according to the present invention can be added at any step in the preparation of the dough and can be added in one, two or more steps. The lipolytic enzyme of the present invention is added to dough ingredients that are kneaded and baked to make a baked product using methods well known in the art. See, for example, US Pat. No. 4,567,046, EP-A-426,211, DR-A-60-78529, XP-A-62-111629 and DR-A-63-258528.

Термин эффективное количество определен в настоящем описании как количество липолитического фермента согласно настоящему изобретению, которое достаточно для обеспечения измеряемого эффекта, по меньшей мере, интересующего свойства теста и/или печеного изделия.The term effective amount is defined herein as the amount of a lipolytic enzyme according to the present invention which is sufficient to provide a measurable effect of at least the properties of the dough and / or baked product of interest.

Термин улучшенное свойство определен в настоящем описании как любое свойство теста и/или изделия, полученного из теста, особенно печеного изделия, которое улучшено действием липолитического фермента согласно настоящему изобретению относительно теста или продукта, в которые не включен липолитический фермент согласно настоящему изобретению. Улучшенное свойство может включать, без ограничений, увеличенную прочность теста, увеличенную эластичность теста, увеличенную стабильность теста, уменьшенную липкость теста, улучшенную растяжимость теста, улучшенный вкус печеного изделия, улучшенное античерствление печеного изделия.The term “enhanced property” is defined herein as any property of a dough and / or product obtained from a dough, especially a baked product, which is enhanced by the action of the lipolytic enzyme according to the present invention with respect to the test or product that does not include the lipolytic enzyme according to the present invention. An improved property may include, without limitation, increased strength of the dough, increased elasticity of the dough, increased stability of the dough, reduced stickiness of the dough, improved extensibility of the dough, improved taste of the baked product, improved anti-baking of the baked product.

Улучшенное свойство может быть определено путем сравнения теста и/или печеного изделия, приготовленного с добавлением полипептида настоящего изобретения согласно способам настоящего изобретения, описанным ниже в примерах, или без добавления. Органолептические качества могут быть оценены с использованием процедур, хорошо отработанных в хлебопекарной промышленности, и могут включать, например, использование группы квалифицированных экспертов-дегустаторов.An improved property can be determined by comparing the dough and / or the baked product prepared with or without adding the polypeptide of the present invention according to the methods of the present invention described below in the examples. Organoleptic qualities can be evaluated using procedures well-established in the baking industry, and may include, for example, the use of a group of qualified expert tasters.

Термин увеличенная прочность теста определен в настоящем описании как свойство теста, которое обычно имеет эластичные свойства и/или требует большего вклада работы в формование и придание формы.The term increased strength of the dough is defined in the present description as a property of the dough, which usually has elastic properties and / or requires a greater contribution of work to molding and shaping.

Термин увеличенная эластичность теста определен в настоящем описании как свойство теста, которое обычно имеет большую тенденцию к восстановлению своей первоначальной формы после того, как оно было подвергнуто некоторому физическому растяжению.The term increased elasticity of the test is defined in the present description as a property of the test, which usually has a great tendency to restore its original shape after it has been subjected to some physical stretching.

Термин увеличенная стабильность теста определен в настоящем описании как свойство теста, которое менее восприимчиво к механическим воздействиям, таким образом, лучше поддерживающее свою форму и объем.The term increased stability of the test is defined in the present description as a property of the test, which is less susceptible to mechanical stress, thus, better supporting its shape and volume.

Термин уменьшенная липкость теста определен в настоящем описании как свойство теста, котоThe term reduced stickiness of the test is defined in the present description as a property of the test, which

- 23 008007 рое имеет уменьшенную тенденцию прилипания к поверхности, например, при механическом производстве теста, и является легко оцениваемым эмпирически пекарем-лаборантом или измеряемым с использованием анализатора текстуры (например, ТАХТ2), известными в данной области техники.- 23 008007 Roy has a reduced tendency to adhere to the surface, for example, in the mechanical production of dough, and is an easily evaluated empirically laboratory baker or measured using a texture analyzer (e.g., TACT2) known in the art.

Термин улучшенная растяжимость теста определен в настоящем описании как свойство теста, которое может быть подвергнуто увеличенному натяжению или растяжению без разрыва.The term improved elongation of the test is defined in the present description as a property of the test, which can be subjected to increased tension or stretching without breaking.

Термин улучшенная способность теста к механической обработке определен в настоящем описании как свойство теста, которое является обычно менее тягучим, и/или более плотным, и/или более эластичным.The term improved machining ability of the dough is defined in the present description as a property of the dough, which is usually less viscous and / or more dense and / or more elastic.

Термин увеличенный объем печеного изделия измеряется как определенный объем данного батона хлеба (объем/вес), обычно определяемый традиционным способом определения с использованием рапсового семени.The term increased volume of a baked product is measured as the specific volume of a given loaf of bread (volume / weight), usually defined by the traditional method of determination using rapeseed.

Термин улучшенная структура хлебного мякиша печеного изделия определен в настоящем описании как свойство печеного изделия с более удлиненными и/или тонкими стенками ячеек в хлебном мякише и/или более однородным и/или гомогенным распределением ячеек в хлебном мякише и обычно оценивается эмпирически пекарем-лаборантом.The term improved structure of the bread crumb of a baked product is defined in the present description as a property of a baked product with more elongated and / or thiner cell walls in the bread crumb and / or a more uniform and / or homogeneous distribution of cells in the bread crumb and is usually evaluated empirically by a laboratory assistant.

Термин улучшенная мягкость печеного изделия противопоставлен твердости и определен в настоящем описании как свойство печеного изделия, которое является более легко сжимаемым и легко оценивается эмпирически пекарем-лаборантом или измеряется с использованием анализатора (например, ТАХТ2), известным в данной области техники.The term improved softness of a baked product is opposed to hardness and is defined in the present description as a property of a baked product, which is more easily compressible and is easily evaluated empirically by a laboratory assistant or measured using an analyzer (e.g., TAXT2) known in the art.

Термин улучшенный вкус печеного изделия оценивают при помощи группы квалифицированных дегустаторов.The term improved taste of a baked product is evaluated using a group of qualified tasters.

Термин улучшенное античерствление печеного изделия определен в настоящем описании как свойства печеного изделия, которые имеют уменьшенную скорость ухудшения параметров качества, например, мягкости и/или эластичности, во время хранения.The term improved anti-curing of a baked product is defined herein as properties of a baked product that have a reduced rate of deterioration of quality parameters, for example, softness and / or elasticity, during storage.

Термин тесто определен в настоящем описании как смесь муки и других ингредиентов, достаточно плотных для замешивания или раскатывания. Тесто может быть свежим, замороженным, предварительно раскатанным или подвергнутым предварительной термообработке. Приготовление замороженного теста описано Ки1р и йогеп/ в Егохеп апб РеГпдеШеб ЭоидН апб Вайегк.The term dough is defined herein as a mixture of flour and other ingredients that are sufficiently dense to knead or roll. The dough can be fresh, frozen, pre-rolled or pre-cooked. The preparation of the frozen dough is described by Ki1r and yogep / in Ehekhep ap ReGpdeSheb EoidN apb Vayegk.

Термин печеное изделие определен в настоящем описании как любой продукт, приготовленный из теста, либо мягкого, либо хрустящего типа. Примеры печеных изделий, любых белого, серого или черного типа, которые могут быть преимущественно изготовлены при помощи настоящего изобретения, являются хлебом (более конкретно белым хлебом, хлебом из ржаной муки или ржаного шрота) обычно в виде батонов или бубликов, длинного французского хлеба, макаронных изделий, лаваша, тортильи, тако, тортов, блинов, бисквитов, булочек, хлебной крошки, парового хлеба и хрустящего хлеба или т.п.The term baked product is defined herein as any product made from dough, either soft or crunchy. Examples of baked goods, of any white, gray or black type, which can be predominantly made using the present invention, are bread (more specifically white bread, rye flour bread or rye meal), usually in the form of loaves or bagels, long French bread, pasta products, pita bread, tortilla, tacos, cakes, pancakes, biscuits, rolls, bread crumbs, steamed bread and crisp bread, etc.

Липолитический фермент настоящего изобретения и/или дополнительные ферменты, предназначенные для использования в способах настоящего изобретения, могут быть в любом виде, подходящем для рассматриваемого использования, например, в виде сухого порошка, быстрорастворимого порошка, или гранулята, более конкретно, непорошкообразного гранулята, жидкости, более конкретно, стабилизированной жидкости или защищенного фермента, такого как описано в А001/11974 и А002/26044. Гранулы и быстрорастворимые порошки могут быть приготовлены обычными способами, например путем распыления липолитического фермента согласно настоящему изобретению на носитель в гранулятор с псевдоожиженным слоем. Носитель может состоять из отдельных ядер, имеющих подходящие размеры частиц. Носитель может быть растворимым и нерастворимым, например солью (такой как №С1 или сульфат натрия), сахаром (таким как сахароза или лактоза), сахарным спиртом (таким как сорбитол), крахмалом, рисом, измельченным зерном или соей. Липолитический фермент согласно настоящему изобретению и/или дополнительные ферменты могут содержаться в препаратах замедленного освобождения. Способы приготовления препаратов замедленного освобождения хорошо известны в данной области техники. Добавление пригодных для пищи стабилизаторов, таких как сахар, сахарный спирт или других полиолей и/или молочной кислоты или другой органической кислоты согласно установленным способам могут, например, стабилизировать жидкие ферментативные препараты.The lipolytic enzyme of the present invention and / or additional enzymes intended for use in the methods of the present invention may be in any form suitable for the intended use, for example, in the form of a dry powder, instant powder, or granulate, more specifically, non-powdered granulate, liquid, more specifically, a stabilized liquid or a protected enzyme, such as described in A001 / 11974 and A002 / 26044. Granules and instant powders can be prepared by conventional methods, for example by spraying the lipolytic enzyme of the present invention onto a carrier in a fluidized bed granulator. The carrier may consist of individual nuclei having suitable particle sizes. The carrier may be soluble and insoluble, for example, a salt (such as No. C1 or sodium sulfate), sugar (such as sucrose or lactose), sugar alcohol (such as sorbitol), starch, rice, ground grain or soy. The lipolytic enzyme of the present invention and / or additional enzymes may be contained in sustained release formulations. Methods for preparing sustained release preparations are well known in the art. The addition of edible stabilizers such as sugar, sugar alcohol or other polyols and / or lactic acid or other organic acid according to established methods can, for example, stabilize liquid enzyme preparations.

Липолитический фермент согласно настоящему изобретению также может быть включен в дрожжи, содержащие композиции, такие как раскрытые в ЕР-А-0619947, ЕР-А-0659344 и А002/49441.The lipolytic enzyme according to the present invention can also be included in yeast containing compositions, such as disclosed in EP-A-0619947, EP-A-0659344 and A002 / 49441.

Преимуществом является то, что для добавления в заранее приготовленные смеси муки полипептиды согласно настоящему изобретению находятся в виде сухого продукта, например непорошкообразно гранулированного, в то время как для добавления вместе с жидкостью он находится преимущественно в жидком виде.An advantage is that for addition to flours prepared in advance, the polypeptides of the present invention are in the form of a dry product, for example powder granular, while for addition together with the liquid it is predominantly in liquid form.

Один или несколько дополнительных ферментов также могут быть добавлены в тесто. Дополнительный фермент может быть любого происхождения, включая животное или растительное, и предпочтительно микробное (бактериальное, дрожжевое или грибковое) происхождение и может быть получен при помощи техник, обычно используемых в данной области техники.One or more additional enzymes can also be added to the dough. The additional enzyme can be of any origin, including animal or plant, and preferably microbial (bacterial, yeast or fungal) origin and can be obtained using techniques commonly used in the art.

В предпочтительном варианте осуществления дополнительный фермент может быть амилазой, такой как альфа-амилаза (пригодная для обеспечения сахара, способного к брожению при помощи дрожIn a preferred embodiment, the additional enzyme may be amylase, such as alpha-amylase (suitable for providing sugar that is capable of fermentation by yeast

- 24 008007 жей и замедляющая черствление) или бета-амилаза. циклодекстрин глюканотрансфераза. пептидаза. более конкретно. экзопептидаза (пригодная для усиления вкуса). трансглутаминаза. липаза (пригодная для модификации липидов. присутствующих в тесте или компонентах теста для размягчения теста). фосфолипаза. целлюлаза. гемицеллюлаза. более конкретно. пентозаназа. такая как ксиланаза (пригодная для частичного гидролиза пентозанов. которые увеличивают растяжимость теста). протеаза (пригодная для ослабления клейковины. более конкретно. при использовании муки из твердой пшеницы). изомераза дисульфидных белков. например. изомераза дисульфидных белков. как раскрыто в \У095/00636. гликозилтрансфераза. пероксидаза (пригодная для улучшения консистенции теста). лакказа или оксидаза. например глюкозооксидаза. гексозооксидаза. альдозооксидаза. пиранозооксидаза. липоксигеназа или оксидаза Ь-аминокислот (пригодная для улучшения консистенции теста).- 24 008007 dj and retardation of stiffening) or beta-amylase. cyclodextrin glucanotransferase. peptidase. more specific. exopeptidase (suitable for enhancing taste). transglutaminase. lipase (suitable for modifying lipids present in the test or components of the test to soften the test). phospholipase. cellulase. hemicellulase. more specific. pentosanase. such as xylanase (suitable for partial hydrolysis of pentosans. which increase the elongation of the dough). protease (suitable for weakening gluten. more specifically. when using durum wheat flour). disulfide protein isomerase. eg. disulfide protein isomerase. as disclosed in \ U095 / 00636. glycosyltransferase. peroxidase (suitable for improving the consistency of the test). laccase or oxidase. for example glucose oxidase. hexose oxidase. aldose oxidase. pyranose oxidase. L-amino acid lipoxygenase or oxidase (suitable for improving the consistency of the test).

Если одна или несколько активностей дополнительных ферментов добавлены по способам настоящего изобретения. такие активности могут быть добавлены отдельно или вместе с полипептидом согласно настоящему изобретению. необязательно в качестве компонента(компонентов) композиции. улучшающей хлеб и/или улучшающей муку. Другие ферментативные активности могут быть любыми ферментами. описанными выше и могут быть дозированы согласно установленной практике хлебопечения.If one or more activities of additional enzymes are added according to the methods of the present invention. such activities may be added separately or together with the polypeptide of the present invention. optionally as a component (s) of the composition. improving bread and / or improving flour. Other enzymatic activities may be any enzymes. described above and can be dosed according to established bakery practice.

Настоящее изобретение также относится к способам приготовления печеных изделий. включающих выпекание теста. полученного способом настоящего изобретения для производства печеного изделия. Выпекание теста для производства печеного изделия может быть выполнено с использованием способов. хорошо известных в данной области техники.The present invention also relates to methods for preparing baked goods. including baking dough. obtained by the method of the present invention for the production of a baked product. Baking dough for the production of a baked product can be performed using methods. well known in the art.

Настоящее изобретение также относится к тесту и печеным изделиям. соответственно. произведенным способами настоящего изобретения.The present invention also relates to dough and baked goods. respectively. produced by the methods of the present invention.

Настоящее изобретение дополнительно относится к предварительной смеси. например. в виде композиции муки. для теста и/или печеных изделий. приготовленных из теста. причем предварительная смесь содержит полипептид настоящего изобретения. Термин предварительная смесь определен в настоящем описании для понимания ее в обычном значении. т.е. как смесь агентов печения. обычно включающих в себя муку. которая может быть использована не только в установках/оборудовании промышленного хлебопечения. но также в пекарнях розничной продажи. Предварительная смесь может быть приготовлена путем смешивания полипептида или композиции. улучшающей хлеб и/или улучшающей тесто настоящего изобретения. содержащей полипептид. с подходящим носителем. таким как мука. крахмал. сахар или соль. Предварительная смесь может содержать другие добавки. улучшающие тесто и/или улучшающие хлеб. например. любые добавки. включающие ферменты. упомянутые выше.The present invention further relates to a premix. eg. in the form of a flour composition. for dough and / or baked products. cooked from dough. moreover, the preliminary mixture contains the polypeptide of the present invention. The term pre-mix is defined in the present description to understand it in its usual meaning. those. as a mixture of baking agents. usually including flour. which can be used not only in plants / equipment for industrial bakery. but also in retail bakeries. A pre-mix can be prepared by mixing the polypeptide or composition. improving bread and / or improving the dough of the present invention. containing a polypeptide. with a suitable carrier. such as flour. starch. sugar or salt. The premix may contain other additives. improving dough and / or improving bread. eg. any additives. including enzymes. mentioned above.

Настоящее изобретение дополнительно относится к хлебопекарным добавкам в виде гранулированного или быстрорастворимого порошка. который содержит полипептид настоящего изобретения. Дополнительная хлебопекарная добавка предпочтительно имеет узкое распределение размера частиц с более чем 95% (по весу) частиц в области от 25 до 500 мкм.The present invention further relates to bakery additives in the form of a granular or instant powder. which contains the polypeptide of the present invention. The additional baking additive preferably has a narrow particle size distribution with more than 95% (by weight) of particles in the region of 25 to 500 microns.

Для теста и хлеба производство настоящего изобретения может быть использовано в комбинации со вспомогательными веществами обработки. определенными ранее в настоящем описании. такими как вспомогательные вещества химической обработки. таким как оксиданты (например аскорбиновая кислота). восстанавливающие агенты (например Ь-цистеин). оксидоредуктазы (например. глюкозооксидаза) и/или другие ферменты. такие как ферменты. модифицирующие полисахариды (например. α-амилаза. гемицеллюлаза. ферменты для печения и т.д.). и/или ферменты. модифицирующие белки (эндопротеаза. экзопротеаза. ферменты для печения и т.д.).For dough and bread, the manufacture of the present invention can be used in combination with processing aids. defined earlier in the present description. such as chemical processing aids. such as oxidizing agents (e.g. ascorbic acid). reducing agents (e.g. b-cysteine). oxidoreductases (e.g. glucose oxidase) and / or other enzymes. such as enzymes. modifying polysaccharides (e.g. α-amylase. hemicellulase. liver enzymes, etc.). and / or enzymes. modifying proteins (endoprotease. exoprotease. enzymes for liver, etc.).

Пример 1. Ферментация АзретдШиз шдетExample 1. Fermentation Azretd Schiz

Липолитические ферменты. кодируемые нуклеотидной последовательностью. как предусмотрено в настоящем описании. получили путем конструирования плазмид экспрессии. содержащих последовательности ДНК. трансформации штамма А. шдет такой плазмидой и культивирования штаммов А. шдет следующим ниже способом.Lipolytic enzymes. encoded by the nucleotide sequence. as provided herein. obtained by constructing expression plasmids. containing DNA sequences. the transformation of strain A. sits with such a plasmid and the cultivation of strains of A. sows in the following manner.

Свежие споры (10⁶-10⁷) штаммов А. шдет инокулировали в 20 мл С8Ь среды (100 мл флакон. перегородка) и культивировали в течение 20-24 ч при 34°С и 170 об./мин. После инокуляции 5-10 мл С8Ь перед культивированием в 100 мл С8М среде (500 мл флакон. перегородка) штаммы ферментировали при 34°С и 170 об./мин в течение 3-5 дней.Fresh spores (10 ⁶ -10 ⁷ ) of A. shade strains were inoculated into 20 ml of C8b medium (100 ml vial. Septum) and cultured for 20-24 hours at 34 ° C and 170 rpm. After inoculation of 5-10 ml of C8L before cultivation in 100 ml of C8M medium (500 ml vial septum), the strains were fermented at 34 ° C and 170 rpm for 3-5 days.

Бесклеточные супернатанты получили центрифугированием в 50 мл флаконах Стешет (30 мин. 5000 об./мин). Супернатанты предварительно отфильтровали микроволокнистым фильтром СЕ/А \УНа1тап С1азз (150 мм Е) для удаления более больших частиц. до рН 5 доводили 4 н КОН (по необходимости) и стерильно отфильтровали 0.2 мкм (с бутылочным верхом) фильтром со всасыванием для удаления грибкового материала. Супернатанты хранили при 4°С (или -20°С).Cell-free supernatants were obtained by centrifugation in 50 ml Steshet vials (30 min. 5000 rpm). The supernatants were pre-filtered with a CE / A \ UNA1tap C1azz microfiber filter (150 mm E) to remove larger particles. 4 N KOH was adjusted to pH 5 (if necessary) and 0.2 μm (bottle top) was sterile filtered with a suction filter to remove fungal material. Supernatants were stored at 4 ° C (or -20 ° C).

Среда С8Ь состояла из (в количестве на 1 л): 100 г Сот 81еер 8о11бз (ИоциеПе). 1 г NаΗ₂Ρ0₄Ή₂0. 0.5 г Мд80₄-7Н₂0. 10 г глюкоза-Н₂0 и 0.25 г Вазйбоп (пеногаситель). Ингредиенты растворили в половине объема воды и рН довели до рН 5.8 при помощи №10Н или Н₂80₄; 100 мл флакон с перегородкой и шариком для вспенивания заполнили 20 мл бульона ферментации и стерилизовали в течение 20 мин при 120°С. после чего 200 мкл раствора. содержащего 5000 ΐυ/мл пенициллина и 5 мг/мл стрептомицина. добавили в каждый флакон после охлаждения до комнатной температуры.The C8b medium consisted of (in an amount per 1 liter): 100 g Sot 81eer 8o11bz (Iocepe). 1 g NaΗ ₂ Ρ 0 ₄ Ή ₂ 0. 0.5 g MD80 ₄ -7H ₂ 0. 10 g glucose-H ₂ 0 and 0.25 g Wazybop (antifoam). The ingredients were dissolved in half the volume of water and the pH was adjusted to pH 5.8 using No. 10H or H ₂ 80 ₄ ; A 100 ml vial with a septum and a foaming ball was filled with 20 ml of fermentation broth and sterilized for 20 min at 120 ° C. then 200 μl of solution. containing 5000 ΐυ / ml penicillin and 5 mg / ml streptomycin. added to each vial after cooling to room temperature.

- 25 008007- 25 008007

С8М среда состояла из (в количестве на литр): 150 г мальтоза-Н₂0, 60 г 8оу1опе (пептон), 1 г №Н₂Р0₄-Н₂0, 15 г Мд80₄-7Н₂0, 0,08 Твин 80, 0,02 г Вазййоп (пеногаситель), 20 г МЕ8, 1 г Ь-аргинина. Ингредиенты растворили в половине объема воды и рН довели до рН 6,2 при помощи №0Н или Н₂80₄; 100 мл флакон с перегородкой и шариком для вспенивания заполнили 100 мл бульона ферментации и стерилизовали в течение 120 мин при 120°С, после чего 1 мл раствора, содержащего 5000 ГО/мл пенициллина и 5 мг/мл стрептомицина, добавили в каждый флакон после охлаждения до комнатной температуры.C8M medium consisted of (in amount per liter): 150 g maltose-H ₂ 0, 60 g 8ou1ope (peptone), 1 g WH ₂ P0 ₄ H ₂ 0, 15 g Md80 ₄ -7H ₂ 0, 0.08 Tween 80, 0.02 g Wazyop (antifoam), 20 g ME8, 1 g L-arginine. The ingredients were dissolved in half the volume of water and the pH was adjusted to a pH of 6.2 using No. 0H or H ₂ 80 ₄ ; A 100 ml vial with a septum and a foaming ball was filled with 100 ml of fermentation broth and sterilized for 120 min at 120 ° C, after which 1 ml of a solution containing 5000 GO / ml of penicillin and 5 mg / ml streptomycin was added to each bottle after cooling to room temperature.

Пример 2. Очистка липолитических ферментов настоящего изобретенияExample 2. Purification of lipolytic enzymes of the present invention

Этап 1 - Приготовление ультрафильтратовStage 1 - Preparation of ultrafiltrates

Выполнили ультрафильтрацию супернатантов культур, которые получены в примере 1, для удаления низкомолекулярных загрязнений, которые могут мешать при определении ферментативной активности и тестах при выпечке. Ультрафильтрацию 30 мл супернатанта проводили системой МйНроге ЕаЬзса1е ТЕЕ, оборудованной фильтром с 10 кОа границей пропускания.Ultrafiltration of the culture supernatants obtained in Example 1 was performed to remove low molecular weight contaminants that may interfere with enzymatic activity determination and baking tests. Ultrafiltration of 30 ml of the supernatant was carried out by a MyNrohe Ebz1e TEE system equipped with a filter with a 10 kOa transmission boundary.

В зависимости от цвета образцы промывали 3-5 раз 40 мл объемами 100 мМ холодного фосфатного буфера рН 6,0, включающего в себя 0,5 мМ СаС1₂. Конечный объем раствора фермента составил 30 мл и далее он упоминается как ультрафильтрат.Depending on the color, the samples were washed 3-5 times with 40 ml in volumes of 100 mm cold phosphate buffer pH 6.0, including 0.5 mm CaCl ₂ . The final volume of the enzyme solution was 30 ml and is hereinafter referred to as ultrafiltrate.

Этап 2 - Определение концентрации липолитических ферментов при помощи А280 и НР8ЕС.Stage 2 - Determination of the concentration of lipolytic enzymes using A280 and HP8ES.

Концентрацию липолитических ферментов в ультрафильтрате вычислили из экстинкции при 280 нм (А280), свойственной липолитическим ферментам, и вычислили коэффициент молекулярной экстинкции липолитических ферментов. Измерение А280 выполнили спектрометром Иу1коп ХБ 8есошаш (Веип 4е Копйе, АЬсоийе, Нидерланды).The concentration of lipolytic enzymes in the ultrafiltrate was calculated from extinction at 280 nm (A280) inherent to lipolytic enzymes, and the molecular extinction coefficient of lipolytic enzymes was calculated. Measurement of A280 was carried out by a Hu1kop HB 8esoshash spectrometer (Beip 4e Kopie, Alsoye, the Netherlands).

Коэффициент молекулярной экстинкции фермента может быть вычислен из количества остатков тирозина, триптофана и цистеина на молекулу (8.С. С111 Р.Н. уоп Н1рре1, Апа1.Вюсйеш. 182, 319-326 (1989)). Коэффициент молекулярной экстинкции этих аминокислот составляет 1280, 5690 и 120 М¹-см^-1, соответственно. Количество остатков тирозина, триптофана и цистеина в липолитических ферментах настоящего изобретения может быть выведено из последовательностей 8ЕЦ ΙΏ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 и 39. Вычисленные коэффициенты ослабления липолитических ферментов настоящего изобретения суммированы в табл. 2.The molecular extinction coefficient of the enzyme can be calculated from the number of tyrosine, tryptophan, and cysteine residues per molecule (8.C. C111 R.N. uop H1pre1, Apa1. Vyusyesh. 182, 319-326 (1989)). The molecular extinction coefficient of these amino acids is 1280, 5690 and 120 M ¹ -cm ^-1 , respectively. The amount of tyrosine, tryptophan and cysteine residues in the lipolytic enzymes of the present invention can be deduced from the sequences 8EC ΙΏ N0: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 39. The calculated attenuation coefficients lipolytic enzymes of the present invention are summarized in table. 2.

Таблица 2table 2

Липолитиче ский фермент Lipolytic enzyme ЗЕ<2 10 ΝΟ: ZE <2 10 ΝΟ: # аминокислоты # amino acids Вычисленное М.И. (Оа) Calculated M.I. (Oah) Вычисленный коэффициент экстинкции при 280 нм The calculated extinction coefficient at 280 nm Тгр Tgr Туг Tug Суз Suz мУсм ¹ musm ¹ 1 (мг/мл^{1 γ}·1 (mg / ml ^{1 γ} см ¹ cm ¹ ΝΒΕ028 ΝΒΕ028 3 3 13 thirteen 26 26 6 6 64141 64141 107970 107970 1,7 1.7 ΝΒΕ029 ΝΒΕ029 6 6 14 14 27 27 6 6 63250 63250 114940 114940 1,8 1.8 ΝΒΕ030 ΝΒΕ030 9 9 17 17 26 26 6 6 59952 59952 130730 130730 2,2 2.2 ΝΒΕ031 ΝΒΕ031 12 12 9 9 27 27 4 4 61173 61173 86250 86250 1,4 1.4 ΝΒΕ032 ΝΒΕ032 15 fifteen 3 3 13 thirteen 6 6 29683 29683 34430 34430 1,2 1,2 ΝΒΕ033 ΝΒΕ033 18 18 7 7 24 24 2 2 44890 44890 70790 70790 1,6 1,6 ΝΒΕ034 ΝΒΕ034 21 21 11 eleven 19 19 7 7 53796 53796 87750 87750 1,6 1,6 ΝΒΕ036 ΝΒΕ036 24 24 10 10 23 23 7 7 64945 64945 87180 87180 1,3 1.3 ΝΒΕ038 ΝΒΕ038 27 27 13 thirteen 29 29th 4 4 55161 55161 111570 111570 2,2 2.2 ΝΒΕ039 ΝΒΕ039 30 thirty 11 eleven 26 26 6 6 59298 59298 96590 96590 1,6 1,6 ΝΒΕ043 ΝΒΕ043 33 33 16 16 35 35 8 8 62564 62564 136800 136800 2,2 2.2 ΝΒΕ045 ΝΒΕ045 36 36 0 0 6 6 6 6 26688 26688 8400 8400 0,31 0.31 ΝΒΕ042 ΝΒΕ042 39 39 14 14 30 thirty 7 7 61593 61593 118900 118900 1,9 1.9

Экстинкция ультрафильтрата при 280 нм (А280), которая является свойством липолитических ферментов, зависит от чистоты образца фермента. Чистота, определенная с использованием НР8ЕС (высокоразрешающей хроматографией по размеру молекул) с Т8К 8\¥-Х1. колонкой (300-7,8 мм; область М^ 10-300 кОа). Буфер для элюции состоял из 25 мМ натрий фосфатного буфера рН 6,0 и был использован поток 1 мл/мин. Инъецировали 5-100 мкл образцы. Измерили поглощение при 280 нм.The extinction of the ultrafiltrate at 280 nm (A280), which is a property of lipolytic enzymes, depends on the purity of the enzyme sample. Purity determined using HP8ES (high resolution molecular size chromatography) with T8K 8 \ ¥ -X1. column (300-7.8 mm; region M ^ 10-300 kOa). The elution buffer consisted of 25 mM sodium phosphate buffer pH 6.0 and a flow of 1 ml / min was used. 5-100 μl samples were injected. The absorbance was measured at 280 nm.

А280 в ультрафильтратах, свойственное липолитическому ферменту настоящего изобретения, получили из отношения поверхности пика к пику соответствующего липолитического фермента в хроматограмме и общей поверхности пиков поглощения при 280 нм. Затем для каждого липолитического фермента вычислили концентрацию липолитического фермента в ультрафильтрате путем умножения А280 ультрафильтрата на отношение, описанное выше, и разделили на вычисленный коэффициент экстинкцииA280 in ultrafiltrates, characteristic of the lipolytic enzyme of the present invention, was obtained from the ratio of the peak surface to the peak of the corresponding lipolytic enzyme in the chromatogram and the total surface of the absorption peaks at 280 nm. Then, for each lipolytic enzyme, the concentration of the lipolytic enzyme in the ultrafiltrate was calculated by multiplying the A280 ultrafiltrate by the ratio described above, and divided by the calculated extinction coefficient

- 26 008007 (1 мг/мл раствора - табл. 2 - самая большая правая колонка). Пример 3. Измерения активностей- 26 008007 (1 mg / ml of solution - table. 2 - the largest right column). Example 3. Measurement of activities

Бесклеточные супернатанты, полученные в примере 1, исследовали при помощи липазы, фосфолипазы и галактолипазы, что показано в табл. 3.Cell-free supernatants obtained in example 1 were investigated using lipase, phospholipase and galactolipase, as shown in table. 3.

Таблица 3. Активности липолитических ферментов в бесклеточных супернатантах, как приготовлено в примере 1Table 3. The activity of lipolytic enzymes in acellular supernatants, as prepared in example 1

Липолитический фермент Lipolytic enzyme липаза lipase фосфолипаза А phospholipase A лизофосфолипаза lysophospholipase галактолипаза galactolipase ΝΒΕ028 ΝΒΕ028 + + + + + + 0 0 ΝΒΕ029 ΝΒΕ029 + + + + + + 0 0 ΝΒΕ031 ΝΒΕ031 +++ +++ + + + + + + ΝΒΕ032 ΝΒΕ032 ++ ++ + + + + 0 0 ΝΒΕ033 ΝΒΕ033 + + ++ ++ + + + + ΝΒΕ034 ΝΒΕ034 0 0 + + 0 0 0 0 ΝΒΕ036 ΝΒΕ036 0 0 + + 4- 4- 0 0 ΝΒΕ038 ΝΒΕ038 0 0 + + 0 0 0 0 ΝΒΕ039 ΝΒΕ039 + + 0 0 0 0 0 0 ΝΒΕ043 ΝΒΕ043 + + 0 0 0 0 0 0

= нет отличия от контроля;= no difference from control;

+/++/+++ =выше, чем контроль.+ / ++ / +++ = higher than control.

Активность липазы определили спектрофотометрически с использованием 2,3-меркапто-1пропанолтрибутирата (ТВОИ?) в качестве субстрата. Липаза гидролизует сульфидные связи ТВОИР, таким образом, освобождая тиобутановую кислоту, которая в последующей реакции с 4,4дитиодипиридином (ЭТЭР) образует 4-тиопиридон. Последний находится в таутомерном равновесии с 4-меркаптопиридином, который поглощается при 334 нм. Реакция протекает в 0,1М ацетатном буфере рН 5,0, содержащем 0,2% Тритон Х-100, 0,65 мМ ТВО1ЛР и 0,2 мМ ЭТЭР, при 37°С. Одна единица липазы определена, как количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль 4 тиобутановой кислоты в 1 мин в установившихся условиях реакции.Lipase activity was determined spectrophotometrically using 2,3-mercapto-1-propanol tributyrate (TBOI?) As a substrate. Lipase hydrolyzes the sulfide bonds of TBOIR, thereby releasing thiobutanoic acid, which in the subsequent reaction with 4,4dithiodipyridine (ETER) forms 4-thiopyridone. The latter is in tautomeric equilibrium with 4-mercaptopropyridine, which is absorbed at 334 nm. The reaction proceeds in 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, containing 0.2% Triton X-100, 0.65 mM TBO1LR and 0.2 mM ETER, at 37 ° C. One unit of lipase is defined as the amount of enzyme that releases 1 μmol of 4 thiobutanoic acid in 1 min under steady state reaction conditions.

Фосфолипазу А определили спектрофотометрически с использованием 1,2-дитиодиоктаноилфосфатдихолина в качестве субстрата. Фосфолипаза А гидролизует сульфидную связь в 1 положении (РЬА1) или 2 положении (РЬА2), таким образом освобождая 4 тиооктановую кислоту, которая в последующей реакции реагирует с 4,4' -дитиопиридином для образования 4-тиопиридона. Последний находится в таутомерном равновесии с 4-меркаптопиридином, который поглощается при 334 нм. Реакция протекает в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,0, содержащем 0,2% Тритон Х-100, 0,65 мМ субстрата и 0,2 мМ □ТОР, при 37°С. Одна единица фосфолипазы А (РЬА) определена как количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль 4 тиооктановой кислоты в 1 мин в установившихся условиях реакции.Phospholipase A was determined spectrophotometrically using 1,2-dithiodioctanoylphosphate dicholine as a substrate. Phospholipase A hydrolyzes the sulfide bond at the 1 position (PBA1) or 2 position (PBA2), thereby releasing 4 thiooctanoic acid, which in the subsequent reaction reacts with 4,4'-dithiopyridine to form 4-thiopyridone. The latter is in tautomeric equilibrium with 4-mercaptopropyridine, which is absorbed at 334 nm. The reaction proceeds in 0.1 M acetate buffer, pH 4.0, containing 0.2% Triton X-100, 0.65 mm substrate and 0.2 mm □ TOP, at 37 ° C. One unit of phospholipase A (PBA) is defined as the amount of enzyme that releases 1 μmol of 4 thiooctanoic acid in 1 min under steady state reaction conditions.

Активность лизофосфолипазы определили ³¹Р-ЯМР спектроскопией с использованием лизофосфатидилхолина в качестве субстрата. Лизофосфолипаза гидролизует эфирную связь, таким образом освобождая жирную кислоту из группы глицерина. Образованный таким образом глицеринфосфохолин количественно определили, используя ЯМР. Реакция протекала в 50 мМ ацетатном буфере рН 4,5, дополнительно содержащем 1 мг/мл лизофосфатидилхолин и 5мМ СаС1₂, в течение 30 мин при 55°С. Одна единица лизофосфолипазы (ЬРС) определена как количество фермента, которое образует 1 мкмоль 4 глицеринфосфохолина кислоты в 1 мин в установившихся условиях реакции.Lysophospholipase activity was determined by ³¹ P-NMR spectroscopy using lysophosphatidylcholine as a substrate. Lysophospholipase hydrolyzes the ester bond, thereby releasing the fatty acid from the glycerol group. The glycerolphosphocholine thus formed was quantified using NMR. The reaction proceeded in 50 mM acetate buffer pH 4.5, additionally containing 1 mg / ml lysophosphatidylcholine and 5 mM CaCl ₂ , for 30 min at 55 ° C. One unit of lysophospholipase (LRS) is defined as the amount of enzyme that forms 1 µmol of 4 glycerolphosphocholine acid in 1 min under steady state reaction conditions.

Активность галактолипазы определили ЯМР спектроскопией с использованием дигалактозилдиглицерида в качестве субстрата согласно способу, описанному ИЛауата и Μаί8иба (1972) Ацпс. Вю1. С1ет. 36, 1831. Галактолипаза гидролизует эфирную связь между жирными кислотами и глицериновой основой, таким образом, освобождая одну или две жирные кислоты. Реакция протекает в 50 мМ ацетатном буфере рН 4,5, дополнительно содержащем 5мМ СаС1₂, 0,2% Тритон Х-100 и 1 мг/мл дигалактозилдиглицерида (липидные продукты), в течение 30 мин при 30°С. Одна единица галактолипазы определена как количество фермента, которое образует 1 мкмоль жирной кислоты в 1 мин в установившихся условиях реакции.The activity of galactolipase was determined by NMR spectroscopy using digalactosyldiglyceride as a substrate according to the method described by ILauat and Μaί8iba (1972) ACPS. Vu1. C1. 36, 1831. Galactolipase hydrolyzes the ester bond between the fatty acids and the glycerol base, thereby releasing one or two fatty acids. The reaction proceeds in 50 mM acetate buffer pH 4.5, additionally containing 5 mM CaCl ₂ , 0.2% Triton X-100 and 1 mg / ml digalactosyl diglyceride (lipid products), for 30 min at 30 ° C. One galactolipase unit is defined as the amount of enzyme that forms 1 μmol of fatty acid in 1 min under steady state reaction conditions.

Ультрафильтраты, полученные в примере 2, подвергли РАИ измерению активности фермента. Активность грибковой альфа-амилазы измерили с использованием тестовых таблеток Р1абеЬак Ату1аке (РБагтаыа). Таблетки РБабеЬаз содержат субстрат водонерастворимого крахмала и голубой краситель, связанный поперечными связями с субстратом. Субстрат гидролизовали грибковой амилазой, освобождая окрашенные растворимые мальтодекстрины, которые перешли в раствор. Кривую калибровки пригоThe ultrafiltrates obtained in Example 2 subjected the RAI to measurement of enzyme activity. The activity of fungal alpha-amylase was measured using test tablets P1abeAbAtuAke (RBagtaa). RBabe3 tablets contain a substrate of water-insoluble starch and a blue dye, linked by cross-linking with the substrate. The substrate was hydrolyzed with fungal amylase, releasing colored soluble maltodextrins, which passed into solution. Curve calibration

- 27 008007 товили при помощи раствора, содержащего упомянутую активность грибковой альфа-амилазы. Из стандарта и неизвестных образцов в 50 мМ буфере малеиновой кислоты рН 5,5 приготовили соответствующие разбавления. Образцы по 5 мл инкубировали при 30°С в течение 5 мин, добавили РйабеЬак таблетку и после 15 мин реакцию остановили путем добавления 1,0 мл 0,5 н гидроксида натрия. Смеси оставили остывать до комнатной температуры в течение 5 мин, после чего добавили 4,0 мл воды, после встряхивания руками в течение 15 мин образцы центрифугировали при 4700 об./мин в течение 10 мин. Экстинкцию верхних слоев измерили при 620 нм. ΟΏ 620 нм является единицей измерения для активности грибковой альфа-амилазы. Одна единица грибковой альфа-амилазы (РАИ) определена в настоящем описании как количество фермента, которое превращает 1 г крахмала (100% сухого вещества) за 1 ч в продукт, обладающий прозрачностью при 620 нм после реакции с йодным раствором известной концентрации в установившихся условиях реакции.- 27 008007 was prepared using a solution containing the mentioned activity of fungal alpha-amylase. Appropriate dilutions were prepared from standard and unknown samples in 50 mM maleic acid buffer pH 5.5. Samples of 5 ml were incubated at 30 ° C for 5 minutes, a Ryabeak tablet was added, and after 15 minutes the reaction was stopped by adding 1.0 ml of 0.5 N sodium hydroxide. The mixture was allowed to cool to room temperature over 5 minutes, after which 4.0 ml of water was added, after shaking with hands for 15 minutes, the samples were centrifuged at 4700 rpm for 10 minutes. The extinction of the upper layers was measured at 620 nm. ΟΏ 620 nm is the unit of measure for the activity of fungal alpha-amylase. One unit of fungal alpha-amylase (RAI) is defined in the present description as the amount of an enzyme that converts 1 g of starch (100% dry matter) in 1 h to a product with transparency at 620 nm after reaction with an iodine solution of known concentration under steady-state reaction conditions .

Таблица 4. Аи и белок в ультрафильтратах, приготовленных в примере 2Table 4. Au and protein in ultrafiltrates prepared in example 2

Липолитический фермент Lipolytic enzyme Белок (мг/мл) из анализа 280 нм Protein (mg / ml) from 280 nm analysis Грибковая амилаза (ΕΑϋ/мл) Fungal Amylase (ΕΑϋ / ml) ΝΒΕ028 ΝΒΕ028 2,3 2,3 4,5 4,5 ΝΒΕ029 ΝΒΕ029 1,3 1.3 3,0 3.0 ΝΒΕ030 ΝΒΕ030 0,4 0.4 2,6 2.6 ΝΒΕ031 ΝΒΕ031 0,1 0.1 2,5 2,5 ΝΒΕ032 ΝΒΕ032 1,0 1,0 0,3 0.3 ΝΒΕ033 ΝΒΕ033 Νϋ Νϋ 0,3 0.3 ΝΒΕ034 ΝΒΕ034 Νϋ Νϋ 2,7 2.7 ΝΒΕ036 ΝΒΕ036 Νϋ Νϋ 3,4 3.4 ΝΒΕ038 ΝΒΕ038 2,0 2.0 3,7 3,7 ΝΒΕ039 ΝΒΕ039 2,2 2.2 0,6 0.6

ΝΒΕ043 ΝΒΕ043 0,1 0.1 0,2 0.2 ΝΒΕ045 ΝΒΕ045 Νϋ Νϋ 4,0 4.0 ΝΒΕ042 ΝΒΕ042 1,6 1,6 1,5 1,5

Дополнительно к активностям, приведенным в табл. 4, также присутствуют незначительные активности глюкоамилазы, однако в таких низких количествах, что эти ферменты не мешают в экспериментах хлебопечения, описанных в примере 4.In addition to the activities given in table. 4, insignificant glucoamylase activities are also present, however, in such low quantities that these enzymes do not interfere with the baking experiments described in Example 4.

Пример 4. Эксперименты 1 хлебопечения - батоны хлебаExample 4. Experiments 1 bakery - loaves of bread

Батоны хлеба выпекли из 150-граммовых кусков теста, полученного путем смешивания 200 г муки (Ко11Ьп™/1Ык™ в соотношении 80/20), 1,4 г сухих хлебопекарных дрожжей (Регт1рап®), 4 г соли, 3 г сахара, 10 мг аскорбиновой кислоты, 116 г воды и 2 г жира. После перемешивания в течение 6 мин и 15 с в стержневом миксере, тесто разделили на куски по 150 г и поставили для брожения в течение 45 мин при 30°С, обмяли и поставили для брожения в течение еще 25 мин, отформовали и приготовили. Брожение проводили при относительной влажности 90-100%. После финального брожения в течение 70 мин при 30°С тесто пекли в течение 20 мин при 225°С.Loafs of bread were baked from 150-gram slices of dough obtained by mixing 200 g of flour (Ko11Ln ™ / 1Yk ™ in a ratio of 80/20), 1.4 g of dry baker's yeast (Regt1rap®), 4 g of salt, 3 g of sugar, 10 mg of ascorbic acid, 116 g of water and 2 g of fat. After stirring for 6 minutes and 15 seconds in a rod mixer, the dough was divided into 150 g pieces and set for fermentation for 45 minutes at 30 ° C, kneaded and set for fermentation for another 25 minutes, molded and prepared. Fermentation was carried out at a relative humidity of 90-100%. After the final fermentation for 70 minutes at 30 ° C, the dough was baked for 20 minutes at 225 ° C.

Различное воздействие (табл. 5 и 6) липолитических ферментов в экспериментах хлебопечения сравнили с контролем, содержащим такое же количество грибковой амилазы, которую добавили иным способом при помощи дозировки ультрафильтрата (для активности грибковой амилазы в ультрафильтратах см. табл. 4). Это было необходимо, так как количество грибковой амилазы, добавленной с липолитическими ферментами, особенно повлияло на объем хлеба, а не на другие параметры. Объем батонов хлеба с добавленным контрольным количеством грибковой амилазы приняли за 100%.The different effects (Tables 5 and 6) of lipolytic enzymes in baking experiments were compared with a control containing the same amount of fungal amylase, which was added in another way by dosing ultrafiltrate (for the activity of fungal amylase in ultrafiltrates, see table 4). This was necessary, since the amount of fungal amylase added with lipolytic enzymes especially affected the volume of bread, and not other parameters. The volume of loaves of bread with an added control amount of fungal amylase was taken as 100%.

- 28 008007- 28 008007

Таблица 5Table 5

Эффект the effect Оценка Rating 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 липкость stickiness очень highly липкое sticky Контрольный Control Значите- Mean- Прекрасно Perfectly теста test липкое sticky хлеб bread льно flax сухое dry естс there is лучше it's better Ен Yong Растворимость Solubility Очень Highly Меньше, чем Less than Контрольный Control хорошо well Очень Highly теста test короткая short контроль the control хлеб bread длинная long Структура Structure плохая bad неоднород- heterogeneous Контрольный Control хорошая good отличная great хлебного bread ная naya хлеб bread ю Yu мякиша crumb е И e AND ТТтаогп т/’/'Угэтгтл· TTTaogp t / ’/ 'Hugettle · ГТгчтдъ АО ТА ХД ΧΧ^^Αν^ΙΧΟ ГТгчтдъ АО ТА ХД ΧΧ ^^ Αν ^ ΙΧΟ Очень Highly троль. НЬМ Troll. NEW о т личный a great Очень Highly белый white светлый light coloured хлеб bread темный dark О) Р¹ O) P ¹ Цвет хлебного Bread color Слишком Too Очень Highly Контрольный Control отличный a great Абсолютно Absolutely ф с f s мякиша crumb желтая yellow желтый yellow хлеб bread белый white черствение stale Слишком Too Очень Highly Контрольный Control мягче softer отличный a great твердый solid твердый solid хлеб bread

Объем батона определили при помощи измерителя объема хлеба БУМ-3 (ΚΙ Сагдз 1п81гитеп18 АБ, У1кеп, 8\\'е4еп). Принцип такого измерения основан на отражении ультразвука, измеренного при помощи датчика вокруг вращающегося хлеба. Время измерения составляло 45 с.The loaf volume was determined using a BUM-3 bread volume meter (ΚΙ Sagdz 1p81gitep18 AB, U1kep, 8 \\ 'e4ep). The principle of this measurement is based on the reflection of ultrasound measured with a sensor around a rotating bread. The measurement time was 45 s.

Липкость теста и растяжимость оценили при помощи квалифицированного пекаря, используя шкалу, изображенную в табл. 5. Измеряли среднее значение 2 батонов на один объект.The stickiness of the dough and extensibility was evaluated using a qualified baker, using the scale shown in the table. 5. The average value of 2 loaves per object was measured.

После таких тестов куски теста округлили и первое брожение проводили в течение 45 мин при 30°С и после этого тесто обмяли, отформовали, приготовили и поставили для брожения в течение 75 мин при 30°С. Относительная влажность во время брожения составляла 85%.After such tests, the dough pieces were rounded and the first fermentation was carried out for 45 min at 30 ° С and after that the dough was kneaded, molded, prepared and set for fermentation for 75 min at 30 ° С. Relative humidity during fermentation was 85%.

Затем оценили стабильность теста после брожения при помощи наличия пузырьков, корочки с оборванными краями и нерегулярных кривых поверхностей корочки. Куски теста выпекали в течение 20 мин при 225°С. Объемы батонов определили способом ΒνΜ-3: в таблице представлены средние значения 2 хлебов, которые выпекали как один объект.The stability of the test after fermentation was then evaluated using the presence of bubbles, a crust with dangling edges, and irregular curved surfaces of the crust. Pieces of dough were baked for 20 minutes at 225 ° C. The loaf volumes were determined using the ΒνΜ-3 method: the table shows the average values of 2 loaves that were baked as a single object.

Структуру хлебного мякиша оценили при помощи профессионального пекаря, используя шкалу, изображенную в табл. 5. После хранения батонов в течение 3 дней в полиэтиленовых сумках при комнатной температуре измерили твердость хлебного мякиша, используя 81еуепз анализатор текстуры. Два ломтика толщиной 2 см из центра каждого батона проанализировали анализатором текстуры, используя пробу диаметром 1,5 дюйма, глубиной давления 5 мм (25%) и скоростью давления 0,5 мм/с. В таблице показано среднее значение двух измерений.The structure of the bread crumb was evaluated using a professional baker, using the scale shown in table. 5. After storing the loaves for 3 days in plastic bags at room temperature, the hardness of the bread crumb was measured using a 81e texture analyzer. Two slices 2 cm thick from the center of each loaf were analyzed by a texture analyzer using a sample with a diameter of 1.5 inches, a pressure depth of 5 mm (25%) and a pressure speed of 0.5 mm / s. The table shows the average of two measurements.

Цвет корочки оценивали при помощи профессионального пекаря согласно шкале, изображенной в табл. 5. В качестве контроля использовали стандартный рецепт хлеба с датской формой для выпечки.The color of the crust was evaluated using a professional baker according to the scale shown in the table. 5. As a control, a standard bread recipe with a Danish baking dish was used.

Цвет хлебного мякиша оценивали при помощи профессионального пекаря согласно оценке, изображенной в табл. 5. Цвет хлебного мякиша контрольного хлеба оценили как норму (3). В качестве положительного контроля батоны 2 объектов использовали с одной и той же композицией как контроль плюс 0,5% соевая мука. Процедуры брожения и выпечки такие же как и для контроля без соевой муки. Последний оценили как отличный.The color of the crumb was evaluated using a professional baker according to the assessment depicted in table. 5. The color of the bread crumb of the control bread was rated as the norm (3). As a positive control, loaves of 2 objects were used with the same composition as control plus 0.5% soy flour. Fermentation and baking procedures are the same as for control without soy flour. The latter was rated as excellent.

Нависающую верхушку хлеба оценивали путем нависания верхушки относительно формы для выпечки, более нижние кромки верхушки - более низкая оценка. Меньше нависания, более лучшая оценка.The hanging top of the bread was evaluated by overhanging the top relative to the baking dish, the lower edges of the top - a lower score. Less overhang, better score.

Черствление хлеба оценили путем ощущения твердости хлебного мякиша ломтиков хлеба. Перед нарезкой ломтиков хлеб хранили в пластиковой сумке при комнатной температуре в течение 4 дней. Более мягкий хлебный мякиш ломтиков имеет более лучшую оценку.The staleness of the bread was evaluated by feeling the hardness of the crumb bread slices. Before slicing, the bread was stored in a plastic bag at room temperature for 4 days. A softer bread crumb of slices has a better rating.

- 29 008007- 29 008007

Таблица 6Table 6

Липолитический Lipolytic Параметр Parameter

фермент enzyme Объем (%) Volume (%) Липкость теста Stickiness test Растяжимость теста Elongation test Устойчивость теста Sustainability test Структура хлебного мякиша Crumb structure Цвет корочки Crust color Цвет хлебного мякиша Crumb color Нависание верхушки Top hanging черствление stale ΝΒΕ028 ΝΒΕ028 100 100 3 3 3 3 4 4 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 ΝΒΕ029 ΝΒΕ029 104 104 3 3 3 3 4 4 3 3 4 4 4 4 4 4 3 3 ΝΒΕ030 ΝΒΕ030 107 107 3 3 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 ΝΒΕ031 ΝΒΕ031 102 102 3 3 2 2 4 4 5 5 4 4 4 4 4 4 4 4 ΝΒΕ032 ΝΒΕ032 98 98 3 3 3 3 4 4 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 ΝΒΕ033 ΝΒΕ033 105 105 3 3 2 2 4 4 2 2 4 4 3 3 3 3 3 3 ΝΒΕ034 ΝΒΕ034 104 104 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 ΝΒΕ036 ΝΒΕ036 100 100 3 3 3 3 4 4 3 3 4 4 4 4 4 4 3 3 ΝΒΕ038 ΝΒΕ038 109 109 3 3 3 3 4 4 5 5 4 4 4 4 3 3 3 3 ΝΒΕ039 ΝΒΕ039 109 109 3 3 3 3 4 4 4 4 3 3 4 4 3 3 3 3 ΝΒΕ043 ΝΒΕ043 106 106 3 3 3 3 4 4 3 3 4 4 4 4 3 3 3 3 ΝΒΕ045 ΝΒΕ045 110 110 3 3 3 3 4 4 4 4 3 3 4 4 4 4 4 4 ΝΒΕ042 ΝΒΕ042 110 110 3 3 4 4 4 4 4 4 3 3 4 4 3 3 3 3

Пример 5. Эксперименты 2 хлебопечения - батардExample 5. Experiments 2 bakery - batard

Хлебопекарные качества липолитических ферментов согласно настоящему изобретению протестировали с французским типом хлеба, называемым батард. Приготовление батардов в стандартном процессе хлебопечения было осуществлено путем смешивания 3000 г белой муки при примерно 20°С. 70 г прессованных дрожжей, 60 г соли, 68 ч./млн аскорбиновой кислоты, 30 ч./млн Ваке7уте® Н8₂₀₀₀ (грибковая гемицеллюлоза), 7 ч./млн Ваке7уте® Р500 (грибковая α-амилаза) и 1680 мл воды (8-10°С) в спиральном миксере (Оюкпа:2 мин со скоростью 1; 100 Вт-ч подавали при скорости 2). Температура теста составляла 27°С. Механически обработанное тесто проанализировали вручную при помощи профессионального пекаря. Тесто подвергли 15-минутной проверке на увеличение объема в герметичном шкафу при 32°С и 90% влажности. Позже тесто разделили на 6 кусков по 350 г, раскатали и поставили для брожения в течение 15 мин при 32°С и 90% влажности. В конце этого периода куски теста отформовали, придали форму и последний раз поставили тесто для брожения на 90 мин при 32°С и 90% влажности. Полностью подошедшее тесто разрезали по длине кусков теста и выпекали в печи при 240°С в течение 30 мин в присутствии пара. После остывания до комнатной температуры объемы батонов определили ВVМ способом (см. пример 4).The baking properties of the lipolytic enzymes according to the present invention were tested with a French type of bread called batard. The preparation of bardards in a standard baking process was carried out by mixing 3000 g of white flour at about 20 ° C. 70 g of compressed yeast, 60 g of salt, 68 ppm ascorbic acid, 30 ppm Vake7ute® H8 ₂₀₀₀ (fungal hemicellulose), 7 ppm Vake7ute® P500 (fungal α-amylase) and 1680 ml of water ( 8-10 ° C) in a spiral mixer (Oyukpa: 2 min at a speed of 1; 100 Wh-h served at a speed of 2). The test temperature was 27 ° C. Machined dough was analyzed manually using a professional baker. The dough was subjected to a 15-minute test to increase the volume in a sealed cabinet at 32 ° C and 90% humidity. Later, the dough was divided into 6 pieces of 350 g, rolled out and set for fermentation for 15 minutes at 32 ° C and 90% humidity. At the end of this period, the dough pieces were molded, shaped, and the last time the dough was placed for fermentation for 90 min at 32 ° C and 90% humidity. The fully matched dough was cut along the length of the dough pieces and baked in an oven at 240 ° C for 30 min in the presence of steam. After cooling to room temperature, the loaf volumes were determined by the BBM method (see Example 4).

Разламывание, разрезание и форму батонов проанализировали сразу после остывания до комнатной температуры при помощи профессионального пекаря, используя оценку в табл. 7. После 16 ч (всю ночь) хранения в закрытом ящике при комнатной температуре проанализировали качество хлебного мякиша при помощи профессионального пекаря. Оценку батонов (табл. 8) получали от 1 объекта.The breaking, cutting and shape of the loaves were analyzed immediately after cooling to room temperature using a professional baker, using the score in table. 7. After 16 hours (all night) of storage in a closed box at room temperature, the quality of bread crumb was analyzed using a professional baker. The evaluation of loaves (tab. 8) was obtained from 1 object.

- 30 008007- 30 008007

Таблица 7Table 7

Эффект the effect Оценка Rating 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 Разламывание, разрезание Breaking cutting Очень рыхлый и мягкий Very loose and soft Рыхлый и мягкий Loose and soft Контрольный хлеб Control bread Тонкая и хрустящая корочка Устойчиво идущий разрез Thin and crisp Steadily running cut Корочка слишком тонкая, слишком твердая The crust is too thin, too hard Структура хлебного мякиша Crumb structure бедная poor Не однородная Not uniform Контрольный хлеб Control bread хорошая good отличная great форма the form высота height плоская flat средняя average Контрольный хлеб Control bread Выше, чем (3) Higher than (3) Гораздо выше, чем (3) Much higher than (3) бороздка groove бороздка закрыта groove closed бороздка закрыта groove closed Контрольный хлеб Control bread Полностью открыта Completely is open Полностью открыта; рваная Completely open; torn

Таблица 8. Выполнение хлебопечения липолитическими ферментами настоящего изобретенияTable 8. Performing bakery lipolytic enzymes of the present invention

Липолитиче ский Lipolytic Параметр Parameter

фермент enzyme Дозирование* Dosage * Объем батона (%) The volume of the loaf (%) Разламывание& разрезание Cracking & cutting Форма The form Структура хлебного мякиша Crumb structure нет not 0 0 100 100 3 3 3 3 3 3 ΝΒΕ028 ΝΒΕ028 0,75 0.75 3 3 4 4 4 4 4 4 ΝΒΕ030 ΝΒΕ030 3 3 103 103 4 4 4 4 3 3 ΝΒΕ031 ΝΒΕ031 2,5 2,5 95 95 4 4 4 4 3 3 ΝΒΕ036 ΝΒΕ036 Νϋ Νϋ 88 88 3 3 3 3 3 3 ΝΒΕ038 ΝΒΕ038 30 thirty 100 100 4 4 4 4 3 3 ΝΒΕ039 ΝΒΕ039 64 64 126 126 3 3 4 ' 4 ' 3 3 ΝΒΕ045 ΝΒΕ045 Νϋ Νϋ 89 89 4 4 4 4 3 3 ΝΒΕ042 ΝΒΕ042 12 12 98 98 3 3 4 4 4 4

* в ч./млн, основанном на весе муки и весе фермента, определенном А280 способом.* ppm based on the weight of the flour and the weight of the enzyme determined by the A280 method.

Claims

1. The selected polynucleotide hybridizable with a polynucleotide selected from the group consisting of 8E0 GO N0: 10, 11.

2. The selected polynucleotide according to claim 1, hybridizable under stringent conditions with a polynucleotide selected from the group consisting of 8E0 GO N0: 10, 11.

3. The selected polynucleotide according to claim 1 or 2, obtained from a mycelium fungus.

4. The selected polynucleotide according to claim 3, obtained from Azregd Schiz.

5. The selected polynucleotide encoding a polypeptide containing the amino acid sequence 8E0 GO N0: 12 or its functional equivalent.

6. An isolated polynucleotide encoding at least one functional domain of the 8E0 GO N0: 12 polypeptide or its functional equivalent.

7. An isolated polynucleotide containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of 8E0 GO N0: 10, 11 or their functional equivalents.

- 31 008007

8. The selected polynucleotide selected from the group consisting of 8E0 ΙΌ N0: 10, 11.

9. A vector containing a polynucleotide sequence according to claims 1 to 8.

10. The vector according to claim 9, in which said polynucleotide sequence according to claims 1-8 is operatively linked to regulatory sequences suitable for expression of said polynucleotide sequence in a suitable host cell.

11. The vector of claim 10, wherein said suitable host cell is a mycelium fungus.

12. A method for producing a polynucleotide according to claims 1-8 or a vector according to claims 9-11, comprising the steps of culturing a host cell transformed with said polynucleotide or said vector, isolating said polynucleotide or said vector from the host cell.

13. An isolated lipolytic enzyme with the sequence 8E0 ΙΌ N0: 12 or its functional equivalent.

14. The selected lipolytic enzyme according to item 13, obtained from AkregdShik Schdeg.

15. An isolated lipolytic enzyme obtained by expressing a polynucleotide according to claims 18 or a vector according to claims 9 to 11 in a suitable host cell, for example, Acregdic schdeck.

16. Recombinant lipolytic enzyme containing the functional domain of any of the lipolytic enzymes according to claims 13-15.

17. A method for producing a lipolytic enzyme according to claims 13-16, comprising the steps of transforming a suitable host cell with an isolated polynucleotide according to claims 1-8 or a vector according to claims 9-11, culturing said cell under conditions allowing expression of said polynucleotide, and optionally purifying the encoded polypeptide from said cell or culture medium.

18. A recombinant host cell containing a polynucleotide according to claims 1-8 or a vector according to claims 9-11.

19. Recombinant host cell expressing a lipolytic enzyme according to claims 13-16.

20. Purified antibodies that react with the lipolytic enzyme according to claims 13-16.

21. A fusion protein containing the sequence of a lipolytic enzyme according to claims 13-16.

22. A method of obtaining a test containing the addition of a lipolytic enzyme according to any one of claims 13-16.

23. A method of obtaining a baked product from a dough prepared by the method according to item 22.

24. The use of the lipolytic enzyme according to any one of paragraphs.13-16 to obtain a dough and / or baked product from this dough.

- 32 008007

List of Sequences <110> ϋ3Μ ΙΡ Azze3 Β.ν.

<120> NEW LIPASES AND THEIR APPLICATION <130> 2Ju78IO <160> 39 <170> RaEePyp wegshop 3.1 <210> 1 <211> 3728 <212> DNA <213> AzregdShiv ptdeg <400> 1

sdddsaa-s: a surrender dsdseaxea sdSassddd awards! s SEATFOOD 60 EDEESESAAA Baaaaaaaaaaaaaaaaaaa Eds'bseb'ad sssdaseda ddddddsed sabd'edds 120 addEaGETaa SEEEEDDDS EassaasEas dsddsasE Edaadaad sasdddsdsds 180 sdddda Foodstuff FoodEaEaaaE FoodFood dasedaseds Eddbd-ead 240 here SJEaBsGGDD EEEECEDEAS Badaadada DEDSSDDEDD SEDDDDES 300 yeah yeah dadsa Foodstuff cessaesses Yesdssss SEABASSSE 360 yes aaddd aEddSdaEdd dsdadaabaa FOOD a'ad'esed'es 420 baessbss Edsasgds aaad + garden№ yes esa es sssasEsaaE sesessesa 480 Bds-ss-baeae ssdadasaa SASASASAS Besa-b-baaa dsssdadss ataaessaess 540 asaassassss sasadssadd dEasaEssad ddesesses ssdssddada aaaaadsss 600 C ^ zdsssssssss asSaddass *! P G. G. ST S S7 ST P St1 ------ - - s S c d d s S. s s b s a e s a s a s a s ϊιΙςΙςοοηοοΙςα 660 Baaaeda saaesa dsaaadssas hereby dsaEdsassss saasa esaes 720 SssdsaBaaB acassaess sdaadsaa! SaadsEedas YESEEDYEEEE SEE 780 DEBaassa + E sdBasBeess aaaedasaes aaessaased aladas esd cssbssbss 840 saaEassaUd dasdssssas DessaBdesa aaad eaadas Bads bads sddsdebaaae 900 saaBEaBdaB HERE aaessssedad Bcdbc Units adaaeeadas 960 Food Bldg SasEssBads Bcssedaaaa addessesses Bcdbcbc 1020 ADCEDDSEDD SEDAJAEJS Hurry up aadE-baasad aassadsaas Badadss 1080 Edddsdds acesses + dd SESSESSEDS Edddaddsad SassssEadss Esaas Es'yad 1140 asassad ESSSSAS aTsaadadad kindergarten aaasaassass Essaesaess 1200 saasadssas ssEsaasaas assesgisa SsddssdeEs ssedsssdad ESDADSADD 1260 adEdeHssE ddddea'saaad FOODFOODFood addssd aEssasssssd EsdasdeBda 1320 aaassdESEa Esdssssaa! dasadsdasa asdddddea Esaedessess assad 1380 dasedasadas E-bssesddd ASSESSED asaasdssas adadabddd Ea-edaEdss 1440

- 33 008007

ssdddkakdd aksdakdad adddadskdd sddddaadd akdsdsdd Kksdakdada 1500 Askdkakdaa scdaakaka aksddss adadadadaa adaddakdad cddcdd 1560 cackdock dakskkddk dddcddcddd kdsaddddd daskdskdak ssdaddkadd 1620 acascade cccdcdcdk dskdkdkdd dkkdakdskd asdakdkdsa addcasa 1680 kadaskakakak kdksksssad dddcddcda Akdakaadss cddcdddd dksksdaksa 1740 acckdcdk ddsddsdkk ddaxxcd askskdsda dddccddd sdkkskskss 1800 kxassdks adcakcddd kksksadskda Sakdasak dkaddaakss ddsaasasda 1860 asskaddask cdcdaxad sdsdsksssa kdsakkdddk saaasaaaas axaaddsdk 1920 cddddd sssddasaad axassak ddddadaax adsdcdadak kakassskaa 1980 kadsakksda kakasadsds skdasakds asadcddcds skasadsds ddadssssass 2040 cddxassaa sdasddkdas aasdadddx kakksadads sddkakdsas assassssss 2100 aksksdsks ksksksksd skaassadsa kadssaksak ddaakssds aasdsadksd 2160 dassssss saasdsdasd daskdkass adssdack sdassadax dkdaasdsaa 2220 ssaadkakdk sksssskks sssaaaadas aakasksaaa how to Akakaskas 2280 kasakdaaad skdsassass ksaadsaasa ssskssaakd sskssdsdaa dkssssksk 2340 saasdakska sassdssds dasaksddss cddaakddkk sdssassax dasdsdsk 2400 xaxaaada Akakssssaa aksaksaka sddddddd skksdsssaad dksssakss 2460 ksakdddsas saasassdas ddddsdkda dkksksddkas dasdddsdcd aasaskdakd 2520 ssdaadsdak caddies akdddd sssssssssss ssssskssss assaakssss 2580 aadakakaka cockatoo dakaskaadd kdaaakdaaa Akdakadsak ssaaasdskd 2640 ddkskaaas daaassssaad ssasdassk skksdssas kakssaasa kskssdsssk 2700 add-ons kasduakdd dsaasasdas skuussdaad C and y y y y 3 and y aacacaad O 7 / G ζ. / s skasdadksd AKDDSDDSD aksdkdsak dddcdd adddccds ksadksadaa 2820 dakdaaddad kakdaddads aadcddcds dkaxdddd duckdsdcd sdkkdaakda 2880 kksdadkasd accdddddd sdsaccccds caddkaacd Saxaxax akssskakk 2940 accdccccs sskdsddkak dacacccdc akdskaakda cddcdcd sdkdsaksda 3000 cadaksssdk cccdccs saasscdcd sadasaksa skssdkkddd auxdaksss 3060 dsaadaskdd adcdddd cskddssdsd adddcdda sddskkkdk dasddackcd 3120 dakssdaakd ddsakdddd casdxxs kksksaksk kakadaakk dkdaaakdaa 3180 dddcdcddc skaakdddd kdasadksks ccdccssss saskddssda aakasaassk 3240 saskdakssd adddaskcd cdkssddsk assddddd ddaad cccd cddadaadda 3300 cascade asddddddda kakdakkakak kaakasaakk dkdsddkaad kkdskdskaa 3360 dkadkaskas kakakdkaka caddadddcd kdddkdaaaa pre-attack duskaskax 3420 aaddakddkk adakaskaka cascaccas cascade Akkaskaskak aaksaadask 3480 adaadaaadk skaskdakkd accaccsda skdaksdakk dkakkdaksk adkkadkaka 3540 ksaaaksdas aaadadssds sccccccc saccsack ksssdssask aadssad 3600 askakassak adkadkakad skddkkkadk kdakdssdad sadsssaass cskdaccd 3660 Akaksadsak kssaakssak kkkksksaskd dsaaadaaka ckadaadadd aaddaddadd 3720 addakaas 3728

<210> 2 <211> 1749

- 34 008007 <212> DNA <213> AzregdShiz phdeg <220>

<221> SDZ <222> (1) .. (1749) <400> 2

akd grandfather hell dsa SCS SCS cdd SCS css skd skd ddk dds hell ace ska 48 Mek A1a Zeg A1a Bie Bie Tgr Bie Zeg Bie Bie C1u C1u Zeg Tht Bie 1 5 10 fifteen dss ksa ask ska das ace adk aac ace ssk ace ax aad hell dsa das 96 A1a Zeg Tht Bie Azr Tht Zeg Azp Tht Rgo Tht 11th Bz Agd A1a Azr 20 25 thirty dsa dda aas aas ace css ksa ax ssa asa dss ace SCS aas aas ace 144 A1a C1u Azp Azp Tht Zeg Zeg 11th Rgo Tht A1a Tht Bie Azp Azp Tht 35 40 45 dks cx ax dds caustic css skd sss dad cx dad garden dad ccd cx skd 192 Ya1 RNe 11th C1u Agd Zeg Bie Rgo 61and Pb C1 and C1p C1 and Bie Pb Bie fifty 55 60 ddk ax aad kkk Dec duck dad sss dkd food cx ace ssd sneaker asd ccd 240 C1u Not Bz Pb A1a Azr C1 and Rgo Ya1 Agd Pb Tht Rgo Zeg Tht Bie 65 70 75 80 aah ace dks as sds dss aac das hell das aas ddd dkd as sack Dec 288 Bz Tht Ya1 Tug Agd A1a Azp Azr Zeg Azr Azp C1u Ya1 Tug Nhz A1a 85 90 95 css asa dsa css dda skd garden ask css sneaker ddd ace dkd SCS cas aas 336 Zeg Tht A1a Zeg C1u Bie C1p Tht Zeg Zeg C1u Tht Ya1 Bie Tug Azp 100 105 BUT dss asa dad as ddd as duck kde sss ddd as dda css duck dad asd 384 A1a Tht C1 and Tug C1u Tug Azr Suz Rgo C1u Tug C1u Zeg Azr C1 and Tht 115 120 125 dad skd grandfather dad yeah dda as grandfather sdd cx duck dad aas cdk akd aas 432 C1 and Bie A1a C1 and C1 and 61u Tug A1a Agd Pb Azr C1 and Azp Suz Mek Azp 130 135 140 skd aac aka acc sdd sss aad hell dad aah dad duck dad ccd ccd ssk 480 Bie Azp 11th Not Agd Rgo Bz Agd C1 and Bz C1 and Azr C1 and Bie Bie Rgo 145 150 155 160 dkd akd acc cdd ax kkk ddk ddk ddk cdd dkd garden ddk grandfather ask Dec 528 Ya1 Mek Not Tgr 11th Pb C1u C1u C1u Tgr Ya1 C1p C1u A1a Tht A1a 165 170 175 duck ssd add cas aac akd hell 1: a1: acc dkk sds garden ddk grandfather ccd aac 576 Azr Rgo Agd Tug Azp Mek Zeg Tug 11th Ya1 Agd C1p C1u A1a Bie Azp

- 35 008007

180 185 190

dub aad sce des ccd ddk des Esd aec aaE Eas cde dkd DSE grandfather Eee 624 Azr Bz Rgo Ya1 Bie C1u Ya1 Zeg Not Azp Tug Agd Ya1 A1a A1a Pb 195 200 205 dda EEC cp das ECE des dad dkk aU yeah Ess dds aas asd aas ska 672 C1u Pb Bie Azr Zeg Ya1 C1 and Ya1 MeE C1 and Zeg C1u Azp Tht Azp Bie 210 215 220 dda CEE cde duck garden sds des dss aU saE cdd des aah saa aas aec 720 C1u Bie Agd Azr 61p Agd Ya1 A1a MeE Bottom Tgr Ya1 Bz C1p Azp Not 225 230 235 240 aad grandfather Eee ddk ddk das ssd das aad aec ass aec cdd dda yeah Esa 768 Bz A1a Pb C1u C1u Azr Rgo Azr Bz Not Tht Not Tgr C1u C1 and Zeg 245 250 255 DSE ddk dss bass hell des dda dss sas eat des ass aas das ddk das 816 A1a C1u A1a Tug Zeg Ya1 C1u A1a Hb Bie Ya1 Tht Azp Azr C1u Azr 260 265 270 aas dad dds ska : 1s hell dss dss aec aU yeah Ess dds aas dsa des 864 Azp C1 and C1u Bie Pb Agd A1a A1a Not MeE C1 and Zeg C1u Azp A1a Ya1 275 280 285 dda sss sss bass aas dds asd das cdd Eas garden ssd aU Eas das garden 912 C1u Rgo Rgo Tug Azp C1u Tht Azr Tgr Tug ΘΙη Rgo MeE Tug Azr C1p 290 295 300 ax dkd aas dsa ass aas Food ass ass Esa hell aas ass CEE saa Food 960 Not Ya1 Azp A1a Tht Azp Suz Tht Tht Zeg Zeg Azp Tht Bie C1p Suz 305 310 315 320 cEC sds yeah des sss Ns Esa asd aec Eas ass dss dsa das aec dds 1008 Bie Agd C1 and Ya1 Rgo Pb Zeg Tht Not Tug Tht A1a A1a Azr Not C1u 325 330 335 skd yeah cdd EEC dss ass aec das dds ass EEC aec aah yeah EAE sss 1056 Bie C1 and Tgr Pb A1a Tht Not Azr C1u Tht Pb Not Bz 61and Tug Rgo 340 345 350 saa ax hell aee asd dad dds sds EEC dss aad des sss aec cEC saE 1104 C1p Not Zeg Not Tht C1 and C1u Agd Pb A1a Bz Ya1 Rgo Not Bie H13 355 360 365 dds ass aas ass das dad dds dkd hell EEC ddk asd asd dds dkd aas 1152 61u Tht Azp Tht Azr 61and C1u Ya1 Zeg Pb C1u Tht Tht C1u Ya1 Azp 370 375 380 acE duck dss yeah grandfather ax garden garden ccd aU dsa Ess aah sds cdd des 1200 Tht Azr A1a C1 and A1a Not C1p C1p Bie MeE A1a Zeg Bz Agd Tgr Ya1 385 390 395 400 cea aas yeah ass saa dss asd ass cEC cea Esd sas EAE sss aas aec 1248 Bie Azp C1 and Tht C1p A1a Tht Tpg Bie Bie Zeg ΗΪ3 Tug Rgo Azp Not

405 410 415

- 36 008007

Bss dss ba dds Bd1 sss Bac dda Dd dds aas asd ace Dd ssd aad 1296 Zeg A1a Bie C1u Suz Rgo Tug C1u Tgr <31u Azp Tht Tht Tgr Rgo Bz 420 425 430 cd ddd Ba yeah Ba aad sds Bac dad Bcd ab grandfather dds yes cd Bds 1344 Bie C1u Tug C1 and Tug Bz Agd Tug C1 and Zeg Me A1a C1u Azr Bie Suz 435 440 445 ab d " ds! ssd add add 11d cbc hell garden aad hell aad dad BaS dad 1392 Me! Ya1 A1a Rgo Agd Agd Bie Bie Zeg C1p Bz Μβΐ Bz C1 and Tug C1 and 450 455 460 dad saa dkd ΐΐΐ grandfather Ba edd Dd Yes! dc dcb grandfather ΐΐ ₅ aab yes Bcd 1440 C1 and C1p Ya1 Pb A1a Tug Agd Tgr Azr Ya1 A1a A1a Bie Azp Azr Zeg 465 470 475 480 hell asd ab ddd dd grandfather sa ΐΐΐ dcb dad abc ssd ΐΐΐ ρΐΐ ΐΐο dss 1488 Zeg Tht 11th C1u Ya1 A1a Ηιβ Pb A1a C1 and 11th Rgo Pb Ya1 Pb A1a 485 490 495 aas ss! dkd garden aas abc ac ssd Bd dda hell Yes! sss dsa hell cd 1536 Azp Rgo Ya1 C1p Azp 11th Tht Rgo Bie C1u Zeg Azr Rgo A1a Agd Bie 500 505 510 dad Eid dd! aab cd dss grandfather add ab Dd asd dcb ΐΐΐ dd asd Yes! 1584 C1 and Bie C1u Azp Bie A1a A1a Agd Μθΐ Tgr Tht A1a Pb Ya1 Tht Azr 515 520 525 Bd yes ssd aab ddd sa ddb dc ΐοΐ ddb abc sss sas Dd ssd aah 1632 Bie Azr Rgo Azp C1u ΗΪ3 C1u Ya1 Zeg C1u 11th Rgo Ηιβ Tgr Rgo Bz 530 535 540 Ras aas cbc ac yes ssd add das ΐΐΐ dd ΐΐο edd ba ssd add yes 1680 Tug Azp Bie Tht Azr Rgo Agd Azr Pb Ya1 Pb Agd Bie Rgo Agd Azr 545 550 555 560 dda hell Ba dd dad aad yes ac ΐΐΐ add asd ddd ddd ab yes Ba 1728 C1u Zeg Tug Ya1 C1 and Bz Azr Tht Pb Agd Tht C1u C1u 11th Azr Tug 565 570 575 ab aab asa βΐΐ dd edd Baa 1749 Not Azp Tht 11th Ya1 Agd

580 <210> 3 <211> 582 <212> PROTEIN <213> Azregd Shiz pdeg <400> 3

Mek A1a Running A1a Lye Ley Tgr Ley Zeg Ley Ley C1u 61u Zeg Thj Lye

15 10 15

37 008007

A1a Zeg Tht Bie 20 Azr Tht Zeg Azp Tht 25 Rgo Tht 11th Bz Agd thirty A1a Azr A1a C1u Azp Azp Tht Zeg Zeg 11th Rgo Tht A1a Tht Bie Azp Azp Tht 35 40 45 Ya1 Pb 11th C1u Agd Zeg Bie Rgo C1 and Pb C1 and C1p C1 and Bie Pb Bie fifty 55 60 C1u 11th Bz Pb A1a Azr C1 and Rgo Ya1 Agd Pb Tht Rgo Zeg Tht Bie 65 70 75 80 Bz Tht Ya1 Tug Agd A1a Azp Azr Zeg Azr Azp C1u Ya1 Tug H13 A1a 85 90 95 Zeg Tht A1a Zeg C1u Bie C1p Tht Zeg Zeg C1u Tht Ya1 Bie Tug Azp 100 105 110 A1a Tht C1 and Tug C1u Tug Azr Suz Rgo C1u Tug C1u Zeg Azr C1 and Tht 115 120 125 C1 and Bie A1a C1 and C1 and C1u Tug A1a Agd Pb Azr C1 and Azp Suz Mek Azp 130 135 140 Bie Azp 11th Not Agd Rgo Bz Agd C1 and Bz C1 and Azr C1 and Bie Bie Rgo 145 150 155 160 Ya1 Mek Not Tgr Not Pb C1u C1u C1u Tgr 7a1 C1p C1u A1a Tht A1a 165 170 175 Azr Rgo Agd Tug Azp Mek Zeg Tug 11th Ya1 Agd C1p C1u A1a Bie Azp 180 185 190 Azr Bz Rgo Ya1 Bie C1u Ya1 Zeg 11th Azp Tug Agd νθΐ A1a A1a Pb 195 200 205 C1u Pb Bie Azr Zeg Ya1 C1 and Ya1 Mek C1 and Zeg C1u Azp Tht Azp Bie 210 215 220 C1u Bie Agd Azr C1p Agd Ya1 A1a Mek ΗΪ3 Tgr Ya1 Bz C1p Azp 11th 225 230 235 240 Bz A1a Pb C1u C1u Azr Rgo Azr Bz 11th Tht 11th Tgr C1u C1 and Zeg 245 250 255 A1a C1u A1a Tug Zeg Ya1 C1u A1a H13 Bie Ya1 Tht Azp Azr C1u Azr 260 265 270 Azp C1 and C1u Bie Pb Agd A1a A1a Not Mek C1 and Zeg C1u Azp A1a Ya1 275 280 285 C1u Rgo Rgo Tug Azp C1u Tht Azr Tgr Tug C1p Rgo Mek Tug Azr C1p 290 295 300 Not Ya1 Azp A1a Tht Azp Suz Tht Tht Zeg Zeg Azp Tht Bie C1p Suz 305 310 315 320 Bie Agd C1 and Ya1 Rgo Pb Zeg Tht 11th Tug Tht A1a A1a Azr Not C1u 325 330 335 Bie C1 and Tgr Pb A1a Tht Not Azr C1u Tht Pb Not Bz C1 and Tug Rgo 340 345 350 C1p 11th Zeg Not Tht C1 and C1u Agd Pb A1a Bz Ya1 Rgo 11th Bie ΗΪ3

- 38 008007

355 360 365 C1u Tht Azp Tht Azr C1 and C1u Ya1 Zeg Pb C1u Tht Tht C1u Ya1 Azp 370 375 380 Tht Azr A1a C1 and A1a 11th C1p C1p Bie MeE A1a Zeg Bz Agd Tgr Ya1 385 390 395 400 Bie Azp C1 and Tht C1p A1a Tht Tht Bie Bie Zeg ΗΪ3 Tug Rgo Azp Not 405 410 415 Zeg A1a Bie C1u Suz Rgo Tug C1u Tgr C1u Azp Tht Tht Tgr Rgo Bz 420 425 430 Bie C1u Tug C1 and Tug Bz Agd Tug C1 and Zeg MeE A1a 61u Azr Bie Suz 435 440 445 MeE Ya1 A1a Rgo Agd Agd Bie Bie Zeg C1p Bz MeE Bz C1 and Tug C1 and 450 455 460 61and C1p Ya1 Pb A1a Tug Agd Tgr Azr Ya1 A1a A1a Bie Azp Azr Zeg 465 470 475 480 Zeg Tht 11th C1u Ya1 A1a H13 Pb A1a C1 and Not Rgo Pb Ya1 Pb A1a 485 490 495 Azp Rgo Ya1 C1p Azp Not Tht Rgo Bie C1u Zeg Azr Rgo A1a Agd Bie 500 505 510 C1 and Bie C1u Azp Bie A1a A1a Agd MeE Tgr Tht A1a Pb Ya1 Tht Azr 515 520 525 Bie Azr Rgo Azp C1u H1z C1u Ya1 Zeg C1u Not Rgo ΗΪ3 Tgr Rgo Bz 530 535 540 Tug Azp Bie Tht Azr Rgo Agd Azr Pb Ya1 Pb Agd Bie Rgo Agd Azr 545 550 555 560 C1u Zeg Tug Ya1 C1 and Bz Azr Tht Pb Agd Tht C1u C1u Not Azr Tug 565 570 575

Not Azp Thr 11e Wa1 Agd

580 <210> 4 <211> 3853 <212> DNA <213> Azregd Schiz n! Deg

<400> 4 SEEESSEDEEE DSSDDESEEE FOOD aEaddaEasa aeEssssad saasdEesdd 60 EEEDESEDES AEEEEEEAADE DEDSDEDDAS Edasadssaa dddssaddd dssssedsse 120 CEAECAEEEEA aEessassasd SESSDSSESED sadssesedds assaddy saaaEesad 180 dddddad add-ons addSESEaad adaaesedad ddaaadda EsasEeadaa 240 aaaeeeaed DESSDDSEED Essda addaaddsE ESSEESSSSE saeaeddsds 300 sssdddEssss food courts EESDDDASDE EEESSDDSE YesDesEaEa SESESEAEAAE 360

- 39 008007

sksssds adad food! aaasYdd! Bbc edddddad sissy 420 dkadasdskd Bce dadSadsass asbasad ddsaadkaa Eddsside! 480 NadssShd Basddde Food adsaaShos ddsya sda! s! q! 1 540 ssdbax 'Bsa FADEADAS akaaaasbss skadsasds aadaasdde 600 sdaasayaas yeah'a'aaaaaa Biblical SEDDSAADDS B'ssdaaa'EDE ! 1d !!! ssgs 660 dbsd Radsas EDUCATION Yes! SamsaM daddyaaaaa Badaasadss 720 addaaaaaa! ssaaakssa SECURITY asdaaaedds asseas'ab desssakaa 780 bastard aaksaadass 1sShs £ sdd RaEyssaEa! dsasadsaas c ^ abdddy 840 ssegsds !! d sddassass yes esaacdaa sasshssdd ssadyassaa daaakdsaas 900 adaaaaaaaa sssdsa Bastard Bsadasadad ddds! sed aadssedss! 960 Bbc dsdessdss sdsdsaatsak succes yeah-bc ssddsddd 1020 EsaEaaaaaa ssssaaaESE daksadaadd dssadaas ac-bdsd sddsssssad! 1080 HERE ddsddddddaE EsassEssdd ssasyasa dadaaasaa! asaa1sbd1s 1140 SYSKSDY yes Bssaaa-bda aaadssdsd !! excuse d'aaaaaa 1200 EsDesIsaa WEDDDDDY Baiddydd saaddada aaddaadssd dadkaddaaa 1260 ss'ddddas'ye adadassaas yes! dsaiddaea saadaaad1aa ddeaes-bsda 1320 Adadad syssaadga sddaesedas SakdasYaad asbdsds Dr. YaiddEdda 1380 dassssedes addEaasaE Blddddddaaa hell slah Bldsasas 1440 sEddeEdsE adddaddddsd sakda aaEssssd sadseaksad Edaad-bdd 1500 dssssaadcd EYassaasd Bakssaasa ssEDsEdaa! ddsadsska EyaEdaEdd! 1560 aE'EDGdaa''d saxadds garden ASDDAYAS FUNDS! ssdaasaa! 1620 C -> 4- Ζ-Ζ ζ-Ч Ч Ζ ⁴ ^ ζ-г ζ-h —v 4-4-4-4-4 “<—g —h / -, —CH— ”7“ H —CH Ζ-h 7 — D 4-7H-h 4- 4— 7 * Ζ 4 “—h Ζ-h ζ-Ζ Ζ—” - Ή Ή ζ-ζ Ζ “4 —Ч Ζ-Ч 7-Г Ζ4 4— -4¼¼ 1 sop SSaSGaaSa υαι_ Iutsaiuu υαι_υι_ and vanities aaca ^ y ι_ι_ and a ι_ yiwu and si — ι_ u iaku ^ ua and. and ιυυυ Caddsses dsddadsaaa aEc-ess dkadad asdas bce Eaaadadad! 1740 dssaddbc adsssadaa ddddsaas! 1s dgsaaad! 1s save it EddadsEaas 1800 dssdasdaad ddbsd ДсйдЬЬдддададада ddadksaasa sadakdsda dbsddsdad 1860 sadysaaad b-dddddss saasaasds assassdaya ! s !! dddads rssssssss 1920 dasa Essys adakadda ssssssssa idyaddaa ddssassds edda 1980 aaEsaayasa addddds ssad ddbda ACCESS sdsaddadd 2040 YdassadEs adax absssdsaak axSadGa! ayadsyasa! dbdasd !! 2100 axadssside yes HERE Bcdbc dddds Hurry up! 2160 abbssdasd Bieceaaaaa UnitsUnders sdddddd asdaasaa saadssa'a 2220 yeah SEAASADIA Yssdsa! d adsaaaa FOOD! drddydyssad! 2280 YEDEDASAA saPdassss aAZESAGES! ddaddyädd Jessasaiss Samass-ba! d 2340 AEEDSDSAA disadass ads bdaa ac! a! c ± bc1 Baddaaaaa ! d !! garden! dd 2400 ssdssakasa akaTsdakaa EssddadaEa a! c! 11 !! sd a'assass sasdaass 2460 asacacdeFood dbsdasd NassdEdsd ddddsakaa aaasaxad ! yes! sass !! 2520 Dsaad FOOD: Esdddssasd AdaEsasaEa SHOP SEAAEEEEEad aaEdasEdEd 2580 dSesakska assad dsssdsadde SEEasdsss ASEDDEDDEA aEdAdsaa 2640 sssssaads abaadgdks Ддддддддддд aasyasds aydadsdaa aaYadaska! 2700 YSSSEMA! dasda dads Bdsd dajdaada ! a! d !! 1 !! s 2760 dadaYassd dadsadad adesda-bd-bs dssaaaaa aaaaaaaa 2820 abaaddad hell Yeah! Askdasakaa de-bc Idbay 2880 Ba'a'a'd'' sssdshddds s'Ed'''''d''a dyasesesa Eadss'eds'd s !! dadaas! 2940

- 40 008007

saxcdkks aksakadada kassaakkkak ddaaddakad dkdddsaksd dkdkk cd kkk 3000 saxaadask askaskaak aadksaskda adaaddskdk adaskdaaad sdsdasakd 3060 Akdakkadaa kkssaaskkk ddksaasaka kdsakkadas kakaaaaddd asakkkada 3120 adaascaad asakasdass acaddddcd daaaasaddd cEessssdkss dsksadssdk 3180 Askkaadssa sassdssddda ddkkadkadk cdddddddd assassad aakssksk 3240 dkkkkdkk kkkdbsks kakaaaaskask cddddxddds axxdadak dkskskssadd 3300 akdskaaaas skksdddkks sksasadsdd adddddcdx aaskddskkk kkkaakdsak 3360 kskkdsdskaa addcdcdcd aasasddsaa cockatoo kdakakskda adcccdcdc 3420 dksaadasak acccccc kdassassad assakaaax dddkakksa sad 3480 saxxsaaa saccducks acadkadadk dskasas kdasksaadd dakkdaaaak 3540 daccaccda aaakakaddk ad cccdaac aasakskdd sasasdadsk kkadskddak 3600 kadkaadakd kdasdssdak cccddddcccd accakdhack saccddsad kkssssad 3660 ddasadsssd dkkaadaasd aasskksksk dadssdd asaaakdsdd ddaasadada 3720 kaddadadakd ssdaadsakd SEEkdddsaa sadaadssas kdkdaaaaas saxxasada 3780 kakskdkda caddcc dsaskdaskd cssdsdaaad sdaksakaks how to 3840 Askdadaask adk 3853

<210> 5 <211> 1743 <212> DNA <213> Azregd ± 11 out of phdeg <220>

<221> SDZ <222> (1) .. (1743) <400> 5

akd kkk dkk css sneaker ekk Dec ska kka dsa ekk acc Dec sec ccd ax 48 Mek Pb Ya1 Zeg Zeg Bie A1a Bie Bie A1a Bie 11th A1a Rgo Bie 11th 1 5 10 fifteen dsa acc grandfather dka aah aka yeah garden ssa dda aka aac ssa aac sss asa 96 A1a Not A1a Ya1 Bz 11th C1 and C1p Rgo C1u 11th Azp Rgo Azp Rgo Tht 20 25 thirty Dec ask dka food aac dds ace cas as ddk SCS sack aas garden sas as 144 A1a Tht Ya1 Agd Azp C1u Tht Tug Tug C1u Bie Hb Azp C1p Nhz Tug 35 40 45 aac saa das SCS kkk SCS ddk acc ssa as dsa garden saa sec acc ddk 192 Azp C1p Azr Bie RNe Bie C1u Not Rgo Tug A1a C1p C1p Rgo 11th C1u fifty 55 60 das ekk sds ccd sdd ace ssa food kea akd aas ace css cdd ssa dka 240 Azr Bie Agd Bie Agd Tht Rgo Agd Zeg Mek Azp Tht Zeg Tgr Rgo Ya1 65 70 75 80

- 41 008007

ssa hell aaE dsa asa yeah EAE Esa sss dsa Food DEER dda Eee aaE garden 288 Rgo Agd Azp A1a Tht C1 and Tug Zeg Rgo A1a Suz Ya1 C1u Pb Azp C1p 85 90 95 asa dad ddk DSE Ess yeah dss Food CEE acE cEC aaE des des sds ssd 336 Tht C1 and C1u A1a Zeg C1 and A1a Suz Bie Tht Bie Azp Ya1 Ya1 Agd Rgo 100 105 110 dsa hell ax DSE CEE ECE yeah hell CEE sss DEER DSE des Unit aee saE 384 A1a Zeg Not A1a Bie Zeg C1 and Zeg Bie Rgo Ya1 A1a Yb Tgr Not Nyz 115 120 125 dds ddd dda EEC ace Ess dds ECE Esa Esa dad aah saa Eas aaE eat 432 C1u C1u C1u Pb Tht Zeg C1u Zeg Zeg Zeg C1 and Bz C1p Tug Azp Bie 130 135 140 Ess EEC ax DEER yes garden Esa des saa aU yeah aad sss DEER aec dsa 480 Zeg Pb 11th Ya1 Azr C1p Zeg Ya1 C1p MeE C1 and Bz Rgo Ya1 11th A1a 145 150 155 160 des hell cea aaE Eab cde CEE saa Food Unit dDE Eee aU Unit hell aad 528 Ya1 Zeg Bie Azp Tug Agd Bie C1p Suz Tgr C1u Pb MeE Tgr Zeg Bz 165 170 175 dad aU aad yeah dss dda yeah ddd aas eat dda CEE hell das saa food 576 C1 and Mek Bz C1 and A1a C1u Ya1 C1u Azp Bie C1u Bie Agd Azr C1p Agd 180 185 190 EEA DSE eat sack Unit aaa saa yeah aas aee DSE grandfather Eee dDE dda das 624 Bie A1a Bie Bottom Tgr 11th C1p C1 and Azp Not A1a A1a Pb C1u C1u Azr 195 200 205 sce DSE garden dye asa aee Unit dDE yeah hell dss dds DSE aaE hell DEER 672 Rgo A1a C1p Ya1 Tht Not Tgr C1u C1 and Zeg A1a C1u A1a Azp Zeg Ya1 210 215 220 dds asa sack skd DEER DSE Eas dda ddd sds yes yes dDE aaa EEC cde 720 C1u Tht Bottom Bie Ya1 A1a Tug C1u C1u Agd Azr Azr C1u 11th Pb Agd 225 230 235 240 dsa DSE aec hell yeah hell dDE dss ssa hell DEER Eas saa cde EAE ssa 768 A1a A1a 11th Zeg C1 and Zeg C1u A1a Rgo Zeg Ya1 Tug C1p Agd Tug Rgo 245 250 255 asa sce DSE yeah Unit garden sss EAE EAE yes dDE aee grandfather aaE dsa Esa 816 Tht Rgo A1a C1 and Tgr C1p Rgo Tug Tug Azr C1u 11th Ya1 Azp A1a Zeg 260 265 270 dds Food hell Esa dsa asd yes acE Food DSE Food cEC food asa aee ssa 864 C1u Suz Zeg Zeg A1a Tht Azr Tht Bie A1a Suz Bie Agd Tht Not Rgo 275 280 285 acE aas aaa Food saE dds aec Eee das aas asd ECE aee yeah sss aU 912 Tht Azp 11th Bie Bottom C1u Not Pb Azr Azp Tht Zeg Not Ya1 Rgo MeE 290 295 300 sas DSE aee Esa dds cEC hell dda dsa aah EEC aee sce des aaa yes 960

- 42 008007

ΗΪ5 A1a 11th Zeg C1u Bie Zeg C1u A1a Bz Pb Not Rgo Ya1 Not Azr 305 310 315 320 das das EEC aee aah dad hell dss asd DEER garden cEC garden aad dds aas 1008 Azr Azr Pb Not Bz C1 and Zeg A1a Tht Ya1 C1p Bie C1p Bz C1u Azp 325 330 335 EEC des aah DEER STS Eas Food aee dda DSE aas dss das yeah ddd acE 1056 Pb Ya1 Bz Ya1 Rgo Tug Bie Not C1u A1a Azp A1a Azr C1 and C1u Tht 340 345 350 dsa Eee DSE grandfather dad dda des aas asa yes DSE dad Eee sds dad cea 1104 A1a Pb A1a Ya1 C1 and C1u Ya1 Azp Tht Azr A1a C1 and Pb Agd C1 and Bie 355 360 365 des aah dDE Unit dds cEC aas aas DSE ace asd yes aec Food dad dss 1152 Ya1 Bz C1u Tgr C1u Bie Azp Azp A1a Tht Tht Azr Not Bie C1 and A1a 370 375 380 cea Eas ssa das aee sce garden aaa dda aec STS dss aaa aU DEER dda 1200 Bie Tug Rgo Azr Not Rgo C1p 11th C1u Not Rgo A1a Not MeE Ya1 C1u 385 390 395 400 add ssa ssd Ess dda EAE dda aaE saa Eas aad cde grandfather dss dsa Eee 1248 Agd Rgo Rgo Zeg C1u Tug C1u Azp C1p Tug Bz Agd Ya1 A1a A1a Pb 405 410 415 garden dDE yes DEER aas aec saE dss dsa cde add Food ace hell garden aec 1296 C1p C1u Azr Ya1 Azp Not H.2-3 A1a A1a Agd Aggt Bie Tht Zeg C1p 11th 420 425 430 Unit Esa Ess sds aaE aec Esa yeah hell Eas aU Eee das DEER aec 1344 Tgr Zeg Zeg Agd Azp Not Zeg Ya1 Tug Zeg Tug MeE Pb Azr Ya1 Not 435 440 445 hell sce dda EAE dds STS ECE DSE dDE Ess EAE DSE ddd DSE acE saE 1392 Zeg Rgo C1u Tug C1u Rgo Zeg A1a C1u Zeg Tug A1a C1u A1a Tht Ntz 450 455 460 dDE acE yes aee ssd Eas DEER EEC EAE aaE eat yes dds eat ddd EAE 1440 C1u Tht Azr Not Rgo Tug Ya1 Pb Tug Azp Bie Azr C1u Bie C1u Tug 4 65 470 475 480 das Esd aas aas aad Ess aaa yeah hell aaa sce aas hell EAE Ess sds 1488 Azr Zeg Azp Azp Bz Zeg 11th C1 and Zeg Not Rgo Azp Zeg Tug Zeg Agd 485 490 495 aU hell aah aee aU Esa hell aU Unit des hell Eee grandfather asa asa Food 1536 MeE Zeg Bz 11th MeE Zeg Agd MeE Tgr Ya1 Zeg Pb Ya1 Tht Tht Bie 500 505 510 das ssa aaE saE ECE dda dDE aU des ssa saE STS aee sce aU aee 1584 Azr Rgo Azp ΗΪ3 Zeg C1u C1u MeE Ya1 Rgo H13 Rgo Not Rgo MeE Not 515 520 525 grandfather saa Food garden ace food DSE yeah Esa acE aec EEC EEA dda acE aaE 1632 A1a C1p Suz C1p Tht Agd A1a C1 and Zeg Tht Not Pb Bie C1u Tht Azp

- 43 008007

530 535 540

dkk garden cdd sed ssa cas aac ax duck aac sed dad aka ax kkk cx Ya1 C1p Tgr Rgo Rgo Tug Azp Not Azr Azp Rgo C1 and 11th 11th Pb Pb 545 550 555 560 duck ace duck dke asd aas eke asa as ask cdd sss dsa ddk ekk cas Azr Tht Azr ν ₃ ι Tht Azp Bie Tht Tug Tht Tgr Rgo A1a C1u Bie Tug 565 570 575 dss sas cdd cdd kaa A1a ΗΪ3 Tgr Tgr 580

1680

1728

1743

<210> 6 <211> 580 <212> PROTEIN <213> Azregd Shiz pdeg

<400> 6

Mek Pb Ya1 Run Run Bie A1a Bie Bie A1a Bie 11th A1a Rgo Bie Not 1 5 10 fifteen A1a 11th A1a Ya1 Bz 11th C1 and C1p Rgo C1u 11th Azp Rgo Azp Rgo Tht 20 25 thirty A1a Tht Ya1 Agd Azp C1u Tht Tug Tug <31u Bie ΗΪ3 Azp C1p ΗΪΞ Tug 35 40 45 Azp C1p Azr Bie Pb Bie C1u Not Rgo Tug A1a C1p C1p Rgo Not C1u fifty 55 60 Azr Bie Agd Bie Agd Tht Rgo Agd Run Mek Azp Tht Run Tgr Rgo Ya1 65 70 75 80 Rgo Agd Azp A1a Tht C1 and Tug Run Rgo A1a Suz Ya1 C1u Pb Azp C1p 85 90 95 Tht C1 and C1u A1a Run C1 and A1a Suz Bie Tht Bie Azp Ya1 Ya1 Agd Rgo 100 105 but A1a Run 11th A1a Bie Run C1 and Run Bie Rgo Ya1 A1a Ya1 Tgr Not Bottom 115 120 125 C1u C1u C1u Pb Tht Run C1u Zeg Run Zeg C1 and Bz C1p Tug Azp Bie 130 135 140 Run Pb 11th Ya1 Azr C1p Run Ya1 C1p Mek C1 and Bz Rgo Ya1 Not A1a 145 150 155 160 Ya1 Run Bie Azp Tug Agd Bie C1p Suz Tgr C1u Pb Mek Tgr Run Bz 165 170 175 C1 and Mek Bz C1 and A1a C1u Ya1 C1u Azp Bie C1u Bie Agd Azr C1p Agd 180 185 190 Bie A1a Bie ΗΪ5 Tgr 11th C1p C1 and Azp Not A1a A1a Pb C1u C1u Azr

- 44 008007

195 200 205 Rgo A1a ΘΙη Ya1 Tht Not Tgr C1u C1 and Zeg A1a C1u A1a Azp Zeg Ya1 210 215 220 C1u Tht Nhz Bie Ya1 A1a Tug C1u C1u Agd Azr Azr C1u Not Pb Agd 225 230 235 240 A1a A1a Not Zeg C1 and Zeg C1u A1a Rgo Zeg Ya1 Tug ΘΙη Agd Tug Rgo 245 250 255 Tht Rgo A1a C1 and Tgr C1p Rgo Tug Tug Azr C1u Not Ya1 Azp A1a Zeg 260 265 270 C1u Suz Zeg Zeg A1a Tht Azr Tht Bie A1a Suz Bie Agd Tht 11th Rgo 275 280 285 Tht Azp 11th Bie Nhz C1u 11th Pb Azr Azp Tht Zeg Not Ya1 Rgo Mek 290 295 300 Nhz A1a 11th Zeg C1u Bie Zeg 61u A1a Bz Pb Not Rgo Ya1 Not Azr 305 310 315 320 Azr Azr Pb 11th Bz C1 and Zeg A1a Tht Ya1 ΘΙη Bie ΘΙη Bz C1u Azp 325 330 335 Pb Ya1 Bz Ya1 Rgo Tug Bie 11th C1u A1a Azp A1a Azr C1 and C1u Tht 340 345 350 A1a Pb A1a Ya1 C1 and C1u Ya1 Azp Tht Azr A1a C1 and Pb Agd C1 and Bie 355 360 365 Ya1 Bz C1u Tgr C1u Bie Azp Azp A1a Tht Tht Azr Not Bie C1 and A1a 370 375 380 Bie Tug Rgo Azr Not Rgo C1p 11th C1u 11th Rgo A1a Not Me Ya1 C1u 385 390 395 400 Agd Rgo Rgo Zeg C1u Tug C1u Azp C1p Tug Bz Agd Ya1 A1a A1 a Pb 405 410 415 C1p C1u Azr Ya1 Azp 11th Nhz A1a A1a Agd Agd Bie Tht Zeg ΘΙη 11th 420 425 430 Tgr Zeg Zeg Agd Azp Not Zeg Ya1 Tug Zeg Tug MeE Pb Azr Ya1 11th 435 440 445 Zeg Rgo C1u Tug C1u Rgo Zeg A1a C1u Zeg Tug A1a C1u A1a Tht Refinery 450 455 460 C1u Tht Azr 11th Rgo Tug Ya1 Pb Tug Azp Bie Azr C1u Bie C1u Tug 465 470 475 480 Azr Zeg Azp Azp Bz Zeg 11th C1 and Zeg 11th Rgo Azp Zeg Tug Zeg Agd 485 490 4 95 Me Zeg Bz 11th Mek Zeg Agd Mek Tgr Ya1 Zeg Pb Ya1 Tht Tht Bie 500 505 510 Azr Rgo Azp H15 Zeg C1u C1u Me Ya1 Rgo Nhz Rgo Not Rgo Mek 11th 515 520 525 A1a C1p Suz C1p Tht Agd A1a C1 and Zeg Tht 11th Pb Bie C1u Tht Azp

530 535 540

- 45 008007

Cha1 C1p Tgr Rgo Rgo Tug Azp Not Azr Azp Rgo C1 and 11th 11th Pb Pb 545 550 555 560 Azr Tht Azr Cha1 Tht Alp Yee Tht Tug Tht Tgr Rgo A! a C1u Bie Tug

565 570 575

A1a Ηί3 Tgr Tgr

580 <210> 7 <211> 2769 <212> DNA <213> Azregd Schiz ptdeg <400> 7

ddaasaard abadas dadaasdrdd Bssdbrd yes baaaaaa 60 Radbdss ADDRESS daksddsaaa saarrdss Bhhhhhhhh bastard 120 sdssrdardr yeah Baaaaaaa Bastard sadsad Baaaaaaaa 180 bassassas abdssss Bff ddaassa dds ASSAIR aadssbssd 240 dssdaSaRa SRSASDDRAY dddsdas Bbc cssacass Bastard 300 aaadddddr Sad Dadaada saDaDssd bastard Balsaasaas aaabs 360 saasasdda give ssdasbd bastard aaassssdsas asdda 420 dbsbc RsdbcRad Bssssaa yeah kindergarten asdsdddadsd 480 Ddddddrddd assssdb Bssssssas asshldds Bddddsas Bastard 540 dssssss Bldsdsada Basadadaa bbc Rdssdsdad bast 600 DADRDR aasRadsda ddddrddradd ДдЬЬдссссЬЬ ADDRESS Bastard 660 Rdbadss ddaadssdaa ddassssds dsddsa Baadds DRaRaSSa 720 Bcdbc yes dddddasa saadaasdds dakssdaad aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa saddrdrdd 780 sbddasr dsddddsd dsdsssd bddddsas Bdbsdsss BasRasdsda 840 abdasard ddadsaassa surrender ssaasdds saassbass dsdadasas 900 ddasadddas dbsbddr aaaaaaaaa asasyassss adasda garden 960 give Ddssaadda a'c Bdasasa'd РсаРасасЬЬЬдР Bastard 1020 ssadssssss bldddda Baaddds Bssbcb sddsdasa asaadsad 1080 aasabdas Bssass abdsssadd Bastard Bssaasas Baddad 1140 Bssaaaaaa ssdadRRsad ssdsssss dass dsadadad ARDDdaa 1200 Baaaaaaaa ssddaaa'b Bdsdssaa Bdbsddsdaa AddsRsaass addsbas 1260 ddsa Bcdadd ARDSSRDS ssdsdda Bastard dabd 1320 Dadasarss aaddssad Bddsdb Bldg dddrdrdds Bsasaddddd 1380 Baasaas ssdsssads Bdsb Blddb ssdsadd hell 1440 Bbc aaassassd BsaaRaRyr Bdsad LARRDDSRSR ARARBDSAA 1500 ARABADSS dasaDaRa dassssaaa ssdrdsd yes Bcdbc 1560 Да Ь Ь да с д Р Р Р dsdsdsdsdsr drddadrddd Baaddaa sardaadsd Bsdddda 1620 rssssdaaaa LARRDDS adasaasaad Bsscss sa daskada dsaasadya 1680 adsad dddasad saaddy Bdsdasds Bcdassass ssdsards 1740

- 46 008007

sadaadadss ECEEDSSDSS aadEEEddSd EsaEssessa addadce dssasas 1800 assesesseas sassdssdae DEEDEassaad ACEEEEEASE ceddssaad ddasadds 1860 dsaaEeaedd FoodFoodEdss daddssdads Food stuff dsddddaE Essedds 1920 hell esdadda DEAEAAESAAS sdcEasaaEa dSSESESSES EEEDESEEEs asdaasEaEa 1980 YESDEEEDEA SSSAECEEDS ESSEEEEEASE dsssseac AsaaEaEsad loan 2040 AEASAESEES Essdasdaaa dasadsDEEa ccEEDadSDD AdadEdsss daddssds 2100 aaEesdaEsE dasasddsds yes Eadsasaaas asdass Yeahhhhhhhh 2160 adaaddsdaa EsadasEdEs Edsad edas Edasse SEASDEDSDE ssaEdds 2220 gadget sdcEacEacE ddddsEDEaE desaaedas EEessaEacE yeah ead 2280 seaasaaaaa saddsaasEEE SESSAEAEAEC hessessdeas sdddsadd adsaEssas 2340 Eddassdass FOODFOOD SEESddEasd EaEaaesedd asd YesESesadsad 2400 Eaddaad asasseseds Sassda Edsaa YESEEAESEAS Yeshhhhhhhhhh daaddasa esa 2460 EsaassdEsa dsdadasdE sdda EEaEaEsEDd dsaasdadas saasddda 2520 SESAESSEDDD adEesddeaaa sddsasadsa DEDDSDASSA YesasaddFood SEDDSESDAS 2580 dsddda Esaaeecaec Eaesssaeec adaaeseddd ddEadsseaE asasassa 2640 aEsadadEad EaEaEasaEs aeaessasaa AESSAECESS assEaEaEas aaaaassssa 2700 aseaaessea saasadsdss Eddeessee Essss SESEEEEAAEE Essssesssss 2760 Yesssesse 2769

<210> 8

Ο Ί 1 h. 1 СОО + 4.11+ ± υζ. -e <212> DNA <213> AzregdShiz ptdeg <220>

<221> SDZ <222> (1) .. (1623) <400> 8

aU grandfather garden dDE grandfather DSE Eee dda eat cEC ddd eat DSE dss ECE DSE 48 MeE Ya1 C1p C1u Ya1 A1a Pb C1u Bie Bie C1u Bie A1a A1a Zeg A1a 1 5 10 fifteen Food dds acE EAE grandfather sss Eas Eas grandfather aaE Food asa Unit dad saa ssa 96 Bie C1u Tht Tug A1a Rgo Tug Tug A1a Azp Bie Tht Tgr C1 and C1p Rgo 20 25 thirty sdd acE eat Ess aas Unit Ess aas CEE ace des dad asa sdd asa ddd 144 Agd Tht Bie Zeg Azp Tgr Zeg Azp Bie Tht Ya1 C1 and Tht Agd Tht C1u 35 40 45 asd EEC aee dDE aU cEC aaE das acE Eas ssa das DEER food garden Eee 192 Tht Pb Not C1u MeE Bie Azp Azr Tht Tug Rgo Azr Ya1 Agd C1p Pb fifty 55 60 eat food DEER sce EAE dss aad sce sce aee ddd yes EEA hell Unit CEE 240

- 47 008007

Bie Agd Ya1 Rgo Tug A1a Bz Rgo Rgo 11th C1u Azr Bie Agd Tgr Bie 65 70 75 80 ssk ssk sack sdd ekk das aas ksa hell hell asa as das css ace cx 288 Rgo Rgo H13 Agd Bie Azr Azp Zeg Zeg Agd Tht Tug Azr Zeg Tht Pb 85 90 95 as dds ssa dss cdk ssd garden as dkk ssa dsa dad hell duck kkk cdd 336 Tug C1u Rgo A1a Suz Rgo C1p Tug Ya1 Rgo A1a C1 and Zeg Azr Pb Tgr 100 105 110 aac yeah as yeah ssd dad aac ccd skd SCS aac dks dds yeah add SCS 384 Azp C1 and Tug C1 and Rgo C1 and Azp Bie Bie Bie Azp Ya1 C1u C1 and Agd Bie 115 120 125 aas garden dds cake asd dsa cdd css sneaker ksa dad duck kde skd css ska 432 Azp C1p C1u Zeg Tht A1a Tgr Zeg Zeg Zeg C1 and Azr Suz Bie Zeg Bie 130 135 140 grandfather dka cdd ask ssa sneaker as Dec aac dad asa css aad skd ssa dkk 480 A1a Ya1 Tgr Tht Rgo Zeg Tug A1a Azp C1 and Tht Zeg Bz Bie Rgo Ya1 145 150 155 160 grandfather skd kkk dks asd dda ddk ddk dds ax asa ddd ddk ax aas acc 528 A1a Bie Pb Ya1 Tht C1u C1u C1u C1u 11th Tht C1u C1u Not Azp 11th 165 170 175 ssd css garden skd sss cake Dec cdd dka cake sds cake garden dad sack ax 576 Rgo Zeg C1p Bie Rgo Zeg A1a Tgr \ 7a1 Zeg Agd Zeg C1p C1 and Ηί3 Not 180 185 190 d " dkk ace ax aac cas sds dks aac acc kkk dds aac sss aah sneaker 624 Ya1 Ya1 Tht 11th Azp Tug Agd Ya1 Azp 11th Pb C1u Azp Rgo Bz Zeg 195 200 205 caustic grandfather ccd aac duck asd sneaker ekk asd skd akd das dkd sds Dec Dec 672 Agd A1a Bie Azp Azr Tht Zeg Bie Tht Bie Mek Azr Ya1 Agd A1a A1a 210 215 220 dkd dad cdd dka as dad aas acc yeah grandfather cx ddk ddk aac sss yeah 720 Ya1 C1 and Tgr Ya1 Tug C1 and Azp Not C1 and A1a Pb C1u C1u Azp Rgo C1 and 225 230 235 240 aac acc akd dks hell ska saa dkk css cake sas akd ask hell Dec aas 768 Azp 11th Mek Ya1 Agd Bie C1p Ya1 Zeg Zeg ΗΪ3 Mek Tht Agd A1a Azp 245 250 255 adk aad garden ska cdd dda garden ksa saa ddk Dec ccd skd asd sack skd 816 Zeg Bz C1p Bie Tgr C1u C1p Zeg C1p C1u A1a Bie Bie Tht H13 Bie 260 265 270 cas ace SCS dsa cdd ssa yeah dad ssk ekk dss dss aad cx dds dks 864 Tug Tht Bie A1a Tgr Rgo C1 and C1 and Rgo Bie A1a A1a Bz Pb C1u Ya1 275 280 285 ax css saa dda dsa cake dss asa SCS aas SCS cake ace asd sss duck 912 11th Zeg C1p C1u A1a Zeg A1a Tht Bie Azp Bie Zeg Tht Tht Rgo Azr

- 48 008007

290 295 300

dkd cas saa das kkk das ax dkd dss aad dda ska dds kde aac as 960 Ya1 Tug 61p Azr Pb Azr Not Ya1 A1a Bz C1u Bie 61u Suz Azp Tug 305 310 315 320 ddk duck duck dss dad dss dad skd dad kde akd caustic ddd acc css cdd 1008 61u Azr Azr A1a C1 and A1a C1 and Bie C1 and Suz Mek Agd C1u Not Zeg Tgr 325 330 335 dkd garden ax dad dad as ax aas sds cas aac hell cake ssk cake acc 1056 Ya1 C1p Not C1 and C1 and Tug 11th Azp Agd Tug Azp Zeg Zeg Rgo Zeg Not 340 345 350 Dec cx asd aas as acc sss duck dad aah cas ax cx css das yeah 1104 A1a RNe Tht Azp Tug Not Rgo Azr C1 and Bz Tug Not Pb Zeg Azr C1 and 355 360 365 hell garden caustic cas ekk dad edd aad dkk dss food dds ssd ksa acc food 1152 Agd 61p Agd Tug Bie C1 and Agd Bz Ya1 A1a Agd C1u Rgo Zeg Not Agd 370 375 380 cake das asd grandfather food yeah cx ssk hell asa aas asd ace ksa dka aac 1200 Zeg Azr Tht A1a Agd C1 and Pb Rgo Zeg TNG Azp Tht Tht Zeg Ya1 Azp 385 390 395 400 acc yeah yeah dds yeah ksa das cdk skd dsa dkd ask das ekk grandfather ska 1248 Not 61and C1 and C1u C1 and Zeg Azr Suz Bie A1a Ya1 Tht Azr Bie A1a Bie 405 410 415 caustic grandfather css acc ddd SCS dad ace as sds cas cas cdd Dec dds aas 1296 Agd A1a Zeg Not C1u Bie C1 and Tht Tug Agd Tug Tug Tgr A1a C1u Azp 420 425 430 cx css aac ax adk sss dka ssd cdd ska dda dsa cx sas cdd ace 1344 Pb Zeg Azp Not Zeg Rgo Ya1 Rgo Tgr Bie C1u A1a Pb Hb Tgr Tht 435 440 445 das skd skd akd ax cx ddk asd as aac skd das dke dds dad ax 1392 Azr Bie Bie Mek 11th Pb C1u Tht Tug Azp Bie Azr Ya1 <31 y C1 and 11th 450 455 460 sneaker garden ccd yeah dke das ace cake dss asd akd saa duck as ska SCS 1440 Zeg 61p Bie 61and Ya1 Azr Tht Zeg A1a Tht Mek C1p Azr Tug Bie Bie 465 470 475 480 dss kkk skd aad das ksa ksa ace dke hell dad asd dke dda cdd ssd 1488 A1a Pb Bie Bz Azr Zeg Zeg Tht Ya1 Zeg C1 and Tht Ya1 C1u Tgr Rgo 485 490 495 kka as skd dds aas dad ace aas dda dda SCS ax skd dad cx ddk 1536 Bie Tug Bie 61u Azp C1 and Tht Azp C1u 61u Bie Not Bie C1 and Pb C1u 500 505 510 aas dds asa dsa dkd edd ace ax asa ddk das cdd SCS das grandfather dda 1584 Azp C1u Tht A1a Ya1 Agd Tht Not TNG C1u Azr Tgr Bie Azr A1a C1u 515 520 525

- 49 008007

Food EEC aaE Esa Xxx aec ssa EEC hell aec Unit ddd ead 1623 Suz Pb Azp Zeg Zeg 11th Rgo Pb Agd Not Tgr C1u 530 535 540

<210> 9 <211> 540 <212> PROTEIN <213> AzregdShiz pideg

<400> 9 MeE Ya1 61p 61u Ya1 A1a Pb 61u Bie Bie C1u Bie A1a A1a Zeg A1a 1 5 10 fifteen Bie C1u Tht Tug A1a Rgo Tug Tug A1a Azp Bie Tht Tgr 61and C1p Rgo 20 25 thirty Agd Tht Bie Zeg Azp Tgr Zeg Azp Bie Tht Ya1 C1 and Tht Agd Tht 61u 35 40 45 Tht Pb 11th C1u MeE Bie Azp Azr Tht Tug Rgo Azr Ya1 Agd 61p Pb fifty 55 60 Bie Agd Ya1 Rgo Tug A1a Bz Rgo Rgo 11th 61u Azr Bie Agd Tgr Bie 65 70 75 80 Rgo Rgo H13 Agd Bie Azr Azp Zeg Zeg Agd Tht Tug Azr Zeg Tht Pb 85 90 95 Tug 61u Rgo A1a Suz Rgo C1p Tug Ya1 Rgo A1a 61and Zeg Azr Pb Tgr 100 105 110 Azp 61and Tug C1 and Rgo 61and Azp Bie Bie Bie Azp Ya1 61u 61and Agd Bie 115 120 125 Azp C1p 61u Zeg Tht A1a Tgr Zeg Zeg Zeg C1 and Azr Suz Bie Zeg Bie 130 135 140 A1a Ya1 Tgr Tht Rgo Zeg Tug A1a Azp C1 and Tht Zeg Bz Bie Rgo Ya1 145 150 155 160 A1a Bie Pb Ya1 Tht 61u 61u 61u 61u Not Tht 61u 61u 11th Azp 11th 165 170 175 Rgo Zeg C1p Bie Rgo Zeg A1a Tgr Ya1 Zeg Agd Zeg 61p 61 and ΗΪ3 11th 180 185 190 Ya1 Ya1 Tht 11th Azp Tug Agd Ya1 Azp 11th Pb 61u Azp Rgo Bz Zeg 195 200 205 Agd A1a Bie Azp Azr Tht Zeg Bie Tht Bie MeE Azr Ya1 Agd A1a A1a 210 215 220 Ya1 C1 and Tgr Ya1 Tug C1 and Azp 11th 61and A1a Pb 61u C1u Azp Rgo C1 and 225 230 235 240 Azp 11th MeE Ya1 Agd Bie 61p Ya1 Zeg Zeg H13 MeE Tht Agd A1a Azp 245 250 255

50 008007

Zeg bz C1p Bie 260 Tgr C1u C1p Zeg C1p C1u 265 A1a Bie Bie Tht 270 Ηί3 Bie Tug Tht Bie A1a Tgr Rgo C1 and C1 and Rgo Bie A1a A1a Bz Pb C1u Ya1 275 280 285 Not Zeg C1p C1u A1a Zeg A1a Tht Bie Azp Bie Zeg Tht Tht Rgo Azr 290 295 300 Ya1 Tug C1p Azr Pb Azr Not Ya1 A1a Bz C1u Bie C1u Suz Azp Tug 305 310 315 320 C1u Azr Azr A1a C1 and A1a C1 and Bie C1 and Suz Me Agd C1u Not Zeg Tgr 325 330 335 Ya1 C1p Not C1 and C1 and Tug Not Azp Agd Tug Azp Zeg Zeg Rgo Zeg Not 340 345 350 A1a Pb Tht Azp Tug Not Rgo Azr C1 and Bz Tug Not Pb Zeg Azr C1 and 355 360 365 Agd C1p Agd Tug Bie C1 and Agd Bz Ya1 A1a Agd C1u Rgo Zeg Not Agd 370 375 380 Zeg Azr Tht A1a Agd C1 and Pb Rgo Zeg Tht Azp Tht Tht Zeg Ya1 Azp 385 390 395 400 Not C1 and 61and C1u C1 and Zeg Azr Suz Bie A1a Ya1 Tht Azr Bie A1a Bie 405 410 415 Agd A1a Zeg 11th C1u Bie C1 and Tht Tug Agd Tug Tug Tgr A1a C1u Azp 420 425 430 Pb Zeg Azp 11th Zeg Rgo Ya1 Rgo Tgr Bie C1u A1a Pb H13 Tgr Tht 435 440 445 Azr Bie Bie Me 11th Pb C1u Tht Tug Azp Bie Azr Ya1 C1u C1 and 11th 450 455 460 Zeg C1p Bie C1 and Ya1 Azr Tht Zeg A1a Tht Me C1p Azr Tug Bie Bie 465 470 475 480 A1a Pb Bie Bz Azr Zeg Zeg Tht Ya1 Zeg C1 and Tht Ya1 C1u Tgr Rgo 485 490 495 Bie Tug Bie C1u Azp C1 and Tht Azp 61u C1u Bie Not Bie C1 and Pb C1u 500 505 510 Azp C1u Tht A1a Ya1 Agd Tht Not Tht C1u Azr Tgr Bie Azr A1a C1u 515 520 525 Suz Pb Azp Zeg Zeg Not Rgo Pb Agd Not Tgr 61u

530 535 540 <210> 10 <211> 3235 <212> DNA <213> Azregd Schiz

- 51 008007 <400> 10

DEEEEESAEE Food EEEddsdds ESSEEEDEAE aaaaEEaaaa dddddds 60 EATING DEASEEEDDDA EEEEEEEEEEA dSEEEdased ЕасАэдЕЕЕ ddddsdd 120 FoodEadssda surrender asssasdaas garden EaEaEEasa ESSEEESAE 180 EEEDDESSD dessaasss dssEEEEaasas sssaasaasE asaadsad Food 240 AsaEedasES ASSESSED dsEdaassaE dsaddssdss saas aEEassassaa 300 dsaEdsdaaE sda dasaadsdd dedaaaedes surrender aassaaadsd 360 saasdd ddsesseees sssdsadadd sadssee dsadsseee aasEddSdd 420 yeah FoodEsaasE food kindergarten asadda adsaEEDEED 480 dssEaaEaEa ESSEEEASED ESSEDESEDA SESSESSESS EedaEsads SESSDEEEEDS 540 dsaEdadaas dddEEsdaas DEESSEDDDS sassssdddd dsdEaEaEe Sessdsssas 600 DECESSEDES ssssfood daaassEesd Yes Yes saEsaddssa DEEDDSEAED 660 adaaadddd SEEEDSEDES FOOD aaaedsadde SESAEADSAA yes essassades 720 sdaddadds saeddsdaed Yesdaaassa Eddadds IEEE SESSDA 780 dssessaadas aEadaddaE aeEdadsasE Edaaasdaad dddddaaaaa EddaasEdaEa 840 EaEadadEEEa Sessssadss Yes, Yessdadad cceaedass aeadsddeas adaedaedds 900 saEsaEdaad dssss ddsessessess ESSSSEDSS DESEDDDSDA SESSADES 960 edddaeda dSESSEASED EsaceEaEEDs dsa essa esd dssassd esa EEDDAAAAEC 1020 Eddsaedus dadadsEesa asaaeaeess SEEEEDSADSAD dsssssad dsedseddsd 1080 EsEdaadsss ssasaassssE Eddaaas ssesddsasE DEESADSS saddadsses 1140 yeah ssdsada asEEssassas dda edadads yeah SESEDDESAE 1200 iuuSSiSSiS at C and. at a and c scc SEEEDDEASA desdddsass α a and C s. S with Soo auua.iiuSSe Ί About SG \ daasa AEESDDSDS sdddsddddas sassdsddas EsdaadsUds NEXTED 1320 NEXT ddsdddds FOOD EESaaaddsd FOODFOODFood dEasaasdaE 1380 ddeaesaesd Yesdaadada adaas edss Eaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa deadsaeda aeaaaaaaaaaaaaaaaaaa 1440 ddddddee ddddeeseeds ssdadaaadda yes essaddad dasddd sdaassEdd 1500 dsESSDedas saasssssed sssadsadU ddEEDssdas aasa Esdadd SECEEEDDEDD 1560 adassssddas eddadda EEEdddda aEsadsadda dssa EEEEEEESA 1620 yes Yesdasddaa asaESesEEEa Saadda Yeaad ssseEdeEss dddddddssae 1680 saeddasess ddeaddead ESSssdsad SSSD dddd esaadd dasadsad 1740 aaaaaaaaaaaa DEADDEDAE SEDSADDSED Essessee aasdasasss Herewith 1800 dsdEdaasEa dasasassd aseessessaaa Edddsaaas Essd edssad dsaEEEEaad 1860 SECESSEECE DEDDDSEEEE saEaEDEDss Yesdassddas dddddddd Foodstuffs 1920 addd EEDDDSAAAD sadddaaaa Edseddddes ssdEesaesd Edddsdassa 1980 adadda dddasseee Esdss EsadEssaas aEEasdasda EsdasdaddE 2040 ddDesdasEas SEDDESSESE ACEESEEESEA FoodsEads surrender EOODADASE 2100 heddssssed Eassadas sassassaddea sdddessessd Eesaddasad dsdsdssaa 2160 saasEddeae ssdsaaEEEa adsdaEEDs cdc ddsdasEedd ECEEssassE 2220 ESSDDSDD Yesessesse sEDaEsad ddaaaessc SECURITY surdaeddes 2280 deasseddsd ASSEEDESE aEddssassss adEesEdddd assEssassad daad edass 2340 DSEDSADDED EECEaEddda Esaadssaaa SEAEDSADSE adEecEadss asasdEasEa 2400 UNIVERSAL DEEDEAEASDS FoodEssdaa Sessaassdd ddddadEasa FOODFOOD 2460 dsad yeah hell EEsddadsd aasdasdssa desesesseas 2520

- 52 008007

yes sdsaasddda saEaEdEeE saessadssad aaEassdsdd SECESSASE 2580 FOOD ^ ddsdddddd DESSDDASDD EsaddaasEEE adsseeaeda yes 2640 here is ddssesddaa aaddaeaaaa ddddaesaeda aEadEasEad csaEaEeaaE 2700 daaddsaa ЕасасдсдЕ Eddass EEaEadsEs ssDEEEEEEEa Ead eassaes 2760 DEEaEassad ssaaEsaade sassassdsas dassddddas ddsdaaesss yeah 2820 aadaaaEEDs Jessssaddss hell dsdaEeddss assesessaa ddsasaddds 2880 SAEESEDSAD sdseddadda EESA ESSDSAA EEsssssdd sssddssssda SassdsEaEa 2940 dds cssassaE sdda Esdsseaaed Esessdessde Esasaads 3000 aadad food hell Foodstuff ddaaEesaad seadadcea adsdaeaeed 3060 sakdddsaaa FOODFOOD sEEDEDsEs ESSEEESads ESSESSEDES dzadadadd 3120 EEEDDSEAEA aaEEdaadEd DEEDDESDDD DEESSDEDAD ddds dsEssesssss 3180 EEEEEADASDS aas edadads SEDADESES EssadssaE saEeassassE samsa 3235

<210> eleven <211> 1689 <212> DNA <213> AzregdShiz p! Deg

<220>

<221> C3 <222> (1) .. (1689) <400> 11

aU dss aec aU aad dss cEC CEE Unit cEC Ess CEE Ess cEC dss des 48 MeE A1a 11th MeE Bz A1a Bie Bie Tgr Bie Zeg Bie Zeg Bie A1a Ya1 1 5 10 fifteen Unit grandfather acE ssa DEER saa sdd yes dsa DSE sce acE des acE aee grandfather 96 Tgr A1a Tht Rgo Ya1 C1p Agd Azr A1a A1a Rgo Tht Ya1 Tht 11th A1a 20 25 thirty saE ssa Esd dss ace des aee dda aah ECE dds aaE des dad hell EEC 144 ΗΪ3 Rgo Zeg A1a Tht Ya1 11th C1u Bz Zeg C1u Azp Ya1 C1 and Zeg Pb 35 40 45 aas aaE aee sss Eee grandfather garden dss sss asa dds Esd eat cde eat aad 192 Azp Azp 11th Rgo Pb A1a C1p A1a Rgo Tht C1u Zeg Bie Agd Bie Bz fifty 55 60 sss ssa saa sss Food yeah acE dss cEC dds acE DEER garden dss asa dda 240 Rgo Rgo C1p Rgo Bie C1 and Tht A1a Bie C1u Tht Ya1 C1p A1a Tht C1u 65 70 75 80 dss Esd saa Esd Food ssd garden aU Eas EEC ace asd yes dad hell yeah 288 A1a Zeg C1p Zeg Suz Rgo C1p MeE Tug Pb Tht Tht Azr C1 and Zeg C1 and 85 90 95 EEC ssd asa Esd des aee dds cEC cEC DSE yes cEC sce Food yeah garden 336

- 53 008007

Pb Rgo Thr Zeg 7a1 100 Not C1u Bie Bie 105 A1a Azr Bie Rgo Bie 110 Ya1 C1p Esd DSE ace aaE DSE cEC dad yes Food eat aas aee das aee sdd cde 384 Zeg A1a Tht Azp A1a Bie C1 and Azr Suz Bie Azp Not Azr 11th Agd Agd 115 120 125 ssd dss ddd ace ace grandfather das Esd aad eat sce grandfather eat des Unit aec 432 Rgo A1a C1u Tht Tht A1a Azr Zeg Bz Bie Rgo Ya1 Bie νβΐ Tgr 11th 130 135 140 Eee dds dda dds SER yeah CEE dDE Esa aad grandfather aU EAE yes dDE asa 480 Pb C1u C1u C1u Pb C1 and Bie C1u Zeg Bz A1a MeE Tug Azr C1u Tht 145 150 155 160 asd aU yeah Esa Esd Esd aaa das aad aas aU sce aec grandfather Eee yeah 528 Tht MeE Ya1 Zeg Zeg Zeg Not Azr Bz Azp MeE Rgo Not Ya1 Pb Ya1 165 170 175 dsa aU aaE Tar eating grandfather dda dDE EEC ddd EEC Food sss dda aad dad 576 A1a MeE Azp Tug Agd Ya1 C1u C1u Pb C1u Pb Bie Rgo C1u Bz C1 and 180 185 190 aec eat dad das ddd Ese grandfather aas cea ddd cEC eat das saa eating CEE 624 Not Bie C1 and Azr C1u Zeg A1a Azp Bie C1u Bie Bie Azr C1p Agd Bie 195 200 205 dss eat garden Unit dn dss das aas aec dad dss Eee dDE dda das ssd 672 A1a Bie C1p Tgr Ya1 A1a Azr Azp Not C1 and A1a Pb C1u C1u Azr Rgo 210 215 220 das aad dkd asd aee Unit dda yeah Esa dsa dda dss aee Ess DEER Eee 720 Azr Bz Ya1 Tht Not Tgr C1u C1 and Zeg A1a <31u A1a Not Zeg Ya1 Pb 225 230 235 240 give garden aU aec Nd Eas das dda aas aec acE Eas aad yes aad sss 768 Azr C1p MeE Not Bie Tug Azr C1u Azp Not Tht Tug Bz Azr Bz Rgo 245 250 255 PD No. with sdd ddd des aec aU das Ess dDE hell DEER DEER STS dsa das 816 Bie Pb Agd C1u A1a Not MeE Azr Zeg C1u Zeg Ya1 Ya1 Rgo A1a Azr 260 265 270 sss des Yes/ ddd des aad dda garden saa yeah EAE yes grandfather yeah grandfather yeah 864 Rgo νβΐ Azr 61u Ya1 Bz C1u C1p C1p Ya1 Tug Azr A1a νβΐ Ya1 C1 and 275 280 285 ECE dsa dds Eat Sss ECE ECE aas das ace cea DSE Food eat cde yeah 912 Zeg A1a C1u Suz Zeg Zeg Zeg Azp Azr Tht Bie A1a Suz Bie Agd 61and 290 295 300 cea das Gus ace das ίΐο cEC aaE grandfather dsa aas Ess grandfather ssa dds aee 960 Bie Azr Tug Tht Azr Pb Bie Azp A1a A1a Azp Zeg 57a1 Rgo C1u Not 305 310 315 320 EEA hell Eas saE ECE grandfather grandfather EEA Esa EAE grandfather sce food ssd das ddd 1008 Bie Zeg Tug H1z Zeg νβΐ A1a Bie Zeg Tug Ya1 Rgo Agd Rgo Azr C1u

- 54 008007

325 330 335

asd grandfather ccd sneaker dsa kea sed das dkk ccd dds aah dsa ddd aah as 1056 TNG A1a Bie Zeg A1a Zeg Rgo Azr Ya1 Bie C1u Bz A1a C1u Bz Tug 340 345 350 Dec sdd dke sed cx ax dkd dds das saa dad duck dad ddd ace kka 1104 A1a Agd Ya1 Rgo Pb 11th Ya1 C1u Azr C1p C1 and Azr C1 and C1u Tht Bie 355 360 365 X dss ccd kkk garden css aas acc asd asd ax das dad dkd dke das 1152 Pb A1a Bie Pb C1p Zeg Azp 11th Tht Tht 11th Azr O1i Ya1 Ya1 Azr 370 375 380 Us skd dss kea Us cx cx as das Dec hell food dad garden ekk yeah 1200 Tug Bie A1a Zeg Tug Pb Pb Tug Azr A1a Zeg Agd 61and C1p Bie C1 and 385 390 395 400 yeah ska dkd dss skd cas ssa das ace ace asd cas ddd cake sed cx 1248 C1 and Bie Ya1 A1a Bie Tug Rgo Azr Tht Tht Tht Tug C1u Zeg Rgo Pb 405 410 415 add asa dds grandfather dss aas aas cdd as sed saa kkk aad food ccd dss 1296 Agd Tht C1u A1a A1a Azp Azp Tgr Tug Rgo 01p Pb Bz Agd Bie A1a 420 425 430 dss acc eke dds das ccd dke cx ace acc ace sdd sdd dsa cx eke 1344 A1a Not Bie 61u Azr Bie νβΐ Pb Tht 11th Tht Agd Agd A1a Pb Bie 435 4 4 0 L l with υ sneaker as dsa dad yeah ax css sec duck ekk sed aas cdd sneaker cas skd 1392 Zeg Tug A1a C1 and C1 and Not Zeg Rgo Azr Bie Rgo Azp Tgr Zeg Tug Bie 450 455 460 grandfather ace as das as dds ace ssa dkk skd ddd ace cx sas dda adk 1440 A1a Tht Tug Azr Tug C1u Tht Rgo Ya1 Bie C1u Tht Pb Bottom O1u Zeg 465 470 475 480 das skd skd garden dkd cx as ddd ax aad ssa aas as dsa Dec adk 1488 Aar Bie Bie C1p Ya1 Pb Tug C1 y 11th Bz Rgo Azp Tug A1a A1a Zeg 485 490 495 cake hell sas asd cas as skd hell kkk dkd as asd skd duck sed aas 1536 Zeg Zeg ΗΪ3 Tht Tug Tug Bie Zeg Pb Ya1 Tug Tht Bie Azr Rgo Azp 500 505 510 css aas sdd ddd dad cas acc dad cdd sed garden cdd aad yeah sneaker sdd 1584 Zeg Azp Agd C1u 61and Tug Not C1 and Tgr Rgo 61p Tgr Bz C1 and Zeg Agd 515 520 525 garden ccd akd aac cx dda grandfather aas das dss adk eke ekk asd duck duck 1632 C1p Bie Mek Azp Pb C1u A1a Azp Azr A1a Zeg Bie Bie Tht Azr Azr 530 535 540 cx eating aas ddd asa as dad cx ax skd garden aac ace grandfather grandfather cx 1680 Pb Agd Azp 61u Tht Tug C1 and Pb 11th Bie C1p Azp Tht A1a A1a Pb 545 550 555 560

- 55 008007 cac a bc food

Nhz 11e

1689 <210> 12 <211> 562 <212> PROTEIN <213> AzregdhNiz phdeg <400> 12

Mek A1a Not Me Bz A1a Bie Bie Tgr Bie Zeg Bie Zeg Bie A1a Ya1 1 5 10 fifteen Tgr A1a Tht Rgo Ya1 C1p Agd Azr A1a A1a Rgo Tht Ya1 Tht Not A1a 20 25 thirty Nhz Rgo Zeg A1a Tht Ya1 11th 01 y Bz Zeg C1u Azp Ya1 C1 and Zeg Pb 35 40 45 Azp Azp Not Rgo Pb A1a C1p A1a Rgo Tht C1u Zeg Bie Agd Bie Bz fifty 55 60 Rgo Rgo C1p Rgo Bie C1 and Tht A1a Bie C1u Tht Ya1 O1p A1a Tht C1u 65 70 75 80 A1a Zeg C1p Zeg Suz Rgo C1p Mek Tug Pb Tht Tht Azr O1i Zeg C1 and 85 90 95 Pb Rgo Tht Zeg Ya1 11th C1u Bie Bie A1a Azr Bie Rgo Bie Ya1 C1p 100 105 110 Zeg A1a Tht Azp A1a Bie C1 and Azr Suz Bie Azp 11th Azr 11th Agd Agd 115 120 125 Rgo A1a C1u Tht Tht A1a Azr Zeg Bz Bie Rgo Ya1 Bie Ya1 Tgr Not 130 135 140 Pb C1u C1u C1u Pb C1 and Bie C1u Zeg Bz A1a Mek Tug Azr O1u Tht 145 150 155 160 Tht Me Ya1 Zeg Zeg Zeg 11th Azr Bz Azp Mek Rgo 11th Ya1 Pb Ya1 165 170 175 A1a Me Azp Tug Agd Ya1 C1u C1u Pb C1u Pb Bie Rgo C1u Bz C1 and 180 185 190 Not Bie C1 and Azr C1u Zeg A1a Azp Bie C1u Bie Bie Azr C1p Agd Bie 195 200 205 A1a Bie C1p Tgr Ya1 A1a Azr Azp Not C1 and A1a Pb O1u C1u Azr Rgo 210 215 220 Azr Bz Ya1 Tht 11th Tgr C1u C1 and Zeg A1a C1u A1a Not Zeg Ya1 Pb 225 230 235 240 Azr C1p Mer Not Bie Tug Azr C1u Azp Not Tht Tug Bz Azr Bz Rgo 245 250 255 Bie Pb Agd C1u A1a 11th Mek Azr Zeg C1u Zeg Ya1 Ya1 Rgo A1a Azr

- 56 008007

260 265 270 Rgo Ya1 Azr C1u Ya1 Bz C1u C1p C1p Ya1 Tug Azr A1a Ya1 Ya1 C1 and 275 280 285 Zeg A1a C1u Suz Zeg Zeg Zeg Azp Azr TNG Bie A1a Suz Bie Agd (Neither 290 295 300 Bie Azr Tug TNG Azr RNe Bie Azp A1a A1a Azp Zeg Ya1 Rgo C1u 11th 305 310 315 320 Bie Zeg Tug Bottom Zeg Ya1 A1a Bie Zeg Tug Ya1 Rgo Agd Rgo Azr (Well 325 330 335 Tht A1a Bie Zeg A1a Zeg Rgo Azr Ya1 Bie C1u Bz A1a C1u Bz Tug 340 345 350 A1a Agd Ya1 Rgo RNe Not Ya1 C1u Azr C1p 61and Azr C1 and C1u TNG Bie 355 360 365 RNe A1a Bie RNe C1p Zeg Azp Not TNG TNG Not Azr C1 and Ya1 Ya1 Azr 370 375 380 Tug Bie A1a Zeg Tug RNe RNe Tug Azr A1a Zeg Agd C1 and C1p Bie C1 and 385 390 395 400 C1 and Bie Ya1 A1a Bie Tug Rgo Azr TNG TNG TNG Tug C1u Zeg Rgo RNe 405 410 415 Agd TNG C1u A1a A1a Azp Azp Tgr Tug Rgo C1p RNe Bz Agd Bie A1a 420 425 430 A1a Not Bie C1u Azr Bie Ya1 RNe TNG Not TNG Agd Agd A1a RNe Bie 435 440 445 Zeg Tug A1a C1 and C1 and Not Zeg Rgo Azr Bie Rgo Azp Tgr Zeg Tug Bie 450 455 460 A1a TNG Tug Azr Tug C1u TNG Rgo Ya1 Bie C1u TNG RNe Bottom C1u Zeg 465 470 475 480 Azr Bie Bie C1p Ya1 RNe Tug C1u Not Bz Rgo Azp Tug A1a A1a Zeg 485 490 495 Zeg Zeg Bottom TNG Tug Tug Bie Zeg RNe Ya1 Tug TNG Bie Azr Rgo Azp 500 505 510 Zeg Azp Agd C1u C1 and Tug Not C1 and Tgr Rgo C1p Tgr Bz C1 and Zeg Agd 515 520 525 C1p Bie Mek Azp RNe C1u A1a Azp Azr A1a Zeg Bie Bie TNG Azr Azr 530 535 540 RNe Agd Azp C1u TNG Tug C1 and RNe Not Bie C1p Azp TNG A1a A1a RNe 545 550 555 560

ΗΪ3 Not <210> 13 <211> 2097 <212> DNA

- 57 008007 <213> AzregdShiz pBdeg <400> 13

sseddsedas dsEaEassda adasda Yes, here EEDSESADAD dssssdad 60 DEEEDDDS sesaaaaa DEADESEESD NECESSEED aadasa saddasasds 120 ddEsdassE EsdadEdEas aeaaaaaaaaaaaaaaaaaa Eaaaaaaaaa FOODFOOD saaddsaeae 180 DEEADEEESD dsadEddEaa aadsddsEes ECEECEECA EsEddSaddE ddada edsse 240 aseaedaed EsaEssaaasE Eddedeceseas aadasdaasa saadsEEEAD Essdasdaas 300 garden EsEdeEaadE aeaaaadads esaadad es DECEED addadad 360 AEADEEEDEED AEDDESDDSDD ADCESSECA AEADEAEAD Eaaaaaaaaa sddadadesd 420 EadadEssee Eaaaaaaaaa adddadadds FoodFoodFood ddddae aaeeeessas 480 EaaEadsdaE EaaadssssEa yes Yesdaddd aEcEedadds aaaaaaaaaaa DEAESADEDD 540 asaeaessed hell yes yes addaadaaad addaadada 600 daddsaada sad EaEassEeEd sadadsadss saessdesas FoodEaEsadd 660 SESECESESE csaeacaeaec asdad esaas FOOD aEaadsdEad Edasaddssd 720 garden yesessdesas Eddds ESSDSDASE YESEEDESEa Yessdedased 780 NOW ddEdaassaa dededd adddddaaaa aeda food adddad 840 ddaasaEss aadsasasE adasdad esa dsdasdad adsdaessas Esddesesesas 900 essssessa Eadesesae EDEDEDSSAA EddsaasEaa DEAEESSAEC SASEEEEEEAAE 960 EaaadFoodEs adds yeah dseddaesed DEASADAESA yeahhhhhhhh 1020 EssEddaaEa surrender ssass esadd aeEsasdaEa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa das edssads 1080 Esdaaeddsa ESSESSDESA SECEASASSE dssde aaEesessda ASSESSEAAE 1140 DESAEEEE dssaaaaed desaesaes dsEDdsssed dsa jessads ssaEssEass 1200 sdssEEadds YesadsaEsa escesses SEDSAAEADS assdaasass surrender 1260 EDEDESESSEA saeddsad dsdssassea sEasdaadas EOODAEEass Edsaaddd 1320 dsEsadass SaaddsEaE dsasEeasds saaaasseas dddsaeaed AddsEssss 1380 SEEEEDESDS ddssesaadd piss aEdddssasd yeah sEasAssd 1440 sdadd daaaadasdd dsdssdasaa yes desdesdesas ssdaaddsds 1500 SEEssadass SECEASDESS SEAADEEESda ddaeddeaes Esddada FoodEaads 1560 dddddssee dssass ssadaddsas saasEEDdsd dddaESEaed asaesdsaea 1620 FOOD aaESEaEsds dsda addsdasdes SEDDAEASSD Eddsddsds 1680 cssfood YESEDDDES sda adsdaEedas sdsEeaasd aEddSdadss 1740 EAESEDESADSAD ssdddaaaa aEcEaasdde yes sddssdasd aaEeddEsas 1800 sssaassass ASSESSEESD Edsa Eddddass aaEdaaUddd Edsaadasas 1860 EDESSESSESA dassssedusd DESAEAESDD Eddasaas yes UNDER 1920 ddEsaaaaas dssEeddase sEasdssdaa dsdaddeEs desesdesdes Edddaesess 1980 sdsdsad dasEaESaES EECEDAAAAE EEDEAEAEAA dhhhhhhhhhh FOOD EASSS 2040 ddeEassade SAEEADEDES aaaaaaaaaa aaaaaaaasas sasaasEess Essaads 2097

<210> 14 <211> 834 <212> DNA

- 58 008007 <213> Azregd Shiz pdeg <220>

<221> POPs <222> (1) .. (834) <400> 14

aU cde cea Esa Esd eat dss eat dsa Ess hell dss aec cea STS dss 48 MeE Agd Bie Zeg Zeg Bie A1a Bie A1a Zeg Zeg A1a Not Bie Rgo A1a 1 5 10 fifteen EEA dds Eas hell aec aas das EEC Ess Food aaE hell ace yeah sas ssd 96 Bie C1u Tug Zeg 11th Azp Azr Pb Zeg Suz Azp Zeg Tht C1 and ΗΪ5 Rgo 20 25 thirty aaE ssa DEER grandfather cEC cea saE ddd cea dds dss ace Eas Eas yeah das 144 Azp Rgo Ya1 Ya1 Bie Bie H1z C1u Bie C1u A1a Tht Tug Tug C1 and Azr 35 40 45 Food aaE Eas eat saa dDE Unit cea garden ace saa dds EAE Food acE Eas 192 Bie Azp Tug Bie C1p C1u Tgr Bie C1p Tht C1p C1u Tug Suz Tht Tug fifty 55 60 dss aah ace Eas dDE dsa EAE yeah dds EEC STS Eee des dds dds cEC 240 A1a Bz Tht Tug C1u A1a Tug C1 and C1u Pb Rgo Pb Ya1 C1u C1u Bie 65 70 75 80 aad dss aec dss yeah Esd dss asd yeah aec dss grandfather Eas aec sds dad 288 Bz A1a 11th A1a C1 and Zeg A1a Tht C1 and 11th A1a A1a Tug Not Agd C1 and 85 90 95 grandfather aah yeah aad asd dds dss das aad aee das CEE des dDE sas Ess 336 Ya1 Bz C1 and Bz Tht C1u A1a Azr Bz 11th Azr Bie Ya1 C1u Hb Zeg 100 105 110 yeah dds dss EEC garden ace cEC Eas des sce aad EEC dad yes dDE aec 384 C1 and C1u A1a Pb C1p Tht Bie Tug Ya1 Rgo Bz Pb <31and Azr C1u Not 115 120 125 Esd dad aU eat yes aad eat grandfather dss aee dsa sce STS ace hell dds 432 Zeg C1 and MeE Bie Azr Bz Bie Ya1 A1a 11th A1a Rgo Rgo Tht Agd C1u 130 135 140 ace aas Food grandfather ddd aec EAE das aec dsa EAE DEER eat dda aaE cea 480 Tht Azp Bie A1a C1u 11th Tug Azr 11th A1a Tug Ya1 Bie C1u Azp Bie 145 150 155 160 Esd sds yes eat aaa dds das des eat yes ace grandfather dds Food dss dss 528 Zeg Agd Azr Bie Not C1u Azr Ya1 Bie Azr Tht Ya1 C1u Suz A1a A1a 165 170 175 Food yes yes eat dDE ssd yes dda dsa grandfather aee das sds Food aas yes 576 Suz Azr Azr Bie C1u Rgo Azr C1u A1a A1a 11th Azr Agd Bie Azp Azr 180 185 190

- 59 008007

dds dad ssk ax dkd garden ssd dda aac aac ska asd dkd acc dsa sneaker 624 C1u C1 and Rgo 11th Ya1 C1p Rgo C1u Azp Azp Bie Tht Ya1 Not A1a Zeg 195 200 205 sdd css das yeah ccd dks ace ssa ace ace ace css cx dkd sack yeah 672 Agd Zeg Azr C1 and Bie Ya1 Tht Rgo Tht Tht Tht Zeg Pb Ya1 Ηί3 C1 and 210 215 220 duck ddd dkd ace aac yeah cdd dkd saa das ask cdk ssk ska das ssk 720 Azr 61u Ya1 Tht Azp C1 and Tgr Ya1 <31p Azr Tht Suz Rgo Bie Azr Rgo 225 230 235 240 dks ddk sack ax ddk dad dsa cas duck skd aas dks cdd aac ccd dks 768 Ya1 C1u H13 11th 61u C1 and A1a Tug Azr Bie Azp Ya1 Tgr Azp Bie Ya1 245 250 255 aah aas dss ccd das cake asd ssd aad caustic dad cx dks kde sneaker skd 816 Bz Azp A1a Bie Azr Zeg Tht Rgo Bz Agd C1 and Pb Ya1 Suz Zeg Bie 260 265 270 dda cake sss dds add kda 834 C1u Zeg Rgo C1u Agd

275 <210> 15 <211> 277 <212> PROTEIN <213> AzregdShiz pddeg <400> 15

Mek Agd Bie Zeg Zeg Bie A1a Bie A1a Zeg Zeg A1a 11th Bie Rgo A1a 1 5 10 fifteen Chog ΤΊ Chog Tht P Rt-p D ' _g · * - '' 'L - 20 25 thirty Azp Rgo Ya1 Ya1 Bie Bie Hb C1u Bie C1u A1a Tht Tug Tug C1 and Azr 35 40 45 Bie Azp Tug Bie C1p C1u Tgr Bie C1p Tht C1p C1u Tug Suz Tht Tug fifty 55 60 A1a Bz Tht Tug C1u A1a Tug C1 and C1u Pb Rgo Pb Ya1 C1u C1u Bie 65 70 75 80 Bz A1a 11th A1a C1 and Zeg A1a Tht C1 and 11th A1a A1a Tug 11th Agd C1 and 85 90 95 Ya1 Bz C1 and Bz Tht C1u A1a Azr Bz 11th Azr Bie Ya1 C1u Ηί3 Zeg 100 105 but C1 and C1u A1a Pb C1p Tht Bie Tug Ya1 Rgo Bz Pb C1 and Azr C1u 11th 115 120 125 Zeg C1 and Mek Bie Azr Bz Bie Ya1 A1a 11th A1a Rgo Rgo Tht Agd C1u

- 60 008007

130 135 140 Tht Azp Bie A1a C1u Not Tug Azr Not A1a Tug Ya1 Bie C1u Azp Bie 145 150 155 160 Zeg Agd Azr Bie 11th C1u Azr Ya1 Bie Azr Tht Ya1 C1u Suz A1a A1a 165 170 175 Suz Azr Azr Bie C1u Rgo Azr C1u A1a A1a Not Azr Agd Bie Azp Azr 180 185 190 C1u C1 and Rgo Not Ya1 C1p Rgo C1u Azp Azp Bie Tht Ya1 11th A1a Zeg 195 200 205 Agd Zeg Azr C1 and Bie Ya1 Tht Rgo Tht Tht Tht Zeg Pb Ya1 ΗΪ3 C1 and 210 215 220 Azr C1u Ya1 Tht Azp C1 and Tgr Ya1 ΘΙη Azr Tht Suz Rgo Bie Azr Rgo 225 230 235 240 Ya1 C1u H13 Not C1u C1 and A1a Tug Azr Bie Azp Ya1 Tgr Azp Bie Ya1 245 250 255 Bz Azp A1a Bie Azr Zeg Tht Rgo Bz Agd C1 and Pb Ya1 Suz Zeg Bie 260 265 270

C1u Zeg Rgo 61u Agd

275 <210> 16 <211> 1881 <212> DNA <213> Azregd Schiz pgdeg <400> 16

coddles give up dddsad ДдПсЬдсддс dssssassad Bdsb 60 kindergarten sssdsssssdd bold daadssds Bssbss ssdsdsds 120 dGdaGdsssa asddcasd daddadaddG dsdddadda Bdsdids Bdaaaads 180 ssddddd aclbc dsd'b'ss Basddsddd Bsdssss ssdadsa 240 sassdss Bssdss Bssddsada asad daddah addiction ddaaaaaaa 300 yeahhhhhhhh bassdad ddcdssss SHISSSA asssssss Εΐΐοοβΐοοο 360 Bcdcbcd SASSSSN zsssssss ssdssa'bda Bssss-bsd ddsdsyas 420 Bddssdsdad cssbss ddsdsaasdd sdsdsssas dsssddsss asdssssss 480 sssssadssa dda-bsscdd Bastard ssdadds surrender yeshhhhhhh 540 sss'bssddsd sddsddsss dsdsdsdsa aspdass ddd dddds aadsdbsdd 600 sddshasaa saccas ssasasad AsadSad saadssss Д д д с да да да 660 ssassssdsk dddssssss dddddss1: ssdssdssd saassadad HERE 720 sssassada! css Bldbd Baaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Bssads dssbasa 780 ssadsssds cbdb bssdssss Bdsads HERE aasdssssd 840 abdaddd ssssaadss BcIssassd ssddds dssddsss dssassssd 900 accdcdcd saddds dssdssd Bsdss''daa sdaddasdss garden 960

- 61 008007

Eddddee SECEDDSDSDE dsseeddss dsdaaedds Edsedasad garden 1020 essssssssda DEEEDASAE dssdddesedd ssdDddDdd Esecasessss aaEDEEassa 1080 dsDesaFood sassdd edass YesdassaEsa DEDDSDDASE saessssss dssdsssedd 1140 decededead sassassass dadass adEsaEssE sadssads aadasdasdd 1200 dassseasaa ssdsadda ESSEADSSD ssaaddass dassss edss dadsddd 1260 ECEECEASDS SEEssadaas eEssEsEdE ASEEEEEDESAA sda asdEessadd 1320 sddddd dsadaaddsd sEdassadd asddaeasae dddseassaE dddDEssdsds 1380 ada edssdd dsesdsdeas ADDESEAEES adda garden essa saddaeasdd 1440 FOOD saadsdseas Edd edsedd yes SEEEDEAEDAD gas supply 1500 Esdd eddssa SESDDSADAD saddefood dsaasdssad ddsdeddaas Eddeaddasda 1560 YESEEEE sddaaEaE kindergarten asaadassda ddddd aEssdsaaed 1620 EsasEsEdaa SasdasEss Essence adadaddddd NEXT dedaaaaaed 1680 FOOD sEdeEaEdd ADDDESSDESE SESSEEDAEA DEAAEDDDS aaeddaeddsd 1740 dsEesaedaaa saEddEasda aadaEeadaE EaEaEaaaaa DEADDADADE ddeaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaa Food SEEEDEESSE dEaEeESeaE asaaasdsda ssaEesad 1860 aaEdaseEasE ddsasa from , 1881

<210> 17 <211> 1257 <212> DNA <213> AzregdShiz pideg

<220>

<221> CP5 <222> (1). . (1257) <400> 17

aU EAE aec sss Esd grandfather eat CEE eat dss grandfather hell eat EEC saE dds 48 MeE Tug 11th Rgo Zeg Ya1 Bie Bie Bie Al a Al a Zeg Bie Pb NLz 6Lu 1 5 10 fifteen dsa asd grandfather eat sss asd sss dds Ess asd sss aec ssd sss hell garden 96 A1a Tht A1a Bie Rgo Tht Rgo 6Lu Zeg TNG Rgo 1Le Rgo Rgo Zeg BLP 20 25 thirty yes sss Unit Eas hell grandfather sss dad dds EEC dad dad DSE yes sss dDE 144 Azr Rgo Tgr Tug Zeg Al a Rgo 6 li 61 y Pb bly 6 li Al a Azr Rgo BLU 35 40 45 dss aec eat sds grandfather sdd sss grandfather sss dds aas Food ace grandfather yeah grandfather 192 A1a 11th Bie Agd Ya1 Agd Rgo Al a Rgo 6Lu Azp Bie Tht WAL WAL WAL fifty 55 60 dds aaE grandfather Esd grandfather dss Eas aas aec cEC Eas sds acE asa das hell 240 61u Azp A1a Zeg A1a Al a Tug Azp 1Le Bie Tug Agd Tht Tht Azr Zeg 65 70 75 80

- 62 008007

garden cas aad sss css cdd Dec dkd ace ace skd skd dkd sss sss dkd 288 ΘΙη Tug Bz Rgo Zeg Tgr A1a Ya1 Tht TNG Bie Bie Ya1 Rgo Rgo Yb 85 90 95 dss dss css dss dss dke aas garden adk dke skd SCS css sas garden ax 336 A1a A1a Zeg A1a A1a Ya1 Azp ΘΙη Zeg Ya1 Bie Bie Zeg Hb ΘΙη 11th 100 105 110 dss cas duck sneaker cx das dke aac dss adk sss hell cas dss akd cas 384 A1a Tug Azr Zeg RNe Azr Ya1 Azp A1a Zeg Rgo Zeg Tug A1a Mek Tug 115 120 125 ace hell ssd sss css duck acc ax SCS dss skd garden sds dds cdd cx 432 Tht Zeg Rgo Rgo Zeg Azr Not 11th Bie A1a Bie ΘΙη Agd C1u Tgr Pb 130 135 140 dkk aas dke sss duck cas dad dds sss aac dss cake cx ace dss ddk 480 Ya1 Azp Ya1 Rgo Azr Tug C1 and C1u Rgo Azp A1a Zeg Pb Tht A1a C1u 145 150 155 160 dkd garden css dds sack dss ace SCS das sneaker dke sds hell dkd SCS dss 528 Ya1 ΘΙη Zeg C1u Hb A1a TNG Bie Azr Zeg Ya1 Agd Zeg Ya1 Bie A1a 165 170 175 Her dda cx dds skd aas dad das dss garden cas Dec skd cdd ddk cas 576 Zeg C1u Pb C1u Bie Azp C1 and Azr A1a C1p Tug A1a Bie Tgr C1u Tug 180 185 190 gay dds ddk dss ccd dss hell yeah cdd Dec Dec yeah skd garden akd saa 624 Zeg C1u C1u A1a Bie A1a Zeg C1 and Tgr A1a A1a C1 and Bie C1p Mek ΘΙη 195 200 205 Us Dec sss dad ccd aas acc dss ddk skd dss dkd ddk ddk SCS ask 672 Tug A1a Rgo C1 and Bie Azp 11th A1a C1u Bie A1a Ya1 C1u C1u Bie Tht 210 215 220 sss aac dkk ace hell dke akd das asd dkd ace sneaker ace ax adk grandfather 720 Rgo Azp Ya1 Tht Zeg Ya1 Mek Azr TNG Ya1 Tht Zeg TNG 11th Zeg A1a 225 230 235 240 dda SCS ax sss dss dss dss skd ddk skd sneaker hell garden sas sss dad 768 C1u Bie 11th Rgo A1a A1a A1a Bie C1u Bie Zeg Zeg ΘΙη Hb Rgo 61and 245 250 255 ace cas dad cx ax SCS hell garden SCS aad asd asd dda sss cas aas 816 Tht Tug C1 and Pb 11th Bie Zeg C1p Bie Bz Tht Tht C1u Rgo Tug Azp 260 265 270 sds asa dda cx ska dss dss aad das skd ace skd css dad grandfather dad 864 Agd Tht C1u Pb Bie A1a A1a Bz Azr Bie TNG Bie Zeg C1 and A1a C1 and 275 280 285 dke cx cas dss cx garden aas ax cx duck cas kkk dke aas dda sneaker 912 Ya1 RNe Tug A1a RNe C1p Azp 11th RNe Azr Tug RNe Ya1 Azp C1u Zeg 290 295 300 dss asd cx garden grandfather dad dkd dkd garden aad grandfather skd aas garden das dda 960

- 63 008007

A1a Tht Pb C1p A1a C1 and Ya1 Ya1 C1p Bz A1a Bie Azp C1p Azr C1u 305 310 315 320 Ras ab dds Ras sa ddd Bc ssd garden ab ssd dkd cbc grandfather Ras aad 1008 Tug Mer C1u Tug Yuz C1u Pb Rgo C1p Mek Rgo Ya1 Bie A1a Tug Bz 325 330 335 dcb ab sas yes dad ax adk sss abc garden gift asd yes sds drd abc 1056 A1a 11th Ηίδ Azr C1 and 11th Zeg Rgo 11th C1p Azr Tht Azr Agd Ya1 11th 340 345 350 aad sds Ras ddb cd dda Bd aas abc Bd Crayfish dad edd aas ace 1104 Bz Agd Tug Suz C1u Bie C1u Bie Azp 11th Bie Tug C1 and Agd Azp Tht 355 360 365 ax ddr dds sas Bcd dsa dad garden dd aab dds aas dss add grandfather Dd 1152 Not C1u 61u Ηίδ Zeg A1a C1 and C1p Ya1 Azp 61u Azp A1a Agd A1a Tgr 370 375 380 aas Dd Bd asd hell ab Bc das dda asd Ba grandfather garden garden Ras aad 1200 Azp Tgr Bie Tht Zeg 11th Pb Azr C1u Tht Tug A1a C1p C1p Tug Bz 385 390 395 400 ace dad ddd Bds asd ax sds aab dc ac cd aas asd acE Bss Bss 1248 Tht C1 and C1u Suz Tht 11th Agd Azp Ya1 Tht Bie Azp Tht Tht Zeg Zeg 405 410 415

1257 bb bastard

Ya1 Tug <210> 18 <211> 418 <212> PROTEIN <213> Azregd Shiz pdeg <400> 18

Mek Tug 11th Rgo Zeg Ya1 Bie Bie Bie A1a A1a Zeg Bie Pb Ηίδ C1u 1 5 10 fifteen A1a Tht A1a Bie Rgo Tht Rgo C1u Zeg Tht Rgo 11th Rgo Rgo Zeg C1p 20 25 thirty Azr Rgo Tgr Tug Zeg A1a Rgo C1 and C1u Pb C1 and C1 and A1a Azr Rgo C1u 35 40 45 A1a 11th Bie Agd Ya1 Agd Rgo A1a Rgo C1u Azp Bie Tht Ya1 Ya1 Ya1 fifty 55 60 C1u Azp A1a Zeg A1a A1a Tug Azp 11th Bie Tug Agd Tht Tht Azr Zeg 65 70 75 80 C1p Tug Bz Rgo Zeg Tgr A1a Ya1 Tht Tht Bie Bie Ya1 Rgo Rgo Ya1 85 90 95 A1a A1a Zeg A1a A1a Ya1 Azp 61p Zeg Ya1 Bie Bie Zeg Ηίδ C1p 11th

- 64 008007

100 105 110 A1a Tug Azr Zeg Pb Azr Ya1 Azp A1a Zeg Rgo Zeg Tug A1a MeE Tug 115 120 125 Tht Zeg Rgo Rgo Zeg Azr 11th 11th Bie A1a Bie C1p Agd C1u Tgr Pb 130 135 140 Ya1 Azp Ya1 Rgo Azr Tug C1 and C1u Rgo Azp A1a Zeg Pb Tht A1a C1u 145 150 155 160 Ya1 C1p Zeg C1u Nhz A1a Tht Bie Azr Zeg Ya1 Agd Zeg Ya1 Bie A1a 165 170 175 Zeg C1u Pb C1u Bie Azp C1 and Azr A1a C1p Tug A1a Bie Tgr C1u Tug 180 185 190 Zeg C1u C1u A1a Bie A1a Zeg C1 and Tgr A1a A1a C1 and Bie C1p MeE C1p 195 200 205 Tug A1a Rgo C1 and Bie Azp 11th A1a C1u Bie A1a Ya1 C1u C1u Bie Tht 210 215 220 Rgo Azp Ya1 Tht Zeg Ya1 MeE Azr Tht Ya1 Tht Zeg Tht 11th Zeg A1a 225 230 235 240 C1u Bie 11th Rgo A1a A1a A1a Bie C1u Bie Zeg Zeg C1p H1z Rgo C1 and 245 250 255 Tht Tug C1 and Pb 11th Bie Zeg C1p Bie Bz Tht Tht C1u Rgo Tug Azp 260 265 270 Agd Tht C1u Pb Bie A1a A1a Bz Azr Bie Tht Bie Zeg C1 and A1a C1 and 275 280 285 Ya1 Pb Tug A1a Pb C1p Azp 11th Pb Azr Tug Pb Ya1 Azp C1u Zeg 290 295 300 A1a Tht Pb C1p A1a C1 and Ya1 Ya1 C1p Bz A1a Bie Azp C1p Azr C1u 305 310 315 320 Tug MeE C1u Tug H13 C1u Pb Rgo C1p MeE Rgo Ya1 Bie A1a Tug Bz 325 330 335 A1a 11th ΗΪ3 Azr C1 and 11th Zeg Rgo 11th C1p Azr Tht Azr Agd Ya1 11th 340 345 350 Bz Agd Tug Suz C1u Bie C1u Bie Azp 11th Bie Tug C1 and Agd Azp Tht 355 360 365 11th C1u C1u H13 Zeg A1a C1 and C1p Ya1 Azp C1u Azp A1a Agd A1a Tgr 370 375 380 Azp Tgr Bie Tht Zeg 11th Pb Azr C1u Tht Tug A1a C1p C1p Tug Bz 385 390 395 400 Tht C1 and C1u Suz Tht 11th Agd Azp Ya1 Tht Bie Azp Tht Tht Zeg Zeg 405 410 415

Wa1 Tug <210> 19

- 65 008007 <211> 2809 <212> DNA <213> Azregd Shiz ndeg <400> 19

adRaRdRaR saRRRdaaad ArSadRaaaR yeahhhhhhhhhhhh dsasaRdsa sdsrrrdda 60 asdasda daRsdRada ARDSSSADR gardenRsRdsdR ddrsadasda dassa race 120 RRdsaRaRdR asaaRsRadR adRaRaaRaR ddRdRaaaRs UssaRaassR yes 180 sasasRaRsa ddddsrrdddr AsaRaddsda adRadss asaaRsaaas aaRsaRssaa 240 asRssaadss aaaRrdssads yeah aaadsasas arDaRdRRas adrdsasrad 300 DdaaassaaR SRDRDRsass aRsasRsadd AssassadRa Raasdaasss sssr 360 ssasdadRsR RsrssddaRs saRsRdsass RsaRassassds RaaRRRssRR dassdRsRsa 420 AASDSSDDS RdssdsdsaRa RaddsRdsDd dasdads redd adssdssdss RRssdRsdrs 480 yes rassdada RdddsRddrrr Rssdsddaas sdsrrdsdsa RaRsdaRsad DSSDDSRSRA 540 Radaaddasa aasadrradr aasssrdard asRrddsddr yesRRdsdRRR Rasaadaadd 600 Raddsddsrcr RRasRsasRR dsasRsdsRd aaRssssrrss dsaaRRdsRd dsRsdsaRd 660 ddaads sdasdrasdd sRsasRsada saRRsdsdd dsdadsdssd RRdsassaRd 720 ARDSADRSRD ARRsRRddad AsaRrdddss adadsaRRRs SRDRRsaRss addRaddaRR 780 yesRadadad RdRddadsRd AradRadadR RddddasaR daddRddRda Rsrssdersd 840 dddaRasdRs dadRaRssaa dssdsaaRRR aadadRaRdd RaaaddaRaR aadddrsaaa 900 sdRasRdaRs RSRRdddsadd aasRsdsdsaR RRRddsdaas aasa daaRRdsRsa 960 - \ -l *> »-» 1 — r <~ e + - 1 ^P 2 ^G ' dssaasidas aauau α a iassuu and iddsddsddsd dasai sidda d θ 4 ~ rz Η Έ y ΐ; SRDARsdaa aasaasaRsa assaasddds SRRdssssdd ARRaddRaad ssarasasaRd 1080 aadaaddsss ssRadasdRs RdddddddaaR ssRdasRRds RdsRRdRRss dsRRdaRRRa 1140 Rssrsrrssss sRadRsaRds ddRsRRdddR SRRRdaads RRdsRRsds dsaRRaRddR 1200 RsasRasRas RasRsaddR yesRaadRaRR RRadRRddRR yesRRRdsaaa RRdRssaRss 1260 SRRRRsdara aRaddaddrr RddRsRRaaR sdRsaRddsd sdsdrrssdd RSARRddasd 1320 dsRdRRRRdd RsdadRaRR RddssssRRRR RddddRdsrd ARRRRddRaR RdsRddaaRd 1380 ddRRaRasR ARRARASASAR RsRdRsRdsd RaadRadRdR DRRsaRRsRs RddaaRRdRd 1440 DRsRaRdRsd addddsaada dsRaasRdas dsadsrdaas SRDRRaRRAaa DRRsRdRRas 1500 daRsdaRssa adasRaRsRR saasdssrrs ARRSSRSSSD ARDASSSDDS Raadsdddr 1560 aaadadada aaaRRdsRds DRSDDRRDSSR SRDDSDRSDD asRRsassda RaRaRdsdsd 1620 SRDRRSDDAR aradddsdda ddaasaRaRs drssadasad ddddaRdsda Rsrdsrrddr 1680 srdssassdas RdsssRaRsd daaaddadad dadddddda adaRaassa ddddsdaadd 1740 adsaRsaada adaadd SRaRsRssas saRdrRsRsa RdaRdRdsad RdaadRsRdd 1800 ARDSRDRSRDSR saddadds dsdaRdssrr ssdrrrsaaR RadRsdaaad dddsRaRdas 1860 drdrddrdrd ddaasarad addaaasaad RasRsdaada ADDRESS dsRRsdsss 1920 SRDRsdaasd ADRRsRddda SRRRRsdaRs daRsadRRsR sRRRssaRda RaRssssadas 1980 adsarsaadr ARaRssRdda adRadasadd SadssssRssss RdRsaRasdR ddddrrsrdsd 2040 sadddaasad sdsaddsRR Rdsdasdsrd RssaRrsaRs SRRRdRRdaa RsadaadaRs 2100 daRdRsRRRd Rddsrsrdsds DSSDDSAArd dsrssdasad drsrrssaaa RsaRsRsdRd 2160 dasRsdsRsa RdaaddsRRS dssdaasrrs SRDRRRsRds RdRRRddsad asdsadc 2220 SRRadsRsaa surrender dsadasaRR sRsRassssds sRaRsRRRdR RrddaRsaRs 2280

- 66 008007

dasasdasas ЕЕСДСДДССЕ DEESAAEEDD Addsad Asa Esadssd SEDsadaad 2340 SEDDSADDDE ASSESSED DEEEEEKES asEdassassa ADDESDESDE ssaEddeEs 2400 garden ddsassddaa EEssadEEs Yesda aaaessaeds SSSDSESSADE 2460 AEEDEDDSSA YES EEasaadssd desaad surrender saEeaadasd 2520 SSSAEEDESS EEDEEDAEDD sddEdsdaE heC aeaesaasde yes 2580 dadsesses ddddassdE ddsdaaddaa ESSSSADSE AEDA hell 2640 Eddsddsd aEdEdassa AEEDDEAEEs aassa Yesdaads ddddsddd 2700 AdSeddada aEsadaaadd dasa dadaaddEEa aEDDEDSSDS ddddsas 2760 DEASSDASAE aaadEasdad DESSEDSASS aaEdaadasa sdsaaaaes 2809

<210> 20 <211> 1413 <212> DNA <213> Azregd Schiz pideg <220>

<221> C3 <222> (1) .. (1413) <400> 20

aU grandfather sds dkk ssd des aee dda edd eat Eee cdd EEC dad EAE Food 48 MeE A1a Agd Ya1 Rgo Ya1 11th C1u Agd Bie Pb Tgr Pb C1 and Tug Bie 1 5 10 fifteen dss CEE Eee ddd Esd eat aee ccd yeah QED eat yeah Unit dkE aaa saE 96 A1a Bie Pb C1u Zeg Bie 11th Bie Ya1 Bie Bie C1 and Tgr Ya1 11th ΗΪ3 20 25 thirty aee aec asa EEC Food eat sce yeah sce dkE aee aad EEC Edk Eas yes 144 11th 11th Tht Pb Suz Bie Rgo C1 and Rgo Ya1 11th Bz Pb Suz Tug Azr 35 40 45 food Ess aad acE aec EEC aas dss EEC aee sce sss yes das ssd DSE 192 Agd Zeg Bz Tht 11th Pb Azp A1a Pb 11th Rgo Rgo Azr Azr Rgo A1a fifty 55 60 aad sds ddk aah yeah dad aah aee DSE grandfather Esd dkk DSE eat grandfather Esd 240 Bz Agd C1u Bz C1 and C1 and Bz 11th A1a A1a Zeg Ya1 A1a Bie A1a Zeg 65 70 75 80 das EEC asd yes aaa Food grandfather eat EEC dda EAE dad grandfather dad yeah saE 288 Azr Pb Tht Azr Not Suz A1a Bie Pb C1u Tug C1 and A1a C1 and C1 and Bottom 85 90 95 aec dke garden asa ddd duck dds EAE eat CEE ddk eat sas food eat STS 336 11th Ya1 C1p Tht C1u Azr C1u Tug Bie Bie C1u Bie Bottom Agd Bie Rgo 100 105 110 EAE edd aah dda dad dad ddd add aad aec aas garden dds yeah ddd hell 384

- 67 008007

Tug Agd Bz 115 C1u C1 and C1 and C1u Agd 120 Bz Not Azp C1p C1u 125 C1 and C1u Zeg ax aad aad aad dke dke as eke sas sack ddk eke akd akd Food adk 432 11th Bz Bz Bz ba1 Ya1 Tug Bie Bottom Bottom O1u Bie Mek Mek Suz Zeg 130 135 140 yeah dke cdd ax cdk skd Esa dad dad garden food kde ekk sed Ekk saa 480 C1 and Ya1 Tgr 11th Suz Bie Zeg C1 and C1 and C1p Agd Suz Bie Rgo Pb C1p 145 150 155 160 kka dke yeah add dds as das dkd cdd ccd ddd aas aac hell dda aas 528 Bie ba1 C1 and Agd C1u Tug Azr Ya1 Tgr Bie C1u Azp Azp Agd C1u Azp 165 170 175 aad cas sneaker aad aad css dke aad sack sneaker sss skd sneaker aas dad Eke 576 Bz Tug Zeg Bz Bz Zeg Ya1 Bz Bottom Zeg Rgo Bie Zeg Azp C1 and Pb 180 185 190 cdd das kkk sneaker ax duck garden cx sneaker cx sack duck ax ssa das hell 624 Tgr Azr Pb Zeg 11th Azr C1p Pb Zeg Pb Bottom Azr Pe Rgo Azr Zeg 195 200 205 ax aad as ax skd yeah dkd asa ddd garden sss css skd Esa cas dkd 672 11th Bz Tug 11th Bie C1 and Ya1 Tht C1u C1p Rgo Zeg Bie Zeg Tug Ya1 210 215 220 ddd cx sneaker garden dda asa grandfather garden dsa kkk grandfather asd skd css acc sack 720 C1u Pb Zeg C1p C1u Tht A1a C1p A1a Pb A1a Tht Bie Zeg 11th Bottom 225 230 235 240 ssk ccd ccd aac garden aad ax duck dke kkk dkd Dec eke grandfather sed dsa 768 Rgo Bie Bie Azp C1p Bz 11th Azr Ya1 Pb 17a1 A1a Bie A1a Rgo A1a 245 250 255 akd Dec sed asa ddk ekk ssa aac sack eke dkd das sneaker eke akd aad 816 Mek A1a Rgo Tht C1u Bie Rgo Azp Bottom Bie Ya1 Azr Zeg Bie Mek Bz 260 265 270 Dec sneaker sed aas cx skd Ekk skd skd kkk dds hell eating hell ax ekk 864 A1a Zeg Rgo Azp Pb Bie Pb Bie Bie Pb C1u Agd Agd Zeg 11th Bie 275 280 285 hell kea asd asd akd cdd garden asa acc eke cas sed ssk ax Ekk dkk 912 Zeg Zeg Tht Tht Mek Tgr C1p Tht 11th Bie Tug Rgo Rgo 11th Pb Ya1 290 295 300 cdd ax ax das asd kea ekk eating dds skd cx aac cdd add Food aad 960 Tgr 11th 11th Azr Tht Zeg Bie Agd C1u Bie Pb Azp Tgr Agd Suz Bz 305 310 315 320 aas ax hell eating cdd garden aad skd dsa ddd cas skd sack skd Ekk css 1008 Azp 11th Zeg Agd Tgr C1p Bz Bie A1a C1u Tug Bie Bottom Bie Pb Zeg 325 330 335 cx ask hell ace aad sneaker dke dke sack cdd cx garden acc acc sdd sas 1056 Pb Tht Zeg Tht Bz Zeg Ya1 Ya1 Bottom Tgr Pb C1p 11th Not Agd Bottom

- 68 008007

340 345 350 edd aaE EEC garden EEC Eas yes das yeah aec saE dss ssd cEC hell aee 1104 Agd Azp Pb C1p Pb Tug Azr Azr C1 and 11th Bottom A1a Rgo Bie Zeg 11th 355 360 365 grandfather dss hell dad food Eee Eas aad ssd des aad Eas ssd acE aad aas 1152 Ya1 A1a Zeg 61and Agd Pb Tug Bz Rgo 7a1 Bz Tug Rgo Tht Bz Azp 370 375 380 aee aad asd sss aee des eat Food EAE dds dDE hell yes hell cEC DEER 1200 Not Bz Tht Rgo 11th Ya1 Bie Bie Tug C1u C1u Zeg Azr Zeg Bie Ya1 385 390 395 400 yes aec aas grandfather aU Food Ess dad cEC sce sds ddd ace grandfather grandfather aad 1248 Azr Not Azp Ya1 MeE Bie Zeg C1 and Bie Rgo Agd C1u Tht Ya1 A1a Bz 405 410 415 yeah aec ssd garden EAE dad saE EEA yes EEC Food Unit grandfather cde yes grandfather 1296 C1 and Not Rgo C1p Tug C1 and Bottom Bie Azr Pb Bie Tgr A1a Agd Azr Ya1 420 425 430 das saa Food yeah EEC aas saE des EEC yeah grandfather eat dad edd Eas hell 1344 Azr C1p Bie Ya1 Pb Azp Bottom Ya1 Pb C1 and A1a Bie C1 and Agd Tug Zeg 435 440 445 Esd dad aaE garden aah ddd asa Food aU dad aad DEER aaE dDE dss grandfather 1392 Zeg C1 and Azp C1p Bz C1u Tht Bie MeE C1 and Bz Ya1 Azp C1u A1a A1a 450 455 460 dds asa EAE yeah ssd asa Yeah 1413 C1u Tht Tug Ya1 Rgo Tht 465 470

<210> 21 <211> 470 <212> PROTEIN <213> AzregdShiz pideg

<400> 21

MeE A1a Agd Ya1 Rgo Ya1 11th C1u Agd Bie Pb Tgr Pb C1 and Tug Bie 1 5 10 fifteen A1a Bie Pb C1u Zeg Bie Not Bie Ya1 Bie Bie C1 and Tgr Ya1 Not Bottom 20 25 thirty 11th 11th Tht Pb Suz Bie Rgo C1 and Rgo Ya1 Not Bz Pb Suz Tug Azr 35 40 45 Agd Zeg Bz Tht 11th Pb Azp A1a Pb Not Rgo Rgo Azr Azr Rgo A1a fifty 55 60 Bz Agd C1u Bz C1 and C1 and Bz Not A1a A1a Zeg Ya1 A1a Bie A1a Zeg 65 70 75 80

69 008007

Azr Pb Tht Azr Not 85 Suz A1a Bie Pb C1u 90 Tug C1 and A1a C1 and C1 and 95 Nhz 11th Ya1 C1p Tht C1u Azr C1u Tug Bie Bie C1u Bie Nhz Agd Bie Rgo 100 105 110 Tug Agd Bz C1u C1 and C1 and C1u Agd Bz Not Azp C1p C1u C1 and C1u Zeg 115 120 125 11th Bz Bz Bz Ya1 Cha1 Tug Bie Nhz Nhz C1u Bie Mek Mek Suz Zeg 130 135 140 C1 and Ya1 Tgr Not Suz Bie Zeg C1 and C1 and C1p Agd Suz Bie Rgo Pb C1p 145 150 155 160 Bie Ya1 C1 and Agd C1u Tug Azr Ya1 Tgr Bie C1u Azp Azp Agd C1u Azp 165 170 175 Bz Tug Zeg Bz Bz Zeg Ya1 Bz Nhz Zeg Rgo Bie Zeg Azp C1 and Pb 180 185 190 Tgr Azr Pb Zeg 11th Azr C1p Pb Zeg Pb Nhz Azr 11th Rgo Azr Zeg 195 200 205 Not Bz Tug 11th Bie C1 and Ya1 Tht C1u C1p Rgo Zeg Bie Zeg Tug Ya1 210 215 220 C1u Pb Zeg C1p C1u Tht A1a C1p A1a Pb A1a Tht Bie Zeg Not Nhz 225 230 235 240 Rgo Bie Bie Azp C1p Bz 11th Azr 57a1 Pb Ya1 A1a Bie A1a Rgo A1a 245 250 255 Mek A1a Rgo Tht C1u Bie Rgo Azp Nhz Bie Ya1 Azr Zeg Bie Me Bz 260 265 270 A1a Zeg Rgo Azp Pb Bie Pb Bie Bie Pb C1u Agd Agd Zeg Not Bie 275 280 285 Zeg Zeg Tht Tht Mek Tgr C1p Tht Not Bie Tug Rgo Rgo 11th Pb Ya1 290 295 300 Tgr Not Not Azr Tht Zeg Bie Agd C1u Bie Pb Azp Tgr Agd Suz Bz 305 310 315 320 Azp Not Zeg Agd Tgr C1p Bz Bie A1a C1u Tug Bie Nhz Bie Pb Zeg 325 330 335 Pb Tht Zeg Tht Bz Zeg Ya1 Ya1 Nhz Tgr Pb ΘΙη Not 11th Agd Nhz 340 345 350 Agd Azp Pb C1p Pb Tug Azr Azr C1 and Not Nhz A1a Rgo Bie Zeg 11th 355 360 365 Ya1 A1a Zeg C1 and Agd Pb Tug Bz Rgo Ya1 Bz Tug Rgo Tht Bz Azp 370 375 380 Not Bz Tht Rgo 11th Ya1 Bie Bie Tug C1u C1u Zeg Azr Zeg Bie Ya1 385 390 395 400 Azr 11th Azp Ya1 Mek Bie Zeg C1 and Bie Rgo Agd C1u Tht Ya1 A1a Bz 405 410 415 C1 and Not Rgo C1p Tug C1 and Refinery Bie Azr Pb Bie Tgr A1a Agd Azr Ya1

- 70 008007

420 425 430 Azr C1p Bie Ya1 RNe Azp Bottom Ya1 RNe C1 and A1a Bie C1 and Agd Tug Zeg 435 440 445 Zeg 31and Azp C1p Bz C1u TNG Bie Mek C1 and Bz Ya1 Azp C1u A1a A1a 450 455 460 C1u TNG Tug Ya1 Rgo TNG 465 470

<210> 22 <211> 3328 <212> DNA <213> Block

dakkakdaa dasaddddd sksksadkad Akdakksksd sasaakkdsa skksskdddd 60 adsccc dkskskadkd auckccack adasaddx cskdsdsda ddddddd 120 skaasasdk dakakskakd kkdsskskk askkadaad aaaddkskd skkddkadsk 180 ddaasssad acacadca kdkadkaka kdaadakkss akdskkdd aacaccssds 240 sdkddskdaa caddddask skskasss adssaaddda kksksssda acccccds 300 sakakdkkdk cddskska kssskdsds accsksdk kdsdsdsdsd dddddddss 360 dasadx aaasdakdaa acccccdd skskdskad kdadsdsdk ksassakkkk 420 skkdddsds kkksksasks kaskssakak casadskkss dskkkdsaak ddddddcdk 480 dskdsdaskk kdaakkdsks dsakadsaad adasascdas sadsaakssa dskskskds 540 ssasakakdk kdsskkkdss kadkakks akaakkakd cdcssadcda dasadccdc 600 cascade dskkdadkcd ddaaksdkdk skdkdassa cddaaakaka kakksddak 660 sksadaasak skskassdkk kdkaakkkkk dacacascus ssaddakddd asaakdddda 720 how to cddddcss cascade aadskska dasadaskds asccacc 780 accakdskaa accskkasd adasaskx xxaadcxx cddsscccd caddasadad 840 kdaaasasda dsdkksaas ccdcdcd dackdccd akaccaksk sadasadsk 900 kkssasakss kdkaakssss aasadaaaaa dakasasadk Akaksaskad aadskssaa 960 kadkkaksak dskdsasssk aasadsaakd sadksassk dskdsdksad stupid 1020 KSSDDADAAD kakssdadak adsdakaadd Akdsdadak aadakkddds adddadakd 1080 adaaadakak ssksdsdskss adaadkadds bastard akaaskadcd asaadkssss 1140 ssdsssksk ssdadsaaas casaskxaa sakdskdaak dsasdskssa kkdskdsds 1200 SKSDKKDSSA dkksksksss cascaccds ssadsaskk dssksksass saassdads 1260 daccsaadss accksddsks sdkdddksss ddsdsssaska saadakddxd cdskakaa 1320 ksdassksds Dksakaakss sssaddddsas cdksdksds asdaskskda sadasasdsk 1380 saadkssssd dkadakdskk cssdaddaak kssakasdsa kkdsssssaa kddddakad 1440 asddcccds sdkdsddddd skkdsakds dasddasdad accredited skadkadaq 1500 sddsssaadd like dskskskk akasdasakk sadaksakak skdaskskks addkddsskd 1560 daaadsadsk skkdaakssa aakdasakad dkddkdakda adascus asadxaacd 1620 kskkssddss ksakdddsdsk sadddaaaas kssskdsksds cddcdcd sasdddsdad 1680

- 71 008007

ssEasaEsd sddsaseddE addEaEaESa sssesadess EsEaEaEass sasadseaaaa 1740 Eaessadsse ssddasasaa sasddssesd AEDDESDDSE ddDsddasda dssss 1800 kindergarten EsaasEassd DEASDESSES aaassEdEss EssdaaEsaa SESAASEAAS 1860 aassa esad saEddSdss SESDSDSES Essa essas ccEaassdss aaadaaddaa 1920 EssaesaSe addssesse DassadaEss EssEdsEds aEdddEssaa yeah 1980 SasaEEEEsaa sddsdassa asssaad esa SESEAAESDD ccECssdss ddsdsdsasE 2040 ssdeaaedsss sceEceEaada EasaaaEada AsEssadEssss eEssssssaa asEaasdssa 2100 sasada eads ssassasa aEdaasEasa asssassaaa Sasssssses EEsassddsd 2160 ssaEsaYesda aEssddsdss dssass dssdssss ssssseasaas dssessssess 2220 asdaaessa aEEsasadas Yesessesed aaasddddsed sasEaassES sssdasas 2280 ssaShkdss SEDESESSDDS dsssssssse ssesadsse Eassassdss EssaEssessd 2340 EECEsdasaa aEasaassss EssaEssdsE dddssEssa asssdesaec dassassadada 2400 EsaEssassd csdsssses dasdssedds dsEsaddaaa DEDDAAEADD aEdssssEss 2460 Yeahdddd saas esdaas daddddasaE ASEASDESS Yesdassass ECESECESSD 2520 adda EXCESSEDES sdaassssess Essssdsdea ssssdadads dasa esada 2580 pissing food yesEesEsssss yes essdaa EaEaEdsEas ddsdssdssa Esassdada 2640 saaddsdae sssdadessea ddaaddsadE EEaadsddsE ddddddsddsd Eaeddsae 2700 EDUCEDAEDS dedessade sddsadasdd sdddd Foodstuff yes 2760 DEDADSSDDE foohhhhh sds Food FOOD ddsdsdaass 2820 edaeda yes dadasdeeea eSSEDsddE Edddaeaee Esddaddses 2880 adadddaddE Edsddddd EEESEEDSDE aEdEcEsEs JACK saeddddaes 2940 GIVEN ddddddddd EaEddddd ddddddeee ddadaddeae hell 3000 daddddddd yes ddddddddd aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Edsedddddd yes 3060 dddEEDsdds dadd adddaadda ddddddd dadad EEEEDDESED 3120 ddaddad yesEssdad Food EEEAEAEAEA desEadadda adddaEDEa 3180 EaEasEdEad EsaceEaEsED EadaasEEEa NEXT AdaEadEaaa ЕасЕасаасЕ 3240 dsEdaadass Eadda Eada asdas DEEEaaessE saasssedas Eaaaaaaaa 3300 DEDESEEASE Edsa csEaasaE 3328

<210> 23 <211> 1779 <212> DNA <213> AzregdShiz phdeg <220>

<221> POPs <222> (1) .. (1779) <400> 23

aU eat aaE dsa sds Ess ay DSE eat dss Esd Food SSS DEE CEE cEC 48 MeE Bie Azp A1a Agd Zeg Not A1a Bie A1a Zeg Bie Rgo Wa1 Bie Bie 1 5 10 fifteen

- 72 008007

cea cea EEC dss garden saa CEE dss ECE sas ssa ace dad garden aee saa 96 Bie Bie Pb A1a C1p 61p Bie A1a Zeg Bottom Rgo Tht C1 and C1p 11th 61p 20 25 thirty dss aee eat DSE ssd Unit des ssd dss dsa cea saa yes des grandfather cEC 144 A1a 11th Bie A1a Rgo Tgr Ya1 Rgo A1a A1a Bie C1p Azr Ya1 Ya1 Bie 35 40 45 EAE aaE food sce sds des aaa aec STS garden dds acE des des dds asd 192 Tug Azp Agd Rgo Agd Ya1 11th 11th Rgo C1p C1u Tht Ya1 Ya1 C1u Tht fifty 55 60 ace Food asa das asd cEC aad Ess ssd yeah yes DSE EEC food dda aee 240 Tht Bie Tht Azr Tht Bie Bz Zeg Rgo Ya1 Azr A1a Pb Agd C1u 11th 65 70 75 80 ssa Eas dsa Food sce ssa aee ddd yes hell edd Eee sds cde grandfather dad 288 Rgo Tug A1a Bie Rgo Rgo 11th C1u Azr Agd Agd Pb Agd Agd A1a C1 and 85 90 95 DSE des saE grandfather asd das dad. aee aec yes DSE hell yeah EEC dds ssa 336 A1a Ya1 H13 A1a Tht Azr C1 and 11th 11th Azr A1a Zeg C1 and Pb C1u Rgo 100 105 110 add Food sce dda aad garden cEC Food aaE ssa aaE das aaa dDE dDE yes 384 Agd Suz Rgo C1u Bz C1p Bie Bie Azp Rgo Azp Azr 11th C1u C1u Azr 115 120 125 yeah das Food cEC asa des aaE des EEC edd sce saE dds DSE garden dda 432 C1 and Azr Suz Bie Tht Ya1 Azp Ya1 Pb Agd Rgo Bottom C1u A1a C1p C1u 130 135 140 aah cEC sce des DSE yeah Eas grandfather sas dds dda dss Eas aaE sds dds 480 Bz Bie Rgo Ya1 A1a Ya1 Tug Ya1 ΗΪ5 C1u C1u A1a Tug Azp Agd C1u 145 150 155 160 acE DSE aah EAE ssa dss Ess dda sas aas asd dss Esd aU des dds 528 Tht A1a Bz Tug Rgo A1a Zeg C1u Bottom Azp Tht A1a Zeg MeE Ya1 C1u 165 170 175 Unit Esd das dad STS EEC DEER dsa des hell EEC aas Eas sds aec dds 576 Tgr Zeg Azr C1 and Rgo Pb Ya1 A1a Ya1 Zeg Pb Azp Tug Agd 11th C1u 180 185 190 dss cEC dds EEC cEC ssa Ess ace cea ace dss aah yeah dda aec cEC 624 A1a Bie C1u Pb Bie Rgo Zeg Tht Bie Tht A1a Bz C1 and C1u 11th Bie 195 200 205 aas cea dds cEC saE das garden aec cEC eat eat saa Unit des saa yeah 672 Azp Bie C1u Bie Bottom Azr C1p 11th Bie Bie Bie C1p Tgr Ya1 C1p C1 and 210 215 220 aas aec dsa saE EEC aas dds das ssa ace saa des acE cea aec dds 720 Azp 11th A1a Bottom Pb Azp C1u Azr Rgo Tht C1p Ya1 Tht Bie Not C1u 225 230 235 240 cEC Ess dss dds grandfather sas Ess aaa dss sas sas aec aU aas Eas aas 768

- 73 008007

Bie Zeg A1a C1u A1a 245 NLz Zeg 11th A1a NLz 250 NLz Lle MeE Azp Tug 255 Azp ssa ssa aas ace sss cEC Eee sas sds dss aec aec yeah Ess dds dss 816 Rgo Rgo Azp Tht Rgo Bie Pb NLz Agd Al a 11th Lle SLI Zeg SLU Ala 260 265 270 dss ace Ess sds dss des sas sss Eas aas dss Ess cEC sas yeah Ess 864 A1a Tht Zeg Agd A1a WAL NLz Rgo Tug Azp Al a Zeg Bie NLz SLI Zeg 275 280 285 saa EEC asa das EEC cEC acE yeah asd dds Food acE aas cEC sss das 912 C1p Pb Tht Azr Pb Bie Tht SLI Tht SLU Suz Tht Azp Bie Rgo Azr 290 295 300 acE dss aee Food sss Food cEC sds dss cEC ssa Ess Esa dss aee ace 960 Tht A1a 11th Bie Rgo Suz Bie Agd Al a Bie Rgo Zeg Zeg Al a Lle Tht 305 310 315 320 ace dss Ess aec Ess des EEC das aah Eas aas sss Ess aec sds Unit 1008 Tht A1a Zeg 11th Zeg WAL Pb Azr Bz Tug Azp Rgo Zeg 11th Agd Tgr 325 330 335 dss EEC saa sss des aec das sas dad aec aec sas sds sdd sss aec 1056 A1a Pb C1p Rgo Ya1 1Le Azr ΗΪ3 SLI 1Le 11th NLz Agd Agd Rgo Lle 340 345 350 das dss Unit sds Esa dda aad Unit aaE add aU sss aec cea asd dds 1104 Azr A1a Tgr Agd Zeg SLU Bz Tgr Azp Agd MeE Rgo Lle Bie Tht SLU 355 360 365 EEC aas Esd aas dad ddd asa Eas Eas des sce sds aas cEC ECE cEC 1152 Pb Azp Zeg Azp C1 and SLU Tht Tug Tug WAL Rgo Agd Azp Bie Zeg Bie 370 375 380 Ess dad yes EEC acE Esd EEC EEC food ace cEC cEC sss grandfather Eas sss 1200 Zeg C1 and Azr Pb Tht Zeg Pb Pb Agd Tht Bie Bie Rgo A1a Tug Rgo 385 390 395 400 dad hell das aec garden ace aec yes dad aec Eas sss yes ssd aaE yeah 1248 C1 and Zeg Azr 11th C1p Tht 11th Azr SLI 11th Tug Rgo Azr Rgo Azp WAL 405 410 415 EAE DSE asd grandfather Esd ssa Eas cEC dad asa add ssd aec ssd hell cea 1296 Tug A1a Tht A1a Zeg Rgo Tug Bie SLI Tht Agd Rgo Lle Rgo Zeg Bie 420 425 430 dda add garden Eee aad sdd eat dad grandfather grandfather EAE ddd saE EAE grandfather EAE 1344 C1u Agd C1p Pb Bz Agd Bie SLI A1a Al a Tug SLU NLz Tug Al a Tug 435 440 445 grandfather Food ssa yeah sdd garden asd grandfather ddd Eee DEER DSE aaE yes yes dDE 1392 A1a Suz Rgo Ya1 Agd SLP Tht Al a SLU Pb WAL Al a Azp Azr Azr SLU 450 455 460 Food dDE dad ssd grandfather Eee Food EAE sds Unit grandfather Food aaE aad acE DEER 1440 Suz C1u C1 and Rgo Ya1 Pb Bie Tug Agd Tgr Al a Bie Azp Bz Tht WAL

- 74 008007

465 470 475 480

acc dda dds grandfather aas sack ddk duck garden akd dad as dad asd kkk aac 1488 Not C1u C1u A1a Azp ΗΪ3 61u Azr C1p Mek C1 and Tug C1 and Tht Pb Azp 485 490 495 ssk grandfather dkk add duck acc sneaker dad Dec garden add dad dkk grandfather ddd ccd 1536 Rgo A1a Ya1 Agd Azr Not Run C1 and A1a Syap Agd C1 and Ya1 A1a C1u Bie 500 505 510 kkk sack grandfather as dkd ask sneaker kkk dkd dkd sack ddd duck ssd aac dkk 1584 Pb ΗΪ3 A1a Tug Ya1 Tht Run Pb Ya1 Ya1 H13 C1u Azr Rgo Azp Ya1 515 520 525 skd ddd ddk add as dad ddd add dad dkk cdd dad add as adk ddd 1632 Bie 51u C1u Agd Tug C1 and C1u Agd C1 and Ya1 Tgr Sai Agd Tug Run C1u 530 535 540 dad dda ddd dad dkd akd dkd kkk ddd dad ddd aac duck yeah caustic Dec 1680 C1 and C1u C1u C1 and Ya1 Mek Ya1 Pb C1u C1 and C1u Azp Azr Sai Agd A1a 545 550 555 560 ddd ddd duck dda dkk ddd dkk grandfather grandfather add ccd aad add duck dad cdd 1728 C1u C1u Azr C1u Ya1 C1u Ya1 A1a A1a Agd Bie Bz Agd Azr Sai Tgr 565 570 575 ddd dkd aad dad cdk dda kkk cdd cake ddd add adk ddd acc css dad 1776 C1u Ya1 Bz C1 and Suz C1u Pb Tgr Run C1u Agd Run Syau Not Run C1 and

580 5V5 590 kda

1779 <210> 24 <211> 592 <212> PROTEIN <213> AzregdShiz ptdeg <400> 24

Mek Bie Azp A1a Agd Run 11th A1a Bie A1a Run Bie Rgo Ya1 Bie Bie 1 5 10 fifteen Bie Bie Pb A1a C1p C1p Bie A1a Run H13 Rgo Tht C1 and Syap 11th C1p 20 25 thirty A1a Not Bie A1a Rgo Tgr Ya1 Rgo A1a A1a Bie C1p Azr Ya1 Ya1 Bie 35 40 45 Tug Azp Agd Rgo Agd Ya1 Not Not Rgo C1p Syau Tht Ya1 Ya1 C1u Tht fifty 55 60 Tht Bie Tht Azr Tht Bie Bz Run Rgo Ya1 Azr A1a Pb Agd Syau 11th 65 70 75 80 Rgo Tug A1a Bie Rgo Rgo 11th C1u Azr Agd Agd Pb Agd Agd A1a Sai 85 90 95

- 75 008007

Aba Ya1 Hb Aba 100 Tht Azr SI 11th 11th 105 Azr Aba Zeg SI Pb 110 Sue Rgo Agd Suz Rgo C1u Bz Bn Bie Bie Azp Rgo Azp Azr 11th Sue Sue Azr 115 120 125 SI Azr Suz Bie Tht Yb Azp Yb Pb Agd Rgo Hb Sue Aba ΘΙη Sue 130 135 140 Bz Bie Rgo Yb Aba Yb Tug Yb Hb Sue Sue Aba Tug Azp Agd Sue 145 150 155 160 Tht Aba Bz Tug Rgo Aba Zeg Sue Hb Azp TNG A1a Zeg Mek Yb Sue 165 170 175 Tgr Zeg Azr C1 and Rgo Pb Yb Aba Yb Zeg Pb Azp Tug Agd 11th Sue 180 185 190 Aba Bie Sue Pb Bie Rgo Zeg Tht Bie Tht Aba Bz SI Sue 11th Bie 195 200 205 Azp Bie Sue Bie Hb Azr Bn 11th Bie Bie Bie C1p Tgr Yb Bn SI 210 215 220 Azp 11th Aba Hb Pb Azp Sue Azr Rgo Tht Bn Yb Tht Bie 1b Sue 225 230 235 240 Bie Zeg Aba Sue Aba Hb Zeg 1b Aba Hb Hb 11th Mek Azp Tug Azp 245 250 255 Rgo Rgo Azp Tht Rgo Bie Pb Hb Agd Aba 11th 11th SI Zeg Sue Aba 260 265 270 Aba Tht Zeg Agd Aba Yb Hb Rgo Tug Azp Aba Zeg Bie Hb C1 and Zeg 275 280 285 C1p Pb Tht Azr Pb Bie Tht SI Tht Sue Suz TNG Azp Bie Rgo Azr 290 295 300 Tht Aba 11th Bie Rgo Suz Bie Agd Aba Bie Rgo Zeg Zeg Aba 11th Tht 305 310 315 320 Tht Aba Zeg 11th Zeg Yb Pb Azr Bz Tug Azp Rgo Zeg 11th Agd Tgr 325 330 335 Aba Pb Bn Rgo Yb 11th Azr Hb SI 11th 11th Hb Agd Agd Rgo 1b 340 345 350 Azr Aba Tgr Agd Zeg Sue Bz Tgr Azp Agd Mek Rgo 11th Bie Tht Sue 355 360 365 Pb Azp Zeg Azp SI Sue Tht Tug Tug Yb Rgo Agd Azp Bie Zeg Bie 370 375 380 Zeg SI Azr Pb Tht Zeg Pb Pb Agd Tht Bie Bie Rgo Aba Tug Rgo 385 390 395 400 SI Zeg Azr 11th ΘΙη Tht 11th Azr SI 11th Tug Rgo Azr Rgo Azp Yb 405 410 415 Tug A1a Tht Aba Zeg Rgo Tug Bie SI Tht Agd Rgo 11th Rgo Zeg Bie 420 425 430 Sue Agd Bn Pb Bz Agd Bie SI Aba Aba Tug Sue Hb Tug Aba Tug

- 76 008007

435 440 445 A1a Suz Rgo Ya1 Agd C1p Tht A1a C1u Pb Ya1 A1a Azp Azr Azr C1u 450 455 460 Suz C1u C1 and Rgo Ya1 Pb Bie Tug Agd Tgr A1a Bie Azp Bz Tht Ya1 465 470 475 480 11th C1u C1u A1a Azp Bottom C1u Azr ΘΙη MeE C1 and Tug C1 and Tht Pb Azp 485 490 495 Rgo A1a Ya1 Agd Azr 11th Zeg C1 and A1a ΘΙη Agd C1 and Ya1 A1a C1u Bie 500 505 510 Pb Bottom A1a Tug Ya1 Tht Zeg Pb Ya1 Ya1 Bottom C1u Azr Rgo Azp Ya1 515 520 525 Bie C1u C1u Agd Tug C1 and C1u Agd C1 and Ya1 Tgr C1 and Agd Tug Zeg C1u 530 535 540 C1 and C1u C1u C1 and Ya1 MeE Ya1 Pb C1u C1 and C1u Azp Azr C1 and Agd A1a 545 550 555 5 60 C1u C1u Azr C1u Ya1 C1u Ya1 A1a A1a Agd Bie Bz Agd Azr C1 and Tgr 565 570 575 C1u Ya1 Bz C1 and Suz C1u Pb Tgr Zeg C1u Agd Zeg C1u 11th Zeg C1 and

580 585 590 <210> 25 <211> 3932 <212> DNA <213> Azregd Shiz pideg <400> 25

garden EAT ddda Eeeaesesds Essaaasada sesdsseaes 60 surrender esa adEASAEAE dsaas eads aEEadEsaaa EaEaasdssd dsadaad 120 AEEEEEDESSE EESSECESEEES EEessEssdaa yeahhhhhhh ddaEaaaaaaa dadssdddd 180 dssesaaade sddsesaass ddsdsdeEeds saasEEEEaaaa Edsadasaas saESdeEEss 240 ddsd ddddsda AdaEsadaEs saaaEssssa aaasaessae ddddEaaaEs 300 aadaaEedad DEEASA Yesda ssdaEddds ЕССЕЕааЕсса ASSESSEEES sddddaaaas 360 SEECEAEAED aeasa Yesessessed EECESSECESS Essssddddd Edssaaaess 420 ddddsdsed ESSENTIALLY Eadsaassad surrender aaaEeEdEss aaessssaad 480 aaEsadadEa asEceEasaas ssaaesades dsseaaaasd sasadsaaaa yeah 540 Esddasadss aasdsaaaa aadadaEEaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaddsses sssesaesas sEssassaaad EsdaaaEsaa Esaddassa SEADESEASE 660 sdsdasedaa surrender ssdsa EEaaadEEesa adasad EaEDsEedss 720 sdaassEEEEa sasa SSSEEESSDE adaaessaa dsessaesdda sadadad 780 FOODFOOD aaEdEddEdd EEassassd EEassessedS Foodstuff EEDESSESSEAS 840 sss edadsas addassa DEEasasas ssssasdddd EATING HERE 900 sadseesdes dasaeddas Foodstuff seseseses aaadaakdES ddaaasas 960 Eaeddsaedd sEDEdddaa loan Edeaaaaaaa SEEaddss ccECEssss 1020

- 77 008007

RssdadaddR RRdasaGarden ddddrrr garden AdaRadRssd Esdaeaeeeea EdDesEssES 1080 RdRsRRsRRd ssdsRasRed SDDSSRsaRR asrssssas SRSDSRRSRA sasadaaRds 1140 surrender AsaEssdsRs srasrdrds adRssdsaaR ddsasaRasd addrRsRsRa 1200 Raaessssad EasaRsadd ASRRDERSSR sdsa RaRdsdsads SESSDDEEDD 1260 Radds RRSSDRssas sasaassdsr saasasdasd RddasRddsa sRsdaaaRds 1320 aasadssRaE RasaRdaaR DRARDSDRRA RdddRadsdas dasRddRaRR ddassdasdr 1380 ADDRESS daRRdRsRsd SRsRsadRdR yes sasdsda asEsaadsds 1440 daads DRSRDRSRRSR ddaRdsaRdd EddaaaEs dsadaaddad DsasRsdsda 1500 rssssdrras aassrcrssr AsaRsdRssa AsaaRsssad dadaRdsaaR SCRSSARSAR 1560 RddsdRdasR dRsaasEass dssEEEEddd ARDDDDARRs CECEaEadss addaad 1620 sdasdaadds RssdssaasR Raddas sdassaasdd SasdsRsRdR ASRDDSRSSA 1680 adadaaRaRs dsrrssrrsd ddddsdass DRSDDSDSRS AssaRsRddd DssaadRds 1740 sddrdsssaas ADSDRSDDS RssaRRRadR ddsa ddssadaaRd ARDDSARSRRR 1800 ssrdrdssddd Rsdssdada dsddsrssdr assssssssss dsadsarasa Rdadsdssda 1860 adaRdsasaa ssarasRaRd ARDSSDSRDSR saasdsaass aasRdsassd dsrsrrssaa 1920 SassssRRasR Rdrsrssdrd aadRRssssas surrender ADSRSSARSR RsaasadsRs 1980 SECRDSDS ddddsaddaR aRsaRsssdr saRrdasds yeseesses DadssRsddd 2040 daRadRRaaR sRssadasRd dssaaRRsds saaaasssssd SRRsRRaRsd dsassasasRR 2100 sdasdaaddd AssaadRaRd ssssrsardd SRaRaaRass assdassaar RRdRsRsssr 2160 sdRssaadss aasddaassa ARRaRassad sdsrcrssass ARRdsaRssss Rassssad 2220 Rdassadss DRRDRDRARRs sdddaassssr RsaaddRsdR sssssassdr saRasddRRa 2280 ssad sdsdrddsrd SSRRSSRsdd SDRARSRDSRs ardsasdsds SRSDSSDSDR 2340 dasaassssad Rdddsrdsas asRddaaRdR AssRdssRas DRDRARSASR yeah 2400 dasasraddd ssarradarad dadssdsdsa RddsRaRdaa DRSSSSRRS DEEessaEaa 2460 RRaRdaRddR RRdddsdaRd aasddddaaa surrender assrddssas aasRaRsdas 2520 Radar sddrdrddd RdadsRRRaR RaaRsaRRRd yesRssdaaRR aRadRaaRad 2580 RdadRdaRRR dssssassra SSRsRddasa SRDSRRRadd ADRRDaddd Raaddaadda 2640 RdsRdasasd SRDSRSRDSSR ADRDASDDAR ArssasRds SRDRsRasas aasadaaass 2700 ssdsaaaaRa RddRsRRRda RdRsaaRdRd asRddasRdd SRRaRdRRda assad 2760 RaRadadsdd adddaaRRds DRARARSASR adsarRsRds adadRdssRR RaaRsddRad 2820 ddRadasRad addsRRSaaR ARSAARADAR aEsasasaEa saddadads dssss 2880 sssrssadar SaadadsRaR RssdRRaaaa ddraddsar sssdsdsassd ddddddaadds 2940 sddddddrs RRassRsRdR ddaaasrad aaRRssadsa asdaRddRRR Radaaaddss 3000 adARsRdRRd AsRsaRRdRR RdaRssRssd ARDRRDSARS surrender Rsrdsrrdde 3060 srdrdssaadd ARDRRRaasad SRDSRDRRda ddsaasRsRa yesssssss adassRRRas 3120 RARSRDSDSRD asRadadddr AsadRaddRs sRasRRRdaa ЕССЕЕддсд DERDDDARRE 3180 sdsddaaddr RdRsRsaass SRCAARDSRR DRASASDASAD ADDDSRRDDS aaRdadasda 3240 dassasddds daRrdasaRd RdRsaadsad RadsRaRsdd daaRsRdaaa aadsards 3300 DRASRDDASR RRdsaddsaa AddsRdRsRd RRsRadassa RsdsdsRadad sdsddrdads 3360 aRasRaddsd adsrdaaaad ssRadaadsd drrdssddrr ARSSDSRRRd RRRdRdsssr 3420 RRssdrrrss ddddsdradds aaRsasaRRR addsaardss DRDRDDDSSR RddadaRsRs 3480 assraiser ARRdsaRRRR AssrSasddR yes dadRadasRaR sadddaaasr 3540 dadssRaRRd ARSARASASE ARRassassa sasaaadsRd ssaaddaasa aRadRaaRdR 3600

- 78 008007

dadsdssaad dadaSaSSsSS SdaasSSSd SSSSADSSSS SdSasSasasS asssadssad 3660 asadddddsss dSaSsdaSdd sSssasadsd ddaSaSsaSd aaSssSSsaSd SsdSsasdas 3720 SsaSassSsd adsdaadd ssdddSaSSa sssasssddd aaaSSdSSsaS dasSdSadad 3780 sSadsSdsSs caddy DSSASSSSSD СсадСССаСа aaSSssaddd sssssssdsdss 3840 saasssssaas aSdDdddsSs SSasdsSdsSs AsSaSaSSad SSadddssss adadaa ssas 3900 AdaaSSaSSd dsaSSdSSssS SsaSsdSSss aa 3932

<210> 26 <211> 1518 <212> DNA <213> AzregdShiz phdeg <220>

<221> SEZ <222> (1) .. (1518) <400> 26

ASD dss Sss Sss dss SSc Cd ssd cSa CCC grandfather dss SSS SSa csd sss 48 Me! A1a Zeg Zeg Ya1 Pb Bie Rgo Bie Bie A1a A1a Zeg Bie Bie Rgo 1 5 10 fifteen asa ssc dss Sss asa garden aaS dss yes asa ssd asa Sss dss ssS ac 96 Tht Bie A1a Zeg Tht C1p Azp A1a Azr Tht Rgo Tht Zeg A1a Rgo Tht 20 25 thirty dd saa dss sds aaS dds asa Sas dad ddb ssc CaS aaS sss asd Sas 144 Ya1 C1p Ya1 Agd Azp C1u Tht Tug C1 and C1u Bie Tug Azp Rgo Tht Tug 35 40 45 aaS garden das SSD SSc ssc dds aSa ssd CaS grandfather garden ssS ssd DSS dds 192 Azp C1p Azr Bie Pb Bie C1u Not Rgo Tug A1a C1p Rgo Rgo Ya1 C1u fifty 55 60 dad cSa food SSc sdS ssa ssa saa ssd ssc aas asd asd SDD ac dds 240 61and Bie Agd Pb Agd Rgo Rgo C1p Rgo Bie Azp Tht Tht Tgr Tht C1u 65 70 75 80 ace! food aaS dsa asa dss CaS Sas aaS yeah SDS ACC dds CaS dds hell 288 Tht Agd Azp A1a Tht A1a Tug Tug Azp C1 and Suz Not C1u Tug C1u Zeg 85 90 95 das das Dd CaS Dd ace das dSa dss Sss yeah yes SDS ssc dss ssc 336 Azr Azr Tgr Tug Tgr Tht Azr Ya1 Ya1 Zeg C1 and Azr Suz Bie A1a Bie 100 105 110 hell dd ACC food ssS sas dds ACC das SSS hell grandfather aad csd sss dss 384 Zeg Ya1 Not Agd Rgo Bottom C1u Not Azr Zeg Zeg A1a Bz Bie Rgo Ya1 115 120 125 dss sss Dd ASD caS dd! dda yeah SSc dsa yeah dda dds ac sds das 432

- 79 008007

Ya1 RNe 130 Tgr mek ΗΪ3 C1u C1u 135 C1 and RNe A1a C1 and C1u 140 C1u TNG Agd Azr css caustic cas aas SCS css Us ax dke saa saa css garden dad akd saa 480 Zeg Agd Tug Azp Bie Zeg Tug Not Ya1 C1p C1p Zeg C1p 61and Mek C1p 145 150 155 160 cake sss ax acc dds dkd ask dke aas cas sds ekk sneaker dda cdd dda 528 Zeg Rgo Not 11th C1u Ya1 TNG Ya1 Azp Tug Agd Bie Zeg C1u Tgr C1u 165 170 175 cx SCS as hell garden yeah dke dss das yeah dds css dss aas kka dda 576 RNe Bie Tug Zeg C1p C1 and Ya1 A1a Azr C1 and C1u Zeg A1a Azp Bie C1u 180 185 190 SCS sds das saa sdd sas Dec skd cas cdd SCS saa dad aac ax Dec 624 Bie Agd Azr C1p Agd ΗΪ3 A1a Bie Tug Tgr Bie C1p C1 and Azp Not A1a 195 200 205 css cx dds dds das sed sneaker sdd SCS ace ax cdd dds saa adk dss 672 Zeg RNe 61u C1u Azr Rgo Zeg Agd Bie TNG Not Tgr C1u O1p Zeg A1a 210 215 220 ddk dss aas hell dke ddk SCS sack kka dkd dsa cas das dds garden aac 720 C1u A1a Azp Zeg Ya1 C1u Bie ΗΪ3 Bie Ya1 A1a Tug Azr C1u C1p Azp 225 230 235 240 duck dds ax cx caustic dss ddd ax dss dad hell dds css dka sss css 768 Azr C1u 11th RNe Agd A1a C1u Not A1a C1 and Zeg C1u Zeg Ya1 Rgo Zeg 245 250 255 SCS dsa dsa cas akd hell dss yeah duck dsa saa ssa cas as duck dss 816 Bie A1a A1a Tug Mek Zeg A1a C1 and Azr A1a C1p Rgo Tug Tug Azr A1a 260 265 270 dke dke aas dsa ace aas kde ace dds cake css aas ace ekk ask Idk 864 Ya1 Ya1 Azp A1a TNG Azp Suz TNG C1u Zeg Zeg Azp TNG Bie TNG Suz 275 280 285 SCS caustic yeah dkk sss ace das dke SCS hell css ax cx aas hell css 912 Bie Agd C1 and Ya1 Rgo TNG Azr Ya1 Bie Zeg Zeg Not RNe Azp Zeg Zeg 290 295 300 SCS dke Dec ddd dsa dda as sack sss dke acc das dds duck cx SCS 960 Bie Ya1 A1a C1u A1a C1u Tug Nhz Rgo Ya1 Not Azr C1u Azr RNe Bie 305 310 315 320 hell dss sneaker ddd aka dkk aac SCS garden ask dds saa cx dss aah ace 1008 Agd A1a Zeg C1u Not Ya1 Azp Bie C1p TNG C1u C1p RNe A1a Bz TNG 325 330 335 ssd ekk ekk ax dds ace aas cx das yeah ddd ace aad as dss sec 1056 Rgo Bie Bie Not C1u TNG Azp RNe Azr 01and C1u TNG Bz Tug A1a Rgo 340 345 350 sack dds as aac ace ace das saa kkk dke css SCS dke saa dss aas 1104 Ηίβ C1u Tug Azp TNG TNG Azr C1p RNe Ya1 Zeg Bie Ya1 C1p A1a Azp

- 80 008007

355 360 365

dda ace aaR RaR ace hell dsr CPC ace APP dsa Rss SRD Ras ssa gift 1152 C1u Tht Azp Tug Tht Run A1a Bie Tht 11th A1a Run Bie Tug Rgo Azr 370 375 380 das ssa dss DDR ddr APP ssd dda ace CPP saa ddr Happy Birthday sss ssa ssd 1200 Azr Rgo A1a Ya1 C1u 11th Rgo C1u Tht Bie C1p C1u Agd Rgo Rgo Rgo 385 390 395 400 Rsa Ras ddr Ras garden Rdd aad sds drd dsr dss PPc wed with dds gift SRD 1248 Run Tug C1u Tug C1p Tgr Bz Agd Ya1 A1a A1a Pb Bie C1u Azr Bie 405 410 415 CPC ard sas grandfather SSR sds sds drd asa ace garden Rdd SRD dsa sas Rdd 1296 Bie Mer Hb A1a Rgo Agd Agd Ya1 Tht Tht C1p Tgr Bie A1a ΗΪ3 Tgr 420 425 430 aaR dr a SSR dss Ras drd RaR sas Rdd aas d ^ d ard asa CPA ddd ssa 1344 Azp Ya1 Rgo A1a Tug Ya1 Tug H13 Tgr Azp Ya1 MeR Tht Bie C1u Rgo 435 440 445 PP gift dda dss grandfather saR dds RaR yeah drs sss PPc adr PPc saR aaR 1392 Bie Azr C1u A1a A1a Bottom C1u Tug C1 and Ya1 Rgo Pb Run Pb Bottom Azp 450 455 460 RaR gift ddr RRd dds gift yeah edd dda aas das hell drd ace rdd ssa 1440 Tug Azr C1u Bie C1u Azr C1 and Agd C1u Azp Azr Run Ya1 Tht Tgr Rgo 465 470 475 480 saa CPA Red acP ard ard Rsa edd ard Rdd drd hell PPP APP aaR saR 1488 C1p Bie Run Tht Mer Mer Run Agd Mer Tgr Ya1 Run Pb 11th Azp ΗΪ3 485 4 90 495 Bd gift ssd aaR RaR adr aaR adR dad Rda 1518 Bie Azr Rgo Azp Tug Run Azp Run C1 and

500 505 <210> 27 <211> 505 <212> PROTEIN <213> Azregd Shiz pdeg <400> 27

MeR A1a Run Run Ya1 Pb Bie Rgo Bie Bie A1a A1a Run Bie Bie Rgo 1 5 10 fifteen Tht Bie A1a Run Tht C1p Azp A1a Azr Tht Rgo Tht Run A1a Rgo Tht 20 25 thirty Ya1 C1p Ya1 Agd Azp C1u Tht Tug C1 and C1u Bie Tug Azp Rgo Tht Tug 35 40 45 Azp C1p Azr Bie Pb Bie C1u 11th Rgo Tug A1a C1p Rgo Rgo Ya1 C1u

81 008007

50 55 60

C1 and Bie Agd Rye Agde Rgo Рgo С1п Rgo Bie Azp Tht Tht Tgr Tht C1u 65 70 75 80 Tht Agd Azp A1a Tht A1a Tug Tug Azp 61and Suz 11th C1u Tug <31 y Zeg 85 90 95 Azr Azr Tgr Tug Tgr Tht Azr Ya1 Ya1 Zeg C1 and Azr Suz Bie A1a Bie 100 105 110 Zeg Ya1 11th Agd Rgo Ηί3 C1u 11th Azr Zeg Zeg A1a Bz Bie Rgo Ya1 115 120 125 Ya1 Pb Tgr MeE H13 C1u C1u C1 and Pb A1a C1 and C1u C1u Tht Agd Azr 130 135 140 Zeg Agd Tug Azp Bie Zeg Tug 11th Ya1 C1p C1p Zeg C1p C1 and MeE 61p 145 150 155 160 Zeg Rgo 11th 11th C1u X7a1 Tht Ya1 Azp Tug Agd Bie Zeg C1u Tgr <31u 165 170 175 Pb Bie Tug Zeg C1p C1 and Ya1 A1a Azr C1 and C1u Zeg A1a Azp Bie C1u 180 185 190 Bie Agd Azr C1P Agd ΗΪ3 A1a Bie Tug Tgr Bie C1p C1 and Azp 11th A1a 195 200 205 Zeg Pb C1u C1u Azr Rgo Zeg Agd Bie Tht 11th Tgr C1u C1p Zeg A1a 210 215 220 C1u A1a Azp Zeg Ya1 C1u Bie ΗΪ3 Bie Ya1 A1a Tug Azr C1u C1p Azp 225 230 235 240 Azr C1u Not Pb Agd A1a C1u 11th A1a C1 and Zeg C1u Zeg Ya1 Rgo Zeg 245 250 255 Bie A1a A1a Tug MeE Zeg A1a C1 and Azr A1a C1p Rgo Tug Tug Azr A1a 260 265 270 Ya1 Ya1 Azp A1a Tht Azp Suz Tht C1u Zeg Zeg Azp Tht Bie Tht Suz 275 280 285 Bie Agd C1 and Ya1 Rgo Tht Azr Ya1 Bie Zeg Zeg 11th Pb Azp Zeg Zeg 290 295 300 Bie Ya1 A1a C1u A1a C1u Tug H1z Rgo Ya1 11th Azr C1u Azr Pb Bie 305 310 315 320 Agd A1a Zeg C1u 11th Ya1 Azp Bie C1p Tht C1u C1p Pb A1a Bz Tht 325 330 335 Rgo Bie Bie 11th C1u Tht Azp Pb Azr C1 and C1u Tht Bz Tug A1a Rgo 340 345 350 H13 C1u Tug Azp Tht Tht Azr C1p Pb Ya1 Zeg Bie Ya1 C1p A1a Azp 355 360 365 C1u Tht Azp Tug Tht Zeg A1a Bie Tht 11th A1a Zeg Bie Tug Rgo Azr 370 375 380 Azr Rgo A1a Ya1 C1u 11th Rgo C1u Tht Bie C1p C1u Agd Rgo Rgo Rgo 385 390 395 400

- 82 008007

5eg Tug C1u Tug <31n Tgr bg Agd Ya1 A1a A1a Pb Bie C1u Azr 415 Bie 405 410 Bie MeE Bottom A1a Rgo Agd Agd Ya1 Tht Tht C1p Tgr Bie A1a Bottom Tgr 420 425 430 Azp Ya1 Rgo A1a Tug Ya1 Tug Bottom Tgr Azp Ya1 MeE Tht Bie C1u Rgo 435 440 445 Bie Azr C1u A1a A1a Bottom C1u Tug C1 and Ya1 Rgo Pb Zeg Pb Bottom Azp 450 455 460 Tug Azr C1u Bie C1u Azr C1 and Agd C1u Azp Azr Zeg Ya1 Tht Tgr Rgo 465 470 475 480 C1p Bie Zeg Tht MeE MeE Zeg Agd MeE Tgr Ya1 Zeg Pb 11th Azp Bottom 485 490 495 Bie Azr Rgo Azp Tug Zeg Azp Zeg C1 and 500 505

<210> 28 <211> 3091 <212> DNA <213> Azregd Schiz pideg <400> 28

ddsdaasdd sCEDadSed ssDdddds adaadadad ssdddasEaE ddaeaeedds 60 daddaaaaaa EEaEadEada EEaEadddad EsdaaEdsad SESSDEDEEDD NEXT 120 Food ddasa ddaaaada aasdsdasdd daaaaaaasa Food 180 sdddda desasa ddddsdda EEEEsssses FOLLOWING EssEsaasEs 240 ESSEEESESE EECAEEEssa ESSDA DESAASESA EsEsasEscda hell 300 Eaaeeeezadd DESSEDESA dsssad esaa dDEESSEEEad EEsdaEssE EsadEEDdss 360 sdesaedess aEEDassadd aaeddadsaa dssssdaFood dda dsddadasa 420 Sedssaaess EDEDEAESSA ESSSSEEaas adsdaaedd sassadcece SEDSSDEA 480 ADCESSEDESED sasadssead SEDSSDEEEa ddsEedass SEECESSESEE dsdsa esad 540 Food asEadsssss asadade Essesseeesd ASEDEDDSES ddaasd 600 ddddddd aaaaaaaaaaaaaaaaaaa dsssadad ddEEDdsEad sceEtsEsEsE SEDDDEDDSS 660 adassassass ssaEasaEa ddaEssdEdd Foodstuff AEECEEEDESA EEsdssaed 720 Yesdaa Yesass dsaEdsddaa ddaddasdss EEDSSEEDS eeeee sasa eseddsd 780 ASSESSEEEEE Esadassssed dadssdae sdsdaDAFOOD aEessEdssd ddssas 840 ADCESSEEEEE aasdeseddd here FOODFOOD JESA EscdEeasa 900 DEESESASASAA EsddeEaaaad saEesDedds sssdaddses DEEDSASAS asaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 960 EEEEEEEEEE SEDDSASSDE ESSEEEESE SEEEDDESEA DEADEEEE sEsadaasss 1020 Esdd eddas SEEDDSEASA saadaEaEaa addsaaaECE SEDSSSSAED DEAESADESA 1080 DEDDSEDDDD aeasdseasd sdds Eassddddes hereinafter ceddssas 1140 ddaEssEdas adddadad dsDEEsaada adsaEesaad NEXT EECEasaaEa 1200 aaEaaaaada EaEaEEdsda TEXT EdsEaaEass sadddsasad saeddessss 1260

- 83 008007

dddcddcss sassadssaa cakssassks ssdsaddsas dkssdaddak kdksskksss 1320 coddak sdsssssads csdcddaad skaskasdad dskdsssdkk kksdkkdda 1380 xxaaddadd sddskksaak dssaaskssa dssssaaska saakddaasa ddccdaxd 1440 aadsddssaa kakdkssakd dkddkddx sksksaaska sadddxddc ssdkasdddk 1500 kskskskdd aksddddd skddddddd daadsdkdaa saakdsdsd aaddassaaa 1560 ksaaddkssk daadcdddcd saadadsaka khsadsaddk Akdsddasas ksassaassss 1620 asadsaaaks assdskaakk kindergarten kkkddaddsd axssadx sdkkdkkaks 1680 ddsddsdasa dsdsaddsds adsxcax askxax kkksadsssa sdkddsad 1740 dasdasdaas kakkssasds cdssdssds dadksssaaa dskkdskss kakdkdass 1800 dksaaksaaa dssaakksds skakaasas skddxaks dsdsddsdcd sdsaadduck 1860 ksadasasss ksdsdsksk asdssdaska aassassad aaskdsadsd saxaasax 1920 aasasasssk casssassds ssaasaadsa sskskass cdkasddkss sdksdksdas 1980 ddskssssa kssadaska sasakassdd skkkkssads aaddsaaakk saxaaadx 2040 sssdkaaksk ksddsdasda sassaasdaa ddaasaak csdssssaa aasdasskss 2100 assdksdddsd aadssdasas skksakssaa dassaakksss ssaasaksaa skksassass 2160 skaassaads kdaasdaskd dkakssaaa daaaassaaaa sksdsdadkk ssssaakkss 2220 ksssssk ddsdksssds kadsassdsd kasddkdaaa Xadakakak skkdsdddd 2280 akskasakdk sskskdkdkk cdcdcdss dddksaasa dskddaaska ksakkakdsk 2340 dkdsaddass ssdsdsdsda adsxsadds adadddcdx dksakaskdk ddaadaaaak 2400 dssacccddd dssdsadka cddcdds asassdssdd sdksdkaksk saskdadaak 2460 dsdsaakkd cdddcduck kindergarten kddasdadkk xaccadadc DKKKDAKSSD 2520 aakssdskda ddkakssddd dadkssddad cddaadasdk ddddcdd asakdddddad 2580 daccaxds ddaccaccc ssdsdaq dadasdadda cddadasdk dksddaddsd 2640 sadadddaaa dddcdaaka ckddadkadk dkkddddssdd askkdsksa dkdkkdsas 2700 kkakkakskk cddxdddd kaaddkakak acacadacade kakaakakkd kaadskakad 2760 backdoor sdkdaakkda acacacdadd aaadakddx kkdkakaaak saaaasakks 2820 kkkkkddsk dssakkssas daxaxacc sssaakdax aaassaadka askakaassd 2880 aacacacasa kskakaksaa sskdsksksks axadaakka ssaaaadasd dddssddsas 2940 asasaaskaa assstasaaaa kasaxaasa kaaassssaaa koakaaaasa kaakasasa 3000 aaadaaadad aaaadaadds aaaasaadcd adadaasca skkssssasa caddad 3060 aasdaasdak daakdddda caxaxax a 3091

<210> 29 <211> 1617 <212> DNA <213> Azregd Schiz pideg <220>

<221> POPs <222> (1). . (1617) <400> 29

- 84 008007

aU aee EEC Eee saE eat dsa ssd EEC EEC Eee cEC Eee dDE cea yeah 48 MeE 11th Pb Pb Bottom Bie A1a Rgo Pb Pb Pb Bie Pb C1u Bie Ya1 1 5 10 fifteen yeah ECE ECE garden aas sce asd grandfather das CEE dds Eas asa hell EAE aah 96 Ya1 Zeg Zeg C1p Azp Rgo Tht Ya1 Azr Bie C1u Tug Tht Agd Tug Bz 20 25 thirty dds aah ECE eat sss aaE dDE aec hell garden Unit eat ddd aaa sds Eas 144 C1u Bz Zeg Bie Rgo Azp C1u 11th Zeg C1p Tgr Bie C1u 11th Agd Tug 35 40 45 grandfather DSE dsa sce ace ddd ECE eat edd EEC ECE grandfather ssa garden yes sce 192 A1a A1a A1a Rgo Tht C1u Zeg Bie Agd Pb Zeg A1a Rgo 61p Azr Rgo fifty 55 60 das asd yeah yes dds DEER saa yeah dsa EEC aad saE dDE sss edd Food 240 Azr Tht Ya1 Azr C1u Ya1 C1p C1 and A1a Pb Bz Bottom C1u Rgo Agd Suz 65 70 75 80 DEER sss ace hell saa EAE sss acE sss dsa dds asd Ess dad yes Food 288 Ya1 Rgo Tht Zeg C1p Tug Rgo Tht Rgo A1a C1u Tht Zeg C1 and Azr Suz 85 90 95 cEC EEC cEC yes yeah Eas DSE sss hell Esd grandfather yeah DSE acE asd add 336 Bie Pb Bie Azr Ya1 Tug A1a Rgo Zeg Zeg Ya1 C1 and A1a Tht Tht Agd 100 105 110 eat sss DEER EEC DEER Unit aee saa dda dds dds EEC aaE dss aas Ess 384 Bie Rgo Ya1 Pb Ya1 Tgr Not C1p C1u C1u C1u Pb Azp A1a Azp Zeg 115 120 125 hell sss aas Eas aaE dda asa dda Food aec yeah grandfather dss aaE aU Ess 432 Zeg Rgo Azp Tug Azp C1u Tht C1u Bie 11th C1 and A1a A1a Azp MeE Zeg 130 135 140 aU grandfather grandfather des ace EEC aas Eas add des dDE ssd Eas ddd EEC cEC 480 MeE Ya1 Ya1 Ya1 Tht Pb Azp Tug Agd Ya1 C1u Rgo Tug C1u Pb Bie 145 150 155 160 ECE dda Ess dad grandfather eat dad dda dda hell grandfather aas aaE dds eat aad 528 Zeg C1u Zeg C1 and Ya1 Bie C1 and C1u C1u Zeg Ya1 Azp Azp C1u Bie Bz 165 170 175 das saa aec aad des eat aad Unit grandfather saa dad saE aec hell aad Eee 576 Azr C1p 11th Bz Ya1 Bie Bz Tgr Ya1 C1p C1 and Bottom 11th Zeg Bz Pb 180 185 190 dda dds yes sss hell sas DEER DEER aec dds dds das hell dsa dds dsa 624 C1u C1u Azr Rgo Zeg Bottom Ya1 Ya1 11th C1u C1u Azr Zeg A1a C1u A1a 195 200 205 grandfather ECE aec acE cEC saE CEE Esa dss sas dDE dds hell das das yeah 672 A1a Zeg 11th Tht Bie Bottom Bie Zeg A1a Bottom C1u C1u Agd Azr Azr C1 and 210 215 220 cea ΐΐ s sas DSE dss dss dsa dad Ess saa hell Eee DSE sce aU Food 720

- 85 008007

Bie Pb NLz Ala Ala Ala Ala SLI Zeg SLP Zeg Pb Ala Rgo MeE Bie 225 230 235 240 ace des aaE saa hell saa EEC dss EAE aas aas eat des aec sds dss 768 Tht WAL Azp SLP Zeg SLP Pb Ala Tug Azp Azp Bie WAL Not Agd Ala 245 250 255 dds Food dsa hell yes Esa das ace cEC dss Food EEA sds food cea aas 816 SLU Suz Ala Zeg Azr Zeg Azr Tht Bie Ala Suz Bie Agd Agd Bie Azp 260 265 270 ace asa yeah eat garden sds aec aas aec aas asa sss EEA sss ace dss 864 Tht Tht SLI Bie SLP Agd 11th Azp Not Azp Tht Rgo Bie Rgo Tht Ala 275 280 285 saa saa dsa sce cEC Eas eat Eas dDE sss des des das dds Ess cEC 912 SLP SLP Ala Rgo Bie Tug Bie Tug C1u Rgo WAL WAL Azr SLU Zeg Bie 290 295 300 aec ssa das Eas asa Eas sdd CEE EEC garden saa dds aah EEC aec aah 960 Not Rgo Azr Tug Tht Tug Agd Bie Pb SLP SLP SLU Bz Pb Lle Bz 305 310 PL5 320 des sss yeah aec EEC dds das das ace aas yeah dda asa aec EEC des 1008 WAL Rgo WAL Lle Pb SLU Azr Azr Tht Azp SLI SLU Tht Lle Pb WAL 325 330 335 sss aah asd ace Ess ace des dds yeah dss das ace EEC aec saa das 1056 Rgo Bz Tht Tht Zeg Tht WAL SLU SLI Ala Azr Tht Pb 11th SLP Azr 340 345 350 saa EEC sss aas aec aas EEC ace sas cea ace aad eat aas das Unit 1104 C1p Pb Rgo Azp Lle Azp Pb Tht NLz Bie Tht Bz Bie Azp Azr Tgr 355 360 365 EAE cEC aah yeah aas saa acE sds dad EEC sss aaE Ess Ess sss Eas 1152 Tug Bie Bz SLI Azp SLP Tht Agd SLI Pb Rgo Azp Zeg Zeg Rgo Tug 370 375 380 Unit cde sss DSE hell ace grandfather Eas dDE yeah aec hell EAE aec Food ssd 1200 Tgr Agd Rgo Ala Zeg Tht Ala Tug SLU SLI 11th Agd Tug Lle Suz Rgo 385 390 395 400 ddd aec Eas aU Ess ECE grandfather Eee DSE hell dss dDE des aas hell Unit 1248 SLU Lle Tug MeE Zeg Zeg WAL Pb Ala Zeg Ala SLU WAL Azp Zeg Tgr 405 410 415 aas EAE saE EAE DSE grandfather garden das sss dss grandfather yeah dss Esa dds hell 1296 Azp Tug NLz Tug Ala Ya1 C1p Azr Rgo Ala Ala SLI Ala Zeg SLU Agd 420 425 430 dDE des hell saE acE grandfather yeah yeah aaE dss aee Unit dds ssd garden EAE 1344 SLU WAL Zeg NLz Tht WAL SLI SLI Azp Ala 11th Tgr SLU Rgo SLP Tug 435 440 445 grandfather hell dds asa ssd ssd grandfather Esd EAE cEC acE dad aaE grandfather ssa aee 1392 WAL Zeg SLU Tht Rgo Rgo Ala Zeg Tug Bie Tht SLI Azp Ala Rgo Not

- 86 008007

dd ssd dkd aed garden dds Bass Unit asd hell EEC aee hell grandfather Eee yes 1440 Ya1 Rgo Ya1 MeE C1p C1u Tug Tgr Tht Zeg Pb Not Agd Ya1 Pb Azr 465 470 475 480 ssd aaE ssd eat add EAE ssd ddd hell ssd dad Unit aad asd Unit hell 1488 Rgo Azp Rgo Bie Agd Tug Rgo C1u Zeg Rgo C1 and Tgr Bz Tht Tgr Zeg 485 490 495 gift dda saE ddd dad Yes! EAE edd edd aaa Eee des sds asd aaE dad 1536 Azr C1u Nhz C1u C1 and Azr Tug Agd Agd 11th Pb Ya1 Agd Tht Azp C1 and 500 505 510 asd add aU dad asd dkd Eating dad grandfather garden add yeah add Food yeah EAE 1584 Tht Agd Mer C1 and Tht Ya1 Zeg C1 and A1a C1p Agd C1 and Agd Suz C1 and Tug 515 520 525 Unit hell hell DEER ddd ssd das Food Eating garden Food 1617 Tgr Zeg Zeg Ya1 C1u Rgo Azr Bie Zeg C1p 530 535

<210> thirty <211> 538 <212> PROTEIN <213> Azregd Shiz pdeg

<400> 30

MeE 11th Pb Pb Nhz Bie A1a Rgo Pb Pb Pb Bie Pb C1u Bie ν ₃ ι 1 5 10 fifteen Ya1 Zeg Zeg C1p Azp Rgo Tht Ya1 Azr Bie C1u Tug Tht Agd Tug Bz 20 25 thirty C1u Bz Zeg Bie Rgo Azp C1u 11th Zeg C1p Tgr Bie C1u 11th Agd Tug 35 40 45 A1a A1a A1a Rgo Tht C1u Zeg Bie Agd Pb Zeg A1a Rgo C1p Azr Rgo fifty 55 60 Azr Tht Ya1 Azr C1u Ya1 C1p C1 and A1a Pb Bz Nhz C1u Rgo Agd Suz 65 70 75 80 7a1 Rgo Tht Zeg C1p Tug Rgo Tht Rgo A1a C1u Tht Zeg C1 and Azr Suz 85 90 95 Bie Pb Bie Azr Ya1 Tug A1a Rgo Zeg Zeg Ya1 61and A1a Tht Tht Agd 100 105 110 Bie Rgo Ya1 Pb Ya1 Tgr Not C1p 61u C1u C1u Pb Azp A1a Azp Zeg 115 120 125 Zeg Rgo Azp Tug Azp C1u Tht C1u Bie 11th C1 and A1a A1a Azp MeE Zeg 130 135 140 MeE Ya1 Ya1 Ya1 Tht Pb Azp Tug Agd Ya1 C1u Rgo Tug C1u Pb Bie

- 87 008007

145 150 155 160

Zeg Sue Zeg Cie Yb 165 Bie b Sue Sue Zeg 170 Ya azp Azp Sue Bie 175 Bz Azr Bn Not Bz Yb Bie Bz Tgr Yb Bn SI Hb 1b Zeg Bz Pb 180 185 B90 Sue Sue Azr Rgo Zeg Hb 7ab νβΤ Not Sue Sue Azr Zeg Aba Sue Aba 195 200 205 Aba Zeg Not TNG Bie Hb Bie Zeg Aba Hb Sue Sue Agd Azr Azr SI 210 215 220 Bie Pb Hb Aba Aba Aba Aba SI Zeg Bn Zeg Pb Aba Rgo Mek Bie 225 230 235 240 Tht Yb Azp Bn Zeg Bn Pb Aba Tug Azp Azp Bie Yb 1b Agd Aba 245 250 255 Sue Suz Aba Zeg Azr Zeg Azr Tht Bie Aba Suz Bie Agd Agd Bie Azp 260 265 270 Tht Tht SI Bie Bn Agd 1b Azp 1b Azp Tht Rgo Bie Rgo Tht Aba 275 280 285 Bn Bn Aba Rgo Bie Tug Bie Tug Sue Rgo Yb Yb Azr Sue Zeg Bie 290 295 300 Not Rgo Azr Tug Tht Tug Agd Bie Pb Bn Bn Sue Bz RNe 1b Bz 305 310 315 320 Yb Rgo Yb 1b Pb Sue Azr Azr TNG Azp SI Sue TNG 1b Pb Yb 325 330 335 Rgo Bz Tht Tht Zeg Tht Yb Sue SI Aba Azr TNG Pb 1b Bn Azr 340 345 350 Bn Pb Rgo Azp Not Azp Pb Tht Hb Bie TNG Bz Bie Azp Azr Tgr 355 360 365 Tug Bie Bz SI Azp Bn Tht Agd SI Pb Rgo Azp Zeg Zeg Rgo Tug 370 375 380 Tgr Agd Rgo Aba Zeg Tht Aba Tug Sue SI 1b Agd Tug 1b Suz Rgo 385 390 395 400 Sue 1b Tug Mek Zeg Zeg Yb Pb Aba Zeg Aba Sue Yb Azp Zeg Tgr 405 410 415 Azp Tug Hb Tug Aba Yb Bn Azr Rgo Aba Aba SI Aba Zeg Sue Agd 420 425 430 Sue Yb Zeg Hb Tht Yb SI SI Azp Aba 1b Tgr Sue Rgo Bn Tug 435 440 445 Yb Zeg Sue TNG Rgo Rgo Aba Zeg Tug Bie Tht SI Azp Aba Rgo Not 450 455 460 Yb Rgo Yb Mek Bn Sue Tug Tgr Tht Zeg Pb 1b Agd Yb Pb Azr 465 470 475 480 Rgo Azp Rgo Bie Agd Tug Rgo Sue Zeg Rgo SI Tgr Bz Tht Tgr Zeg 485 490 495

- 88 008007

Azr C1u ΗΪ8 C1u C1i Azr Tug Agd Agd 11th Rye Wa1 Agd Tht 510 Azp C1 and 500 505 Tht Agd MeE C1 and Tht Ya1 Zeg C1 and A1a C1p Agd C1 and Agd Suz C1 and Tug 515 520 525 Tgr Zeg Zeg Ya1 C1u Rgo Azr Bie Zeg C1p 530 535

<210> 31 <211> 4575 <212> DNA <213> Azregd Schiz pideg <400> 31

yes garden dadasda EaasEsaEsa YesDesEsES saeddaadd 60 EEDEASASSS aasaEEada csEsaasaEa EEsasddaE aEessEdsaa yeahhhhhhhh 120 aaadssaesa SESSASEEEE DEADEAEEDE Eadssaassd dDEEEdadsd FOOTWEAR 180 EDEDASESE Yeaaddd aeaaaaaaaaaaaa aEdEssasaa EDEDESSESSA EEdssadaE 240 deadsssad hellhhhhhhhhh EECE Edsad EEsdaEds Eaessdde EssadEaaas 300 EaEeaddeEs ddsesdesdesa sassadasad asasdas food sssa dssaddaaes 360 FOODEaddss Eadsad dsdEdsasaE aEddSeeEdd Eadaaaadda Eddssed 420 FOOD YesadaEdas ddEaaaaeds NEXT ddadadaads FOODFOODFood 480 ddada Edaaaaedds EESDSADEDD saassesad kindergarten dssddaaeas 540 Edseddsde yes TAKE FOOD EESAEAEASA ddDeEaaaas asasdEaadd 600 aahhhhhhhhhhhh EAEadsadd FOOD EEDESEADAE Edsad edas FOOD 660 dsaadddEEE AEEEEEssass CEEDAADEAS ACCESS desaaadds aaEssassssa 720 EsaadEaaEa aaaaaaaaa ESSEEEEAESA hesddsess EsEadEadEd sadssesade 780 asadasaas dddasEaasa dsesEsEEDs FOOD dadsdsass SASEEEEESES 840 Essdssssee ESSEEEEEE dsEEEEsaaE ddss dddESEsED ADCESSEDEED 900 FOODFOOD aEddEadEds dadsdsaaa ADDED Esaaassassa Food 960 EsadaddEaa DEDSDADADD dada esadda ddaddadads Eeeaaaaaad dssdsdadd 1020 sddsadadas ddsaadasaE sEddEde assadse hell AEaasadeEaE 1080 EEEEEEDESE sasdasesed SAEEDSSEEE aaEaadsED dsdeaaeeee deaddass 1140 Food Eadssssadd ddddsEDEDDE FOODFOOD dadsEDsEDs sssdadaEEC 1200 AEEEassass Ead Esaddda Essdddsddd EEEEEAEASE sss eddadds ddaaedaass 1260 EEEEEEEAESA sEdaaaaEes sddsa JESTER ASEDDSEAED dddeeee 1320 SEAESDSESA saessessdes addsassess surrender DESAAASEDED ddadEdssd 1380 aeadaaaasa Saada Esaaa EsEcDEssss Edddeeddas ddEsasaEes ddEdaaadad 1440 DEEEEESEES dssessaassa dssEEEEsaEd ESDDSDSES hell Essaadsaa 1500 EEEEaadsas EdEasEssas EadEsasasE DEEEEadsad Edsedeses Food 1560 SEaaasEssd AEEEEEESES DEDAEASED seaaadasa EEaEaEssE asadaseeaec 1620 EsEdEdaaaa addsadEEEa ACEESESSEDES aaEsaEdaad ssEEEEead SECEEECESSD 1680 Esaaecaec ASSSSEASED Food sadsssseaad ddaaaaaaas AEEEEDSSDEA 1740

- 89 008007

daddkdaask akaasksaak saakdaskda aadskkaasd kakksasaa kxaxxas 1800 sdkdaadadk saccasacca kasdakssad ssaddssdsd skdasaksad sadddcdad 1860 addsax cskskdskdsd dasakaadss daakssakkd sakdakdsda skskssdsdaa 1920 adadkakddd cdcssdaask dassakdksa dkddssssak Akddskssa askasasdaa 1980 sasadassk kakadkssss ddkssssasa askkaaakss ddadakdsdd dddcdsadda 2040 Akddaasasd dakasakdkd cddaakdkad dassaaasaa accddskds dkddasakks 2100 dasksdask dassssssaa kdsdskdsdss ddddaskda dssacaddd akaadaasas 2160 sdkdaksask sakdsksdsk assdskkkk skaksakkak dksksdakak saddaadasa 2220 kadsakdass dkdaasasda kdaaddddaak dsksssdasd skkadkkddk cdddskddd 2280 sacredssads skddsaassk dsassaassss ad kadssad asaaadaasd daadccacca 2340 cdddcskas Akdsksadk akaakdadda kkakkskskk ddaakkssak kkdskaadss 2400 sssdkkdsda saskkdsdkk dddssaasss sdadskskk aakdadsksk dddxdddd 2460 dsdssdsk asscd sdakdkaad cadskdaas adasca addassack 2520 Askkaas addsdcdcd acaddaacdk acadkkasd dzadkdaksa aaaaddkkak 2580 skdsaddkda ddaccdasd sssaskkskk casdsdkks kskaskass adsaaaacad 2640 adsdaddask dksskassk aaasddcdx sdksssdskd aakasdasaa kdssadsksk 2700 ssadkskskd kakddakksa cddcdcadcad kdaaakskas sksaasdasa adcascasses 2760 dasdsdaq daasaaaasa ddsdddcdsk ksdsasaadd sddsasksss dasksksdak 2820 asaakskkas acccccc daasasksdd ksaakaksdd ssadssaack accadsad 2880 dsdkdsdska ksdksksdk sskkdddddkk kskksaakdd ddksdadsks dssaakdadd 2940 daksdkkaaa xxddddd aaddassads dskkddssk dsaccdddcd aaadadaas 3000 kkdsaddkkk sdddddddd kkkssakaaa dskakkaaas dkasasadks saaaakkask 3060 aacdasadx Askskakas addsdassk adkaaadksd kdakkkasdd asaaadkdss 3120 ddskssdaaa dddddd ssaaakssds dsdkasaasd dssdadakda sdddsksksks 3180 sdsddadds caddddx sdddsdsddcd kaskaskds dkdsskkdaa sksssskdd 3240 asakakdads skkddkssa dsaaakadsa dasdaddsad dakkksssa dassassssds 3300 aaaskdusk dkskasdsd sassdssksks asadksskaa asaasakksk daassassass 3360 dssaasdasa sdasdska saaskdddd sssasadcdd adddkdaskk sdkadsdsda 3420 kakssadsd adsaasksda sasaddadas kksdksaaad kassaaksak aaksddskas 3480 assassdasd aaddaasas adadcdss daassadcda asassassds sdaakkaaaa 3540 daakassssa dskdkadka ssksskssss kksskssksk axsssssack ssssaksssa 3600 akaassassaa sssadsaasa asaasskasd dskddddssk suburban garden dkadkaks 3660 sdsksskda skskssssss aassassass skksdddsak sssaxax daadaasksd 3720 dsdsdaasdk sasskkssa sadsskaszd dsddsdsakk ssdsssadasd kindergarten 3780 addsdasds bastard dssdsdasds dskasasskd kddskkdd ddddsasaka 3840 asksdasads ackaccas sdakksaasa ssaadasada sdkkasaas adddaadaad 3900 dddcds kkksksddas dkdakksksa kskksaasaa skkaakddk kakdddkksa 3960 dkssdaasss dksksassaak dskssadada dskakaskda dskkadskas sksakdkssd 4020 dskdsdkdak sadskksask aacadcdd axsaakaa dkddaskdk sdsddaadda 4080 asdskasdaa dasddaadaak cddssddcdk Akdakskda daaksskcd adkakdaksk 4140 ddddakdsdaa cdxaskxd kakdsddsds sdkaskkd dsdkaaddad dccccsdc 4200 kdakkaakds kaaksdddd dsdkaksada ddkdaakdkd dkdkadskkd sadssdkkds 4260 skaskcdks daskkksaaa sksaaaaskk kskakkdada dadaaaakkd kdsdaddaaa 4320

- 90 008007

DEASEASSDS ddddsadaasa SECESSEDSAS ADDESSEAE seasaasas asEdaasada 4380 DESAEAEADSA yesEADadEad AEEDESAADS EEasaEsad AsaEaassss assasaaaae 4440 sEddEaada Eadsasa CEEEEaaaaa yeahhhhhhhhhh yeah yeah yeah EaEaaEsdds 4500 EastEaaaaa aEEsaaaasa yeah yeah dsEDedasas saEssdassa EEasasEade 4560 aaad ddds 4575

<210> 32 <211> 1695 <212> DNA <213> Azregd Schiz pideg <220>

<221> C3 <222> (1) .. (1695) <400> 32

aU aad dda aU cEC ssd asd CEE hell Unit Food dsa eat dds aU dss 48 MeE Bz C1u MeE Bie Rgo Tht Bie Zeg Tgr Bie A1a Bie C1u MeE A1a 1 5 10 fifteen hell eat dsa ace Food ace aas ssa yeah dss garden asa aad aas dda hell 96 Zeg Bie A1a Tht Suz Tht Azp Rgo Ya1 A1a C1p Tht Bz Azp C1u Zeg 20 25 thirty EAE EAE dDE des Eas aU CCE garden EAE aaE dad yes EAE Eee CEE dda 144 Tug Tug C1u Cha1 Tug MeE Rgo C1p Tug Azp C1 and Azr Tug Pb Bie O1u 35 40 45 aee ssa Eee DSE aad STS ssd Food dsa sas Food cde Unit dss aas STS 192 Not Rgo Pb A1a Bz Rgo Rgo Bie A1a Hb Bie Agd Tgr A1a Azp Rgo fifty 55 60 dad hell CEE aaE dad ECE Unit Esd dda Food sds sce DSE ace dds EAE 240 C1 and Zeg Bie Azp C1 and Zeg Tgr Zeg C1u Bie Agd Rgo A1a Tht C1u Tug 65 70 75 80 grandfather aU yeah Food aaa dDE Eas dds hell yes saa aah dDE EAE eat garden 288 A1a MeE C1 and Suz 11th C1u Tug C1u Zeg Azr C1p Bz C1u Tug Bie C1p 85 90 95 hell dad das Food cEC Eas cea aas grandfather des cde STS DSE yeah Eas das 336 Zeg C1 and Azr Suz Bie Tug Bie Azp Cha1 Cha1 Agd Rgo A1a C1 and Tug Azr 100 105 110 aaE dss hell CEE ssa des CEE yeah Unit aee saE dds dDE dds EEC dsa 384 Azp A1a Zeg Bie Rgo Cha1 Bie Cha1 Tgr 11th H15 C1u C1u C1u Pb A1a 115 120 125 saa dds dds acE STS das CEE food Eas aaE CEE asa Eee aee DEER yeah 432 C1p C1u C1u Tht Rgo Azr Bie Agd Tug Azp Bie Tht Pb 11th Ya1 C1 and

- 91 008007

130 135 140

sas Esd des aaE aec dds garden ssa aee aec dsa dkd hell DEER dss EAE 480 Bottom Zeg Ya1 Azp Not C1u ΘΙη Rgo Not Not A1a Ya1 Zeg Ya1 A1a Tug 145 150 155 160 cde cEC ddk sce cdd ddk EEC EEC aaE ddd des dad cEC dss aaE dad 528 Agd Bie C1u Rgo Tgr C1u Pb Pb Azp C1u Ya1 C1 and Bie A1a Azp C1 and 165 170 175 dda Esd EEA aaE cEC ddd eat aad das garden sds ccd dss eat saE cdd 576 C1u Zeg Bie Azp Bie C1u Bie Bz Azr ΘΙη Agd Bie A1a Bie Bottom Tgr 180 185 190 dkd aah dad aas aee dsa ddk EEC ddk dds das sce hell aah des dkd 624 Ya1 Bz C1 and Azp Not A1a C1u Pb C1u C1u Azr Rgo Zeg Bz Ya1 Ya1 195 200 205 aee Eas dda saa hell dss dds Ess yeah hell dkd dda Eas saa aec sds 672 Not Tug C1u ΘΙη Zeg A1a C1u Zeg C1 and Zeg Ya1 C1u Tug ΘΙη Not Agd 210 215 220 grandfather Eas aas dds food yes das ddd cEC EEC sds dda dds aU aU dad 720 A1a Tug Azp C1u Agd Azr Azr C1u Bie Pb Agd C1u C1u MeE MeE 61and 225 230 235 240 Ess dds grandfather dkd EEA CCE dds hell dss Food aas cEC ass cdd asa EAE 768 Zeg C1u A1a X7a1 Bie Rgo C1u Zeg A1a Bie Azp Bie Tht Tgr Tht Tug 245 250 255 dad sce cdd EEC garden saa aaa dsa das dad dsa dda Food Ess garden ass 816 C1 and Rgo Tgr Pb C1p ΘΙη Not A1a Azr 61and A1a C1u Suz Zeg ΘΙη Tht 260 265 270 ass sds aah eat das kde cea sds sds asd sss EEC asa des cea aas 864 Tht Agd Bz Bie Azr Suz Bie Agd Agd Tht Rgo Pb Tht Ya1 Bie Azp 275 280 285 aas aee eat aas ass ass dss aas das asd asd sce Eas aas cdd add 912 Azp Not Bie Azp Tht Tht A1a Azp Azr Tht Tht Rgo Tug Azp Tgr Agd 290 295 300 sss asa dkd das ddk das EEC yeah grandfather food EAE sss hell dad saa cEC 960 Rgo Tht Ya1 Azr C1u Azr Pb Ya1 A1a Agd Tug Rgo Zeg C1 and ΘΙη Bie 305 310 315 320 das asa dda das EEC des aah yeah ssa aec aaa aec dds Eas ass asd 1008 Azr Tht C1u Azr Pb Ya1 Bz Ya1 Rgo Not Not Not C1u Tug Tht Tht 325 330 335 das yeah dda asa asa dad Food ssa yeah ssa dkd aas ass ass dss yeah 1056 Azr C1 and C1u Tht Tht C1 and Suz Rgo C1 and Rgo Ya1 Azp Tht Tht A1a C1 and 340 345 350 EEA aah yeah Eas cEC hell Esa asa asa ass Eas dds cdd dss cEC das 1104 Bie Bz C1 and Tug Bie Zeg Zeg Tht Tht Tht Tug C1u Tgr A1a Bie Azr 355 360 365

- 92 008007

kea garden dka dka css sneaker SCS skd das SCS cas sss aas ace ace css 1152 Run C1p Ya1 \ 7a1 Zeg Zeg Bie Bie Azr Bie Tug Rgo Azp Tht Tht Zeg 370 375 380 cx dds ax ssa ksa css yeah yeah SCS dds dds aas dke ace cx ssa 1200 Pb C1u Not Rgo Zeg Zeg 31and C1 and Bie C1u C1u Azp Ya1 Tht Pb Rgo 385 390 395 400 garden sss cas dds dss dsa cx sds garden asd dsa dsa cas cas dds das 1248 C1p Rgo Tug C1u A1a A1a Pb Agd C1p Tht A1a A1a Tug Tug C1u Azr 405 410 415 dss garden cx aka dss grandfather asd sds cas ace cdk dad ska cdd grandfather dsa 1296 A1a C1p Pb 11th A1a A1a Tht Agd Tug Tht Suz C1 and Bie Tgr A1a A1a 420 425 430 sack aas skd asa dsa as kde cas food cx aas ace aad asa das duck 1344 Bottom Azp Bie Tht A1a Tug Suz Tug Agd Pb Azp Tht Bz Tht Azr Azr 435 440 445 cas aas add yeah yeah dds dkd grandfather sack cx sneaker das dkd ax cx ax 1392 Tug Azp Agd C1 and C1 and C1u Ya1 A1a ΗΪ3 Pb Zeg Azr Ya1 Not Pb Not 450 455 460 cx aas aas ekk aac ddk as ddd cx adk ssd aas ssd cx ace aac 1440 Pb Azp Azp Bie Azp C1u Tug C1u Pb Zeg Rgo Azp Rgo Pb Tht Azp 465 470 475 480 Dec ssa dad hell as ask dad ekk hell cas SCS akd css dds sneaker cdd 1488 A1a Rgo C1 and Zeg Tug Tht C1 and Bie Zeg Tug Bie Mek Zeg C1u Zeg Tgr 485 490 495 ax hell cx ask aac adk skd duck ssk aac aad cdd ask ddk sds dda 1536 Not Run Pb Tht Azp Zeg Bie Azr Rgo Azp Bz Tgr Tht C1u Agd 61u 500 505 510 add aas Dec asd aad asd dad aac cdd sss dkd as duck skd dad aac 1584 A.Z p A1a Tht T, 70 Tht C1 and Az p TTG Rgo Ya1 T, 7T ~ Δ cn Bie SI A.zp 7 _ 7. _u Ζ- 515 520 525 sss ccd adk akd ax cdd duck grandfather aac dke ask csd as grandfather grandfather ssd 1632 Rgo Bie Zeg Mek 11th Tgr Azr A1a Azp Ya1 Tht Zeg Tug A1a A1a Rgo 530 535 540 duck ask cdd caustic aad dad ddk acc grandfather ccd acc aac Dec aac sdd add 1680 Azr Tht Tgr Agd Bz C1 and C1u Not A1a Bie Not Azp A1a Azp Agd Agd 545 550 555 560 grandfather as garden add kda 1695

A1a Tug C1p Agd <210> 33 <211> 564 <212> PROTEIN

- 93 008007 <213> Azregd Shiz pideg <400> 33

MeE Bz C1u MeE Bie Rgo Tht Bie Zeg Tgr Ley A1a Ley C1u MeE A1a 1 5 10 fifteen Zeg Bie A1a Tht Suz Tht Azp Rgo Ya1 A1a C1p Tht Bz Azp C1u Zeg 20 25 thirty Tug Tug C1u Ya1 Tug MeE Rgo C1p Tug Azp C1 and Azr Tug Pb Bie C1u 35 40 45 11th Rgo Pb A1a Bz Rgo Rgo Bie A1a Bottom Bie Agd Tgr A1a Azp Rgo fifty 55 60 C1 and Zeg Bie Azp C1 and Zeg Tgr Zeg C1u Bie Agd Rgo A1a Tht C1u Tug 65 70 75 80 A1a MeE C1 and Suz 11th C1u Tug C1u Zeg Azr C1p Bz C1u Tug Bie C1p 85 90 95 Zeg C1 and Azr Suz Bie Tug Bie Azp Ya1 Ya1 Agd Rgo A1a C1 and Tug Azr 100 105 but Azp A1a Zeg Bie Rgo Ya1 Bie Ya1 Tgr 11th Bottom C1u C1u C1u Pb A1a 115 120 125 61p C1u C1u Tht Rgo Azr Bie Agd Tug Azp Bie Tht Pb Not Ya1 C1 and 130 135 140 Bottom Zeg Ya1 Azp 11th C1u C1p Rgo Not Not A1a Ya1 Zeg Ya1 A1a Tug 145 150 155 160 Agd Bie C1u Rgo Tgr C1u Pb Pb Azp C1u Ya1 C1 and Bie A1a Azp C1 and 165 170 175 C1u Zeg Bie Azp Bie C1u Bie Bz Azr C1p Agd Bie A1a Bie Bottom Tgr 180 185 190 Ya1 Bz C1 and Azp 11th A1a C1u Pb C1u C1u Azr Rgo Zeg Bz Ya1 Ya1 195 200 205 11th Tug C1u C1p Zeg A1a C1u Zeg C1 and Zeg Ya1 C1u Tug Θΐη 11th Agd 210 215 220 A1a Tug Azp C1u Agd Azr Azr C1u Bie Pb Agd C1u C1u MeE MeE C1 and 225 230 235 240 Zeg C1u A1a Ya1 Bie Rgo C1u Zeg A1a Bie Azp Bie Tht Tgr Tht Tug 245 250 255 C1 and Rgo Tgr Pb C1p C1p 11th A1a Azr C1 and A1a C1u Suz Zeg C1p Tht 260 265 270 Tht Agd Bz Bie Azr Suz Bie Agd Agd Tht Rgo Pb Tht Ya1 Bie Azp 275 280 285 Azp 11th Bie Azp Tht Tht A1a Azp Azr Tht Tht Rgo Tug Azp Tgr Agd 290 295 300 Rgo Tht Ya1 Azr C1u Azr Pb Ya1 A1a Agd Tug Rgo Zeg 61and C1p Bie 305 310 315 320

- 94 008007

Azr Tht C1u Azr Pb 325 Ya1 Bz Yes 1 Rgo 11th 330 Not 11th C1u Tug Tht 335 Tht Azr C1 and C1u Tht Tht C1 and Suz Rgo C1 and Rgo Yes 1 Azp Tht Tht A1a C1 and 340 345 350 Bie Bz C1 and Tug Bie Zeg Zeg Tht Tht Tht Tug C1u Tgr A1a Bie Azr 355 360 365 Zeg C1p Yes 1 Yes 1 Zeg Zeg Bie Bie Azr Bie Tug Rgo Azp Tht Tht Zeg 370 375 380 Pb C1u 11th Rgo Zeg Zeg C1 and 61and Bie C1u C1u Azp Ya1 Tht Pb Rgo 385 390 395 400 C1p Rgo Tug C1u A1a A1a Pb Agd C1p Tht A1a A1a Tug Tug C1u Azr 405 410 415 A1a C1p Pb 11th A1a A1a Tht Agd Tug Tht Suz C1 and Bie Tgr A1a A1a 420 425 430 Η13 Azp Bie Tht A1a Tug Suz Tug Agd Pb Azp Tht Bz Tht Azr Azr 435 440 445 Tug Azp Agd C1 and C1 and C1u Ya1 A1a Bottom Pb Zeg Azr Yes 1 11th Pb 11th 450 455 460 Pb Azp Azp Bie Azp C1u Tug C1u Pb Zeg Rgo Azp Rgo Pb Tht Azp 465 470 475 480 A1a Rgo C1 and Zeg Tug Tht C1 and Bie Zeg Tug Bie Me! Zeg C1u Zeg Tgr 485 490 4 95 Not Zeg Pb Tht Azp Zeg Bie Azr Rgo Azp Bz Tgr Tht C1u Agd C1u 500 505 510 Agd Azp A1a Tht Bz Tht 61and Azp Tgr Rgo Ya1 Tug Azr Bie C1 and Azp 515 520 525 Rgo Bie Zeg Me! 11th Tgr Azr A1a Azp Ya1 Tht Zeg Tug A1a A1a Rgo 530 535 540 Azr Tht Tgr Agd Bz C1 and C1u 11th A1a Bie 11th Azp A1a Azp Agd Agd 545 550 555 560

A1a Tug ΘΙη Agd <210> 34 <211> 2371 <212> DNA <213> AzregdShiz ptdeg <400> 34 ddasdd! d! with adaRadadas srrddaadd sRdaassas dddsasasddd60 sasdrrdadd asssRdsaRd ssddrdRaRds sddaRaaRdd sadaRaRss sddsRaaRrddddsdasddsdasddsdasddsdasddsdasddsdasddsdasddsdasddsdasddsdasddsdasdasddsdasddsdasddsdasddsdasddsdasds daRdRRRsaa180

RdaadsRssaaas !!! asad RdsRaddsRd RaaasdRda! RARAARSASD ARDRAAARRDA 240

- 95 008007

RRARSARSRA SaasRsaass sssdsassaa daaaRdaaRs SRRSRDSRSDD aadaaaaada 300 sdsaRRssa daadaasRRR RRssRadaRa asaaasadra ARSADRSSAR ssdRssssRda 360 Rssssss ARSDAASSRS ddraadasds Rsdasssaaa aassadassd asaadsRRRR 420 saassrssssr aaasdaaasa asddsrdrdr RdaRsdRdaa srdrdrrdss RaRassaaRa 480 Rada aRaddaRada aaRRdadRRR assdrddaaa addssssds RasadRRRaa 540 RRaassaass sassassa sssaaddsas SRDRaasadd dasRasRdRs sadadadrd 600 ARADREDDSRA drdddsadas DRSDDARDAA sRssddaada sssRaasRda RasdRadaas 660 saRsdRdaas ssRddRRRdR sssRadRRsd ddddsdsRaRR sssadsdrad aaaadsdds 720 dARssRsRda aasadRRRRs ssssddddd RasRRdsRad RADRASRASRA RsaRasaaa 780 dradrdradr ddasaadass addRsRasR asRaRRadRR adRRsRdRRR sarsssdasr 840 saaRRRRdsd Rsssaadass SRDDDRRRDRS sddddss Rrdssssaasa surrender 900 ddadRaadRa Rdddddda sRaassRsdd aaRaRRsRRd RsRsRRRRRa DRASRARSRA 960 DSSRRRADRD adasRaRads adRadRdaas sadadadad dadadaRDRs RaRaRaadRa 1020 GardenRsdRada Rssss Raaasa RdassadsRR SadasRsada sRsdadsads GardenRadsadRs 1080 gardenRssasRs RRRsaRRsRs asssssrrsrr RAISARSRRA saaRaaRRRs RARRsaaRaa 1140 DRSRDSADRD sassassass asasRRsaR RsRsRdadad ARaaaaaaRa asaaaaRds 1200 SSSSSRsaaa Rsssrssrss Rsddsdssrc ssRddssass SRSDSSSRRRR SssassssasR 1260 ddsaassdas dssdaaaass RsRassdsad RsaaRRsds ADDDSDSRSA sadssaasda 1320 asRsdadsad ddaadsRds addardrdas RsRsaRsRRR dsdadddddr saasRadadsR 1380 RdddaaRaRd DRARDSRRDR Rdss RassssRasR aRacRaRssss adaasaRass 1440 aadsasasa Rsasaaaasa RdRddadssa ddadsraars adrddrddrd ARADARARAR 1500 dradddsass DRAaRsdss SSSSRSRSRSRD sdasaass aaaRssaaas RsddaRssda 1560 SaaadRsdss Rdssaddd Rsddsdssa a rassadsdss ddasrdsrds adaa 1620 dssssadaas AssdaRssdd ddadRaRsRs sdsdsdaad SadRdRRsd addddsdaa 1680 RsdaadRdR sssaaRasRa adaRrdRRds ddddddrRaR addRaRaRaR sssrrrssss 1740 RRRassRRss sssaRaRsaa RdsRadadds aaaddaaRaR sARdsRaaRd RadaRdRRdd 1800 ddaaasadRs aaddaadsds RdRdaRRdas aasdssds aadaas sassassdrd 1860 aaadassaad Rdaadddrdr sdRdsRsRRs dddrRsasda yeah ddaRsasddd 1920 gardenRssssRa ARRASSSSRAA ddaRadasrd aaddRRRaRR drdssdrddd SDRDSRddrs 1980 RdRdaRdaRa sdRRddRRdR RdddsdaRd saRsRdasdR ards RdsdddrdaR 2040 dsddsdadsR RRRRddssda daaddrsad RSRRssadRa DRRsdasRas RadSrssads 2100 RsddaRdssd sdadRadRRs ARDSRDSRDSD dddasdrsdr sdRsddddrr DRSDDDASRD 2160 RsRRsRRRRR Rrddaddrcr SRaaaRadaa RadaRada RdadRddRss dddrddddddr 2220 Raddddda DRRDRRRSDRRR RsRsRRddaR yesRRRadRRR ssdRRaRRRa SRRadsRddd 2280 ARaADARaRa RddRasaRad RADRADRDRD RRdRdaRdRR ARRsRddsRa RRRRdRasas 2340 RRRdasaRda RsRdsdaRaR dddddsdrc a 2371

<210> 35 <211> 789 <212> DNA <213> Azregd Schiz pideg

- 96 008007 <220>

<221> SBZ <222> (1) .. (789) <400> 35

akd dss sss SCS aah css SCS SCS SCS dds dss css skd dss ace SCS 48 Mek Aba Rgo Bie Bz Zeg Bie Bie Bie Sue Aba Zeg Bie Aba TNG Bie 1 5 10 fifteen dss ekk css ace ssa skd dsa ace das dss yeah aas SCS cas dsa caustic 96 Aba Bie Zeg TNG Rgo Bie Aba TNG Azr Aba SI Azp Bie Tug Aba Agd 20 25 thirty saa cx dds asd dds cake asa dss aas yeah SCS dad garden dda hell kde 144 Bn RNe Sue TNG Sue Zeg TNG Aba Azp SI Bie SI Bn Sue Zeg Suz 35 40 45 ... 1 to aad at a c yiwu ace and Cc a and c these usd add ddd bc E.S and dad Smiling ddd eat X s Bz Azr Yb TNG Bie 11th RNe Aba Agd Sue Zeg TNG SI Bie Sue Azp fifty 55 60 akd dds ace dka ax dds sss ssk SCS kde das aas skd aah css aah 240 Mek Sue TNG Yb Not Sue Rgo Rgo Bie Suz Azr Azp Bie Bz Zeg Bz 65 70 75 80 SCS dda css das aah dke dss kde garden ddk dke dds dds saa cas hell 288 Bie Sue Zeg Azr Bz Yb Aba Suz Bn Sue Yb Sue Sue Bn Tug Zeg 85 90 95 dss dda SCS dkd garden aac dss skd sss garden aas ace duck ssd ddd adk 336 Aba Sue Bie 7ab Bn Azp Aba Bie Rgo Bn Azp TNG Azr Rgo Sue Zeg 100 105 110 ax css dss grandfather aad garden akd cx dad dad grandfather aac sneaker aad cdk sss 384 Not Zeg Aba Aba Bz Bn Mek RNe SI SI Aba Azp Zeg Bz Suz Rgo 115 120 125 aac ask aad acc dkk grandfather ddk ddk as adk saa dda hell Dec dkd acc 432 Azp TNG Bz 11th Yb Aba Sue Sue Tug Zeg Bn Sue Zeg Aba Yb Not 130 135 140 das aas dss dkd saa yeah SCS hell ace ace dkd aah das saa dkd aad 480 Azr Azp Aba Yb Bn SI Bie Zeg Tht TNG Yb Bz Azr Bn Yb Bz 145 150 155 160 ddk dke dkd SCS cx ddd cx asd hell aas dkd garden duck sas ddd garden 528 Sue Ya1 Yb Bie RNe Sue RNe TNG Agd Azp Yb Bn Azr Hb Sue Bn 165 170 175 ax ssk aac cas ssk aad duck das dkd aad dkk as cdk dss dkd dds 576 Not Rgo Azp Tug Rgo Bz Azr Azr Yb Bz Yb Tug Suz Aba Yb Sue 180 185 190 duck skd dke cdk duck duck asd ccd dkk dkk asd grandfather akd sack skd asd 624 Azr Bie Yb Suz Azr Azr TNG Bie Yb Yb TNG Aba Mek Hb Bie TNG

97 008007

195 200 205

as dds akd duck grandfather ddk duck grandfather grandfather hell kkk ccd dss dad aad dd 672 Tug C1u Mek Azr A1a C1u Azr A1a A1a Zeg Pb Bie A1a C1 and Bz Ya1 210 215 220 garden cake css adk adk sneaker ask ask hell css hell sneaker duck dss grandfather adk 720 C1p Zeg Zeg Zeg Zeg Zeg Tht Tht Zeg Zeg Zeg Zeg Azr A1a A1a Zeg 225 230 235 240 adk ksa cake Dec grandfather ddd asd sneaker sneaker sneaker ddd ccd sneaker dda skd cake 768 Zeg Zeg Zeg A1a A1a C1u Tht Zeg Zeg Zeg C1u Bie Zeg C1u Bie Zeg 245 250 255 cake kkk kkk dda ddk SCS kaa 789 Zeg Pb Pb C1u C1u Bie

260

<210> 36 <211> 262 <212> PROTEIN <213> AzregdShiz pddeg

<400> 36

Mek A1a Rgo Bie Bz Zeg Bie Bie Bie C1u A1a Zeg Bie A1a Tht Bie 1 5 10 fifteen A1a Bie Zeg Tht Rgo Bie A1a Tht Azr A1a C1 and Azp Bie Tug A1a Agd 20 25 thirty C1p Pb C1u Tht C1u Zeg Tht A1a Azp C1 and Bie C1 and C1p C1u Zeg Suz 35 40 45 Bz Azr Ya1 Tht Bie 11th Pb A1a Agd C1u Zeg Tht C1 and Bie C1u Azp fifty 55 60 Mek C1u Tht Ya1 11th C1u Rgo Rgo Bie Suz Azr Azp Bie Bz Zeg Bz 65 70 75 80 Bie C1u Zeg Azr Bz Ya1 A1a Suz C1p C1u Ya1 C1u C1u C1p Tug Zeg 85 90 95 A1a C1u Bie Ya1 C1p Azp A1a Bie Rgo 61p Azp Tht Azr Rgo C1u Zeg 100 105 110 11th Zeg A1a A1a Bz C1p Mek Pb C1 and C1 and A1a Azp Zeg Bz Suz Rgo 115 120 125 Azp Tht Bz 11th Ya1 A1a C1u 61u Tug Zeg C1p C1u Zeg A1a Ya1 11th 130 135 140 Azr Azp A1a Ya1 61p C1 and Bie Zeg Tht Tht Ya1 Bz Azr C1p Ya1 Bz 145 150 155 160 C1u Ya1 Ya1 Bie Pb C1u Pb Tht Agd Azp Ya1 C1p Azr H13 C1u C1p 165 170 175

- 98 008007

11th Rgo Azp Tug 180 Rgo Bz Azr Azr Ya1 185 Bz Ya1 Tug Suz A1a 190 Ya1 C1u Azr Bie Ya1 Suz Azr Azr Tht Bie Ya1 Ya1 Tht A1a Me Bottom Bie Tht 195 200 205 Tug C1u MeC Azr A1a C1u Azr A1a A1a Zeg Pb Bie A1a C1 and Bz Ya1 210 215 220 C1p Zeg Zeg Zeg Zeg Zeg Tht Tht Zeg Zeg Zeg Zeg Azr A1a A1a Zeg 225 230 235 240 Zeg Zeg Zeg A1a A1a C1u Tht Zeg Zeg Zeg C1u Bie Zeg C1u Bie Zeg 245 250 255

5g Ре РЬе С1у С1у Лей

260 <210> 37 <211> 2981 <212> DNA <213> Azregd Schiz pideg <400> 37

Bssbssss bdsc ddsadaasss sddadasaas ssasasaaa dsassssaaad 60 saaaa'dasa Give up Baaaaaaaaaaaaaaaaaa share Bdssssss sasbddas 120 cssbss Babs sssddsaaas sssaaa ssds Bdaddss adsad 180 dhhhhhh here AsdaSaaaa HERE Bdscssssss Bcdbc 240 ssddddsaa Bdsads assaaaddd sssdssssas dssssss asddssaadd 300 Bsdsdaasdd SASABALD ddaddasaa bdsd bitch • SELL 360 yes Kindergarten bastard asbdsd sasddd garden 420 asdaaads dadddsdad sdsddsda add-ons saaSaSsD daddasd 480 dddddds dsaaesscSs Bsdadadss addsss adsbss Bdsdb 540 aaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaa CsdSadas give up Sddassssas adssdaads 600 Bbc SdaaSdSSa Bhhhhhhhhhh Bsdsaaa yes hessssss 660 ddddsddd abasddad dddssss Give up hell adsdssasaa 720 sahdssdsd abdssss acssaaaaa yes Bastard sdbdada 780 Assadas csdds Bdsdb ddaaadssd Са д Ь с Ь д д SadSaaas 840 Baaaaaaaaaaaaaaaaaaa sddsadddd HERE LssadSsaad Bc'dddddsas SddsaaSass 900 aaaaaaaaaaaaaaaaa SsadddaEsa aadbad SSSASSDda Ssaaddadah Babsdds 960 Bsddaddad assassah yes Blddddd sdssddads yes 1020 ddSaSsassass Bdsads sddsddd dasda dddas Bssddd adda 1080 dadSsaddad ddabs adsSadSssa dssaaaaaa ssdddassa adcdoc 1140 yes sdddsaad sdddsdss dasdadad bldb dddssdsds 1200 yes Bastard yeah bsaassassa ssaddyaaa ssddasss 1260 aabdsdds ssda Fucking alsaddas ddddsadss sadassad 1320 aaaaaaaaa Bldt css daddass alassdasda adddasadss 1380

- 99 008007

EEEdddss saddeaesaa sassadasadad dEKESEaEd saeaesesasas addAdeFood 1440 yeahhhhhhhh EaasaEssed aaadaasssss adadsadsaa aasdddsaaa ESECASEDDS 1500 hell eddsdaa YesEdEss adEssssss Sassda Esdss saddaaaess YadsadSea 1560 COUNTRY FOOD ssadasUdd dsa essssda ЕЕсЕЕсдддЕ dasasadad Essssessaa 1620 addsassaa Edddsdsda scedessaaa sdsadddddas EaEaEaaeds Edassaassd 1680 Yesdssdasaa Food ddasadadas SESDASDASD dsdEasEdEe eesdaeesaa 1740 Eaeddseddsd dssda ssaessedess Eddssssass saEEEEad AADEEDSEEE 1800 EdeaeEsaas aasa dasesdddea ssaEeasdda AADSSDEESD saddda edss 1860 surrenderEssEas deasadseaa dsaas dassadza Eddsa esse EsaEssassa 1920 EEEadass aaEEsddds Esaaddas EU ADSEDEASAD EddsaassdE addddaadda 1980 Esadssddee YESEADEADE FOOD Foodstuff EasadsEasa Eddadssada 2040 sasd eddsdd aaddadddda EsdasEaEaE saaEessdED dssaasdsde asEddSdaEa 2100 adseezaeds EaEsdaaaas AsaFoodFood adsdadadad Eeeeeeee ssdFoodFood 2160 EEDSSEDDSDA daddaaaadd EEaaddsaaa saadda addddd addsessecea 2220 hell dEADEAD Food SESDEEEadaa dsaaaeasad AEDSSAEACE 2280 EssEdsaasa aassssadaas Eedeeaaa saadeeeee saaasdda DEADESDDE 2340 ESSDA aaaaadsaad ESSEADSDE Yesdadddaa ssaadasass sasasadadd 2400 adsaEeasda aEessaaaee assaaadsse deaaaaaaaa aassadzada dassdsseaaa 2460 EEADESAASE asadsa EECAEEDEAS sEdsaaddas CEEEasasds DEDDESESASSS 2520 aEdeEassaad ssaadssaas ddssaada sdaaaaaaas saadaddaaa ssasssesses 2580 saadaa esaa daassssaddd ddEsaadada aEcEddaads yes yeah ESSEEEEEEE 2640 IEEE Eassadada ddddaddad ddsdEesaes DESAAESADE ADEADE 2700 ssdsss EdEdeEadEs EaEaEssdda ssaEdddda sEADEeaEs aEasdaEssa 2760 EaassaadES cssda seasddseas saaaasEada aaaaaaaaaa EaEeddadEa 2820 sdaaaddaas EaaassaaEa seaaaaaaa aaaaaaadad Eaaadaaaaa adadEaaaaa 2880 assaads yeahhhhhhh AEEEssssed YEARS saEssssea cceaeeda 2940 assdddEesa ssaaedasad sdda AEEEEEDASES d 2981

<210> 38 <211> 1686 <212> DNA <213> Azregd Schiz nLdeg <220>

<221> C3 <222> (1) .. (1686) <400> 38

aU cea aad cEC DSE DEER DSE CEE Eee Esd EEA CEE dss grandfather dds aaE 48 MeE Bie Bz Bie Ala WAL Ala Bie Pb Zeg Bie Bie Ala WAL SLU Azp 1' 5 10 fifteen dsa grandfather ssa ace aah grandfather dss cde Ess asd dss hell sce asd dss aad 96

- 100 008007

A1a A1a Rgo TNG 20 Bz Ya1 A1a Agd Zeg 25 TNG A1a Zeg Rgo TNG thirty A1a Bz dkk sds aas ddk asa as dke dda dkd asa aac grandfather sack cas garden saa 144 Ya1 Agd Azp C1u TNG Tug Ya1 C1u Ya1 TNG Azp A1a Nhz Tug 61p C1p 35 40 45 duck cx kkk ccd dda akd ssd as dss garden garden sec kka ddk das ccd 192 Azr RNe RNe Bie C1u Mek Rgo Tug A1a C1p C1p Rgo Bie C1u Azr Bie fifty 55 60 sds cx asd dkd sec garden css skd aas yeah hell cdd adk dds dad sds 240 Agd RNe TNG Ya1 Rgo C1p Zeg Bie Azp C1 and Zeg Tgr Zeg C1u C1 and Agd 65 70 75 80 das grandfather aad yeah as css aac ax cdk dka dda cas ddk ace das sneaker 288 Azr A1a Bz C1 and Tug Zeg Azp 11th Suz Ya1 C1u Tug C1u TNG Azr Zeg 85 90 95 acc cdd cas ssa garden css yeah Dec cdk ska ace ccd aac dke ax eating 336 11th Tgr Tug Rgo C1p Zeg C1 and A1a Suz Bie TNG Bie Azp Ya1 11th Agd 100 105 110 duck cake cake dsa aac dad aas sneaker aad SCS sss dkd dds dke cdd aka 384 Azr Zeg Zeg A1a Azp 61and Azp Zeg Bz Bie Rgo Ya1 C1u Ya1 Tgr 11th 115 120 125 sack dda ddk dds cx kkk dad dda cake adk Dec das garden sds cas aas 432 NKZ C1u C1u C1u RNe RNe C1 and C1u Zeg Zeg A1a Azr C1p Agd Tug Azp 130 135 140 akd css grandfather acc dkk dss aas css as aad ax dda aad sed cx acc 480 Mek Zeg A1a 11th Ya1 A1a Azp Zeg Tug Bz 11th C1u Bz Rgo RNe 11th 145 150 155 160 Dec dke hell kka aas as sds ekk sneaker dsa cdd dds cx ccd adk css 528 A1a Ya1 Zeg Bie Azp Tug Agd Bie Zeg A1a Tgr C1u RNe Bie Zeg Zeg 165 170 175 adk saa dke cdd dds ask dds aac ace aac ska ddk ax add duck saa 576 Zeg C1p Ya1 Tgr C1u TNG C1u Azp TNG Azp Bie C1u 11th Agd Azr C1p 180 185 190 add kka dsa SCS sack cdd ax aad dad aac ax grandfather dsa cx dda dda 624 Agd Bie A1a Bie ΗΪ3 Tgr 11th Bz C1 and Azp 11th A1a A1a RNe C1u C1u 195 200 205 das ssa duck aad ax ask ax cdd dds yeah cake dss dda grandfather akd css 672 Azr Rgo Azr Bz 11th TNG 11th Tgr C1u C1 and Zeg A1a C1u A1a Mek Zeg 210 215 220 dkd ddk as sas ekk dsa dsa Us dds ddk add das duck dda SCS cx 720 Ya1 01y Tug ΗΪ3 Bie A1a A1a Tug C1u C1u Agd Azr Azr C1u Bie RNe 225 230 235 240 caustic dda dda acc akd dad ksa dda ddd ask acc dsa Dec adk ssa dss 768 Agd C1u C1u 11th Mek C1 and Zeg C1u C1u TNG 11th A1a A1a Zeg Rgo A1a

- 101 008007

245 250 255

aas EAE ace ddd Eas saa grandfather sas EAE yes dad CEC grandfather ddk saa des 816 Azp Tug Tht C1u Tug C1p A1a ΗΪ3 Tug Azr C1 and Bie A1a C1u C1p Ya1 260 265 270 dDE Food Ess das yeah yeah yes Esd Food garden Food eat sds yeah DEER ssd 864 C1u Suz Zeg Azr Ya1 Ya1 Azr Zeg Bie C1p Suz Bie Agd C1 and Ya1 Rgo 275 280 285 EEC dad aah Food aas DSE DSE cEC aas ace ace hell dDE aas Esd yes 912 Pb (Neither Bz Bie Azp A1a A1a Bie Azp Tht Tht Zeg (Well Azp Zeg Azr 290 295 300 EEC aaE EEC ddd sss des aee yes dda yes aaa aec add das Unit dds 960 Pb Azp Pb C1u Rgo Ya1 Not Azr C1u Azr Not Not Agd Azr Tgr C1u 305 310 315 320 hell cEC garden cea das aad saE yeah EEC des aah des sce aee CEE dsa 1008 Zeg Bie C1p Bie Azr Bz Ηίε C1 and Pb Ya1 Bz Ya1 Rgo Not Bie A1a 325 330 335 dDE ace aaE ace das yeah ddd asa dss Eee ddd sss asa dDE aec aas 1056 (Well Tht Azp Tht Azr C1 and C1u Tht A1a Pb C1u Rgo Tht (Well Not Azp 340 345 350 asd asa dad dad EEC EAE dsa EAE cEC asa yes dds yeah ECE dda EEC 1104 Tht Tht C1 and C1 and Pb Tug A1a Tug Bie Tht Azr 61u (AI Zeg C1u Pb 355 360 365 garden cea sss sss asd aec dss garden yeah aec eat garden cEC Eas sce yes 1152 C1p Bie Rgo Rgo Tht Not A1a C1p 61and Not Bie C1p Bie Tug Rgo Azr 370 375 380 yes ssa dsa eat dds aec sss yeah Eee cEC dDE das acE hell des ssd 1200 Azr Rgo A1a Bie C1u Not Rgo C1 and Pb Bie C1u Azr Tht Agd Ya1 Rgo 385 390 395 400 Ess aah dds Eas saa Unit sdd sds ace Food dsa Eas dsa ddd das EAE 1248 Zeg Bz C1u Tug C1p Tgr Agd Agd Tht Suz A1a Tug A1a 61u Azr Tug 405 410 415 yeah aU saE dss aas cde sds food saa Food dad grandfather Unit asa dad ace 1296 Ya1 MeE H15 A1a Azp Agd Agd Agd C1p Suz C1 and A1a Tgr Tht (AI Tht 420 425 430 Esd asd asd grandfather Eas Food EAE food EEC aaE aU cde grandfather dss yes des 1344 Zeg Tht Tht A1a Tug Suz Tug Agd Pb Azp MeE Agd A1a A1a Azr Ya1 435 440 445 sss aec eat ECE dds dss ace saE Eee yeah yeah DEER DSE Eee yeah EEC 1392 Rgo 11th Bie Zeg C1u A1a Tht ΗΪ3 Pb C1 and (Neither Ya1 A1a Pb Ya1 Pb 450 455 460 aas aas aee dsa dda cEC ddd Eas saE Eas dda aad ssd EEC dsa ddd 1440 Azp Azp 11th A1a (Well Bie C1u Tug ΗΪ3 Tug C1u Bz Rgo Pb A1a (Well 465 470 475 480

- 102 008007

aU STS dad Ess Eas yeah garden cea hell aas Food aU ace hell aU Unit 1488 MeE Rgo C1 and Zeg Tug Ya1 C1p Bie Zeg Azp Bie MeE Tht Zeg MeE Tgr 485 490 495 dsa Ess EEC aec sas yes EEA das sce aaE Esd dds aec aad das Esa 1536 A1a Zeg Pb 11th Bottom Azr Bie Azr Rgo Azp Zeg C1u 11th Bz Azr Zeg 500 505 510 DSE yeah garden Unit saa ssd Eas ddd aad yes garden ssd DEER yes cea grandfather 1584 A1a Ya1 C1p Tgr C1p Rgo Tug C1u Bz Azr C1p Rgo Ya1 Azr Bie Ya1 515 520 525 Eee yes grandfather aaE des asd hell Eas hell Eas aU dad ssa das asd Unit 1632 Pb Azr A1a Azp Ya1 Tht Zeg Tug Zeg Tug MeE C1 and Rgo Azr Tht Tgr 530 535 540 edd aad dad ddd aec das EAE aec aaE Ess grandfather dss aas grandfather Eas Unit 1680 Agd Bz C1 and C1u 11th Azr Tug 11th Azp Zeg Ya1 A1a Azp A1a Tug Tgr 545 550 555 560

Eaa food 1686 Agd

<210> 39 <211> 561 <212> PROTEIN <213> AzregdShiz pideg

<400> 39

MeE Bie Bz Bie A1a Ya1 A1a Bie Pb Zeg Bie Bie A1a Ya1 C1u Azp 1 5 10 fifteen A1a A1a Rgo Tht Bz Ya1 A1a Agd Zeg Tht A1a Zeg Rgo Tht A1a Bz 20 25 thirty Ya1 Agd Azp C1u Tht Tug Ya1 C1u Ya1 Tht Azp A1a Bottom Tug C1p C1p 35 40 45 Azr Pb Pb Bie C1u MeE Rgo Tug A1a C1p C1p Rgo Bie C1u Azr Bie fifty 55 60 Agd Pb Tht Ya1 Rgo C1p Zeg Bie Azp C1 and Zeg Tgr Zeg C1u C1 and Agd 65 70 75 80 Azr A1a Bz 01 and Tug Zeg Azp 11th Suz Ya1 C1u Tug C1u Tht Azr Zeg 85 90 95 11th Tgr Tug Rgo C1p Zeg C1 and A1a Suz Bie Tht Bie Azp Ya1 11th Agd 100 105 110 Azr Zeg Zeg A1a Azp 61and Azp Zeg Bz Bie Rgo Ya1 C1u Ya1 Tgr Not 115 120 125 Bottom C1u C1u C1u Pb Pb C1 and C1u Zeg Zeg A1a Azr C1p Agd Tug Azp 130 135 140

- 103 008007

MeE Zeg A1a Not ya1 A1a Azp Zeg Tug Bz Not O1u Bz Rgo Pb 11th 145 150 155 160 A1a Cha1 Zeg Bie Azp Tug Agd Bie Zeg A1a Tgr O1u Pb Bie Zeg Zeg 165 170 175 Zeg C1p Cha1 Tgr C1u Tht C1u Azp Tht Azp Bie C1u Not Agd Azr C1p 180 185 190 Agd Bie A1a Bie Bottom Tgr 11th Bz C1 and Azp 11th A1a A1a Pb O1u C1u 195 200 205 Azr Rgo Azr Bz Not Tht Not Tgr 01y 01and Zeg A1a C1u A1a MeE Zeg 210 215 220 Cha1 C1u Tug Bottom Bie A1a A1a Tug 31u 01y Agd Azr Azr C1u Bie Pb 225 230 235 240 Agd C1u 01 y Not MeE O1i Zeg C1u O1u Tht Not A1a A1a Zeg Rgo A1a 245 250 255 Azp Tug Tht C1u Tug C1p A1a Nyz Tug Azr C1 and Bie A1a C1u O1p Ya1 260 265 270 C1u Suz Zeg Azr Cha1 Cha1 Azr Zeg Bie C1p Suz Bie Agd C1 and Ya1 Rgo 275 280 285 Pb C1 and Bz Bie Azp A1a A1a Bie Azp Tht Tht Zeg C1u Azp Zeg Azr 290 295 300 Pb Azp Pb O1u Rgo Cha1 Not Azr C1u Azr 11th Not Agd Azr Tgr O1u 305 310 315 320 Zeg Bie C1p Bie Azr Bz Bottom 01and Pb Ya1 Bz Cha1 Rgo Not Bie A1a 325 330 335 C1u Tht Azp Tht Azr C1 and C1u Tht A1a Pb C1u Rgo Tht C1u Not Azp 340 345 350 Tht Tht C1 and C1 and Pb Tug A1a Tug Bie Tht Azr C1u 01and Zeg C1u Pb 355 360 365 C1p Bie Rgo Rgo Tht 11th A1a O1p C1 and Not Bie C1p Bie Tug Rgo Azr 370 375 380 Azr Rgo A1a Bie C1u Not Rgo E1i Pb Bie 01y Azr Tht Agd Ya1 Rgo 385 390 395 400 Zeg Bz C1u Tug O1p Tgr Agd Agd Tht Suz A1a Tug A1a C1u Azr Tug 405 410 415 Cha1 MeE H1z A1a Azp Agd Agd Agd C1p Suz C1 and A1a Tgr Tht O1i Tht 420 425 430 Zeg Tht Tht A1a Tug Suz Tug Agd Pb Azp MeE Agd A1a A1a Azr Cha1 435 440 445 Rgo 11th Bie Zeg 01y A1a Tht H13 Pb O1i C1 and Ya1 A1a Pb Cha1 Pb 450 455 460 Azp Azp Not A1a C1u Bie 01y Tug Bottom Tug C1u Bz Rgo Pb A1a C1u 465 470 475 480 MeE Rgo C1 and Zeg Tug Ya1 C1p Bie Zeg Azp Bie MeE Tht Zeg MeE Tgr

- 104 008007

485 490 495 A1a Zeg Pb 11th Nhz Azr Bie Azr Rgo Azp Zeg C1u 11th Bz Azr Zeg 500 505 510 A1a Ya1 ΘΙη Tgr ΘΙη Rgo Tug C1u Bz Azr ΘΙη Rgo Ya1 Azr Bie Ya1 515 520 525 Pb Azr A1a Azp Ya1 Tht Zeg Tug Zeg Tug MeE C1 and Rgo Azr Tht Tgr 530 535 540 Agd Bz C1 and C1u 11th Azr Tug 11th Azp Zeg Ya1 A1a Azp A1a Tug Tgr 545 550 555 560

Agd