DE69736526T2

DE69736526T2 - Therapeutische verwendung von stickstoffmonoxydinhibitoren

Info

Publication number: DE69736526T2
Application number: DE69736526T
Authority: DE
Inventors: Grigori Cold Spring Harbor ENIKOLOPOV; Natalia I. Cold Spring Harbor PEUNOVA; Boris Moscow KUZIN; Hollis Cold Spring Harbour CLINE; Tatiyana Michurina
Original assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Current assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Priority date: 1996-11-13
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2017-11-14
Also published as: US20030119905A1; EP0952828A2; AU5585598A; WO1998020865A2; EP0952828B1; ATE336240T1; DE69736526D1; US5977181A; CA2271729A1; WO1998020865A3; US6809117B2

Description

VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht den Nutzen der vorläufigen US-Anmeldung mit Serien-Nr. 60/030,690, eingereicht am 13. November, 1996, und den Nutzen der vorläufigen US-Anmeldung mit Serien-Nr. 60/045,411, eingereicht am 2. Mai, 1997.
REGIERUNGSUNTERSTÜTZUNG
Arbeit, die hierin beschrieben wird, wurde durch Beihilfe Nr. 5RO1NS32764 der National Institutes of Health unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten hat bestimmte Rechte in der Erfindung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Organentwicklung benötigt ein eng kontrolliertes Programm von Zellproliferation, gefolgt von Wachstumsarrest und Differenzierung und oft programmiertem Zelltod. Die Balance zwischen der Zahl von Zellteilungen und dem Ausmaß des folgenden programmierten Zelltods bestimmt die endgültige Größe eines Organs (Literaturübersicht von Bryant und Simpson, Quart. Rev. of Biol. 59: 387–415 (1984); Raft, Nature 356: 397–400 (1992)). Obwohl viel über die zelluläre Maschinerie, die den Zeitpunkt von Beginn und Ende der Zellteilung per se bestimmt, gut verstanden wird (Übersicht von Hunter und Pines, Cell 79: 573–582 (1994); Morgan, Nature 374: 131–134 (1995); Weinberg, Cell 81: 323–330 (1995)), ist wenig über die Signale bekannt, die einzelne Gruppen von Zellen und Organen das Wachstum bei der geeigneten Zellzahl und Größe beenden lassen. Ein besseres Verstehen der involvierten Signale liefert mögliche Ziele zum Manipulieren der zellulären Maschinerie, was in therapeutischen Vorteilen für eine Zahl von Zuständen resultiert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass Stickoxid (NO) ein wichtiger Wachstumsregulator in einem intakten, sich entwickelnden Organismus ist. Im Speziellen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Vermehren einer Population von hämatopoetischen Stammzellen, einschließlich Vorläufern von myeloiden, lymphoiden und erythroiden Zellen, im Knochenmark in einem Säuger, die in der Lage sind, normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen, wobei das Knochenmark mit einem Inhibitor von NO wie einem Inhibitor von Stickoxid-Synthase (NOS) in Kontakt gebracht wird, wodurch Knochenmark produziert wird, das eine erhöhte Population von hämatopoetischen Stammzellen aufweist, die in der Lage sind, normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen. Die Erfindung schließt nicht die industrielle oder kommerzielle Verwendung von menschlichen Embryonen ein. Das Verfahren kann in vivo oder ex vivo ausgeführt werden. Zusätzlich kann das Verfahren verwendet werden, Differenzierung von erythroiden Zellen und/oder myeloiden Zellen in dem Säuger zu verhindern. Das Verfahren kann darüber hinaus Inkontaktbringen des Knochenmarks mit mindestens einem Agens (z.B. einem hämatopoetischen Wachstumsfaktor) umfassen, das Differenzierung einer ausgewählten hämatopoetischen Stammzellpopulation induziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung eines Säugers, um eine Population von hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark des Säugers zu erhöhen, die in der Lage sind, normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen. In dem Verfahren wird das Knochenmark des Säugers mit einem Inhibitor von NOS in Kontakt gebracht, wodurch Knochenmark produziert wird, das eine erhöhte Population von hämatopoetischen Stammzellen aufweist, die in der Lage sind, normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen. Das Verfahren kann darüber hinaus Inkontaktbringen des Knochenmarks mit mindestens einem Agens umfassen, das Differenzierung einer ausgewählten hämatopoetischen Stammzellpopulation induziert.
In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Behandeln eines Säugers, um eine Population von hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark des Säugers zu vermehren, die in der Lage sind, normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen, wird Knochenmark, das transplantiert werden soll, erhalten, wobei das zu transplantierende Knochenmark von dem Säuger erhalten werden kann, der behandelt wird (autologe Transplantation), oder von einem anderen Säuger (heterologe Transplantation). Das zu transplantierende Knochenmark wird mit einem Inhibitor von NOS in Kontakt gebracht. Das Knochenmark, das transplantiert werden soll, wird in den Säuger, der behandelt wird, transplantiert, wodurch dem Säuger Knochenmark geliefert wird, das eine erhöhte Population von hämatopoetischen Stammzellen aufweist, die in der Lage sind, normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen. Das Verfahren kann darüber hinaus Behandeln des Säugers mit einem Inhibitor von NOS vor oder nach Transplantieren des Knochenmarks umfassen. Alternativ kann das Verfahren darüber hinaus Behandeln des Säugers mit einem Enhancer von NOS vor oder nach Transplantieren des Knochenmarks umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren des Erhöhens einer Population von sich teilenden Zellen in einem Gewebe eines Säugers, umfassend Inkontaktbringen der Zellen mit einem Inhibitor von Stickoxid. In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Erhöhen einer Population von Zellen in der S-Phase in einem Gewebe eines Säugers, umfassend das Inkontaktbringen des Gewebes mit einem Inhibitor von NO wie einem Inhibitor von NOS. In einer Ausführungsform resultiert das Verfahren in einer Steigerung der Größe eines Organs, in dem das Gewebe vorkommt. Darüber hinaus können die Zellen in der S-Phase, wie hierin beschrieben in Gentherapie verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Vermindern einer Population von Zellen in der S-Phase in einem Gewebe eines Säugers und Induzieren der Differenzierung der Zellen, umfassend das Inkontaktbringen des Gewebes mit einem Enhancer von NO wie einem Enhancer von NOS. In einer Ausführungsform resultiert das Verfahren in einer Verminderung der Größe eines Organs, mit dem das Gewebe assoziiert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Koordinieren von entwicklungsbezogenen Entscheidungen bei einem Zelltyp in einem Säuger, umfassend das Einbringen von NO in den Zelltyp oder einen Vorläufer des Zelltyps, wodurch Proliferation des Zelltyps oder eines Vorläufers des Zelltyps inhibiert wird, und Induzieren von Differenzierung des Zelltyps oder eines Vorläufers des Zelltyps.
Ein Verfahren zum Induzieren von Differenzierung in einer Säuger-Zellpopulation, umfassend das Inkontaktbringen der Zellpopulation mit NO oder einem NO-Enhancer, wird auch durch die vorliegende Erfindung umspannt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Regenerieren von Gewebe in einem erwachsenen Säuger, umfassend das Inkontaktbringen eines ausgewählten Gewebes (z.B. Blut, Haut, Knochen und Verdauungsepithel) oder von Vorläuferzellen des ausgewählten Gewebes mit einem Inhibitor von NO, wodurch Differenzierung inhibiert und Proliferation von Zellen des Gewebes induziert wird, dann Inkontaktbringen des ausgewählten Gewebes mit einer Verbindung (z.B. Stickoxid, einem Wachstumsfaktor oder einer Kombination von beiden), die Proliferation inhibiert und Differenzierung induziert. In einer Ausführungsform involviert das Verfahren die Repopulation eines Organs oder Gewebes (z.B. Muskel oder Nervenfaser), das normalerweise aus nicht-teilenden Zellen besteht, durch Inkontaktbringen eines ausgewählten Organs oder Gewebes oder von Vorläuferzellen des ausgewählten Organs oder Gewebes mit einem Inhibitor von NO, wodurch Differenzierung inhibiert und Proliferation von Zellen des Organs oder Gewebes induziert wird, dann Inkontaktbringen des ausgewählten Organs oder Gewebes mit einer Verbindung, die Proliferation inhibiert und Differenzierung induziert.
Die Erfindung umspannt auch ein Verfahren zum Produzieren einer Subpopulation von hämatopoetischen Zellen. In dem Verfahren wird Knochenmark mit einem Inhibitor von NOS in Kontakt gebracht, wodurch Knochenmark produziert wird, das eine erhöhte Population von hämatopoetischen Stammzellen aufweist, die in der Lage sind, normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen; und mit mindestens einem Agens (z.B. einem hämatopoetischen Wachstumsfaktor), das ausgewählt ist, um spezifische Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellpopulation zu induzieren, wodurch eine Subpopulation von hämatopoetischen Zellen produziert wird.
Identifizierung von NO als einen wichtigen Wachstumsregulator in einem Organismus liefert verschiedene therapeutische Anwendungen in Menschen und anderen Säugern.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ergebnisse der hierin beschriebenen Arbeit haben gezeigt, dass ein transzellulärer Bote (Stickoxid (NO)) eine kritische Rolle in Gewebedifferenzierung und Entwicklung eines Organismus spielt. NO reguliert die Balance zwischen Zellproliferation und Zelldifferenzierung im intakten, sich entwickelnden Organismus. Gesteigerte Produktion von NO ermöglicht die Beendigung der Zellteilung und in der Folge Differenzierung von Zellen in einem Gewebe, wohingegen Entfernen des NO-vermittelten Wachstumsarrests die Zellteilung fördert.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen einer Population von hämatopoetischen Stammzellen in einem Säuger, einschließlich Vorläufern von myeloiden, lymphoiden und erythroiden Zellen, im Knochenmark, die in der Lage sind normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen, durch Inkontaktbringen des Knochenmarks mit einem Inhibitor von NO wie einem Inhibitor von NOS. Die vorliegende Erfindung schließt ein Verfahren zum Behandeln eines Säugers ein, um eine Population von hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark des Säugers zu erhöhen, die in der Lage sind, normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen, wobei das Knochenmark des Säugers mit einem Inhibitor von NOS in Kontakt gebracht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Erhöhen einer Population von sich teilenden Zellen in einem Gewebe eines Säugers, umfassend das Inkontaktbringen der Zellen mit einem Inhibitor von Stickoxid. In einer Ausführungsform kann die vorliegende Erfindung auch verwendet werden, um eine Population von Zellen (angezielte Zellen) in S-Phase in einem Gewebe eines Säugers im Vergleich zu einem ähnlichen Gewebe in einem unbehandelten Tier durch Inkontaktbringen des Gewebes mit einem Inhibitor von NO wie einem Inhibitor von NOS zu erhöhen. In einer Ausführungsform resultiert das Verfahren in einer Steigerung der Größe eines Organs, mit dem das Gewebe assoziiert ist. Im Gegenzug kann die vorliegende Erfindung auch verwendet werden, um eine Population von Zellen in S-Phase in einem Gewebe eines Säugers zu verringern und zum Induzieren der Differenzierung der Zellen, umfassend das Inkontaktbringen des Gewebes mit einem Enhancer von NO wie einem Enhancer von NOS. In einer Ausführungsform resultiert das Verfahren in einer Verringerung der Größe eines Organs, mit dem das Gewebe assoziiert ist. Darüber hinaus können die Zellen in S-Phase, wie hierin beschrieben, bei der Gentherapie verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Koordinieren von Entwicklungsentscheidungen bei einem Zelltyp in einem Säuger, umfassend das Einbringen von NO in den Zelltyp oder einen Vorläufer des Zelltyps, wodurch Proliferation des Zelltyps oder eines Vorläufers des Zelltyps inhibiert und Differenzierung des Zelltyps oder eines Vorläufers des Zelltyps induziert wird. Ein Verfahren zum Induzieren der Differenzierung in einer Säuger-Zellpopulation, umfassend das Inkontaktbringen der Zellpopulation mit NO oder einem NO-Enhancer ist auch durch die vorliegende Erfindung umspannt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Regenerieren von Gewebe in einem erwachsenen Säuger. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen eines ausgewählten Gewebes mit einem Inhibitor von NO, wodurch Differenzierung inhibiert und Proliferation von Zellen des Gewebes induziert wird, dann Inkontaktbringen des ausgewählten Gewebes mit einer Verbindung, die Proliferation inhibiert und Differenzierung der proliferierten Zellen zu Zellen, die für das Gewebe charakteristisch sind, induziert. In einer Ausführungsform involviert das Verfahren die Repopulation eines Organs oder Gewebes (z.B. Muskel oder Nervenfaser), das normalerweise nicht-teilende Zellen aufweist, umfassend das Inkontaktbringen eines ausgewählten Organs oder Gewebes mit einem Inhibitor von NO, wodurch Differenzierung inhibiert und Proliferation von Zellen des Organs oder Gewebes induziert wird, dann Inkontaktbringen des ausgewählten Organs oder Gewebes mit einer Verbindung, die Proliferation inhibiert und Differenzierung der proliferierten Zellen zu Zellen induziert, die charakteristisch sind für das Organ oder Gewebe. Verbindungen, die Proliferation inhibieren und Differenzierung induzieren, schließen NO, einen Enhancer von NO, einen Wachstumsfaktor ein. Eine oder mehrere dieser Verbindungen können verwendet werden, um Proliferation zu inhibieren und Differenzierung zu induzieren.
Gewebe, das unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren regeneriert werden kann, schließt Blut, Haut, Knochen und Verdauungsepithel, Nervenfaser, Muskel, Knorpel, Fett oder Fettgewebe, Knochenmarkstroma und Sehnen ein.
Die hierin beschriebenen Verfahren können darüber hinaus den Schritt des Inkontaktbringens der Zielzellen (z.B. Knochenmark) mit zumindest einem Agens umfassen, das Differenzierung einer ausgewählten hämatopoetischen Stammzellpopulation in einen bestimmten Zelltyp induziert (z.B. Erythrocyten, Makrophagen, Lymphocyten, Neutrophile und Blutplättchen). Zum Beispiel kann in der Ausführungsform, in der ein Säuger durch Inkontaktbringen des Knochenmarks des Säugers mit einem Inhibitor von NOS behandelt wird, um eine Population von hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark des Säugers zu erhöhen, die erhöhte Population von Knochenmarkszellen mit einem Agens wie einem hämatopoetischen Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht werden, was Differenzierung der Zellen eines bestimmten Zelltyps bewirken oder fördern wird. Agenzien wie hämatopoetische Wachstumsfaktoren, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um Differenzierung der erhöhten oder ausgedehnten Zahl von Zellen, die durch Inkontaktbringen der Zellen mit einem NOS-Inhibitor produziert wurden, zu induzieren, schließen zum Beispiel Erythropoietin, G-CSF, GM-CSF und Interleukine wie IL-1, IL-2, IL-3 und IL-6 ein. Alternativ können die hierin beschriebenen Verfahren darüber hinaus den Schritt des Inkontaktbringens des Knochenmarks mit mindestens einem Agens umfassen, das darüber hinaus Proliferation der ausgewählten hämatopoetischen Stammzellpopulation eines bestimmten Zelltyps (z.B. Erythrocyten, Makrophagen, Lymphocyten, Neutrophile und Blutplättchen) induziert oder beibehält.
Inhibitoren von NO zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen zum Beispiel NO-Radikalfänger wie 2-Phenyl-4,4,5,5-tetraethylimidazolin-1-oxyl-3-oxid (PTIO), 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetraethylimidazolin-1-oxyl-3-oxid (Carboxy-PTIO) und N-Methyl-D-glucamindithiocarbamat (MGD); und NOS-Inhibitoren wie N-Nitro-L-argininmethylester (L-NAME), N-Monomethyl-L-arginin (L-NMMA), 2-Ethyl-2-thiopseudoharnstoff (ETU), 2-Methylisothioharnstoff (SMT), 7-Nitroindazol, Aminoguanidinhemisulfat und Diphenyleniodonium (DPI) ein.
Enhancer von NO schließen zum Beispiel NOS-Enhancer und NO-Donoren wie Natriumnitroprussid (SNP), S-Nitroso-N-acetylpenicillamin (SNAP), S-Nitrosoglutathion (SNOG, GSNO), Diethylamin-NONOat (DEA/NO), DETA/NO (NOC-18), 3-Moropholinosydnonimin (SIN-1) und Spermin-NONOat (Sper/NO) ein.
NO ist ein diffundierfähiger multifunktioneller zweiter Botenstoff, der mit zahlreichen physiologischen Funktionen in Säugern in Verbindung gebracht worden ist, die von der Erweiterung von Blutgefäßen bis zu Immunantwort und Potenzierung von synaptischer Übertragung reichen (Bredt und Snyder, Annu. Rev. Biochem. 63: 175–195 (1994); Nathan und Xie, Cell 78: 915–918 (1994); Garthwaite und Boulton, Annu. Rev. Physiol. 57: 683–706 (1995). NO wird von Arginin durch NOS in fast allen Zelltypen produziert. Eine Gruppe von drei chromosomalen Genen, die zu zahlreichen Isoformen von NOS führen, ist aus Säugerzellen cloniert worden (Knowles und Moncada, Biochem. J. 298: 249–259 (1994); Wang und Marsden, Adv. Pharmacol. 34: 71–90 (1995)), und vor kurzem ist ein Drosophila-NOS-Gen, dessen codierende Struktur dem Gen für die neuronale Säuger-Isoform gleicht, isoliert worden (Regulski und Tully, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9072–9076 (1995)).
Zellteilung und nachfolgender programmierter Zelltod in Imaginalscheiben von Drosophila-Larven bestimmen die endgültige Größe von Organen und Strukturen der erwachsenen Fliege. Hierin beschriebene Ergebnisse zeigen, dass NO in die Kontrolle der Größe von Körperstrukturen während der Drosophila-Entwicklung involviert ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass NOS in hohen Mengen in sich entwickelnden Imaginalscheiben exprimiert wird. Inhibition von NOS in Larven bewirkt Hypertrophie von Organen und deren Segmenten in erwachsenen Fliegen, wohingegen ektopische Expression von NOS in Larven den gegenteiligen Effekt hat. Blockieren der Apoptose in Imaginalscheiben des Auges entlarvt überschüssige Zellproliferation und resultiert in einer Steigerung der Zahl von Ommatidien und Komponentzellen der individuellen Ommatidien. Diese Ergebnisse zeigen die Aktivität von NO als ein antiproliferatives Mittel während der Drosophila-Entwicklung, das die Balance zwischen Zellproliferation und Zelldifferenzierung kontrolliert. Darüber hinaus demonstrieren die hier gezeigten Ergebnisse, dass NO als ein wesentlicher Regulator von Hämatopoiese nach Knochenmarks (BM)-Transplantation wirkt. NO reguliert die Reifung von sowohl den erythroiden als auch myeloiden Stammbäumen. Diese Daten zeigen, dass Manipulationen der NOS-Aktivität und NO-Spiegel während der Hämatopoiese verwendet werden können, um Blutzell-Produktion zu verändern (verstärken oder reduzieren). Dies ist für beugende und therapeutische Eingriffe nützlich.
Während der Drosophila-Entwicklung werden die Struktur, Größe und Form der meisten Organe der erwachsenen Fliege in den imaginalen Strukturen der Larven festgelegt (Cohen, Imaginal disc development, in The Development of Drosophila melanogaster, M. Bate und A. Martinez-Afias, Hrsg. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), 747–841 (1993); Fristrom und Fristrom, The metamorphic development of the adult epidermis, in The Development of Drosophila melanogaster, M. Bate und A. Martinez-Afias, Hrsg. (Gold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), 843–897 (1993)). Imaginalscheiben, spezialisierte Gruppen von undifferenzierten epithelialen Zellen, die während der Embryogenese rekrutiert werden, werden in dem ersten Larvenstadium als Integument der Larven-Epidermis gebildet. Scheibenzellen teilen sich schnell während der Larven-Entwicklung und hören am Ende der dritten Larvenstadium-Periode mit der Proliferation auf. In Bein-, Flügel- und Halteren-Scheiben stoppt das Fortschreiten durch den Zellzyklus in der G2-Phase 3–4 Stunden vor der Puparium-Bildung. Es setzt sich 15–18 Stunden später (12–14 Stunden nach Puparium-Bildung) fort und stoppt dann wieder in einem definierten räumlichen Muster nach 12–14 Stunden (10–14 Stunden der Puppen-Entwicklung) (Fain und Stevens, Devel. Biol. 92: 247–258 (1982); Graves und Schubiger, Devel. Biol. 93: 104–110 (1982); Schubiger und Palka, Devel. Biol. 123: 145–153 (1987)). Obwohl die meisten der sich teilenden Zellen in der späten Larve und in der frühen Puppe schon auf ihr Schicksal im Erwachsenenstadium festgelegt sind, entwickeln sie keinen vollständig differenzierten Phänotyp, bis der Wachstumsarrest fest etabliert ist. So ist Zellproliferation zeitweilig von Zelldifferenzierung getrennt, die später während der Metamorphose vor sich geht. Versuche mit transplantierten Imaginalscheiben legen nahe, dass das Beenden der Zellproliferation in diesen Strukturen durch Mechanismen kontrolliert wird, die, obwohl sie spezifisch für die Scheibe sind, nicht völlig Zell-autonom sind (Bryant und Schmidt, J. Cell Sci. Erg. 13: 169–189 (1990); Cohen, Imaginal disc development, in The Development of Drosophila melanogaster, M. Bate und A. Martinez-Afias, Hrsg. (Gold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), 747–841 (993)). Die Signalwege, die einen koordinierten, zeitweiligen Wachstumsarrest in Larven und Puppen und des folgenden endgültigen Wachstumsstopp in Puppen und Erwachsenen kontrollieren, sind nicht bekannt, aber sie involvieren wahrscheinlich interzelluläre und intrazelluläre zweite-Botenmoleküle, die noch nicht identifiziert worden sind.
Transformierung von imaginalen Vorstufen in erwachsenen Strukturen während der Fliegen-Metamorphose involviert den Übergang von Zellproliferation zu Zelldifferenzierung. Beenden der Zellteilung ist eine notwendige, jedoch nicht ausreichende Bedingung, damit die Zelldifferenzierung fortfährt. Eine zeitweilige Cytostase erfolgt am Ende der Larven-Periode, und ein permanenter Arrest der Zellteilung erfolgt während der Puppen-Entwicklung. NO, ein diffundierfähiges Botenmolekül, ist zu effizientem Blockieren der Zellteilung in der Lage. Einbringen von NOS initiiert ein Umschalten auf Wachstumsarrest vor der Differenzierung von kultivierten neuronalen Zellen (Peunova und Enikolopov, Nature 375: 68–73 (1995)). So kann NOS als ein permissiver Faktor wirken, der die weitere Entwicklung des vollständig differenzierten Phänotyps möglich macht. Die hierin beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass NOS als ein antiproliferatives Mittel während der normalen Drosophila-Entwicklung wirkt, was darauf hinweist, dass NO ein wichtiger Wachstumsregulator im intakten, sich entwickelnden Organismus ist.
Während der Larven-Entwicklung gibt es eine graduelle und räumlichspezifische Akkumulierung von NADPH-Diaphorase-Aktivität in sich entwickelnden Imaginalscheiben, was eine Steigerung des Gesamt-NOS-Gehalts reflektiert. Zu der Zeit, wenn zeitweilige Cytostase in Imaginalscheiben etabliert wird, wird die NADPH-Diaphorase-Färbung besonders intensiv, und sie sinkt graduell während der Präpuppen- und Puppen-Entwicklung. Neben den Imaginalscheiben schließen andere Strukturen mit intensiver NADPH-Diaphorase-Färbung Imaginalringe, Histoblasten und das Gehirn ein. Diese Strukturen unterziehen sich radikalen Veränderungen während der Metamorphose, bevor sie erwachsene Organe hervorbringen. Ihre Entwicklung schließt Perioden von schneller Zellteilung abwechselnd mit Perioden von Cytostase ein und muss daher Mechanismen zur koordinierten Beendigung von DNA-Synthese und Zellteilung in einem räumlich definierten Muster ausnutzen. Da NO Zellteilung verhindern kann und diffundieren und innerhalb eines begrenzten Volumens wirken kann, wurde die Fähigkeit von NO, als Induktor eines koordinierten Wachstumsarrests während der Drosophila-Entwicklung zu wirken, in Betracht gezogen. In der Tat, wenn NO aktiv seine antiproliferative Aktivität während der Entwicklung von Imaginalscheiben ausübt, dann könnte die Inhibition von NOS, bevor die zeitweilige Cytostase am Ende der Larven-Periode etabliert ist, zu der Umkehr des Arrests der Zellteilung führen und zusätzliche Teilungen induzieren, die im Gegenzug zu erhöhter Größe von Strukturen des Körpers der erwachsenen Fliege führen könnten. Umgekehrt könnte eine überschüssige oder ektopische Produktion von NO in Larven eine vorzeitige Beendigung der Zellteilung bewirken und zu einer Reduzierung der Größe der Strukturen in den Erwachsenen führen.
Beide Vorhersagen wurden in hierin beschriebenen Experimenten bestätigt, in denen NOS-Aktivität in der sich entwickelnden Fliege manipuliert wurde. NOS-Inhibierung in Larven bewirkte eine Steigerung in der Zahl von Zellen in manchen Teilen des erwachsenen Körpers und eine Steigerung von ihrer Größe, wohingegen ektopische Expression des NOS-Transgens während der Entwicklung eine Verminderung der Zahl von Zellen in machen Strukturen im Erwachsenen und eine Verminderung von deren Größe wahrscheinlich durch teilweise Fusion und Reduktion bewirkte. Im sich entwickelnden Bein waren die Segmente, die am häufigsten betroffen waren, wenn die NOS-Aktivität inhibiert wurde, und die Segmente, die am häufigsten betroffen waren, wenn die Aktivität ektopisch induziert wurde, nicht überlappend und komplementär. Am wichtigsten war, dass ihre Verteilung zu der Verteilung von NOS in den Imaginalscheiben passte, wodurch die Hypothese unterstützt wird, dass NO eine verursachende Rolle im Wachstumsarrest in der normalen Entwicklung spielt.
Die antiproliferativen Eigenschaften von NO legen nahe, dass NOS in der Entwicklung durch seinen Einfluss auf DNA-Synthese und Zellteilung wirkt. Die hierin beschriebenen Ergebnisse mit BrdU-Inkorporierung in Bein-Scheiben mit erhöhter und verminderter Produktion von NO bekräftigen diese Position und legen eine direkte Verbindung zwischen Synthese von NO, Anzahl der S-Phasen-Zellen und der endgültigen Größe des Organs nahe. In Übereinstimmung mit dieser Idee wurde in vielen Fällen keine BrdU-Inkorporation in Regionen beobachtet, die hoch angereichert mit NOS sind. Die Mechanismen für den NO-vermittelten Arrest des Zellzyklus (sowohl zeitweilig als auch endgültig) sind nicht klar, aber sie involvieren wahrscheinlich die konventionelle zelluläre Maschinerie für Wachstumsarrest, z.B. Zellzyklus-abhängige Kinasen und deren Inhibitoren. In Übereinstimmung damit wurden Änderungen in der Expression von diesen Proteinen beobachtet, wenn kultivierte Zellen mit NO behandelt wurden. Ein faszinierendes Merkmal von Imaginalscheibenzellen ist, dass sie aufhören, sich zu teilen und in der G2-Phase in dem späten dritten Larvenstadium akkumulieren, die der Periode der zeitweiligen Cytostase vorangeht (Fain und Stevens, Devel. Biol. 92: 247–58 (1982); Graves und Schubiger, Devel. Biol. 93: 104–110 (1982); Schubiger und Palka, Devel. Biol. 123: 145–153 (1987)). Dies ist vergleichbar mit der Tendenz von NO-behandelten (Peunova und Enikolopov, Nature 375: 68–73 (1995)) und NGF-behandelten (Buchkovich und Ziff, Mol. Biol. Cell 5: 225–241 (1994)) PC12-Zellen, in der G2-Phase zu akkumulieren. Interessanterweise werden Imaginalscheiben vom G2-Block freigesetzt, und treten 12–15 Stunden nach Puparium-Bildung wieder in die S-Phase ein, zu der Zeit, wenn die Diaphorase-Färbung in erwachsenen Fliegen auf niedrige Spiegel absinkt. Diese Korrelationen zwischen Imaginalscheibenzellen und NO-behandelten Zellen unterstützt die Idee, dass NO ein wesentlicher Induktor von Cytostase in den Zellen der Imaginalscheiben im Präpuppenstadium sein kann.
Die endgültige Zahl an Zellen in einem Organ oder einem Segment wird sowohl durch Zell-Multiplikation als auch Zelltod bestimmt, welchen sich die bildenden Strukturen der Fliege als ein normaler Schritt in der Entwicklung unterziehen (besonders in den späten Stadien der Puppen-Entwicklung). Die hierin beschriebenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Änderungen in der Größe der Beinsegmente nach Manipulation der NOS-Aktivität direkt mit den Änderungen in der DNA-Synthese und der Zahl von sich teilenden Zellen korreliert. Darüber hinaus wurden keine signifikanten Änderungen in der Apoptose in den Laven- und Präpuppen-Beinscheiben nach Inhibierung oder ektopischer Expression von NOS im Vergleich zu den Kontrollscheiben festgestellt, wenn Zelltod durch Acridinorange-Färbung oder durch den TUNEL-Test beobachtet wurde. Dies legt nahe, dass es eher Zell-Multiplikation ist als Änderungen im programmierten Zelltod, die zu den Änderungen in der Größe des Appendix führt.
Auf der anderen Seite kann apoptotischer Tod exzessive Zellproliferation in anderen sich entwickelnden Organen verbergen. Der Effekt der Abwesenheit von programmiertem Zelltod auf eine mögliche, exzessive Zellproliferation wurde auch getestet. Transgene Fliegen wurden verwendet, in denen programmierter Zelltod im sich entwickelnden Auge durch rekombinantes p35, einem Inhibitor von Apoptose, unterdrückt wurde, um exzessive Proliferation nach NOS-Inhibierung zu enthüllen. Unter diesen Umständen sind einige Zelltypen und Strukturen überrepräsentiert, die deutlichste Änderung ist eine Gesamtsteigerung der Größe des Auges auf Grund der erhöhten Zahl von Ommatidien. Zusätzlich proliferierten andere Zelltypen (z.B. sekundäre und tertiäre Pigmentzellen, Zapfenzellen und Zellen der Borsten) nach NOS-Inhibition zu Spiegeln, die höher waren als jene, die durch Blockieren der Apoptose durch p35 erzielt wurden (Hay et al., Development 120: 2121–2129 (1994)). Diese Daten zeigen, dass das Entfernen von unterdrückendem Einfluss von NO zu einer Steigerung in der Größe des erwachsenen Organs führt, es sei denn, dass dieser Effekt durch programmierten Zelltod maskiert ist, und weisen darauf hin, dass die endgültige Zellzahl im erwachsenen Organ unter dualer Kontrolle sowohl durch Zellproliferation als auch programmierten Zelltod ist. Darüber hinaus liefern diese Daten unabhängig Unterstützung für die Hypothese, dass NO direkt die Zellzahl während der Entwicklung reguliert.
Nach Inhibition von NOS mit einer von zwei strukturell nicht verwandten Verbindungen wurde exzessives Wachstum in verschiedenen Graden für unterschiedliche Organe in den meisten Strukturen der erwachsenen Fliegen, die von Imaginalscheiben und Histoblasten stammen, beobachtet. Die offensichtlichsten Änderungen wurden in den Segmenten der Beine beobachtet, deren Primordia die höchsten Spiegel an NOS zeigten. Es schien keine wesentliche Zahl von Fällen zu geben, in denen eine Verdoppelung einer größeren Struktur (zum Beispiel Segmente der Beine oder Flügel) erfolgte: Dies weist darauf hin, dass zusätzliche Proliferation von Zellen unter dem Einfluss von NOS-Inhibitoren erfolgt, nachdem das Entwicklungsschicksal für die Meisten der Zellen in den Imaginalscheiben festgelegt ist. Dies legt nahe, dass in den meisten Fällen NO für die Induktion von Wachstumsarrest und folgender Differenzierung von schon festgelegten Zellen wichtiger sein kann als für die Entwicklungs-Festlegung und Etablierung der Zellidentität im Embryo oder in den Larven.
Nur manche der Achsen der sich entwickelnden Strukturen wurden durch Manipulationen der NOS-Aktivität beeinflusst. Zum Beispiel wurden in sich entwickelnden Beine nur die anterioposterioren und die dorsoventralen Achsen, nicht aber die proximodistale Achse durch Inhibition der NO-Produktion beeinflusst. Im Gegensatz dazu wurde nur die proximodistale Achse beeinflusst, wenn NOS ektopisch exprimiert wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ein Gradient von NO in den Prozess der Etablierung der Polarität der Achsen im sich entwickelnden Organ involviert sein kann.
Daher zeigen diese Ergebnisse, dass Inhibition von NOS in Larven zu Vergrößerung von Organen in Erwachsenen führt und dass umgekehrt ektopische Expression von NOS in Larven zu einer Reduktion in der Größe von Organen in Erwachsenen führt. Die Verteilung von betroffenen Segmenten im erwachsenen Bein entspricht auch der Verteilung von NOS in den Larven, und die Änderungen in der Segmentgröße können direkt mit Änderungen in der DNA-Synthese in Imaginalscheiben nach Manipulationen der NOS-Aktivität korreliert werden. Die erhöhte Zellproliferation, die als Antwort auf NOS-Inhibition erfolgt, wird in machen Strukturen durch programmierten Zelltod maskiert, und sie kann durch Unterdrücken der Apoptose offenbart werden. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass Aktivierung von NOS ein wesentlicher Schritt in der Drosophila-Entwicklung ist. Sie bestätigen, dass NO als ein antiproliferatives Agens während der Zelldifferenzierung und Entwicklung des Organismus wirkt und die Zellzahl in einem intakten, sich entwickelnden Organismus kontrolliert.
NOS-Expression kann in einer großen Zahl von Geweben und Zelltypen durch geeignete Stimulation auf hohe Spiegel induziert werden (Bredt und Snyder, Annu. Rev. Biochem. 63: 175–195 (1994); Forstermann et al., Adv. Pharmacol. 34: 171–186 (1995)). In den meisten Fällen unterscheidet sich das Muster der NOS-Verteilung in einem sich entwickelnden Organismus stark von der Verteilung im erwachsenen Organismus. Darüber hinaus deckt sich vorübergehende Erhöhung der NOS-Expression in einem gegebenen Gewebe oft mit der Beendigung der Teilung von festgelegten Vorläuferzellen. Das sich entwickelnde Säugergehirn liefert eine besonders passende Demonstration davon (Bredt und Snyder, Neuron 13: 301–313 (1994); Blottner et al., Histochem. J. 27: 785–811 (1995)). Eine starke Erhöhung der NOS-Aktivität in der sich entwickelnden cerebralen corticalen Platte und dem Hippocampus an Tagen 15–19 der pränatalen Entwicklung korreliert mit dem Zeitablauf der Beendigung der Vorläuferzell-Proliferation des strengen Wachstumsarrests und der Zelldifferenzierung; bemerkenswert ist, dass die NOS-Aktivität zurückgeht, nachdem die Proliferation von festgelegten neuronalen Vorläufern vollständig ist. NOS-Spiegel sind auch vorübergehend erhöht in sich entwickelnden Lungen, Knochen, Blutgefäßen und Nervensystem (Blottner et al., Histochem. J. 27: 785–811 (1995); Collin-Osdoby et al., J. Cell Biochem. 57: 399–408 (1995); Cramer et al., J. Comp. Neurot. 353: 306–316 (1995); Shaul, Adv. Pediatr. 42: 367–414 (1995); Wetts et al., Dev. Dyn. 202: 215–228 (1995)). Anderswo ist die NOS-Aktivität in sich regenerierenden Geweben stark erhöht, wenn die Beendigung der Zellteilung wesentlich ist für Verhinderung des unregulierten Wachstums (Roscams et al., Neuron 13: 289–299 (1994); Blottner et al., Histochem. J. 27: 785–811 (1995); Decker und Obolenskaya, J. Gastroenterol. Hepatol. 10 Erg. 1: 2–7 (1995); Hortelano et al., Hepatology 21: 776–786 (1995)). In allen diesen Fällen könnte eine vorübergehende Erhöhung der NOS-Aktivität ein Umschalten von Proliferation zu Wachstumsarrest und Differenzierung auslösen, was so zu der korrekten Morphogenese des Gewebes und des Organs beiträgt.
Hierin beschriebene Ergebnisse unterstützen die Position, dass Produktion von NO während embryonaler Entwicklung und während Geweberegeneration im erwachsenen Organismus notwendig ist für die korrekte Kontrolle der Zellproliferation. Die antiproliferativen Eigenschaften von NO sind besonders wichtig in Situationen, in denen endgültige Differenzierung von festgelegten Zellen zeitweilig von Zellproliferation getrennt ist und streng abhängig ist von der Beendigung der Zellteilung. Nimmt man die Vielzahl der NOS-Isoformen und deren überlappende Gewebeverteilung, ist es vorstellbar, dass jede Gruppe von Zellen im Embryo und Fetus einer NO-Wirkung ausgesetzt werden kann. Darüber hinaus eröffnen kürzliche Daten, die zeigen, dass NO innerhalb des Organismus durch Hämoglobin befördert werden kann (Jia et al., Nature 380: 221–226 (1996)), die Möglichkeit, dass ein sich entwickelnder Säuger-Embryo auch exogen durch die Mutter mit NO beliefert werden kann. Die vorliegende Erfindung schießt die Verwendung von menschlichen Embryonen für industrielle oder kommerzielle Zwecke aus.
NO ist ein leicht diffundierfähiges Molekül, und es kann daher seine antiproliferativen Eigenschaften nicht nur in der Zelle ausüben, die es produziert, sondern auch in den benachbarten Zellen (Gally et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3547–3551 (1990)). Diese Eigenschaft ist wichtig, wenn man Mechanismen für die koordinierte Entwicklung einer Gruppe von benachbarten Zellen in Betracht zieht, die darauf festgelegt ist, eine bestimmte Struktur zu bilden. Diese Zellen müssen ein intrinsisches Signal erzeugen, das ihnen sagt, in einer koordinierten Weise die Teilung zu stoppen, nachdem sie eine bestimmte Anzahl erreicht haben. Diese Kooperation und Koordination wird in vielen Fällen durch streng kontrollierte parakrine Regulation erreicht, die Signalisieren zwischen angrenzenden Zellen durch Lückenverbindungen oder sezernierte Proteine involviert. Die hierin beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass noch eine andere Art von koordinierten Entwicklungsentscheidungen in Gruppen von Zellen durch diffundierfähige antiproliferative zweite Botenmoleküle erfolgt, die sich ohne eine Notwendigkeit für Oberflächenrezeptoren oder spezialisierte Systeme zur Sekretion verbreiten können und einen Einfluss innerhalb einer begrenzten Domäne ausüben. Eine effiziente Quelle von leicht diffundierfähigen Molekülen kann synchronisierte Änderungen in den angrenzenden Zellen innerhalb eines begrenzten Volumens eines Gewebes induzieren. Darüber hinaus können einige angrenzende Zellen, die leicht diffundierfähige antiproliferative Botenmoleküle produzieren, den gesamten Pool dieser Moleküle, die sowohl durch die Nachbarn als auch durch sie selbst produziert werden, teilen. Wenn ein bestimmter Grenzwert-Spiegel eines Signals benötigt wird, um eine Signalkette zu initiieren, die letztendlich zu Wachstumsarrest führt, dann könnten die Zellen in dieser Gruppe aufhören, sich zu teilen, wenn eine bestimmte Zahl von Zellen und daher eine bestimmte lokale Konzentration von Botenmolekülen erreicht ist. Auf diese Weise instruiert NO die sich entwickelnden Strukturen durch Organisieren von Gruppen von Zellen in funktionelle Anhäufungen und Koordinieren von ihren Entscheidungen über Proliferation und Differenzierung, ihr Wachstum zu beenden, wenn sie die passende Größe und Form erreichen, und nimmt so an Gewebe- und Organmorphogenese teil.
Wie auch hierin beschrieben, wurde die Rolle von NO in der Hämatopoiese untersucht. Um die Anwesenheit von NOS in den Knochenmark (BM)-Zellen zu demonstrieren, wurde BM von erwachsenen Mäusen auf die NDPH-Diaphorase-Aktivität von NOS (die die Verteilung der gesamten Enzymaktivität in einem Gewebe reflektiert) getestet. Es wurde gefunden, dass BM einen wesentlichen Anteil an Zellen (bis zu 12%) mit starker Diaphorase-Färbung enthält. Die Morphologie der NADPH-Diaphorase-Zellen legt nahe, dass sie großteils aus dem Granulocyten-Makrophagen-Stammbaum in unterschiedlichen Stadien der Differenzierung sind. Dies ist in Übereinstimmung mit zahlreichen Daten, die zeigen, dass NOS in den Zellen des myeloiden Stammbaums vorhanden ist und durch geeignete Stimulation auf hohe Spiegel induziert werden kann.
Ein Mausmodell von syngenem BM-Transfer wurde verwendet, um die Rolle von NO in der Hämatopoiese zu beurteilen. Mäuse wurden bestrahlt, um Hämatopoiese im Empfängertier zu inhibieren, BM wurde von syngenen Tieren transplantiert, und die Tiere wurden mit spezifischen NOS-Inhibitoren behandelt. Diese Vorgehensweise erlaubt die Proliferation, Differenzierung und das Überleben nur von den transplantieren Zellen. Um die Änderungen in der Hämatopoiese, die durch NOS-Inhibitoren eingebracht wurden, zu untersuchen, wurden die Kolonien in der Milz beobachtet, um die Differenzierung von erythroiden Zellen zu testen, und die Bildung von Kolonien auf den Membranen, die in die peritoneale Höhle der Empfänger platziert wurden, wurde beobachtet, um die Differenzierung von Zellen des Granulocyten-Makrophagen-Stammbaums zu testen. Die Rolle von NO auf die Hämatopoiese wurde durch Injizieren der Tiere mit den spezifischen und strukturell nicht verwandten NOS-Inhibitoren L-Nitroargininmethylester (L-NAME) und 2-Ethyl-2-thiopseudoharnstoff (ETU) getestet. Das inaktive Enantiomer D-NAME wurde als eine Kontrolle verwendet. Die Tiere wurden getötet, und die Zahl und Zusammensetzung von Kolonien in der Milz (reflektierend die Zellen, die erythroide Differenzierung durchlaufen haben) und Kolonien auf den Membranen (reflektierend die Zellen, die myeloide Differenzierung durchlaufen haben) wurden untersucht.
Zusammengefasst weisen die Ergebnisse dieser Untersuchungen darauf hin, dass NO die Hämatopoiese nach BM-Transplantation moduliert. Dies bestätigt die Rolle von NO als ein wesentlicher regulierender Faktor im Organismus, der die Balance zwischen Proliferation und Differenzierung kontrolliert. Dies zeigt auch, dass Manipulation von NO-Spiegeln für einen therapeutischen Eingriff verwendet werden kann, um die Zahl an undifferenzierten hämatopoetischen Zellen nach BM-Transplantation zu erhöhen; das Verhältnis von Zellen, die erythroide oder myeloide Differenzierung durchlaufen, zu verändern; und Transplantat-versus-Empfänger-Erkrankung, die eine Hauptursache der Sterblichkeit bei Patienten ist, die sich einer BM-Transplantation unterziehen, zu beeinflussen oder zu unterdrücken.
Die meisten der Gewebe und Organe im erwachsenen Organismus unterziehen sich ständig Regeneration und Erneuerung, durchlaufen Phasen von schneller Proliferation, Determination, Wachstumsarrest, Differenzierung und oft programmierten Zelltod. Viele menschliche Erkrankungen werden durch inkorrekte oder unvollständige Differenzierungsschritte verursacht, was im Verlust der Funktion eines bestimmten Gewebes oder Organs resultiert. Dies legt nahe, dass diese Erkrankungen behandelt werden können und darüber hinaus die korrekte Funktion der betroffenen Gewebe und Organe durch Anzielen und Manipulieren von Zell- und Gewebedifferenzierung wiederhergestellt werden kann.
Diese hierin beschriebene Arbeit, die die Rolle von NO in Zellproliferation und Differenzierung in einem Organismus demonstriert, liefert verschiedene therapeutische Anwendungen in Menschen und anderen Säugern. Im Speziellen kann dieser NO-basierende Ansatz auf erneuerbare und sich regenerierende Gewebe wie Blut, Knochen, Haut und Verdauungsepithel fokussiert werden. Zusätzlich kann eine ähnliche Strategie verwendet werden, um Organe mit sich normalerweise nicht teilenden Zellen wie Muskel- und Nervenzellen wieder zu besiedeln.
Die hierin beschriebene Arbeit kann auch verwendet werden, um Gentherapie-Verfahren zu verstärken. Zum Beispiel kann NOS verwendet werden, um eine Population von Zellen in die S-Phase zu führen, in der sich die Zellen replizieren. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, sprechen replizierende Zellen besser auf Gentherapie-Verfahren (z.B. Einbringen von Genen durch lebende Vektoren) als nicht replizierende Zellen an. Daher liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Umwandeln von Zellen in ein Stadium, das die Zellen empfänglicher macht für Gentherapie-Verfahren, wobei die Zellen mit einem NO-Inhibitor (z.B. NOS-Inhibitor) in Kontakt gebracht werden. Im Gegensatz dazu liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Umwandeln von Zellen in ein Stadium, das die Zellen gegen Gentherapie-Verfahren resistent macht. Das heißt, die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Umwandeln von Zellen in ein Stadium, das die Zellen resistenter gegen Gentherapie-Verfahren macht, wobei die Zellen mit NO und/oder einem NO-Enhancer (z.B. NOS-Enhancer) in Kontakt gebracht werden.
Die Ergebnisse der hierin beschriebenen Arbeit unterstützen die Fähigkeit von NO, als ein wesentlicher Regulator von Hämatopoiese nach Knochenmarkstransplantation (BMT) zu wirken. NO reguliert die Reifung von Stammbäumen sowohl von erythroiden als auch von myeloiden Zellen. Durch Beeinflussen der NO-Produktion im Empfängertier nach BMT kann die Zahl von undifferenzierten Stamm- und Blastenzellen, die dann zu weiterer Differenzierung entlang der erythroiden oder myeloiden Stammbäume fähig sind, dramatisch erhöht werden. Die Blastenzell- Anreicherung erreicht 80-fach für den myeloiden Stammbaum und 20-fach für den erythroiden Stammbaum. Die hierin beschriebenen Daten zeigen, dass Manipulationen der NOS-Aktivität und NO-Spiegel während der Hämatopoiese für therapeutische Zwecke verwendet werden können, um Selbsterneuerung und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen zu beeinflussen und beschädigte oder defekte Zellen zu ersetzen. Anwendungsbereiche schließen Stärkung der Bildung von Blutzellen und myeloiden Zellen in Folge von hoch dosierter Chemotherapie bei Krebsbehandlung; verbesserte Einwachsen nach Knochenmarks- oder Stammzellentransplantationen und Gentherapie; Stammzelltherapie durch Amplifizieren der undifferenzierten Zellen der erythroiden und myeloiden Stammbäume und Anwenden der geeigneten Faktoren, um terminate Differenzierung zu induzieren; und Regulierung der Bildung von verschiedenen Blutzell-Bestandteilen zum Behandeln von hämatologischen und Autoimmun-Störungen ein.
Die Daten zeigen auch, dass eine Ändernung der Spiegel der NO-Produktion Osteoblasten- und Chondrocyten-Differenzierung beeinflusst. Diese Ergebnisse zeigen, dass Manipulation der NO-Produktion Wachstum und Differenzierung von Osteoblasten, Chondrocyten oder mesenchymalen Stammzellen regulieren kann. Dies kann zur Amplifizierung und weiteren Differenzierung von Zellen im verletzten Gewebe oder für Zellimplantate (wenn nötig in Kombination mit biokompatiblen Trägern) verwendet werden. Daher kann ein NO-basierender Ansatz für Regenerierungstherapie des beschädigten Gewebes, Reparatur nach Verletzung, altersbedingte Erkrankungen wie Osteoporose und Osteoarthritis und zur Rekonstruktion von Mark-Stroma in Folge von hoch dosierter Krebs-Chemotherapie verwendet werden.
Zusätzlich zeigen die Daten, dass Ändern der Spiegel der NO-Produktion die Keratinocyten-Differenzierung beeinflusst. Die hierin beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass Regulierung der NO-Produktion verwendet werden kann, wenn erhöhte Proliferation und folgende Differenzierung von Hautgewebe nötig ist (z.B. bei Verbrennungen und Wundheilung). Darüber hinaus kann NO verwendet werden, um Störungen zu kontrollieren, die durch Hyperproliferation von Keratinocyten während Psoriasis verursacht werden. Noch eine andere potentielle Anwendung ist, NO- basierende Präparate als abschälendes Agens bei kosmetischer Therapie zu verwenden.
Für NO ist gezeigt worden, dass es als ein Regulator von Zelldifferenzierung in neuronalen Zellen wirkt. Es ist demonstriert worden, dass NO Gehirnentwicklung in Tieren reguliert und zum Kontrollieren der Größe des Gehirns in intakten Tieren beiträgt.
Es ist auch gezeigt worden, dass NO in bestimmten Zusammenhängen die Überlebenseffekte von Wachstumsfaktoren durch Aktivieren eines antiapoptotischen Programms vermittelt und neuronale Zellen vor dem Tod bewahren kann. In Kombination legen diese Studien über die Rolle von NO in Neuronen nahe, dass NO verwendet werden kann, um Proliferation und folgende Differenzierung von Nervenzellen in Ersatztherapie nach neurodegenerativen Störungen, die durch Alter (z.B. Alzheimer- oder Parkinson-Krankheit), Schlaganfall oder Verletzung verursacht werden, zu kontrollieren.
NO wird aktiv in glatten Muskelzellen der Blutgefäße produziert und unterliegt einer komplexen physiologischen Regulierung. Diese Zellen sind hochempfindlich für eine Unterdrückung der DNA-Synthese durch NO. Die sehr starke antiproliferative Aktivität von NO kann zur Inhibierung der Proliferation von glatten Muskelzellen und Bildung von Neointima zur Behandlung von Restenose in Folge von Angioplastik verwendet werden.
Zusätzlich findet eine NO-basierende Therapie Anwendung bei der Behandlung von Beschwerden, die durch Zerstörung von spezifischen Zellgruppen charakterisiert sind. Dies schließt Hepatocyten-Regenerierung nach toxischer Verletzung der Leber, Behandlung von Störungen des Reproduktionssystems und Verabreichung von differenziertem Pankreasgewebe zur Behandlung von Typ 1-Diabetes ein.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können in vivo oder ex vivo ausgeführt werden. Verabreichung des NO-Inhibitors, NO-Enhancers und/oder Agens, das Differenzierung induziert, kann unter Verwendung von verschiedenen Abgabesystemen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt werden. Die Wege der Verabreichung schließen intradermale, transdermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane, orale, epidurale und intranasale Wege ein. Jeder andere praktische Weg der Verabreichung kann verwendet werden, wie zum Beispiel Infusion oder Bolus-Injektion oder Absorption durch epitheliale oder Schleimhaut-Auskleidungen. Zusätzlich kann der NO-Inhibitor, NO-Enhancer und/oder das Agens, das Differenzierung induziert, mit anderen Komponenten oder biologisch aktiven Mitteln wie Adjuvantien, pharmazeutisch verträglichen grenzflächenaktiven Substanzen, Excipienten, Trägern, Verdünnern und Vehikeln verabreicht werden. Verabreichung kann systemisch oder lokal sein, z.B. direkte Injektion an der Stelle, die die Zellen, die als Ziel dienen sollen, enthält.
Der NO-Inhibitor, NO-Enhancer und/oder das Agens, das Differenzierung induziert, kann als Proteine (Peptide) und/oder Gene (Polynucleotide), die solche Proteine oder Peptide codieren, verabreicht werden. In der Ausführungsform, in der der NO-Inhibitor, NO-Enhancer und/oder das Agens, das Differenzierung induziert, Proteine oder Peptide sind, können sie durch in vivo-Expression von Genen oder Polynucleotiden, die solche codieren, in ein Säugerindividuum verabreicht werden. Einige Expressionssysteme wie lebende Vektoren sind kommerziell erhältlich oder können entsprechend rekombinanten DNA-Techniken zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung reproduziert werden.
Die Menge an NO-Inhibitor, NO-Enhancer und/oder Agens zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, die effektiv sein wird in der Behandlung der bestimmten Störung oder des Zustandes, wird von der Art der Störung oder des Zustandes abhängen und kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. Die genaue Dosis, die im Präparat eingesetzt werden soll, wird auch vom Weg der Verabreichung und der Schwere der Erkrankung oder Störung abhängen und sollte gemäß der Beurteilung des Praktikers und den Umständen jedes Patienten entschieden werden.
Die folgenden Beispiele werden zum Zweck der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung angegeben und sollen nicht ausgelegt werden, um den Rahmen dieser Erfindung zu limitieren.
BEISPIELE
BEISPIEL 1 Stickoxid reguliert Zellproliferation während der Drosophila-Entwicklung
Drosophila-Bestände
Drosophila melanogaster Oregon R-Stamm wurde für die meisten der beschriebenen Versuche verwendet. Transgene GMR-P35-Fliegen (3.5 und 2.1 Allele, Hay et al., Development 120: 2121–2129 (1994) waren ein großzügiges Geschenk von B. Hay und G.M. Rubin. Transgene Fliegen, die das Maus-Makrophagen-NOS (NOS2)-Gen unter Hitzeschock-Promotor (hs-mNOS20 (2)- und hs-mNOS 15(2)-Allele) trugen, wurden durch P-Element-vermittelte Keimbahn-Transformierung hergestellt. Ein 4100-Basenpaar-NotI-Fragment vom Plasmid CL-BS-mac-NOS, enthaltend das gesamte Maus-Makrophagen-NOS-Gen (Lowenstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6711–6715 (1992)), wurde in die NotI-Stelle im P-Element-Vektor pP (CaSpeR-hs) cloniert (Thummel und Pirrotta, Drosophila Information Service 71: 150 (1992)), wobei es unter die Kontrolle des Drosophila hsp70-Promotors platziert wurde. Das Konstrukt wurde in Embryonen zusammen mit dem Helfer-P-Element phs-II-Δ2-3 (Misra und Rio, Cell 62: 269–284 (1990)) co-injiziert (Spradling, P element-mediated transformation, in Drosophila: A practical approach, D.B. Roberts, Hrsg. (Oxford: IRL Press) 60–73 (1986)). Ein Satz von zwei unabhängigen homozygoten Transformanten wurde etabliert. Expression des NOS2-Transgens nach Hitzeschock-Behandlung von Larven und erwachsenen Fliegen wurde durch Diaphorase-Färbung und durch Protein- und RNA-Analyse bestätigt. In Kontrollexperimenten induzierten identische Schemata von Hitzeschock-Behandlung von nicht-transformierten Fliegen keine anatomischen Veränderungen per se.
Histochemie und Elektronenmikroskopie
NADPH-Diaphorase-Färbung wurde, wie von Dawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7797–7801 (1991) und Hope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2811–2814 (1991) beschrieben, mit geringen Modifikationen durchgeführt. Fixierungsunempfindliche NADPH-Diaphorase-Färbung reflektiert die Aktivität von verschiedenen NOS-Isoformen in Säugern und Drosophila. Imaginalscheiben wurden in 80% Glycerin eingebettet und in einem Zeiss Axiophot-Mikroskop unter Nomarski-Optik photographiert. Cobaltsulfid-Färbung der Puppen-Retinas wurde, wie von Wolff und Ready, Development 113: 825–839 (1991) beschrieben, durchgeführt. BrdU-Markierung, um Zellen in S-Phase zu identifizieren, wurde, im Wesentlichen wie von Schubiger und Palka, Devel. Biol. 123: 145–153 (1987) und von Baker und Rubin, Devel. Biol. 150: 381–396 (1992) beschrieben, mit geringen Modifikationen ausgeführt. Imaginalscheiben wurden entfernt, abgespült und in Schneider-Medium in einer 50 μg/ml-Lösung von BrdU für 30–40 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Sie wurden in 4% Formaldehyd fixiert, mit einer 1:1 Mischung von Heptan und Formaldehyd behandelt, abgespült, durch 1 M HCl entpuriniert, mit 1 % Schafserum blockiert und mit anti-BrdU-Antikörpern (Beckton-Dickinson) inkubiert. Nach ausführlichem Waschen wurden die Scheiben mit Flourescein-gekoppelten sekundären anti-Maus-Antikörpern (Boehringer-Mannheim) inkubiert. Nach dem Abspülen wurden individuelle Imaginalscheiben wegpräpariert, in Ethanol dehydratisiert und in Vectashield-Einbettungsmedium (Vector Laboratories) eingebettet. Rasterelektronenmikroskopie wurde am SUNY Stony Brook Microscopy Center, im Wesentlichen wie von Kimmel et al., Genes Devel. 4: 712–727 (1990) beschrieben, durchgeführt. Die Zahl der Ommatidien wurde sowohl durch Analysieren von Serien von Rasterelektronenmikrographien als auch durch Analysieren von Erwachsenenköpfen unter blauem Fluoreszenzlicht in einem Zeiss Axiophot-Mikroskop bestimmt.
Mikroinjektion von Larven
Zur Inhibition von NOS wurden Larven im dritten Larvenstadium mit L-Nitroargininmethylester (L-NAME), seinem inaktiven Enantiomer D-Nitroargininmethylester (D-NAME) (beide von Sigma) und 2-Ethyl-2-thiopseudoharnstoff (ETU; Calbiochem) injiziert. Die Chemikalien wurden in Schneider-Lösung in Konzentrationen von 0,1 M für L-NAME und D-NAME und 0,01 M für ETU gelöst und mit Freundschem-Adjuvans (Sigma) in einem Verhältnis von 1:3 gemischt. Mengen von 5–10 nl wurden in späte Stadien des dritten Larvenstadiums unter Verwendung einer Glasnadel mikroinjiziert. Der Zeitpunkt der Injektion von NOS-Inhibitoren, die die höchste Effizienz ergab (bestimmt durch die Änderungen im Phänotyp der Erwachsenen), wurde in Testversuchen bestimmt, und es wurde gefunden, dass es am effizientesten ist, wenn sie 5–12 Stunden vor Puparium-Bildung durchgeführt wurde. Diese Behandlung beeinträchtigte nicht den Beginn von Puparium-Bildung und Schlüpfen.
Ektopische Expression von NOS
Für eine regulierte ektopische Expression von NOS wurden Larven, die die Maus-NOS2-cDNA unter der Kontrolle des Drosophila Hitzeschock-Promotors trugen, mit Hitzeschock bei 36°C für 40 Minuten innerhalb der ersten Stunde nach Puparium-Bildung behandelt. Für BrdU-Markierungsversuche wurden Larven im dritten Larvenstadium mit Hitzeschock 5–8 Stunden vor Puparium-Bildung behandelt.
ERGEBNISSE
NOS wird in Imaginalscheiben während der Larven-Entwicklung exprimiert.
Am Ende des dritten Larvenstadiums unterziehen sich Zellen der Imaginalscheiben zeitweilig einem Zellzyklusarrest. Die Cytostase wird 12–14 Stunden nach Puparium-Bildung beendet und wird noch einmal (permanent) in der späten Puppe und dem pharaten Erwachsenen etabliert. Die Fähigkeit von NO, reversibel Zellteilung anzuhalten und zeitweiligen Wachstumsarrest zu etablieren, macht es zu einem überzeugenden Kandidaten für das Vermitteln von Cytostase in Imaginalscheiben. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden Imaginalscheiben des dritten Larvenstadiums und frühe Puppen auf NOS-Anwesenheit untersucht. Drosophila-NOS (dNOS)-Gen, das vorzugsweise im Erwachsenenkopf exprimiert wird, ist vor kurzem cloniert und charakterisiert worden (Regulski und Tully, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9072–9076 (1995)). Unterschiedliche NOS-verwandte mRNA-Arten sind jedoch im Embryo, in Larven und erwachsenen Fliegen vorhanden. Diese mRNAs können durch das clonierte dNOS-Gen oder durch andere potentielle Drosophila-NOS-Gene produziert werden, was den Nachweis der relevanten RNA-Spezies schwer macht. Daher wurde, um die Expression von NOS in Drosophila während der Larven-Entwicklung sichtbar zu machen, die histochemische Färbung für die NADPH-Diaphorase (reduziertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat-Diaphorase)-Aktivität von NOS verwendet, die die Verteilung der gesamten Enzymaktivität in einem Gewebe reflektiert (Dawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7797–7801 (1991); Hope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2811–2814 (1991); Muller, Eur. J. Neurosci. 6: 1362–1370 (1994)).
NADPH-Diaphorase-Färbung wurde in allen Imaginalscheiben, Imaginalringen, Histoblasten und dem Gehirn der Larven beginnend im dritten Larvenstadium beobachtet. Die Färbung wurde intensiver, als die Entwicklung fortschritt, und im späten dritten Larvenstadium der Larven und frühen Puppen wurde ein hoch spezifisches und reproduzierbares Muster von sehr intensiver Färbung offensichtlich. In der Imaginalscheibe des Beins wurde NADPH-Diaphorase-Färbung ursprünglich ganz am Anfang des dritten Larvenstadiums gesehen. Die Färbung war begrenzt auf das Zentrum der Scheibe, entsprechend der mutmaßlichen distalen Spitze des Beins. Als die Scheiben reiften, intensivierte sich die Diaphorase-Färbung, und im späten dritten Larvenstadium verdeckte sie beinahe die Unterscheidung zwischen individuellen konzentrischen Ringen der epithelialen Faltung, die normaler Weise in axialer Ansicht gesehen wird. Am Ende des dritten Larvenstadiums war die Färbung des Zentrums der Scheibe (distale Spitze), die sich am Beginn der dritten Periode am dunkelsten färbte, schwächer im Vergleich zu den umgebenden Zellen. Später in der Entwicklung, wenn die Scheiben begannen, sich in die Präpuppen umzuwandeln, wurde die Diaphorase-Färbung des sich bildenden Beins weniger intensiv, und ein ausgeprägtes charakteristisches Muster der Färbung von individuellen Segmenten wurde offensichtlich. 2 bis 4 Stunden nach Puparium-Bildung wurde intensive NADPH-Diaphorase-Färbung in der mutmaßlichen Tibia, den ersten und zweiten Tarsalsegmenten und dem proximalen Teil des fünften Tarsalsegments des sich bildenden Beins beobachtet. Die Färbung war in den dritten und vierten Segmenten viel schwächer, und Bereiche von intensiver Färbung waren ungleichmäßig über die Regionen des mutmaßlichen Femurs verteilt. Schwache Färbung war auch in der Hüfte und Körperwand vorhanden. Das Fortschreiten der Färbungsmuster durch die Larven-Entwicklung war hoch-spezifisch und reproduzierbar. Die Färbung der Imaginalscheiben entsprechend den ersten, zweiten und dritten Beinpaaren war sehr ähnlich. Wie bei den Imaginalscheiben des Beins zeigten andere Imaginalscheiben, Imaginalringe und Histoblasten steigend intensive NADPH-Diaphorase-Färbung, als die Larven-Entwicklung fortschritt. Flügel, Auge, Haltere und genitale Scheiben im dritten Larvenstadium hatten ausgeprägte und reproduzierbare Muster von intensiver Färbung, die graduell in einem spezifischen räumlichen Muster während der frühen Puppen-Entwicklung schwächer wurde.
Diese Ergebnisse zeigen, dass es eine graduelle und spezifische Akkumulierung von NOS in sich entwickelnden Imaginalscheiben gibt, die die höchsten Spiegel zu der Zeit erreicht, wenn das Fortschreiten durch den Zellzyklus sich verlangsamt.
Synthese von DNA wird durch Manipulationen der NOS-Aktivität beeinflusst.
Wenn NO als ein antiproliferatives Agens während der Drosophila-Entwicklung in Stadien wirkt, wenn die Zellen von Imaginalscheiben in zeitweilige Cytostase eintreten, dann könnte seine Wirkung direkt die DNA-Synthese in den Scheiben beeinflussen. Es würde dann erwartet werden, dass Inhibition von NOS die Blockierung schwächt und die Zahl von Zellen in der S-Phase erhöht; im Gegensatz dazu würden hohe Spiegel von NO zu einem Absinken der Zahl von sich teilenden Zellen führen. Um diese Hypothese zu testen und um das Ausmaß und die Verteilung des antiproliferativen Effekts von NO zu kartieren, wurde DNA-Synthese in Larven- und Präpuppen-Scheiben beobachtet, während die Spiegel der NOS-Aktivität manipuliert wurden. Um NOS-Aktivität zu inhibieren, wurden spezifische NOS-Inhibitoren in sich entwickelnde Larven injiziert. Um die Spiegel von NOS zu erhöhen, wurde die Expression des NOS-Transgens in transformierten Larven induziert, die das Maus-NOS2-cDNA-Gen (Lowenstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6711–6715 (1992)) unter der Kontrolle des Hitzeschock-Promotors trugen. NOS2 ist eine Calcium-unabhängige Form von NOS, die zu effizienter konstitutiver NO-Produktion in der Lage ist. Imaginalscheiben wurden mit 5-Bromdesoxyuridin (BrdU) markiert, und das Ausmaß und die Verteilung der Markierung von S-Phasenkernen in Beinimaginalscheiben von Larven nach Inhibierung von NOS, von NOS2-Transformanten nach Hitzeschock-Induktion und von unbehandelten Kontrolllarven wurden verglichen. Die Daten zeigen, dass signifikant mehr BrdU-markierte Zellen in Imaginalscheiben von Larven, in denen NOS-Aktivität durch L-Nitroarginin-methylester (L-NAME) unterdrückt wurde, vorhanden waren als in unbehandelten Kontrolllarven (oder Larven, die mit dem inaktiven Isomer D-NAME behandelt wurden). Die Daten zeigen auch, dass es signifikant mehr BrdU-markierte Zellen in Imaginalscheiben von Fliegen gab, in denen NOS inhibiert wurde, als in Kontrollfliegen. Im Gegensatz dazu gab es deutlich weniger BrdU-markierte Zellen in imaginalen Scheiben von induzierten, NOS-transformierten Fliegen als in nicht induzierten Kontrollen. Zur gleichen Zeit schienen diese Änderungen in der Zahl von BrdU-markierten Zellen nach Inhibition oder ektopischer Expression von NOS gleichmäßig über die gesamte Scheibe verteilt zu sein.
Diese Daten weisen darauf hin, dass Modulierung der NOS-Aktivität die Zahl von Zellen in Imaginalscheiben in der S-Phase beeinflusst, was konsistent ist mit den Beobachtungen, dass NO DNA-Synthese und Zellteilung unterdrückt.
Inhibition von NOS resultiert in Hypertrophie von Beinsegmenten.
Die höchsten Spiegel von Diaphorase-Färbung erfolgen während der Entwicklungsperiode, wenn sich DNA-Synthese und die Rate der Zellteilung in den meisten Imaginalscheibenzellen verlangsamen. Die starken antiproliferativen Eigenschaften von NO und das spezifische Muster der Diaphorasefärbung, das in reifen Imaginalscheiben gesehen wird, deutet an, dass NO als ein Wachstumsarrest-Agens in diesen Strukturen wirken könnte, das fähig ist zur Inhibition von DNA-Synthese und zur Unterstützung von zeitweiliger Cytostase während des Umschaltens zur Metamorphose. Wenn NO in der Tat als ein antiproliferatives Agens während der späten Stadien der Larven-Entwicklung wirkt, dann könnte eine Inhibition von NOS in exzessivem Wachstum von Organen und Geweben resultieren, wohingegen ektopische Überexpression des NOS-Gens den gegenteiligen Effekt haben könnte.
Um dies Hypothese zu testen, wurde NOS-Aktivität durch Injektion von spezifischen NOS-Inhibitoren in die sich entwickelnden Larven am Ende des dritten Larvenstadiums einige Stunden vor der Metamorphose inhibiert. Die meisten der Larven beendeten die Metamorphose erfolgreich, was erwachsene Fliegen innerhalb des normalen Zeitrahmens hervorbrachte. Die resultierenden Erwachsenen unterschieden sich von normalen Fliegen auf viele Weisen, wobei die dramatischsten Vergrößerungen der Anhänge und anderer Strukturen des Fliegenkörpers waren. Die Änderungen schlossen ein a) Hypertrophie des Femurs, der Tibia und der Segmente des Tarsus; b) übermäßiges Wachstum der Gewebe, die von der genitalen Scheibe abstammten; in extremen Fällen trugen diese Zellen zu mehr als einem Viertel des Fliegenkörpers bei; c) eine Vergrößerung der Gesamtoberfläche der Flügel; d) übermäßiges Wachstum der Zellen der Tergiten und Sterniten; e) Hypertrophie des Humerus; f) gelegentliche Duplikationen von manchen Bereichen des Auges; g) gelegentliche Realbildung von genitalen Strukturen, Beinen und Augen; und h) gelegentliche ektopische Bildung von deplazierten Körperstrukturen.
Die Änderungen waren in den Beinen der Erwachsenen am ausgeprägtesten und betrafen diese am häufigsten. Die Hypertrophie war besonders stark in den dritten Beinpaaren, wo der Durchmesser von bestimmten Segmenten 3–4-fach stieg. Die Anzahl von Borsten und die Zahl der Reihen von Borsten stieg auch, was bestätigt, dass Hyperproliferation der Zellen erfolgt war. Die am stärksten betroffenen Beinsegmente waren jene (erste und zweite Tarsalsegmente, Tibia und Femur), deren Vorläufer die höchsten Spiegel an NOS in den Larven- und Präpuppen-Stadien aufwiesen. Die Änderungen betrafen vorwiegend die anterioposterioren und dorsoventralen, aber nicht die proximodistalen Achsen, so dass die Länge der betroffenen Segmente die gleiche blieb. Identische Änderungen wurden beobachtet, wenn zwei strukturell nicht verwandte Inhibitoren von NOS, 2-Ethyl-2-thiopseudoharnstoff (ETU) und L-NAME (aber nicht D-NAME) verwendet wurden, was darauf hinweist, dass der beobachtete Effekt spezifisch von der Blockierung der NOS-Aktivität resultierte.
Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass Inhibition von NOS in den späten Stadien der Larven-Entwicklung in exzessiver Zellproliferation und erhöhter Größe der Strukturen der Körpers der erwachsenen Fliege resultiert.
Ektopische Expression eines Maus-NOS-Transgens resultiert in reduzierter Größe von Beinsegmenten.
Die Fähigkeit von NO, DNA-Synthese und Zellproliferation zu inhibieren, legt nahe, dass Überexpression von NOS in sich entwickelnden Larven zu verminderter Zellproliferation in den Imaginalscheiben und zu einer Reduktion in der Größe von Organen der erwachsenen Fliege führen kann. Transformierte Fliegen, die das Maus-NOS2-Transgen unter der Kontrolle des Hitzeschock-Promotors exprimieren, wurden getestet. Transgene Larven wurden innerhalb einer Stunde nach der Puparium-Bildung Hitze-geschockt, um ektopische Expression von NOS zu induzieren, bevor die letzten Zellteilungen stattfinden. Dies resultierte in einer Reduktion in der Größe der Extremitäten der Fliege. Die distalen Segmente der Beine waren am häufigsten und im höchsten Grad betroffen. In extremen Fällen war der gesamte Tarsus 1,5–2-fach verkürzt, und die dritten, vierten und fünften Segmente waren mit schwach definierten Grenzen zusammengeschmolzen. Die Zahl der Borsten in einer Reihe der betroffenen Segmente sank auch, obwohl sich die Zahl der Reihen nicht änderte. Die Segmente des erwachsenen Beins, die am öftesten durch die Überexpression von NOS betroffen waren (die dritten, vierten und fünften Tarsalsegmente), waren jene, die nicht durch die NOS-Inhibitoren betroffen waren und deren Vorläufer besonders niedrige Spiegel an Diaphorase-Färbung in den frühen Präpuppen-Stadien zeigten. Die meisten Endstrukturen des Anhangs einschließlich der tarsalen Klauen, blieben in diesen defekten Beinen intakt. Dies legt nahe, dass die beobachtete Reduktion der Größe eher auf Grund von inkomplettem Wachstum des distalen Bereichs des sich entwickelnden Anhangs als durch völligen Verlust seiner distalen Strukturen erfolgte. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der NOS-Inhibition betrafen die Änderungen nur die proximodistale Achse, während der Durchmesser der betroffenen Segmente der gleiche blieb. Zusätzlich zu der Reduktion der Größe der Beinsegmente schlossen Änderungen eine Verringerung der Gesamtoberfläche der Flügel, Schnitte in den Flügeln und reduzierte Größe von Tergiten und Sterniten ein.
Diese Ergebnisse unterstützen die Schlussfolgerung, dass ektopische Expression von NOS in den späten Stadien der Larven-Entwicklung in einer Verminderung der Zellproliferation und einer Reduzierung der Größe der Strukturen des Körpers der erwachsenen Fliege resultiert.
Inhibition von Apoptose enttarnt exzessive Proliferation.
In Beinimaginalscheiben korrelierten die Änderungen der Zahl von S-Phase-Kernen nach Manipulation der NOS-Aktivität direkt mit den Änderungen in der Größe der Erwachsenenextremitäten. In der Augenimaginalscheiben wurde jedoch beständig eine Erhöhung der Zahl von Zellen in der S-Phase nach Inhibition von NOS festgestellt, aber das resultierende Erwachsenenauge erschien gewöhnlich normal. Die Möglichkeit, dass der offensichtlich normale Augenphänotyp als ein Ergebnis von programmiertem Zelltod erfolgte, der exzessiver Zellproliferation entgegen wirkt, die durch NOS-Inhibition induziert wird, und die normale Zahl von Zellen im Auge während der Metamorphose wiederherstellt, wurde getestet. Um programmierten Zelltod zu unterdrücken, wurden GMR-P35-Fliegen verwendet (Hay et al., Development 120: 2121–2129 (1994); gespendet von Drs. B. Hay und G. Rubin), in denen Apoptose im sich entwickelnden Auge großteils durch Expression von rekombinantem Baculovirus-p35-Protein verhindert wird. p35 ist ein starker Inhibitor von Apoptose, der durch Inhibieren der Interleukin 1B-converting Enzymähnlichen Proteasen wirkt und Apoptose in vielen Zusammenhängen verhindern kann. GMR-P35-Fliegen exprimieren p35 unter der transkriptionellen Kontrolle der multimerisierten Glass-Bindungsstelle des Drosophila Rh1-Promotors. Glass-Promotor steuert die Expression des Transgens in allen Zellen in und posterior zu der morphogenetischen Furche in der Augenscheibe (Ellis et al., Development 119: 855–865 (1993)).
Wenn NOS in GMR-P35-Larven inhibiert wurde, zeigten die Augen der erwachsenen Fliegen zahlreiche Veränderungen, die die exzessive Proliferation von verschiedenen Zelltypen im sich entwickelnden Auge reflektierten. Die dramatischste dieser Änderungen war in der Zahl der Ommatidien im Erwachsenenauge, die vom beinahe unveränderlichen Komplement von 750 in Wildtyp-Fliegen (747+/–4) und unbehandelten GMR-P35-Fliegen (748+/–6) auf beinahe 820 (818+/–21) nach NOS-Inhibition in GMR-P35-Fliegen stieg. Dies zusammen mit der erhöhten Zahl von Zellen pro Ommatidium bewirkte eine Erhöhung der Gesamtgröße des Auges. Andere Änderungen in p35-exprimierenden Fliegen nach Inhibition von NOS im Vergleich zu den GMR-P35-Kontrollfliegen schlossen ein a) mehr Ommatidien mit einer unregelmäßigen Form (vielleicht auf Grund der ungleichen Erhöhung der Anzahl verschiedener Zelltypen); b) mehr Ommatidien mit einer unregelmäßigen Anordnung der Reihen; und c) mehr Ommatidien mit einer kleineren Größe.
Eine andere Manifestierung der Inhibition der NO-Produktion in GMR-P35-Fliegen war eine Steigerung der Zahl von Pigment-, Zapfen- und Borstenzellen. Wildtyp-Ommatidien enthalten zusätzlich zu acht Photorezeptorzellen einen Satz von vier Zapfenzellen und zwei primären Pigmentzellen, umgeben von einer Anordnung von sechs sekundären Pigmentzellen, drei tertiären Pigmentzellen und drei Borsten (Wolff und Ready, Pattern formation in the Drosophila retina, in The Development of Drosophila melanogaster, M. Bate und A. Martinez-Arias, Hrsg. (Cold Spring Harbor Larboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), 1277–1326 (1993)). Die Zahl an Photorezeptor- und Hilfszellen ist normalerweise konstant, und Variationen dieser Anordnung in den Augen der normalen Fliegen sind sehr selten. In GMR-P35-Fliegen war die Zahl an sekundären und tertiären Pigmentzellen von 12 auf 25 (25+/–4) Zellen pro Probenbereich (definiert wie in Hay et al., Cell 83: 1253–1262 (1995)) als ein Ergebnis von unterdrücktem programmierten Zelltod erhöht. Inhibition von NOS in diesen Fliegen resultierte in einer weiteren Erhöhung der Zahl von sekundären und tertiären Pigmentzellen auf mehr als 35 (36+/–8) pro Probenbereich. Diese Zahl übersteigt die maximale Zahl von Pigmentzellen, die in unbehandelten GMR-P35-Fliegen von programmiertem Zelltod bewahrt wurden, und legt nahe, dass zusätzliche Pigmentzellen als ein Ergebnis von exzessiver Zellproliferation hervorgebracht werden, die durch Inhibition von NOS in Kombination mit Unterdrückung von Zelltod, verursacht durch p35, verursacht wird.
Die Zahl der Ommatidien mit zusätzlichen primären Pigmentzellen in GMR-P35-Fliegen nach Inhibition von NOS war auch erhöht im Vergleich zu Kontrollfliegen, obwohl sie die Spiegel in unbehandelten GMR-P35-Fliegen nur leicht überstieg. Darüber hinaus war die Zahl an Borsten in manchen Bereichen des Auges in GMR-P35-Fliegen nach NOS-Inhibition auf bis zu 4–5 pro Ommatidium anstatt der drei, die in normalen Fliegen und unbehandelten GMR-P35-Fliegen gesehen werden, erhöht, und diese waren oft deplaziert. In ähnlicher Weise war die Zahl der Zapfenzellen von vier in normalen und unbehandelten GMR-P35-Ommatiden auf fünf und sechs in vielen Ommatidien von GMR-P35-Fliegen nach NOS-Inhibition erhöht. Ansammlungen von Ommatidien wurden auch gefunden, die eine, zwei oder drei Zapfenzellen enthielten, was inkorrekt gebildeten überzähligen Ommatidien entsprechen kann, die nicht den korrekten Satz von Zellen erlangten.
Daher enthüllte die Verhinderung von Apoptose durch Baculovirus-p35-Protein in sich entwickelnden Augen von transgenen Fliegen eine exzessive Proliferation von verschiedenen Zelltypen nach NOS-Inhibition in Larven, die andernfalls durch programmierten Zelltod in den Larven und Puppen maskiert war.
BEISPIEL 2 Stickoxid reguliert Hämatopoiese in Tieren
Erythroide Differenzierung
Um die Bildung von Zellen des erythroiden Stammbaums in der Milz der bestrahlten Empfängermäuse zu untersuchen, wurden die Tiere (Weibchen von F1 CBAxC57B1-Hybriden mit einem Gewicht von 22–24g) mit 750 cGy Gesamtkörperbestrahlung innerhalb von 3–4 Stunden vor der Transplantation behandelt. Diese Dosis wurde als ausreichend für völlige Unterdrückung von Hämatopoiese in den bestrahlten Empfängermäusen ausgetestet. BM-Zellen wurden aus den Oberschenkelknochen von syngenen Spendern gespült und intravenös in die Empfänger injiziert (10⁵ BM-Zellen pro Maus). Die Tiere erhielten zweimal täglich Injektionen von 100 mg/kg L-NAME und D-NAME und 10 mg/kg ETU für 7–10 Tage. Mäuse wurden 9–10 Tage nach der Transplantation analysiert.
Der Differenzierungsstatus der Kolonien in der Milz wurde durch morphologische Kriterien und durch immunhistochemische Tests auf die Anwesenheit von Rezeptoren für verschiedene Cytokine, die nur zu bestimmten Stadien der Reifung der erythroiden Zellen vorhanden sind, bewertet. Die Analyse der Kolonien in der Milz von Kontrolltieren und Tieren, die mit dem inaktiven Enantiomer D-NAME behandelt wurden (Tabelle 1), zeigte, dass in Übereinstimmung mit zahlreichen Daten die meisten der Kolonien in der Milz (> 60%) erythroide Kolonien enthielten, kleinere Fraktionen enthielten undifferenzierte Blastenzellen (14%) oder sowohl erythroide als auch Blastenzellen (13%) und kleine Fraktionen von Kolonien enthielten Megakaryocyten (7,5%) und Granulocyten (4%). Im Gegensatz dazu enthielten die meisten der Kolonien in der Milz, wenn Tiere mit NOS-Inhibitoren nach BM-Transplantation behandelt wurden, undifferenzierte Blastenzellen (bis zu 85% von Blastenzell-Kolonien und gemischte Blastenerythroide Zell-Kolonien). Erythroide Kolonien umfassten nur 15% der Gesamtzahl an Kolonien, und die Megakaryocyten- und Granulocyten-Kolonien waren nicht nachweisbar. Die Ergebnisse waren ähnlich mit zwei strukturell nicht verwandten NOS-Inhibitoren, was die Spezifität ihrer Wirkung bestätigte. So kehrte eine verlängerte Behandlung von Empfängermäusen nach BM-Übertragung mit einem NOS-Inhibitor das Verhältnis von Blastenzellen-enthaltenden Kolonien zu den erythroide Zellen-enthaltenden Kolonien fast um das 16-fache um, was effektiv erythroide Differenzierung verhinderte.
Tabelle 1 Bildung von hämatopoetischen Kolonien in Milzen von bestrahlten Mäusen nach Injektion von NOS-Inhibitoren.
Myeloide Differenzierung
Um die Bildung der Zellen des myeloiden Stammbaums zu untersuchen, wurden Celluloseacetat-Membranen in die Peritonealhöhle von Mäusen implantiert. Nach 7 Tagen, wenn eine Schicht von Fibroblasten die Membranen bedeckt hatte, wurden die Mäuse, wie oben beschrieben, bestrahlt. BM-Zellen von syngenen Spendern wurden in die Peritonealhöhle der Empfänger injiziert (10⁵ BM-Zellen pro Maus). Tiere erhielten Injektionen von NOS-Inhibitoren, wie oben beschrieben. Membranen mit wachsenden Kolonien wurden 7–8 Tage später isoliert und analysiert.
Der Differenzierungsstaus der Kolonien in der Milz wurde durch morphologische Kriterien, Myeloperoxidase-Reaktion und durch immunhistochemische Tests auf die Anwesenheit von Rezeptoren für verschiedene Cytokine, die nur zu bestimmten Stadien der myeloiden Zellreifung vorhanden sind, bewertet. Die Analyse der Kolonien auf den Membranen in Kontrolltieren und Tieren, die mit dem inaktiven Enantiomer D-NAME behandelt wurden (Tabelle 2), zeigte, dass in Übereinstimmung mit zahlreichen Daten die meisten Kolonien (92%) Granulocyten-Kolonien enthielten. Eine viel kleinere Fraktion enthielt undifferenzierte Blastenzellen (6%), und eine sehr kleine Fraktion von Kolonien enthielt erythroide Zellen (1,3%). Im Gegensatz dazu, wenn Tiere nach BM-Transplantation mit NOS-Inhibitoren behandelt wurden, enthielten die meisten der Kolonien auf den Membranen (bis zu 85%) undifferenzierte Blastenzellen. Kolonien mit differenzierten Zellen des Granulocyten-Stammbaums umfassten nur 15,6% der Gesamtzahl von Kolonien, und eine vernachlässigbare Fraktion der Kolonien (< 0,5%) enthielt erythroide Zellen. Die Ergebnisse waren ähnlich mit zwei strukturell nicht verwandten NOS-Inhibitoren, was die Spezifität ihrer Wirkung bestätigte. Daher kehrte eine verlängerte Behandlung von Empfängermäusen nach BM-Transfer mit NOS-Inhibitor das Verhältnis von Blastenzell-enthaltenden Kolonien zu den Granulocyten-Kolonien um fast das 80-Fache um, was effektiv eine myeloide Differenzierung verhinderte.
Tabelle 2 Bildung von hämatopoetischen Kolonien auf Celluloseacetat in der Peritonealhöhle von bestrahlten Mäusen nach Injektion von NOS-Inhibitoren.
Differenzierungsstaus von transplantierten BM-Zellen
Um das Stadium zu untersuchen, zu dem die transplantierten Zellen fortgeschritten sind, wurden Kolonien in der Milz und auf den Membranen mit spezifischen Antikörpern für Rezeptoren von verschiedenen Wachstumsfaktoren getestet. Diese Analyse ermöglicht es, sich das Stadium des vielstufigen Differenzierungsprozesses, das schlussendlich zu erythroider oder myeloider Differenzierung führt, vorzustellen und zu bewerten. Wir haben Antikörper verwendet, die spezifisch für die Rezeptoren von Interleukin 3 (IL-3-R), Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF-R), Granulocyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF-R) und Erythropoietin (EpoR) sind. Das Auftreten von jedem dieser Rezeptoren markiert ein spezifisches Stadium in der Hämatopoiese.
Die Ergebnisse der Analyse zeigen, dass die Blastenzellen in den Milzkolonien (repräsentierend erythroide Differenzierung) sich hauptsächlich in dem Stadium der Differenzierung akkumuliert haben, wo sie schon den Rezeptor für IL-3, aber nicht für Erythropoietin, GM-CSF oder G-CSF erworben haben, wohingegen die Kolonien mit morphologischen Zeichen von erythroider Differenzierung EpoR akkumuliert haben.
Die Blastenzellen in den Kolonien auf den Membranen (repräsentierend myeloide Differenzierung) haben sich hauptsächlich in dem Stadium der Differenzierung akkumuliert, wo sie schon den Rezeptor für IL-3, aber nicht für Erythropoietin, GM-CSF oder G-CSF erworben haben, wohingegen die Myeloperoxidase-positiven Kolonien mit morphologischen Zeichen von myeloider Differenzierung GM-CSF-R und G-CSF-R akkumuliert haben.
Stammzellen im Knochenmark
Um die Reifung von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark der bestrahlten Empfängermäuse zu untersuchen, wurden die Tiere, wie oben beschrieben, behandelt, und die BM-Zellen der Oberschenkelknochen von syngenen Spendern wurden intravenös in die Empfänger injiziert (10⁵ BM-Zellen pro Maus). Die Tiere erhielten Injektionen von NOS-Inhibitoren (L-NAME, sein inaktives Enantiomer D-NAME und ETU), wie oben beschrieben, und die Mäuse wurden 7–10 Tage nach der Transplantation analysiert.
Die BM-Zellen wurden auf die Anwesenheit von verschiedenen Wachstumsfaktor-Rezeptoren getestet, die als Marken des Differenzierungsstadiums dienen und auf die Anwesenheit von Stammzellen und multipotenten Vorläuferzellen hinweisen. Die BM-Präparate wurden auf Zellen getestet, die Rezeptoren für HSF (Ligand von c-kit), GM-CSF, G-CSF und IL-3 exprimieren. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass Inhibition der NO-Synthese in den Empfängertieren nach BM-Transfer zu dramatischer Erhöhung der Zahl von c-kit-positiven und IL-3-R-positiven Zellen führt, was nahe legt, dass die Population von Zellen im BM stark mit hämatopoetischen Stammzellen angereichert wird. Zur gleichen Zeit sinkt die Zahl an Zellen, die Rezeptoren für G-CSF exprimieren, was die späteren Stadien der Differenzierung markiert, fast dreifach, während die Zahl von GM-CSF-R-positiven Zellen leicht erniedrigt ist. Dies legt nahe, dass Inhibition von NOS während der Hämatopoiese selektiv das BM mit undifferenzierten Stammzellen anreichert, die schon c-kit- und IL-3-Rezeptoren erworben haben, aber nicht zu den späteren Stadien fortgeschritten sind, in dennen der Rezeptor für G-CSF synthetisiert wird.
Tabelle 3 Anwesenheit von hämatopoetischen Markern in BM-Zellen von bestrahlten Mäusen nach Injektion von NOS-Inhibitoren
Umkehrbarkeit der Wirkung von NOS-Inhibitoren in BM-Zellen
Die entscheidende Frage ist, ob undifferenzierte Stammzellen, die im Knochenmark als ein Ergebnis der Behandlung mit NOS-Inhibitoren akkumuliert sind, die Fähigkeit haben, in ein normales Stadium zurückzukehren und den normalen Hämatopoiese-Prozess fortzusetzen, sobald die Wirkung von NOS-Inhibitoren ausgeschaltet ist. Die Unfähigkeit, das zu tun, könnte darauf hinweisen, dass die Zellen in ihrem undifferenzierten Stadium belassen werden, ähnlich zu verschiedenen pathologischen Zuständen. Um diese Frage zu beantworten, wurde die Behandlung von Mäusen mit NOS-Inhibitoren 7–9 Tage nach dem BM-Transfer unterbrochen, und die BM-Zellen wurden auf die Anwesenheit von Hämatopoiese-Markern 1–7 Tage nach Beendigung der Injektionen getestet. Kontrollmäuse erhielten weiter die täglichen Injektionen. Die Ergebnisse (Tabelle 4) zeigen, dass, sobald die Behandlung mit Inhibitoren von NOS ausgesetzt wird, die Zellen in der Lage waren, ihre Differenzierung fortzuführen und zu den späteren Stadien normal fortzufahren. Dies weist darauf hin, dass eine Anreicherung von Stammzellen nach Behandlung mit NOS-Inhibitoren reversibel ist und verwendet werden kann, um die Zahl von Stammzellen zu „steigern", bevor sie induziert werden, weiter entlang ihres Differenzierungswegs fortzufahren.
Tabelle 4 Anwesenheit von hämatopoetischen Markern in BM-Zellen von bestrahlten Mäusen nach Injektion von NOS-Inhibitoren und nachfolgendem Abbrechen der Behandlung
NOS-Inhibition und Apoptose
Um zu testen, ob eine verlängerte Behandlung mit NOS-Inhibitoren die Rate an programmiertem Zelltod in BM-Zellen beeinflusst, wurde die Zahl an apoptotischen Zellen in der Präparation von BM-Zellen untersucht. Die TUNEL-Methode wurde verwendet, wodurch die Zellen mit intensiv fragmentierter DNA, einem Kennzeichen von Apoptose, offengelegt wurden und zur gleichen Zeit wurde die DAPI-Färbung verwendet, um die Kerne von allen Zellen in der Präparation sichtbar zu machen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass weder eine verlängerte Behandlung mit L-NAME noch mit ETU den Anteil von apoptotischen Zellen (8 +/– 3% in Kontrollen zu 7% +/– in L-NAME-behandelten und 8% +/– in ETU-behandelten Tieren) beeinflusste. In ähnlicher Weise beeinflusste ein Abbrechen der Behandlung mit Inhibitoren nicht den programmierten Zelltod in BM-Präparationen (9 +/– 4% der TUNEL-positiven Zellen). Dies legt nahe, dass Manipulation der NOS-Aktivität in den Tieren nach BMT, obwohl sie einen tiefgreifenden Effekt auf Differenzierung und Reifung von hämatopoetischen Zellen hat, nicht das Ausmaß von programmiertem Zelltod in BM-Zellen beeinflusst, was darüber hinaus die Umsetzbarkeit von Anwendungen von NOS-Inhibitoren zur Therapie unterstützt.
BEISPIEL 3 STICKOXID REGULIERT GEHIRNENTWICKLUNG IN WIRBELTIEREN
Es ist vor kurzem gezeigt worden, dass Stickoxid (NO), ein multifunktioneller zweiter Botenstoff, in Zell- und Gewebedifferenzierung und Entwicklung des Organismus involviert ist. NO-Synthase (NOS) kontrolliert den Übergang von Zellproliferation zu Wachstumsarrest und reguliert als eine Folge die Balance zwischen Zellproliferation und Differenzierung in kultivierten neuronalen Zellen in sich entwickelnden Drosophila und während der Hämatopoiese in Säugern (Peunova et al., 1996; Kuzin et al., 1996; Michurina et al., 1997). Hier wurde getestet, ob NOS in die Gehirnentwicklung von Wirbeltieren involviert ist. Xenopus laevis wurde als ein Modellorganismus für diese Studien gewählt, die die Untersuchung auf die Bildung des Gehirns fokussierten. Das Xenopus-NOS-Gen wurde cloniert, und die Verteilung von NOS-positiven Neuronen im sich entwickelnden Gehirn wurde untersucht. Es wurde gefunden, dass Inhibition von NOS die Zahl von Zellen im sich entwickelnden Gehirn dramatisch erhöht und die Gesamtgröße des Gehirns erhöht. Die Ergebnisse legen nahe, dass NOS direkt in die Kontrolle von Zellproliferation und neuronaler Differenzierung im sich entwickelnden Wirbeltier-Gehirn involviert ist.
Clonieren des Xenopus-NOS-Gens
Unter Verwendung der Information über die bekannten NOS-Gene wurde die NOS-cDNA von Xenopus (XnNOS) cloniert. Die Analyse seiner primären Struktur legt nahe, dass das clonierte Gen das Homolog der Ca²⁺-abhängigen neuronalen NOS-Isoform von Säugern repräsentiert. Die Analyse des Gens zeigt einen bemerkenswerten Grad von evolutionärer Konservierung mit langen Strecken von Aminosäuresequenzen, die identisch sind zu jenen von Menschen, Mäusen, Ratten und Drosophila. Das clonierte Gen produziert enzymatisch aktives Protein, wenn es in kultivierte Zellen transfiziert wird. Die primäre Struktur des Gens ermöglichte es, einen spezifischen Antikörper zu erhalten, und die Immunfluoreszenz-Analyse weist darauf hin, dass die Diaphorase-Färbung des sich entwickelnden Xenopus die Verteilung des XnNOS-Enzyms korrekt repräsentiert. Diese Feststellung wird durch in situ-Hybridisierungsanalyse von XnNOS-Transkripten im Kaulquappen-Gehirn unterstützt. Das clonierte Gen wird jetzt verwendet, um andere vermeintliche NOS-Gene von Xenopus zu isolieren.
NOS wird in einem konsistenten räumlich-zeitlichen Muster im sich entwickelnden Xenopus-Gehirn exprimiert
Das Xenopus-Gehirn unterzieht sich einer Histogenese, startend bei Stadium 39–40; davor besteht das Neuronalrohr aus sich schnell teilenden undifferenzierten neuroepithelialen Zellen. Im wachsenden Gehirn der Xenopus-Kaulquappe werden neue Zellen in der engen Zone der Keimschicht in einem definierten Muster hervorgebracht, das durch Markierung mit BrdU offen gelegt werden kann. Die Verteilung der NADPH-Diaphorase-Färbung (die auf NOS-Expression hinweist) im Xenopus-Gehirn von Stadium 40 bis Stadium 50 wurde analysiert. Zonen von Färbung erschienen zuerst im Stadium 43, dem Zeitpunkt der Migration von jungen Neuronen weg vom Neuronalrohr und ihrer Differenzierung. Färbung erschien außerhalb der Keimschicht und wurde intensiver, als die Entwicklung von Kaulquappen fortschritt. Die intensivste Färbung wurde in einzelnen großen differenzierten Neuronen im Tectum und Rückenmark und in der Randzone des Tectum, die aus Fortsätzen von differenzierten Neuronen zusammengesetzt ist, beobachtet. Der Gradient der Diaphorase-Färbung war latero-medial und umgekehrt zu dem Muster der Proliferation, was nahe legt, dass Zonen von aktiver Proliferation in der Keimschicht während dieser Stadien frei von NOS-Aktivität blieben.
Inhibition von NOS im sich entwickelnden Gehirn resultierte in exzessiver Proliferation von jungen Neuronen
Um zu testen, ob NOS in den Wachstumsarrest in neuronalen Vorläufern im sich entwickelnden Xenopus-Gehirn involviert ist, wurde die NO-Produktion durch Einbringen von Plastikstücken, die mit NOS-Inhibitoren L-NAME und ETU imprägniert waren, in den Ventrikel des Kaulquappen-Gehirns im Stadium 43 blockiert. Nach 3, 7 und 12 Tagen wurden die Tiere auf Änderungen in den Mustern der Zellteilung, Differenzierung, des Überlebens und der Morphologie des Gehirns untersucht. BrdU-Markierung zeigte eine dramatische Steigerung der Zahl von Zellen in der S-Phase des Zellzyklus in den Inhibitor-behandelten Gehirnen im Vergleich zu den Kontrollgehirnen. Die Zahl an BrdU-positiven Zellen im Tectum stieg konstant im Verlauf des Versuches. Färbung von Zellkernen mit DAPI legte eine höhere Zahl von Zellen in den Gehirnschnitten in jedem Zeitintervall des Experiments offen, was darauf hinweist, dass überschüssige Zellen in der S-Phase erfolgreich den Zellzyklus durch Mitose beendeten.
Inhibition von NOS und programmierter Zelltod
Ob die Inhibition von NOS und exzessive Proliferation von Zellen im sich entwickelnden Gehirn den programmierten Zelltod von Neuronen im Tectum beeinflusst, wurde untersucht. Unter Verwendung der TUNEL-Technik, um die apoptotischen Zellen im Gehirn sichtbar zu machen, wurde gefunden, dass am Tag 3 die Zahl an TUNEL-positiven Zellen die gleiche sowohl in der Kontrolle als auch dem Inhibitor-behandelten Tectum war. Nach 7 und 12 Tagen gab es jedoch mehr apoptotische Zellen in den Gehirnen von Tieren, die NOS-Inhibitoren erhielten, als in Kontrolltieren. Die Erhöhung der Zahl von TUNEL-positiven Zellen erfolgt nicht auf Grund der Toxizität der Inhibitoren, da Zellen fortfuhren, BrdU sehr effektiv zu inkorporieren. Identische Veränderungen wurden mit zwei strukturell nicht verwandten Inhibitoren von NOS beobachtet, was darauf hinweist, dass die Effekte spezifisch vom Blockieren der NOS-Aktivität resultierten. Diese Daten legen nahe, dass exzessive Proliferation von Zellen im Tectum zu Aktivierung von programmiertem Zelltod führt, was bewirkt, die überschüssigen Neuronen zu entfernen. Alternativ kann dies darauf hinweisen, dass differenzierte Neuronen zum Überleben von NO abhängig wurden, ähnlich zu der Situation in vollständig differenzierten PC12-Zellen (Peunova et al., 1996).
Neuronale Differenzierung im Gehirn wird durch Inhibition von NOS beeinflusst
Um zu testen, ob exzessive Zellproliferation, die durch NOS-Inhibitoren induziert wird, die Verteilung und Differenzierung von Neuronen im Xenopus-Gehirn beeinflusst, wurden Antikörper gegen spezifische neuronale Marker verwendet, die ein spezifisches und hoch reproduzierbares Expressionsmuster während der Xenopus-Entwicklung haben. Es wurde gefunden, dass die Verteilung von Neuronen, die positiv sind für Islet-1, N-Tubulin und N-CAM, nach Inhibition von NOS verändert war. Insbesondere wurden die Neuronen in die Randzone verlagert, die Neuronen in der Zwischenschicht waren heterogener und mit kürzeren Verzweigungen als in Kontrollgehirnen, und die ausgeprägte geschichtete Struktur des Tectum war verändert. Zusätzlich war die Zahl von Islet-1-positiven Motoneuronen nach Inhibition von NOS erhöht.
Inhibition von NOS führt zu ektopischer Proliferation von neuronalen Vorläufern
Das Xenopus-Gehirn hat eine feine Cytoarchitektur. Gruppen von benachbarten Zellen teilen den Platz und die Zeit der Geburt und sind in allgemeine lokale Kreisläufe involviert. Die Position von jungen und reifen Neuronen im Gehirn ist streng abhängig vom Platz ihrer Geburt, Migration und endgültigen Differenzierung und bildet ein charakteristisches Muster. In den Gehirnen von Tieren, die mit Inhibitoren von NOS behandelt wurden, wurden zusätzlich zu extra-Schichten von jungen, sich teilenden neuronalen Vorläufern zahlreiche ektopische Stellen von neuronaler Proliferation gefunden. Große Ansammlungen von Zellen wurden in atypischer Lage beobachtet, die die Randzone, verschiedene Bereiche des Tectum, das Telencephalon und das Rautenhirn besetzten.
Inhibition von NOS erhöht die Gesamtgröße des Gehirns
Inhibition der NOS-Aktivität in den Gehirnen von sich entwickelnden Kaulquappen resultierte in erhöhter Zahl von Zellen in der S-Phase, begleitet von einem bescheidenen Ansteigen des programmierten Zelltods in späten Stadien. Zusammen erhöhte dies die Gesamtzahl an Zellen im Gehirn und erhöhte folglich die Gesamtgröße des Gehirns. Die am meisten betroffenen Bereiche sind das optische Tectum und der Bereich unmittelbar anschließend an den Ventrikel, wo das imprägnierte Plastikstück inseriert worden war. In Fällen, in dennen die Quelle des NOS-Inhibitors im Ventrikel in Richtung des Telencephalons oder der Rautenhirnregionen im sich entwickelnden Gehirn verschoben wurde, wurde eine Steigerung der Größe der anterioren beziehungsweise der posterioren Teile des Gehirns beobachtet.
Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass NO die Zahl an Neuronen im sich entwickelnden Gehirn kontrolliert und eine Inhibition von NOS direkt die Größe des Xenopus-Gehirns beeinflusst. Dies bestätigt die Rolle von NO als ein allgemeiner Regulator von Zell- und Gewebedifferenzierung im Organismus. Dies legt nahe, dass Manipulationen der NO-Spiegel für therapeutische Zwecke verwendet werden können, um Proliferation und folgende Differenzierung von Nervenzellen in der Ersatztherapie nach neurodegenerativen Störungen, die durch Altern (z.B. Alzheimer-, Parkinson-Krankheit oder Chorea Huntington), Schlaganfall oder Trauma verursacht werden, zu kontrollieren.

Claims

Verwendung eines Inhibitors von Stickoxid für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung, welche verursacht wird durch Altern, Alzheimer, Parkinson, Huntington, Osteoporose, Verbrennungen, Wunden, Erkrankungen, welche durch Hyperproliferation von Keratinocyten verursacht werden, Psoriasis, Schlaganfall, Trauma, Restenose, toxische Verletzung der Leber, Fortpflanzungssystem-Erkrankungen, Transplantat-versus-Empfänger-Erkrankung, zur Vermehrung von Stammzellen in der Stammzelltherapie, einen hämatologisch mangelhaften Zustand, welcher z.B. durch Chemotherapie verursacht wird, und hämatologische Erkrankungen, und wobei die Verwendung die Verwendung menschlicher Embryonen für industrielle oder gewerbliche Zwecke ausschließt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Behandlung in einem Säuger eine Population von Vorläuferzellen in einem Gewebe erhöht, wobei der Säuger einer erhöhten Population an Vorläuferzellen bedarf.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei die Vorläuferzelle eine Stammzelle ist, z.B. ein/eine Osteoblast, Chondrocyt, mesenchymale Stammzelle, Keratinocyt oder neuronaler Vorläufer.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Gewebe Knochenmark, Haut, Muskel, Gehirn, Pankreas, Fortpflanzungsorgane oder neuronales Gewebe ist.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Gewebe mit dem Inhibitor in Kontakt gebracht wird (z.B. ex vivo), wobei Gewebe mit einer erhöhten Population an Vorläuferzellen erzeugt wird, welche fähig sind, normale Differenzierung zu durchlaufen.
Verwendung gemäß Anspruch 2 oder 5, wobei das Gewebe mit einer erhöhten Population an Vorläuferzellen in einen Säuger mit Bedarf dafür implantiert wird.
Verwendung gemäß Anspruch 2 oder 5, wobei das Gewebe Knochenmark und die Vorläuferzelle eine hämatopoetische Stammzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Differenzierung von Zellen der erythrocytären Reihe oder Knochenmarkszellen verhindert wird.
Verwendung gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei das Gewebe ferner mit mindestens einem Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht wird, welcher ausgewählt wurde, die Differenzierung einer ausgewählten Zellpopulation zu induzieren.
Verwendung gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei der Inhibitor des Stickoxids ein Inhibitor der Stickoxid-Synthase ist, z.B. L-Nitroargininmethylester, 2-Ethyl-2-thiopseudoharnstoff, Aminoguanidinhemisulfat oder N-Monomethyl-L-arginin.
In vitro-Verfahren zur Erhöhung einer Population von Vorläuferzellen in einem Gewebe, welches den Schritt des Hinzufügens eines Inhibitors von Stickoxid umfasst, wobei das Verfahren die Verwendung von menschlichen Embryonen für industrielle oder gewerbliche Zwecke ausschließt.
In vitro-Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Vorläuferzelle eine Stammzelle ist.
In vitro-Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Vorläuferzelle ein/eine Osteoblast, Chondrocyt, mesenchymale Stammzelle, Keratinocyt oder neuronaler Vorläufer ist.
In vitro-Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Gewebe Knochenmark, Haut, Muskel, Gehirn, Pankreas, Fortpflanzungsorgane oder neuronales Gewebe ist.
In vitro-Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Gewebe mit dem Inhibitor in Kontakt gebracht wird (z.B. ex vivo), wobei Gewebe mit einer erhöhten Population von Vorläuferzellen erzeugt wird, welche fähig sind, normale Differenzierung zu durchlaufen.
In vitro-Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 15, wobei das Gewebe mit einer erhöhten Population an Vorläuferzellen zur Implantierung in einen Säuger mit Bedarf dafür geeignet ist.
In vitro-Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 15, wobei das Gewebe Knochenmark und die Vorläuferzelle eine hämatopoetische Stammzelle ist.
In vitro-Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Differenzierung von Zellen der erythrozytären Reihe oder Knochenmarkszellen verhindert wird.
In vitro-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 18, wobei das Gewebe ferner mit mindestens einem Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht wird, welcher ausgewählt wurde, um Differenzierung einer ausgewählten Zellpopulation zu induzieren.
In vitro-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 19, wobei der Inhibitor von Stickoxid ein Inhibitor von Stickoxid-Synthase ist, z.B. L-Nitroargininmethylester, 2-Ethyl-2-thiopseudoharnstoff Aminoguanidinhemisulfat oder N-Monomethyl-L-arginin.
Verwendung eines Inhibitors von Stickoxid für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in der Behandlung einer hämatologischen Erkrankung, wobei die Verwendung die Verwendung menschlicher Embryonen für industrielle oder gewerbliche Zwecke ausschließt.
Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei Knochenmark mit dem Inhibitor in Kontakt gebracht wird, wobei Knochenmark mit einer erhöhten Population an hämatopoetischen Stammzellen erzeugt wird, welche fähig sind, normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen.
Verwendung gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei Knochenmark ferner mit mindestens einem hämatopoetischen Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht wird, welcher ausgewählt wurde, um die Differenzierung einer ausgewählten Zellpopulation zu induzieren.
Verwendung eines Inhibitors von Stickoxid für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer hämatologischen Erkrankung, wobei die Verwendung die Verwendung menschlicher Embryonen für industrielle oder gewerbliche Zwecke ausschließt und die Behandlung umfasst: (a) das Erhalten von Knochenmark, welches in den Säuger transplantiert werden soll; (b) das Inkontaktbringen des zu transplantierenden Knochenmarks mit dem Inhibitor von Stickoxid, wobei Knochenmark mit einer erhöhten Population an hämatologischen Stammzellen erzeugt wird, welche fähig sind, normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen; (c) das Transplantieren des Knochenmarks von Schritt (b) in den zu behandelnden Säuger, wobei der Säuger mit Knochenmark mit einer erhöhten Population an hämatopoetischen Stammzellen versehen wird, welche fähig sind, normale Hämatopoiese und Differenzierung zu durchlaufen.
Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei die Behandlung ferner umfasst: (d) das Behandeln des Säugers mit einem Enhancer von Stickoxid oder mindestens einem Wachstumsfaktor nach dem Transplantieren des Knochenmarks.
Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei die Behandlung ferner umfasst: (d) das Behandeln des Säugers mit einem Inhibitor von Stickoxid nach dem Transplantieren des Knochenmarks.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei der Inhibitor ein Inhibitor von Stickoxid-Synthase ist, z.B. L-Nitroargininmethylester, 2-Ethyl-2-thiopseudoharnstoff Aminoguanidinhemisulfat oder N-Monomethyl-L-arginin.