DE69735292T2

DE69735292T2 - Gefaesszellen wachstumsfaktor (vegf) nukleinsäureligand-komplexe

Info

Publication number: DE69735292T2
Application number: DE69735292T
Authority: DE
Inventors: Nebojsa Boulder JANJIC; Larry Boulder Gold; G. Paul Niwot SCHMIDT; Chandra Thornton VARGEESE; Michael Louisville WILLIS
Original assignee: Gilead Sciences Inc
Current assignee: Gilead Sciences Inc
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2017-10-18
Also published as: KR100514929B1; EP0957929A1; NZ334859A; GEP20094799B; JP3626503B2; ES2259188T3; NL300234I2; EP1685842A3; CA2269072C; EP1685842A2; JP2005046160A; EP0957929A4; WO1998018480A1; CA2269072A1; RU2177950C2; PT957929E; ATE318143T1; DK0957929T3; JP4160038B2; EP0957929B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Hier werden Hochaffinitäts-2'-Fluoro(2'-F)-Pyrimidin-RNA-Liganden für den vaskulären Endothelwachstumsfaktor (VEGF) beschrieben. Das hier benutzte Verfahren zur Identifizierung solcher Nukleinsäureliganden wird SELEX genannt, ein Kurzzeichen für „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment" [Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung]. Ferner ist in dieser Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Komplexes enthalten, die einen VEGF-Nukleinsäureliganden und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfassen, indem ein VEGF-Nukleinsäureligand durch SELEX-Methodik identifiziert wird, und indem der VEGF-Nukleinsäureligand mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung kovalent verlinkt wird. Die Erfindung enthält ferner Komplexe, die einen oder mehrere VEGF-Nukleinsäureliganden und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfassen. Die Erfindung betrifft ferner die Verbesserung der Pharmakokinetik-Eigenschaften eines VEGF-Nukleinsäureliganden durch die kovalente Verlinkung des VEGF-Nukleinsäureliganden mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung, um einen Komplex zu bilden. Die Erfindung betrifft ferner die Verbesserung der Pharmakokinetik-Eigenschaften eines VEGF-Nukleinsäureliganden durch die Verwendung eines Lipidkonstrukts, das einen VEGF-Nukleinsäureliganden oder einen Komplex umfasst, der einen VEGF- Nukleinsäureliganden und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst. Diese Erfindung betrifft ferner eine Methode zum Targeting eines therapeutischen oder diagnostischen Wirkstoffs auf ein biologisches Target, das VEGF exprimiert, indem der Wirkstoff mit einem Komplex assoziiert wird, der einen VEGF-Nukleinsäureliganden und eine lipophile Verbindung oder eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht umfasst, wobei der Komplex ferner mit einem Lipidkonstrukt assoziiert ist, und der VEGF-Nukleinsäureligand ferner mit dem Äußeren des Lipidkonstrukts assoziiert ist.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
A. SELEX
Jahrelang galt das Dogma, dass Nukleinsäuren primär eine informatorische Rolle spielten. Durch eine Methode, die als systematische Evolution der Liganden durch exponentielle Anreicherung, genannt SELEX, bekannt ist, wurde deutlich, dass Nukleinsäuren eine dreidimensionale strukturelle Diversität, nicht unähnlich den Proteinen, aufweisen. SELEX ist eine Methode zur In-vitro-Evolution der Nukleinsäuremoleküle mit hoch spezifischer Bindung an Targetmoleküle und wird in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/536,428, die am 11. Juni 1990 mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment" eingereicht wurde und jetzt eingestellt ist, in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/714,131, eingereicht am 10. Juni 1991 mit dem Titel „Nucleic Acid Ligands," jetzt US-Patentschrift Nr. 5,475,096, in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/931,473, eingereicht am 17. Aug. 1992 mit dem Titel „Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands", jetzt US-Patentschrift Nr. 5,270,163 (vergleiche auch WO 91/19813) beschrieben. Jede dieser Anmeldungen, die hier kollektiv SELEX-Patentanmeldungen genannt werden, beschreibt eine grundsätzlich neue Methode zur Umwandlung eines Nukleinsäureliganden in irgendein gewünschtes Targetmolekül. Der SELEX-Vorgang stellt eine Klasse von Produkten bereit, die Nukleinsäureliganden genannt werden, wobei jeder Ligand eine einmalige Sequenz aufweist, und die die Eigenschaft hat, spezifisch an eine gewünschte Targetverbindung oder ein gewünschtes Targetmolekül zu binden. Jeder mit SELEX identifizierte Nukleinsäureligand ist ein spezifischer Ligand einer gegebenen Targetverbindung oder eines gegebenen Targetmoleküls. SELEX basiert auf der einmaligen Einsicht, dass Nukleinsäuren ausreichende Kapazität zur Bildung einer Vielzahl zwei- und dreidimensionaler Strukturen und ausreichende chemische Wandelbarkeit aufweisen, die innerhalb ihrer Monomere verfügbar ist, um als Liganden (Bildung spezifischer Bindungspaare) mit praktisch jeder chemischen Verbindung, egal ob monomerisch oder polymerisch, zu agieren. Moleküle jeder Größe und Zusammensetzung können als Targets dienen.
Die SELEX-Methode beinhaltet die Auswahl aus einem Gemisch von Kandidatenoligonukleotiden und die schrittweisen Wiederholungen von Bindung, Trennung und Amplifikation unter Verwendung des gleichen allgemeinen Auswahlschemas, um praktisch jedes gewünschte Kriterium der Bindungsaffinität und Selektivität zu erreichen. Ausgehend von einem Gemisch aus Nukleinsäuren, die vorzugsweise ein Segment einer randomisierten Sequenz umfassen, umfasst die SELEX-Methode Schritte, in denen das Gemisch, unter Bedingungen, die für die Bindung günstig sind, mit dem Target in Kontakt gebracht wird, die ungebundenen Nukleinsäuren von den Nukleinsäuren, die spezifisch an Targetmoleküle gebunden waren, getrennt werden, die Nukleinsäure-Target-Komplexe dissoziiert werden, die Nukleinsäuren, die von den Nukleinsäure-Target- Komplexen dissoziiert sind, amplifiziert werden, um ein mit Liganden angereichertes Gemisch aus Nukleinsäuren zu liefern, dann die Schritte der Bindung, Trennung, Dissoziation und Amplifikation durch so viele Zyklen wie gewünscht wiederholt werden, um hochspezifische Nukleinsäureliganden mit hoher Affinität zum Targetmolekül zu liefern.
Die betreffenden Erfinder haben erkannt, dass die SELEX-Methode beweist, dass Nukleinsäuren als chemische Verbindungen ein breites Spektrum von Formen, Größen und Konfigurationen bilden können, und in der Lage sind, ein weit größeres Repertoire von Bindungsfunktionen und anderen Funktionen aufweisen können, als jene, die von Nukleinsäuren in biologischen Systemen offenbart werden.
Die betreffenden Erfinder haben erkannt, dass SELEX oder SELEX-ähnliche Vorgänge verwendet werden können, um Nukleinsäuren zu identifizieren, die jede gewählte Reaktion vereinfachen können, auf ähnliche Weise wie Nukleinsäureliganden für jedes gegebene Target identifiziert werden können. In der Theorie setzen die betreffenden Erfinder voraus, dass in einem Kandidatengemisch von ungefähr 10¹³ bis 10¹⁸ Nukleinsäuren mindestens eine Nukleinsäure mit der geeigneten Form existiert, um jede einer großen Vielzahl physikalischer und chemischer Interaktionen zu erleichtern.
Die Basis-SELEX-Methode wurde modifiziert, um eine Reihe spezifischer Ziele zu erreichen. Zum Beispiel beschreibt die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/960,093, eingereicht am 14. Okt. 1992 mit dem Titel „Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure" die Verwendung von SELEX in Verbindung mit Gelelektrophorese, um Nukleinsäuremoleküle mit spezifischen strukturellen Merkmalen auszuwählen, wie etwa Bent-DNA. Die US- Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/123,935, eingereicht am 17. Sept. 1993 mit dem Titel „Photoselection of Nucleic Acid Ligands", beschreibt eine SELEX-basierte Methode zur Auswahl von Nukleinsäureliganden, die photoreaktive Gruppen enthalten, die in der Lage sind, ein Targetmolekül zu binden und/oder photochemisch zu vernetzen und/oder zu photoinaktivieren. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/134,028, eingereicht am 7. Okt. 1993 mit dem Titel „High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine", jetzt US-Patentschrift Nr. 5,580,737, beschreibt eine Methode zur Identifikation hochpezifischer Nukleinsäureliganden, die zwischen nah verwandten Molekülen unterscheiden können, welche nicht-peptidisch sein können, die Counter-SELEX genannt wird. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/143,564, eingereicht am 25. Okt. 1993 mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX" jetzt US-Patentschrift Nr. 5,567,588, beschreibt eine SELEX-basierte Methode, die die höchst effiziente Trennung zwischen Oligonukleotiden mit hoher und niedriger Affinität für ein Targetmolekül erreichen kann.
Die SELEX-Methode umschließt die Identifikation von Hochaffinitäts-Nukleinsäureliganden, die modifizierte Nukleotide enthalten, die dem Liganden verbesserte Merkmale verleihen, wie etwa verbesserte In-vivo-Stabilität oder verbesserte Verabreichungsmerkmale. Beispiele solcher Modifikationen enthalten chemische Substitutionen an den Ribose- und/oder Phosphat- und/oder Basenpositionen. SELEX-identifizierte Nukleinsäureliganden, die modifizierte Nukleotide enthalten, werden in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/117,991, eingereicht am 8. Sept. 1993 mit dem Titel „High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", jetzt US-Patentschrift Nr. 5,660,985 beschrieben, die Oligonukleotide beschreibt, die chemisch modifizierte Nukleotidderivate an den 5- und 2'- Positionen der Pyrimidine enthalten. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/134,028, oben, beschreibt hoch spezifische Nukleinsäureliganden, die ein oder mehrere Nukleotide enthalten, die mit 2'-Amino(2'-NH2), 2'-Fluoro(2'-F), und/oder 2'-O-Methyl(2'-OMe) modifiziert sind. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/264,029, eingereicht am 22. Juni 1994 mit dem Titel „Novel Method of Preparation of Known und Novel 2'-Modified Nucleosides by Intramolecular Nucleophilic Displacement", beschreibt Oligonukleotide, die verschiedene 2'-modifizierte Pyrimidine enthalten.
Die SELEX-Methode umschließt die Kombination ausgewählter Oligonukleotide mit anderen ausgewählten Oligonukleotiden und nicht-Oligonukleotid-funktionellen Einheiten, wie in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/284,063 beschrieben, eingereicht am 2. Aug. 1994 mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX" jetzt US-Patentschrift Nr. 5,637,459, bzw. US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/234,997, eingereicht am 28. April 1994 mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX". Diese Anmeldungen ermöglichen die Kombination eines breiten Spektrums von Formen und anderer Eigenschaften und effiziente Amplifikations- und Replikationsmerkmale von Oligonukleotiden, mit den gewünschten Eigenschaften anderer Moleküle.
Die SELEX-Methode umschließt ferner die Kombination ausgewählter Nukleinsäureliganden mit lipophilen Verbindungen oder nicht-immunogenen Verbindungen mit hohem Molekulargewicht in einem diagnostischen oder therapeutischen Komplex, wie in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/434,465, eingereicht am 4. Mai 1995 mit dem Titel „Nucleic Acid Complexes", beschrieben. VEGF-Nukleinsäureliganden, die mit einer lipophilen Verbindung, wie etwa Diacylglycerol oder Dialkylglycerol, in einem diagnostischen oder therapeutischen Komplex assoziiert sind, werden in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/739,109, eingereicht am 25. Okt. 1996, mit dem Titel „Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes", beschrieben. VEGF-Nukleinsäureliganden, die mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht, wie etwa Polyethylenglykol oder einer lipophilen Verbindung, wie etwa Glycerolipid, Phospholipid oder Glycerolamidlipid in einem diagnostischen oder therapeutischen Komplex assoziiert sind, werden in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/897,351, eingereicht am 21. Juli 1997 mit dem Titel „Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Complexes", beschrieben.
B. LIPIDKONSTRUKTE
Lipiddoppelschichtvesikel sind geschlossene, flüssigkeitsgefüllte mikroskopische Kugeln, die hauptsächlich aus individuellen Molekülen gebildet werden, die polare (hydrophile) und nicht polare (lipophile) Abschnitte aufweisen. Die hydrophilen Abschnitte können Phosphato-, Glycerylphosphato-, Carboxy-, Sulfato-, Amino-, Hydroxy- oder Cholingruppen oder andere polare Gruppen umfassen. Beispiele lipophiler Gruppen sind gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffe, wie etwa Alkyl, Alkenyl oder andere Lipidgruppen. Es können auch Sterole (z. B. Cholesterin) und andere pharmazeutisch verträgliche Adjuvanzien (einschließlich Antioxidanzien wie alpha-Tocopherol) zugesetzt werden, um die Vesikelstabilität zu verbessern oder andere gewünschte Merkmale zu verleihen.
„Liposome" sind eine Untergruppe der Lipiddoppelschichtvesikel und bestehen hauptsächlich aus Phospholipidmolekülen, die zwei hydrophobe Schwänze, bestehend aus langen Fettsäureketten, enthalten. Werden sie Wasser ausgesetzt, richten sich diese Moleküle spontan aus, um Doppelschichtmembranen mit den lipophilen Enden der Moleküle in jeder assoziierten Schicht im Zentrum der Membran zu bilden, und dabei bilden die gegenüberliegenden polaren Enden jeweils die innere bzw. äußere Oberfläche der Doppelschichtmembran(en). Somit weist jede Seite der Membran eine hydrophile Oberfläche auf, während das Innere der Membran ein lipophiles Medium umfasst. Diese Membranen können in einer Serie konzentrischer kugelförmiger Membranen, getrennt durch dünne Wasserstraten, ähnlich den Schichten einer Zwiebel, um einen inneren wässrigen Raum herum angeordnet sein. Diese multilamellaren Vesikel (MLV) können durch das Anwenden einer Scherkraft in unilamellare Vesikel (UV) umgewandelt werden.
Die therapeutische Verwendung von Liposomen enthält die Verabreichung von Arzneimitteln, die in freier Form normalerweise toxisch sind. In liposomaler Form ist das toxische Arzneimittel okkludiert und kann von den Geweben weggelenkt werden, die gegenüber dem Arzneimittel empfindlich sind, und es zu ausgewählten Bereichen targetieren. Liposome können therapeutisch auch verwendet werden, um Arzneimittel über einen längeren Zeitraum abzugeben und dadurch die Häufigkeit der Applikation zu reduzieren. Zusätzlich können Liposome eine Methode zur Bildung wässriger Dispersionen hydrophober oder amphiphiler Arzneimittel bereitstellen, die normalerweise für die intravenöse Verabreichung nicht geeignet sind.
Damit viele Arzneimittel und bildgebende Wirkstoffe ein therapeutisches oder diagnostisches Potential haben können, müssen sie an die richtige Stelle im Körper verabreicht werden, und somit kann das Liposom leicht injiziert werden und die Basis für die stetige Abgabe und Arzneimittel-Verabreichung an spezifische Zelltypen oder Teile des Körpers bilden. Mehrere Techniken können für die Verwendung von Liposomen genutzt werden, um eingekapselte Arzneimittel zu ausgewähltem Wirtsgewebe und weg von empfindlichen Geweben zu targetieren. Diese Techniken enthalten die Manipulation der Größe der Liposome, ihre Nettooberflächenladung und ihren Applikationsweg. MLVs werden gewöhnlich, primär weil sie relativ groß sind, schnell vom retikuloendothelialen System (hauptsächlich Leber und Milz) aufgenommen. Bei UVs wurde andererseits festgestellt, dass sie erhöhte Umlaufzeiten, verringerte Clearanceraten und im Vergleich zu den MLVs eine größere Biodistribution aufweisen.
Die passive Verabreichung von Liposomen enthält die Verwendung verschiedener Applikationswege, z. B. intravenös, subkutan, intramuskulär und topisch. Jeder Weg unterscheidet sich in der Lokalisierung der Liposome. Zwei übliche Methoden, die verwendet werden, um Liposome aktiv auf ausgewählte Targetbereiche zu lenken, beinhalten die Anlagerung entweder von Antikörpern oder spezifischen Rezeptorliganden an die Oberfläche der Liposome. Antikörper sind für ihre hohe Spezifität gegenüber ihrem entsprechenden Antigen bekannt und wurden an die Oberfläche der Liposome angelagert, aber in vielen Fällen waren die Ergebnisse nicht sehr erfolgreich. Einige Anstrengungen waren jedoch erfolgreich dabei, Liposome ohne die Verwendung von Antikörpern zu Tumoren zu targetieren, vergleiche zum Beispiel die US-Patentschriften Nr. 5,019,369, 5,441,745 oder 5,435,989.
Ein Entwicklungsbereich, der von den Forschern aggressiv verfolgt wird, ist die Verabreichung von Wirkstoffen nicht nur an einen spezifischen Zelltyp, sondern in das Cytoplasma der Zelle und sogar in den Nukleus. Dies ist besonders wichtig für die Verabreichung biologischer Wirkstoffe, wie etwa DNA, RNA, Ribozyme und Proteine. Ein viel versprechender therapeutischer Ansatz in diesem Bereich umschließt die Verwendung von Antisense- DNA- und -RNA-Oligonukleotiden zur Behandlung einer Krankheit. Ein Hauptproblem, das bei der wirksamen Anwendung der Antisense-Technologie auftritt, ist, dass die Oligonukleotide in ihrer Phosphodiesterform in den Körperflüssigkeiten und durch intrazelluläre und extrazelluläre Enzyme, wie etwa Endonukleasen und Exonukleasen, schnell abgebaut werden, bevor die Targetzelle erreicht wird. Die intravenöse Applikation führt auch zu einer schnellen Clearance aus dem Blutstrom durch die Niere, und die Aufnahme reicht nicht aus, um eine wirksame intrazelluläre Arzneimittelkonzentration zu produzieren. Liposom-Einkapselung schützt die Oligonukleotide vor den Abbauenzymen, erhöht die Zirkulationshalbwertszeit und erhöht die Aufnahmeeffizienz als Ergebnis der Phagocytose der Liposome. Auf diese Weise können Oligonukleotide ihr gewünschtes Target erreichen und können in vivo an Zellen verabreicht werden.
Es wurden wenige Fälle berichtet, in denen Forscher Antisense-Oligonukleotide an lipophile Verbindungen oder nicht-immunogene Verbindungen mit hohem Molekulargewicht angelagert haben. Antisense-Oligonukleotide sind jedoch nur als intrazelluläre Wirkstoffe wirksam. Antisense-Oligodesoxyribonukleotide, die auf den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGF) targetiert wurden, wurden in Liposome eingekapselt, die mit Folat über einen Polyethylenglykolspacer (Folat-PEG-Liposome) verlinkt sind und in kultivierten KB-Zellen über Folat-Rezeptor-vermittelte Endocytose verabreicht wurden (Wang et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3318–3322). Zusätzlich wurden Alkylendiole an Oligonukleotide angelagert (Weiss et al., US-Patentschrift Nr. 5,245,022). Außerdem wurde eine lipophile Verbindung, die kovalent an ein Antisense-Oligonukleotid angelagert wurde, in der Literatur ( EP 462 145 B1 ) bewiesen.
Das Laden biologischer Wirkstoffe in Liposome kann durch den Einschluss in die Lipidformulierung oder das Laden in die vorgebildeten Liposome erfolgen. Die passive Verankerung von Oligopeptid- und Oligosaccharidliganden an die äußere Oberfläche der Liposome wurde von (Zalipsky et al. (1997) Bioconjug. Chem. 8:111:118) beschrieben.
C. VEGF
Das Wachstum neuer Blutgefäße aus dem vorhandenen Endothel (Angiogenese) wird bei gesunden Erwachsenen streng kontrolliert durch die gegensätzlichen Wirkungen positiver und negativer Regulatoren. Unter einigen pathologischen Bedingungen, einschließlich proliferativer Retinopathien, rheumatoider Arthritis, Psoriasis und Krebs, herrschen die positiven Regulatoren vor, und die Angiogenese trägt zum Fortschreiten der Krankheit bei (untersucht in Folkman (1995) Nature Medicine 1:27-31). Bei Krebs wird die Ansicht, dass Angiogenese den begrenzenden Schritt der Tumor- und Metastasenwachstumsrate darstellt, (Folkman (1971) New Engl. J. Med. 285:1182–1186) jetzt von beachtenswerten experimentellen Beweisen gestützt (untersucht in Aznavoorian et al. (1993) Cancer 71:1368–1383; Fidler and Ellis (1994) Cell 79:185–188; Folkman (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82:4–6).
Die Menge der Blutgefäße im Tumorgewebe ist ein starker negativer Prognoseindikator bei Brustkrebs (Weidner et al. (1992) J. Natl. Cancer Inst. 84:1875–1887), bei Prostatakrebs (Weidner et al. (1993) Am. J. Pathol. 143:401–409), bei Gehirntumoren (Li et al. (1994) Lancet 344:82–86) und bei Melanomen (Foss et al. (1996) Cancer Res. 56:2900–2903).
Eine Anzahl angiogenischer Wachstumsfaktoren wurden bisher beschrieben, unter denen der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor (VEGF) eine Schlüsselrolle als positiver Regulator der physiologischen und pathologischen Angiogenese zu spielen scheint (untersucht in Brown et al. (1996) Control of Angiogenesis (Goldberg and Rosen, eds.) Birkhauser, Basel, im Druck; Thomas (1996) J. Biol. Chem. 271:603–606). VEGF ist ein sekretiertes Disulfid-verlinktes Homodimer, das die Endothelzellen selektiv dazu stimuliert, zu prolifieren, zu migrieren und Matrixabbauende Enzyme zu produzieren (Conn et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1323–1327); Ferrara and Henzel (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161:851–858); Gospodarowicz et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7311–7315); Pepper et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:902–906; Unemori et al. (1992) J. Cell. Physiol. 153:557–562), wobei alle Vorgänge zur Bildung neuer Gefäße erforderlich sind. Zusätzlich dazu, dass es das einzige bekannte Endothelzellen-spezifische Mitogen ist, ist VEGF unter den angiogenischen Wachstumsfaktoren in seiner Fähigkeit einmalig, eine vorübergehende Erhöhung der Blutgefäßpermeabilität für Makromoleküle zu induzieren (daher sein ursprünglicher und alternativer Name, vaskulärer Permeabilitätsfaktor VPF) (Dvorak et al. (1979) J. Immunol. 122:166–174; Senger et al. (1983) Science 219:983–985; Senger et al. (1986) Cancer Res. 46:5629–5632). Die erhöhte vaskuläre Permeabilität und die resultierende Ablagerung von Plasmaproteinen im extravaskulären Raum unterstützt die Bildung neuer Gefäße, indem eine provisorische Matrix für die Migration der Endothelzellen bereitgestellt wird (Dvorak et al. (1995) Am. J. Pathol. 146:1029–1039). Hyperpermeabilität ist tatsächlich ein charakteristisches Merkmal neuer Gefäße, einschließlich jener, die mit Tumoren assoziiert sind (Dvorak et al. (1995) Am. J. Pathol. 146:1029–1039). Außerdem ist bekannt, dass kompensatorische Angiogenese, die durch Gewebesauerstoffmangel induziert ist, durch VEGF vermittelt wird (Levy et al. (1996) J. Biol. Chem. 2746–2753); Shweiki et al. (1992) Nature 359:843–845).
VEGF tritt als Ergebnis alternativen Spleißens des VEGF-Gens in vier Formen auf (VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189, VEGF-206) (Houck et al. (1991) Mol. Endocrin. 5:1806–1814; Tischer et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:11947–11954). Die zwei kleineren Formen sind diffundierbar, während die zwei größeren Formen als Folge ihrer hohen Affinität für Heparin überwiegend zur Zellmembran lokalisiert bleiben. VEGF-165 bindet auch an Heparin und ist die ergiebigste Form. VEGF-121, die einzige Form, die nicht an Heparin bindet, scheint eine niedrigere Affinität für die Rezeptoren (Gitay-Goren et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5519–5523) sowie eine niedrigere mitogene Potenz zu haben (Keyt et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:7788–7795). Die biologischen Wirkungen von VEGF werden durch zwei Tyrosinkinaserezeptoren (Flt-1 und Flk-1/KDR) vermittelt, deren Expression streng auf Zellen endothelischen Ursprungs beschränkt ist (de Vries et al. (1992) Science 255:989–991; Millauer et al. (1993) Cell 72:835–846; Terman et al. (1991) Oncogene 6:519–524). Während die Expression der beiden funktionellen Rezeptoren für die Hochaffinitätsbindung erforderlich ist, scheint die chemotaktische und mitogene Signalgebung in Endothelzellen primär durch den KDR-Rezeptor aufzutreten (Park et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:25646–25654; Seetharam et al. (1995) Oncogene 10:135–147; Waltenberger et al. (1994) J. Biol. Chem. 26988–26995). Die Bedeutung von VEGF und VEGF-Rezeptoren für die Entwicklung von Blutgefäßen wurde unlängst bei Mäusen bewiesen, denen ein einziges Allel für das VEGF-Gen fehlte (Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435–439; Ferrara et al. (1996) Nature 380:439–442) oder beide Allele für die Flt-1- (Fong et al. (1995) 376:66–70) oder Flk-1-Gene (Shalaby et al. (1995) Nature 376:62–66). In jedem Fall wurden unterschiedliche Anomalien bei der Gefäßbildung beobachtet, die in embryonaler Letalität resultierten.
VEGF wird praktisch von allen Tumorzellen in variierenden Mengen produziert und sekretiert (Brown et al. (1997) Regulation of Angiogenesis (Goldberg and Rosen, Eds.) Birkhauser, Basel, pp. 233–269). Der direkte Beweis, dass VEGF und dessen Rezeptoren zum Tumorwachstum beitragen, wurde unlängst durch einen Beweis erhalten, dass das Wachstum menschlicher Tumor-Xenogentransplantate bei Nacktmäusen gehemmt werden konnte, indem Antikörper zu VEGF neutralisiert wurden (Kim et al. (1993) Nature 362:841–844), durch die Expression des dominant-negativen VEGF-Rezeptors flk-1 (Millauer et al. (1996) Cancer Res. 56:1615–1620; Millauer et al. (1994) Nature 367:576–579), durch Inhibitoren der Flk-1-Tyrosinkinaseaktivität mit niedrigem Molekulargewicht (Strawn et al. (1966) Cancer Res. 56:3540–3545), oder durch die Expression einer Antisense-Sequenz zu VEGF mRNA (Saleh et al. (1996) Cancer Res. 56:393–401). Wichtig ist auch, dass herausgefunden wurde, dass die Inzidenz von Tumormetastasen durch VEGF-Antagonisten drastisch reduziert wurde (Claffey et al. (1996) Cancer Res. 56:172–181).
Zusätzlich zu ihrer Verwendung als Antikrebswirkstoffe können VEGF-Inhibitoren bei einer großen Vielzahl proliferativer Krankheiten nützlich sein, die durch exzessive Angiogenese gekennzeichnet sind, einschließlich Psoriasis, Augenleiden, Kollagengefäßkrankheiten und rheumatoider Arthritis. Obwohl von den meisten Tumorarten bekannt ist, dass sie VEGF produzieren, zeigte bis vor kurzem keiner, dass funktionelle VEGF-Rezeptoren exprimiert werden. Es wurde gezeigt, dass Kaposi-Sarkom-Zellen (KS) nicht nur ergiebige Mengen von VEGF produzieren, sondern auch funktionelle VEGF-Rezeptoren exprimieren und daher VEGF für das autokrine Wachstum verwenden. Das Kaposi-Sarkom wird typischerweise mit herkömmlichen antimetabolischen Arzneimittel behandelt. Ein wesentliches Defizit bei der Verwendung von Chemotherapie bei KS-Patienten ist jedoch die begleitend induzierte Immunsuppression, was schwerwiegende Konsequenzen bei Patienten hat, deren Immunsystem bereits gefährdet ist. Der Bedarf an alternativen Therapien ist in frühen Stadien der Krankheit besonders groß, in denen erste KS-Läsionen erscheinen, die Patienten sich ansonsten jedoch ziemlich gesund fühlen. In dieser Hinsicht hat die Einkapselung chemotherapeutischer Arzneimittel, wie etwa Daunorubicin in Liposome unlängst nachgewiesen, dass sie eine viel versprechende Methode zur Minimierung der Nebenwirkungen der Chemotherapie ist, bei der gleichzeitig die Antitumorwirksamkeit erhalten blieb. Arzneimittel mit niedriger Toxizität, die selektiv aktivierte Zellen endothelischen Ursprungs targetieren, wie etwa die hier beschriebenen Nukleinsäureligand-VEGF-Antagonisten, wären ein enormer Pluspunkt bei der Behandlung von KS.
Andere Bereiche, in denen die VEGF-Nukleinsäureliganden potentiell klinisch nützlich sein könnten, sind Augenleiden, die durch exzessive Angiogenese gekennzeichnet sind. Beispiele solcher Leiden sind Makuladegeneration und diabetische Retinopathie. Bei der Makuladegeneration beeinträchtigt die progressive choroidale Angiogenese unter der Makula (ein Teil der Netzhaut, der für die höchste Sehschärfe verantwortlich ist) das Sehvermögen. Bei der diabetischen Retinopathie beeinträchtigt die Angiogenese in der Netzhaut das Sehvermögen. Auch wenn die Auslöser für den Beginn des Blutgefäßwachstums bei der Makuladegeneration und der diabetischen Retinopathie derzeit noch nicht bekannt sind, scheint VEGF ein wichtiger Angiogenese-Induktor zu sein (Lopez, P. F. et al. (1996) Invest. Ophthalmol. Visual Science 37, 855–868; Kliffen, M. et al. (1997) Br. J. Ophthalmol. 81, 154–162; Kvanta, A. et al. (1996) Invest. Ophthalmol. Visual Science 37, 1929–1934; Paques et al. (1997) Diabetes & Metabolism 23:125–130). VEGF-Inhibitoren können daher bei der Abschwächung der Angiogenese bei der Makuladegeneration nützlich sein.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen RNA-Liganden oder RNA-Liganden für VEGF, bestehend aus der Sequenz:
fCmGmGrArAfUfCmAmGfUmGmAmAfUmGfCfUfUmAfUmAfCmAfUfCfCmG-3'3-dT.
Im Folgenden wird (werden) der (die) oben genannte(n) Ligand(en) als „VEGF-RNA-Ligand(en) der Erfindung" bezeichnet. Ferner enthält die Erfindung einen Komplex, der einen RNA-Liganden der Erfindung für VEGF und eine nicht-immunogene Verbindung mit einem hohen Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst. Dieser Komplex kann ferner einen Linker zwischen besagtem Liganden und besagter nicht-immunogener Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder besagter lipophiler Verbindung umfassen. Die nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht kann Polyalkylenglykol sein, welches seinerseits Polyethylenglykol sein kann. Dieses Polyethylenglykol kann optional ein Molekulargewicht von ungefähr 10 bis 80 K, spezieller von ungefähr 20 bis 45 K, aufweisen. Der Komplex kann die Struktur haben, die in einer der 1H, 1I, 1J, 1K oder 1L dargestellt ist. Ferner sind in der Erfindung Zusammensetzungen enthalten, die den RNA-Liganden der Erfindung für VEGF oder einen der oben erwähnten Komplexe und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Diese Zusammensetzung kann ferner für die Anwendung am Auge geeignet sein. Der RNA-Ligand der Erfindung für VEGF oder die oben erwähnten Komplexe können in der Therapie oder in der Diagnose verwendet werden, speziell für die Behandlung oder Diagnose einer Krankheit oder eines Leidens, die/das von VEGF vermittelt wird, oder für die Hemmung von Angiogenese oder Tumorwachstum, die/das von VEGF vermittelt wird.
Ferner werden hier Hochaffinitäts-2'Fluoro(2'-F)-modifizierte Pyrimidin-RNA-Liganden für den vaskulären Endothelwachstumsfaktor (VEGF) beschrieben. Das hier benutzte Verfahren zur Identifizierung solcher Nukleinsäureliganden wird SELEX genannt, ein Kurzzeichen für „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment" [Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung]. Die hier beschriebenen Liganden wurden aus einem Anfangspool von ungefähr 10¹⁴ RNA-Molekülen ausgewählt, die an 30 oder 40 angrenzenden Positionen randomisiert wurden. Hier enthalten sind die entstandenen Liganden, die in den Tabellen 2 bis 6 gezeigt werden.
Ferner wird eine Methode zur Herstellung eines Komplexes beschrieben, der aus einem VEGF-Nukleinsäureliganden und einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung besteht, wobei die Methode, die die Identifikation eines Nukleinsäureliganden aus einem Kandidatengemisch von Nukleinsäuren umfasst, bei der die Nukleinsäure ein Ligand von VEGF ist, durch die Methode (a) das Kandidatengemisch der Nukleinsäuren mit VEGF in Kontakt zu bringen, (b) zwischen den Mitglieder des besagten Kandidatengemisches auf der Basis der Affinität zu VEGF zu trennen und c) die ausgewählten Moleküle zu amplifizieren, um ein Gemisch aus Nukleinsäuren zu liefern, angereichert für Nukleinsäuresequenzen mit einer relativ höheren Affinität zur Bindung an VEGF, und die kovalente Verlinkung des besagten identifizierten VEGF-Nukleinsäureliganden mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung. Die Erfindung umfasst ferner einen Komplex, der aus einem VEGF-Nukleinsäureliganden und einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung besteht.
Die Erfindung enthält ferner ein Lipidkonstrukt, das einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung oder einen Komplex enthält. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Methode zur Herstellung eines Lipidkonstrukts, das einen Komplex umfasst, wobei der Komplex einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und eine lipophile Verbindung umfasst.
In einer anderen Ausführungsform stellt diese Erfindung eine Methode zur Verbesserung der Pharmakokinetik-Eigenschaften eines VEGF-RNA-Liganden der Erfindung durch die kovalente Verlinkung des VEGF-RNA-Liganden mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung bereit, um einen Komplex zu bilden und um den Komplex einem Patienten zu applizieren. Die Erfindung betrifft ferner eine Methode zur Verbesserung der Pharmakokinetik-Eigenschaften eines VEGF-RNA-Liganden der Erfindung, indem der Komplex ferner mit einem Lipidkonstrukt assoziiert wird.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Komplexe bereitzustellen, die einen oder mehrere VEGF-RNA-Liganden der Erfindung in Assoziation mit einer oder mehreren nicht-immunogenen Verbindungen mit hohem Molekulargewicht oder lipophilen Verbindungen umfassen, und Methoden zur Produktion derselben. Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Lipidkonstrukte bereitzustellen, die einen Komplex umfassen. Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, einen oder mehrere VEGF-RNA-Liganden der Erfindung in Assoziation mit einer oder mehreren nicht-immunogenen Verbindungen mit hohem Molekulargewicht oder lipophilen Verbindungen mit verbesserten Pharmakokinetik-Eigenschaften bereitzustellen.
In Ausführungsformen der Erfindung, die auf Komplexe gerichtet sind, die aus einem VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht bestehen, ist es bevorzugt, dass die nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht Polyalkylenglykol, insbesondere Polyethylenglykol (PEG) ist. Insbesondere weist das PEG ein Molekulargewicht von ungefähr 10 bis 80 K auf. Am meisten bevorzugt weist das PEG ein Molekulargewicht von ungefähr 20 bis 45 K auf. In Ausführungsformen der Erfindung, die auf Komplexe gerichtet sind, die aus einem VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und einer lipophilen Verbindung bestehen, ist es bevorzugt, dass die lipophile Verbindung ein Glycerolipid ist. In den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Lipidkonstrukt vorzugsweise ein Lipiddoppelschichtvesikel und am meisten bevorzugt ein Liposom. In der bevorzugten Ausführungsform wird der VEGF-RNA-Ligand der Erfindung nach der SELEX-Methode identifiziert.
In Ausführungsformen der Erfindung, die auf Komplexe gerichtet sind, die eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfassen, die kovalent mit einem VEGF-RNA-Liganden oder Liganden der Erfindung verlinkt sind, kann der VEGF-RNA-Ligand oder die Liganden in einer Targeting-Kapazität dienen.
Daneben kann der VEGF-RNA-Ligand der Erfindung durch kovalente oder nicht kovalente Interaktionen mit einem Lipidkonstrukt assoziiert werden, ohne Teil eines Komplexes zu sein.
Außerdem kann, in Ausführungsformen der Erfindung, die auf Lipidkonstrukte gerichtet sind, die einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung oder eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einen Komplex aus lipophiler Verbindung/VEGF-RNA-Liganden umfassen, bei dem das Lipidkonstrukt von der Art ist, dass es eine Membran hat, die ein inneres Kompartiment definiert, wie etwa ein Lipiddoppelschichtvesikel, wobei der VEGF-RNA-Ligand oder -Komplex in Assoziation mit dem Lipidkonstrukt mit der Membran des Lipidkonstrukts assoziiert werden oder in dem Kompartiment eingekapselt werden kann. In Ausführungsformen, bei denen der VEGF-RNA-Ligand der Erfindung mit der Membran in Assoziation ist, kann der VEGF-RNA-Ligand mit dem nach innen schauenden oder nach außen schauenden Teil der Membran assoziieren, so dass der VEGF-RNA-Ligand in das Vesikel hinein oder aus ihm herausragt. In einigen Ausführungsformen kann ein VEGF-RNA-Ligand-Komplex der Erfindung passiv auf die Außenseite eines vorgebildeten Lipidkonstrukts geladen werden. In Ausführungsformen, in denen der RNA-Ligand aus dem Lipidkonstrukt herausragt, kann der VEGF-RNA-Ligand als Targetingkapazität dienen.
In Ausführungsformen, bei denen der VEGF-RNA-Ligand des Lipidkonstrukts als Targetingkapazität dient, kann das Lipidkonstrukt zusätzliche therapeutische oder diagnostische Wirkstoffe mit sich assoziiert haben. In einer Ausführungsform ist der therapeutische oder diagnostische Wirkstoff mit dem Äußeren des Lipidkonstrukts assoziiert. In anderen Ausführungsformen ist der therapeutische oder diagnostische Wirkstoff in das Lipidkonstrukt eingekapselt oder mit dem Inneren des Lipidkonstrukts assoziiert. In noch einer weiteren Ausführungsform ist der therapeutische oder diagnostische Wirkstoff mit dem Komplex assoziiert. In einer Ausführungsform ist der therapeutische Wirkstoff ein Arzneimittel. In einer alternativen Ausführungsform sind der therapeutische oder diagnostische Wirkstoff ein oder mehrere zusätzliche Nukleinsäureligand(en).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine diagnostische Verwendung des VEGF-RNA-Liganden der Erfindung. Dies enthält die Bereitstellung eines VEGF-RNA-Liganden der Erfindung oder eines Komplexes, der einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung oder ein Lipidkonstrukt umfasst, die den Komplex der vorliegenden Erfindung für die Verwendung zur Inhibition der Angiogenese, zur Inhibition des Wachstums von Tumoren, zur Inhibition des Kaposi-Sarkoms, zur Inhibition der Makuladegeneration oder zur Inhibition der diabetischen Retinopathie umfasst.
Ferner wird hier eine Methode zur Targetierung eines therapeutischen oder diagnostischen Wirkstoffs auf ein biologisches Target beschrieben, dass VEGF exprimiert durch die Assoziation des Wirkstoffs mit einem Komplex, der einen VEGF-Nukleinsäureliganden und eine lipophile Verbindung oder eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht umfasst, wobei der Komplex ferner mit einem Lipidkonstrukt assoziiert ist und der VEGF-RNA-Ligand ferner mit dem Äußeren des Lipidkonstrukts assoziiert ist.
Diese und andere Aufgaben sowie die Natur, der Umfang und die Nutzung dieser Erfindung werden dem Fachmann schnell aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen ersichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A bis 1Q zeigen die Molekülbeschreibungen von NX213 (1A), NX278 (1B), scNX278 (1C), scNX213 (1D), NX31838-PL (1E), NX31838 Lipidamid 1 ( 1F), NX31838 Lipidamid 2 (1G), NX31838-40K PEG (1H), NX31838-20K PEG (1I), NX31838 40K PEG-Dimer ohne Linker (NX31838d0) (1J), NX31838 40K Dimer mit einem C5-Linker (NX31838d1) (1K), NX31838 40K PEG-Dimer mit zwei C5-Linkern (NX31838d2) (1L), C-5 Aminolinker (1M), Glycerolbisphosphat-Linker (1N), 18 Atomspacer-Linker (10), Aminotetraethylenglykol-Linker (1P), 3'3' dT (1Q) und NX31917 (1R). Die 5'-Phosphatgruppe des Liganden ist in den Figuren abgebildet. mPEG steht für Methylpolyethylenglykol. Ein kleiner Buchstabe vor einem Nukleotid zeigt Folgendes an: m=2'-O-Methyl, a=2'-Amino, r=Ribo und f=2'-Fluoro. Wenn kein Buchstabe vor einem Nukleotid steht, zeigt das ein Desoxyribonukleotid an (2'H). 3'3'-dT zeigt eine invertierte 3'3'-Phosphodiester-Verlinkung am 3'-Ende an. Ein S nach einem Nukleotid bezeichnet eine Rückgratkettenmodifikation, die aus einer Phosphorthioat-Internukleosid-Verlinkung besteht.
2 zeigt die Bindungseigenschaften der verschiedenen Nukleinsäureliganden mit VEGF. Die Bindungsaffinitäten des unmodifizierten Nukleinsäureliganden (NX213, offener Kreis), dessen Dialkylglycerol-modifizierter Analog (NX278, offener Diamant) und liposomaler NX278 (NX278-L, offenes Rechteck) wurden zusammen mit den Kontrollen mit der durchmischten (scrambled) Sequenz (sc) (scNX213, geschlossener Kreis; scNX278, geschlossener Diamant; und scNX278-L, geschlossenes Rechteck) durch ein Elektromobilitäts-Vergleichsexperiment (Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA) bestimmt. NX213 ist 5'-TsTsTsTs mAaCaC aCaUrG rRaUmG rGaUmA mGrAaC mGaCaC mGmGmG mGaUmG TsTsTsTsT-3' (SEQ-ID-NR. 1) und scNX213 ist 5'-TsTsTsTs mGaUaC mGmGaU mAaCrG mGrAmG aUmGrG rAaCnC mGaUaC mAaCmG TsTsTsTsT-3' (SEQ-ID-NR.4) ³²P 5= End-markiertes NX-213 (1,5 nM) wurde in einem Bindungspuffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,01 % menschlichem Serumalbumin) bei 37°C 20 Min, lang in Gegenwart von VEGF (0,33 nM) und dem Konkurrenz-Oligonukleotid (5 pM – 0,33 μM) inkubiert. Der ³²P NX-213/VEGF-Komplex wurde aus dem freien ³²P NX-213 durch Elektrophorese auf 8 % Polyacrylamidgel (19:1 Acrylamid:bis-Acrylamid, Tris-Borat, 89 mM, 1 mM EDTA als Laufpuffer) aufgetrennt. Die Intensität des Bandes, das dem ³²P NX-213/VEGF-Komplex bei variierenden Konkurrenz-Konzentrationen entsprach, wurde durch Phosphorimager-Analyse quantifiziert. Die normalisierten Daten für die Menge des Komplexes, der in Abwesenheit des Konkurrenten gebildet wurde, wurden durch die Methode der kleinsten Quadrate an die Konkurrenz-Bindungsgleichung angepasst.
3 zeigt die Wirkung der verschiedenen Nukleinsäureliganden auf VEGF-induzierte Erhöhungen der vaskulären Permeabilität. VEGF (20 nM) mit oder ohne Nukleinsäureliganden wurde Meerschweinchen intradermal injiziert, die zuvor eine Injektion mit einem Evans-Blaufarbstoff erhalten hatten. Die Menge des Farbstoffaustritts wurde quantifiziert durch die Messung der relativen Menge an Licht, das durch die Haut an der Injektionsstelle absorbiert wurde.
4 zeigt, dass NX278-L das KS-Zellwachstum hemmt. Das Wachstum der KSY-1-Zellen in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von NX213, NX278-L und scNX278-L. KSY-1-Zellen wurden am 0. Tag in Platten mit 24 Vertiefungen mit einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung gesät. Am 1. und 3. Tag wurde frisches, identisch behandeltes Medium ersetzt. Die Anzahl der Zellen wurde durch Trypsinisierung der Zellen am 5. oder 6. Tag der Kultur unter Verwendung des Coulter-Teilchenzählers bestimmt.
Die Versuche wurden mehrmals dreifach durchgeführt. Die gezeigten Ergebnisse sind der Durchschnitt und SE des repräsentativen Versuchs.
5A und 5B zeigen, dass NX278 das KS-Zellwachstum bei athymischen Mäusen hemmt. Den athymischen Mäusen wurde am 1. Tag ein KS-Tumor hinter den Vorderbeinen implantiert. Die Mäuse wurden mit NX278-L (50 μg/Tag/Maus, 5A und 150 μg/Tag/Maus, 5B) durch tägliche intraperitoneale Injektion fünf Tage lang, beginnend am 2. Tag, behandelt. Die Kontrollmäuse wurden mit leeren Liposomen unter Verwendung der gleichen Menge an Lipiden wie bei der mit dem Nukleinsäureliganden behandelten Gruppe behandelt. Die Tumorgrößen wurden über einen Zeitraum von zwei Wochen gemessen. Die Tumore wurden am 14. Tag entfernt und gemessen.
6 fasst die Daten für die Plasmakonzentration von NX31838 20 K PEG (⧠), 40 K PEG (∎) und NX31838 (Minus PEG) (∇) als Funktion der Zeit nach der Bolusinjektion zusammen.
7 fasst die Daten für die Plasmakonzentration von NX31838 PL als Funktion der Zeit nach der Bolusinjektion zusammen.
8A bis 8D zeigen Veränderungen der vaskulären Permeabilität, die durch die intradermale Injektion von VEGF-Protein (0,8 pmol) ± Nukleinsäure-Ligand/monoklonale Antikörper, wie angegeben, hervorgerufen wird. Die lokale Extravasation von Evans-Blaufarbstoff wurde 30 Min. nach der Injektion durch Transillumination der geernteten Haut bestimmt. Figuren A, B, C und D zeigen die Wirkung der Vermischung von NX31838-20K PEG, NX31838-40K PEG, NX31838-PL oder NX31838d2-40K PEG mit Protein 30 Min. vor der Injektion. Die Werte sind ± SEM-Mittelwerte. *P < 0,05 verglichen mit VEGF allein. Vergleiche 1 für die Molekülbeschreibungen.
9A bis 9C zeigen die Bewertung der Nukleinsäure-Liganden-Attenuierung von VEGF-vermittelter Hornhautangiogenese. Null oder drei pmol VEGF-Protein wurden in ein Biopolymer (Hydron) eingebaut und in das Hornhautstroma implantiert. Die Tiere wurden zweimal täglich intravenös entweder mit PBS oder Nukleinsäure-Ligand 5 Tage lang, wie angegeben, behandelt. Figuren A, B und C illustrieren die Wirkung der systemischen Behandlung mit NX31838-20K-PEG-, NX31838-40K-PEG- oder NX31838-PL-Nukleinsäure-Ligand bei Neovaskularizsation. Die Werte sind ± SEM-Mittelwerte. *P < 0,05 verglichen mit 3 pmol der VEGF+PBS-Gruppe. Vergleiche 1 für die Molekülbeschreibungen.
10 fasst die Daten für das Plasma-(OΔ) oder Glaskörper-(⦁,
, ∎)Konzentration von NX31838-40K PEG als Funktion der Zeit nach der Verabreichung zusammen.
11 zeigt Tumorwachstumskurven von humanen A673-Tumoren, die subkutan (s.c.) in Nacktmäusen wachsen, die mit 40 mg/kg oder 10 mg/kg VEGF-NX31838-40K-PEG-Nukleinsäureligand (NX 31838 NAL), zweimal täglich verabreicht (BID), behandelt wurden. Eine negative Kontrolle bestand in einer durchmischten VEGF-Nukleinsäureligandensequenz, NX31917 NAL (vergleiche 1R für die Molekülbeschreibung), dosiert mit 40 mg/kg zweimal täglich, und eine positive Kontrolle bestand in einem monoklonalen anti-VEGF-Antikörper mAb 26503.11 (R & D Systems), der mit 100 μg/Maus zweimal wöchentlich dosiert wurde. Da es keinen signifikanten Unterschied zwischen der Gruppe mit der 40-mg/kg-Dosis und der Gruppe mit der 10-mg/kg-Dosis zu geben schien, fand keine weitere Dosierung mit der 40-mg/kg-Gruppe nach dem 14. Tag statt. Gruppen von 8 Mäusen wurden s.c. mit 1 × 10⁷ A673 Tumorzellen am 0. Tag implantiert, und die Behandlung begann mit den Testverbindungen durch intraperitoneale Injektionen am 1. Tag für die Dauer des Versuchs. Das Tumorvolumen, ausgedrückt als mm³, wurde bestimmt unter Verwendung der Formel: Tumorvol. = L × W²/2.
12 zeigt Tumorwachstumskurven unterschiedlicher Dosierungspläne (Vergleich der zweimal täglichen Dosierung (BID) mit der einmal täglichen Dosierung (QD)), 40K PEG-Partien (Vergleich NX31838.07-Partie mit der NX31838.04-Partie), und verschiedener Arzneimittelformulierungen (Vergleich des liposomalen VEGF NX31838PL NAL mit VEGF NX31838 NAL 40K PEG) des VEGF-NX31838-Nukleinsäureliganden (NAL). Gruppen von 8 Mäusen wurden s.c. mit 1 × 10⁷ A673-Tumorzellen am 0. Tag implantiert und die Behandlung begann mit den Testverbindungen durch intraperitoneale Injektionen am 1. Tag für die Dauer des Versuchs. Mehrere Gruppen hatten Tiere, bei denen die Tumore nicht wuchsen, und folglich hatten einige Gruppen für die abschließende Analyse nur 7 (NX31838.04 10 mg/kg BID und NX31838.04 3 mg/kg BID), oder 6 (NX31838.04 10 mg/kg QD und NX31838.07 10 mg/kg BID) Tiere. Das Tumorvolumen, ausgedrückt in mm³, wurde bestimmt unter Verwendung der Formel: Tumorvol. = L × W²/2.
13 zeigt die dosisabhängige Inhibiton von A673-Tumoren, die subkutan (s.c.) in Nacktmäusen wuchsen, durch den VEGF-NX31838-40K-PEG-Nukleinsäureliganden (NX31838 NAL), der einmal täglich verabreicht wurde. Bei dieser Titration wurde keine Dosis ohne Wirkung erreicht; die Tumorinhibition wurde auch bei der niedrigsten Dosis (0.03 mg/kg) beobachtet. Gruppen von 8 Mäusen wurden s.c. mit 1 × 10⁷ A673-Tumorzellen am 0. Tag implantiert und die Behandlung mit Testverbindungen durch intraperitoneale Injektionen begann am 1. Tag für die Dauer des Versuchs; Gruppe NX31838 NAL 3 mg/kg hatte 2 Tiere, bei denen die Tumore nicht wuchsen, und enthält folglich nur 6 Tiere. Das Tumorvolumen, ausgedrückt in mm³, wurde bestimmt unter Verwendung der Formel: Tumorvol. = L × W²/2.
14 zeigt Tumorwachstumskurven, die die Inhibition in Stadien befindlicher (d. h. etablierter) A673-Tumore, die subkutan (s.c.) in Nacktmäusen wuchsen, durch den VEGF-NX31838-40K-PEG-Nukleinsäureliganden (NAL) beweisen, der einmal täglich verabreicht wurde. Eine positive Kontrolle, bestand in einem monoklonalen Anti-VEGF-Antikörper mAb 26503.11 (R & D Systems), der mit 100 μg/Maus zweimal wöchentlich dosiert wurde. Den Mäusen wurden 1 × 10⁷ A673-Zellen implantiert und die Tumore durften auf ein Volumen von 200 ± 100 mm³ anwachsen, danach wurden die Tiere nach Gewicht sortiert, zur dauerhaften Identifizierung tätowiert und die Behandlung mit den Testverbindungen durch intraperitoneale Injektionen begonnen und für die Dauer des Versuchs fortgesetzt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von 8 Mäusen dar. Das Tumorvolumen, ausgedrückt in mm³, wurde bestimmt unter Verwendung der Formel: Tumorvol. = L × W²/2.
15 fasst die Daten für die Plasmakonzentration von NX213-, NX278-, NX278-Liposom nach Bolusinjektion zusammen.
16 zeigt die Wachstumskurven von KSY-1-Tumoren, die Nacktmäusen subkutan implantiert wurden. Die Mäuse wurden mit intraperitonealen Injektionen von NX31917 40K PEG oder NX31838 40K PEG (30 mg/kg) oder PBS zweimal täglich für die Dauer des Versuchs behandelt. Mit der Behandlung wurde einen Tag nach der subkutanen Implantation von 2 × 10⁷ KSY-1-Zellen in die hintere Flanke von Nacktmäusen begonnen. In jeder Gruppe wurden vier Mäuse verwendet. Fehler sind SEM.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
DEFINITIONEN:
„Kovalente Bindung" ist die chemische Bindung, die durch gemeinsame Elektronen gebildet wird.
„Nicht kovalente Interaktionen" sind Mittel, durch die molekulare Einheiten durch Interaktionen zusammengehalten werden, die nicht kovalente Bildungen sind, einschließlich ionischer Interaktionen und Wasserstoffbindungen.
„Lipophile Verbindungen" sind Verbindungen, die die Neigung haben, sich mit Lipiden und/oder anderen Materialen oder Phasen mit niedrigen dielektrischen Konstanten zu assoziieren oder zu trennen, einschließlich Strukturen, die im Wesentlichen aus lipophilen Komponenten bestehen. Lipophile Verbindungen enthalten Lipide sowie Verbindungen, die keine Lipide enthalten, die die Neigung haben, sich mit Lipiden (und/oder anderen Materialien oder Phasen mit niedrigen dielektrischen Konstanten) zu assoziieren. Cholesterin, Phospholipid und Glycerolipide, wie etwa Dialkylglycerol und Diacylglycerol, und Glycerolamidlipide sind weitere Beispiele lipophiler Verbindungen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die lipophile Verbindung, die mit dem VEGF-Nukleinsäureligand kovalent verlinkt ist, ein Glycerolipid mit der Struktur:
wobei R¹, R² und R³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus CH₃(CH₂)_n-O(PO₃)-CH₂-; und CH₃(CH₂)_n-CONH₂-CH₂- CH₃(CH₂)_nO-, CH₃(CH₂)_nOCH₂-, CH₃(CH₂)_n(CO)OCH₂-, CH₃(CH₂)_n(CO)O- und X-, worin mindestens eine X- sein muss und X unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (PO₄), O und CH₂OC=O und worin n = 0 bis 30, vorzugsweise 10 bis 20 ist. Wenn R CH₃(CH₂)_n-O(PO₃)-CH₂- ist, ist die lipophile Verbindung ein Phospholipid. Wenn R CH₃(CH₂)_n-CONH₂-CH₂- ist, ist die lipophile Verbindung ein Glycerolamidlipid. Wenn R CH₃(CH₂)_nO- oder CH₃(CH₂)_nOCH₂- ist, ist die lipophile Verbindung ein Dialkylglycerollipid. Wenn R CH₃(CH₂)_n(CO)OCH₂- oder CH₃(CH₂)n(CO)O- ist, ist die lipophile Verbindung Diacylglycerollipid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist R³ X-.
„Komplex", wie hier verwendet, beschreibt die molekulare Einheit, die durch die kovalente Verlinkung eines VEGF-Nukleinsäure-Liganden an eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung gebildet wird. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der Komplex als A-B-Y abgebildet, worin A eine lipophile Verbindung oder eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht ist, wie hier beschrieben; B optional ist und ein oder mehrere Linker Z sein kann; und Y ein VEGF-RNA-Ligand der Erfindung ist.
Für die Ziele dieser Erfindung sind „Lipidkonstrukte" Strukturen, die Lipide, Phospholipide oder Derivate davon enthalten, die eine Vielzahl unterschiedlicher struktureller Anordnungen umfassen, von denen bekannt ist, dass sie Lipide in einer wässrigen Suspension annehmen. Diese Strukturen enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Lipiddoppelschichtvesikel, Mizellen, Liposome, Emulsionen, Lipidstreifen oder -blätter, und können mit einer Vielzahl von Arzneimitteln und Komponenten Komplexe bilden, von denen bekannt ist, dass sie pharmazeutisch verträglich sind. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Lipidkonstrukt ein Liposom. Das bevorzugte Liposom ist unilamellar und hat eine relative Größe von weniger als 200 nm. Übliche zusätzliche Komponenten der Lipidkonstrukte enthalten unter anderem Cholesterin und alpha-Tocopherol. Die Lipidkonstrukte können allein oder in jeder Kombination verwendet werden, die ein Fachmann schätzen wurde, um die gewünschten Merkmale für eine bestimmte Anwendung bereitzustellen. Zusätzlich sind die technischen Aspekte der Lipidkonstrukte und Liposombildung dem Fachmann bekannt, und alle Methoden, die üblicherweise auf diesem Gebiet praktiziert werden, können für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
„Nukleinsäureligand", wie hier verwendet, ist eine nicht natürlich auftretende Nukleinsäure, die einen gewünschten Effekt auf ein Target aufweist. Das Target der vorliegenden Erfindung ist VEGF, daher der Begriff VEGF-Nukleinsäureligand. Ein gewünschter Effekt enthält, ist aber nicht beschränkt auf das Binden des Targets, die katalytische Veränderung des Targets, die Reaktion mit dem Target auf eine Weise, die das Target oder die funktionelle Aktivität des Targets modifiziert/verändert, die kovalente Anlagerung an das Target, wie in einem Suizidinhibitor, die Erleichterung der Reaktion zwischen dem Target und einem anderen Molekül. In der bevorzugten Ausführungsform ist der Effekt eine spezifische Bindungsaffinität für VEGF, worin der Nukleinsäureligand keine Nukleinsäure ist, die die bekannte physiologische Funktion aufweist, durch VEGF gebunden zu sein.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird der VEGF-Nukleinsäureligand der Komplexe und Lipidkonstrukte der Erfindung durch SELEX-Methodik identifiziert. VEGF-Nukleinsäureliganden werden aus einem Kandidatengemisch aus Nukleinsäuren identifiziert, wobei besagte Nukleinsäure ein Ligand von VEGF ist, durch die Methode, die umfasst, das a) Kandidatengemisch mit VEGF in Kontakt zu bringen, worin Nukleinsäuren, die eine erhöhte Affinität zu VEGF im Verhältnis zum Kandidatengemisch aufweisen, von dem Rest des Kandidatengemischs getrennt werden können; b) die Nukleinsäuren mit der erhöhten Affinität von dem Rest des Kandidatengemischs zu trennen und c) die Nukleinsäuren mit der erhöhten Affinität zu amplifizieren, um ein mit Liganden angereichertes Gemisch von Nukleinsäuren zu liefern (vergleiche US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/233,012, eingereicht am 25. April 1994 mit dem Titel „High Affinity Oligonucleotide to Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)", US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/447,169, eingereicht am 19. Mai 1995 mit dem Titel „High Affinity Oligonucleotide Ligands to Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)". Ein bevorzugter Nukleinsäureligand ist der VEGF-RNA-Ligand der Erfindung.
Das „Kandidatengemisch" ist ein Gemisch aus Nukleinsäuren mit unterschiedlicher Sequenz, aus der der gewünschte Ligand zu wählen ist. Die Quelle eines Kandidatengemischs können natürlich auftretende Nukleinsäuren oder Fragmente davon, chemisch synthetisierte Nukleinsäuren, enzymatisch synthetisierte Nukleinsäuren oder Nukleinsäuren, die aus einer Kombination der vorstehenden Techniken hergestellt wurden, sein. In einer bevorzugten Ausführungsform hat jede Nukleinsäure fixierte Sequenzen, die eine randomisierte Region umgeben, um das Amplifikationsverfahren zu vereinfachen.
„Nukleinsäure" bedeutet entweder DNA, RNA, einzelsträngig oder doppelsträngig, und alle chemischen Modifikationen davon. Modifikationen enthalten, sind aber nicht beschränkt auf jene, die andere chemische Gruppen bereitstellen, die zusätzlich Ladung, Polarisierbarkeit, Wasserstoffbindung, elektrostatische Interaktion und Fluxionalität für die Nukleinsäureligandbasen oder den Nukleinsäureliganden als Ganzes einbauen. Solche Modifikationen enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf 2'-Position-Zuckermodifikationen, 5-Position-Pyrimidinmodifikationen, 8-Position-Purinmodifikationen, Modifikationen bei exocyclischen Aminen, Substitution von 4-Thiouridin, Substitution von 5-Bromo- oder 5-Jodo-Uracil, Rückgratkettenmodifikationen, wie etwa Intemukleosid-Phosphorothioat-Verlinkungen, Methylationen, unübliche Basenpaarungskombinationen, wie etwa die Isobasen Isocytidin und Isoguanidin und ähnliche. Die Modifikationen können auch 3'- und 5'-Modifikationen wie etwa Capping enthalten.
Eine „nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht" ist eine Verbindung etwa zwischen 1000 Da und 1,000,000 Da, insbesondere etwa zwischen 1000 Da und 500,000 Da und am meisten bevorzugt etwa zwischen 1000 Da und 200,000 Da, die typischerweise keine Immunantwort generiert. Für die Ziele dieser Erfindung ist eine immunogene Antwort eine, die den Organismus dazu bringt, Antikörperproteine herzustellen. Beispiele für nicht-immunogene Verbindungen mit hohem Molekulargewicht enthalten Polyalkylenglykol und Polyetkylenglykol. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht, die kovalent mit dem VEGF-Nukleinsäureligand verlinkt ist, ein Polyalkylenglykol und weist die Struktur R(O(CH₂)_x)_nO- auf, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und CH₃, x = 2–5, und n ≈ MW des Polyalkylenglykols/16+14x. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das Molekulargewicht ungefähr zwischen 10 und 80 kDa. In der bevorzugtesten Ausführungsform liegt das Molekulargewicht des Polyalkylenglykols ungefähr zwischen 20 und 45 kDa. In der bevorzugtesten Ausführungsform ist x = 2 und n = 9 × 10². Es kann ein oder mehrere Polyalkylenglykole geben, die an den gleichen VEGF-Nukleinsäureliganden angelagert sind, wobei die Summe des Molekulargewichts vorzugsweise zwischen 10 und 80 kDa, insbesondere 20 und 45 kDa beträgt. In einigen Ausführungsformen kann die nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht auch ein Nukleinsäureligand sein.
„Lipiddoppelschichtvesikel" sind geschlossene, flüssigkeitsgefüllte mikroskopische Kugeln, die hauptsächlich aus individuellen Molekülen gebildet werden, die polare (hydrophile) und nicht polare (lipophile) Abschnitte aufweisen. Die hydrophilen Abschnitte können Phosphato-, Glycerylphosphato-, Carboxy-, Sulfato-, Amino-, Hydroxy- oder Cholingruppen und andere polare Gruppen umfassen. Beispiele für nicht polare Gruppen sind gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffe, wie etwa Alkyl, Alkenyl oder andere Lipidgruppen. Es können auch Sterole (z. B. Cholesterin) und andere pharmazeutisch verträgliche Adjuvanzien (einschließlich Antioxidanzien wie alpha-Tocopherol) zugesetzt werden, um die Vesikelstabilität zu verbessern oder andere gewünschte Merkmale zu verleihen.
„Liposome" sind eine Untergruppe der Lipiddoppelschichtvesikel und bestehen hauptsächlich aus Phospholipidmolekülen, die zwei hydrophobe Schwänze, bestehend aus langen Fettsäureketten, enthalten. Werden sie Wasser ausgesetzt, richten sich diese Moleküle spontan aus, um eine Doppelschichtmembran mit den lipophilen Enden der Moleküle in jeder assoziierten Schicht im Zentrum der Membran zu bilden, und dabei bilden die gegenüberliegende polaren Enden die innere bzw. äußere Oberfläche der Doppelschichtmembran. Somit weist jede Seite der Membran eine hydrophile Oberfläche auf, während das Innere der Membran ein lipophiles Medium umfasst.
Wenn diese Membranen gebildet werden, sind sie generell in einem System konzentrisch geschlossener Membranen, die durch interlamellare wässrige Phasen separiert sind, ähnlich den Schichten einer Zwiebel, um einen inneren wässrigen Raum herum, angeordnet.
Diese multilamellaren Vesikel (MLV) können durch das Anwenden einer Scherkraft in unilamellare Vesikel (UV) umgewandelt werden.
Ein „Kationisches Liposom" ist ein Liposom, das Lipidkomponenten enthält, die bei einem physiologischen pH-Wert eine positive Gesamtladung haben.
Die „SELEX"-Methodik beinhaltet die Kombination der Auswahl von Nukleinsäureliganden, die mit einem Target auf eine wünschenswerte Weise interagieren, zum Beispiel die Bindung an ein Protein, mit der Amplifikation dieser ausgewählten Nukleinsäuren. Wiederholte Zyklierung der Auswahl/Amplifikationsschritte ermöglichen die Auswahl eines oder einer kleinen Anzahl von Nukleinsäuren, die am stärksten mit dem Target aus einem Pool interagieren, der eine sehr große Anzahl von Nukleinsäuren enthält. Das Zyklieren des Auswahl/Amplifikationsverfahrens wird fortgesetzt, bis ein ausgewähltes Ziel erreicht ist. Die SELEX-Methodik ist in den SELEX-Patentanmeldungen beschrieben.
„Target" bedeutet eine interessierende Verbindung oder ein interessierendes Molekül für das ein Ligand gewünscht wird. Ein Target kann ein Protein (wie etwa VEGF, Thrombin, und Selektin), Peptid, Kohlenhydrat, Polysaccharid, Glycoprotein, Hormon, Rezeptor, Antigen, Antikörper, Virus, Substrat, Metabolit, Übergangszustand-Analog, Cofaktor, Inhibitor, Arzneimittel, Farbstoff, Nährstoff, Wachstumsfaktor usw. ohne Beschränkung sein. Das Haupttarget des Gegenstands der Erfindung ist VEGF.
„Verbesserte Pharmakokinetik-Eigenschaften" bedeutet, dass der VEGF-Nukleinsäureligand, der mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung kovalent verlinkt ist oder mit einem Lipidkonstrukt assoziiert ist, eine längere Zirkulationshalbwertszeit in vivo im Vergleich zum gleichen VEGF-Nukleinsäureliganden zeigt, der nicht mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung assoziiert ist oder mit einem Lipidkonstrukt assoziiert ist.
„Linker" ist eine molekulare Einheit, die zwei oder mehrere molekulare Einheiten durch kovalente Bindung oder nicht kovalente Interaktionen verbindet und die räumliche Separation der molekularen Einheiten auf eine Weise ermöglichen kann, die die funktionellen Eigenschaften eines oder mehrerer der molekularen Einheiten bewahren kann. Ein Linker kann auch unter dem Namen Spacer bekannt sein. Beispiele für Linker enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf die in 1M bis 1P gezeigten Strukturen.
„Therapeutik", wie hier verwendet, enthält Behandlung und/oder Prophylaxe. Wenn es verwendet wird, betrifft Therapeutik Menschen oder andere Tiere.
Hier werden RNA-Liganden für VEGF offenbart, die aus 2'F-modifizierten Nukleotiden, wie etwa den spezifischen RNA-Liganden für VEGF, die in den Tabellen 2 bis 6 (SEQ-ID-Nr.: 15-132) gezeigt werden, bestehen. Spezifischer beschrieben werden Nukleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen homolog sind und die im Wesentlichen die gleiche Fähigkeit aufweisen, VEGF als den spezifischen Nukleinsäureliganden zu binden, der in den Tabellen 2 bis 6 gezeigt wird. Mit im Wesentlichen homolog ist ein Grad primärer Sequenzhomologie im Überschuss von 70 % gemeint, am meisten bevorzugt im Überschuss von 80 %, und insbesondere sogar im Überschuss von 90 %, 95 % oder 99 %. Der Prozentsatz an Homologie, wie hier beschrieben, wird als der Prozentsatz der Nukleotide berechnet, die in der kleineren der zwei Sequenzen gefunden wurden, die sich mit identischen Nukleotidresten in der Sequenz anordnen, wobei sie verglichen werden, wenn 1 Lücke in einer Länge von 10 Nukleotiden eingeführt werden kann, um bei dieser Anordnung zu unterstützen. Die im Wesentlichen gleiche Fähigkeit, an VEGF zu binden, bedeutet, dass die Affinität innerhalb einer oder zwei Größenordnungen der Affinitätsgröße der hier beschrieben Liganden liegt. Der Durchschnittsfachmann ist in der Lage zu bestimmen, ob eine gegebene Sequenz – die im Wesentlichen homolog zu jenen ist, die hier spezifisch beschrieben sind – die gleiche Fähigkeit hat, an VEGF zu binden.
Ein Überblick der Sequenzhomologien der Nukleinsäureliganden von VEGF, die in den Tabellen 2 bis 6 (SEQ-ID-Nr.: 15-132) gezeigt wird, zeigt, dass Sequenzen mit kleiner oder nicht primärer Homologie im Wesentlichen die gleiche Fähigkeit haben können, VEGF zu binden. Aus diesen Gründen enthält diese Erfindung auch Nukleinsäureliganden, die im Wesentlichen die gleiche vorausgesetzte Struktur oder strukturellen Motive und die Fähigkeit aufweisen, VEGF zu binden, wie die Nukleinsäureliganden, die in Tabellen 2 bis 6 gezeigt werden.
Im Wesentlichen können die gleiche Struktur oder strukturellen Motive durch Sequenzanordnung unter Verwendung des Zukerfold-Programms vorausgesetzt werden (vergleiche Zuker (1989) Science 244:48–52).
Wie dem Fachmann bekannt sein wird, können andere Computerprogramme verwendet werden, um die sekundäre Struktur und die strukturellen Motive vorherzusagen. Die gleiche Struktur oder das strukturelle Motiv der Nukleinsäureliganden in Lösung oder als gebundene Struktur können im Wesentlichen auch unter Verwendung von NMR oder anderer Techniken vorausgesetzt werden, wie dem Fachmann bekannt sein wird.
Auch beschrieben wird eine Methode zur Herstellung eines Komplexes, der einen VEGF-Nukleinsäureliganden und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst, durch die Methode, die die Identifikation eines Nukleinsäureliganden aus einem Kandidatengemisch aus Nukleinsäuren umfasst, worin die Nukleinsäure ein Ligand von VEGF ist, durch die Methode, (a) das Kandidatengemisch der Nukleinsäuren mit VEGF in Kontakt zu bringen, (b) zwischen den Mitgliedern des besagten Kandidatengemisches auf der Basis der Affinität zu VEGF zu trennen und c) die ausgewählten Moleküle zu amplifizieren, um ein Gemisch aus Nukleinsäuren zu liefern, angereichert für Nukleinsäuresequenzen mit einer relativ höheren Affinität zur Bindung an VEGF, und die kovalente Verlinkung des besagten identifizierten VEGF-Nukleinsäureliganden mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Komplexe bereitzustellen, die einen oder mehrere VEGF RNA-Liganden der Erfindung umfassen, die mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung kovalent verlinkt sind. Solche Komplexe haben einen oder mehrere der folgenden Vorteile gegenüber einem VEGF-RNA-Liganden, der nicht mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung assoziiert ist: 1) Verbesserte Pharmakokinetik-Eigenschaften und 2) verbesserte Kapazität für intrazelluläre Verabreichung oder 3) verbesserte Kapazität für Targeting. Ferner haben Komplexe, die mit einem Lipidkonstrukt assoziiert sind, die gleichen Vorteile.
Die Komplexe oder die Lipidkonstrukte, die den VEGF-RNA-Liganden der Erfindung oder Komplexe umfassen, können von einem, zwei oder drei dieser Vorteile profitieren. Zum Beispiel kann ein Lipidkonstrukt der vorliegenden Erfindung a) ein Liposom, b) ein Arzneimittel, das im Innern des Liposoms eingekapselt ist, und c) einen Komplex umfassen, der einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und eine lipophile Verbindung umfasst, wobei die VEGF-RNA-Ligandenkomponente des Komplexes mit dem Äußeren des Lipidkonstrukts assoziiert ist und daraus herausragt. In einem solchen Fall wird das Lipidkonstrukt, das einen Komplex umfasst, 1) verstärkte Pharmakokinetik-Eigenschaften aufweisen, 2) erhöhte Kapazität für die intrazelluläre Verabreichung des eingekapselten Arzneimittels aufweisen und 3) spezifisch auf die vorausgewählte Stelle in vivo targetiert sein, die durch den äußerlich assoziierten VEGF-RNA-Liganden VEGF exprimiert.
In einer anderen Ausführungsform stellt diese Erfindung eine Methode zur Verbesserung der Pharmakokinetik-Eigenschaften eines VEGF-RNA-Liganden der Erfindung durch die kovalente Verlinkung des VEGF-RNA-Liganden mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung bereit, um einen Komplex zu bilden und den Komplex einem Patienten zu applizieren. Die Erfindung betrifft ferner eine Methode zur Verbesserung der Pharmakokinetik-Eigenschaften eines VEGF-RNA-Liganden der Erfindung, indem der Komplex ferner mit einem Lipidkonstrukt assoziiert wird.
In einer anderen Ausführungsform umfasst der Komplex der vorliegenden Erfindung einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung, der kovalent an einer lipophilen Verbindung angelagert ist, wie etwa einem Glycerolipid oder einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht, wie etwa Polyalkylenglykol oder Polyethylenglykol (PEG). In diesen Fällen werden die Pharmakokinetik-Eigenschaften des Komplexes im Vergleich zum VEGF-RNA-Liganden allein verstärkt. In einer anderen Ausführungsform werden die Pharmakokinetik-Eigenschaften des VEGF-RNA-Liganden im Vergleich zum VEGF-RNA-Liganden allein verstärkt, wenn der VEGF-RNA-Ligand an eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung kovalent angelagert ist und ferner mit einem Lipidkonstrukt oder dem VEGF-RNA-Liganden assoziiert ist, der in einem Lipidkonstrukt eingekapselt ist.
In Ausführungsformen, in denen es mehrfache VEGF-RNA-Liganden der Erfindung gibt, gibt es aufgrund der mehrfachen Bindungsinteraktionen mit VEGF einen Anstieg der Avidität. Außerdem werden in Ausführungsformen, in denen der Komplex einen mehrfachen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung umfasst, die Pharmakokinetik-Eigenschaften des Komplexes, im Vergleich zu einem VEGF-RNA-Ligand allein, verbessert sein. In Ausführungsformen, in denen ein Lipidkonstrukt mehrfache Nuklein-RNA-Liganden oder Komplexe umfasst, können die Pharmakokinetik-Eigenschaften des VEGF-RNA-Liganden im Vergleich zu Lipidkonstrukten verbessert werden, in denen es nur einen Nuklein-RNA-Liganden oder Komplex gibt.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Komplex der vorliegenden Erfindung einen VEGF-RNA-Liganden, der an einen (dimerisch) oder mehrere (multimerisch) andere Nukleinsäureliganden angelagert ist. Der Nukleinsäureligand kann zu einem VEGF oder einem unterschiedlichen Target sein. In Ausführungsformen, in denen es mehrfache VEGF-Nukleinsäureliganden gibt, gibt es aufgrund der mehrfachen Bindungsinteraktionen mit VEGF eine Erhöhung der Avidität. Außerdem werden in Ausführungsformen der Erfindung, in denen der Komplex einen VEGF-RNA-Liganden umfasst, der an eine oder mehrere andere VEGF-Nukleinsäureliganden angelagert ist, die Pharmakokinetik-Eigenschaften des Komplexes, im Vergleich zu einem VEGF-RNA-Liganden allein, verbessert.
Die nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder die lipophile Verbindung kann an eine Vielzahl von Positionen auf dem VEGF-RNA-Liganden der Erfindung kovalent gebunden sein, wie etwa an eine exocyclische Aminogruppe auf der Base, der 5-Position eines Pyrimidinnukleotids, der 8-Position eines Purinnukleotids, der Hydroxylgruppe des Phosphats oder einer Hydroxylgruppe oder einer anderen Gruppe an den 5'- oder 3'-Termini des VEGF-RNA-Liganden. In Ausführungsformen, in denen die lipophile Verbindung ein Glycerolipid ist, oder die nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht ein Polyalkylenglykol oder Polyethylenglykol ist, ist sie vorzugsweise an das 5'- oder 3'-Hydroxyl der Phosphatgruppe davon gebunden. In der bevorzugtesten Ausführungsform ist die lipophile Verbindung oder die nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht an das 5'-Hydroxyl der Phosphatgruppe des RNA-Liganden gebunden. Die Anlagerung der nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder der lipophilen Verbindung an den VEGF-RNA-Liganden kann direkt oder unter Nutzung von Linkern oder Spacern erfolgen. In Ausführungsformen, in denen das Lipidkonstrukt einen Komplex umfasst oder in denen die VEGF-RNA-Liganden in dem Liposom eingekapselt sind, ist eine nicht kovalente Interaktion zwischen dem VEGF-RNA-Liganden oder dem Komplex und dem Lipidkonstrukt bevorzugt.
Ein Problem, das bei der therapeutischen Verwendung von Nukleinsäuren auftritt, ist, dass Oligonukleotide in ihrer Phosphodiesterform in den Körperflüssigkeiten schnell durch intrazelluläre und extrazelluläre Enzyme, wie etwa Endonucleasen und Exonukleasen, abgebaut werden, bevor die gewünschte Wirkung offenkundig wird. Einige chemische Modifikationen des VEGF-Nukleinsäureliganden können durchgeführt werden, um die In-vivo-Stabilität des VEGF-Nukleinsäureliganden zu erhöhen oder die Verabreichung des VEGF-Nukleinsäureliganden zu verstärken oder zu vermitteln. Die Modifikationen der VEGF-Nukleinsäureliganden, die in dieser Erfindung betrachtet werden, enthalten, sind aber nicht beschränkt auf jene, die andere chemische Gruppen bereitstellen, die zusätzliche Ladung, Polarisierbarkeit, Hydrophobie, Wasserstoffbindung, elektrostatische Interaktion und Fluxionalität in die VEGF-Nukleinsäureligandenbasen oder den VEGF-Nukleinsäureliganden als Ganzes einbauen. Solche Modifikationen enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf 2'-Position-Zuckermodifikationen, 5-Position-Pyrimidinmodifikationen, 8-Position-Purinmodifikationen, Modifikationen bei exocyclischen Aminen, Substitution von 4-Thiouridin, Substitution von 5-Bromo- oder 5-Jodo-Uracil, Rückgratkettenmodifikationen, Phosphorothioat- oder Alkylphosphatmodifikationen, Methylationen, unübliche Basenpaarungskombinationen, wie etwa die Isobasen Isocytidin und Isoguanidin und ähnliche. Die Modifikationen können auch 3'- und 5'-Modifikationen wie etwa Capping enthalten.
Wo die Nukleinsäureliganden durch die SELEX-Methode abgeleitet wurden, können die Modifikationen Prä- oder Post-SELEX-Modifikationen sein. Prä-SELEX-Modifikationen liefern VEGF-Nukleinsäureliganden, die sowohl Spezifität für VEGF als auch verbesserte In-vivo-Stabilität aufweisen. Post-SELEX-Modifikationen, die an 2'-OH-Nukleinsäureliganden durchgeführt wurden, können zu verbesserter In-vivo-Stabilität führen, ohne die Bindungskapazität der Nukleinsäureliganden negativ zu beeinflussen. Die bevorzugten Modifikationen des erfindungsgemäßen VEGF-Nukleinsäureliganden sind 5'- und 3'-Phosphorothioat-Capping und/oder 3'3'-invertierte Phosphodiester-Verlinkung am 3'-Ende. In der bevorzugtesten Ausführungsform ist die bevorzugte Modifikation des VEGF-Nukleinsäureliganden die 3'3'-invertierte Phosphodiester-Verlinkung am 3'-Ende. Zusätzliche 2'Fluoro(2'-F)-, 2'Amino(2'-NH₂)- und 2'O-Methyl(2'-OMe)-Modifikation einiger oder aller Nukleotide sind bevorzugt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung führt die kovalente Verlinkung des VEGF-RNA-Liganden der Erfindung mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung zu verbesserten Pharmakokinetik-Eigenschaften (d. h. langsamere Clearancerate) im Verhältnis zum VEGF-RNA-Liganden, der nicht mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder einer lipophilen Verbindung assoziiert ist.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der Komplex, der einen VEGF-RNR-Liganden der Erfindung und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst, ferner mit einem Lipidkonstrukt assoziiert werden. Diese Assoziation kann, im Vergleich mit dem VEGF-RNA-Liganden oder Komplex, der nicht mit einem Lipidkonstrukt assoziiert ist, zu verbesserten Pharmakokinetik-Eigenschaften führen. Der VEGF-Nukleinsäureligand oder Komplex kann mit dem Lipidkonstrukt durch kovalente oder nicht kovalente Interaktionen assoziiert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Assoziation durch nicht kovalente Interaktionen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lipidkonstrukt ein Lipiddoppelschichtvesikel. In der bevorzugtesten Ausführungsform ist das Lipidkonstrukt ein Liposom.
Liposome zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können mit irgendeiner der verschiedenen Techniken hergestellt werden, die derzeit dem Fachmann bekannt sind, oder später entwickelt werden. Typischerweise werden sie aus einem Phospholipid hergestellt, zum Beispiel Distearoylphosphatidylcholin, und können andere Materialen, wie etwa neutrale Lipide, zum Beispiel, Cholesterin und auch Oberflächenmodifikatoren, wie etwa positiv geladene Verbindungen (z. B. Sterylamin- oder Aminomannose- oder Aminomannitolderivate von Cholesterin) oder negativ geladene Verbindungen (z. B. Diacetylphosphat, Phosphatidylglycerol) enthalten. Multilamellare Liposome können mit herkömmlichen Techniken gebildet werden, das heißt durch Ablagerung eines ausgewählten Lipids auf der Innenwand eines geeigneten Behälters oder Gefäßes, indem das Lipid in einem geeigneten Lösemittel gelöst wird und dann das Lösemittel verdampft wird, damit ein dünner Film auf dem Inneren des Gefäßes zurückbleibt, oder durch Sprühtrocknung. Eine wässrige Phase wird dann mit einer wirbelnden oder Vortexing-Bewegung dem Gefäß zugefügt, was zur Bildung von MLVs führt. UVs können dann durch Homogenisierung, Beschallung oder Extrusion (durch Filter) aus MLVs gebildet werden. Zusätzlich können UVs durch Techniken zur Entfernung von Detergenzien gebildet werden.
In einigen Ausführungsformen dieser Erfindung umfasst das Lipidkonstrukt einen (mehrere) targetierende(n) VEGF-RNA-Ligand(en) der Erfindung, der (die) mit der Oberfläche des Lipidkonstrukts und einem eingekapselten therapeutischen oder diagnostischen Wirkstoff assoziiert ist (sind). Vorzugsweise ist das Lipidkonstrukt ein Liposom. Vorgebildete Liposome können modifiziert werden, um mit den VEGF-RNA-Liganden zu assoziieren. Zum Beispiel assoziiert sich ein kationisches Liposom durch elektrostatische Interaktionen mit dem VEGF-RNA-Liganden. Ein VEGF-RNA-Ligand, der mit einer lipophilen Verbindung, wie etwa einem Glycerolipid kovalent verlinkt ist, kann vorgebildeten Liposomen zugefügt werden, wobei das Glycerolipid, Phospholipid oder Glycerolamidlipid mit der liposomalen Membran assoziiert wird. Alternativ kann der VEGF-RNA-Ligand mit dem Liposom während der Formulierung des Liposoms assoziiert werden.
Es ist dem Fachmann bekannt, dass sich Liposome sehr gut zur Einkapselung oder dem Einbau einer großen Vielzahl therapeutischer und diagnostischer Wirkstoffe eignen. Eine Vielzahl von Verbindungen können in das innere wässrige Kompartiment der Liposome eingeschlossen werden. Illustrierende therapeutische Wirkstoffe enthalten Antibiotika, antivirale Nukleoside, antifungale Nukleoside, Stoffwechselregulatoren, Immunmodulatoren, chemotherapeutische Arzneimittel, Toxin-Gegenmittel, DNA, RNA, Antisense-Oligonukleotide usw. Ebenso können die Lipiddoppelschichtvesikel mit einem diagnostischen Radionuklid (z. B. Indium 111, Jod 131, Yttrium 90, Phosphor 32 oder Gadolinium) und fluoreszierenden Materialien oder anderen Materialien geladen werden, die in In-vitro- und In-vivo-Anwendungen nachweisbar sind. Es versteht sich, dass der therapeutische oder diagnostische Wirkstoff durch die Liposomwände in dem wässrigen Inneren eingekapselt werden kann. Alternativ kann der getragene Wirkstoff ein Teil davon sein, das heißt in den Materialien dispergiert oder gelöst sein, die die Vesikelwand bilden.
Während der Liposombildung können wasserlösliche Trägerwirkstoffe in das wässrige Innere eingekapselt werden, indem sie in der hydrierenden Lösung eingeschlossen und indem die lipophilen Moleküle in die Lipiddoppelschicht durch Einschluss in die Lipidformulierung eingebaut werden. Im Falle einiger Moleküle (z. B. kationischer oder anionischer lipophiler Arzneimittel) kann das Laden der Arzneimittel in vorgebildete Liposome zum Beispiel mit den Methoden erfolgen, die in der US-Patentschrift Nr. 4,946,683 beschrieben werden. Nach der Arzneimittel-Einkapselung werden die Liposome verarbeitet, um nicht eingekapselte Arzneimittel durch Prozesse wie etwa Gelchromatographie oder Ultrafiltration zu entfernen. Die Liposome werden dann typischerweise einer Sterilfiltration unterzogen, um alle Mikroorganismen zu entfernen, die in der Suspension vorhanden sein könnten. Mikroorganismen können auch durch aseptische Verarbeitung entfernt werden.
Wenn große hydrophile Moleküle in Liposome eingekapselt werden sollen, können größere unilamellare Vesikel mit Methoden wie etwa Umkehrphasen-Verdampfung (Reverse-phase Evaporation REV) oder Lösemittel-Infusionsmethoden gebildet werden. Andere Standardmethoden für die Bildung von Liposomen sind dem Fachmann bekannt, zum Beispiel enthalten Methoden für die kommerzielle Produktion von Liposomen das Homogenisierungsverfahren, das in der US-Patentschrift Nr. 4,753,788 beschrieben wurde, und die Dünnschichtverdampfungs-Methode, die in der US-Patentschrift Nr. 4,935,171 beschrieben wurde.
Es versteht sich, dass der therapeutische oder diagnostische Wirkstoff auch mit der Oberfläche des Lipiddoppelschichtvesikels assoziiert werden kann. Zum Beispiel kann ein Arzneimittel an ein Phospholipid oder Glycerid (einer Arzneimittelvorstufe) angelagert werden. Der Phospholipid- oder Glyceridanteil der Arzneimittelvorstufe kann in die Lipiddoppelschicht des Liposoms durch Einschluss in die Lipidformulierung oder durch Laden in vorgebildete Liposome eingebaut werden (vergleiche die US-Patenschriften Nr. 5,194,654 und 5,223,263).
Für einen Fachmann wird schnell offensichtlich, dass die besondere Methode zur Herstellung der Liposome von der angestrebten Verwendung und der Art der Lipide abhängen wird, die verwendet werden, um die Doppelschichtmembran zu bilden.
Lee and Low (1994, JBC, 269: 3198–3204) und DeFrees et al. (1996, JACS, 118: 6101–6104) haben zuerst gezeigt, dass die Co-Formulierung eines Ligand-PEG-Lipids mit Lipidkomponenten Liposome ergab, die sowohl nach innen als auch nach außen gerichtete Orientierungen des PEG-Liganden aufwiesen. Die passive Verankerung wurde von Zalipsky et al. (1997, Bioconj. Chem. 8: 111–118) als eine Methode zur ausschließlichen Verankerung von Oligopeptid- und Oligosaccharidliganden an die äußere Oberfläche der Liposome skizziert. Das zentrale Konzept, das in ihrer Arbeit präsentiert wird, ist, dass Ligand-PEG-Lipid-Konjugate hergestellt werden können und dann in vorgebildete Liposome über den spontanen Einbau („Verankerung") des Lipidschwanzes in die bestehende Lipiddoppelschicht formuliert werden können. Die Lipidgruppe wird dieser Insertion unterzogen, um einen niedrigeren freien Energiezustand über die Entfernung ihres hydrophoben Lipidankers aus der wässrigen Lösung und ihre nachfolgende Positionierung in der hydrophoben Lipiddoppelschicht zu erreichen. Der Hauptvorteil eines solchen Systems ist, dass das Oligolipid ausschließlich am Äußeren der Lipiddoppelschicht verankert wird. Somit werden keine Oligolipide dadurch verschwendet, dass sie für Interaktionen mit ihren biologischen Targets nicht verfügbar sind, weil sie eine nach innen gerichtete Orientierung haben.
Die Effizienz der Verabreichung eines VEGF-Nukleinsäureliganden an Zellen kann optimiert werden, indem Lipidformulierungen und Bedingungen verwendet werden, von denen bekannt ist, dass sie die Fusion der Liposome mit den zellulären Membranen verstärken. Zum Beispiel fördern einige negativ geladene Lipide, wie etwa Phosphatidylglycerol und Phosphatidylserin, die Fusion, vor allem in Gegenwart anderer Fusogene (z. B. multivalente Kationen wie Ca²⁺, freie Fettsäuren, virale Fusionsproteine, kurzkettiges PEG, Lysolecithin, Detergenzien und oberflächenaktive Stoffe). Phosphatidylethanolamin kann auch in der Liposomformulierung enthalten sein, um die Membranfusion zu erhöhen und gleichzeitig die zelluläre Verabreichung zu verstärken. Zusätzlich können freie Fettsäuren und Derivate davon, die zum Beispiel Carboxylat-Teile enthalten, verwendet werden, um pH-empfindliche Liposome herzustellen, die bei höherem pH-Wert negativ geladen und bei niedrigerem pH-Wert neutral oder protoniert sind. Von solchen pH-empfindlichen Liposomen ist bekannt, dass sie eine größere Tendenz zur Fusion besitzen.
In der bevorzugten Ausführungsform sind die VEGF-RNA-Liganden der vorliegenden Erfindung durch die SELEX-Methodik abgeleitet. SELEX wird in der jetzt eingestellten US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/536,428 mit dem Titel Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/714,131, eingereicht am 10. Juni 1991 mit dem Titel Nucleic Acid Ligands, jetzt US-Patentschrift Nr. 5,475,096, der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/931,473, eingereicht am 17. Aug. 1992 mit dem Titel Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands, jetzt US-Patentschrift Nr. 5,270,163 beschrieben (vergleiche auch WO 91/19813). Diese Anmeldungen werden insgesamt SELEX-Patentanmeldungen genannt.
Das SELEX-Verfahren stellt eine Klasse von Produkten bereit, die Nukleinsäuremoleküle sind, wobei jedes eine einmalige Sequenz aufweist und jedes davon die Eigenschaft hat, spezifisch an eine gewünschte Targetverbindung oder ein gewünschtes Molekül zu binden. Targetmoleküle sind vorzugsweise Proteine, können aber unter anderem auch Kohlenhydrate, Peptidoglycane und eine Vielzahl kleiner Moleküle enthalten. Die SELEX-Methodik kann auch verwendet werden, um biologische Strukturen, wie etwa Zelloberflächen oder Viren, durch die spezifische Interaktion mit einem Molekül zu targetieren, das ein integraler Bestandteil dieser biologischen Struktur ist.
In seiner einfachsten Form kann das SELEX-Verfahren durch die folgende Serie von Schritten definiert werden:

1) Es wird ein Kandidatengemisch aus Nukleinsäuren mit unterschiedlicher Sequenz hergestellt. Das Kandidatengemisch enthält generell Regionen mit fixierten Sequenzen (d. h., jedes der Mitglieder des Kandidatengemischs enthält die gleichen Sequenzen an den gleichen Stellen) und Regionen randomisierter Sequenzen. Die Regionen mit der fixierten Sequenz werden ausgewählt entweder: (a) um die Amplifikationsschritte, die unten beschrieben werden, zu unterstützen, (b) um eine Sequenz zu imitieren, von der bekannt ist, dass sie an das Target bindet, oder (c) um die Konzentration einer gegebenen strukturellen Anordnung der Nukleinsäuren in dem Kandidatengemisch zu verstärken. Die randomisierten Sequenzen können vollständig randomisiert sein (d. h., die Möglichkeit, eine Base an irgendeiner Position zu finden, beträgt eins zu vier) oder nur teilweise randomisiert sein (z. B. kann die Möglichkeit, eine Base an irgendeiner Stelle zu finden, aus irgendeinem Level zwischen 0 und 100 Prozent ausgewählt werden).
2) Das Kandidatengemisch wird mit dem ausgewählten Target unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Bindung zwischen dem Target und den Mitgliedern des Kandidatengemischs begünstigen. Unter diesen Umständen kann die Interaktion zwischen dem Target und den Nukleinsäuren des Kandidatengemischs als die Bildung von Nukleinsäure-Targetpaaren zwischen dem Target und jenen Nukleinsäuren betrachtet werden, die die größte Affinität für das Target aufweisen.
3) Die Nukleinsäuren mit der höchsten Affinität für das Target werden von jenen Nukleinsäuren mit einer geringen Affinität zum Target getrennt. Da nur eine äußerst kleine Anzahl von Sequenzen (und möglicherweise nur ein Molekül einer Nukleinsäure), die den Nukleinsäuren mit der höchsten Affinität entsprechen, in dem Kandidatengemisch vorhanden sind, ist es generell erwünscht, die Trennungskriterien so festzulegen, dass eine signifikante Menge an Nukleinsäuren in dem Kandidatengemisch (etwa 5 bis 50 %) während der Trennung zurückgehalten wird.
4) Jene Nukleinsäuren, die während der Trennung als Nukleinsäuren mit einer relativ höheren Affinität für das Target ausgewählt werden, werden dann amplifiziert, um ein neues Kandidatengemisch zu erzeugen, dass mit Nukleinsäuren angereichert ist, die eine relativ höhere Affinität für das Target aufweisen.
5) Durch die Wiederholung der oben genannten Trennungs- und Amplifikationsschritte enthält das neu gebildete Kandidatengemisch immer weniger einmalige Sequenzen, und der durchschnittliche Affinitätsgrad der Nukleinsäuren zum Target erhöht sich generell. Auf die Spitze getrieben wird das SELEX-Verfahren ein Kandidatengemisch liefern, das eine oder eine kleine Anzahl einmaliger Nukleinsäuren enthält, die jene Nukleinsäuren aus dem Originalkandidatengemisch darstellen, die die höchste Affinität zum Targetmolekül aufweisen.

Die Basis-SELEX-Methode wurde modifiziert, um eine Reihe spezifischer Ziele zu erreichen. Zum Beispiel beschreibt die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/960,093, eingereicht am 14. Okt. 1992 mit dem Titel „Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure", die Verwendung von SELEX in Verbindung mit Gelelektrophorese, um Nukleinsäuremoleküle mit spezifischen strukturellen Merkmalen, wie etwa Bent-DNA, auszuwählen. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/123,935, eingereicht am 17. Sep. 1993 mit dem Titel „Photoselection of Nucleic Acid Ligands", beschreibt eine SELEX-basierte Methode zur Auswahl von Nukleinsäureliganden, die photoreaktive Gruppen enthalten, die in der Lage sind, ein Targetmolekül zu binden und/oder photochemisch zu vernetzen und/oder zu photoinaktivieren. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/134,028, eingereicht am 7. Okt. 1993 mit dem Titel „High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine", jetzt US-Patentschrift Nr. 5,580,737, beschreibt eine Methode zur Identifikation hochspezifischer Nukleinsäureliganden, die zwischen nah verwandten Molekülen unterscheiden können, genannt Counter-SELEX. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/143,564, eingereicht am 25. Okt. 1993 mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", jetzt US-Patentschrift Nr. 5,567,588, beschreibt eine SELEX-basierte Methode, die die höchst effiziente Trennung zwischen Oligonukleotiden mit hoher und niedriger Affinität für ein Targetmolekül erreichen kann. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/964,624, eingereicht am 21. Okt. 1992 mit dem Titel „Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev", jetzt US-Patentschrift Nr. 5,496,938, beschreibt Methoden zum Erhalt verbesserter Nukleinsäureliganden nachdem SELEX ausgeführt wurde. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/400,440, eingereicht am 8. März 1995 mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX", beschreibt Methoden zur kovalenten Verlinkung eines Liganden an sein Target.
Die SELEX-Methode umschließt die Identifikation von Hochaffinitäts-Nukleinsäureliganden, die modifizierte Nukleotide enthalten, die dem Liganden verbesserte Merkmale verleihen, wie etwa verbesserte In-vivo-Stabilität oder verbesserte Verabreichungsmerkmale. Beispiele solcher Modifikationen enthalten chemische Substitutionen an den Ribose- und/oder Phosphat- und/oder Basenpositionen. SELEX-identifizierte Nukleinsäureliganden, die modifizierte Nukleotide enthalten, werden in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/117,991, eingereicht am 8. Sept. 1993 mit dem Titel „High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", jetzt US-Patentschrift Nr. 5,660,985, beschrieben, die Oligonukleotide beschreibt, die chemisch modifizierte Nukleotidderivate an den 5- und 2'-Positionen der Pyrimidine enthalten. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/134,028, oben, beschreibt hochspezifische Nukleinsäureliganden, die ein oder mehrere Nukleotide enthalten, die mit 2'-Amino (2'-NH₂), 2'-Fluoro(2'-F) und/oder 2'-O-Methyl(2'-OMe) modifiziert sind. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/264,029, eingereicht am 22. Juni 1994 mit dem Titel „Novel Method of Preparation of Known and Novel Nucleotides by Intramolecular Nucleophilic Displacement", beschreibt Oligonukleotide, die verschiedene 2'-modifizierte Pyrimidine enthalten.
Die SELEX-Methode umschließt die Kombination ausgewählter Oligonukleotide mit anderen ausgewählten Oligonukleotiden und nicht-Oligonukleotid-funktionellen Einheiten, wie in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/284,063 beschrieben, eingereicht am 2. Aug. 1994 mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX", jetzt US- Patentschrift Nr. 5,637,459, bzw. der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/234,997, eingereicht am 28. April 1994 mit dem Titel „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX". Diese Anmeldungen ermöglichen die Kombination eines breiten Spektrums von Formen und anderer Eigenschaften und effiziente Amplifikations- und Replikationsmerkmale von Oligonukleotiden mit den gewünschten Eigenschaften anderer Moleküle.
Die SELEX-Methode umschließt ferner die Kombination ausgewählter Nukleinsäureliganden mit lipophilen Verbindungen oder nicht-immunogenen Verbindungen mit hohem Molekulargewicht in einem diagnostischen oder therapeutischen Komplex, wie in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/434,465, eingereicht am 4. Mai 1995 mit dem Titel „Nucleic Acid Complexes", beschrieben. Die SELEX-Methode umschließt ferner die Kombination ausgewählter VEGF-Nukleinsäureliganden mit lipophilen Verbindungen, wie etwa Diacylglycerol oder Dialkylglycerol, wie in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/739,109, eingereicht am 25. Okt. 1996 mit dem Titel „Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes", beschrieben. VEGF-Nukleinsäureliganden, die mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht, wie etwa Polyethylenglykol oder einer lipophilen Verbindung, wie etwa Glycerolipid, Phospholipid oder Glycerolamidlipid, in einem diagnostischen oder therapeutischen Komplex assoziiert sind, werden in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/897,351, eingereicht am 21. Juli 1997 mit dem Titel „Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Complexes", beschrieben.
SELEX identifiziert Nukleinsäureliganden, die Targets mit hoher Affinität und mit herausragender Spezifität binden können, was eine singuläre Errungenschaft darstellt, die auf dem Gebiet der Nukleinsäureforschung beispiellos ist. Diese Merkmale sind natürlich die gewünschten Eigenschaften, die ein Fachmann bei einem therapeutischen oder diagnostischen Liganden suchen würde.
Um Nukleinsäureliganden zu produzieren, die für die Verwendung als Pharmazeutikum erwünscht sind, ist es bevorzugt, dass der Nukleinsäureligand (1) an das Target auf eine Weise bindet, die in der Lage ist, die gewünschte Wirkung auf dem Target zu erreichen; dass er (2) so klein wie möglich ist, um die gewünschte Wirkung zu erhalten; dass er (3) so stabil wie möglich ist; und dass er (4) ein spezifischer Ligand für das gewählte Target ist. In den meisten Situationen ist es bevorzugt, dass der Nukleinsäureligand die höchstmögliche Affinität mit dem Target aufweist. Daneben können Nukleinsäureliganden erleichternde Eigenschaften haben.
In der auf übliche Weise abgetretenen US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/964,624, eingereicht am 21. Okt. 1992 ('624), jetzt US-Patentschrift Nr. 5,496,938, werden Methoden zum Erhalt verbesserter Nukleinsäureliganden, nachdem SELEX ausgeführt wurde, beschrieben.
Das SELEX-Verfahren wurde verwendet, um eine Gruppe mit RNA-Liganden, die eine hohe Affinität zu VEGF aufweisen, aus Random-2'-Aminopyrimidin-RNA-Bibiliotheken zu identifizieren und ssDNA-Liganden aus Random-ssDNA-Bibliotheken (US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/447,169, eingereicht am 19. Mai 1995 mit dem Titel High-Affinity Oligonucleotide Ligands to Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), die eine Teilfortsetzungsanmeldung der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/233,012 ist, eingereicht am 25. April 1994 mit dem Titel High-Affinity Oligonucleotide Ligands to Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); vergleiche auch Green et al. (1995) Chemistry and Biology 2:683–695).
In Ausführungsformen, in denen der (die) VEGF-Nukleinsäureligand(en) in einer Targeting-Kapazität dienen kann (können), nehmen die VEGF-Nukleinsäureliganden eine dreidimensionale Struktur an, die beibehalten werden muss, damit der VEGF-Nukleinsäureligand an sein Target binden kann. In Ausführungsformen, in denen das Lipidkonstrukt einen Komplex umfasst und der VEGF-Nukleinsäureligand des Komplexes aus der Oberfläche des Lipidkonstrukts herausragt, muss der VEGF-Nukleinsäureligand im Verhältnis zur Oberfläche des Lipidkonstrukts passend orientiert sein, so dass dessen Targetbindungskapazität nicht gefährdet wird. Dies kann erfolgen, indem der VEGF-Nukleinsäureligand an einer Position angelagert wird, die vom Bindungsabschnitt des VEGF-Nukleinsäureliganden entfernt ist. Die dreidimensionale Struktur und die passende Orientierung kann auch durch die Verwendung eines Linkers oder Spacers, wie oben beschrieben, bewahrt werden.
Jede Auswahl therapeutischer oder diagnostischer Wirkstoffe kann für die targetierte Verabreichung durch den Komplex an den Komplex angelagert werden. Zusätzlich kann jede Auswahl therapeutischer oder diagnostischer Wirkstoffe für die targetierte Verabreichung durch das Lipidkonstrukt, wie oben diskutiert, an das Lipidkonstrukt angelagert, eingekapselt oder eingebaut werden.
In Ausführungsformen, in denen der Komplex eine lipophile Verbindung und einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung in Assoziation mit einem Liposom umfasst, könnte der VEGF-RNA-Ligand zum Beispiel Tumorzellen targetieren, die VEGF exprimieren, (z. B. beim Kaposi-Sarkom) für die Verabreichung eines Antitumor-Arzneimittels (z. B. Daunorubicin) oder eines bildgebenden Wirkstoffs (z. B. radioaktive Markierungen). Es sollte festgehalten werden, dass Zellen und Gewebe, die den Tumor umgeben, auch VEGF exprimieren und die gezielte Verabreichung eines Antitumor-Arzneimittels an diese Zellen auch wirksam wäre.
In einer alternativen Ausführungsform könnte der therapeutische oder diagnostische Wirkstoff, der an die Targetzelle verabreicht werden soll, ein anderer Nukleinsäureligand sein.
Ferner erwägt diese Erfindung, dass der Wirkstoff, der verabreicht werden soll, so in den Komplex eingebaut werden kann, dass er mit der äußeren Oberfläche des Liposoms (z. B. einer Arzneimittelvorstufe, einem Rezeptorantagonisten oder einer radioaktiven Substanz zur Behandlung oder Bildgebung) assoziiert werden kann. Wie beim VEGF-RNA-Liganden der Erfindung kann der Wirkstoff durch kovalente oder nicht kovalente Interaktionen assoziiert werden. Das Liposom würde eine extrazelluläre gezielte Verabreichung des Wirkstoffs bereitstellen, wobei das Liposom als Linker dient.
In einer anderen Ausführungsform kann eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht (z. B. PEG) an das Liposom angelagert werden, um verbesserte Pharmakokinetik-Eigenschaften für den Komplex bereitzustellen. Die VEGF-RNA-Liganden der Erfindung können an die Liposommembran angelagert werden oder können an eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht angelagert werden, die ihrerseits an die Membran angelagert ist. Auf dieses Weise kann der Komplex von den Blutproteinen abgeschirmt werden und somit dazu gebracht werden, für einen längeren Zeitraum zu zirkulieren, während der VEGF-RNA-Ligand noch ausreichend exponiert ist, um mit seinem Target in Kontakt zu kommen und daran zu binden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird mehr als ein VEGF-RNA-Ligand der Erfindung an die Oberfläche des gleichen Liposoms angelagert. Dies stellt die Möglichkeit bereit, die gleichen VEGF-Moleküle ganz nah zueinander zu bringen, und kann verwendet werden, um spezifische Interaktionen zwischen den VEGF-Molekülen zu generieren.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und ein Nukleinsäureligand für ein unterschiedliches Target an der Oberfläche des gleichen Liposoms angelagert werden. Dies stellt die Möglichkeit bereit, VEGF ganz nah an ein unterschiedliches Target zu bringen, und kann verwendet werden, um spezifische Interaktionen zwischen VEGF und dem anderen Target zu generieren. Zusätzlich zur Verwendung des Liposoms als einen Weg, Targets ganz in die Nähe zu bringen, können Wirkstoffe in das Liposom eingekapselt werden, um die Intensität der Interaktion zu erhöhen.
Das Lipidkonstrukt, das einen Komplex umfasst, eröffnete VEGF die Möglichkeit mehrfacher Bindungsinteraktionen. Dies hängt natürlich von der Anzahl der VEGF-RNA-Liganden je Komplex und der Anzahl der Komplexe je Lipidkonstrukt und der Mobilität der VEGF-RNA-Liganden und Rezeptoren in ihren jeweiligen Membranen ab. Da sich die wirksame Bindungskonstante als Produkt der Bindungskonstante für jede Stelle erhöhen kann, gibt es einen substanziellen Vorteil, mehrfache Bindungsinteraktionen zu haben. Anders gesagt, indem viele VEGF-RNA-Liganden an das Lipidkonstrukt angelagert sind und daher Multivalenz erzeugen, kann die wirksame Affinität (d. h. die Avidität) des multimerischen Komplexes für sein Target genauso gut werden, wie das Produkt der Bindungskonstante für jede Stelle.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Komplex der vorliegenden Erfindung einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung, der an eine lipophile Verbindung, wie etwa ein Glycerollipid, angelagert ist. In diesem Fall werden die Pharmakokinetik-Eigenschaften des Komplexes im Vergleich zum VEGF-RNA-Liganden allein verbessert. Wie oben diskutiert, kann das Glycerollipid, Phospholipid oder Glycerolamidlipid kovalent an den VEGF-RNA-Liganden an zahlreichen Positionen auf dem VEGF-RNA-Liganden gebunden sein. In Ausführungsformen, in denen ein Glycerollipid verwendet wird, ist es bevorzugt, dass der VEGF-RNA-Ligand an das Lipid durch Phosphodiesterverlinkungen gebunden ist.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Lipidkonstrukt einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung oder einen Komplex. In dieser Ausführungsform kann das Glycerolipid aufgrund der Neigung eines Glycerolipids, sich mit anderen lipophilen Verbindungen zu assoziieren, den Einbau des VEGF-RNA-Liganden in das Liposom unterstützen. Das Glycerolipid, das mit einem VEGF-RNA-Liganden assoziiert ist, kann in die Lipiddoppelschicht des Liposoms durch Einschluss in die Formulierung oder durch Laden in die vorgebildeten Liposome eingebaut werden. Das Glycerolipid kann mit der Membran des Liposoms auf eine solche Weise assoziieren, dass der VEGF-RNA-Ligand in oder aus dem Liposom herausragt. In Ausführungsformen, in denen der VEGF-RNA-Ligand aus dem Komplex herausragt, kann der VEGF-RNA-Ligand in einer Targetingkapazität dienen. Es versteht sich, dass zusätzliche Verbindungen mit dem Lipidkonstrukt assoziiert werden können, um die Pharmakokinetik-Eigenschaften des Lipidkonstrukts weiter zu verbessern. Zum Beispiel kann ein PEG an den nach außen gerichteten Teil der Membran des Lipidkonstrukts angelagert werden.
In anderen Ausführungsformen umfasst der Komplex der vorliegenden Erfindung einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung, der kovalent mit einer nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht, wie etwa Polyalkylenglykol oder PEG, verlinkt ist. In dieser Ausführungsform sind die Pharmakokinetik-Eigenschaften des Komplexes im Vergleich zum VEGF-RNA-Liganden allein verbessert. Das Polyalkylenglykol oder das PEG können an einer Vielzahl von Positionen auf dem VEGF-RNA-Liganden kovalent gebunden sein. In Ausführungsformen, in denen Polyalkylenglykol oder PEG verwendet werden, ist es bevorzugt, dass der VEGF-RNA-Ligand durch die 5'-Hydroxylgruppe über eine Phosphodiesterverlinkung gebunden ist.
In einigen Ausführungsformen können viele Nukleinsäureliganden mit einer einzigen, nicht-immunogenen Verbindung mit hohem Molekulargewicht, wie etwa Polyalkylenglykol oder PEG, oder einer lipophilen Verbindung, wie etwa einem Glycerolipid, assoziiert werden. Die Nukleinsäureliganden können alle VEGF-RNA-Liganden der Erfindung oder RNA-Liganden für VEGF und ein unterschiedliches Target sein. In Ausführungsformen, in denen es mehrfache VEGF-RNR-Liganden gibt, gibt es aufgrund der mehrfachen Bindungsinteraktionen mit VEGF eine Erhöhung an Avidität. In noch weiteren Ausführungsformen können viele Polyalkylenglykol-, PEG-, Glycerollipidmoleküle aneinander angelagert werden. In diesen Ausführungsformen können ein oder mehrere VEGF-RNA-Liganden oder RNA-Liganden für VEGF und andere Targets mit jedem Polyalkylenglykol, PEG oder Glycerollipid assoziiert sein. Dies führt auch zu einer Erhöhung der Avidität jedes Nukleinsäureliganden zu seinem Target. In Ausführungsformen, in denen mehrfache VEGF-RNA-Liganden an Polyalkylenglykol, PEG oder Glycerollipid angelagert werden, gibt es die Möglichkeit, die VEGF-Moleküle ganz nah zueinander zu bringen, um spezifische Interaktionen zwischen VEGF zu generie ren. Wo mehrfache RNA-Liganden, die für VEGF spezifisch sind, und unterschiedliche Targets an Polyalkylenglykol, PEG oder Glycerollipid angelagert sind, gibt es die Möglichkeit, VEGF und ein anderes Target ganz nah zueinander zu bringen, um spezifische Interaktionen zwischen VEGF und dem anderen Target zu generieren. Zusätzlich kann in Ausführungsformen, in denen es RNA-Liganden zu VEGF oder RNA-Liganden zu VEGF und unterschiedlichen Targets gibt, die mit Polyalkylenglykol, PEG oder Glycerollipid assoziiert werden, ein Arzneimittel auch mit Polyalkylenglykol, PEG oder Glycerollipid assoziiert werden. Somit würde der Komplex die gezielte Verabreichung des Arzneimittels bereitstellten, wobei Polyalkylenglykol, PEG oder Glycerollipid als Linker dienten.
VEGF-RNA-Liganden der Erfindung binden selektiv an VEGF. Somit sind ein Komplex, der einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst oder ein Lipidkonstrukt, das einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung oder einen Komplex umfasst, als Pharmzeutika oder diagnostische Wirkstoffe nützlich. Die vorliegende Erfindung enthält daher Verwendungen im Zusammenhang mit der Inhibiton von Angiogenese durch die Applikation eines Komplexes, der einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst, ein Lipidkonstrukt, das einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung oder einen Komplex umfasst, der einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst. Die Komplexe, die den VEGF-RNA-Liganden enthalten und die Lipidkonstrukte können verwendet werden, um jeden Krankheitszustand, der eine ungeeignete VEGF-Produktion, besonders Angiogenese, beinhaltet, zu behandeln, zu hemmen, ihm vorzubeugen oder ihn zu diagnostizieren. Bei gesunden Erwachsenen tritt Angiogenese, außer während des Menstruationszyklus und bei der Wundheilung, nur selten auf. Angiogenese ist jedoch ein zentrales Merkmal verschiedener Krankheitszustände, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Krebs, diabetische Retinopathie, Makuladegeneration, Psoriasis und rheumatoide Arthritis. Die vorliegende Erfindung enthält somit auch, ist aber nicht beschränkt auf die Verwendung des VEGF-RNA-Liganden de Erfindung in Verbindung mit der Behandlung, Inhibition, Vorbeugung oder Diagnose von diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, Psoriasis und rheumatoider Arthritis. Daneben wird VEGF in variierenden Mengen von praktisch allen Tumorzellen produziert und sekretiert. Somit enthält die vorliegende Erfindung die Verwendung des VEGF-RNA-Liganden der Erfindung in Verbindung mit der Behandlung, Inhibition, Vorbeugung oder Diagnose von Krebs durch die Applikation eines Komplexes, der einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst, ein Lipidkonstrukt, das einen Komplex oder einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung in Assoziation mit einem Lipidkonstrukt umfasst, ohne Teil des Komplexes zu sein. Es wurde gezeigt, dass bei einer Krebsart, dem Kaposi-Sarkom (KS), die Zellen nicht nur ergiebige Mengen an VEGF produzieren, sondern auch funktionelle VEGF-Rezeptoren exprimieren und daher VEGF für das autokrine Wachstum verwenden. Somit enthält die vorliegende Erfindung die Verwendung des VEGF-RNA-Liganden der Erfindung in Verbindung mit der Inhibition des Kaposi-Sarkoms durch die Applikation eines Komplexes, der einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst, ein Lipidkonstrukt, das einen solchen Komplex umfasst, oder einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung in Assoziation mit einem Lipidkonstrukt, ohne Teil eines Komplexes zu sein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Lipidkonstrukt einen Komplex, der einen VEGF-RNA-Liganden und eine lipophile Verbindung mit einem zusätzlichen diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoff umfasst, der in dem Lipidkonstrukt eingekapselt oder mit dem Inneren des Lipidkonstrukts assoziiert ist. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Lipidkonstrukt ein Lipiddoppelschichtvesikel und insbesondere ein Liposom. Die therapeutische Verwendung der Liposome enthält die Verabreichung von Arzneimitteln, die in freier Form normalerweise toxisch sind. In liposomaler Form ist das toxische Arzneimittel okkludiert und kann von den Geweben weggelenkt werden, die gegenüber dem Arzneimittel empfindlich sind, und es zu ausgewählten Bereichen targetieren. Liposome können therapeutisch auch verwendet werden, um Arzneimittel über einen längeren Zeitraum abzugeben und dadurch die Häufigkeit der Applikation zu reduzieren. Zusätzlich können Liposome eine Methode zur Bildung wässriger Dispersionen hydrophober oder amphiphiler Arzneimittel bereitstellen, die normalerweise für die intravenöse Verabreichung nicht geeignet sind.
Damit viele Arzneimittel und bildgebende Wirkstoffe ein therapeutisches oder diagnostisches Potential haben können, müssen sie an die richtige Stelle im Körper verarbreicht werden, und somit kann das Liposom leicht injiziert werden und die Basis für die stetige Abgabe und Arzneimittel-Verabreichung an spezifische Zelltypen oder Teile des Körpers bilden. Mehrere Techniken können für die Verwendung von Liposomen genutzt werden, um eingekapselte Arzneimittel zu ausgewähltem Wirtsgewebe und weg von empfindlichen Geweben zu targetieren. Diese Techniken enthalten die Manipulation der Größe der Liposome, ihre Nettooberflächenladung und ihren Applikationsweg. MLVs werden gewöhnlich, primär weil sie relativ groß sind, schnell vom retikuloendothelialen System (hauptsächlich Leber und Milz) aufgenommen. Bei UVs wurde andererseits festgestellt, dass sie erhöhte Umlaufzeiten, verringerte Clearanceraten und im Vergleich zu den MLVs eine größere Biodistribution aufweisen.
Die passive Verabreichung von Liposomen enthält die Verwendung verschiedener Applikationswege, z. B. intravenös, subkutan, intramuskulär und topisch. Jeder Weg unterscheidet sich in der Lokalisierung der Liposome. Zwei übliche Methoden, die verwendet werden, um Liposome aktiv auf ausgewählte Targetbereiche zu lenken, enthalten die Anlagerung entweder von Antikörpern oder spezifischen Rezeptorliganden an die Oberfläche der Liposome. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der VEGF-RNA-Ligand der Erfindung mit der äußeren Oberfläche des Liposoms assoziiert und dient in einer Targetingkapazität. Zusätzliche Targetingkomponenten, wie etwa Antikörper oder spezifische Rezeptor-Liganden, können auf der Liposomoberfläche eingeschlossen werden, wie dem Fachmann bekannt sein dürfte. Zusätzlich waren einige Bemühungen zum Targeting von Liposomen auf Tumoren ohne die Verwendung von Antikörpern erfolgreich, vergleiche zum Beispiel die US-Patentschriften Nr. 5,019,369, 5,435,989 und 4,441,775, und dem Fachmann dürfte bekannt sein, wie diese alternativen Targeting-Methoden einzubauen sind.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen eines Komplexes, der einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst, ein Lipidkonstrukt, das einen VEGF-RNA-Liganden der Erfindung und eine nicht-immunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst, und ein VEGF-RNA-Ligand der Erfindung in Assoziation mit einem Lipidkonstrukt, ohne Teil eines Komplexes zu sein, können parenteral durch Injektion appliziert werden, auch wenn andere wirksame Applikationsformen, wie etwa intraartikuläre Injektion, Inhalationsnebel, oral aktive Formulierungen, transdermale Iontophorese oder Zäpfchen auch vorgesehen sind. Ein bevorzugter Träger ist physiologische Kochsalzlösung, aber es wird erwogen, dass andere pharmazeutisch verträgliche Träger auch verwendet werden können. In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Träger und der VEGF-RNA-Ligand-Komplex eine physiologisch kompatible Formulierung mit langsamer Abgabe konstituieren. Das primäre Lösemittel in einem solchen Träger kann entweder wässriger oder nicht wässriger Natur sein. Zusätzlich kann der Träger andere pharmakologisch verträgliche Exzipienten zur Modifizierung oder Erhaltung des pH-Werts, der Osmolarität, der Viskosität, der Klarheit, der Farbe, der Sterilität, der Stabilität, der Lösegeschwindigkeit oder des Geruchs der Formulierung enthalten. In ähnlicher Weise kann der Träger noch andere pharmakologisch verträgliche Exzipienten zur Modifikation oder dem Erhalt von Stabilität, Lösegeschwindigkeit, Abgabe oder Absorption des VEGF-RNA-Liganden der Erfindung enthalten. Solche Exzipienten sind jene Substanzen, die gewöhnlich und üblicherweise genutzt werden, um Dosierungen für die parentale Applikation entweder in Einheitsdosis- oder Mehrfach-Dosis-Form zu formulieren.
Sobald die therapeutische oder diagnostische Zusammensetzung formuliert wurde, kann sie in sterilen Ampullen als Lösung, Suspension, Gel, Emulsion, Feststoff oder als dehydriertes oder lyophilisiertes Pulver gelagert werden. Solche Formulierungen können entweder in gebrauchsfertiger Form gelagert werden, oder in einer Form, die die Rekonstitution unmittelbar vor der Applikation erfordert. Die Art und Weise der Applikation von Formulierungen, die den VEGF-RNA-Liganden der Erfindung für die systemische Verabreichung enthalten, kann subkutan, intramuskulär, intravenös, intranasal oder über ein Vaginal- oder Rektalzäpfchen sein.
Die Vorteile der Komplexe und Lipidkonstrukte der Erfindung enthalten: i) Verbesserung der Plasma-Pharmakokinetik des RNA-Liganden; ii) Präsentation von Nukleinsäureliganden in einer multivalenten Anordnung mit dem Ziel, die Interaktionsavidität mit ihren Targets zu erhöhen; iii) die Kombination von zwei oder mehreren präsentierenden Nukleinsäureliganden mit unterschiedlichen Spezifitäten in dem gleichen Liposomteilchen; iv) Verstärkung der Verabreichung der präsentierenden Nukleinsäureliganden an Tumore, indem aus den intrinsischen tumortargetierenden Eigenschaften der Liposome Nutzen gezogen wird; und v) Verwendung der hohen Affinität und Spezifität der präsentierenden Nukleinsäureliganden, die mit der von Antikörpern vergleichbar ist, um liposomale Inhalte zu spezifischen Targets zu leiten, wobei die präsentierenden Nukleinsäureliganden für die hier beschriebenen Herstellungsarten gut geeignet sind, da, anders als die meisten Proteine, die Denaturierung der präsentierenden Nukleinsäureliganden durch Wärme, verschiedene molekulare Denaturierungsmittel und organische Lösemittel schnell reversibel ist.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung zu erläutern und zu illustrieren und sollten nicht als Beschränkung der Erfindung verstanden werden. Die Strukturen der Nukleinsäureliganden, die in den Beispielen unten beschrieben werden, werden in 1 gezeigt. Beispiel 1 beschreibt die Konjugation von Nukleinsäureliganden mit Lipidreagenzien. Die Fähigkeit eines Dialkylglycerolderivats des VEGF-Nukleinsäureliganden (NX278), entweder als freier Ligand oder eingebaut in die Doppelschicht der Liposome (NX278-L), die Aktivität von VEGF in vitro und in vivo zu hemmen, wird in Beispiel 2 beschrieben. Beispiel 3 beschreibt die experimentellen Verfahren zur Generierung von 2'-F-Pyrimidin-modifizierten RNA-Liganden zu VEGF. Beispiel 4 beschreibt den 2'-F-Pyrimidin-modifizierten RNA-Liganden zu VEGF. Beispiel 5 beschreibt die Synthese von Glycerolipid, Phospholipid und Glycerolamidlipid und des PEG-modifizierten VEGF-Nukleinsäureliganden. Beispiel 6 beschreibt die Pharmakokinetik-Eigenschaften von Phospholipid(PL)- und PEG-modifizierten VEGF-Nukleinsäureliganden. Beispiel 7 beschreibt die Herstellungen des NX31838-PL-Liposom-Komplexes. Beispiele 8 bis 10 beschreiben die Wirksamkeit in vivo der VEGF-Nukleinsäureligandenkomplexe. Beispiel 11 beschreibt die intravitreale Pharmakokinetik von NX3-1838-40K PEG bei Kaninchen.
BEISPIEL 1. Synthese eines mit Dialkylglycerol (1,2-di-O-octadecyl-sn-glycerol) modifizierten VEGF-Nukleinsäureliganden
In diesem Beispiel wird die Konjugation der Nukleinsäureliganden mit Lipidreagenzien beschrieben. Die Synthese des mit (1,2-Di-O-octadecyl-sn-glycerol) modifizierten VEGF-Nukleinsäureliganden wird unten gezeigt.
Schema 1
Tetraethylenglykolmonotosylat (2a):
Tetraethylenglykol (200 ml, 1,15 mol) wurde in 500 ml Pyridin gelöst und auf 0 °C abgekühlt und mit 22,0 g (0,115 mol) p-Toluensulfonylchlorid behandelt. Nachdem die Lösung fertig war, wurde das Reaktionsgemisch über Nacht im Kühlschrank gelagert und dann im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in 800 ml EtOAc gelöst und mit 3 × 600 ml H₂O extrahiert. Die H₂O-Fraktionen wurden mit EtOAc rückextrahiert und die kombinierten EtOAc-Fraktionen wurden mit gesättigtem wässrigem Na₂HPO₄ extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und zu einem farblosen Öl konzentriert. Das Öl wurde durch Flashchromatograpie unter Verwendung von 800 ml Silicagel gereinigt und mit Hexan eluiert, 25 % EtOAc – 50 % EtOAc in Hexan, dann EtOAc, dann 10 % MeOH – 20 % MeOH in EtOAc, um 23,7 g (60 %) des reinen Produkts und 11 des Produkts, das geringfügige Verunreinigungen enthielt, zu erbringen. 2a: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 7,77 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 4,13 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,68-3,53 (m, 14H), 2,58 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 2,42 (s, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) d 168,2, 158,3, 144,8, 135,9, 133,8, 132,0, 129,9, 128,0, 127,7, 126,6, 123,1, 113,0, 85,9, 73,0, 70,6, 70,4, 70,0, 69,7, 67,8, 64,4, 55,1, 37,1; Niedrig auflösende Massenspektrometrie (MS) m/e berechnet für C₁₅H₂₄O₈S (M+1): 349,1.
Tetraethylenglykolmonophthalimid (3a):
Einer gerührten Lösung aus 31,96 g (0,092 mol) von 2a in 400 ml wasserfreiem DMF wurden 14,2 g (1,05 equiv.) Phthalimid und 14,4 ml (1,05 equiv.) 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en zugefügt. Die Lösung wurde 18 Stunden lang auf 70°C erhitzt und dann im Vakuum konzentriert. Das rohe gelbe Öl wurde mit Flashchromatographie unter Verwendung von 1600 ml Silicagel gereinigt und mit 25 % EtOAc – 50 % EtOAc – 75 % EtOAc in Hexan eluiert, dann EtOAc, dann 10 % MeOH – 20 % MeOH in EtOAc, um 23,8 g (80 %) von 3a als Öl zu erbringen. Durch Stehen wurde 3a zu einem wachsartigen weißen Feststoff. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 7,84-7,78 (m, 2H), 7,70-7,66 (m, 2H), 3,86 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,70 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,64-3,51 (m, 12H), 2,67 (bs, 1H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) d 168,2, 133,8, 132,0, 123,1, 72,4, 70,5, 70,4, 70,2, 70,0, 67,8, 61,6, 37,2.
Synthese von Verbindung 4a:
Eine Lösung aus 15 g (0,0464 mol) von 3a in 150 ml THF und 15 ml DMF wurde unter Ar auf 0 °C abgekühlt. Allylbromid (6,0 ml, 1,5 equiv.) wurde der Lösung zugefügt, gefolgt von der Zugabe von 1,76 g (1,5 equiv.) NaH als Feststoff. Die trübe gelbe Suspension wurde bei 0 °C 30 Minuten lang und dann bei Raumtemperatur 18 Std. lang gerührt. MeOH (50 bis 100 ml) wurde zugefügt und konzentriert, dann wurde das Gemisch im Vakuum konzentriert. Das Rohmaterial wurde mit Flashchromatographie unter Verwendung von 1.500 ml Silicagel gereinigt und mit 25 % EtOAc – 50 % EtOAc – 75 % EtOAc in Hexan eluiert, dann EtOAc, dann 10 % MeOH in EtOAc, um 11,05 g (65 %) von 4a als gelbes Öl zu erbringen. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 7,84-7,80 (m, 2H), 7,72-7,67 (m, 2H), 5,94-5,84 (m, 1H), 5,28-5,14 (m, 2H), 3,99 (d, J = 5,61 Hz, 2H), 3,88 (t, J = 5,85 Hz, 2H), 3,72 (t, J = 5,76 Hz, 2H), 3,64-3,54 (m, 13H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) d 168,0, 134,6, 133,7, 131,9, 123,0, 116,9, 72,0, 70,4, 69,9, 69,2, 67,7, 37,0.
1-Dimethoxytrityl-3-(phthalimidotetraethylenglykolyl)-sn-glycerol (9):
Gemäß Schema 1 wurde die Verbindung 9 wie folgt synthetisiert: Einer gerührten Lösung von 4a (10,13 g, 0,0279 mol) in 100 ml Aceton und 1 ml H₂O wurden 3,98 g (1,22 equiv.) N-Methylmorpholin-N-oxid zugefügt. Dieser Suspension wurden 1,75 ml (0,005 equiv.) Osmiumtetroxid als 2,5%ige Lösung in iPrOH zugefügt. Nach der Zugabe der OsO₄-Lösung wurde das Reaktionsgemisch klar gelb. Nachdem die TLC-Analyse die vollständige Umwandlung von 4a (ca. 16 Std.) anzeigte, wurde das Reaktionsgemisch mit 1,5 g Natriumhydrosulfit und 5,0 g Florisil behandelt und 30 Minuten lang gerührt. Die Suspension wurde durch Florisil filtriert, das Filtrat wurde zu einem Öl konzentriert. Das Rohprodukt wurde mit einer anderen Partie kombiniert, die auf die gleiche Weise aus 1,0 g von 4a hergestellt worden war. Die zwei 100ml-Anteile von Pyridin wurden aus den kombinierten Partien co-verdampft, und der Rückstand wurde in 300 ml Pyridin gelöst. Die Lösung wurde auf 0 °C abgekühlt und 10,89 g (1,05 equiv.) von 4,4'-Dimethoxytritylchlorid wurden zugefügt. Ein Trockenrohr wurde in den Kolben eingeführt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 16 Std. lang gerührt. Die Lösung wurde mit 20 ml MeOH behandelt und im Vakuum konzentriert, wobei die Temperatur des Wasserbads auf unter 40 °C gehalten wurde. Das Rohöl wurde mit Flashchromatographie unter Verwendung von 1.100 ml Silicagel (nass auf eine Säule gepackt unter Verwendung von 3 % Triethylamin in Hexan) gereinigt und mit 10 bis 100 % EtOAc in Hexan eluiert (wobei alle 3 % Triethylamin enthielten), um 21,3 g (89 % nach zwei Schritten) von 9 als gelbes Öl zu ergeben. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 7,80-7,77 (m, 2H), 7,66-7,64 (m, 2H), 7,39-7,22 (m, 9H), 7,20-6,76 (m, 4H), 3,97 (bs, 1H), 3,84 (t, J = 5,97 Hz, 2H), 3,74 (s, 6H), 3,68 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,60-3,49 (m, 14H), 3,13-2,76 (m, 2H 2,00 (bs, 1H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) d 168,2, 158,3, 144,8, 135,9, 133,8, 132,0, 129,9, 128,0, 127,7, 126,6, 123,1, 113,0, 85,9, 73,0, 70,6, 70,4, 70,0, 69,7, 67,8, 64,4, 55,1, 37,1; Niedrig auflösende Massenspektrometrie (MS) m/e berechnet für C₄₀H₄₅O₁₀N (M+NH₄+): 717.5.
1-Dimethoxytrityl-3-(aminotetraethylenglykolyl)-sn-glycerol (10)
Gemäß Schema 1 wurde Verbindung 10 wie folgt synthetisiert: Verbindung 9 (5,2 g, 7,2 mmol) wurde in 50 ml 40%igem Methylamin in H₂O aufgenommen, und es wurden 10 ml Methanol zugefügt, um das Ausgangsmaterial löslich zu machen. Das Reaktionsgemisch wurde 5 Std. lang auf 50 °C erhitzt und dann im Vakuum konzentriert und mit Toluen co-verdampft. Das Rohmaterial wurde mit Flashchromatographie auf 200 ml Silicagel gereinigt und mit 15 % methanolischem Ammoniak in Dichlormethan eluiert. Es wurden 3,94 g (96 %) von 10 als schwach gelbes Öl gesammelt. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 7,46-7,21 (m, 9H, DMT), 6,81 (d, 4H, DMT), 4,00 (m, 1H), 3,80 (s, 6H), 3,70-3,49 (überlappend m, 18H), 3,20 (dd, J = 9,24, 5,49 Hz, 1H), 3,12 (dd, J = 9,21, 6,0 Hz, 1H), 2,84-2,80 (m, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) d 158,30, 144,82, 136,01, 129,95, 128,04, 127,66, 126,61, 112,95, 85,85, 73,46, 72,85, 70,55, 70,45, 69,99, 69,51, 64,43, 55,10, 41,40; Niedrig auflösende Massenspektrometrie (MS) m/e berechnet für C₃₂H₄₄O_SN (M+1⁺): 570,353, gefunden 570,4.
Schema 2
Chlorameisensäureester 19:
Einer gerührten Lösung aus 3 g (5,03 mmol) 1,2-Di-O-octadecyl-sn-glycerol 18 in 60 ml Toluen wurden 20 ml einer 1,93M-Lösung von Phosgen zugefügt. Eine zusätzliche Phosgenlösung (2 × 10 ml; 15,4 equiv. Phosgen insgesamt) wurde zugefügt, bis kein weiteres alkoholisches Ausgangsmaterial zurückblieb (durch ¹H-NMR-Analyse der konzentrierten Aliquots). Das Überschuss-Phosgen und -HCl wurde durch einen Sauger entfernt, und das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um 3,3 g (98 %) des gewünschten Chlorameisensäureesters 19 als weißes Pulver zu erbringen. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 4,45 (dd, J = 11,22, 3,69 Hz, 1H), 4,34 (dd, J = 11,22, 6,15 Hz, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,56-3,40 (m, 6H), 1,53 (m, 4H), 1,24 (m, 62H), 0,87 (t, J = 6,36 Hz, 6H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) d 75,90, 71,91, 71,35, 70,93, 69,36, 31,99, 29,96-29,44 (überlappende Signale von den Kohlenwasserstoffketten), 26,13, 26,04, 22,76, 14,18.
Konjugat 20:
Einer gerührten Lösung aus 2,25 g (3,95 mmol) von 10 in 60 ml Pyridin wurden 2,6 g des Distearylglycerol-Chlorameisensäureesters 18 zugefügt. Die ¹H-NMR-Analyse eines konzentrierten Aliquots nach 2 Std. ließ keinen verbleibenden Chlorameisensäureester mehr erkennen, und das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert. Der Rohrückstand wurde mit Material kombiniert, das auf ähnliche Weise aus 0,5 g (0,88 mmol) von 10 und 0,58 g des Chlorameisensäureesters hergestellt wurde, und die kombinierten Partien wurden mit Flash-Silicagel-Chromatographie auf einer Säule aus 100 ml Silicagel (gepackt in Hexane, die 2 Triethylamin enthalten) gereinigt, mit 200 ml Hexanen eluiert, dann 250 ml jeweils 10 bis 20 und 30 % EtOAc in Hexanen, 500 ml 40 % EtOAc in Hexanen, dann 250 ml jeweils 50 – 60 – 70 und 80 EtOAc in Hexanen, und schließlich mit 250 ml EtOAc. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden konzentriert, um 3,3 g (57 %) des Konjugats 20 zu erbringen.
Phosphoramidit 21:
Einer gerührten Lösung von 3,8 g (3,26 mmol) des Konjugats in 25 ml CH₂Cl₂ wurden 1,14 ml (6,52 mmol) Diisopropylethylamin zugefügt, dann 1,09 ml (4,88 mmol) 2-Cyanoethyl N,N-Diisopropylchlorphosphoramidit. Nach 2 Stunden wurde das Gemisch mit CH₂Cl₂ verdünnt und mit gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen, über Na₁SO₄ getrocknet und konzentriert. Der Rohrückstand wurde mit Flash-Silicagel-Chromatographie auf einer Säule mit 125 ml Silicagel (gepackt in Hexanen, die 2 % Triethylamin enthalten) gereinigt, mit 100 ml Hexanen eluiert, dann 250 ml jeweils 10 und 20 % EtOAc in Hexanen, 500 ml 30 % EtOAc in Hexanen, dann 250 ml von 50 % EtOAc in Hexanen. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden konzentriert, um 4,2 g (95 %) des Phosphoramidits 21 zu erbringen. ³¹P NMR (CDCl₃) d 151,52, 151,08.
Der VEGF Nukleinsäureligand – -1,2-Di-O-octadecyl-sn-glycerol-Konjugat
Die 1,2-Di-O-octadecyl-sn-glycerolgruppe wurde in den VEGF Nukleinsäureliganden NX213 (vergleiche 1A) unter Verwendung von Phosphoramidit 21 (Schema 2) konjugiert. Das resultierende Konjugat wurde NX278 genannt (SEQ-ID-Nr.: 2) (vergleiche 1B). NX278 wurde mit Umkehrphasen-HPLC gereinigt, und seine Zusammensetzung wurde mit Elektrospray-Massenspektroskopie (m/z beobachtet = 11703 ± 4, m/z berechnet = 11720) bestätigt. Die Phosphorothioat-Intemukleosid-Verlinkungen wurden an 8 Positionen in NX278 verwendet (an den 3'- und 5'-Enden), und die Differenz der 0,16-Masseeinheiten zwischen den erwarteten und den beobachteten Massen ist möglicherweise auf die unvollständige Oxidation durch den schwefelnden Wirkstoff zurückzuführen, der durchschnittlich zu einer Phosphorothioatverlinkung je Molekül weniger führt als erwartet.
BEISPIEL 2. Wirksamkeit in vitro und in vivo des Nukleinsäureligand-Liposomkomplexes
Der mit Dialkylglycerol (DAG) modifizierte VEGF-Nukleinsäureligand (NX278), eingebettet in die Liposom-Doppelschicht
Der NX278-Liposomkomplex wurde hergestellt, indem NX-278 (1 mg) (1B; SEQ-ID-Nr.: 2) mit einem sprühgetrockneten Gemisch aus DSPC:Cholesterin (50 mg/ml; 2:1, Mol:Mol) in 25 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4) inkubiert wurde, der 9 % Saccharose enthielt, und 15 bis 30 Min. bei etwa 60 °C unter Verwendung eines Probe-Sonicators beschallt wurde, bis eine opalisierende Lösung erhalten wurde. Der Kontroll-Nukleinsäureligand-Liposomkomplex, der einen durchmischten Sequenzanalog von Ligand NX-278 (scNX278) enthielt (1C; SEQ-ID-Nr.: 3) wurde auf die gleiche Weise hergestellt. Bei einer typischen Herstellung wurden Liposome mit einem mittleren Durchmesser von 50 nm und einer Verteilungsbreite in halber Höhe von 20 nm erhalten. Die Größe der Liposomteilchen wurde in einem Teilchengrößenanalysator (Leeds & Northrup Model Microtrack UPA 150, Horsham, PA) bestimmt. Es wurden Liposome mit vergleichbarer Größenverteilung mit der gleichen Lipidzusammensetzung, aber ohne den lipid-konjugierten Nukleinsäureliganden erhalten. Es wird erwartet, dass ein 50nm-Liposom durchschnittlich 40 Nukleinsäureliganden enthält, die auf beiden Seiten der Doppelschicht ausgebreitet sind. Die Berechnung wurde wie folgt durchgeführt. Bei einem angenommenen Oberflächenbereich von 19 Å² für Cholesterin und 60 Å² für Distearylphoshatidylcholin im Liposom wurde eine Anzahl an Lipidmolekülen je Liposom von 3,13 × 10⁴ erhalten, für ein kugelförmiges Liposom mit 50 nm Außendurchmesser und einer Membrandicke von 20 Å². Aus der Zusammensetzung des Liposoms (2:1 Mol:Mol Distearyphosphatidylcholin (MW = 790,2):Cholesterin (MW = 386,7)), unter der Annahme einer homogenen Verteilung der Lipide, wurde eine Molekülmasse von 2,1 × 10⁷ für das Liposom berechnet.
Um die Trennung der Nukleinsäureliganden zwischen den inneren und äußeren Oberflächen der Liposome zu bestimmen, wurde die Zugänglichkeit von NX278 in der liposomalen Formulierung für T₁-Ribonuklease untersucht. Mit zwei Riboguanosinen in der Sequenz (Green et al. (1995) Chemistry and Biology 2:683–695) wird NX278 wirksam durch Ribonuklease T₁ gespalten. Die einfache Inkubation von NX278 mit vorgebildeten Liposomen schützt den Nukleinsäureliganden nicht vor der Ribonuklease T₁. Wenn NX278 jedoch durch Beschallung in Liposome einbaut ist (NX278-Liposom), ist ungefähr 1/3 vor der Nuklease geschützt. Die Zugabe von 0,1 Triton X-100 zum NX278-Liposom, das das Liposom sprengt, ohne die Aktivität der Nuklease zu beeinflussen, exponiert den zuvor geschützten Nukleinsäureligand der Verdauung. Diese Ergebnisse stimmen mit der Ansicht überein, dass der Nukleinsäureligand auf beiden Seiten der Doppelschicht verteilt ist.
Bindungsaffinitäten von NX213, NX278 und des NX278-Liposoms für VEGF
Die Bindungsaffinitäten von NX213, NX278 und des NX278-Liposoms für VEGF wurden unter Verwendung von Elektromobilitäts-Vergleichsmethoden (Competition Electrophoretic Mobility Shift Methods) (2) untersucht. Die Bindungsaffinität von NX278 für VEGF war mit der von NX213 vergleichbar. Die offensichtliche Bindungsaffinität des NX278-Liposoms war im Vergleich zu NX278 3-fach niedriger. Ein Teil der beobachteten Affinitätsreduktion ist potenziell auf die Beschränkung einer Fraktion des Nukleinsäureliganden auf das Innere des Liposoms zurückzuführen. Wie erwartet binden die durchmischten Sequenzanaloge an VEGF im Wesentlichen mit geringeren Affinitäten (2).
Plasma-Pharmakokinetik-Eigenschaften von NX213, NX278 und des NX278-Liposoms
Die Konzentrationen von NX213, NX278 und des NX278-Liposoms im Plasma von Sprague-Dawley-Ratten als Funktion der Zeit werden in 15 gezeigt, und die Parameter aus der Kompartimentsanalyse werden in Tabelle 1 zusammengefasst. Der größte Teil von NX213 wird in der Alpha-Phase mit einer t_1/2 von 7 Minuten und einer Gesamtclearancerate von 6,8 ml/kg/Min schnell gecleart. Die Konjugation einer Phospholipidgruppe zu dem Nukleinsäureliganden führt zu einer stark biphasischen Clearance aus dem Blut mit erhöhter β(t_1/2) und etwas langsamerer Gesamtclearancerate (4,95 ml/kg/Min.) im Vergleich zu NX213. Der Einbau von NX278 in ein Liposom zeigt einen substanziellen zusätzlichen Rückgang der Clearance des Nukleinsäureliganden aus dem Plasma (1,88 ml/kg/Min.).
Die Wirkung von NX278 auf die HUVEC-Proliferation und die Angiogenese
Die Wirkungen des NX278-Liposoms, scNX278-Liposoms und NX213 auf die Proliferation humaner Endothelzellen aus Nabelschnurvenen (HUVEC) wurde untersucht. Die HUVECs wurden in Gegenwart von VEGF (10 ng/ml) in IMDM:Ham's F12 (1:1) Medium gewachsen, das 10 % fötales Kälberserum (FCS) und Heparin (45 μg/ml) enthielt. Die Zellen wurden in gelatinebeschichteten Platten mit 24 Vertiefungen mit einer Dichte von 20.000 Zellen je Vertiefung am Tag Null plattiert und mit den oben genannten Liganden bei Konzentrationen zwischen 0,1 nM und 1 μM am 1., 2. und 3. Tag behandelt (wobei die Medien zusammen mit den Liganden ersetzt wurden). Das NX278-Liposom hemmte die Proliferation der HUVECs mit einer IC50 von 300 nM (die Konzentration bezieht sich auf die Nukleinsäureligandenkomponente); das scNX278-Liposom und NX213 waren signifikant weniger wirksam (IC50 > 1μM).
VEGF induziert Angiogenese in Hühnchen-Allantoin-Membran-Experimenten (Chicken allantoic membrane (CAM)), und dieses Experiment kann benutzt werden, um Verbindungen zu untersuchen, die Angiogenese hemmen. Das Experiment wird durchgeführt, indem in VEGF- getränkte Filterscheiben auf der CAM angeordnet werden und die Entwicklung neuer Blutgefäße quantifiziert werden kann. Das NX278-Liposom blockierte wirksam VEGF induzierte Angiogenese (Daten nicht gezeigt), während NX213, NX278 und scNX278-Liposom keine Wirkung hatten. Zusammen beweisen diese Untersuchungen, dass NX278 ein spezifischer Inhibitor VEGF-induzierter Endothelzellen-Proliferation in vitro und neuer Gefäßbildung in vivo ist.
Wirkung von NX278 auf VEGF-induzierte Kapillarpermeabilität
VEGF ist der einzige bekannte angiogenische Faktor, der kurzzeitig die Kapillarpermeabilität verstärkt. Die Fähigkeit des NX278-Liposoms, die vaskuläre Permeabilitätsaktivität von VEGF in vivo zu hemmen, wurde untersucht. Das Experiment der vaskulären Permeabilität (auch als Miles-Experiment bekannt (Miles, A. A. and Miles, E. M. (1952) J. Physiol. (London) 118:228) wurde an Meerschweinchen im Wesentlichen wie beschrieben ausgeführt (Senger, R. S. et al., (1983) Science 219:983). NX278-Liposom, NX278 und NX213 in einer Konzentration von 1 μM wurden mit VEGF (20 nM) in Meerschweinchen intradermal injiziert, denen Evans-Blaufarbstoff vorinjiziert wurde. Als Antwort auf VEGF verursachte eine Erhöhung an vaskulärer Permeabilität die Extravasation von albumin-gebundenem Evans-Blaufarbstoff, was zu einem blauen Fleck am Injektionsort führt. Da die Wiedergewinnung des Farbstoffs durch organische Lösemittels-Extraktion generell sehr schlecht ist, wurde eine Quantifizierungsmethode entwickelt, die die Absorption von Licht durch die Haut misst. NX213, NX278, NX278-Liposom und neutralisierende monoklonale Antikörper von VEGF hemmen alle signifikant VEGF-induzierte Permeabilität, wie in 3 gezeigt. Unter den Nukleinsäureliganden schien NX278-Liposom der potenteste Antagonist zu sein. Durchmischte Sequenzanaloge dieser Verbindungen waren nicht hemmend. Die Unterschiede waren dramatisch und mit bloßem Auge wahrnehmbar.
NX278-L hemmt Karposi-Sarkom-Zelllinine in vitro
VEGF-Inhibitoren sind bei einer Vielzahl von Krankheiten potentiell nützlich, einschließlich bösartiger Tumore, bei denen die Progression der Tumore und Metastasen von der Bildung neuer Gefäße abhängig ist. Während von den meisten Tumorarten bekannt ist, dass sie VEGF produzieren, hatte zuvor noch keiner gezeigt, dass er funktionelle VEGF-Rezeptoren exprimiert. Es wurde unlängst gezeigt, dass Kaposi-Sarkomzellen (KS) nicht nur ergiebige Mengen von VEGF produzieren, sondern auch funktionelle VEGF-Rezeptoren exprimieren und daher VEGF zum autokrinen Wachstum verwenden. KS-Zelllinien stellen somit eine einmalige Chance bereit, die Fähigkeit von NX278, die autokrine VEGF-Wachstumsaktivität zu unterbrechen, zu untersuchen.
Die Wirkungen des NX278-Liposoms, des scNX278-Liposoms und von NX213 auf die Proliferation von KS-Zellen wurden untersucht. Die KS-Zelllinie KSY-1 wurde in gelatinebeschichteten Platten mit 24 Vertiefungen mit einer Dichte von 7.500 bis 10.000 Zellen je Vertiefung am 0. Tag in Medium plattiert, das RPMI 1640 enthielt, angereichert mit 2 % FCS, L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin. Die Nukleinsäureliganden wurden in Konzentrationen zwischen 0,1 nM und 1 μM in frischem Medium am 1., 2. und 3. Tag zugefügt, und die Zellzählung wurde am 4. Tag ausgeführt. NX278-Liposom hemmten die Proliferation von KS-Zellen mit einer IC50 von 100 nM; bei 1 μM NX278-Liposom, das Wachstum dieser Zellen wurde vollständig gehemmt. scNX278-Liposom und NX213 wiesen IC50-Werte von >1 μM (4) auf.
NX278-Liposom hemmt KS-Zellenwachstum in vivo.
Da VEGF ein Wachstumsfaktor für KS-Zellen ist, ist es wahrscheinlich, dass die Wirkung der VEGF-Anatagonisten auf KS-Tumore in vivo zweifach ist: Inhibition der parakrinen Wachstumswirkung von VEGF auf Endothelzellen, die mit Tumor assoziiert sind, und Inhibition der autokrinen Wachstumswirkung auf Tumorzellen. KS-Tumore können somit besonders empfindlich gegenüber VEGF-Antagonisten sein. Um die Aktivität der Nukleinsäureliganden in vivo zu testen, wurden Tumortrokare (3 mm³) in athymische Mäuse am 0. Tag implantiert und an fünf aufeinander folgenden Tagen behandelt, beginnend am 2. Tag mit 50, 100 oder 150 μg/Tag/Maus. Die Tumorwachstumsraten wurden über einen Zeitraum von zwei Wochen gemessen. NX278-Liposom hemmt das Tumorwachstum in einer dosisabhängigen Weise mit sehr geringer Inhibition des Tumorwachstums beim niedrigsten Dosierungslevel der 50-μg/Tag/Maus-Dosis (5A), und markiert die Inhibition des Tumorwachstums sowohl bei 100- und 150-μg/Tag/Maus-Dosisleveln (5B, 150 μg/Tag/Maus gezeigt). Leere Liposome (5A, B), scNX278-Liposom sowie NX213 und NX278 waren in allen untersuchten Dosen unwirksam. Zusätzlich blockiert das NX278-Liposom den VEGF-induzierten Flüssigkeitsverlust aus Blutgefäßen.
Beispiel 3. Experimentelle Verfahren für 2'-Fluoro-pyrimidin-modifizierte RNA-Liganden zu VEGF
Dieses Beispiel stellt allgemeine Verfahren bereit, die in Beispiel 4 zur Bewertung des 2'-Fluoro-modifizierten Nukleinsäureliganden zu VEGF verfolgt und eingebaut wurden.
Materialien
Rekombinantes menschlichens VEGF₁₆₅, gereinigt aus der Insektenzelllinie Sf21 wurde von R&D Systems als trägerfreies lyophilisiertes Pulver erworben. Das Protein wurde in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung in einer Konzentration von 10 μM resuspendiert und bei –20 °C in kleinen Aliquots bis zur Verwendung gelagert. Die Aliquots wurden bei 4 °C bis zu 4 Wochen nach dem Auftauen gelagert. Sf21-exprimiertes Maus-VEGF₁₆₄ und E.-coli-exprimiertes menschliches VEGF₁₂₁, VEGF/PlGF-Heterodimer und PlGF wurden auch von R&D Systems als trägerfreie, lyophilisierte Präparate erworben.
Oligonukleotide wurden von Operon Technologies, Inc. erworben oder wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 394 Oligonukleotid-Synthesizers gemäß optimierten Protokollen synthetisiert. 2'-F- und 2'-OMe-Ribonukleotidphosphoramidite wurden von JBL Scientific, Inc. (San Luis Obispo, Calif.) hergestellt. 2'-F-Pyrimidin-NTPs wurden auch von JBL erworben. 2'-OH-Purin-NTPs und -dNTPs wurden von Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey erworben.
Thermostabile DNA-Polymerase T. aquaticus (Taq-Polymerase) wurde von Perkin Elmer-Cetus, (Foster City, Calif.) erworben; AMV-Umkehrtranskriptase (AMV RT) kam von Life Sciences, Inc.; Klenow-DNA-Polymerase kam von New England Biolabs, Beverly, Mass. T7 RNA-Polymerase kam von Enzyco, Inc. (Denver, Colo.). Sequenaee-DNA-Polymerase wird von United States Biochemical Corp. (Cleveland, Ohio) hergestellt.
α-[³²P]-ATP und γ-[³²P]-ATP wurde von New England Nuclear (Boston, Mass.) erhalten.
Das SELEX-Protokoll
Das SELEX-Verfahren wurde in den SELEX-Patent-Anmeldungen detailliert beschrieben. Chemisch synthetisierte DNA-Oligonukleotidbibliotheken („30N7" und „40N7") wurden mit randomisierten Regionen von 30 oder 40 Nukleotiden, flankiert durch übliche fixierte 5'- und 3'-Sequenzen (5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG (30 oder 40 N) CAGACGRCTCGCCCGA-3' hergestellt; SEQ-ID-Nr.: 133 und 134). Kursiv gedruckte Nukleotide am 5'-Ende jedes Templates entsprechen der T7-RNA- Polymerase-Promotersequenz. Oligonukleotidprimere wurden auch zur Verwendung in der Template-Herstellung und der Amplifikation und Umkehrtranskription synthetisiert: 5'-TCGGGCGAGTCGTCTG-3' („3N7"; SEQ-ID-Nr.: 135) und 5'-TAATACGACTCACTRTAGGGAGGACGATGCGG-3' („5N7" SEQ-ID-Nr.: 136). Doppelsträngige DNA-Templates wurden durch Annealing des Primers 3N7 in 30N7- oder 40N7-Bibliotheken und Extension der Primer unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase oder AMV RT hergestellt. Die höhere Inkubationstemperatur, die für AMV RT verwendet wird, (45 °C anstelle von 37 °C) kann die vollständige Extension durch hoch strukturierte Template-Oligonukleotide besser fördern. Die Bibliotheken wurden unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase in Gegenwart von 1 mM von jeweils 2'-OH-ATP und GTP, 3 mM von jeweils 2'-F-CTP und UTP, und 50 μCi α-³²P-ATP transkribiert. Die RNAs wurden aus denaturierenden Polyacrylamidegelen gereinigt, indem die Gelscheibe, die die RNA enthält, exzisiert, zerkleinert und für eine längere Zeit in 2 mM EDTA getränkt wird.
Der SELEX-Prozess der Affinitätsauswahl, gefolgt von ausgewählter Pool-Amplifikation, wurde detailliert beschrieben (vergleiche die SELEX-Patentanmeldungen). Kurz gesagt, eine Runde der Auswahl und Amplifikation wurde wie folgt ausgeführt: VEGF wurde mit einem 5- oder 10-fachen Überschuss an RNA in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 1 mM MgCl₂ (PBSM) (30N7- und 40N7-Bibliotheken) oder in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ (TBSMC) (nur 30N7-Bibliothek) gemischt, und das Gemisch wurde drei Mal hintereinander verdünnt. Nach der Inkubation bei 37 °C für 15 Minuten, wurden die Gemische durch 0,45μ-Typ-HA-Filter (Millipore) passiert, um VEGF-Komplexe mit RNA zu sammeln. Die RNAs wurden aus ausgewählten Filtern durch Inkubation in 2:1 Phenol, pH-Wert 7:7 M Harnstoff eluiert. Nach Präzipitation aus der wässrigen Phase wurden die RNAs zu Primer 3N7 annealed und unter Verwendung von AMV RT umkehrtranskribiert.
Die resultierenden cDNAs wurden mit 15 Zyklen Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der 3N7- und 5N7-Primer und Taq-DNA-Polymerase amplifiziert. Die Transkription des PCR-Produkts lieferte eine neue Bibliothek, die für Sequenzen mit Affinität für VEGF angereichert war. Bei Runde 4 tauchte ein substanzielles filterbindendes Hintergrundsignal in Abwesenheit von VEGF in allen drei ausgewählten RNA-Pools auf. Um die filterbildenden RNAs aus den Pools zu erschöpfen, wurden die Runden 5 und 6 mit einem alternativen Schema zur Trennung VEGF-gebundener RNAs von ungebundenen Molekülen ausgeführt: Nach der Inkubation des RNA-Pools mit dem Wachstumsfaktor wurde jedes Gemisch auf ein 3%iges nicht denaturierendes Polyacrylamidgel angewendet und bei 10 W 45 bis 60 Minuten lang bei 4 °C der Elektrophorese unterzogen. Die VEGF/RNA-Komplexe migrierten über die ungebundene RNA in dieses System und wurden sichtbar gemacht, indem Röntgenfilm dem Gel ausgesetzt wurde. Für diese Runden wurden ausgewählte RNAs durch die „Crush-and-Soak-Methode", wie oben beschrieben, gereinigt. Nach zwölf Runden von Auswahl und Amplifikation wurden individuelle Moleküle in den ausgewählten Pools unter Verwendung des pCR-Script-Direct-Cloning-Kits von Stratagene (La Jolla, Calif.) kloniert. Die Plasmide wurden unter Verwendung der alkalischen Lyse-Methode (PERFECTprep Plasmid-DNA-Kit, 5 Prime→3 Prime, Boulder, Colo.) gereinigt, und Sequenzen der klonierten Regionen wurden unter Verwendung des Dye-Terminator-Cycle-Sequencing-Kits, erhältlich von Perkin Elmer (Foster City, Calif.), erhalten. Die fluoreszierenden Sequenzierungsleitern wurden im National Jewish Center, im Labor von Brian Kotzin, Denver, Colo. gelesen. Die Sequenzen wurden in Familien gruppiert und nach Augenmaß ausgerichtet.
Messung der Bindungsaffinitäten
Während der Transkription durch den Einbau von α-[³²P]-markierten NTPs oder nach der Synthese unter Verwendung von γ-[³²P]-ATP und T4-Polynukleotid-Kinase radioaktiv markierte Nukleinsäureliganden wurden in einer niedrigen Konzentration (zwischen 20 und 70 pM) mit variierenden Konzentrationen von VEGF oder anderen Wachstumsfaktoren bei 37 °C 15 Minuten lang inkubiert. Die Inkubationen erfolgten in TBS-, PBS- oder HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (HBS), pH-Wert 7,4, mit oder ohne Zugabe zusätzlicher bivalenter Kationen. Die Proben wurden durch vorgewaschene 0,45μ-Typ-HA-Filter (Millipore) passiert, gefolgt von einer Wäsche in 5 bis 10 ml Bindungspuffer. Die Filter wurden in Szintillator eingetaucht und gezählt, um die Menge an Protein-gebundener RNA zu quantifizieren, die in jedem Filter zurückblieb. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K_D) des Nukleinsäureliganden, der an ein spezifisches Protein bindet, wurde aus den Datenpunkten berechnet, wie bei Green et al. (1996) Biochem. 35: 14413–14424 beschrieben.
Affinitätsauswahl der Nukleinsäure-Ligandenfragmente
Zehn pmol intern radioaktiv markierte Transkripte von hochaffinen VEGF-Nukleinsäure-Liganden wurden teilweise mit S7-Nuklease verdaut, um eine Mischung radioaktiv markierter Fragmente zu generieren. Ein Zehntel der fragmentierten RNA wurde vor der Filtrierung durch Nitrozellulose mit 10 pM VEGF in 45 ml Bindungspuffer inkubiert. Ausgewählte Fragmente, die aus den Filtern wiedergewonnen wurden, wurden auf einem hoch auflösenden denaturierenden Polyacrylamidgel neben einer Spur auslaufen gelassen, die mit dem nicht ausgewählten Fragment-Pool geladen war. Die kleinsten ausgewählten Bänder wurden individuell von Gel gereinigt und weiter an ihren 5'-Enden mit Polynukleotidkinase markiert, um ihre spezifische Aktivität zu erhöhen. Ein Hälfte der Probe wurde zu einer cDNA des Originaltranskripts annealed und zum Ende des Templates unter Verwendung von Sequenase-DNA-Polymerase ausgedehnt. Ein Vergleich der Migration des gereinigten Fragments und dessen Ausdehnungsprodukts mit einer Standard-Sequenzierungsleiter wurde verwendet, um die wahrscheinliche Größe und Position des ausgewählten Fragments in dem Originaltranskripts zu bestimmen. Synthetische Oligonukleotide, die in Sequenz den Affinitäts-ausgewählten Fragmenten entsprechen, wurden hergestellt, um zu verifizieren, dass der trunkierte Nukleinsäureligand seine Affinität für VEGF beibehalten hat.
2'-OMe-Substitution
Die 2'-OMe-Substitutionsversuche wurden im Wesentlichen ausgeführt wie in Green et al. (1995) Chem. Biol. 2:683–695 beschrieben. Drei oder vier Bibliotheken wurden für jeden der drei trunkierten Liganden (t22, t2, t44) hergestellt, worin fünf oder sechs 2'-OH-Purinpositionen teilweise 2'-OMe-substitutiert waren. Jede Purinposition wurde teilweise in nur einer der Bibliotheken 2'-OMe-modifiziert. Jede 5'-radioaktiv markierte Bibliothek wurde mit VEGF inkubiert, und durch das Protein gebundene, substituierte Oligonukleotide wurden auf Nitrozellulosefiltern gesammelt. Der ausgewählte Pool und die nicht ausgewählte Ausgangsbibliothek wurden teilweise alkalisch hydrolysiert und die Produkte wurden auf einem hoch auflösenden Polyacrylamidgel ausgebreitet. Ein „Band-Intensitätsverhältnis" wurde für jede Purinposition bestimmt, indem das Phosphorimagesignal, das durch Hydrolyse an dieser Position in dem ausgewählten Pool erhalten wurde, durch das Signal geteilt wurde, das für die gleiche Position in der nicht ausgewählten Bibliothek erhalten wurde. Die Band-Intensitätsverhältnisse, die gut über den Bereich für eine besondere Position fallen, sind bezeichnend für einen Hang zu 2'-OH (gegen 2'-OMe) in dem nach Affinität ausgewählten Pool.
Bindungsratenkonstanten
Eine kleine Menge (typischerweise weniger als 1 pmol) der 5'-radioaktiv markierten Nukleinsäureliganden wurden mit 1 nM VEGF bei 37 °C in 1 ml gepufferter Kochsalzlösung, angereichert mit bivalenten Kationen, inkubiert. Zum Zeitpunkt „Null" wurden 50 μl durch Nitrozellulose gefiltert, um die Fraktion von RNA zu bestimmen, die an ein Protein gebunden ist, dann wurde ein Überschuss an (100 oder 500 nM in unterschiedlichen Versuchen) des nicht markierten Nukleinsäureliganden zugefügt und 50 μl Aliquots wurden zu nachfolgenden Zeitpunkten gefiltert. Die Filter wurden im Szintillator gezählt, um die Menge an radioaktiv markierter RNA, die noch an VEGF gebunden ist, an jedem Zeitpunkt zu bestimmen. Die Daten, als Fraktion von gebundener RNA (f) im Verhältnis zur Zeit geplottet, wurde an eine Gleichung zum exponentiellen Zerfall angepasst: f(t) = f0e–kt + b,worin f₀ die Fraktion von gebundener RNA zum Zeitpunkt Null ist, k die Dissoziationsratenkonstante (kd) ist und b die Restbindung der radioaktiv markierten RNA an den Filter am Ende des Versuchs ist (tatsächlich in Abwesenheit von Protein). Die Assoziationsratenkonstanten (kas) wurden aus den gemessenen kd- und K_D-Wertern berechnet, gemäß der Gleichung: ka = kd/KD
Beispiel 4. 2'-Fluoro-modifizierte RNA-Liganden zu VEGF
Auswahl von Liganden
Liganden zu VEGF wurden in drei separaten SELEX-Versuchen aus Bibliotheken von 2'-F-Pyrimidin-modifizierten RNAs isoliert, die 30 oder 40 Random-Nukleotide enthalten. Die Auswahl wurde in PBS durchgeführt, angereichert mit 1 mM MgCl₂ (30N- und 40N-Bibliotheken) oder in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 1 mM MgCl₂ und 1 mM CaCl₂ (nur 30N-Bibliothek). Etwa 10¹⁴ einmalige Sequenzen waren im ersten Auswahlzyklus jedes Experiments enthalten. Nach zehn Zyklen, hatte sich die Affinität zwischen VEGF und jedem RNA-Pool um etwa das 1000-fache im Vergleich zu den Ausgangspools verbessert. Nachdem nach zwei zusätzlichen Zyklen keine weitere Verbesserung der Bindungsaffinität beobachtet wurde, wurden die individuellen Mitglieder der Zwölf-Runden-Pools kloniert und die Sequenzen wurden für ungefähr 50 Isolate aus jeder Auswahl bestimmt.
Oligonukleotidliganden zu VEGF₁₆₅ wurden in drei separaten SELEX-Versuchen isoliert. Individuelle Klone wurden isoliert und sequenziert und die Sequenzen in Familien gruppiert, basierend auf geteilten primären strukturellen Motiven (Tabelle 2). Der Name jedes Liganden gibt das Target (V=VEGF), den Auswahlpuffer (P=PBS; T=TBS), die Länge der randomisierten Region in der Bibliothek (30 oder 40 Nukleotide) und die Klonnummer (nach dem Dezimalpunkt) an. Die Frequenz, mit der eine Sequenz unter den analysierten Klonen auftauchte, ist in Klammern angegeben; Sequenzen, die sich nur in einem Nukleotid unterschieden, wurden der PCR-Mutagenese eines üblichen Vorläufers attribuiert und zusammen mit der variablen Base gruppiert, die in der Sequenz durch ein geeignetes Symbol (Y=U oder C) angegeben ist. Die fixierten Sequenzen, die allen Liganden gemein waren, werden in Kleinbuchstaben an der Spitze gezeigt. Für individuelle Klone wird die Sequenz der variablen Region in Großbuchstaben gezeigt. Für einige Liganden sind die Sequenzen der fixierten Region in Kleinbuchstaben an die Sequenz mit der variablen Region angehängt, wo sie zu möglichen sekundären Strukturen beitragen. Die Hochaffinitäts-K_d zur Bindung an VEGF wird für jeden Liganden gezeigt. Ein Ligand in jeder Familie wurde für die weitere Analyse ausgewählt (graue Box).
Aus einer Gesamtzahl von 143 analysierten Klonen wurden 76 Sequenzen erhalten, die sich in mehr als einem Nukleotid unterschieden. 44 dieser Sequenzen konnten in drei Hauptfamilien gruppiert werden, basierend auf den konservierten primären strukturellen Motiven (Tabelle 2). Sequenzen, die in untergeordneten Familien mit fünf oder weniger Mitgliedern gruppiert werden konnten, und „Waisen"-Sequenzen, die im Isolat einmalig waren, werden in Tabelle 6 gezeigt. Liganden, die das primäre strukturelle Motiv enthalten, das durch die Familien 1 und 2 definiert ist, traten in allen drei Affinitätsauswahlen auf. Ähnlichkeiten zwischen den konservierten primären Strukturen beider Familien lassen vermuten, dass sie auch ähnliche sekundäre Strukturen teilen könnten und/oder dass sie unter Verwendung ähnlicher Kontaktregionen Schnittstellen mit VEGF bilden könnten. Mitglieder der Familie 2 teilen die Möglichkeit zur Bildung eines kurzen basengepaarten Stamms, der das konservierte Sequenzmotiv in einer großen „Schleife" (in Tabelle 2 unterstrichen) einschließt. Mit Ausnahme des schließenden A/U-Basenpaars wird die Sequenzidentität der Basen in mutmaßlichen Stammregionen nicht konserviert. Eine solche „Co-Variation" von Basen, die eher sekundäre als primäre Struktur konserviert, unterstützt die Existenz eines putativen Stamms und lässt vermuten, dass diese Struktur für die Hochaffinitätskonformation dieser Familie von VEGF-Liganden wichtig sein könnte. Es wurden keine vergleichbar konservierten Basenpaar-Interaktionen unter den Sequenzen der Familie 1 nachgewiesen. Eine dritte Familie von Liganden trat nur in den Auswahlen auf, die in TBSMC ausgeführt wurden (Familie 3, Tabelle 2). Zusätzlich zu einem stark konservierten primären strukturellen Motiv teilen alle Mitglieder dieser Familie die Sequenzen 3' der konservierten Region Basenpaar-Komplementarität zu Nukleotiden in der fixierten 5'-Region (in Tabelle 2 unterstrichen). Da bei den meisten der Liganden von den Basen auf der 5'-Seite des putativen Stamms nicht gesagt werden kann, dass sie mit ihren Basenpaar-Partnern covariieren, ist diese Beobachtung für eine gemeinsame sekundäre Struktur weniger voraussagend; dennoch war unsere anfängliche Vermutung einer minimalen Hochaffinitätssequenz, die von dieser Familie (unten beschrieben) abgeleitet ist, durch die starke Konservierung dieses Motivs geleitet. Die Affinitäten der individuellen RNA-Liganden für VEGF wurden, basierend auf einer einzigen Bestimmung von K_D für ihre Interaktion, bewertet. Mit wenigen Ausnahmen zeigten die Liganden sehr hohe Affinität für den Wachstumsfaktor, mit K_Ds zwischen 5 und 50 pM.
Minimale Liganden
Die geteilten primären und sekundären strukturellen Motive, die jede Sequenzfamilie definieren, deuten die minimalen Sequenzelemente an, die für die hohe Affinitätsbindung an VEGF erforderlich sind. Verschachtelte Trunkierungen eines repräsentativen Liganden aus jeder Familie (durch graue Boxen in Tabelle 2 angegeben) wurden durch chemische Synthese produziert, und ihre relativen Affinitäten für VEGF wurden bestimmt (Tabelle 3). Die trunkierten Versionen der Liganden VP30.22, VP30.2 und VT30.44 wurden durch chemische Synthese hergestellt, und ihre Affinitäten für VEGF wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt. Anfängliche Trunkierungen (t22, t2, t44) wurden durch Synthese der Oligonukleotide mit zusätzlichen Basen, denen die 5'- und/oder 3'-Enden fehlten, weiter verfeinert. Um die chemische Synthese zu initiieren, wurde das meiste 3'-Nukleotid mehrerer Liganden modifiziert, entweder durch Substitution von 2'-OH-Cytidin mit 2'-F-Cytidin (unterstrichen) oder durch Zugabe eines 3'-3'-verlinkten Desoxythymidin-"Caps" (Sternchen). Die Länge jedes Oligonukleotids (minus Cap) und dessen hohe Affinität K_D zur Bindung an VEGF werden gezeigt.
Eine anfängliche Prognose für die Minimalsequenz von Klon VP30.22 (Familie 1) erfolgte, indem die Enden eines gereinigten, affinitätsausgewählten Fragments des Volllängen-Liganden gemappt wurde (vergleiche Beispiel 3). Dieses 29-Nukleotidmolekül („t22") zeigte einen etwa dreifachen Verlust an Bindungsaffinität für VEGF im Vergleich zu dem Volllängen-Liganden. Die weitere Trunkierung am 3'-Ende dieses Moleküls verursachte einen sehr starken Verlust an Affinität, aber es konnten bis zu 6 zusätzliche Nukleotide von dem 5'-Ende mit wenig oder keinen Konsequenzen entfernt werden (Tabelle 3). Für Klon VP30.2 aus Familie 2 und Klon VT30.44 aus Familie 3 wurden die trunkierten Liganden „t2" und „t44" synthetisiert, was den putativen Fünf-Basenpaar-Stamm und alle konservierten Sequenzmotive umschloss. Beide trunkierten Liganden behielten beinahe die gesamte Bindungsaktivität des Volllängen-Moleküls. Ferner verursachte die Trunkierung durch die Deletion jeweils eines putativen Basenpaars auf einmal (ein Nukleotid von jedem Ende des Liganden) einen Verlust an Affinität. Somit sagten für diese Sequenzen Trunkierungen, die auf möglichen sekundären Strukturen basierten, sehr gut den minimalen Hochaffinitätsliganden voraus und unterstützten ferner die Hypothese, dass die putativen Stämme zur Hochaffinitätskonformation dieser Liganden beitragen.
2'-OMe-Modifikation
Die Substitution an den 2'-OH-Positionen der RNA-Oligonukleotide durch 2'OMe wurde beobachtet, um ihre Stabilität gegen Nukleasen zu verbessern, die in Rattenurin sowie in anderen biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind. Es ist wahrscheinlich, dass die Stabilisierung der Oligonukleotide zu Nukleasen für ihren Erfolg als therapeutische oder diagnostische Wirkstoffe entscheidend ist. Leider werden 2'-OMe-modifizierte Nukleosidtriphosphate nicht generell als Substrate bei RNA-Polymerasen unter Standardreaktionsbedingungen akzeptiert. 2'-OMe-Purine können jedoch in ein spezifisches Oligonukleotid durch chemische Synthese eingeführt werden. Es wurde beobachtet, dass einige Hochaffinitäts-2'-OH-Purin-RNA-Liganden einen überraschend hohen Prozentsatz an 2'-OMe-Purinsubstitutionen mit geringem Verlust an Affinität für das Targetprotein akzeptieren. Um solche Purinpositionen zu identifizieren, für die 2'-OMe-Substitution mit Hochaffinitätsbindung an VEGF kompatibel ist, wurden mehrere Synthesen der Liganden t2, t22 und t44 hergestellt, in denen fünf oder sechs Purine gleichzeitig mit dem modifizierten Nukleotid teilweise substitutiert wurden (in Beispiel 3 beschrieben). Die Affinitätsauswahl jeder teilweise substituierten Bibliothek wurde verwendet, um jene Moleküle zu isolieren, die substanziell die Affinität für VEGF behielten. In einem solchen affinitätsausgewählten Pool, zeigten Positionen, die die Substitution nicht tolerierten, die Tendenz zu 2'-OH und zeigen somit höhere Empfindlichkeit gegenüber Alkalihydrolyse im Vergleich zur gleichen Position in der nicht ausgewählten Bibliothek. 5'-radioaktiv markierte nicht ausgewählte und affinitätsausgewählte Pools wurden teilweise alkalihydolysiert, und die Produkte wurden auf einem hoch auflösenden Polyacrylamidgel ausgebreitet. In Ligand t22 zeigten G10 und A12 substantielle Neigung zu 2'OH im affinitätsausgewählten Pool, ebenso wie A6 und G21 in Ligand t2, und A5 und A6 in Ligand t44. Während die vorstehende Analyse jene Positionen identifiziert, die wahrscheinlich die Substitution mit den 2'OMe-Nukleotiden nicht ermöglichen, lässt sich aus diesen Daten nicht vorhersagen, wie die simultane Modifikation aller anderen Purine die Bindungsaffinität beeinflussen wird. Tatsächlich ist Ligand t22, synthetisiert mit allen 2'-OMe-Purinen außer G10, A12 und G22 (die eine marginale Präferenz für 2'-OH zeigten), an VEGF mit einer Affinität gebunden, die allen 2'-OH-Purinsequenzen gleich ist, wenn nicht besser (Tabelle 4).
Die trunkierten Oligonukleotide (t22, t2 und t44) wurden mit allen außer einem, zwei oder drei Purinpositionen, die mit 2'-OMe-Purinen substituiert sind, chemisch synthetisiert. Die verbleibenden 2'-OH-Purine werden in jedem Ligandennamen angegeben und werden im Fettdruck in der Ligandensequenz gezeigt. K_DS für die Bindung jedes substituierten Liganden zu VEGF werden gezeigt. Ferner hatte die Substitution bei G22 nur eine geringe Wirkung auf die Bindung an VEGF, aber der Einbau von 2'-OMe bei G10 oder A12, wie vorhergesagt, war für die Bindungsaffinität schädlich. Auf ähnliche Weise tolerierten die Liganden t2 und t44 die 2'-OMe-Substitution an allen bis auf zwei Purinen mit einer drei- bis vierfachen Auswirkung auf die Affinität des Nukleinsäureliganden für VEGF (Tabelle 4).
Die Bindungsaffinitäten und Ratenkonstanten für substituierte Trunkate
In der Hoffung, hoch-2'-substituierte VEGF-Nukleinsäureliganden minimaler Länge zu identifizieren, wurden alle 2'-OMe-Substitutionen, die die Bindung nicht dramatisch herabsetzen, in die trunkierten Liganden t22c, t2a und t44a eingebaut (vergleiche Tabelle 3). Die 2'OH-Nukleotide sind fettgedruckt angegeben, und die 2'OMe-Nukleotide sind normal gedruckt angegeben. Die resultierenden Nukleinsäureliganden t22-OMe und t44-OMe, sind mit K_DS von 67 pM bzw. 49 pM an VEGF gebunden, während Ligand t2OMe mit einer K_D von etwa 140 pM gebunden ist (Tabelle 5). Diese K_DS sind günstig im Vergleich zu denen von NX-213 (K_D = 140 pM), einem zuvor beschriebenen 2'-NH₂-Pyrimidin-, 2'-OMe-Purin-substituierten Oligonukleotidinhibitor von VEGF (vergleiche US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/447,169, die hier als Bezugsdokument angefügt ist). Es wurde herausgefunden, dass jeder der trunkierten 2'-OMe-substituierten Oligonukleotide mit NX-213 und miteinander um die Bindung an VEGF konkurriert.
Die Dissoziationsratenkonstanten (k_d) wurden für jeden der drei 2'-OMe-substitutierten Liganden bestimmt durch den folgenden Verlust eines vorgebildeten Komplexes zwischen dem radioaktiv markierten Liganden und VEGF bei der Zugabe eines großen Überschusses an unmarkierten Liganden. Ligand t22-OMe zeigte die schnellste Dissoziationsrate mit einer Halbwertszeit von etwa 60 Sekunden. Die Liganden t2-OMe und t44-OMe zeigten geringfügig langsamere Dissoziationsraten mit Halbwertszeiten in der Größenordnung von 170 bzw. 90 Sekunden. Die Assoziationsratenkonstanten (k_a), berechnet aus der Gleichgewichtsdissoziationskonstante und der Dissoziationsratenkonstante (K_D = k_d/k_a), reichten von 3 × 10⁷ bis 2 × 10⁸ M^–1 Sek.^–1 (Tabelle 5). Solche schnellen Assoziationsraten lassen eine nahe diffusionsbeschränkte Bindungsinteraktion zwischen diesen Liganden und VEGF vermuten und sind in Übereinstimmung mit den Assoziationsratenkonstanten, die für SELEX-abgeleitete Nukleinsäureliganden zu anderen Targets beobachtet wurden.
Bivalente Kationenabhängigkeit
Die Liganden in den Familien 1 und 2 wurden in Gegenwart von Magnesiumkationen ausgewählt, während Familie-3-Liganden in einem Puffer ausgewählt wurden, der sowohl Magnesium als auch Calcium enthielt. Da bivalente Kationen zu RNA/Protein-Interaktionen durch nicht spezifische oder spezifische Stabilisierung von Hochaffinitäts-RNA-Strukturen beitragen, fragten wir, ob Magnesium und/oder Calcium für die Hochaffinitätsbindung repräsentativer Liganden zu VEGF erforderlich ist. Die Affinitäten der Nukleinsäureliganden t22-OMe und t2-OMe (aus den Familien 1 bzw. 2) blieben unverändert in Gegenwart oder Abwesenheit von zusätzlichen bivalenten Kationen oder des Chelatbildners EDTA (Daten nicht gezeigt). Jedoch zeigten Familie-3-Liganden, wie von Ligand t44-OMe darstellt, eine absolute Abhängigkeit von der Gegenwart von Calcium für die Hochaffinitätsbindung an VEGF. Die Bindung wurde dramatisch reduziert (K_D > 10^–7), wenn bivalente Kationen im Bindungspuffer durch EDTA ersetzt wurden. Die Zugabe von Überschuss-MgCl₂ zu einem an bivalenten Kationen erschöpften Bindungspuffer ergab keine Verbesserung der Bindungsaffinität, aber CaCl₂, in zweifachem molarem Überschuss über EDTA, hat die Bindungsaktivität vollständig wieder hergestellt. Ein identisches Bindungsverhalten wurde für den unmodifizierten Liganden t44 beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Proteinspezifität
Die hier beschriebenen Oligonukleotide wurden auf der Basis ihren Affinitäten für VEGF₁₆₅, des größeren von zwei diffundierbaren Isoformen des Wachstumsfaktors, ausgewählt. VEGF₁₂₁, der kleineren Isoform, fehlt einer der Exone in VEGF₁₆₅ und bindet, anders als letzterer, nicht an Heparin. Keines der drei trunkierten, 2'-OMe-substituierten Oligonukleotide band mit irgendeiner messbaren Affinität an VEGF₁₂₁. Außerdem ist die native Struktur von VEGF₁₆₅ für die Bindung aller drei Nukleinsäureliganden wesentlich, da keine Bindung beobachtet wird, wenn das Protein vor der Inkubation mit den Oligonukleotiden mit DTT reduziert wird.
VEGF ist ein über Spezies stark konserviertes Protein; die menschlichen VEGF₁₆₅- und die Maus-VEGF₁₆₄-Isoformen zeigen 88 Sequenzidentität. Die trunkierten, 2'-OMe-substituierten Liganden banden gleich gut an menschliche und murine VEGF. Es wurde jedoch keinerlei Bindung der Liganden an Homodimere von PIGF beobachtet, einem Plazenta-abgeleiteten Protein, das 53 % Sequenzidentität mit VEGF über die konservierte, dem von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor ähnliche Domäne teilt. Die Heterodimere zwischen VEGF und PIGF wurden unlängst aus den Überständen sowohl normaler als auch tumorabgeleiteter Zelllinien isoliert, und solche Heterodimere zeigten Aktivität bei der Bindung an eine oder zwei Hochaffinitäts-VEGF-Rezeptoren und bei der Induzierung von Antworten in kultivierten Endothelzellen. Die biologische Relevanz von VEGF-/PIGF-Heterodimeren ist unbekannt. Substanzielle Bindung, wenn auch mit überaus reduzierten Affinitäten, wurde mit VEGF/PIGF-Heterodimeren beobachtet. Diese Daten können darauf hinweisen, dass die Nukleinsäureliganden an oder nahe der Schnittstelle zwischen den zwei Untereinheiten in einem Dimer binden und dass PIGF nicht alle Kontaktstellen aufweist, die für die Hochaffinitätsbindung notwendig sind. Alternativ kann die Struktur der VEGF-Untereinheit durch die Partizipation in einem Heterodimer mit PIGF durch die konsequente Distortion der Bindungsoberfläche des Nukleinsäureliganden verändert werden.
Beispiel 5. Synthese von Phospholipid-, Glycerolamidlipid- und PEG-modifizierten VEGF-Nukleinsäureliganden
Drei unterschiedliche Formulierungen wurden für die Synthese der verschiedenen Komplexe aus lipophiler Verbindung/Nukleinsäureligand wie folgt verwendet:
I. C-18-Phosphoramidit für die Synthese der PL-Formulierung
Eine Skizze für die Herstellung von C-18-Phosphoramidit wird in Schema 3 gezeigt. 1-Octadecanol wurde unter Standardbedingungen phosphoryliert. Nach der Aufarbeitung des Reaktionsgemischs wurde der Rückstand auf einer Silicagelsäule mit Hexan:Ethylacetat:Triethylamin (90:10:5) gereinigt, um 21,5 g des reinen Produkts zu bieten (57 % Ausbeute).
Schema 3
II. Synthese von Lipidamid 1
Dieses Phosphoramidit weist, anders als die obigen PLs, Amidverlinkungen auf. Die Struktur des Oligos, das aus der Konjugation dieses Lipids resultiert, wird unten gezeigt.
Mehrere Versuche bewiesen, dass die hohe Unlöslichkeit von Verbindung 22 in organischen Lösemitteln die NMR- und MS- Charakterisierung und weitere Phosphitylierung der Verbindung 22 zu DAG-Amidit 23 unmöglich machte, jedoch haben wir aus den Ergebnissen für die Herstellung von Lipid-Spacer-Amidit (Schema 3) erwartet, dass die Phosphylation der Verbindung 22 mit Chloro-(2-cyanoethoxy)-N,N-diisopropylaminophosphin gehen könnte, wenn das Gemisch refluxiert würde.
Der Ansatz zur Herstellung des DAG-Amidits wird in Schema 4 gezeigt.
Schema 4
N,N'-Bis(stearoyl)-1,3-diamino-2-propanol (22).
Eine Lösung aus Stearoylchlorid (6,789 g, 22,41 mmol) in ClCH₂CH₂Cl (50 ml) wurde tropfenweise einer Lösung aus 1,3-Diamino-2-hydroxypropan (1,0 g, 11,10 mmol) in ClCH₂CH₂Cl (100,0 ml) und TEA (2,896 g, 22,41 mmol) unter Rühren bei Raumtemperatur zugefügt. Nach Abschluss der Zugabe wurde das Gemisch über Nacht auf 70 °C erwärmt, und es bildete sich ein klare Lösung, und die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und gefiltert, und die Feststoffe wurden mit CH₂Cl₂, CH₃OH, 5 % NaHCO₃ und Ethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 22 (6,40 g, 93 % Ausbeute) als weiße Feststoffe zu ergeben. ¹H NMR (Pyridin-d₅; 60 °C, δ, ppm): 3,82-3,78 (m, 1H), 2,37 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1,81-1,76 (m, 4H), 1,30-1,27 (m, 60H), 0,87 (t, J = 5,7 Hz, 6H).
N,N'-Bis(stearoyl)-O-(diisopropylamino-2-cyanoethoxyphosphinyl)-1,3-diamino-2-propanol (23).
Der Verbindung 22 (5,80 g, 9,31 mmol), im Vakuum über Nacht getrocknet, wurde wasserfreies CH₂Cl₂ (150,0 ml) zugefügt und N,N-Diisopropylethylamin (4,2 ml, 18,62 mmol) wurde injiziert. Das Gemisch wurde in einem Eiswasserbad gekühlt und Chloro-(2-cyanoethoxy)-N,N-diisopropylaminophosphin (8,6 ml, 0,47 mmol) wurde injiziert. Nach 30 Min. langem Rühren wurde das Gemisch 90 Min. lang auf 60 °C erwärmt. Nach der Abkühlung auf Raumtemperatur wurden die unlöslichen Materialien gefiltert, und die Lösung wurde mit 5 % NaHCO₃ und Salzlake gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Präzipitation aus CH₃CN gereinigt, um das reine Produkt (4,65 g, 61 % Ausbeute) als weißen Feststoffe zu erbringen. ³¹P NMR (CDCl₃, ppm): 154,04.
I. Synthese von DAG-Spacer-Amidit, Lipidamid 2
Hexa(ethylenglykol) wurde in das Lipidamidit eingebaut, um die Unlöslichkeit der Diamidverbindung 22 zu mildern, die eine Zwischenstufe zu Lipidamidit 23 ist. Eine Skizze der Herstellung von Lipid-Spaceramidit 29 wird in Schema 5 gezeigt. Der Kopplungsschritt der Verbindung 25 mit 1,3-Diamino-2-hydroxypropan und Kalium-t-butoxid in THF funktionierte nicht gut, und die Ausbeute betrug nur ungefähr 20 %. Ein Versuch, die Ausbeute zu verbessern, erfolgt, indem 25 und Diamid 22 reagiert wurden, jedoch wurde kein gewünschtes Produkt nachgewiesen.
Schema 5
(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-hexaethylenglykol (24).
Hexa(ethylenglykol) (18,93 g, 67,05 mmol) wurde mit wasserfreiem Pyridin (3 × 50 ml) co-verdampft, in wasserfreiem Pyridin (400 ml) gelöst, und nach dem Abkühlen auf 0 °C wurde tropfenweise DMTrCl (23,85 g, 70,40 mmol) in Pyridin (50 ml) 30 Min. lang unter Rühren unter Ar zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht auf Raumtemperatur gehalten. Das Pyridin wurde unter hohem Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ gelöst, das mit 5 % NaHCO₃ und Salzlake gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und in Vakuum konzentriert wurde. Das Rohprodukt wurde mittels nasser Silicagel-Flash-Säulenchromatographie in einem Gradienten aus Ethylacetat, dann CH₂Cl₂ und Methanol (95/5), das 0,5 % TEA enthielt, gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden kombiniert, verdampft und im Vakuum getrocknet, um 24 (26,1 g, 66,6 % Ausbeute) als hellgelbes Öl zu erhalten. ¹H NMR (DMSO-d₆; δ, ppm): 7,40 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,33-7,24 (m, 7H), 6,89 (d, J = 8,9 Hz, 4H), 4,61 (t, J = 5,1 Hz, 1H), 3,73 (s, 6H), 3,05 (m, 24H); ¹³C NMR (DMSO-d₆; δ, ppm): 158,02, 145,02, 135,78, 129,67, 128,13, 127,71, 126,61, 113,14, 85,29, 72,33, 72,27, 70,06, 69,87, 69,80, 69,75, 69,70, 62,84, 60,25, 60,19, 55,01.
(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-hexaethylenglykoltosylat (25).
Einer eisgekühlten Lösung (0 °C) von 24 in wasserfreiem Pyridin (50 ml) wurde eine Lösung aus Toluensulfonylchlorid in Pyridin (30 ml) zugefügt. Nach 2 Std. bei Raumtemperatur wurde die Lösung zu einem hellgelben Öl verdampft. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ aufgenommen und mit 5 % NaHCO₃ und Salzlake gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, gefiltert und im Vakuum verdampft. Das Produkt wurde mittels nasser Silicagel-Flashchromatographie gereinigt, mit Ethylacetat eluiert, um das Produkt (4,08 g, 93 % Ausbeute) als hellgelbes Öl zu ergeben. ¹H NMR (DMSO-d₆; δ, ppm): 7,78 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,46 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,40 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,32-7,23 (m, 7H), 6,88 (d, J = 8,8 Hz, 4H), 4,09 (t, J = 4,3 Hz, 2H), 3,72 (s, 6H), 3,06 (m, 22H), 2,40 (s, 3H); ¹³C NMR (DMSO-d₆; δ, ppm): 158,01, 145,01, 135,78, 132,38, 130,12, 129,67, 128,12, 128,02, 127,80, 127,70, 127,62, 113,13.
2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-hexaethylenglykol-1,3-diaminopropan (26).
Ein Gemisch aus 1,3-Diamino-2-hydroxypropan (747 mg, 8,28 mmol) und Kalium-t-butoxid (2,78 g, 24,84 mmol) in wasserfreiem THF wurde 2 Std. lang auf 70 °C erwärmt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Verbindung 25 (4,08 g, 5,25 mmol) in THF wurde injiziert, und das Gemisch wurde bei 70 °C über Nacht gerührt, bis TLC zeigte, dass kein 25 mehr übrig war. Nachdem die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde das THF im Vakuum entfernt, und 25 ml CH₂Cl₂ und 25 ml Wasser wurden zugefügt. Die CH₂Cl₂-Schicht wurde separiert, und das Wasser wurde später mit CH₂Cl₂ extrahiert . Die CH₂Cl₂-Lösungen wurden kombiniert, über Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck verdampft. Das Rohprodukt (2,43 g) wurde ohne weitere Reinigung direkt für die Reaktion verwendet. ¹H NMR (DMSO-d₆; δ, ppm): 7,41 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,32-7,21 (m, 7H), 6,87 (d, J = 8,8 Hz, 4H), 3,73 (s, 6H), 3,52-3,40 (m, 24H), 3,17 (s, 1H), 3,07-3,02 (m, 4H).
N,N'-Bis(stearoyl)-2-(4,4'-dimethoxytrityloxy)-hexaethylenglykol-1,3-diaminopropan (27).
Eine Lösung aus Stearoylchlorid (3,363 g, 11,1 mmol) in ClCH₂CH₂Cl wurde in eine Lösung aus 2 6 in ClCH₂CH₂Cl und TEA (1,9 ml, 11,1 mmol) unter Rühren bei Raumtemperatur injiziert. Das Gemisch wurde 2 Std. lang auf Raumtemperatur gehalten, dann über Nacht auf 70 °C erwärmt. Nachdem die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde die Lösung mit 5 % NaHCO₃ und Salzlake gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das Rohprodukt wurde mittels nasser Silicagel-Flashsäulenchromatographie in einem Gradienten aus Ethylacetat und CH₂Cl₂ (50/50) und dann Ethylacetat und Methanol (50/50) gereinigt. Die zweite Fraktion wurde gesammelt, verdampft und im Vakuum getrocknet, um 27 (640 mg) als hellgelben Feststoff zu ergeben. ¹H NMR (DMSO-d₆; δ, ppm): 7,40 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,37-7,20 (m, 7H), 6,74 (d, J = 8,9 Hz, 4H), 3,71 (s, 6H), 3,63-3,51 (m, 24H), 3,17 (s, 1H), 3,16-3,13 (m, 4H), 2,12 (t, J = 7,3 Hz, 4H), 1,18 (m, 60H), 0,80 (t, J = 6,2 Hz, 6H).
N,N'-Bis(stearoyl)-2-hexaethylenglykol-1,3-diaminopropan (28).
Ein Gemisch der Verbindung 27 (640 mg), 2,5 % DCA-Lösung in CH₂Cl₂ (5 ml) und Trihexylsilan (2 ml) wurde bei Raumtemperatur gerührt bis die orange Farbe verblasste. Nach der Entfernung von CH₂Cl₂ wurde der Rückstand wiederholt aus Hexan präzipitiert, um einen hellgelben Feststoff zu ergeben (210 mg, 63 % Ausbeute). ¹H NMR (CDCl₃, δ, ppm): 3.3,69-3,59 (m, 24H), 3,17 (s, 1H), 3,06-3,01 (m, 4H), 2,21 (t, J = 7,9 Hz, 4H), 1,18 (m, 60H), 0,81 (t, J = 6,3 Hz, 6H).
N,N'-Bis(stearoyl)-2-(düsopropylamino-2-cyanoethoxyphosphinyl-hexaethylenglykol)-1,3-diaminopropan (29).
Verbindung 28 (210 mg, 0,237 mmol), im Vakuum über Nacht getrocknet, wurde in wasserfreiem CH₂Cl₂ (5,0 ml) gelöst, und N,N-Diisopropylethylamin (218 μl, 1,25 mmol) wurde zugefügt. Die Lösung wurde in einem Eiswasserbad gekühlt, und Chloro-(2-cyanoethoxy)-N,N-diisopropylaminophosphin (106 μl, 0,47 mmol) wurde injiziert. Nach 30 Min. langem Rühren wurde das Reaktionsgemisch mit CH₂Cl₂ verdünnt und mit 5 % NaHCO₃ und Salzlake gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um Verbindung 29 zu erbringen. ³¹P NMR (CDCl₃, ppm): 154,04.
Konjugation von 20K- oder 40K-PEG-NHS-Ester zu VEGF-Nukleinsäureliganden
Allgemeines Verfahren: Das VEGF-Oligonukaeotid wurde mit Triethylammoniumsalz ausgetauscht und lyophilysiert. Das Roh-Oligonukleotid wurde in 100 mM Natriumboratpuffer (pH-Wert 9) auf eine Konzentration von 60 mg/ml gelöst. 2 Eq. von PEG-NHS-Ester (Shearwater Polymers, Inc.) wurden in trockenem DMF gelöst (Verhältnis Borat:DMF 1:1), und das Gemisch wurde erwärmt, um den PEG-NHS-Ester zu lösen. Die Oligonukleotidlösung wurde der PEG-Lösung schnell zugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 10 Min. lang kräftig gerührt. Ungefähr 90 % des Oligonukleotids wurde zu PEG-NHS-Ester konjugiert. Vergleiche 1H und 1I.
Synthese der dimeren VEGF-Nukleinsäure-Liganden
Die dimerischen VEGF-Nukleinsäureliganden, die in 1J, K, und L gezeigt werden, wurden wie folgt gemacht.
Synthese von 1,3-Dipivalolyl-2-O-dimethoxy-tritylglycerol 32
Einer gerührten Pyridinlösung der Verbindung 31 (62 g von 70 % des reinen Produkts, 200 mmol, in 200 ml Pyridin), hergestellt gemäß McGee et al. (1988, Synthetic Communication, 1651), wurde Dimethoxytritylchlorid (84 g, 240 mmol, 1,2-facher Überschuss) zugefügt und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert und der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (1 l) aufgenommen, mit Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO₄) und konzentriert. Das Rohgemisch (130 g) wurde so in der nächsten Reaktion verwendet.
Synthese von 2-O-Dimethoxytritylglycerol 33
Ein Gemisch aus der Rohverbindung 32 (130 g), NaOMe (28 g) und Methanol (900 ml) wurde 16 Std. lang auf 50 °C erwärmt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war (TLC), wurde das Gemisch bis zur Trockenheit konzentriert, und der Rückstand wurde in Wasser und CH₂Cl₂ (1:1) gelöst. Die organische Schicht wurde separiert, und die wässrige Schicht wurde mit gesättigtem NH₄Cl, Wasser und Salzlake gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Die Verdampfung des Lösemittel erbrachte eine gummiartige Verbindung, die mittels Silicagel-Säule unter Verwendung von 1:1 Hexan/Ethylacetat, das 2 % TEA enthielt, gereinigt wurde, um Verbindung 33 in 75 % isolierter Ausbeute zu erbringen. ¹H NMR (DMSO-d₆) 3,02-3,07 (m, 2H), 3,17-3,23 (m, 2H), 3,3-3,35 (m, 1H), 3,7 (s, 6H), 4,26 (t, J = 4,1 Hz, 2H, D, O austauschbar), 6,59-6,86 (m, 4H), 7,17-7,68 (m, 9H).
Synthese von Bisamidit 34
Einer eiskalten gerührten Lösung des Alkohols 33 (16,2 g, 41, 18 68 mmol) in CH₂Cl₂ (125 ml) und Diisopropylethylamin (58 ml, 320 mmol) wurde eine phosphitylierende Reagenzie (20,5 ml, 90,62 mmol) zugefügt, und die Lösung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und 2 Std. lang bei gleicher Temperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam in zerstoßenes Eis geschüttet und mit CH₂Cl₂ extrahiert, mit 5 % NaHCO₃, Wasser und Salzlake gewaschen und getrocknet. Der nach der Verdampfung erhaltene Rückstand des Lösemittels wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von 1:1 Hexan/Ethylacetat, das 2 % TEA enthielt, gereinigt, um Verbindung 34 in einer Ausbeute von 70 % zu erbringen. ¹H NMR DMSO-d₆) 1,03-1,12 (2d, 24H), 2,69-2,75 (2t, 4H), 3,1-3,33 (m, 4H), 3,33-3,55 (m, 5H), 3,66-3,7 (m, 4H), 3,72 (s, 6H), 6,83-6,89 (m, 4H), 7,19-7,48 (m, 9H). ³¹P D₃PO₄ als externer Standard 153,64 & 153,39 (2S).
Herstellung von VEGF-Dimeren
Die Synthese von VEGF-Dimeren erfolgte in einem automatisierten 8800-DNA/RNA-Synthesizer. NX31838 wurde hergestellt, wobei rA für Adenosin steht, mG und mA für 2'-O-Methylguanosin bzw. Adenosin steht, und fC und fU für 2'-Desoxy-2'-fluorocytidin bzw. 2'-Fluorotiridin steht und [3'-3'] für eine 3',3'-Internukleotid-Verlinkung steht. Die Synthese wurde durchgeführt bei einer 1mmol-Skala auf einem automatisierten Millipore-8800-Synthesizer unter Verwendung von 5'-DMT-2'-O-methyl-N⁶-tert-butylphenoxyacetyladenosin, 5'-DMT-2'-O-TBDMS-N²-tert-butyl-phenoxyacetylguanosin und 5'-DMT-2'-O-TBDMS-N⁶-tert-butylphenoxyacetyladenosin, 3'-N,N-Diisopropyl-(2-cyanoethyl)phosphoramiditen und 2'-Desoxy-2'-fluoro-5'-DMT-N4-acetylcytidin und 2'-Desoxy-2'-fluoro-5'-DMT-uridin, 3'-N,N-Diisopropyl-(2-cyanoethyl)-phosphoramiditen. Der Synthesezyklus war wie folgt. Die Aktivatorformulierungen sind in Tabelle 12 beschrieben. Die Synthesen wurden unter Verwendung des CPG-Support mit 600 Å Porengröße, 80 bis 120 Maschen, und 60 bis 70 μmol/g Ladung mit 5'-Succinylthymidin durchgeführt. Der Kopplungszyklus wird in Tabelle 12 gezeigt.
Beispiel 6. Pharmakokinetik-Eigenschaften des Phospholipid(PL)- und PEG-modifizierten VEGF-Nukleinsäureliganden
Aus den in Tabelle 2 gezeigten Sequenzen, wurde Sequenz VT30.44 für die weitere Untersuchung ausgewählt und in NX31838 umbenannt. Die Pharmakokinetik-Eigenschaften des VEGF-Nukleinsäureliganden NX31838, der zu 20- und 40K-PEG konjugiert wurde, wurden in Sprague-Dawley-Ratten bestimmt (vergleiche 1 für die Molekülbeschreibungen) (SEQ-ID-Nr.: 8 und 9). Ähnliche Studien wurden auch an NX31838, das zu PL-Lipid als eine liposomale Formulierung und als freies Arzneimittel konjugiert wurde, durchgeführt (vergleiche 1H und I für die Molekülbeschreibungen) (SEQ-ID-Nr.: 8 und 9). In jeder Untersuchung wurde das Oligonukleotid in PBS auf eine Lösungskonzentration von 1,0 mg/ml verdünnt, basierend auf der UV-Absorption bei 260 nm und einem Extinktionskoeffizienten von 0,037 μg Oligo/ml. In allen Untersuchungen erhielten 9 Ratten 1,0 mg Oligonukleotid/kg Tiergewicht durch Bolusinjektion in die Schwanzvene, und Plasmaproben wurden zu verschiedenen Zeiten zwischen 2 Minuten und 24 Stunden genommen. Die Plasmaproben und die Proben zur Qualitätskontrolle wurden unter Verwendung eines Hybridisierungsexperiments analysiert. Das Hybridisierungsexperiment nutzte ein Fang-Oligonukleotid, das eine komplementäre Sequenz zu den 5'-Enden des VEGF-Nukleinsäureliganden enthält, der zu einer Eisenoxid (FeO)-Perle konjugiert wurde (FeO-Spacer-3'-d (GCC TTA GTC ACT T-5') (SEQ-ID-Nr.: 137), worin Spacer = (dT)₈), und ein Nachweis-Oligonukleotid, das zwei Biotinmoleküle am 5'-Ende enthält (Biotin-Biotin-5'-d(Spacer-CGG ATG TAT AAG CA-3'), worin Spacer = (dT)₈) (SEQ-ID-Nr.: 138). Nach Inkubation der Fang- und Nachweissonden mit einer Plasmaprobe, die den VEGF-Nukleinsäureliganden NX31838 enthält, wurde die Menge des Biotin-Oligonukleotids, das zur Perle hybridisiert wurde, mit der Streptavidin-verlinkten alkalischen Phosphatase unter Verwendung von CSPD-Saphir als Lumineszenzsubstrat quantifiziert.
Die Daten für die Plasmakonzentration der freien, PEG20K- und PEG40K-VEGF-Nukleinsäureliganden (NX31838) (SEQ-ID-Nr.: 8 und 9) als Funktion der Zeit nach der Bolusinjektion werden in 6 zusammengefasst. Das 40K-PEG-Konjugat wurde mit monoexponentieller t_1/2 von 360 Minuten gecleart, während die 20K-PEG-Version sehr viel schneller gecleart wurde, wobei 95 % des Nukleinsäureliganden mit einer alpha-t_1/2 von 49 Minuten gecleart wurde und 5 % mit einer beta-t_1/2 von 192 Minuten gecleart wurde, was die offensichtliche Bedeutung der Größe bei der Clearance angibt. Verglichen mit den PEG-konjugierten Nukleinsäureliganden, wurde das freie (unkonjugierte) NX31838 sehr schnell mit einer t_1/2 von mehreren Minuten aus dem Plasma gecleart. Die Plasmakonzentration eines Oligonukleotids als Funktion der Zeit kann durch die Einführung geeigneter funktioneller Gruppen in das Oligonukleotid signifikant erhöht werden.
Daten für die Plasmakonzentration des PL-Lipid-konjugierten VEGF-Nukleinsäureliganden (SEQ-ID-Nr.: 5), formuliert mit und ohne Liposome als Funktion der Zeit nach der Bolusinjektion, sind in 7 zusammengefasst. Die Liposome wurde, wie in Beispiel 7A beschrieben, durch Beschallung in Gegenwart des Nukleinsäureliganden erzeugt und enthalten sowohl auf der Innen- als auch auf der Außenseite Oligonukleotid. Die liposomale Formulierung wurde mit beta-t_1/2 von 1161 Minuten bzw. 131 Minuten sehr viel langsamer gecleart als das freie Arzneimittel. Die Plasmakonzentration eines Oligonukleotids als Funktion der Zeit kann durch die liposomale Formulierung signifikant erhöht werden.
Beispiel 7. Herstellung des NX31838-PL-Liposom-Komplexes
A. Liposomenherstellung durch Filmbildung.
Die Lipide werden in einem Verhältnis von 2 Mol DSPC zu 1 Mol Cholesterin kombiniert. NX31838-PL in Wasser wird den Lipiden in einem Verhältnis von 1:50 (w/w) zugefügt. Das Material wird kombiniert, indem es mit einer Lösung aus Chloroform:Methanol:Wasser (1:3:1) solvatiert wird. Das Lösemittel wird durch Rotationsverdampfung entfernt, die einen heterogenen Film von NX31838-PL, das mit den Lipiden co-gemischt ist, hinterlässt. Der Film wird auf 50 mg/ml rehydriert, basierend auf den Lipiden, in einer Lösung aus 9 % Saccharose, gepuffert mit 25 mM Natriumphosphat bei einem pH-Wert von 7,4. Die Lösung wird kräftig gemischt, auf 65 °C erwärmt und die resultierende weiße, milchähnliche Lösung in 75 ml Aliquots beschallt, um die Lipide zu einem unilamellaren Liposom zu assemblieren. Der Fortschritt der Liposombildung wird visuell verfolgt, bis die Lösung opalisierend wird, und dann mittels Teilchengrößenanalyse über dynamische Lichtstreuung unter Verwendung eines Teilchengrößenanalysators (Leeds & Northrup Model Microtrack UPA 150, Horsham, Pennsylv.). Die Liposomengröße liegt in einem Bereich von 50 bis 70 nm (mittels Volumen-Gewicht-Distributionsmethode).
B. Liposomherstellung durch passive Verankerung.
scNX-278 (vergleiche 1C für die Molekülbeschreibung) wurde getestet, um herauszufinden, ob es einem spontanen Einbau in vorgebildete („leere") Liposome unterzogen würde. Die vorläufigen Ergebnisse unter Verwendung eines DEAE-Experiments (zur Entfernung des freien Nukleinsäureligand/Glycerol-Lipidkomplexes) gab zwei wichtige Erkenntnisse an: 1) Das Laden konnte erreicht werden; und, noch wichtiger, 2) es wurde eine im Wesentlichen vollständige Ladung des Nukleinsäureligand/Glycerollipidkomplexes über 24 Stunden bei Raumtemperatur beobachtet. Eine detailliertere Untersuchung, um die Wirkung der Temperatur auf das Laden zu bestimmen, wurde nachfolgend unternommen. Es wurde beobachtet, dass die Temperatur eine dramatische Wirkung auf die Einbauraten hatte. Auch wenn eine vollständige Ladung über 24 Stunden bei Raumtemperatur erreicht werden konnte, konnte bei erhöhten Temperaturen (67 °C) ein vollständiger Einbau innerhalb von Minuten erreicht werden. Dies erwies sich als eine schnelle und effiziente Methode zum Einbau des Komplexes aus Nukleinsäureligand und lipophiler Verbindung in vorgebildete Liposome.
Dann wurde Ausschlusschromatograpie verwendet, um freies scNX-278 von der Liposom-assoziierten Form zu separieren. Die vorläufige Arbeit wurde unter Verwendung der Ladung von scNX-278 in „leere" 2:1-DSPC:Cholesterin-Liposome durchgeführt. Chromatogramme wurden unter Verwendung einer Superdex-S-200-Säule bei 22 °C generiert. Über einen Zeitraum von 22 Stunden wurde der graduelle Einbau von scNX-278 in die leere Liposompopulation als Verschiebung in den Peak-Arealen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Die Ergebnisse korrelierten gut mit den Daten, die aus dem DEAE-Experiment erhalten wurden.
Es wurden auch Untersuchungen unternommen, um zu bestimmen, ob zusätzliche scNX-278 in beschallte Oligoliposome geladen werden könnten. Ein beschalltes Präparat von scNX-278 wurde hergestellt, indem das Oligolipid mit Lipid co-gelöst wurde und die beiden zusammen co-beschallt wurden. Die resultierenden Liposome zeigten den vollständigen Einbau von scNX-278. Diese beschallte Herstellung wurde dann 2 separaten Runden passiven Verankerns mit zusätzlichen freien scNX-278 unterzogen, um herauszufinden, ob mehr scNX-278 erfolgreich eingebaut werden könnte. Während der ersten Runde des passiven Verankerns wurden nach einer Inkubation für 1 Stunde bei 65 °C alle freien scNX-278 passiv in die Liposome verankert. Der zweite Versuch der passiven Verankerung zusätzlicher scNX-278 führte zu einer unvollständigen Ladung.
Die Haupterkenntnis aus diesen Versuchen ist, dass ein Komplex aus Nukleinsäureligand und lipophiler Verbindung in beschallte Oligoliposome bei hohen Konzentrationen passiv verankert werden kann, dass aber die Kapazität des Liposoms zur Absorbierung zusätzlicher Komplexe aus Nukleinsäureligand und lipophiler Verbindung überschritten werden kann. Nach 2 Runden passiven Ladens (zu etwa 3 mg Lipid-Oligo/50 mg Lipid) erreichten die Liposome offensichtlich ihre „Kapazität", zusätzliche Oligolipide zu absorbieren, da einige der freien Lipidoligos übrig blieben. Diese Daten wurden durch DEAE-Spin-Säulenanalyse bestätigt (Daten nicht gezeigt). Die Schlussfolgerungen, die gezogen werden können, sind : 1) beschallte Liposome besitzen zusätzliche Kapazität zum Einbau von Komplexen aus Nukleinsäureligand und lipophiler Verbindung; und 2) 100 Nukleinsäureligand-Einbau kann über Beschallung erreicht werden.
Nachfolgende Untersuchungen wurden an NX31838-PL durchgeführt (vergleiche 1E für die Molekülbeschreibung). NX31838 ist von signifikantem Interesse, da es verbesserte Pharmakokinetik (vergleiche Beispiel 6) und Biodistribution gegen VEGF-Targets hat, wenn es in Liposome eingebaut ist. Mehrere Untersuchungen wurden durchgeführt, um den Einbau von NX31838 über passive Verankerung in Liposome besser zu verstehen.
Die Untersuchungen zur Kinetik von NX31838-PL gaben an, dass die passive Verankerung für dieses Molekül so schnell war, dass es als unmöglich angesehen wurde, es über irgendeine der Chromatographietechniken, die in der Literatur bekannt sind, zu messen (von denen alle ein Minimum von mehreren Minuten Laufzeit erfordern).
Um die Orientierung des NX31838-PL-Moleküls zu bestimmen (d. h., ob die Nukleinsäureligandkomponente aus dem Liposom herausragt oder in das wässrige Zentrum des Liposoms hineinragt), wurde extern eingeführte RNase verwendet, um irgendeine der Nukleinsäureligandenkomponenten selektiv zu spalten, die aus dem Liposom nach außen ragt. Im Falle der passiv verankerten NX31838-PL-Liposome wird der gesamte Nukleinsäureligand an die RNAse I exponiert. Nach der Triton-X-100-Behandlung wurde keine zusätzliche Verdauung beobachtet. Diese Ergebnisse geben an, dass das passiv geladene NX31838-PL so orientiert ist, dass die Nukleinsäureligandenkomponente aus dem Liposom herausragt. Wenn die passiv verankerten NX31838-PL-Liposome mit RNAse I vorverdaut werden, dann über eine DEAE-Säule laufen, werden etwa 99 % des Nukleinsäureliganden durch die Säule gefangen, während, wenn die gleiche Probe über DEAE läuft, aber ohne die Vorinkubation mit RNAse I, kann fast 100 % des Oligos die Säule, nicht an DEAE gebunden, passieren. Liposom schützt das Oligo vor DEAE. Das Liposom handelt, um die Nukleinsäureligandenkomponente vor DEAE zu schützen, da es sich mit dem Nukleinsäureliganden mit hoher Affinität assoziiert, wobei es dessen Exposition an die DEAE-Gruppen stark reduziert.
Schließlich haben wir, als Teil der Entwicklung neuer Methoden, um den freien Komplex aus Nukleinsäureligand und lipophiler Verbindung aus der Liposom-verankerten Form zu separieren, NX31838.05-PL mit RNase I verdaut. Das gespaltene Oligo konnte unter Verwendung der Ausschlusschromatographie (S-1000-Harz), die der Entfernung des Lipidschwanzes folgte, leicht separiert werden, während der intakte Komplex aus Nukleinsäureligand und lipophiler Verbindung mit Liposomen unter identischen Bedingungen co-eluiert. Diese Daten geben an, dass der Komplex aus Nukleinsäureligand und lipophiler Verbindung möglicherweise eine Mizelle bilden, wenn sie frei in einer Lösung sind. Diese resultiert in dessen Co-Eluierung im Hohlraumvolumen der Säule mit den Liposomen. Die Entfernung des Lipidschwanzes erlaubt es, das Gelfiltrationsmedium einzufügen und dadurch auf geeignete Weise größenbestimmt und gelagert zu werden.
Beispiel 8. In-vivo-Wirksamkeit der VEGF-Nukleinsäureligand-Komplexe – Dermal-vaskuläres Permeabilitätsexperiment
Die Fähigkeit, mehrere unterschiedliche Formulierungen des NX31838-Nukleinsäureliganden die VEGF-induzierten Veränderungen der Permeabilität der dermalen Gefäßanordnung (Miles-Experiment) zu mildern, wurde wie zuvor beschrieben (Senger et al. (1986) Cancer Research 46:5629–5632) mit geringfügigen Modifikationen ausgeführt. Kurz gesagt, ausgewachsene weibliche Meerschweinchen (3/Untersuchung) wurden mit Isofluran anästhesiert, und das Haar auf dem dorsalen und seitlichen Rückenarealen wurde mit einer Haarschneidemaschine entfernt. Evans-Blaufarbstoff (2,5 mg/Meerschweinchen) wurde intravenös verabreicht. Die Injektionslösungen (PBS-, VEGF-, NX31838-Formulierungen und monoklonale anti-VEGF-Antikörper) wurden 30 Min. im Voraus hergestellt, wo angegeben zusammengemischt, mit den Endkonzentrationen wie gezeigt. Jede gezeigte Lösung wurde dann intradermal (zweifache Injektionen/Meerschweinchen; 40 μl/Stelle) auf randomisierte Weise in einer Gitterstruktur, die auf das rasierte Areal gezeichnet wurde, injiziert. Die Meerschweinchen konnten sich von der Anästhesie erholen und wurden 30 Min. nach Abschluss der intradermalen Injektionen durch Exposition an CO₂ getötet. Die Haut wurde dann geerntet, von Unterhautgewebe befreit und durchleuchtet. Die Bilder wurden dann unter Verwendung einer CCD-Farbkamera (Hitachi Denshi KP-50U, Japan) und Image-Pro-Plus-Software (Version 3.1, Media Cybernetics, Silver Springs, Maryl.) eingefangen. Jede Hautprobe wurde normalisiert für die Intensität mit jeder Injektionsstelle, die auf optische Dichte und auf das betroffene Areal analysiert wurde.
8A bis C zeigen die Ergebnisse der Nukleinsäureligand-Attenuierung des VEGF-induzierten vaskulären Austritts für NX31838-20K PEG, NX31838-40K PEG, NX31838-PL in dem liposomalen Präparat, wie in Beispiel 7A beschrieben. Alle Formulierungen konnten den vaskulären Austritt signifikant auf oder nahe an PBS-Kontrolllevel reduzieren, mit Konzentrationen, die nur 100 nM betrugen. Bei 30 nM ging die Blockierungswirkung des Nukleinsäureliganden verloren. Die liposomale NX31838-PL-Formulierung wurde bei dieser Konzentration nicht bewertet, schien aber eine reduzierte Blockierungsaktivität bei 100 nM aufzuweisen. Der monoklonale Anti-VEGF-Antikörper wurde in diesem Modellsystem auch bewertet und war bis zu 100 nM ebenso wirksam, mit einem Verlust der Aktivität bei 30 nM. Somit liegt es nahe, dass in diesem Modellsystem, das in den verschiedenen Formulierungen untersuchte NX31838 als Antikörper bei der Blockierung einer der funktionellen Wirkungen des VEGF-Proteins gleich wirksam ist.
Beispiel 9. In-vivo-Wirksamkeit der VEGF-NukleinsäureLigand-Komplexe – Hornhauttaschen-Modell
Die VEGF-Nukleinsäureliganden(NX31838)-Formulierungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, VEGF-induzierte Hornhaut-Angiogenese in der normalerweise gefäßlosen Rattenhornhaut zu reduzieren. Kurz gesagt, Biopolymerpellets (Hydron) ± VEGF-Protein (3 pmol) wurden etwa 30 Std. vor der Zugabe des Proteins oder der Trägerlösung zu 12 % Biopolymer in 95 % Ethanol hergestellt. Ausgewachsene Sprague-Dawley-Ratten (200 bis 240 g) wurden durch intraperitoneale Injektion von Ketamin HCl (50 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesiert. Das linke Auge wurden dann durch topische Applikation von Tetracain HCl zur Lokalanästhesie präpariert, gefolgt durch die Anwendung verdünnter Povidon-Jod-Lösung und dem nachfolgenden Spülen mit isotonischer Kochsalzlösung. Eine vertikale Spalthautinzision wurde in der Mitte der Hornhaut gemacht. Eine Tasche wurde in der Stroma-Mitte kaudal zum seitlichen Lidwinkel eingeschlitzt, die sich innerhalb von 1,5 mm des Hornhautrands ausdehnt. Dann wurde ein Pellet eingeführt und zur kaudalen Grenze der Tasche hingeschoben. Die Restluft wurde sanft aus der Tasche herausmassiert. Dann wurde ein Tropfen Chloramphenicol-Ophthalmikum-Lösung auf das Auge angewendet. Das Tier wurde umgedreht und das Verfahren am rechten Auge wiederholt, wobei die gleiche Art von Pellet eingeführt wurde. Nach Abschluss der Pellet-Einführung in jedes Auge wurde jedem Tier dann entweder PBS (Volumen entsprechend der Nukleinsäureligandenformulierungsgruppe) oder Nukleinsäureligand (10 mg/kg) intravenös zweimal täglich, wie angegeben, appliziert. Nach 5 Tagen wurde jedes Tier anästhesiert und es wurden unter Verwendung einer 35-mm-Kamera (Minolta X9), die auf einem Präpariermikroskop (KAPS, Deutschland) montiert war, Fotos gemacht. Jedes Auge wurde im Hinblick auf die angiogenische Antwort bewertet, indem die maximale Länge des Gefäßwachstums (0 bis 5), die Dichte des Gefäßwachstums (1 bis 4) neben dem implantierten Pellet und der Umfang des Auges mit auftretender Angiogenese (0 bis 1) gemessen wurde. Ein angiogenischer Index wurde dann als das Produkt von Länge * Dichte * Umfang bestimmt.
Die Fähikgkeit der Nukleinsäureligandenformulierungen, die VEGF-induzierte Angiogenese zu blockieren, ist aus den 9A bis C ersichtlich. Obwohl NX31838-20K PEG bei der Blockierung der vaskulären Permeabilitätsveränderungen genauso wirksam ist wie die anderen Formulierungen, war es bei der Attenuierung der angiogenischen Antwort in der normalerweise gefäßlosen Hornhaut nicht wirksam. Sowohl NX31838-40K PEG und liposomales NX31838-PL reduzierten jedoch das Angiogeneselevel signifikant um 65 bis 70 %. Es wird angenommen, dass diese Unterschiede auf die jeweiligen Pharmakokineseprofile der Nukleinsäureliganden zurückzuführen sind.
Statistische Analyse:
Die Gruppen in dem Miles-Experiment und den Hornhaut-Angiogenese-Modellen wurden unter Verwendung von Rank ANOVA mittels Dunnett-Vergleichen verglichen.
Beispiel 10. In-vivo-Wirksamkeit des VEGF-Nukleinsäureliganden in Tumormodellen
Menschliches Tumor-Xenotransplantationsmodell:
Die Fähigkeit des VEGF-Nukleinsäureliganden NX31838-40K PEG das Wachstum solider Tumoren zu beeinflussen, wurde in einem subkutanen Tumormodell in Nacktmäusen bestimmt. Die menschlichen A673-Rhabdomyosarkom-Tumorzellen wurden auf Gewebekulturen gewachsen, geerntet, und 1 × 10⁷ lebensfähige Zellen wurden subkutan in Nacktmäuse, proximal zur Achselregion der Flanke implantiert. Die Behandlung mit Testverbindungen wurde 12 Stunden später begonnen und für die Dauer des Versuchs fortgesetzt. Die Verbindungen wurden zweimal täglich mit 10 und 40 mg/kg intraperitoneal dosiert. Eine negative Kontrolle bestand in der Dosierung einer durchmischten Aptamersequenz, NX31917-40K PEG (vergleiche 1R für die Molekülbeschreibung) mit 40 mg/kg zweimal täglich, und eine positive Kontrolle bestand in dem Anti-VEGF-Antikörper Mab.26503.11 (R&D Systems, Charge # LD03) dosiert mit 100 μg/Maus zweimal wöchentlich. Beide mit dem Nukleinsäureliganden behandelten Gruppen und die mit dem Antikörper behandelten Gruppen bewiesen eine signifikante Verlangsamung des Tumorwachstums im Vergleich zu der negativen Kontrollgruppe mit den durchmischten Sequenzen (11). Die prozentuale Tumorwachstumsinhibition (TGI) wurde als 75 % und 80 % für die 40-mg/kg- und 10-mg/kg-BID-Gruppen und 83 % für die mit monoklonalem Antikörper behandelte Gruppe (Tabelle 8) bestimmt. Da es keinen signifikanten Unterschied zwischen der 40-mg/kg-Dosis-Gruppe und der 10-mg/kg-Dosis-Gruppe zu geben schien, wurde keine weitere Dosierung der 40-mg/kg-Gruppe nach dem 14. Tag mehr durchgeführt. Wie 11 entnommen werden kann, wuchsen die Tumoren mehrere Tage nach Beendigung der Dosierung schnell und ahmten die Wachstumsrate der negativen Kontrollgruppe nach, während sie bei der 10-mg/kg-Nukleinsäureligand-Gruppe und der mit dem Antikörper behandelten Gruppe weiterhin mit einer reduzierten Rate wuchsen.
Zusätzliche Untersuchungen wurden unter Verwendung des gleichen Tumormodells ausgeführt, wobei neue Partien des VEGF-Nukleinsäureliganden, NX31838-40K PEG (als NX31838.04 und NX31838.07 bezeichnet) verglichen wurden, und auch abwärts dosistitriert von 10 mg/kg BID, 3 mg/kg BID und 1 mg/kg BID. Der Versuch enthält auch eine einmal tägliche Dosis von 10 mg/kg sowie eine liposomale Form des VEGF-Nukleinsäureliganden NX31838-PL bei 10 mg/kg BID. Wie aus 12 und Tabelle 9 hervorgeht, wurde in beiden Versuchen der gleiche Grad an Tumorwachstumsinhibition erreicht. Beide Partien des VEGF-Nukleinsäureliganden waren äquivalent, wenn sie in einem zweimal täglichen Dosisplan mit TGI-Werten von 61 % und 70 % für die alte bzw. die neue Partie verglichen wurden. Zusätzlich wurde bestimmt, dass die einmal tägliche Dosierung (SID) genauso wirksam war wie die zweimal tägliche Dosierung. Das in diesem Versuch verwendete Titrationsschema erreichte jedoch keine Dosis ohne Wirkung.
Ein dritter Versuch wurde ausgeführt, in dem eine weitere Abwärtstitration des VEGF-Nukleinsäureliganden eine Dosis- Antwort-Beziehung im Verhältnis zum Tumorwachstum beweisen konnte. In diesem Versuch wurde der VEGF-Nukleinsäureligand abwärts titriert und erreichte eine Dosis ohne Wirkung von 0,03 mg/kg. Die relative Inhibition des Tumorwachstums geht aus 13 hervor und wird in Tabelle 10 zusammengefasst.
Zusätzlich zu den drei Tumoruntersuchungen ohne Stadien wurde eine Tumoruntersuchung mit Stadien vorbereitet, in denen die Tumoren sich etablieren konnten, und 200+/–100 mm³ vor dem Beginn der Behandlung mit dem VEGF-Nukleinsäureliganden erreichten. Die Dosisgruppen von 10 mg/kg von NX31838-40K PEG und die 100 μg zweimal wöchentlich von mAb 26503 (R & D Systems) erreichten 59 % bzw. 69 % Tumorwachstumsinhibition (14, Tabelle 11). Diese Kollektivuntersuchungen beweisen, dass der VEGF-Nukleinsäureligand die Etablierung eines A673-Tumors verlangsamen sowie das Tumorwachstum inhibieren kann, sobald sich die Tumoren etabliert haben.
Kaposi-Sarkom-Model:
Die Wirkung von NX31838-40K PEG auf das subkutane Wachstum der Kaposi-Sarkom-Zelllinie KSY-1 in Nacktmäusen wurde auch untersucht. KSY-1-Zellen sind unter den Tumorzellen dahingehend einmalig, als sie in Kultur von VEGF-Antagonisten gehemmt werden können. KSY-1-Zellen wurden in Kultur gewachsen, gepooled und subkutan (2 × 10⁷ Zellen/Maus) in die hintere Flanke der Mäuse injiziert. Drei Gruppen von Mäusen (4 Mäuse je Gruppe) wurde durch intraperitoneale Injektionen alle 12 Stunden mit entweder 30 mg/kg NX31838-40K PEG, 30 mg/kg NX31917-40K PEG (vergleiche 1R für die Molekülbeschreibung) oder PBS für die Dauer des Versuchs behandelt. Die Behandlung wurde einen Tag nach der Implantation der Tumorzellen begonnen. Während das Tumorwachstum in den mit PBS behandelten und den mit NX31917-40K PEG behandelten Gruppen vergleichbar war, wurde eine beträchtliche Inhibition des Tumorwachstums in der mit NX31838- 40K PEG behandelten Gruppe beobachtet (16). NX31838-40K PEG hemmte das Wachstum von KSY-1-Tumoren um 65 % (verglichen mit der mit PBS behandelten Gruppe) oder um 69 % (verglichen mit der mit NX31917-40 K PEG behandelten Gruppe) zu dem Zeitpunkt als der Versuch beendet wurde (22. Tag).
Beispiel 11. Intravitreale Pharmakokinetik des VEGF-Nukleinsäureliganden NX31838-40K PEG in Kaninchen
Weiße Neuseelandkaninchen wurden mit dem VEGF-Nukleinsäureliganden NX31838, konjugiert zu 40 mPEG, durch Intravitreale Applikation bei einer Dosis von 0,5 mg/Auge behandelt. 40K PEG wurde zu dem VEGF-Nukleinsäureliganden konjugiert, wie in Beispiel 5 beschrieben, und der resultierende Komplex wird in 1H gezeigt (SEQ-ID-Nr.: 8). Die Kaninchen erhielten eine Intravitreale Injektion von NX31838-40K PEG in jedes Auge. Die Zeit zwischen den Dosen für eine gegebenes Tier überstieg 15 Minuten nicht. Blut- und Glaskörperproben wurden, wie in Tabelle 7 spezifiziert, gesammelt.
Die Analyse der Plasma- und Glaskörperproben wurden unter Verwendung eines Doppelhybridisierungsexperiments durchgeführt. In diesem Experiment werden zwei Hybridisierungssonden verwendet, eine Fangsonde, die an den Vertiefungen von Platten mit 96 Vertiefungen angebracht ist, und eine biotinylierte Nachweissonde. Die Fangsonde bildet ein Hybrid mit dem 5'-Ende des Nukleinsäureliganden. Dieses Experiment ist hochspezifisch und empfindlich gegenüber dem Volllängen-Nukleinsäureliganden, um eine positives Signal zu liefern. Das derzeitige Quantifizierungslimit ist etwa 2 fMol in 5 μl Plasma.
TABELLE 1. Zusammenfassung der pharmakokinetischen Parameter des VEGF-Nukleinsäureliganden nach der intravenösen Bolusapplikation in Sprague-Dawley-Ratten, die aus den Daten, die in Figur 15 gezeigt werden, bestimmt sind (Kompartiment-Analyse).
Tabelle 3.
Tabelle 4. Wirkung von 2'-OMe-Purinsubstitutionen auf die Affinität für VEGF.
Tabelle 5.
Tabelle 6. Zusätzliche 2'-F-Pyrimidinliganden zu VEGF₁₆₅
Tabelle 7: Gruppenverteilungen und Probenzeiten
Tabelle 8: Anti-Tumor-Wirksamkeit des VEGF-Nukleinsäureliganden (NX31838) im A673-Nacktmaus-Xenotransplantationsmodell
Tabelle 9: Anti-Tumor-Wirksamkeit des VEGF-Nukleinsäureliganden (NX31838) im A673-Nacktmaus-Xenotransplantationsmodell
Tabelle 10: Anti-Tumor-Wirksamkeit des VEGF-Nukleinsäureliganden (NX31838) 40 K PEG im Nacktmaus-Xenotransplantationsmodell
Tabelle 11: Anti-Tumor-Wirksamkeit des VEGF-Nukleinsäureliganden (NX31838) im Vergleich zu Anti-VEGF-mAb in einem A673-Wachstumsstadien-Xenotransplantationsmodell
Tabelle 12: Automatisierter Synthesezyklus für die Herstellung von NX31838

^*Äquivalente basieren auf den Molen des CPG-gebundenen 3'-terminalen Nukleosids.
^**Aktivatoräquivalente basieren auf den Molen des Nukleosidphosphoramidits.

Allgemeines Verfahren für die Synthese von Dimeren
Alle anderen Phosphoramidite wurden auf die gleiche Weise wie oben erwähnt gekoppelt, ausgenommen Glycerol-bis-amidit
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein RNA-Ligand für VEGF bestehend aus der Sequenz: fCmGmGrArAfUfCmAmGfUmGmAmAfUmGfCfUfUmAfUmAfCmAfUfCfCmG-3'3'-dT.
Ein Komplex, welcher einen RNA-Liganden für VEGF bestehend aus der Sequenz: fCmGmGrArAfUfCmAmGfUmGmAmAfUmGfCfUfUmAfUmAfCmAfUfCfCmG-3'3'-dT und eine nicht-immunogene Verbindung mit einem hohen Molekulargewicht oder eine lipophile Verbindung umfasst.
Der Komplex von Anspruch 2, weiter umfassend einen Linker zwischen besagtem Liganden und besagter nicht-immunogener Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder besagter lipophiler Verbindung.
Der Komplex von Anspruch 2, wobei besagte nicht-imunogene Verbindung mit hohem Molekulargewicht Polyalkylenglykol ist.
Der Komplex von Anspruch 4, wobei besagtes Polyalkylenglykol Polyethylenglykol ist.
Der Komplex von Anspruch 5, wobei besagtes Polyethylenglykol ein Molekulargewicht von ungefähr zwischen 10–80 kDa hat.
Der Komplex von Anspruch 6, wobei besagtes Polyethylenglykol ein Molekulargewicht von ungefähr 20–45 kDa hat.
Der Komplex von Anspruch 7, wobei besagter Komplex die folgende Struktur hat
Der Komplex von Anspruch 7, wobei besagter Komplex die folgende Struktur hat
Der Komplex von Anspruch 7, wobei besagter Komplex die folgende Struktur hat
Der Komplex von Anspruch 7, wobei besagter Komplex die folgende Struktur hat
Der Komplex von Anspruch 7, wobei besagter Komplex die folgende Struktur hat
Eine Zusammensetzung umfassend den RNA-Liganden von Anspruch 1 oder den Komplex von einem der Ansprüche 2–12 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die Zusammensetzung von Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung für die Anwendung am Auge geeignet ist.
Der RNA-Ligand von Anspruch 1 oder der Komplex von einem der Ansprüche 2–12 zur Verwendung in der Therapie oder in der Diagnose.
Der RNA-Ligand oder der Komplex von Anspruch 15 für die darin vorgegebene Verwendung, wobei die Verwendung die Behandlung oder Diagnose einer Krankheit oder . eines Leidens ist, die/das von VEGF vermittelt wird.
Der RNA-Ligand oder der Komplex von Anspruch 15 zur darin angegebenen Verwendung, wobei die Verwendung die Hemmung von Angiogenese oder Tumorwachstum ist, die/das von VEGF vermittelt wird.