DE60126483T2 - Gezielte Modifikation der Chromatinstruktur - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft die Gebiete Chromatinstruktur und genetische Regulation, und insbesondere die Modifikation von eukaryotischer chromosomaler Chromatinstruktur, zur Erleichterung einer Wechselwirkung von Molekülen mit einer Region von Interesse in eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin.
  • HINTERGRUND
  • Die Regulation der Genexpression in einer Zelle wird im Allgemeinen durch genspezifische Bindung von genregulatorischen Molekülen, oftmals Proteinen, an chromosomale DNA vermittelt. Regulatorische Proteine können entweder eine positive oder negative Regulation von Genexpression bewirken. Im Allgemeinen zeigt ein regulatorisches Protein eine Präferenz zur Bindung an eine bestimmte Bindungssequenz oder an eine Zielstelle. Zielstellen für viele regulatorische Proteine (und andere Moleküle) sind bekannt oder können durch den Fachmann bestimmt werden.
  • Trotz Fortschritten bei der Auswahl und Konzeption von genregulatorischen Proteinen für sequenzspezifische DNA-Bindung, kann ihre Anwendung zur Regulation eines endogenen zellulären Gens beschränkt sein, wenn ihr Zugang zur Zielstelle in der Zelle eingeschränkt ist. Mögliche Ursachen für eingeschränkten Zugang können mit einem oder mehreren Aspekten der Chromatinstruktur des Gens in Zusammenhang stehen. Der Zugang kann durch die Struktur des Gens per se (z.B. Nukleotidmethylierung) oder durch die Struktur der chromosomalen Domäne, in welcher das Gen liegt, beeinflusst werden.
  • Zelluläre DNA, einschließlich des zellulären Genoms, existiert im Allgemeinen in Form von Chromatin, einem Komplex umfassend Nukleinsäure und Protein. Tatsächlich existieren auch die meisten zellulären RNAs in Form von Nukleoproteinkomplexen. Die Nukleinproteinstruktur von Chromatin war Gegenstand intensiver Forschung, wie es dem Fachmann bekannt ist. Im Allgemeinen ist chromosomale DNA in Nukleosomen gepackt. Ein Nukleosom umfasst einen Kern und einen Linker. Der Nukleosomkern umfasst ein Octamer von Kernhistonen (je zwei von H2A, H2B, H3 und H4), um welches etwa 150 Basenpaare chromosomaler DNA gewunden sind. Zusätzlich ist ein Linker-DNA-Segment von etwa 50 Basenpaaren mit Linkerhiston H1 (oder einem verwandten Linkerhiston in bestimmten spezialisierten Zellen) assoziiert. Nukleosomen sind in einer Chromatinfaser von hoher Ordnung organisiert (welche manchmal als „Solenoid" oder als 30 nm Faser bezeichnet wird) und Chromatinfasern sind in Chromosomen organisiert. Siehe beispielsweise Wolffe „Chromatin: Structure and Function" 3. Ausgabe, Academic Press, San Diego, 1998 und Kornberg et al. (1999) Cell 98: 285-294.
  • Die Chromatinstruktur ist nicht statisch, sondern Gegenstand von Modifikation durch Prozesse, welche gemeinsam als Chromatin-Remodeling bekannt sind. Chromatin-Remodeling kann beispielsweise dazu dienen, Nukleosomen aus einer DNA-Region zu entfernen, Nukleosomen von einer DNA-Region zu einer anderen zu bewegen, den Abstand zwischen Nukleosomen zu verändern oder Nukleosomen zu einer DNA-Region im Chromosom hinzuzufügen. Chromatin-Remodeling kann auch zu Veränderungen hinsichtlich der Struktur höherer Ordnung führen, wodurch das Gleichgewicht zwischen transkriptionell aktivem Chromatin (offenes Chromatin oder Euchromatin) und transkriptionell nicht-aktivem Chromatin (geschlossenes Chromatin oder Heterochromatin) beeinflusst wird.
  • Chromosomale Proteine sind Gegenstand vieler Arten chemischer Modifizierung, wobei einige davon oder alle die Chromatinstruktur beeinflussen. Beispielsweise sind Histone Gegenstand von Acetylierung durch Histonacetyltransferasen, Deacetylierung durch Histondeacetylasen, Methylierung durch Histonmethyltransferasen (und deshalb vermutlich von Demethylierung durch Histondemethylasen), Ubichitinierung durch Ubichitinligasen, Deubichitinierung durch Ubichitinhydrolasen, Phosphorylierung durch Histonkinasen, Dephosphorylierung durch Histonphosphatasen und reversible ADP-Ribosylierung durch Poly-ADP-Ribosepolymerase (PARP, auch bekannt als TFIIC). Strahl et al. (2000) Nature 403:41-45. Die Regulierung der Chromatinstruktur durch Methylierung von Histon H3 ist beschrieben worden. Rea et al. (2000) Nature 406:593-599. Modifizierungen von Nicht-Histon chromosomalen Proteinen umfassen beispielsweise Acetylierung von HMG-1 (Munshi et al. (1998) Mol. Cell 2:457-467); HMGs 14 und 17 (Sterner et al. (1981) J. Biol. Chem. 256:8892-8895; Herrera et al. (1999) Mol. Cell. Biol. 19:3466-3473; Bergel et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:11.514-11.520) und Chromatin-ansässigen Transkriptionsregulatoren, wie beispielsweise TFIIE (Imhof et al. (1997) Curr. Biol. 7:689-692), p53 (Gu et al. (1997) Cell 90:595-606) und GATA-1 (Boyes et al. (1998) Nature 396:594-598). Die chemische Modifizierung von Histon- und/oder Nicht-Histonproteinen ist oftmals ein Schritt im Chromatin-Remodeling-Prozess und kann entweder positive oder negative Wirkungen auf die Genexpression haben. Im Allgemeinen ist Histonacetylierung mit Genaktivierung korreliert, während Deacetylierung von Histonen mit Genrepression korreliert ist.
  • Es sind mehrere Enzyme beschrieben und teilweise charakterisiert worden, welche zur chemischen Modifizierung von Histonen in der Lage sind. Beispielsweise umfassen Histonacetyltransferasen Gcn5p, p300/CBP-assoziierten Faktor (P/CAF), p300, CREB-Bindungsprotein (CBP), HAT1, TFIID-assoziierten Faktor 250 (TAFII250) und Steroidrezeptor-Coaktivator-1 (SRC-1 ). Wade et al. (1997) Trends Biochem. Sci. 22:128-132; Kouzarides (1999) Curr. Opin. Genet. Devel. 9:40-48; Sterner et al. (2000) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:435-459. Die HDAC-Proteinfamilie wurde als Histondeacetylasen identifiziert und umfasst Homologe zur Bäckerhefe-Histondeacetylase RPD3 (z.B. HDAC1, HDAC2, HDAC3 und HDAC8) und Homologe zur Bäckerhefe-Histondeacetylase HDA1 (z.B. HDAC4, HDAC5, HDAC6 und HDAC7). Ng et al. (2000) Trends Biochem. Sci. 25:121-126. Die Rsk-2 (RKS90)-Kinase wurde als eine Histonkinase identifiziert. Sassone-Corsi et al. (1999) Science 285:886-891. Es wurde auch eine Histonmethyltransferase (CARM-1) identifiziert. Chen et al. (1999) Science 284:2174-2177.
  • Wirkungen von Veränderungen in der Chromatinstruktur auf die Genexpression sind beschrieben oder abgeleitet worden. Fryer et al. (1998) Nature 393:88-91; und Kehle et al. (1998) Science 282:1897-1900.
  • Aufgrund der dynamischen Struktur von zellulärem Chromatin kann die Fähigkeit eines regulatorischen Moleküls an seine Zielstelle in einem Chromosom zu binden unter bestimmten Umständen durch die Chromatinstruktur eingeschränkt sein. Beispielsweise sind, wenn eine Zielstelle in „offenem" Chromatin (von welchem im Allgemeinen angenommen wird, dass es nukleosomfrei ist oder dass es im Vergleich zu kompaktem Chromatin eine veränderte nukleosomale Konformation aufweist) vorliegt, strukturelle Barrieren für die Bindung eines regulatorischen Moleküls an seine Bindungsstelle unwahrscheinlich. Im Gegensatz dazu ist es wahrscheinlich, dass sterische Barrieren für eine Bindung existieren, wenn eine Zielstelle in „geschlossenem" Chromatin vorliegt (d.h. Chromatin, welches eine weitreichende Struktur höherer Ordnung und/oder einen engen Nukleosomenabstand aufweist). Deshalb hängt die Fähigkeit eines regulatorischen Moleküls, an eine Zielstelle in zellulärem Chromatin zu binden, von der Struktur des Chromatins, welches diese bestimmte Zielstelle umgibt, ab. Die Chromatinstruktur eines bestimmten Gens kann in Abhängigkeit von beispielsweise dem Zelltyp und/oder der Entwicklungsstufe variieren. Aus diesem Grund kann die Regulierung eines gegebenen Gens in einer bestimmten Zelle nicht nur durch das Vorliegen oder die Abwesenheit von genregulatorischen Faktoren beeinflusst werden, sondern auch durch die Chromatinstruktur des Gens.
  • Remodeling von Chromatin kann zur Aktivierung von Genexpression in vitro führen. Beispielsweise stimuliert der NURF-Chromatin-Remodeling-Komplex die Transkriptionsaktivierungsaktivität des GAGA-Transkriptionsfaktors. Tsukiyama et al. (1995) Cell 83:1011-1020. Die Transkriptionsaktivierung durch eine GAL4-VP16-Fusion erfordert den RSF Chromatin-Remodeling-Komplex. LeRoy et al. (1998) Science 282:1900-1904. Der SWI/SNF-Chromatin-Remodeling-Komplex potenziert die Transkriptionsaktivierung durch die VP16-Aktivierungsdomäne und den Liganden-gebundenen Glucocorticoidrezeptor. Neely et al. (1999) Mol. Cell 4:649-655; Wallberg et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 20:2004-2013.
  • Es gibt auch einige Beispiele für ein Erfordernis der Aktivität von Chromatin-Remodeling-Komplexen zur Genaktivierung in vivo. Der humane SWI/SNF-Chromatin-Remodeling-Komplex ist für die Aktivität des Glucocorticoidrezeptors erforderlich. Fryer et al. (1998) Nature 393:88-91. Der SWI/SNF-Chromatin-Remodeling-Komplex aus Säuger ist für die Aktivierung des hsp70-Gens erforderlich. de La Serna et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 20:2839-2851. Mutationen im Drosophila ISWI-Protein beeinflussen die Expression des engrailed Gens und des Ultrabithorax-Gens nachteilig. Deuring et al. (2000) Mol. Cell 5:355-365. Abschließend führen Mutationen im Hefe-SWI/SNF-Gen zu einer Abnahme hinsichtlich der Expression einer Gruppe von Genen und einem Anstieg hinsichtlich der Expression einer anderen Gruppe von Genen, wodurch gezeigt wird, dass Chromatin-Remodeling sowohl positive als auch negative Wirkungen auf die Genexpression haben kann. Holsteege et al. (1998) Cell 95:717-728; Sudarsanam et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3364-3369.
  • Trotz des Wissens um die Wirkungen von Chromatin-Remodeling auf die Genexpression in vitro und in vivo stehen keine Verfahren zur direkten Manipulation der Chromatinstruktur zur Verfügung. Entsprechend bedarf es in Situationen, in welchen ein regulatorisches Protein durch die Chromatinstruktur davon abgehalten wird, mit seiner Zielstelle zu wechselwirken, Verfahren zur zielgerichteten Modifizierung der Chromatinstruktur. Solche Verfahren wären beispielsweise nützlich, um eine Bindung von regulatorischen Molekülen an zelluläres Chromatin zu erleichtern und/oder um den Zugang von DNA-Bindungsmolekülen an zelluläre DNA-Sequenzen zu erleichtern. Dies würde wiederum die Regulation von Genexpression entweder positiv oder negativ durch endogene und exogene Moleküle erleichtern und zusätzliche Verfahren zur Bindung dieser Moleküle an Bindungsstellen in Regionen von Interesse in zellulärem Chromatin bereitstellen.
  • Beerli et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 97:14495-1500, offenbaren Genregulation durch auferlegte Lokalisierung unter Verwendung von entwickelten Zinkfingerproteinen, welche 18 bp DNA-Sequenzen in den 5-untranslatierten Regionen der Protoonkogene erbB-2 und erB-3 binden. Es wurden Transkriptionsfaktoren durch Fusion der DNA-Bindungsproteine an Repressions- oder Aktivierungsdomänen erzeugt.
  • Van Steensel Bas et al. (2000), Nature Technology, Bd. 18, Seiten 424-428 offenbaren die Fusion von Dam-Methylase an eine GAL4-DNA-Bindungsdomäne oder an HP1, und die sich ergebende Methylierung von zellulären Regionen, welche die GAL4- und HP1-Bindungsstellen umgeben.
  • WO 97/11972 offenbart ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens, welches umfasst: Inkontaktbringen eines Promotors des Zielgens, welcher eine Methylierungsstelle enthält, mit einem chimären Protein umfassend einen mutierten DNA-Methyltransferaseabschnitt und einen DNA-Bindungsabschnitt, welcher ausreichend nahe zur Promotorsequenz des Zielgens bindet, um die Promotorsequenz des Zielgens spezifisch zu methylieren, wodurch die Expression des Zielgens gehemmt wird.
  • WO 01/52620 betrifft ein Verfahren zur Modulierung der Expression eines Zielgens in Pflanzenzellen, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen von Pflanzenzellen mit einem Zinkfingerprotein, wobei das Zinkfingerprotein spezifisch an eine Zielnukleotidsequenz oder einen komplementären Strang davon innerhalb eines Zielgens binden kann. Infolge von Bindung des Zinkfingerproteins an die Zielnukleotidsequenz wird die Expression des Zielgens moduliert.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Hierin werden Zusammensetzungen und in vitro-Verfahren offenbart, welche für ein zielgerichtetes Remodeling von Chromatin geeignet sind. Diese Zusammensetzungen und Verfahren sind zur Erleichterung von Prozessen geeignet, welche vom Zugang von zellulären DNA-Sequenzen für DNA-Bindungsmoleküle abhängig sind, wie beispielsweise Transkription, Replikation, Rekombination, Reparatur und Integration. In einer Ausführungsform erleichtert die zielgerichtete Modifizierung von Chromatin die Regulation von Genexpression durch endogene oder exogene Moleküle durch Bereitstellen von Zugang zu zellulären DNA-Sequenzen.
  • Remodeling ist jede Veränderung der Chromatinstruktur im Vergleich zum normalen Zustand des Chromatins in der Zelle, in welcher es vorkommt. Die Erfindung betrifft insbesondere ein in vitro-Verfahren zum Remodeling einer Region von Interesse in eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, Inkontaktbringen des chromosomalen zellulären Chromatins mit einem Fusionspolypeptid, das an eine Zielstelle in der Region von Interesse bindet, wobei das Fusionspolypeptid eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne und eine enzymatische Chromatin-Remodeling-Komplexkomponente umfasst, die Histone kovalent modifiziert oder eine Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität aufweist oder ein funktionelles Fragment davon aufweist, und wobei die Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne entwickelt oder ausgewählt wurde, um die Zielstelle zu erkennen.
  • Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Remodeling einer Region von Interesse in eukaryotischem chromosomalem Chromatin gemäß der Erfindung, ferner umfassend den Schritt, Inkontaktbringen des chromosomalen zellulären Chromatins mit einem zweiten Molekül.
  • Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Remodeling einer Region von Interesse in eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin gemäß der Erfindung, ferner umfassend den Schritt Inkontaktbringen des chromosomalen zellulären Chromatins mit einem dritten Molekül.
  • Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend:
    • a) eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, wobei die Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne entwickelt oder ausgewählt wurde, um eine bestimmte Zielstelle in eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin zu erkennen; und
    • b) eine enzymatische Chromatin-Remodeling-Komplexkomponente, die Histone kovalent modifiziert oder eine Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität aufweist oder ein funktionelles Fragment davon aufweist.
  • Abschließend betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionspolypeptids, wobei das Fusionspolypeptid umfasst eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, die entwickelt ist, eine bestimmte Zielstelle in einer Region von Interesse in eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin zu erkennen, und eine enzymatische Chromatin-Remodeling-Komplexkomponente, die Histone kovalent modifiziert oder eine Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität aufweist oder ein funktionelles Fragment davon aufweist, wobei das Verfahren den Schritt Exprimieren des dieses Fusionspolypeptid kodierenden Polynukleotids umfasst.
  • In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Modifizierung einer Region von Interesse in eukaryotischem chromosomalem zellulären Chromatin bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst: Inkontaktbringen von chromosomalem zellulären Chromatin mit einem Fusionsmolekül, welches an eine Bindungsstelle in der Region von Interesse bindet.
  • Das Fusionsmolekül umfasst eine DNA-Bindungsdomäne und eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes oder ein funktionelles Fragment davon. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsmolekül ein Polypeptid. Chromosomales zelluläres Chromatin kann in einer eukaryotischen Zelle vorliegen. Eukaryotische Zellen umfassen Mikroorganismen, Pilzzellen, pflanzliche und tierische Zellen, einschließlich Zellen aus Vertebraten, Säugern und Mensch.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst die DNA-Bindungsdomäne des Fusionsmoleküls eine Triplex-bildende Nukleinsäure, einen Interkalator, ein antibiotisches Mittel oder ein Bindemittel an die Kleine Furche (minor groove binder). In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die DNA-Bindungsdomäne eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist ein Fusionsmolekül ein Fusionspolypeptid umfassend eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne. Andere Polypeptid-DNA-Bindungsdomänen sind ebenfalls geeignet.
  • Der andere Teil des Fusionsmoleküls ist eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes. Zahlreiche Chromatin-Remodeling-Komplexe sind dem Fachmann bekannt. Chromatin-Remodeling-Komplexe enthalten im Allgemeinen eine enzymatische Komponente, wobei es sich oftmals um eine ATPase, eine Histonacetyltransferase oder eine Histondeacetylase handelt. ATPase-Komponenten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die im Folgenden genannten Polypeptide: SWI2/SNF2, Mi-2, ISWI, BRM, BRG/BAF, Chd-1, Chd-2, Chd-3, Chd-4 und Mot-1. Zusätzliche nicht-enzymatische Komponenten, die bei der Positionierung der enzymatischen Komponente im Hinblick auf ihr Substrat und/oder zur Wechselwirkung mit anderen Proteinen eine Rolle spielen, liegen in Chromatin-Remodeling-Komplexen ebenfalls vor und können als ein Teil eines Fusionsmoleküls verwendet werden. Viele Komponenten von Chromatin-Remodeling-Komplexen sind durch Sequenzhomologie identifiziert worden. Entsprechend ist es wahrscheinlich, dass zusätzliche Chromatin-Remodeling-Komplexe und ihre Komponenten entdeckt werden, und ihre Verwendung ist von der vorliegenden Offenbarung umfasst.
  • Die Modifizierung der Chromatinstruktur erleichtert viele Prozesse, welche einen Zugang zu zellulärer DNA benötigen. In einer Ausführungsform erleichtert Chromatinmodifizierung die Modulierung der Expression eines Gens von Interesse. Modulierung von Expression umfasst Aktivierung oder Repression eines Gens von Interesse. In einer getrennten Ausführungsform erleichtert Chromatinmodifizierung eine Rekombination zwischen einer exogenen Nukleinsäure und zellulärem Chromatin. Auf diese Weise wird die zielgerichtete Integration von Transgenen effizienter durchgeführt.
  • Wie angemerkt, kann ein Fusionsmolekül ein Polypeptid sein. Entsprechend wird in einer Ausführungsform Chromatinmodifizierung durch Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Polynukleotid, welches ein Fusionspolypeptid kodiert, erreicht, so dass das Polynukleotid in die Zelle eingeführt wird und das Fusionspolypeptid in der Zelle exprimiert wird. In diesem Zusammenhang werden sowohl Fusionspolypeptide umfassend eine Fusion zwischen einer DNA-Bindungsdomäne und einer Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes (oder einem funktionellen Fragment davon) als auch Polynukleotide, welche diese kodieren, bereitgestellt. Ebenfalls bereitgestellt werden Zellen umfassend diese Fusionspolypeptide und Zellen umfassend Polynukleotide, welche diese Fusionspolypeptide kodieren. Bevorzugt sind Fusionspolypeptide, welche eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne umfassen und Polynukleotide, welche diese kodieren.
  • In einer Ausführungsform umfasst eine Region von Interesse in zellulärem Chromatin, welche zu modifizieren ist, ein Gen. Beispielhafte Gene, deren Chromatinstruktur durch die Verwendung der hierin offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren modifiziert werden kann, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Erythropoietin (EPO), den Androgenrezeptor, PPAR-γ2, p16, p53, Rb, Dystrophin und e-Cadherin. Entsprechend ist in bestimmten Ausführungsformen die DNA-Bindungsdomäne des Fusionsmoleküls ausgewählt, um an eine Sequenz (d.h. eine Zielstelle) in einem der vorausgehend genannten Gene zu binden.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird eine Modifikation einer eukaryotischen Chromatinstruktur unter Verwendung eines Fusionsmoleküls, wie hierin offenbart, erreicht durch einen zusätzlichen Schritt des Inkontaktbringens von eukaryotischem zellulärem Chromatin mit einem zweiten Molekül. Oftmals erleichtert die Modifizierung einer eukaryotischen Chromatinstruktur, welche durch die Bindung des Fusionsmoleküls bewirkt wird, die Bindung des zweiten Moleküls. Das zweite Molekül kann ein Transkriptionsregulationsmolekül sein, entweder ein endogener Faktor oder ein Faktor, welcher exogen einer Zelle zugeführt wird. In bestimmten Ausführungsformen ist das zweite Molekül ebenfalls ein Fusionsmolekül, vorzugsweise ein Fusionspolypeptid. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das zweite Molekül eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne. Das zweite Molekül kann beispielsweise auch eine Transkriptionsaktivierungsdomäne oder eine Transkriptionsrepressionsdomäne umfassen. Deshalb stellt in einer Ausführungsform die Modifizierung einer Chromatinstruktur in einer Region von Interesse durch ein Fusionsmolekül, wie es hierin offenbart ist, einen Zugang für die Bindung eines zweiten Moleküls bereit, welches die Transkription eines Gens in oder nahe der Region von Interesse regulieren kann.
  • In einer anderen Ausführungsform ist ein zweites Molekül eine Fusion umfassend eine DNA-Bindungsdomäne und ein Enzym (oder ein funktionelles Fragment davon), welches kovalent Histone modifiziert, wie zum Beispiel eine Histonacetyltransferase oder eine Histondeacetylase. Auf diese Weise erleichtert ein erstes Fusionsmolekül ein Remodeling von eukaryotischem chromosomalem Chromatin, wobei das erste Fusionsmolekül es zu einem Substrat für die Aktivität eines zweiten Fusionsmoleküls macht, welches eine kovalente Modifizierung des einem Remodeling unterzogenen Chromatins erleichtert. Alternativ kann ein zweites Molekül eine Fusion zwischen einer DNA-Bindungsdomäne und einer Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes umfassen, welche sich von der, welche im ersten Molekül vorliegt, unterscheidet. Das erste Molekül ist ein Fusionspolypeptid wie in Anspruch 1 zitiert. Auf diese Weise ist es möglich, an einer Region von Interesse in eukaryotischem zellulärem Chromatin mehrere Chromatin-Remodeling-Komplexe zu rekrutieren.
  • In noch einer anderen Ausführungsform wird das zelluläre Chromatin mit drei Molekülen in Kontakt gebracht. Das erste umfasst ein Fusionspolypeptid zwischen einer Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, welche entwickelt wurde oder ausgewählt worden ist, um die Zielstelle zu erkennen und eine enzymatische Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes, welche kovalent Histone modifiziert oder Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität oder ein funktionelles Fragment davon aufweist. Das zweite Molekül kann beispielsweise ein Transkriptionsregulationsmolekül (endogen oder exogen), eine Fusion zwischen einer DNA-Bindungsdomäne und einer Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes oder einer Fusion zwischen einer DNA-Bindungsdomäne und einem Enzym, welches kovalent Histone modifiziert, umfassen. Das dritte Molekül kann ein endogenes oder exogenes Transkriptionsregulationsmolekül oder ein Fusionsmolekül sein. Ein Fusionsmolekül kann ein Fusionspolypeptid sein und kann eine DNA-Bindungsdomäne (z.B. eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne) und eine Transkriptionsregulationsdomäne umfassen, wie beispielsweise eine Aktivierungsdomäne oder eine Repressionsdomäne. Deshalb sind mehrere Kombinationen von Molekülen möglich. Beispielsweise können das erste und das zweite Molekül bei der Modifizierung eukaryotischer chromosomaler Chromatinstruktur in der Region von Interesse eine Rolle spielen, um einen Zugang zu dieser Region für ein drittes Molekül zu ermöglichen, wobei es sich beispielsweise um ein Molekül mit einer Transkriptionsregulationsfunktion handeln kann.
  • Alternativ kann das erste Fusionspolypeptid, wie es in Anspruch 1 zitiert ist, bei der Modifizierung von eukaryotischer Chromatinstruktur eine Rolle spielen, um einen Zugang für das zweite und dritte Molekül (wobei es sich bei beiden beispielsweise um Transkriptionsregulationsmoleküle handeln kann), in einer Region von Interesse in zellulärem Chromatin zu ermöglichen. In einer anderen Ausführungsform kann das erste Molekül ein Chromatin-Remodeling in der Region von Interesse erleichtern, das zweite Molekül kann bei einer kovalenten Modifizierung von Histonen in der Region von Interesse eine Rolle spielen und das dritte Molekül kann in der Region von Interesse binden und eine Transkriptionsregulationsfunktion besitzen. In einer ähnlichen Art und Weise können vierte, fünfte etc. Moleküle ebenfalls mit zellulärem Chromatin in Kontakt gebracht werden, um dessen Struktur in einer Region von Interesse zu modifizieren und um eine Regulation eines Gens in der Region zu bewirken.
  • In einer Ausführungsform umfassen Verfahren zur Modellierung der Expression eines Gens die Schritte des Inkontaktbringens von eukaryotischem zellulärem Chromatin mit einem Fusionspolypeptid, wie es in Anspruch 1 zitiert ist, welches an eine Bindungsstelle in zellulärem Chromatin bindet, wobei die Bindungsstelle in dem Gen liegt und wobei das erste Fusionsmolekül eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne und eine enzymatische Chromatin-Remodeling-Komplexkomponente umfasst, welche Histone kovalent modifiziert oder Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität oder ein funktionelles Fragment davon aufweist und ferner Inkontaktbringen des zellulären Chromatins mit einem zweiten Molekül, das an die Zielstelle im Gen bindet und die Expression des Gens moduliert.
  • Das zweite Molekül kann beispielsweise ein Kleinmolekültherapeutika, ein Bindemittel an die Kleine Furche, ein Peptid, ein Polyamid, ein DNA-Molekül, ein Triplex-bildendes Oligonukleotid, ein RNA-Molekül oder ein Polypeptid sein. Beispielhafte Polypeptide umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Transkriptionsfaktoren, Rekombinasen, Integrasen, Helicasen und DNA- oder RNA-Polymerasen. Jedes der vorausgehend genannten Moleküle kann entweder exogen oder endogen sein. Alternativ kann das zweite Molekül ein zweites Fusionsmolekül sein, beispielsweise ein Fusionspolypeptid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite Molekül ein Fusionspolypeptid umfassend eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne. Das zweite Fusionsmolekül kann auch eine Transkriptionsaktivierungsdomäne oder eine Transkriptionsrepressionsdomäne umfassen.
  • In bestimmten Ausführungsformen der Verfahren zur Modellierung der Expression eines Gens werden mehrere an ersten Fusionsmolekülen, wobei jedes eine unterschiedliche Bindungsstelle im Gen aufweist, mit eukaryotischem zellulärem Chromatin in Kontakt gebracht. Auf ähnliche Art und Weise können mehrere an zweiten Molekülen, wobei jedes eine unterschiedliche Zielstelle im Gen aufweist, mit eukaryotischem zellulärem Chromatin bei der Ausführung der Verfahren zur Modellierung der Expression eines Gens in Kontakt gebracht werden. Daher können die offenbarten Verfahren zur Modulierung der Expression eines Gens die Verwendung eines einzelnen ersten Fusionsmoleküls und eines einzelnen zweiten Moleküls, eines einzelnen ersten Fusionsmoleküls und mehrerer zweiter Moleküle, mehrerer erster Fusionsmoleküle und eines einzelnen zweiten Moleküls, und mehrerer erster Fusionsmoleküle und mehrerer zweiter Moleküle umfassen.
  • In zusätzlichen Ausführungsformen wird die Expression von mehreren Genen gemäß den offenbarten Verfahren moduliert. Dies kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. In einer Ausführungsform werden mehrere an ersten Fusionsmolekülen, wobei jedes an eine unterschiedliche Bindungsstelle bindet, wobei jede unterschiedliche Bindungsstelle in einem unterschiedlichen Gen liegt, mit eukaryotischem zellulärem Chromatin in Kontakt gebracht. In bestimmten Ausführungsformen kann ein erstes Fusionsmolekül an eine geteilte Bindungsstelle in zwei oder mehr von mehreren Genen binden. In einer Ausführungsform eines Verfahrens zur Modellierung der Expression von mehreren Genen bindet ein einzelnes erstes Fusionsmolekül an eine geteilte Bindungsstelle in allen der mehreren Gene, deren Expression moduliert wird.
  • Zusätzliche Verfahren zur Modulierung der Expression von mehreren Genen umfassen Inkontaktbringen von mehreren zweiten Molekülen mit zellulärem Chromatin, in Kombination mit dem Kontakt von einem oder mehreren ersten Fusionsmolekülen mit eukaryotischem zellulärem Chromatin. Jedes der mehreren an zweiten Molekülen kann an eine unterschiedliche Zielstelle binden, wobei jede Zielstelle in einem unterschiedlichen Gen liegt: Alternativ kann ein einzelnes zweites Molekül an eine geteilte Zielstelle in zwei oder mehr unterschiedlichen Genen binden. In einer Ausführungsform bindet ein einzelnes zweites Molekül an eine geteilte Zielstelle in allen der mehreren Gene, deren Expression moduliert wird.
  • In bestimmten Ausführungsformen werden zur Erleichterung der Bindung des Fusionsmoleküls an das zelluläre Chromatin eine oder mehrere zugängliche Regionen innerhalb der Region von Interesse identifiziert und es werden eine oder mehrere Zielstellen für den DNA-Bindungsteil des Fusionsmoleküls innerhalb der zugänglichen Region identifiziert. In getrennten Ausführungsformen ist die DNA-Bindungsdomäne in der Lage, an nukleosomale DNA-Sequenzen zu binden und eine Identifizierung einer zugänglichen Region ist nicht notwendig. Im letzteren Fall führt Chromatinmodifizierung, wie hierin offenbart, oftmals zur Erzeugung einer zugänglichen Region in zellulärem Chromatin in der Region von Interesse, wodurch die Bindung anderer Moleküle, entweder exogen oder endogen, erleichtert wird. Exogene Moleküle, deren Bindung durch die Erzeugung einer zugänglichen Region durch Chromatinmodifizierung erleichtert werden kann, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Bindemittel an die Kleine Furche, Bindemittel an die große Furche (major groove binders), Interkalatoren, Kleinmolekültherapeutika, Nukleinsäuren und Polypeptide, einschließlich Fusionspolypeptide, vorzugsweise umfassend eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne.
  • Es werden auch Polynukleotide bereitgestellt, welche Fusionen zwischen einer DNA-Bindungsdomäne und einer Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes kodieren, sowie Verfahren zu deren Konstruktion.
  • Fusionspolypeptide umfassend eine DNA-Bindungsdomäne und eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes und Verfahren zur Herstellung derartiger Fusionspolypeptide werden ebenfalls bereitgestellt. In einer Ausführungsform werden derartige Fusionspolypeptide durch Exprimieren eines Polynukleotids, wie es im vorausgehenden Absatz beschrieben ist, in einer geeigneten Wirtszelle hergestellt.
  • Verfahren zur Bindung eines exogenen Moleküls an zelluläres Chromatin, wobei die Verfahren eine zielgerichtete Modifizierung von Chromatinstruktur, wie sie hierin offenbart ist, umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt das PCR-Amplifikationsschema zur Herstellung von Konstrukten, welche die Veg1- und Veg3a-DNA-Bindungsdomänen kodieren.
  • 2 zeigt die Ergebnisse einer DNA-Bindungsaffinitätsbestimmung für die Veg1-DNA-Bindungssubdomäne. 2A zeigt eine EMSA-Analyse. Ungebundene Sonde befindet sich am unteren Ende des Gels und eine verschobene Sonde (gebunden an Veg1) wird durch den Pfeil zu der rechten der Bindungsreaktion angezeigt, in welcher 15 nM der Veg1-Maltose-Bindungsproteinfusion verwendet wurden. 2B ist ein Graph, welcher die Kd beschreibt.
  • 3 zeigt ein Autoradiogramm eines DNA-Gels, welches das Vorliegen und die Lokalisierung von DNasel-hypersensitiven Stellen im humanen VEGF-A-Gen zeigt.
  • 4 ist ein schematisches Diagramm des Plasmids pSRC1b-EPO2C. Der nach rechts zeigende Pfeil stellt die Startstelle einer Transkriptionseinheit dar, welche ein Fusionsprotein kodiert, das ein Kernlokalisierungssignal (NLS), eine ZFP-Bindungsdomäne, welche auf das Nukleotid -862 des humanen Erythropoietingens (EPO2c ZFP) gerichtet ist, einen Teil des SRC1-Proteins mit den Aminosäuren 781-1385 (SRC1b) und ein FLAG-Epitop (Flag) umfasst. pCMV stellt einen CMV-Promotor dar. Ausgewählte Restriktionsenzym-Erkennungsstellen sind ebenfalls gezeigt.
  • 5 zeigt Erythropoietin (EPO)-Mengen in transfizierten Zellen und in Kontrollzellen, wie es durch ELISA bestimmt wurde. Der Balken, welcher mit pSRC1b-EPO2C beschriftet ist, stellt die Mengen an EPO dar, welche in das Medium durch Zellen sekretiert wurden, die mit einem Plasmid transfiziert waren, das eine Fusion zwischen einem EPO-zielgerichteten ZFP und einem Teil des SRC1-Proteins kodiert. pCDNA3.1 stellt sekretierte EPO-Mengen in Zellen dar, welche mit einem Kontrollplasmid transfiziert waren, das für keine ZFP-SRC1-Fusion kodiert.
  • 6 ist ein schematisches Diagramm, welches die Struktur eines Satzes an Fusionsmolekülen zeigt, der in Beispiel 13 beschrieben ist. NLS bezieht sich auf eine Kernlokalisierungssequenz, ZFP-DBD bezieht sich auf die VEGF3a/1-Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, MBD bezieht sich auf einen Teil eines Methylbindungsdomäne-Proteins, DNMT bezieht sich auf einen Teil eines DNA-N-Methyltransferaseproteins und Flag bezieht sich auf ein FLAG-Epitop.
  • 7 zeigt VEGF-Mengen in transfizierten Zellen und in Kontrollzellen, wie es durch ELISA bestimmt wurde. Schein bezieht sich auf Zellen, welche mit einem Vektor transfiziert sind, der keine ZFP-MBD oder ZFP-DNMT-Fusion enthält. pEGFP-KRAB bezieht sich auf Zellen, welche mit einem Plasmid, das ein grün fluoreszierendes Protein kodiert, transfiziert sind. PVF3a/1 bezieht sich auf die VEGF3a/1-DNA-Bindungsdomäne, welche in den Beispielen 3 und 13 beschrieben ist. MBD bezieht sich auf verschiedene Methylbindungsdomäne-Proteine. DNMT bezieht sich auf verschiedene DNA-N-Methyltransferasen.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Hierin werden Zusammensetzungen und in vitro-Verfahren offenbart, welche für ein Remodeling von eukaryotischer chromosomaler Chromatinstruktur in einer vorbestimmten Region von Interesse in zellulärem Chromatin geeignet sind. Ein Remodeling der Chromatinstruktur erleichtert viele Prozesse, welche eine Nukleotid-sequenzspezifische Wechselwirkung von Molekülen mit chromosomalem zellulärem Chromatin umfassen. In bestimmten Ausführungsformen ist ein Remodeling der chromosomalen Chromatinstruktur eine Voraussetzung für eine Bindung eines Regulationsmoleküls an seine Zielstelle in chromosomalem zellulärem Chromatin. Eine derartige Bindung kann für die Regulation eines endogenen zellulären Gens durch eines oder mehrere endogene und/oder exogene Moleküle nützlich sein.
  • Eine Regulation von Genexpression umfasst oftmals eine Rekrutierung eines Chromatin-Remodeling-Komplexes an eine Region von zellulärem Chromatin (z.B. der Promotor eines Gens).
  • Eine Rekrutierung kann beispielsweise durch Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen einem Sequenz-spezifischen DNA-Bindungstranskriptionsregulations-Protein, welches an einen Promotor gebunden ist, und einer Komponente des Remodeling-Komplexes geschehen. Siehe zum Beispiel Peterson et al. (2000) Curr. Opin. Genet. Devel. 10:187-192. Veränderungen hinsichtlich der Chromatinstruktur in der Umgebung des Promotors, vermittelt durch den rekrutierten Remodeling-Komplex erleichtern nachfolgende Wechselwirkungen, welche zu Transkriptionsaktivierung oder Transkriptionsrepression führen. Die Region, an welcher ein Remodeling-Komplex lokalisiert werden kann, ist jedoch beschränkt durch die Sequenzspezifität des DNA-Bindungstranskriptionsregulations-Proteins, da die meisten, wenn nicht alle, Proteinkomponenten von Chromatin-Remodeling-Komplexen keine Sequenz-spezifische DNA-Bindungsaktivität besitzen. Deshalb ist es nicht leicht, Chromatin-Remodeling auf eine bestimmte Region von Interesse in zellulärem Chromatin zielauszurichten, solange man nicht über ein Protein verfügt, welches: (1) an Chromatin in oder nahe an der Region von Interesse binden kann und (2) mit wenigstens einer Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes mit mehreren Untereinheiten wechselwirken kann.
  • Die hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen ermöglichen ein zielgerichtetes Remodeling einer beliebigen Region von Interesse in eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin durch Verwendung eines Fusionspolypeptids umfassend eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, welche entwickelt oder ausgewählt worden ist, um die Zielstelle zu erkennen und eine enzymatische Chromatin-Remodeling-Komplexkomponente, welche kovalent Histone modifiziert oder Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität aufweist oder ein funktionelles Fragment davon. Die Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne ist ausgewählt oder entwickelt, um an eine Zielstelle innerhalb oder nahe bei der Region von Interesse zu binden. Eine beliebige Zinkfinger-DNA-Bindungseinheit mit der Voraussetzung Spezifität ist geeignet. Eine Bindung des Zinkfinger-DNA-Bindungsteils des Fusionspolypeptids lokalisiert den Teil des Fusionspolypeptids, umfassend eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes, wie es in Anspruch 1 zitiert ist, an die Region der Bindung, wo sie mit anderen Komponenten wechselwirkt zur Rekonstituierung eines funktionellen Chromatin-Remodeling-Komplexes in der Umgebung der Zielstelle. Chromatin-Remodeling ergibt sich in der Umgebung der Zielstelle, was die Region der Bindung (z.B. ein Genpromotor) für die Wirkung von endogenen Regulationsfaktoren und/oder für die Regulationsaktivitäten von exogenen Molekülen zugänglich gestaltet.
  • Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass zielgerichtetes Remodeling von Chromatin die Regulation von vielen Prozessen, welche den Zugang von Molekülen zu DNA in zellulärem Chromatin umfassen, erleichtert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Replikation, Rekombination, Reparatur, Transkription, Telomerfunktion und -erhaltung, Schwesterchromatidkohäsion und mitotische Chromosomsegregation. Beispielsweise wird die zielgerichtete Integration von exogener DNA in zelluläres Chromatin durch Chromatin-Remodeling in der Region der gewünschten Integrationsstelle gesteigert.
  • Allgemeines
  • Die praktische Ausführung der Offenbarung verwendet, soweit nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Biochemie, Chromatinstruktur und -analyse, computergesteuerter Chemie, Zellkultur, rekombinanter DNA und verwandter Gebiete, welche innerhalb des Fachkönnens liegen. Diese Techniken werden in der Literatur vollständig beschrieben. Siehe zum Beispiel Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 und regelmäßige Aktualisierungen; die Serien METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Dritte Ausgabe, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Bd. 304, „Chromatin" (P. M. Wassarman und A. P. Wolffe, Hrgs.), Academic Press, San Diego, 1999; und METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Bd. 119, „Chromatin Protocols" (P. B. Becker, Hrg.) Humana Press, Totowa, 1999.
  • Definitionen
  • Chromatin ist die Nukleoproteinstruktur, welche das zelluläre Genom umfasst. Zelluläres Chromatin umfasst Nukleinsäure, in erster Linie DNA, und Protein, einschließlich Histonen und Nicht-Histon chromosomalen Proteinen. Der Hauptteil des eukaryotischen zellulären Chromatins liegt in Form von Nukleosomen vor, wobei ein Nukleosomkern etwa 150 DNA-Basenpaare umfasst, welche mit einem Octamer assoziiert sind, das jeweils zwei der Histone H2A, H2B, H3 und H4 umfasst; und Linker-DNA (von variabler Länge in Abhängigkeit vom Organismus) erstreckt sich zwischen Nukleosomkernen. Ein Molekül aus Histon H1 ist im Allgemeinen mit der Linker-DNA assoziiert. Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung soll der Ausdruck „Chromatin" alle Arten von zellulärem Nukleoprotein umfassen, sowohl prokaryotisch als auch eukaryotisch. Zelluläres Chromatin umfasst sowohl chromosomales als auch episomales Chromatin.
  • Chromatinmodifizierung oder Chromatin-Remodeling bezieht sich auf einen beliebigen Prozess, durch welchen die Struktur von Chromatin oder seiner Bestandteile verändert wird. Remodeling kann beispielsweise umfassen: die Entfernung oder Repositionierung von Nukleosomen, die Addition von Nukleosomen, Veränderungen in der Nukleosomdichte, Veränderungen hinsichtlich der DNA-Bahn entlang des Histonoctamers und/oder Veränderungen in Chromatinstruktur mit höherer Ordnung, wie beispielsweise Einwickeln des Chromatinsolenoids. Chromatinmodifizierung kann auch Modifizierungen von Histonen oder Nukleinsäure umfassen, welche nicht notwendigerweise die Struktur von Chromatin verändern, wie es durch gängige Verfahren untersuchbar ist. Beispielsweise sind sowohl Acetylierung oder Deacetylierung von Histonen, als auch die Methylierung oder Demethylierung von Nukleinsäure Beispiele für Chromatinmodifizierung.
  • Ein Chromosom, wie es dem Fachmann bekannt ist, ist ein Chromatinkomplex umfassend das vollständige oder einen Teil des Genoms einer Zelle. Das Genom einer Zelle ist oftmals durch ihren Karyotyp charakterisiert, wobei es sich um die Sammlung aller Chromosomen handelt, die das Genom der Zelle umfassen. Das Genom einer Zelle kann eines oder mehrere Chromosomen umfassen.
  • Ein Episom ist eine replizierende Nukleinsäure, ein Nukleoproteinkomplex oder eine andere Struktur, umfassend eine Nukleinsäure, welche nicht Teil des chromosomalen Karyotyps einer Zelle ist. Beispiele für Episome umfassen Plasmide und bestimmte virale Genome.
  • Eine Zielstelle ist eine Nukleinsäuresequenz, welche einen Teil einer Nukleinsäure definiert, an welchen ein Bindemolekül bindet, vorausgesetzt, dass ausreichende Bedingungen zur Bindung vorliegen. Beispielsweise ist die Sequenz 5'-GAATTC-3' eine Zielstelle für die Eco RI-Restriktionsendonuklease. Obwohl Bindung eines Moleküls an seine Zielstelle in einem nackten Nukleinsäuremolekül normalerweise auftritt, kann als Ergebnis irgendeines Aspekts der Chromatinstruktur, in welcher die Zielstelle lokalisiert ist, ein Bindungsmolekül zur Bindung an seine Zielstelle in zellulärem Chromatin unfähig sein, wobei der Aspekt die Zielstelle für das Bindungsmolekül unzugänglich macht. In anderen Fällen können zusätzlich zur Zielstelle Faktoren zur Bindung eines Moleküls an eine Nukleinsäure an der Zielstelle erforderlich sein. Beispielsweise kann die Bindung eines Moleküls an ein Polynukleotid umfassend eine Zielstelle sowohl eine bestimmte Nukleotidsequenz als auch eine bestimmte Proteinzusammensetzung in der Nachbarschaft oder in der Umgebung der Zielstelle erfordern. Bedingungen, wie beispielsweise die Temperatur, der pH-Wert und die Ionenstärke können die Bindung eines Moleküls an seine Zielstelle ebenfalls beeinflussen.
  • Es sind Bindestellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren bekannt. Siehe zum Beispiel Wingender et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:265-268 und die TRANSFAC-Transkriptionsfaktordatenbank unter http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/, abgerufen am 13. April 2000. Im Allgemeinen können sowohl Zielstellen für neu entdeckte Transkriptionsfaktoren als auch für andere Arten von exogenen Molekülen durch Verfahren, welche dem Fachmann wohl bekannt sind, bestimmt werden, wie beispielsweise durch elektrophoretischen Mobilitätverschiebungsassay (mobility shift assay), Exonuklease-Schutz exonuclease protection), DNase-Footprinting, chemisches Footprinting und/oder direkte Nukleotidsequenzbestimmung einer Bindungsstelle. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., supra, Kapitel 12.
  • Eine Bindungsstelle in zellulärem Chromatin ist eine Region, an welcher ein bestimmtes Molekül, wie beispielsweise ein Protein, an eine Zielstelle im Chromatin bindet. Eine Bindungsstelle umfasst im Allgemeinen eine Zielstelle, aber nicht jede Zielstelle bildet eine Bindungsstelle in zellulärem Chromatin. Beispielsweise kann eine Zielstelle durch eine oder mehrere chromosomale Komponenten, wie beispielsweise Histone oder Nicht-Histon Proteine verdeckt sein oder kann aufgrund von nukleosomaler Chromatinstruktur oder Chromatinstruktur höherer Ordnung für sein Bindungsmolekül unzugänglich gehalten sein. Andererseits kann das Vorliegen von einem oder mehreren chromosomalen Proteinen zusätzlich zu einer Zielstelle erforderlich sein, um eine Bindungsstelle zu definieren.
  • Eine zugängliche Region ist eine Stelle in einem Chromosom, einem Episom oder einer anderen zellulären Struktur umfassend eine Nukleinsäure, in welcher eine Zielstelle, die in der Nukleinsäure vorliegt, durch ein exogenes Molekül, das die Zielstelle erkennt, gebunden werden kann. Ohne dass es erwünscht ist durch eine beliebige bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass eine zugängliche Region eine Region ist, welche nicht in eine nukleosomale Struktur gepackt ist. Die eindeutige Struktur einer zugänglichen Region kann oftmals durch ihre Sensitivität für chemische und enzymatische Sonden, wie beispielsweise Nukleasen, detektiert werden.
  • Ein exogenes Molekül ist ein Molekül, welches normalerweise nicht in einer Zelle vorliegt, aber in eine Zelle durch eines oder mehrere genetische, biochemische oder andere Verfahren eingeführt werden kann. Ein „normales Vorliegen in der Zelle" wird bestimmt im Hinblick auf die besondere Entwicklungsstufe und die Umweltbedingungen der Zelle. Daher ist beispielsweise ein Molekül, welches nur während der embryonalen Entwicklung von Muskeln vorliegt, im Hinblick auf eine adulte Muskelzelle ein exogenes Molekül. Auf ähnliche Weise ist ein Molekül, welches durch einen Hitzeschock induziert wird, ein exogenes Molekül im Hinblick auf eine nicht mit Hitzeschock behandelte Zelle. Ein exogenes Molekül kann beispielsweise eine funktionierende Version eines fehlfunktionierenden endogenen Moleküls oder eine fehlfunktionierende Version eines normal funktionierenden endogenen Moleküls umfassen.
  • Ein exogenes Molekül kann unter anderem ein kleines Molekül sein, wie es beispielsweise durch ein kombinatorisches Chemieverfahren erzeugt wird, oder ein Makromolekül, wie beispielsweise ein Protein, eine Nukleinsäure, ein Kohlenhydrat, ein Lipid, ein Glycoprotein, ein Lipoprotein, ein Polysaccharid, ein beliebiges modifiziertes Derivat der oben genannten Moleküle oder ein beliebiger Komplex umfassend eines oder mehrere der oben genannten Moleküle. Nukleinsäuren umfassen DNA sowie RNA und können einzelsträngig oder doppelsträngig sein; sie können linear, verzweigt oder zirkulär sein; und sie können beliebig lang sein. Nukleinsäuren umfassen sowohl diejenigen, welche Duplexe bilden können als auch Triplex-bildende Nukleinsäuren. Siehe beispielsweise U.S.-Patente Nr. 5,176,996 und 5,422,251. Proteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf DNA-Bindungsproteine, Transkriptionsfaktoren, Chromatin-Remodeling-Faktoren, methylierte DNA-Bindungsproteine, Polymerasen, Methylasen, Demethylasen, Acetylasen, Deacetylasen, Kinasen, Phosphatasen, Integrasen, Rekombinasen, Ligasen, Topoisomerasen, Gyrasen und Helikasen.
  • Ein exogenes Molekül kann von der gleichen Molekülart wie ein endogenes Molekül sein, z.B. ein Protein oder eine Nukleinsäure, vorausgesetzt, dass es eine Sequenz aufweist, welche sich von der eines endogenen Moleküls unterscheidet. Beispielsweise kann eine exogene Nukleinsäure ein infizierendes virales Genom, ein Plasmid oder ein Episom umfassen, welches in eine Zelle eingeführt ist oder ein Chromosom, welches normalerweise nicht in der Zelle vorliegt. Verfahren zur Einführung von exogenen Molekülen in Zellen sind dem Fachmann bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Lipid-vermittelten Transfer (d.h. Liposomen, umfassend neutrale und kationische Lipide), Elektroporation, direkte Injektion, Zellfusion, Partikelbeschuss, Calciumphosphat-Copräzipitierung, DEAE-Dextran-vermittelten Transfer und durch virale Vektoren vermittelten Transfer.
  • Im Gegensatz dazu ist ein endogenes Molekül ein Molekül, welches normalerweise in einer bestimmten Zelle in einer bestimmten Entwicklungsstufe unter bestimmten Umweltbedingungen vorliegt. Beispielsweise kann eine endogene Nukleinsäure ein Chromosom umfassen, das Genom eines Mitochondriums, eines Chloroplasten oder einer anderen Organelle, oder eine natürlich vorkommende episomale Nukleinsäure. Darüber hinaus können endogene Moleküle Proteine, wie beispielsweise Transkriptionsfaktoren und Komponenten von Chromatin-Remodeling-Komplexen umfassen.
  • Ein Fusionsmolekül ist ein Molekül, in welchem zwei oder mehrere Untereinheitenmoleküle verknüpft sind, vorzugsweise kovalent. Die Untereinheitenmoleküle können von der gleichen chemischen Art an Molekül sein oder können verschiedene chemische Arten von Molekülen sein. Beispiele für die erste Art an Fusionsmolekül umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Fusionspolypeptide (z.B. eine Fusion zwischen einer ZFP-DNA-Bindungsdomäne und einer Transkriptionsaktivierungsdomäne) und Fusionsnukleinsäuren (z.B. eine Nukleinsäure, welche das oben beschriebene Fusionspolypeptid kodiert). Beispiele für die zweite Art an Fusionsmolekül umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, eine Fusion zwischen einer Triplex-bildenden Nukleinsäure und einem Polypeptid und eine Fusion zwischen einem Bindemittel an die Kleine Furche und einer Nukleinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Fusionsmolekül eine Nukleinsäure, welche eine ZFP-DNA-Bindungsdomäne in operativer Verknüpfung mit einer Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes oder eines funktionellen Fragments davon kodiert.
  • Ein Gen umfasst im Sinne der vorliegenden Offenbarung sowohl eine DNA-Region, welche ein Genprodukt kodiert (siehe unten) als auch DNA-Regionen, welche die Produktion des Genprodukts regulieren, unabhängig davon, ob derartige regulatorische Sequenzen benachbart zu kodierenden und/oder transkribierenden Sequenzen liegen. Entsprechend umfasst ein Gen, ist aber nicht notwendigerweise beschränkt auf, Promotorsequenzen, Terminatoren, Translationsregulationssequenzen, wie beispielsweise Ribosombindungsstellen und interne Ribosomeintrittsstellen, Enhancer, Silencer, Isolatoren, Grenzelemente Replikationsursprünge, Matrixanlagerungsstellen und Locuskontrollregionen.
  • Genexpression bezieht sich auf die Umwandlung der Information, welche in einem Gen enthalten ist, in ein Genprodukt. Ein Genprodukt kann das direkte Transkriptionsprodukt eines Gens sein (z.B. mRNA, tRNA, rRNA, Antisense-RNA, Ribozym, Struktur-RNA oder jede beliebige andere Art an RNA) oder ein Protein, welches durch Translation von mRNA erzeugt wird. Genprodukte umfassen auch RNAs, welche modifiziert werden durch Prozesse wie beispielsweise Capping, Polyadenylierung, Methylierung und Editierung, und Proteine, welche beispielsweise modifiziert werden durch Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, ADP-Ribosylierung, Myristilierung und Glycosylierung.
  • Modulierung von Genexpression bezieht sich auf eine Veränderung hinsichtlich der Aktivität eines Gens.
  • Modulierung von Expression kann umfassen, ist aber nicht beschränkt auf, Genaktivierung und Genrepression.
  • Genaktivierung ist ein beliebiger Prozess, welcher zu einem Anstieg der Produktion eines Genprodukts führt. Ein Genprodukt kann entweder RNA (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, mRNA, rRNA, tRNA und strukturelle RNA) oder ein Protein sein. Entsprechend umfasst Genaktivierung solche Prozesse, welche die Transkription eines Gens und/oder Translation von mRNA erhöhen. Beispiele für Genaktivierungsprozesse, welche die Transkription erhöhen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, solche, welche die Bildung eines Transkriptionsinitiationskomplexes erleichtern, solche, welche die Transkriptionsinitiationsrate erhöhen, solche, welche die Transkriptionselongationsrate erhöhen, solche, welche die Prozessivität für Transkription erhöhen und solche, welche die Transkriptionsrepression abbauen (durch beispielsweise Blockieren der Bindung eines Transkriptionsrepressors). Genaktivierung kann beispielsweise sowohl die Hemmung von Repression als auch die Stimulation von Expression über ein bestehendes Niveau hinaus begründen. Beispiele für Genaktivierungsprozesse, welche die Translation erhöhen, umfassen solche, welche die Translationsinitiation erhöhen, solche, welche die Translationselongation erhöhen und solche, welche die mRNA-Stabilität erhöhen. Im Allgemeinen umfasst Genaktivierung eine beliebige detektierbare Erhöhung hinsichtlich der Produktion eines Genprodukts, vorzugsweise hinsichtlich der Produktion eines Genprodukts um das etwa 2-fache, stärker bevorzugt vom etwa 2- bis etwa 5-fachen oder einer beliebigen ganzen Zahl dazwischen, stärker bevorzugt zwischen dem etwa 5- und dem etwa 10-fachen oder einer beliebigen ganzen Zahl dazwischen, nochmals stärker bevorzugt zwischen dem etwa 10- und dem etwa 20-fachen oder einer beliebigen ganzen Zahl dazwischen, nochmals stärker bevorzugt zwischen dem etwa 20- und dem etwa 50-fachen oder einer beliebigen ganzen Zahl dazwischen, stärker bevorzugt zwischen dem etwa 50- und etwa 100-fachen oder einer beliebigen ganzen Zahl dazwischen, stärker bevorzugt dem 100-fachen oder mehr.
  • Genrepression ist ein beliebiger Prozess, welcher zu einer Abnahme hinsichtlich der Produktion eines Genprodukts führt. Ein Genprodukt kann entweder RNA (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, mRNA, rRNA, tRNA und strukturelle RNA) oder ein Protein sein. Entsprechend umfasst Genrepression solche Prozesse, welche die Transkription eines Gens und/oder die Translation von mRNA erniedrigen. Beispiele für Genrepressionsprozesse, welche die Transkription erniedrigen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf solche, welche die Bildung eines Transkriptionsinitiationskomplexes hemmen, solche, welche die Transkriptionsinitiationsrate erniedrigen, solche, welche die Transkriptionselongationsrate erniedrigen, solche, welche die Prozessivität von Transkription erniedrigen und solche, welche der Transkriptionsaktivierung entgegenwirken (durch beispielsweise Blockieren der Bindung eines Transkriptionsaktivators). Genrepression kann beispielsweise sowohl die Unterbindung von Aktivierung als auch die Hemmung von Expression unter ein bestehendes Niveau begründen. Beispiele für Genrepressionsprozesse, welche die Translation erniedrigen, umfassen solche, welche die Translationsinitiation erniedrigen, solche, welche die Translationselongation erniedrigen und solche, welche die mRNA-Stabilität erniedrigen.
  • Transkriptionsrepression umfasst sowohl reversible als auch irreversible Inaktivierung von Gentranskription. Im Allgemeinen umfasst Genrepression jede beliebige detektierbare Abnahme hinsichtlich der Produktion eines Genprodukts, vorzugsweise eine Abnahme hinsichtlich der Produktion eines Genprodukts um das etwa 2-fache, stärker bevorzugt vom etwa 2-fachen bis etwa 5-fachen oder eine beliebige ganze Zahl dazwischen, stärker bevorzugt zwischen dem etwa 5- und dem etwa 10-fachen oder eine beliebige ganze Zahl dazwischen, nochmals stärker bevorzugt zwischen dem etwa 10- und etwa 20-fachen oder einer beliebigen ganzen Zahl dazwischen, nochmals stärker bevorzugt zwischen dem etwa 20- und dem etwa 50-fachen oder einer beliebigen ganzen Zahl dazwischen, stärker bevorzugt zwischen dem etwa 50- und dem etwa 100-fachen oder einer beliebigen ganzen Zahl dazwischen, stärker bevorzugt zwischen dem 100-fachen oder mehr. Am stärksten bevorzugt führt Genrepression zur vollständigen Hemmung von Genexpression, so dass kein Genprodukt detektierbar ist.
  • Eukaryotische Zellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Pilzzellen (wie beispielsweise Hefe), Pflanzenzellen, Tierzellen, Säugerzellen und menschliche Zellen.
  • Eine Region von Interesse ist eine beliebige Region von eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin, wie beispielsweise ein Gen oder eine nicht-kodierende Sequenz innerhalb oder in Nachbarschaft zu einem Gen, in welcher es wünschenswert ist, beispielsweise die Chromatinstruktur zu modifizieren und/oder ein exogenes Molekül zu binden. Eine Region von Interesse kann in einem Chromosom oder in einem infizierenden viralem Genom vorliegen.
  • Eine Region von Interesse kann innerhalb der kodierenden Region eines Gens sein, innerhalb von transkribierten nicht-kodierenden Regionen, wie beispielsweise Leadersequenzen, Trailersequenzen oder Introns, oder in nicht-transkribierten Regionen, entweder stromaufwärts oder stromabwärts von der kodierenden Region.
  • Die Ausdrücke „operative Verknüpfung" und „operativ verknüpft" werden mit Bezug zu einer Nebeneinanderstellung von zwei oder mehr Komponenten (wie beispielsweise Sequenzelementen) verwendet, in welcher die Komponenten so angeordnet sind, dass beide Komponenten normal funktionieren und die Möglichkeit erlauben, dass wenigstens eine der Komponenten eine Funktion vermitteln kann, welche auf wenigstens eine der anderen Komponenten ausgeübt wird. Zur Veranschaulichung ist eine Transkriptionsregulationssequenz, beispielsweise ein Promotor, operativ verknüpft mit einer kodierenden Sequenz, wenn die Transkriptionsregulationssequenz das Transkriptionsniveau der kodierenden Sequenz in Reaktion auf das Vorliegen oder die Abwesenheit von einem oder mehreren Transkriptionsregulationsfaktoren kontrolliert. Eine operativ verknüpfte Transkriptionsregulationssequenz ist im Allgemeinen cis mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, muss aber nicht direkt benachbart dazu sein. Beispielsweise kann ein Enhancer eine Transkriptionsregulationssequenz bilden, welche mit einer kodierenden Sequenz operativ verknüpft ist, auch wenn sie nicht benachbart zueinander sind.
  • Im Hinblick auf Fusionspolypeptide kann sich der Ausdruck „operativ verknüpft" auf die Tatsache beziehen, dass jede der Komponenten die gleiche Funktion in der Verknüpfung zu der anderen Komponente ausführt, wie es wäre, wenn sie nicht so verknüpft wäre. Beispielsweise befinden sich im Hinblick auf ein Fusionspolypeptid, in welchem eine ZFP-DNA-Bindungsdomäne mit einer Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes (oder einem funktionellen Fragment davon) fusioniert ist, die ZFP-DNA-Bindungsdomäne und die Komponente des Chromatin-Remodeling-Komplexes (oder ein funktionelles Fragment davon) in operativer Verknüpfung, wenn im Fusionspolypeptid die ZFP-DNA-Bindungsdomäne ihre Zielstelle und/oder ihre Bindestelle binden kann, während die Komponente des Chromatin-Remodeling-Komplexes (oder ein funktionelles Fragment davon) mit anderen Elementen ihres verwandten Chromatin-Remodeling-Komplexes wechselwirken kann.
  • Ein funktionelles Fragment eines Proteins, eines Polypeptids oder einer Nukleinsäure ist ein Protein, ein Polypeptid oder eine Nukleinsäure dessen/deren Sequenz nicht identisch ist mit dem Volllängen-Protein, dem Volllängen-Polypeptid oder der Volllängen-Nukleinsäure, aber noch die gleiche Funktion beibehält wie das Volllängen-Protein, das Volllängen-Polypeptid oder die Volllängen-Nukleinsäure. Ein funktionelles Fragment kann mehr, weniger oder die gleiche Zahl an Resten wie das korrespondierende native Molekül besitzen und/oder kann eine oder mehrere Aminosäure- oder Nukleotidsubstitutionen enthalten. Verfahren zur Bestimmung der Funktion einer Nukleinsäure (z.B. kodierende Funktion, Fähigkeit, an eine andere Nukleinsäure zu hybridisieren) sind im Fachbereich wohl bekannt. Auf ähnliche Art und Weise sind Verfahren zur Bestimmung der Proteinfunktion wohl bekannt. Beispielsweise kann die DNA-Bindungsfunktion eines Polypeptids durch beispielsweise Filterbindung, elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays, oder Immunpräzipitierungsassays bestimmt werden. Siehe Ausubel et al., oben. Die Fähigkeit eines Proteins, mit einem anderen Protein wechselzuwirken.
  • DNA-Bindungsdomänen
  • Die hierin offenbarten Zusammensetzungen und in vitro-Verfahren umfassen Fusionen zwischen einer Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, welche entwickelt oder ausgewählt worden ist, die Zielstelle zu erkennen, und einer enzymatischen Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes, welche kovalent Histone modifiziert oder Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität aufweist. In zusätzlichen Ausführungsformen umfassen die hierin offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren Fusionen zwischen einer DNA-Bindungsdomäne und einer Domäne, welche an der Modulierung von Genexpression teilnimmt, wie beispielsweise eine Transkriptionsaktivierungsdomäne oder eine Transkriptionsrepressionsdomäne. Eine DNA-Bindungsdomäne kann eine beliebige molekulare Einheit umfassen, welche sequenzspezifisch eine chromosomale DNA binden kann. Bindung kann durch elektrostatische Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen oder jede andere beliebige Art und Weise chemischer Wechselwirkung vermittelt werden. Beispiele für Gruppen, welche einen Teil einer DNA-Bindungsdomäne umfassen können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Bindemittel an die Kleine Furche, Bindemittel an die große Furche, Antibiotika, interkalierende Agenzien, Peptide, Polypeptide, Oligonukleotide und Nukleinsäuren. Ein Beispiel für eine DNA-bindende Nukleinsäure ist ein Triplex-bildendes Oligonukleotid.
  • Bindemittel an die Kleine Furche umfassen Substanzen, welche aufgrund ihrer sterischen und/oder elektrostatischen Eigenschaften vorzugsweise mit der kleinen Furche von doppelsträngigen Nukleinsäuren wechselwirken. Bestimmte Bindemittel an die Kleine Furche weisen eine Bevorzugung für bestimmte Sequenzzusammensetzungen auf. Beispielsweise sind Netropsin, Distamycin und CC-1065 Beispiele von Bindemitteln an die Kleine Furche, welche spezifisch an AT-reiche Sequenzen binden, insbesondere Serien von A oder T.
  • Viele Antibiotika sind dafür bekannt, dass sie ihre Wirkungen durch Bindung an DNA ausüben. Bindung von Antibiotika an DNA ist oftmals sequenzspezifisch oder zeigt Sequenzpräferenzen.
  • Actinomycin ist beispielsweise ein relativ GC-spezifisches DNA-Bindungsagens.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine DNA-Bindungsdomäne ein Polypeptid. Bestimmte Peptid- und Polypeptidsequenzen binden an doppelsträngige DNA in einer sequenzspezifischen Weise. Beispielsweise partizipieren Transkriptionsfaktoren bei der Transkriptionsinitiation durch RNA-Polymerase II über sequenzspezifische Wechselwirkungen mit DNA in der Promotor-Region und/oder Enhancer-Region von Genen. Für definierte Regionen innerhalb der Polypeptidsequenz von verschiedenen Transkriptionsfaktoren wurde gezeigt, dass sie für sequenzspezifische Bindung an DNA verantwortlich sind. Siehe zum Beispiel Pabo et al. (1992) Ann. Rev. Biochem. 61:1053-1095 und darin zitierte Referenzen. Diese Regionen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Motive, welche bekannt sind als Leucinzipper, Helix-Loop-Helix (HLH)-Domänen, Helix-Turn-Helix-Domänen, Zinkfinger, β-Faltblattmotive, Steroidrezeptormotive, bZIP-Domänen-Homeodomänen, AT-Hooks und andere. Die Aminosäuresequenzen dieser Motive sind bekannt und in einigen Fällen wurden Aminosäuren, welche für die Sequenzspezifität entscheidend sind, identifiziert. Polypeptide, welche in einem anderen Prozess, bei dem DNA eine Rolle spielt, eine Rolle spielen, wie beispielsweise Replikation, Rekombination und Reparatur, weisen auch Regionen auf, welche hinsichtlich spezifischer Wechselwirkungen mit DNA eine Rolle spielen. Peptidsequenzen, welche bei spezifischer DNA-Erkennung eine Rolle spielen, wie beispielsweise diejenigen, welche in Transkriptionsfaktoren gefunden werden, können erhalten werden durch rekombinante DNA-Klonierungs- und Expressionstechniken oder durch chemische Synthese, und können an andere Komponenten eines Fusionsmoleküls durch bekannte Verfahren angebracht werden.
  • Proteine, welche Methylbindungsdomänen oder funktionelle Fragmente davon enthalten, können ebenfalls als DNA-Bindungsdomänen verwendet werden. Proteine mit Methylbindungsdomänen erkennen und binden an CpG-Dinukleotidsequenzen, in welchen der C-Rest methyliert ist. Proteine, welche eine Methylbindungsdomäne enthalten, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MeCP1 und MeCP2. Siehe zum Beispiel Bird et al. (1999) Cell 99:451-454.
  • Darüber hinaus können DNA-Methyltransferasen, welche die 5-Position von C-Resten in CpG-Dinukleotiden methylieren, wie beispielsweise DNMT1, DNMT2, DNMT3a und DNMT3b oder funktionelle Fragmente davon als DNA-Bindungsdomäne verwendet werden. Ferner können Enzyme, welche methyliertes CpG demethylieren, oder funktionelle Fragmente davon, als DNA-Bindungsdomäne verwendet werden. Fremant et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:2375-2380; Okano et al. (1998) Nature Genet. 19:219-220; Bhattacharya et al. (1999) Nature 397:579-583; und Robertson et al. (2000) Carcinogenesis 21:461- 467.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst eine DNA-Bindungsdomäne eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne. Siehe beispielsweise Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes et al. (1993) Scientific American Feb.:56-65; und Klug (1999) J. Mol. Biol. 293:215-218. In einer Ausführungsform wird eine Zielstelle für eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne identifiziert gemäß den Stellenauswahlregeln, welche in der eigenen Druckschrift WO 00/42219 offenbart sind. ZFP-DNA-Bindungsdomänen werden entwickelt und/oder ausgewählt, um eine bestimmte Zielstelle zu erkennen, wie es beschrieben ist in den eigenen Druckschriften WO 00/42219; WO 00/41566; und U.S. Seriennr. 09/444,241, eingereicht am 19. November 1999, und 09/535,088, eingereicht am 23. März 2000; als auch die U.S.-Patente 5,789,538; 6,007,408; und 6,013,453; sowie die PCT-Veröffentlichungen WO 95/19431, WO 98/54311, WO 00/23464 und WO 00/27878.
  • Bestimmte DNA-Bindungsdomänen können an DNA binden, welche in Nukleosomen gepackt ist. Siehe beispielsweise Cordingley et al. (1987) Cell 48:261-270; Pina et al. (1990) Cell 60:719-731; und Cirillo et al. (1998) EMBO J. 17:244-254. Bestimmte ZFP-enthaltende Proteine, wie beispielsweise Elemente der Kernhormonrezeptorsuperfamilie, können an DNA-Sequenzen binden, welche in Chromatin gepackt sind. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf den Glucocorticoidrezeptor und den Thyroidhormonrezeptor. Archer et al. (1992) Science 255:1573-1576; Wong et al. (1997) EMBO J. 16:7130-7145. Andere DNA-Bindungsdomänen, welche bestimmte ZFP-enthaltende Bindungsdomänen umfassen, erfordern zur Bindung eine zugänglichere DNA. Im letzteren Fall kann die Bindungsspezifität für die DNA-Bindungsdomäne durch Identifizierung zugänglicher Regionen in zellulärem Chromatin bestimmt werden. Zugängliche Regionen können bestimmt werden, wie es beschrieben ist in der eigenen U.S.-Patentanmeldung mit dem Titel „Databases of Accessible Region Sequences; Methods of Preparation and Use Thereof," Referenz S15, welche am gleichen Datum wie vorliegende Anmeldung eingereicht wurde. Eine DNA-Bindungsdomäne wird anschließend entworfen und/oder ausgewählt, um an eine Zielstelle innerhalb der zugänglichen Region zu binden.
  • Chromatin-Remodeling-Komplexe
  • Es sind zwei Hauptarten von Chromatinmodifizierung beschrieben worden. Die erste ist von kovalenter Modifizierung abhängig. Kovalente Modifizierung von Histonen geschieht durch Prozesse, wie beispielsweise Acetylierung und Deacetylierung. Für kovalente Modifizierung von DNA steht beispielhaft die Methylierung von Cytosinresten in CpG-Dinukleotiden. Die zweite Art der Modifizierung führt zu Veränderungen in der Nukleosom-Lokalisierung und/oder -Konformation und beruht auf der Aktivität der ATP-getriebenen Chromatin-Remodeling-Maschinen. Beide Arten an Chromatinmodifizierung werden in vivo durch Multiproteinkomplexe durchgeführt. Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung können Proteine, die in einer der dieser beiden Arten von Chromatinmodifizierung eine Rolle spielen, eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes umfassen.
  • Modifizierungen der ersten Art umfassen oftmals Histonacetylierung, katalysiert durch einen Komplex, welcher eine Histonacetyltransferase (HAT) enthält, oder Histondeacetylierung, katalysiert durch einen Komplex, welcher eine Histondeacetylase (HDAC) enthält. Ein Beispiel für einen Komplex, welcher bei dieser Art von Chromatinmodifizierung eine Rolle spielt, ist ein Histondeacetylasekomplex, wobei Beispiele hierfür die SIN3 und Mi-2-Komplexe umfassen. Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450. Diese Komplexe umfassen im Allgemeinen sowohl eine oder mehrere enzymatische Komponenten (d.h. ein HDAC) als auch eine oder mehrere nicht-enzymatische Komponenten. Deshalb kann eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes entweder eine enzymatische oder eine nicht-enzymatische Komponente (oder ein funktionelles Fragment einer enzymatischen oder nicht-enzymatischen Komponente) eines Komplexes sein, welcher bei der kovalenten Modifizierung von Histonen eine Rolle spielt.
  • Die zweite Art an Chromatinmodifizierung wird durch Multiprotein-Chromatin-Remodeling-Komplexe vermittelt, weist Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität auf und katalysiert verschiedene Arten an Modifizierung von Chromatinstruktur (siehe unten). Im Allgemeinen umfasst ein Remodeling-Komplex eine enzymatische Komponente (eine ATPase-Proteinuntereinheit) und eine oder mehrere nicht-enzymatische Proteinuntereinheiten. Die ATPase-Untereinheiten werden in drei Hauptfamilien eingruppiert: die SWI/SNF-Familie, die ISWI-Familie und die Mi-2/CHD-Familie. Siehe Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446. Eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes kann eines seiner konstituierenden Proteine oder ein funktionelles Fragment davon umfassen. Deshalb kann eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes eine enzymatische Komponente oder eine nicht-enzymatische Komponente sein.
  • Enzymatische Komponenten von Chromatin-Remodeling-Komplexen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die folgenden ATPasen: SWI2/SNF2, STH1, BRM, hBRM, BRG1, Mi-2/CHD, ISW1, ISW2, ISWI und hSNF2h. Tyler et al., oben; Armstrong et al. (1998) Curr. Opin. Genet. Dev. 8:165-172; Guschin et al. (1999) Curr. Biol. 9:R742-746; und Wolffe et al. (2000) J. Struct. Biol. 129:102-122.
  • Modifizierungen in der Chromatinstruktur umfassen sowohl solche, die chromosomale Sequenzen für Regulationsfaktoren zugänglicher gestalten (d.h. Bildung von „offenem" Chromatin) als auch solche, welche chromosomale Sequenzen weniger zugänglich gestalten (d.h. Bildung von „geschlossenem" Chromatin). Solche Modifizierungen können beispielsweise umfassen die Entfernung von Nukleosomen von DNA, die Ablagerung von Nukleosomen auf DNA, die Repositionierung von Nukleosomen, Veränderungen hinsichtlich des Nukleosomenabstands, Veränderungen hinsichtlich der Nukleosomdichte, Veränderungen hinsichtlich des Grads und/oder der Art der Wechselwirkung zwischen DNA und Histonen im Nukleosom, Veränderungen hinsichtlich des Verlaufs von DNA entlang der Oberfläche des Nukleosoms und/oder Veränderungen hinsichtlich einer Chromatinstruktur höherer Ordnung, wie beispielsweise ein Aufwinden des Chromatinsolenoids.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfassen die hierin offenbarten Zusammensetzungen und in vitro-Verfahren Fusionen zwischen einer Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, welche entworfen oder ausgewählt worden ist, um die Zielstelle zu erkennen und einer enzymatischen Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes, welcher Histone kovalent modifiziert oder Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität aufweist, wie oben beschrieben, oder ein Polynukleotid, welches eine derartige Fusion kodiert.
  • Verschiedene Chromatin-Remodeling-Komplexe, ihre Komponenten und Aktivitäten sind in mehreren Organismen und Zelltypen identifiziert und charakterisiert worden. Komplexe, welche als SWI/SNF, RSC, ISW1 und ISW2 bekannt sind, sind in Hefe isoliert und charakterisiert worden.
  • In Drosophila sind die NURF-, CHRAC-, ACF- und Brahma (dSWI/SNF oder BRM)-Komplexe isoliert und charakterisiert worden. Chromatin-Remodeling-Komplexe aus humanen Zellen, welche als brm/BRG (hSWI/SNF), NURD und RSF bezeichnet werden, sind isoliert und charakterisiert worden. Siehe beispielsweise Cairns (1998) Trends Biochem. Sci. 23:20-25; Murchardt et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:185-197; Kingston et al. (1999) Genes. Devel. 13:2339-2352 und ihre zitierten Referenzen. Da sich dieses Feld weiterentwickelt, ist es wahrscheinlich, dass zusätzliche Chromatin-Remodeling-Komplexe und ihre Komponenten entdeckt und charakterisiert werden; die Verwendung solcher neu entdeckter Komponenten von Chromatin-Remodeling-Komplexen ist von der vorliegenden Offenbarung umfasst. Es werden nun beispielhafte Chromatin-Remodeling-Komplexe und ihre Komponenten beschrieben.
  • A. SWI/SNF
  • Der SWI/SNF-Chromatin-Remodeling-Komplex von Hefe umfasst die SWI2/SNF2-Helicase/ATPase und Produkte der SNF5-, SWI3-, SWP73-, ARP7-, ARP9-, SWI1-, SNF6-, SWP82-, SWP29- und SNF11-Gene. Arp7 und Arp9 sind mit Actin im Zusammenhang stehende Proteine. (Das SWP29-Genprodukt ist auch sowohl als TFG-3 oder TAF30 bekannt). Peterson et al. (2000) Curr. Opin. Genet. Devel. 10:187-192.
  • B. SWI/SNF-Homologe
  • Mehrere Chromatin-Remodeling-Komplexe sind aufgrund dessen, dass sie eine Untereinheit mit Homologie zu SWI2 besitzen, isoliert worden. Diese umfassen den Brahma (BRM)-Komplex in Drosophila, die brm/BRG-Komplexe in Säugern, und andere.
  • 1. Brahma
  • Der Drosophila-Brahma (brm)-Komplex (auch bekannt als dSWI/SNF) enthält sowohl eine ATPase-Untereinheit, homolog zu SWI2/SNF2, welche als Brahma (brm) bezeichnet wird, als auch SNR1, BAP155 (Moira), BAP60, BAP111, BAP55, BAP74 und BAP47/ACT1/ACT2-Untereinheiten.
  • 2. brm/BRG-Komplexe aus Säuger
  • In Menschen und Mäusen wurden mehrere Komplexe umfassend eine von zwei SWI2/SNF2-homologen ATPasen charakterisiert. In Mäusen enthalten Chromatin-Remodeling-Komplexe eines der beiden SWI2/SNF2-Homologen mBRM oder mBRG-1, zusammen mit Untereinheiten, welche als mSNF5 und mBAF60a bezeichnet werden. Auf ähnliche Weise liegt in humanen Zellen eines der beiden SWI2/SNF2-Homologen hBRM (auch bekannt als hSNF2α) oder BRG-1 (auch bekannt als hSNF2β) in Chromatin-Remodeling-Komplexen vor, welche auch die hSNF5-(auch bekannt als INI-1 ), hBAF170-, hBAF155-, hBAF60a-(oder hBAF60b- oder hBAF60c-), hBAF57-, β-Actin-, hBAF53-, hBAF250-(auch bekannt als p270) und hBAF110-Untereinheiten enthalten.
  • 3. Chromatin-Remodeling-Komplexe, welche bei der Regulierung von humanen Globingenen aktiv sind
  • Mehrere Chromatin-Remodeling-Komplexe wurden aufgrund ihrer Beteiligung an der Regulation von Globingenexpression in humanen Zellen entdeckt. Diese schließen ein E-RC1, umfassend BRG-1 und das BAF57-Protein, und den PYR-Komplex, umfassend hSNF5/INI1, BAF57, BAF60a und BAF170.
  • 4. RSC
  • Der RSC-Komplex („remodeliert die Struktur von Chromatin"), welcher zuerst in Hefe identifiziert wurde, ist ein Komplex mit 15 Untereinheiten, umfassend die SWI2/SNF2-homologe ATPase STH1, zusammen mit SFH-1, RSC-8, mit Actin in Zusammenhang stehende Proteine, RSC-6 und SAS-5. Zwei kürzlich charakterisierte Untereinheiten von RSC, welche mit Rsc1 und Rsc2 bezeichnet werden, enthalten jeweils zwei Bromodomänen, eine BAH-(„Bromo-benachbarte Homologie") Domäne und ein A/T-Hook-Motiv, und partizipieren deshalb wahrscheinlich an der Wechselwirkung zwischen dem RSC-Komplex und Chromatin. Cairns et al. (1999) Mol. Cell 4:715-723.
  • 5. ATRX- und verwandte Proteine
  • Es wurde eine Familie von Helicase/ATPase-Proteinen mit Homologie zu SNF2 beschrieben. Diese Proteine enthalten sieben konservierte Domänen und spielen in einer Reihe von zellulären Funktionen eine Rolle, einschließlich Transkription, Rekombination und Reparatur. Das Säuger-ATRX-Protein ist ein Beispiel für diese Gruppe von Proteinen. Siehe Picketts et al. (1996) Hum. Mol. Genet. 5:1899-1907.
  • C. ISWI-enthaltende Komplexe
  • Mehrere Chromatin-Remodeling-Maschinen, welche anfänglich in Drosophila-Zellen charakterisiert wurden; enthalten eine ATPase-Untereinheit mit Homologie zu Hefe-SWI2, bekannt als ISWI („Imitat-SWI").
  • 1. NURF
  • NURF (Nukleosom-Remodeling-Faktor) ist ein Komplex aus vier Polypeptiden, der aus Drosophila isoliert wurde, welcher ATP-abhängig Chromatin remodulieren kann. Remodeling durch NURF ist Sarkosyl-sensitiv und Nukleosom-abhängig (insbesondere ist es abhängig von Histonenden) und kann die Bindung von Transkriptionsfaktoren an Chromatin erleichtern. Tsukiyama et al. (1995) Cell 83:1011-1020. Die Komponenten von NURF schließen ein ISWI (eine SWI2-verwandte DNA-abhängige ATPase, auch bekannt als NURF-140), NURF-38, NURF-55 und NURF-215. Zusätzliche Eigenschaften des NURF-Komplexes werden in Sandaltzopoulos et al. (1999) Meth. Enzymology 304:757-765 und darin zitierten Referenzen offenbart.
  • 2. CHRAC
  • CHRAC (Chromatin-Zugänglichkeitskomplex) (Chromatin Accessibility Complex) besitzt ATP-abhängige Nukleosom-Abstands-gebende Aktivität (spacing activity) und vermittelt ATP-abhängige Zugänglichkeit von Chromatin für Restriktionsendonukleasen. Varga Weisz et al. (1995) EMBO J. 14:2209-2216; Varga Weisz et al. (1997) Nature 388:598-602. Der CHRAC-Komplex umfasst die ISWI-ATPase und vier zusätzliche Polypeptide: p15, p20, p175 und DNA-Topoisomerase II.
  • 3. ACF
  • Der ACF-Komplex (ATP verwendender Chromatin-Zusammensetzungs- und Remodeling-Faktor) (ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor), welcher in Drosophila charakterisiert ist, kann die Bindung von Transkriptionsaktivatoren an Chromatin erleichtern und Einfluss auf den Nukleosomenabstand nehmen. Ito et al. (1997) Cell 90:145-155. ACF enthält die ISWI-ATPase und drei zusätzliche Polypeptide: p17, ACFI (p185) und ACFII (p170).
  • 4. RSF
  • Der RSF-Komplex (Remodeling- und Abstandsfaktor) (remodeling and spacing factor), welcher in humanen Zellen gefunden wird, enthält das ISWI-homologe hSNF2h und eine Untereinheit, welche als p325 bekannt ist. Seine Aktivitäten umfassen ATP-abhängig Nukleosom-Remodeling und Nukleosomabstandsgebung. LeRoy et al. (1998) Science 282:1900-1904.
  • 5. ISW1
  • Chromatin-Remodeling-Komplexe in Hefe, mit ATPase-Untereinheiten, welche zu Drosophila ISWI-ATPase homolog sind, umfassen ISW1 und ISW2. ISW1 enthält die ISW1-ATPase-Untereinheit, p74, p105 und p110. ISW1 ist dahingehend charakterisiert worden, dass es Nukleosom-stimulierte ATPase-Aktivität und ATP-abhäng Nukleosom-spaltende und -abstandsgebende Aktivität besitzt. Tsukiyama et al. (1999) Genes Dev. 13:686-697.
  • 6. ISW2
  • Der Hefe-ISW2-Komplex enthält die ISW2-ATPase zusammen mit einer zweiten Untereinheit, welche ein Molekulargewicht von 140 kD aufweist. ISW2 besitzt Nukleosom-stimulierte ATPase-Aktivität und ATP-abhängige Nukleosom-Spaltungsaktivität. Tsukiyama et al. (1999) oben.
  • 7. WCRF
  • Der WCRF-Chromatin-Remodeling-Komplex wurde aus humanen (HeLa-) Zellen isoliert und enthält eine ISWI-homologe ATPase, welche als WCRF 135 (SNF2h) bekannt ist, sowie eine Untereinheit, welche als WCRF 180 bekannt ist. WCRF 180 weist mehrere Kennzeichnen eines Transkriptionsfaktors auf, einschließlich einer Heterochromatinlokalisierungsdomäne, eines PHD-Fingers (eine Cystein-reiche Zink-Bindungsdomäne) und eine Bromodomäne (eine Domäne, von welcher beschrieben wurde, dass sie bei Wechselwirkung mit Histonen eine Rolle spielt). Bochar et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:1038-1043; Jacobsen et al. (2000) Science 288:1422-1425.
  • D. Mi-2-haltige Komplexe
  • Chromatin-Remodeling-Komplexe aus humanen (NRD/NURD-Komplex) und amphibischen Zellen (Mi-2-Komplex) enthalten eine Nukleosom-abhängige ATPase-Aktivität, welche als Mi-2 bezeichnet wird (auch als CHD bekannt). Zusätzliche Proteinkomponenten des amphibischen Mi-2-Komplexes umfassen Mta1-like (ein DNA-Bindungsprotein, welches homolog zu Metastasen-assoziiertem Protein ist), RPD3 (das amphibische Homologe zu den Histondeacetylasen HDAC1 und HDAC2), RbAp48 (ein Protein, welches mit Histon H4 wechselwirkt) und MBD3 (ein Protein, welches eine methylierte CpG-Bindungsdomäne enthält). Der amphibische Komplex enthält zusätzlich eine Serin- und Prolin-reiche Untereinheit, p66. Die Aktivitäten des amphibischen Mi-2-Komplexes umfassen eine Nukleosom-abhängige ATPase, welche nicht durch freie Histone oder DNA, translationale Bewegung von Histonoctameren relativ zur DNA, und Deacetylierung von Kernhistonen innerhalb eines Nukleosoms stimuliert wird. Guschin et al. (2000) Biochemistry 39:5238-5245. Insofern als RbAp48 eine Schlüsselstrukturkomponente des Mi-2-Komplexes zu umfassen scheint, erscheint es zur Fusion mit einer DNA-Bindungsdomäne zur Verwendung in den hierin offenbarten Verfahren insbesondere geeignet.
  • Menschliche NRD/NURD-Komplexe enthalten, zusätzlich zu Mi-2, sowohl Homologe des amphibischen Mta1-like (MTA-2), RPD3 (HDAC1 und HDAC2), RbAp48 und MBD3, als auch zusätzliche Proteine. Siehe Zhang et al. (1999) Genes Dev. 13:1924-1935; und Kornberg et al. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:148-151.
  • E. DNA-Methyltransferasen und methylierte DNA-Bindungsproteine
  • Wie oben beschrieben ist das Protein MBD3 mit Methyl-Bindungsdomäne eine Komponente von Mi-2-haltigen Chromatin-Remodeling-Komplexen. MBD3 und verwandte Proteine mit Methyl-Bindungsdomäne erkennen und binden an CpG-Dinukleotidsequenzen, in welchen der C-Rest methyliert ist. Deshalb können MBD-Proteine Histondeacetylasen an Regionen von Chromatin rekrutieren, welche reich an methyliertem CpG sind. Entsprechend kann ein MBD-Protein eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes umfassen. Proteine, welche eine Methyl-Bindungsdomäne enthalten, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MeCP1 und MeCP2. Siehe zum Beispiel Bird et al. (1999) Cell 99:451-454.
  • Darüber hinaus können DNA-Methyltransferasen, welche die 5-Position von C-Resten in CpG-Dinukleotiden methylieren, wie beispielsweise DNMT1, DNMT2, DNMT3a und DNMT3b als Komponenten eines Chromatin-Remodeling-Komplexes verwendet werden.
  • Nicht alle Remodeling-Komplexe weisen die gleichen Aktivitäten und die gleichen Wirkungen auf die Chromatinstruktur auf. Es ist möglich, dass wenn sensitivere Assayverfahren entwickelt werden und/oder lockerer gebundene Untereinheiten oder Zugänglichkeitsfaktoren identifiziert werden, herausgefunden wird, dass die verschiedenen Chromatin-Remodeling-Komplexe gemeinsame Aktivitäten besitzen. Entsprechend sollten die hierin einzelnen Chromatin-Remodeling-Komplexen zugeschriebenen Aktivitäten nicht als limitierend verstanden werden.
  • Gleichwohl erscheint es aufgrund der heute zur Verfügung stehenden Information, dass jeder Zelltyp eine Vielzahl an Chromatin-Remodeling-Komplexen enthält, welche bestimmte gemeinsame Untereinheiten teilen, und dass die Zusammensetzung eines Chromatin-Remodeling-Komplexes mit dem Zelltyp variieren kann. Die Zahl an Polypeptiduntereinheiten in einem Chromatin-Remodeling-Komplex variiert über einen breiten Bereich, von zwei in den ISW2- und RSF-Komplexen bis zu über 15 im RSC-Komplex aus Hefe. Es scheint auch der Fall zu sein, dass verschiedene Chromatin-Remodeling-Komplexe teilweise überlappende Aktivitäten aufweisen (d.h. dass zwischen verschiedenen Chromatin-Remodeling-Komplexen ein Grad an funktioneller Redundanz existiert). Die vorliegende Offenbarung ist deshalb gedacht, beliebige und alle Polypeptide, welche in einer beliebigen Art von Chromatin-Remodeling-Komplex vorkommen, welche gegenwärtig bekannt sind und welche noch zu entdecken sind, zu umfassen.
  • Histonacetylase- und -deacetlyasekomplexe
  • Beim Prozess der Genaktivierung geht die Bindung von Chromatin-Remodeling-Komplexen an Chromatin im Allgemeinen der Bindung von Histonacetyltransferase (HAT) und/oder Histondeacetylase (HDAC) voraus, was darauf hindeutet, dass HAT- und HDAC-Komplexe durch den Chromatin- Remodeling-Komplex rekrutiert werden oder dass remoduliertes Chromatin einer Bindung von HAT und HDAC-Komplexen zuträglicher ist. Siehe beispielsweise Cosma et al. (1999) Cell 97:299-311; Krebs et al. (1999) Genes Dev. 13:1412-1421. Entsprechend erleichtert in einer Ausführungsform der beanspruchten Verfahren Chromatin-Modifizierung eine Bindung eines HAT- oder HDAC-haltigen Komplexes. Auf diese Weise erleichtert Chromatin-Modifizierung die kovalente Modifikation von nukleosomalen Histonen durch Acetylierung oder Deacetylierung. Histonacetylierung ist im Allgemeinen mit Transkriptionsaktivierung korreliert; während Deacetylierung von Histonen im Allgemeinen mit Transkriptionsrepression assoziiert ist.
  • Es sind zahlreiche HAT-Enzyme beschrieben worden, einschließlich Bäckerhefe Gcn5p, welches für die Expression einer Teilmenge des Hefegenoms erforderlich ist, sein orthologes CREB-Bindungsprotein (CBP) aus Säugern, p300 (wobei die beiden Letztgenannten als Coaktivatoren für eine breite Vielfalt an Transkriptionsfaktoren aus Säuger verwendet werden), TAFII250 (eine Komponente der basalen Transkriptionsmaschinerie) und Steroidrezeptorcoaktivator I (SRC-1 ), welcher Transkriptionsaktivierung durch mehrere Kernhormonrezeptoren möglich macht. Kouzarides (1999) oben; Cheung et al. (2000) Curr. Opin. Cell Biol. 12:326-333; und Sterner et al. (2000) oben.
  • In höheren Eukaryoten wurden zwei Hauptklassen funktionell unterschiedlicher HDACs identifiziert. Klasse I umfasst HDAC1, HDAC2 und HDAC3, wobei es sich um Homologe zur Hefe-Rpd3-Histondeacetylase handelt. Klasse II umfasst HDAC4, HDAC5 und HDAC6; und sind zur Hefe-Hda1-Histondeacetylase homolog. Ng et al., oben.
  • In einer anderen Ausführungsform ist eine ZFP-DNA-Bindungsdomäne mit einer Histonacetyltransferase oder einer Histondeacetylase fusioniert, um eine Chromatin-Modifizierung in Form von kovalenter Modifizierung (Acetylierung oder Deacetylierung) von Histonen zu bewirken. In noch einer anderen Ausführungsform schließt sich einer Modifizierung von Chromatin durch einen Chromatin-Remodeling-Komplex eine Bindung einer ZFP-HAT-Fusion oder einer ZFP-HDAC-Fusion an, um einen aktiven bzw. inaktiven Chromatinzustand zu etablieren.
  • In zusätzlichen Ausführungsformen wird eine Fusion zwischen einer DNA-Bindungsdomäne und einem Protein, welches eine Komponente eines HAT- oder HDAC-haltigen Komplexes ist, bereitgestellt. Auf diese Art und Weise ist es möglich, HAT- oder HDAC-Aktivität an einer Region von Interesse in zellulärem Chromatin zu rekrutieren, wobei dies von der Sequenzspezifität der DNA-Bindungsdomäne abhängig ist. HAT- und HDAC-haltige Komplexe und ihre Polypeptiduntereinheiten-Komponenten sind beschrieben worden. Siehe beispielsweise Grunstein (1997) Nature 389:349-352; Hartzog et al. (1997) Curr. Opin. Genet. Devel. 7:192-198; Kadonaga (1998) Cell 92:307-313; Kuo et al. (1998) BioEssays 20:615-626; Mizzzen et al. (1998) Cell. Mol. Life Sci. 54:6-20; Struhl (1998) Genes Devel. 12:599-606; Workman et al. (1998) Ann. Rev. Biochem. 67:545-579; Ng et al. (1999) Trends Biochem. Sci. 25:121-126; und Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450. Entsprechend sind Komponenten von HAT- und HDAC-haltigen Komplexen dem Fachmann wohl bekannt.
  • Beispielsweise gibt es mehrere HAT-haltige Komplexe in Hefe, wobei einer der SAGA-Komplex ist (Spt-Ada-Gcn5-Acetyltransferase). Grant et al. (1997) Genes Devel. 11:1640-1650; Ikeda et al. (1999) Mol. Cell. Biol. 19:855-863.
  • HDAC-haltige Komplexe umfassen den Sin3-Komplex, welcher in Organismen von Hefe bis zu Säugern konserviert ist. Die Komponenten des Hefe-Sin3-Komplexes umfassen Sin3p, RPD3 (eine Histondeacetylase), RbAp48 und RbAp46. Die Komponenten des Sin3-Komplexes aus Säuger umfassen mSin3A, mSin3B, HDAC1, HDAC2, RbAp48, RbAp49, SAP30 und SAP18. Zhang et al. (1998) Mol. Cell 1:1021-1031. Sin3-Proteine aus Hefe, Drosophila und Vertebraten enthalten eine PAH (gepaarte amphiphatische Helices)-Domäne, umfassend vier konservierte Wiederholungen, welche zwei amphiphatische Helices bilden, die durch einen flexiblen Linker getrennt sind. HDAC1, HDAC2 und RPD3 sind Histondeacetylasen. Die RbAp48- und RbAp49-Proteine wechselwirken mit Histonen. SAP30 und SAP18 sind spezifische Determinanten.
  • Ein anderer HDAC-haltiger Komplex (welcher auch Chromatin- Remodeling-Aktivität besitzt, siehe oben) ist der Mi-2-Komplex. Mehrere Mi-2-Komplexe sind in Menschen und Amphibien beschrieben worden. Der Mi-2-Komplex aus Säuger (auch als NuRD bekannt) umfasst die folgenden Polypeptide: Mi-2 (auch bekannt als CHD), HDAC1, HDAC2, MTA-2 und MBD3. Siehe beispielsweise Ahringer (2000) Trends Genet. 16:351-356. Der amphibische Mi-2-Komplex umfasst Mi-2, Mta1-like (homolog zu MTA2 aus Säuger), p66, RbAp48, RPD3 und MBD3. Guschin et al. (2000) Biochemistry 39:5238-5245. Eine Bindung des methylierten DNA-Bindungsproteins, welches in diesem Komplex vorliegt (MBD3), an methylierte CpG-Dinukleotide in stromaufwärts liegenden Regulatorregionen lokalisiert den Komplex und seine assoziierte HDAC-Aktivität an methylierten Genen. Deshalb wird angenommen, dass der Mi-2-Komplex bei der Repression von Genen eine Rolle spielt, deren stromaufwärts liegende DNA an CpG-Dinukleotiden methyliert ist.
  • Coaktivatoren und Corepressoren, welche mit dem Sin3-Komplex assoziieren, um die Zielausrichtung und seine Wechselwirkung mit Rezeptoren und anderen Transkriptionsregulatotionsproteinen zu unterstützen, sind beschrieben worden. Beispiele umfassen sowohl die N-CoR-, Rb- und SMRT-Proteine aus Vertebraten und ihre Homologen, als auch die Drosophila-SMRTER und Groucho-Proteine und ihre Homologen ohne darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung wird von solchen Coaktivatoren und Corepressoren angenommen, dass sie Komponenten von Chromatin-Remodeling-Komplexen sind, insoweit als dass sie in der Lage sind, verschiedene Arten von Chromatin-Modifizierung zielzusteuern, wenn sie mit einer DNA-Bindungsdomäne fusioniert sind.
  • Für zusätzliche Details und Listen zu HAT- und HDAC-haltigen Komplexen und Proteinen, mit denen sie wechselwirken, siehe Knoepfler et al., oben; Ng et al., oben; und Ahringer, oben.
  • Hormon-Rezeptor-Funkctionsdomänen
  • Der Thyroidhormonrezeptor (TR) ist ein Mitglied der Kernhormonrezeptor-Superfamilie und wird normalerweise konstitutiv an seine Zielgene gebunden. Die Wirkung von TR-Bindung (d.h. entweder Repression oder Aktivierung von Genexpression) ist gewöhnlich vom Vorliegen oder der Abwesenheit ihres Liganden, Thyroidhormon (T3) abhängig. Bei Abwesenheit von T3 reprimiert der Rezeptor im Allgemeinen die Genexpression auf ein Niveau unterhalb des Basalniveaus. Es wurden mehrere Proteine identifiziert, welche durch den Rezeptor ohne Liganden rekrutiert werden und von welchen angenommen wird, dass sie einen repressiven Komplex bilden. Beispiele für derartige Proteine umfassen sowohl SMRT und NCoR, welche direkt mit dem Rezeptor wechselwirken, als auch Sin3, welches mit SMRT/NCoR wechselwirkt. Sin3 wechselwirkt auch mit mehreren Histondeacetylasen, wie beispielsweise HDACs 1 bis 8 (wobei einige hiervon auch direkt mit TR wechselwirken können). Von der Rekrutierung von Histondeacetylasen durch DNA-gebundenen TR wird angenommen, dass es hinsichtlich seiner Fähigkeit, Repression zu verleihen, eine Hauptrolle spielt; es ist jedoch auch möglich, dass andere repressive Faktoren als HDACs durch TR rekrutiert werden.
  • Die Bindung eines Liganden an DNA-gebundenes TR führt zum Zerfall des Repressionskomplexes, welcher mit dem TR assoziiert ist und zur Rekrutierung von Aktivierungsfaktoren an den DNA-gebundenen, Liganden-gebundenen TR. Solche Aktivierungsfaktoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Histonacetyltransferasen SRC-1, CBP/p300 und P/CAF. Oligomere Aktivierungskomplexe können auch durch Liganden-gebundenen TR rekrutiert werden, wie beispielsweise DRIP und ARC. Rachez et al. (1999) Nature 398:824-827; und Naar et al. (1999) Nature 398:828-832. Von diesen wurde gezeigt, dass sie mit anderen Kernhormonrezeptoren wechselwirken, in Reaktion auf Ligandenbindung, und eine Aktivierung von Genexpression im Kontext mit einem Chromatin-Templat erleichtern. Ein anderes Mitglied der Kernrezeptorfamilie, der Glucocorticoidrezeptor (GR), rekrutiert den hBRG1/BAF-Chromatin-Remodeling-Komplex in Reaktion auf Ligandenbindung. Fryer et al. (1998) Nature 393:88-91.
  • TR und verwandte Kernrezeptoren sind modulare Proteine umfassend eine Amino-terminale Region (mit nicht-definierter Funktion), eine zentrale DNA-Bindungsdomäne und eine Carboxy-terminale Ligandenbindungsdomäne (LBD).
  • Die LBD ist zusätzlich zum Bindungshormon für Wechselwirkungen mit sowohl den Repressivfaktoren als auch den Aktivierungsfaktoren, welche oben beschrieben sind, verantwortlich. Wenn die LBD an eine heterologe DNA-Bindungsdomäne (GaI4) fusioniert ist, vermittelt sie die Repression eines Zielpromotors, welcher eine GaI4-Bindungsstelle enthält. Collingwood et al. (1998) EMBO J. 17:4760-4770. Darüber hinaus kann T3-abhängige Transkriptionsaktivierung unter Verwendung einer Fusion der TR-LBD mit der GaI4-DNA-Bindungsdomäne erreicht werden. Tone et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:31,157-31,161.
  • Das Wissen um die Struktur der LBD von TR und verwandter Kernrezeptoren können zusammen mit den Ergebnissen aus Mutagenese-Studien verwendet werden, um mutierte Rezeptoren zu entwickeln, deren Repressions- und Aktivierungsaktivität für die Hormonkonzentration undurchdringbar ist. Beispielsweise rekrutieren Mutanten von TR mit einer mutierten Aminosäure, welche keine physiologischen Mengen von T3 binden können (z.B. G344E, Δ430M und Δ276I), Corepressoren zu ihrer Bindungsstelle. Collingwood et al. (1994) Mol. Endocrinol. 8:1262-1277; Collingwood et al. (1998) oben. Im Gegensatz dazu wurden Mutationen, welche konformationelle Änderungen in der Ligandenbindungsdomäne verursachen, die diejenigen nachahmen, die durch Hormonbindung induziert werden, im Östrogenrezeptor identifiziert (z.B. L536P und Y541D/E/A) und erzeugen konstitutiv aktivierende Formen des Rezeptors. Eng et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17:4644-4653; White et al. (1997) EMBO J. 16:1427-1435.
  • Entsprechend kann ein mutierter Kernhormonrezeptor LBD, welcher beispielsweise von TR oder GR abgeleitet ist, als eine Komponente einer Fusion mit einer DNA-Bindungsdomäne verwendet werden, um aktivierende oder reprimierende Proteinkomplexe an einer Region von Interesse in zellulärem Chromatin zu rekrutieren. Bestimmte natürlich vorkommende mutierte LBDs sind verfügbar und neue Mutanten können durch Verfahren, welche dem Fachmann wohl bekannt sind, konstruiert werden. Die Wirkungsstelle derartiger Komplexe ist durch die Spezifität der DNA-Bindungsdomäne bestimmt; während ihre Aktivität durch die Art der Mutation des LBDs bestimmt ist und unabhängig von der Ligandenkonzentration ist. Beispielsweise wird eine Fusion umfassend ein LBD, welches dahingehend mutiert wurde, dass es kein Hormon binden kann, die Bildung von Repressivkomplexen erleichtern; während ein Fusionsmolekül umfassend eine LBD-Mutation, welche die Konformation des LBD so ändert, dass es einem Liganden-gebundenen LBD ähnelt, die Bildung von Komplexen stimuliert, welche eine Transkriptionsaktivierung erleichtern.
  • Deshalb kann für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung ein mutierter Kernhormonrezeptor LBD als eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes angesehen werden.
  • Konstruktion und Abgabe von Fusionsmolekülen
  • Die hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen schließen Fusionsmoleküle ein, welche eine DNA-Bindungsdomäne und eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes umfassen. Die Komponente eines Remodeling-Komplexes kann entweder eine enzymatische Komponente oder eine nicht-enzymatische Komponente sein. Die Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes, welche vom Fusionspolypeptid, das in Anspruch 1 zitiert ist, umfasst ist, ist eine enzymatische Komponente. Ohne dass es erwünscht ist, durch Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass ein Fusionsmolekül, welches eine enzymatische Komponente umfasst, im Vergleich zu einem Fusionsmolekül, welches eine nicht-enzymatische Komponente umfasst, zu einer stärker beschränkten Region von zellulärem Chromatin führt. Dies liegt daran, dass, wenn die enzymatische Komponente direkt mit einer DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist, ihre Aktivität regional auf die Nähe der Zielstelle der DNA-Bindungsdomäne beschränkt ist (Ein Grad an Flexibilität kann durch Bereitstellung einer Linkersequenz zwischen der enzymatischen Komponente und der DNA-Bindungsdomäne erreicht werden). Im Gegensatz dazu ist es wahrscheinlich, dass, wenn das Fusionsmolekül eine nicht-enzymatische Komponente umfasst, mehrere Proteine zwischen die DNA-Bindungsdomäne (und daher die Zielstelle im Chromatin) und die enzymatische Komponente des rekonstituierten Chromatin-Remodeling-Komplexes treten. Dies ermöglicht möglicherweise ein größeres Wirkungsgebiet der enzymatischen Komponente, wobei dies zur Remodulierung von umfangreicheren Chromatin-Abschnitten führen könnte.
  • Fusionsmoleküle werden durch Klonierungsverfahren und biochemische Konjugation entworfen, welche dem Fachmann wohl bekannt sind. Fusionsmoleküle umfassen eine DNA-Bindungsdomäne und eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes oder ein funktionelles Fragment davon. Fusionsmoleküle umfassen ggf. Kernlokalisierungssignale (wie beispielsweise das aus dem SV40 mittlerem T-Antigen) und Epitoptags (wie beispielsweise FLAG und Hämagglutinin). Fusionsproteine (und sie kodierende Nukleinsäuren) werden so entwickelt, dass der Translationsleserahmen unter den Komponenten der Fusion konserviert ist. Siehe Beispiele 2 und 4, unten, für zusätzliche Details zur Konstruktion von Fusionsmolekülen.
  • Fusionen zwischen einer Polypeptidkomponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes (oder einem funktionellen Fragment davon) einerseits und einer Nicht-Protein-DNA-Bindungsdomäne (z.B. Antibiotika, Interkalator, Bindemittel an die Kleine Furche, Nukleinsäure) andererseits werden durch Verfahren zur biochemischen Konjugation konstruiert, welche dem Fachmann wohl bekannt sind. Siehe beispielsweise Pierce Chemical Company (Rockford, IL)-Katalog. Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung von Fusionen zwischen einem Bindemittel an die Kleine Furche und einem Polypeptid sind beschrieben worden. Mapp et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird eine Fusion zwischen einer Polypeptid-DNA-Bindungsdomäne und einer Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes (oder einem funktionellen Fragment davon) durch eine Fusionsnukleinsäure kodiert. In derartigen Fällen kann die Nukleinsäure in Zwischenvektoren zur Transformation in prokaryotische oder eukaryotische Zellen zur Replikation und/oder Expression kloniert werden. Zwischenvektoren zur Lagerung oder Manipulierung der Fusionsnukleinsäure oder zur Herstellung von Fusionsprotein können beispielsweise prokaryotische Vektoren (z.B. Plasmide), Shuttlevektoren, Insektenvektoren oder virale Vektoren sein. Eine Fusionsnukleinsäure kann auch in einen Expressionsvektor kloniert werden, zur Verabreichung an eine Bakterienzelle, eine Pilzzelle, eine Protozoenzelle, eine Pflanzenzelle, eine tierische Zelle, vorzugsweise eine Säugerzelle, stärker bevorzugt eine menschliche Zelle.
  • Um Expression einer klonierten Fusionsnukleinsäure zu erhalten, wird sie typischerweise in einen Expressionsvektor subkloniert, welcher einen Promotor zur Steuerung der Transkription enthält. Geeignete bakterielle und eukaryotische Promotoren sind im Fachbereich wohl bekannt und werden beschrieben, z.B. in Sambrook et al., oben; Ausubel et al., oben; und Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990). Bakterielle Expressionssysteme sind verfügbar in z.B. E. coli, Bacillus sp. und Salmonella. Palva et al. (1983) Gene 22:229-235. Kits für derartige Expressionssysteme sind kommerziell erhältlich. Eukaryotische Expressionssysteme für Säugerzellen, Hefezellen und Insektenzellen sind im Fachbereich wohl bekannt und ebenfalls kommerziell erhältlich, wie beispielsweise von Invitrogen, Carlsbad, CA und Clontech, Palo Alto, CA.
  • Der Promotor, welcher zur Steuerung der Expression einer Fusionsnukleinsäure verwendet wird, ist von der bestimmten Anwendung abhängig. Beispielsweise wird ein starker konstitutiver Promotor typischerweise zur Expression und Reinigung eines Fusionsproteins verwendet. Im Gegensatz dazu wird, wenn ein Fusionsprotein in vivo verwendet wird, entweder ein konstitutiver oder ein induzierbarer Promotor verwendet, wobei dies von der speziellen Verwendung des Fusionsproteins abhängig ist. Darüber hinaus kann ein schwacher Promotor verwendet werden, wie beispielsweise HSV TK, oder ein Promotor mit ähnlicher Aktivität. Der Promotor kann typischerweise auch Elemente umfassen, welche auf Transaktivierung reagieren, z.B. Hypoxie-Reaktionselemente, GaI4-Reaktionselemente, lac-Repressor-Reaktionselement und Kontrollsysteme mit kleinen Molekülen, wie beispielsweise tet-regulierte Systeme und das RU-486-System. Siehe z.B. Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:5547-5551; Oligino et al. (1998) Gene Ther. 5:491-496; Wang et al. (1997) Gene Ther. 4:432-441; Neering et al. (1996) Blood 88:1147-1155; und Rendahl et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:757-761.
  • Zusätzlich zu einem Promotor enthält ein Expressionsvektor typischerweise eine Transkriptionseinheit oder eine Expressionskassette, welche zusätzliche Elemente enthält, die für die Expression der Nukleinsäure in Wirtszellen, entweder prokaryotisch oder eukaryotisch, erforderlich sind. Eine typische Expressionskassette enthält deshalb einen Promotor, welcher operativ verknüpft ist, z.B. mit der Fusionsnukleinsäuresequenz, sowie Signale, welche erforderlich sind, z.B. für eine effiziente Polyadenylierung des Transkripts, zur Transkriptionstermination, Ribosomenbindung und/oder Translationstermination. Zusätzliche Elemente der Kassette können beispielsweise Enhancer und heterologe gespleißte Intronsignale umfassen.
  • Der spezifische Expressionsvektor, welcher verwendet wird, um die genetische Information in die Zelle zu transportieren, wird im Hinblick auf die beabsichtigte Verwendung des Fusionspolypeptids ausgewählt, z.B. eine Expression in Pflanzen, Tieren, Bakterien, Pilzen, Protozoen etc. Bakterielle Standardexpressionsvektoren umfassen Plasmide, wie beispielsweise pBR322, Plasmide auf Grundlage von pBR322, pSKF, pET23D und kommerziell erhältliche Fusionsexpressionssysteme, wie beispielsweise GST und LacZ. Eptioptags können ebenfalls an rekombinante Proteine angefügt werden, um geeignete Verfahren zur Isolierung, zur Überwachung der Expression und zur Überwachung zellulärer und subzellulärer Lokalisierung bereitzustellen, z.B. c-myc oder FLAG.
  • Expressionssysteme, welche Regulatorelemente aus eukaryotischen Viren enthalten, werden oftmals in eukaryotischen Expressionsvektoren verwendet, z.B. SV40-Vektoren, Papillomavirus-Vektoren und Vektoren, welche vom Epstein-Barr-Virus abgeleitet sind. Andere beispielhafte eukaryotische Vektoren umfassen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, Baculovirus pDSVE und beliebige andere Vektoren, welche die Expression von Proteinen unter Steuerung des SV40 frühen Promotors, des SV40 späten Promotors, des Metallalothionein-Promotors, des murinen Brusttumorvirus-Promotors, des Rous-Sarcomavirus-Promotors, des Polyhedrin-Promotors, oder anderer Promotoren, für welche gezeigt wurde, dass sie zur Expression in eukaryotischen Zellen effektiv sind, ermöglichen.
  • Einige Expressionssysteme weisen Marker zur Selektion von stabil transfizierten Zelllinien auf, wie beispielsweise Thymidinkinase, Hygromycin B-Phosphotransferase und Dihydrofolatreduktase. Expressionssysteme mit hoher Ausbeute sind ebenfalls geeignet, wie beispielsweise Baculovirus-Vektoren in Insektenzellen, mit einer Fusionsnukleinsäuresequenz unter der Transkriptionskontrolle des Polyhedrin-Promotors oder eines beliebigen anderen starken Baculovirus-Promotors.
  • Elemente, welche typischerweise von Expressionsvektoren umfasst sind, schließen auch ein, ein Replikon, welches in E. coli funktioniert (oder in dem prokaryotischen Wirt, wenn er anders als E. coli ist), einen selektiven Marker, z.B. ein Gen, welches Antibiotikaresistenz kodiert, um die Selektion von Bakterien zu ermöglichen, welche rekombinante Plasmide tragen und einzigartige Restriktionsstellen in nicht-essentiellen Regionen des Vektors, um die Insertion von rekombinanten Sequenzen zu ermöglichen.
  • Es können Standardtransfektionsverfahren verwendet werden, um Bakterienzelllinien, Säugerzelllinien, Hefezelllinien, Insektenzelllinien oder andere Zelllinien zu erzeugen, welche große Mengen an Fusionsprotein exprimieren, das, falls gewünscht, unter Verwendung von Standardtechniken gereinigt werden kann. Siehe z.B. Colley et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17619-17622; und Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, Bd. 182 (Deutscher, Hrsg.) 1990. Die Transformation von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen kann gemäß Standardtechniken ausgeführt werden. Siehe z.B. Morrison (1977) J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss et al. (1983) in Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., Hrsg.).
  • Es kann eine beliebige Vorgehensweise zur Einführung von Fremdnukleotidsequenzen in Wirtszellen verwendet werden. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Verwendung von Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Polybren, Protoplastfusion, Elektroporation, Lipid-vermittelte Abgabe (z.B. Liposome), Mikroinjektion, Partikelbeschuss, Einführung von nackter DNA, Plasmidvektoren, virale Vektoren (sowohl episomal als auch integrativ) und beliebige andere wohl bekannte Verfahren zur Einführung klonierter genomischer DNA, cDNA, synthetischer DNA oder anderem fremden genetischen Material in eine Wirtszelle (siehe z.B. Sambrook et al., oben). Es ist nur notwendig, dass die verwendete spezifische gentechnische Vorgehensweise wenigstens ein Gen in die Wirtszelle erfolgreich einführen kann, welche das Protein der Wahl exprimieren kann.
  • Herkömmliche viral-basierte und nicht-viral-basierte Gentransferverfahren können verwendet werden, um Nukleinsäuren in Säugerzellen oder Zielgewebe einzuführen. Derartige Verfahren können verwendet werden, um Fusionspolypeptide kodierende Nukleinsäuren an Zellen in vitro zu verabreichen. Vorzugsweise werden Nukleinsäuren für Verwendungen bei der in vivo- oder ex vivo-Gentherapie verabreicht. Nicht-virale Vektorabgabesysteme umfassen DNA-Plasmide, nackte Nukleinsäure und Nukleinsäure, welche mit einem Abgabevehikel, wie beispielsweise einem Liposom, komplexiert ist. Virale Vektorabgabesysteme umfassen DNA- und RNA-Viren, welche entweder episomale oder integrierte Genome nach Abgabe an die Zelle aufweisen. Für Übersichtsartikel zu Gentherapie-Vorgehensweisen siehe beispielsweise Anderson (1992) Science 256:808-813; Nabel et al. (1993) Trends Biotechnol. 11:211-217; Mitani et al. (1993) Trends Biotechnol. 11:162-166; Dillon (1993) Trends Biotechnol. 11:167-175; Miller (1992) Nature 357:455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10):1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36; Kremer et al. (1995) British Medical Bulletin 51(1):31-44; Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler und Böhm (Hrsg.), 1995; und Yu et al. (1994) Gene Therapy 1:13-26.
  • Verfahren zur nicht-viralen Abgabe von Nukleinsäuren umfassen Lipofektion, Mikroinjektion, Ballistik, Virosome, Liposome, Immunliposome, Polykation- oder Lipid:Nukleinsäure-Konjugate, nackte DNA, künstliche Virionen und Agenzien-gesteigerte Aufnahme von DNA. Lipofektion wird beschrieben in z.B. U.S.-Patent Nr. 5,049,386; 4,946,787 und 4,897,355 und Lipofektionsreagenzien werden kommerziell verkauft (z.B. TransfectamTM und LipofectinTM). Kationische und neutrale Lipide, welche zur effizienten Rezeptor-Erkennung-Lipofektion von Polynukleotiden geeignet sind, umfassen diejenigen von Felgner, WO 91/17424 und WO 91/16024. Nukleinsäuren können auch an Zellen abgegeben werden (ex vivo-Verabreichung) oder an Zielgewebe (in vivo-Verabreichung).
  • Die Herstellung von Lipid:Nukleinsäure-Komplexen, einschließlich angesteuerte Liposomen, wie beispielsweise Immunolipidkomplexe, ist im dem Fachmann wohl bekannt. Siehe z.B. Crystal (1995) Science 270:404-410; Blaese et al. (1995) Cancer Gene Ther. 2:291-297; Behr et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:382-389; Remy et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:647-654; Gao et al. (1995) Gene Therapy 2:710-722; Ahmad et al. (1992) Cancer Res. 52:4817-4820; und U.S.-Patente Nr. 4,186,183; 4,217,344; 4,235,871; 4,261,975; 4,485,054; 4,501,728; 4,774,085; 4,837,028 und 4,946,787.
  • Die Verwendung von Systemen auf Grundlage von RNA- oder DNA-Viren zur Abgabe von Nukleinsäuren zieht ihren Vorteil aus hochentwickelten Prozessen zur Zielausrichtung eines Virus auf spezifische Zellen im Körper und Versenden der viralen Ladung an den Kern. Virale Vektoren können direkt an Patienten verabreicht werden (in vivo) oder sie können verwendet werden, um Zellen in vitro zu behandeln (wobei die modifizierten Zellen an Patienten verabreicht werden) (ex vivo). Herkömmliche auf Viren basierende Systeme zur Abgabe von ZFPs umfassen retrovirale, lentivirale, poxivirale, adenovirale, Adeno-assoziiert-virale, Vesikular-Stomatitis-virale und Herpes-virale Vektoren. Integration in das Wirtsgenom ist mit bestimmten viralen Vektoren möglich, einschließlich der retroviralen, lentiviralen und adeno-assoziierten Virusgentransferverfahren, wobei dies oftmals zur Langzeitexpression des insertierten Transgens führen. Darüber hinaus wurden hohe Transduktionseffizienzen in vielen verschiedenen Zellarten und Zielgeweben beobachtet.
  • Der Tropismus eines Retrovirus kann durch Einführen von Fremdhüllproteinen geändert werden, wodurch eine Veränderung und/oder Expansion der möglichen Zielzellpopulation möglich wird. Lentivirale Vektoren sind retrovirale Vektoren, welche nicht-teilende Zellen transduzieren oder infizieren können und erzeugen typischerweise hohe virale Titer. Die Auswahl eines retroviralen Gentransfersystems ist deshalb vom Zielgewebe abhängig. Retrovirale Vektoren haben eine Verpackungskapazität von bis zu 6–10 kb an Fremdsequenz und enthalten cis-wirkende lange terminate Wiederholungen (LTRs). Die Minimum-cis-wirkenden LTRs sind zur Replikation und Verpackung der Vektoren ausreichend, welche anschließend verwendet werden, um das therapeutische Gen in der Zielzelle zu integrieren, um eine permanente Transgenexpression bereitzustellen. Weit verbreitet verwendete retrovirale Vektoren umfassen diejenigen, welche auf dem Murinen Leukämievirus (MuLV), dem Gibbonaffen-Leukämievirus (GaLV), dem simianen Immundefizienzvirus (SIV), dem humanen Immunschwächevirus (HIV) und Kombinationen davon basieren. Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66:2731-2739; Johann et al. (1992) J. Virol. 66:1635-1640; Sommerfelt et al. (1990) Virol. 176:58-59; Wilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al. (1991) J. Virol. 65:2220-2224; und PCT/US94/05700).
  • Adeno-assoziierte Virus (AAV)-Vektoren werden auch verwendet, um Zellen mit Zielnukleinsäuren zu transduzieren, z.B. bei der in vitro-Herstellung von Nukleinsäuren und Peptiden, und für in vivo- und ex vivo-Gentherapieverfahren. Siehe z.B. West et al. (1987) Virology 160:38-47; U.S.-Patent Nr. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin (1994) Hum. Gene Ther. 5:793-801; und Muzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94:1351. Die Konstruktion von rekombinanten AAV-Vektoren wird in mehreren Publikationen beschrieben, einschließlich den U.S.-Patenten Nr. 5,173,414; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260; Tratschin, et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; und Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828.
  • Rekombinante Adeno-assoziierte Virusvektoren basierend auf dem defekten und nicht-pathogenen Parvovius-Adeno-assoziiertem Virustyp 2 (AAV-2) stellen ein vielversprechendes Genabgabesystem dar. Beispielhafte AAV-Vektoren sind abgeleitet von einem Plasmid, das die AAV 145 bp umgekehrten terminalen Wiederholungen (inverted terminal repeats) enthält, welche eine transgene Expressionskassette flankieren. Ein effizienter Gentransfer und eine stabile transgene Abgabe aufgrund von Integration in die Genome der transduzierten Zelle sind Schlüsselmerkmale für dieses Vektorsystem. Wagner et al. (1998) Lancet 351 (9117):1702-3; und Kearns et al. (1996) Gene Ther. 9:748-55.
  • pLASN und MFG-S sind Beispiele für retrovirale Vektoren, welche in klinischen Studien verwendet worden sind. Dunbar et al. (1995) Blood 85:3048-305; Kohn et al. (1995) Nature Med. 1:1017-102; Malech et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12133-12138. PA317/pLASN war der erste therapeutische Vektor, welcher in einem Gentherapieversuch verwendet wurde. (Blaese et al. (1995) Science 270:475-480. Es wurden Transduktionseffizienten von 50% oder mehr für MFG-S verpackte Vektoren beobachtet. Ellem et al. (1997) Immunol. Immunother. 44(1):10-20; Dranoff et al. (1997) Hum. Gene Ther. 1:111-2.
  • In Anwendungen, für welche eine transiente Expression bevorzugt ist, sind Adenoviral-basierte Systeme nützlich. Adenoviral-basierte Vektoren sind in vielen Zelltypen zu einer sehr hohen Transduktionseffizienz in der Lage und können infizieren und deshalb Nukleinsäure sowohl an sich teilende als auch sich nicht-teilende Zellen abgegeben. Mit solchen Vektoren wurden hohe Titer und Expressionsniveaus beobachtet. Adenovirus-Vektoren können in großen Mengen in einem relativ einfachen System hergestellt werden.
  • Replikationsdefiziente rekombinante Adenoviren (Ad) können mit hohem Titer hergestellt werden und infizieren auf einfache Art und Weise mehrere verschiedene Zelltypen. Die meisten Adenovirus-Vektoren sind so entworfen, dass ein Transgen die Ad E1a-, E1b- und/oder E3-Gene ersetzt; der replikationsdefekte Vektor wird in menschlichen 293-Zellen, welche die erforderlichen E1-Funktionen in trans bereitstellen, propagiert. Ad-Vektoren können in vivo zahlreiche Gewebetypen transduzieren, einschließlich nicht-teilender, differenzierter Zellen, wie sie beispielsweise in der Leber, der Niere und Muskel gefunden werden. Herkömmliche Ad-Vektoren weisen eine große Tragekapazität für insertierte DNA auf. Ein Beispiel für die Verwendung eines Ad-Vektors in einer klinischen Studie umfasste eine Polynukleotidtherapie zur Anti-Tumorimmunisierung mit intramuskulärer Injektion. Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-1089. Zusätzliche Beispiele zur Verwendung von Adenovirus-Vektoren zum Gentransfer in klinischen Studien schließen ein Rosenecker et al. (1996) Infection 24:5-10; Sterman et al., oben; Welsh et al. (1995) Hum. Gene Ther. 2:205-218; Alvarez et al. (1997) Hum. Gene Ther. 5:597-613; und Topf et al. (1998) Gene Ther. 5:507-513.
  • Verpackungszellen werden oftmals zur Bildung von Viruspartikeln verwendet, welche eine Wirtszelle infizieren können. Derartige Zellen umfassen 293-Zellen, welche Adenovirus verpacken und Ψ2-Zellen oder PA317-Zellen, welche Retroviren verpacken. Virale Vektoren, welche in der Gentherapie verwendet werden, werden üblicherweise durch eine Producer-Zelllinie erzeugt, welche einen Nukleinsäurevektor in einen viralen Partikel verpackt. Diese Vektoren enthalten typischerweise die minimalen Virussequenzen, welche zur Verpackung und nachfolgenden Integration in einen Wirt erforderlich sind, wobei andere virale Sequenzen durch eine Expressionskassette für das zu exprimierende Protein ersetzt sind. Fehlende virale Funktionen werden in trans zur Verfügung gestellt, ggf. durch die Verpackungszelllinie. Beispielsweise besitzen AAV-Vektoren, welche in der Gentherapie verwendet werden, typischerweise nur ITR-Sequenzen von dem AAV-Genom, welche zur Verpackung und Integration in das Wirtsgenom erforderlich sind. Virale DNA wird in eine Zelllinie verpackt, welche ein Helferplasmid enthält, das die anderen AAV-Gene kodiert, nämlich rep und cap, aber welches keine ITR-Sequenzen aufweist. Die Zelllinie wird auch mit einem Adenovirus als einem Helfer infiziert. Das Helfervirus unterstützt die Replikation des AAV-Vektors und die Expression von AAV-Genen vom Helferplasmid. Das Helferplasmid wird aufgrund des Fehlens von ITR-Sequenzen nicht in signifikanten Mengen verpackt. Eine Kontaminierung mit Adenovirus kann beispielsweise durch Hitzebehandlung, welche vorzugsweise Adenoviren inaktiviert, verringert werden.
  • In vielen Gentherapie-Anwendungen ist es wünschenswert, dass der Gentherapie-Vektor mit einem hohen Maß an Spezifität an einen bestimmten Gewebetyp abgegeben werden kann. Ein viraler Vektor kann durch Expression eines Liganden als Fusionsprotein mit einem viralen Hüllprotein auf der Außenoberfläche des Virus modifiziert werden, um eine Spezifität für einen gegebenen Zelltyp aufzuweisen. Der Ligand wird so ausgewählt, dass er eine Affinität für einen Rezeptor aufweist, von welchem bekannt ist, dass er auf dem Zelltyp von Interesse vorliegt. Beispielsweise beschrieben Han et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751, dass Moloney-Murine Leukämievirus modifiziert werden kann, so dass es humanes Heregulin, welches mit gp70 fusioniert ist, exprimiert und dass der rekombinante Virus bestimmte humane Brustkrebszellen infiziert, welche humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor exprimieren. Dieses Prinzip kann auf andere Virenpaare, welche ein Ligandfusionsprotein exprimieren und eine Zielzelle, welche einen Rezeptor exprimiert, ausgedehnt werden. Beispielsweise kann ein filamentöser Phage entwickelt werden, um Antikörperfragmente (z.B. Fab oder FV) zu präsentieren, welche eine spezifische Bindungsaffinität für nahezu einen beliebigen ausgewählten zellulären Rezeptor aufweisen. Obwohl die obige Beschreibung hauptsächlich virale Vektoren betrifft, können dieselben Prinzipien auf nicht-virale Vektoren angewendet werden. Solche Vektoren können entwickelt werden, um spezifische Aufnahmesequenzen zu enthalten, welche dazu gedacht sind, die Aufnahme durch spezifische Zielzellen zu begünstigen.
  • Gentherapie-Vektoren können in vivo durch Verabreichung an einen einzelnen Patienten abgegeben werden, typischerweise durch systemische Verabreichung (z.B. intravenöse, intraperitoneale, intramuskulärere, subdermale oder intracranielle Infusion) oder topische Anwendung, wie unten beschrieben. Alternativ können Vektoren ex vivo von Zellen abgegeben werden, wie beispielsweise Zellen, welche aus einem einzelnen Patienten explantiert worden sind (z.B. Lymphozyten, Zellen aus Knochenmarkaspirat, Gewebebiopsie) oder universelle hämopoetische Donorstammzellen, wobei sich Reimplantation der Zellen in einen Patienten anschließt, üblicherweise nach Selektion hinsichtlich solcher Zellen, welche den Vektor inkorporiert haben.
  • Ex vivo-Zelltransfektion zur Diagnose, Forschung oder zur Gentherapie (z.B. mittels Reinfusion der transfizierten Zellen in den Wirtsorganismus) ist dem Fachmann wohl bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Zellen aus dem Probandenorganismus isoliert, mit einer Nukleinsäure (Gen oder cDNA) transfiziert und zurück in den Probandenorganismus (z.B. ein Patient) reinfusioniert. Verschiedene zur ex vivo-Transfektion geeignete Zelltypen sind dem Fachmann wohl bekannt. Siehe z.B. Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 3. Ausgabe, 1994, und darin zitierte Referenzen, für eine Diskussion zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus Patienten.
  • In einer Ausführungsform werden hämopoetische Stammzellen für ex vivo-Verfahren zur Zelltransfektion und zur Gentherapie verwendet. Der Vorteil bei der Verwendung von Stammzellen ist der, dass sie in vitro in anderen Zelltypen differenziert werden können oder in einen Säuger eingeführt werden können (wie beispielsweise den Donor der Zellen), wo sie sich in das Knochenmark einfügen. Verfahren zur Differenzierung von CD34+-Stammzellen in vitro zu klinisch wichtigen Immunzelltypen unter Verwendung von Cytokinen, wie beispielsweise GM-CSF, IFN-γ und TNF-γ sind bekannt. Inaba et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702.
  • Stammzellen werden unter Verwendung bekannter Verfahren zur Transduktion und Differenzierung isoliert. Beispielsweise werden Stammzellen aus Knochenmarkzellen durch Schwenken der Knochenmarkzellen mit Antikörpern, welche unerwünschte Zellen binden, wie beispielsweise CD4+ und CD8+ (T-Zellen), CD45+ (panB-Zellen), GR-1 (Granulocyten) und lad (differenzierte Antigen-präsentierende Zellen), isoliert. Siehe Inaba et al., oben.
  • Vektoren (z.B. Retroviren, Adenoviren, Liposomen etc.), welche therapeutische Nukleinsäuren enthalten, können auch direkt an den Organismus zur Transduktion von Zellen in vivo verabreicht werden. Alternativ kann nackte DNA verabreicht werden. Die Verabreichung findet statt durch einen beliebigen Weg der Wege, welche normalerweise zum Einführen eines Moleküls in ultimativen Kontakt mit Blut oder Gewebezellen verwendet wird. Geeignete Verfahren zur Verabreichung derartiger Nukleinsäuren sind verfügbar und dem Fachmann wohl bekannt, und obwohl zur Verabreichung einer bestimmten Zusammensetzung mehr als ein Weg verwendet werden kann, stellt ein bestimmter Weg oftmals eine unverzüglichere und effektivere Reaktion bereit als ein anderer Weg.
  • Pharmazeutisch annehmbare Träger werden sowohl teilweise durch die bestimmte, zu verabreichende Zusammensetzung bestimmt, als auch durch das bestimmte Verfahren, welches zur Verabreichung der Zusammensetzung verwendet wird. Entsprechend gibt es eine breite Vielfalt an geeigneten Formulierungen für pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung, wie es unten beschrieben ist. Siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, 1989.
  • Abgabevehikel
  • In bestimmten Ausführungsformen können eines oder mehrere Polypeptide, wie in den Ansprüchen definiert, umfassend eine Fusion zwischen einer DNA-Bindungsdomäne und einer Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes in eine Zelle eingeführt werden. Ein wichtiger Faktor bei der Verabreichung von Polypeptidverbindungen ist die Sicherstellung, dass das Polypeptid über die Fähigkeit verfügt, die Plasmamembran einer Zelle zu durchqueren oder die Membran eines intrazellulären Kompartments, wie beispielsweise des Kerns. Zelluläre Membranen sind zusammengesetzt aus Lipidproteinbischichten, welche für kleine, nicht-ionische lipophile Komponenten frei permeabel sind und welche für polare Verbindungen, Makromoleküle und therapeutische oder diagnostische Mittel intrinsisch impermeabel sind. Es wurden jedoch Proteine, Lipide und andere Verbindungen beschrieben, welche über die Fähigkeit verfügen, Polypeptide über eine Zellmembran hinweg zu translozieren.
  • Beispielsweise weisen „Membrantranslokationspolypeptide" amphiphile oder hydrophobe Aminosäuresubsequenzen auf, welche über die Fähigkeit verfügen, als Membran-translozierende Träger zu wirken. In einer Ausführungsform weisen Homeodomänen-Proteine die Fähigkeit auf, über Zellmembranen hinweg zu translozieren. Das kürzeste internalisierbare Peptid eines Homeodomänen-Proteins, Antennapedia, wurde als die dritte Helix des Proteins bestimmt, von Aminosäureposition 43 bis 58. Prochiantz (1996) Curr. Opin. Neurobiol. 6:629-634. Für eine andere Subsequenz, die h (hydrophobe)-Domäne von Signalpeptiden, wurde herausgefunden, dass sie ähnliche Zellmembrantranslokationseigenschaften aufweist. Lin et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:14255-14258.
  • Beispiele für Peptidsequenzen, welche mit einem Fusionspolypeptid zur Erleichterung seiner Aufnahme in Zellen verknüpft werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, ein 11 Aminosäurepeptid des tat-Proteins von HIV; eine Peptidsequenz mit 20 Resten, welche den Aminosäuren 84-103 des p16-Proteins entspricht (siehe Fahraeus et al. (1996) Curr. Biol. 6:84); die dritte Helix der 60 Aminosäure-langen Homeodomäne von Antennapedia (Derossi et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:10444); die h-Region eines Signalpeptids, wie beispielsweise die Kaposi-Fibroblastwachstumsfaktor (K-FGF)-h-Region (Lin et al., oben); und die VP22-Translokationsdomäne von HSV (Elliot et al. (1977) Cell 88:223-233). Andere geeignete chemische Reste, welche eine erhöhte zelluläre Aufnahme bereitstellen, können ebenfalls mit Fusionspolypeptiden verknüpft werden, entweder kovalent oder nicht-kovalent.
  • Toxinmoleküle weisen ebenfalls die Fähigkeit auf, Polypeptide über Zellmembranen hinweg zu transportieren. Oftmals sind solche Moleküle (als „binäre Toxine" bezeichnet) aus wenigstens zwei Teilen zusammengesetzt: einer Translokations- oder Bindungsdomäne und einer getrennten Toxindomäne. Typischerweise bindet die Translokationsdomäne, welche ggf. ein Polypeptid sein kann, an einen zellulären Rezeptor, wodurch der Transport des Toxins in die Zelle erleichtert wird. Einige bakterielle Toxine, einschließlich Clostridium perfringenslotatoxin, Diphtherietoxin (DT), Pseudomonas-Exotoxin A (PE), Pertussistoxin (PT), Bacillus anthracis-Toxin und Pertussis-Adenylatzyklase (CYA) wurden verwendet, um Peptide an das Zellzytosol als interne oder Amino-terminale Fusionen abzugeben. Arora et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3334-3341; Perelle et al. (1993) Infect. Immun. 61:5147-5156; Stenmark et al. (1991) J. Cell Biol. 113:1025-1032; Donnelly et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3530-3534; Carbonetti et al. (1995) Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95:295; Sebo et al. (1995) Infect. Immun. 63:3851-3857; Klimpel et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10277-10281; und Novak et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17186-17193.
  • Derartige Subsequenzen können verwendet werden, um Polypeptide, einschließlich Fusionspolypeptide wie hierin offenbart, über eine Zellmembran hinweg zu translozieren. Dies wird beispielsweise erreicht durch Derivatisieren des Fusionspolypeptids mit einer dieser Translokationssequenzen oder durch Bilden einer zusätzlichen Fusion der Translokationssequenz mit dem Fusionspolypeptid. Gegebenenfalls kann ein Linker verwendet werden, um das Fusionspolypeptid und die Translokationssequenz zu verknüpfen. Es kann ein beliebiger geeigneter Linker verwendet werden, wie beispielsweise ein Peptidlinker.
  • Ein Fusionspolypeptid kann auch in eine tierische Zelle, vorzugsweise eine Säugerzelle, mittels Liposomen und Liposomderivaten, wie beispielsweise Immunoliposome, eingeführt werden. Der Ausdruck „Liposom" betrifft Vesikel, welche aus einer oder mehreren konzentrisch angeordneten Lipidbischichten bestehen, die eine wässrige Phase umkapseln. Die wässrige Phase enthält typischerweise die an die Zelle abzugebende Verbindung.
  • Das Liposom fusioniert mit der Plasmamembran, wodurch die Verbindung in das Cytosol freigesetzt wird. Alternativ wird das Liposom durch Phagozytose in die Zelle aufgenommen oder in einem Transportvehikel in die Zelle aufgenommen. Sobald es einmal im Endosom oder Phagosom vorliegt, wird das Liposom entweder abgebaut oder fusioniert mit der Membran des Transportvehikels und setzt seinen Inhalt frei.
  • Bei gegenwärtigen Verfahren zur Arzneimittelabgabe via Liposomen wird das Liposom äußerst permeabel und setzt die verkapselte Verbindung am Zielgewebe oder der Zielzelle frei. Zur systemischen oder gewebespezifischen Abgabe kann dies beispielsweise in einer passiven Art und Weise erreicht werden, wobei die Liposombischicht mit der Zeit durch die Wirkung von verschiedenen Agenzien im Körper abgebaut wird. Alternativ umfasst die Freisetzung des aktiven Arzneimittels die Verwendung eines Agenz zur Induzierung einer Permeabilitätsveränderung im Liposomvehikel. Liposommembranen können so konstruiert werden, dass sie destabilisiert werden, wenn die Umgebung in der Nähe der Liposommembran sauer wird. Siehe z.B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851 (1987); Biochemistry 28:908 (1989). Wenn die Liposomen durch eine Zielzelle mittels Endozytose aufgenommen werden, werden sie beispielsweise destabilisiert und setzen ihren Inhalt frei. Diese Destabilisierung wird als Fusogenese (fusogenesis) bezeichnet. Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) stellt die Grundlage für viele „fusogene" Systeme dar.
  • Zur Verwendung mit den hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen umfassen Liposome typischerweise ein Fusionspolypeptid wie hierin offenbart, eine Lipidkomponente, z.B. ein neutrales und/oder ein kationisches Lipid, und umfassen ggf. ein Rezeptorerkennungsmolekül, wie beispielsweise einen Antikörper, welcher an einen vorbestimmten Zelloberflächenrezeptor oder einen Liganden (z.B. ein Antigen) bindet. Es steht eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von Liposomen bereit, wie beispielsweise beschrieben in den U.S.-Patenten Nr. 4,186,183; 4,217,344; 4,235,871; 4,261,975; 4,485,054; 4,501,728; 4,774,085; 4,837,028; 4,235,871; 4,261,975; 4,485,054; 4,501,728; 4,774,085; 4,837,028; 4,946,787; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/17424; Szoka et al. (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; Deamer et al. (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629-634; Fraley et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348-3352; Hope et al. (1985) Biochim. Biophys. Acta 812:55-65; Mayer et al. (1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161-168; Williams et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:242-246; Liposomes, Ostro (Hrsg.), 1983, Kapitel 1); Hope et al. (1986) Chem. Phys. Lip. 40:89; Gregoriadis, Liposome Technology (1984) und Lasic, Liposomes: from Physics to Applications (1993). Geeignete Verfahren umfassen beispielsweise Ultraschallbehandlung, Extrusion, Hochdruck/Homogenisierung, Mikrofluidisierung, Detergenzdialyse, Calcium-induzierte Fusion von kleinen Liposomvehikeln und Ether-Fusionsverfahren, welche im Fachbereich alle wohl bekannt sind.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, ein Liposom zielauszurichten, unter Verwendung von zielenden Resten, welche für einen bestimmten Zelltyp, ein Gewebe und dergleichen spezifisch sind. Ein Zielausrichten von Liposomen unter Verwendung einer Vielzahl von zielenden Resten (z.B. Liganden, Rezeptoren und monoklonalen Antikörpern) ist kürzlich beschrieben worden. Siehe z.B. U.S.-Patente Nr. 4,957,773 und 4,603,044.
  • Beispiele für zielende Reste umfassen monoklonale Antikörper, welche für Antigene spezifisch sind, die mit Neoplasmen assoziiert sind, wie beispielsweise Prostatakrebs-spezifisches Antigen und MAGE. Tumore können auch durch Detektion von Genprodukten diagnostiziert werden, welche sich aus der Aktivierung oder Überexpression von Onkogenen, wie beispielsweise ras oder c-erbB2 ergeben. Darüber hinaus exprimieren viele Tumore Antigene, welche üblicherweise durch Fötalgewebe exprimiert werden, wie beispielsweise das Alphafetoprotein (AFP) und das Carcinoembryonale Antigen (CEA). Stellen viraler Infektion können diagnostiziert werden unter Verwendung verschiedener viraler Antigene, wie beispielsweise Hepatitis B-Kern- und Oberflächenantigenen (HBVc, HBVs), Hepatitis C-Antigenen, Epstein-Barr-Virus-Antigenen, humanem Immunschwächetyp 1-Virus (HIV-1)- und Papilloma-Virus-Antigenen. Eine Entzündung kann detektiert werden unter Verwendung von Molekülen, welche durch Oberflächenmoleküle spezifisch erkannt werden, die an Entzündungsstellen exprimiert werden, wie beispielsweise Integrine (z.B. VCAM-1), Selektionrezeptoren (z.B. ELAM-1) und dergleichen.
  • Es werden Standardverfahren zum Koppeln von Zielmitteln an Liposome verwendet. Diese Verfahren umfassen im Allgemeinen die Inkorporation von Lipidkomponenten in Liposomen, z.B. Phosphatidylethanolamin, welches zum Anheften von Zielmitteln aktiviert werden kann, oder die Inkorporation von derivatisierten lipophilen Verbindungen, wie beispielsweise Lipid-derivatisiertes Bleomycin. Liposomen, welche durch Antikörper angezielt werden, können beispielsweise unter Verwendung von Liposomen, welche beispielsweise Protein A inkorporieren, konstruiert werden. Siehe Renneisen et al. (1990) J Biol Chem: 265:16337-16342 und Leonetti et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2448-2451.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichung
  • Fusionspolypeptide, wie hierin offenbart, und Expressionsvektoren, welche Fusionspolypeptide kodieren, können in Verbindung mit verschiedenen Verfahren zur Gentherapie verwendet werden, um die Wirkung eines therapeutischen Genprodukts zu erleichtern. In solchen Anwendungen kann ein Fusionspolypeptid zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, welche direkt an einen Patienten verabreicht werden kann, z.B. zur Erleichterung der Modulierung von Genexpression oder für therapeutische oder prophylaktische Verwendungen, wie beispielsweise Krebs, Ischämie, diabetische Retinopathie, Makuladegeneration, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, HIV-Infektion, Sichelzellanämie, Alzheimer-Erkrankung, muskuläre Dystrophie, neurodegenerative Erkrankungen, vaskuläre Erkrankung, zystische Fibrose, Schlaganfall und dergleichen.
  • Beispiele für Mikroorganismen, deren Hemmung durch Verwendung der hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen erleichtert werden kann, umfassen pathogene Bakterien, z.B. Chlamydien, Rickettsial-Bakterien, Mycobakterien, Staphylokokken, Streptokokken, Pneumokokken, Meningokokken und Conokokken, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella, Diphtherie, Salmonella, Bacilli (z.B. Anthrax), Vibrio (z.B. Cholera), Clostridium (z.B. Tetanus, Botulinus), Yersinia (z.B. Pest), Leptospirosis und Borrelia (z.B. Lyme-Erkrankung-Bakterien), infektiöse Pilze, z.B. Aspergillus, Candida-Spezies; Protozoen, wie beispielsweise Sporozoa (z.B. Plasmodia), Rhizopoden (z.B. Entamoeba) und Flagellaten (Trypanosomen, Leishmania, Trichomonas, Giardia etc.); Viren, z.B. Hepatitis (A, B oder C), Herpesviren (z.B. VZV, HSV-1, HHV-6, HSV-II, CMV und EBV), HIV, Ebola, Marburg und verwandte hämorrhagische Fieber-verursachende Viren, Adenoviren, Influenzaviren, Flaviviren, Echoviren, Rhinoviren, Coxsackieviren, Cornaviren, Respiratory-Syncytial-Viren, Mumpsviren, Rotaviren, Masernviren, Rubellaviren, Parvoviren, Vacciniaviren, HTLV-Viren, Retroviren, Lentiviren, Dengueviren, Papillomaviren, Polioviren, Tollwutviren und Arbovirusencephalitis-Viren etc.
  • Eine Verabreichung von therapeutisch wirksamen Mengen einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend ein Fusionspolypeptid oder eine Nukleinsäure, welche ein Fusionspolypeptid kodiert, findet auf einem beliebigen der Wege statt, welche normalerweise zur Einführung von Polypeptiden oder Nukleinsäuren in ultimativem Kontakt mit dem zu behandelnden Gewebe verwendet werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche Fusionspolypeptide oder Nukleinsäuren umfassen, werden auf eine beliebige geeignete Art und Weise verabreicht, vorzugsweise mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern. Geeignete Verfahren zur Verabreichung derartiger Modulatoren sind verfügbar und dem Fachmann wohl bekannt und, obwohl mehr als ein Weg verwendet werden kann, um eine bestimmte Zusammensetzung zu verabreichen, kann ein bestimmter Weg oftmals eine unverzüglichere und effektivere Reaktion bereitstellen als ein anderer Weg.
  • Pharmazeutisch annehmbare Träger werden sowohl teilweise durch die bestimmte zu verabreichende Zusammensetzung bestimmt, als auch durch das bestimmte Verfahren, welches verwendet wird, um die Zusammensetzung zu verabreichen. Entsprechend gibt es eine breite Vielfalt an geeigneten Formulierungen von pharmazeutischen Zusammensetzungen. Siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausgabe, 1985.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend Fusionspolypeptide oder Nukleinsäuren, allein oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten, können zur Verabreichung mittels Inhalation in Aerosolformulierungen hergestellt werden (d.h. sie können „vernebelt" werden). Aerosolformulierungen können in unter Druck stehende annehmbare Treibmittel eingebracht werden, wie beispielsweise Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen.
  • Formulierungen, welche zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, wie beispielsweise auf intravenösen, intramuskuläreren, intradermalen und subkutanen Wegen, umfassen wässrige und nicht-wässrige, isotonische sterile Injektionslösungen, welche Antioxidationsmittel, Puffer, Bakteriostatika, und gelöste Stoffe enthalten können, welche die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch halten, und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, welche suspendierende Mittel, Löslichkeits-steigernde Mittel, Verdickungsmittel, Stabilisierungsmittel, und Konservierungsmittel enthalten können.
  • Zusammensetzungen können beispielsweise durch intravenöse Infusion, oral, topisch, intraperitoneal, intravesikal oder intrarektal verabreicht werden. Die Formulierungen der Verbindungen können in verschlossenen Einheitsdosierungs- oder Mehrfachdosierungs-Behältern präsentiert werden, wie beispielsweise Ampullen oder Glasfläschchen. Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten hergestellt werden, welche von der Art sind, wie sie dem Fachmann bekannt sind.
  • Assays für Chromatin-Remodeling
  • Es sind verschiedene Aktivitäten von Chromatin-Remodeling-Komplexen beschrieben worden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Folgenden. Eine charakteristische Aktivität aller Chromatin-Remodeling-Komplexe ist eine Nukleosom- oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität. Chromatin-Remodeling-Komplexe können die Bindung von Transkriptionsfaktoren an Gene in einem Chromatinkontext erleichtern und sie können die Zugänglichkeit von Sequenzen in Chromatin für Restriktionsenzyme oder andere Nukleasen erleichtern. Bestimmte Remodeling-Komplexe (diejenigen, welche die ISWI-ATPase enthalten) besitzen auch die Fähigkeit, periodische Nukleosomanordnungen zusammenzusetzen (d.h. sie sind in der Lage, Nukleosomen mit Abstand anzuordnen). Veränderungen hinsichtlich der DNA-Topologie (d.h. des Ausmaßes an Superspiralisierung) können sich auch aus der Wirkung von Chromatin-Remodeling-Komplexen ergeben. Von diesen wird angenommen, dass sie entweder Veränderungen des Verlaufs der DNA entlang des Nukleosoms oder Veränderungen des Verlaufs von Linker-DNA entlang der Chromatinfaser wiedergeben. Chromatin-Remodeling-Komplexe sind auch in der Lage, Histone von Chromatin zu entweder DNA- oder Proteinakzeptoren zu übertragen. Es kann sich auch eine Stimulierung von Transkriptionsinitiation aus der Wirkung von Chromatin-Remodeling-Komplexen ergeben.
  • Ohne dass es erwünscht ist, durch eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, erkennen die Erfinder die Möglichkeit, dass der Mechanismus, welcher allen oben beschriebenen Aktivitäten zugrunde liegt, die Fähigkeit von Chromatin-Remodeling-Komplexen sein kann, eine Nukleosomverschiebung (nucleosome sliding) zu unterstützen oder, grundlegender, die Histon-DNA-Wechselwirkung zu destabilisieren. Entsprechend ist ein beliebiges Protein oder ein Multiprotein-Komplex, welches/welcher Histon-DNA-Wechselwirkungen destabilisieren kann und/oder eine Nukleosombewegung unterstützen kann, zur Verwendung als Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes geeignet.
  • Die verschiedenen Aktivitäten von Chromatin-Remodeling-Komplexen können mittels mehrerer Techniken untersucht werden, wie sie dem Fachmann bekannt sind und wie sie in Veröffentlichungen beschrieben worden sind, welche die Isolierung und Charakterisierung von verschiedenen Chromatin-Remodeling-Komplexen offenbaren, wie es oben dargelegt ist. Siehe auch Imblazano et al. (1994) Nature 370:481-485 und Cote et al. (1993) Science 265:53-60 hinsichtlich einer Beschreibung von Assays, welche die Erleichterung von Transkriptionsfaktorbindung umfassen. Assays, welche eine Nukleosom-repositionierung umfassen, werden beispielsweise beschrieben von Hamiche et al. (1999) Cell 97:833-842 und Guschin et al. (2000) Biochemistry 39:5238-5245.
  • Entsprechend ist es für einen Durchschnittsfachmann möglich, zu bestimmen, ob ein gegebener Multiprotein-Komplex ein Chromatin-Remodeling-Komplex ist, und zu bestimmen, ob ein bestimmtes Polypeptid eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes oder ein funktionelles Fragment davon ist. Zusätzliche Beispiele für Assays zur Chromatin-Remodeling-Aktivität werden unten bereitgestellt und in Veröffentlichungen wie Methods in Enzymology, Bd. 304, „Chromatin" (P. M. Wassarman und A. P. Wolffe, Hrsg.), Academic Press, San Diego, 1999; und Methods in Molecular Biology, Bd. 119, „Chromatin Protocols" (P. B. Becker, Hrg.) Humana Press, Totowa, 1999. Siehe auch U.S.-Patent Nr. 5,972,608.
  • Ein zusätzlicher Assay zur Chromatinmodifizierung ist die Modellierung von Genexpression, wenn die Modifizierung ein Teil eines zweistufigen Verfahrens ist, in welchem die Chromatinmodifizierung die Bindung eines Moleküls ermöglicht, welches die Genexpression moduliert (z.B. ein Polypeptid umfassend eine Fusion zwischen einer Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne und einer Transkriptionsregulationsdomäne). Assays zur Genmodulierung (z.B. Transkriptionsaktivierung und/oder -repression, Reportergenaktivität, Messung von Proteinmengen) sind dem Fachmann wohl bekannt und beispielsweise in der Druckschrift WO 00/41566, welche ebenfalls Eigentum der Anmelderin ist, beschrieben.
  • Anwendungen
  • Die hierin offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren können verwendet werden, um mehrere Prozesse, welche zelluläres Chromatin umfassen, zu erleichtern. Diese Prozesse umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Transkription, Replikation, Rekombination, Reparatur, Integration, Erhaltung von Telomeren, und Prozesse, welche hinsichtlich Chromosomenstabilität und -trennung eine Rolle spielen. Entsprechend können die hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen sowohl verwendet werden, um einen beliebigen dieser Prozesse zu beeinflussen als auch einen beliebigen anderen Prozess, welcher durch Chromatinstruktur beeinflusst werden kann, wie beispielsweise eine Detektion von spezifischen Sequenzen oder Sequenzvarianten in zellulärem Chromatin.
  • Eine zielgerichtete Modifizierung eukaryotischer chromosomaler Chromatinstruktur, wie hierin offenbart, kann in Prozessen, wie beispielsweise therapeutischer Regulierung von mit Erkrankung in Zusammenhang stehenden Genen, Entwickeln von Zellen zur Herstellung von Proteinpharmazeutika, pharmazeutischer Forschung (einschließlich Zielfindung, Zielvalidierung und Entwickeln von Zellen für Hochdurchsatz-Screeningverfahren) und zur Pflanzenkultivierung verwendet werden.
  • Beispielsweise erleichtert in einer Ausführungsform eine Chromatinmodifizierung den Zugang für einen oder mehrere Transkriptionsregulationsfaktoren an eine Zielstelle in zellulärem Chromatin, wodurch sie an einer Modulierung von Genexpression partizipiert. Eine Modulierung von Genexpression kann entweder Erhöhungen oder Erniedrigungen der Mengen an Genexpression umfassen. In einer anderen beispielhaften Ausführungsform erhöht Chromatinmodifizierung die Effizienz von Rekombination, wodurch beispielsweise die zielgerichtete Integration einer exogenen Nukleinsäure erleichtert wird.
  • Chromatin umfasst jede zelluläre Nukleinproteinstruktur. Dies kann umfassen, ist aber nicht beschränkt auf, Chromosomen (d.h. nukleäre Genome), Episome, Nukleoproteine aus Organellen, wie beispielsweise mitochondrielle Genome und Chloroplastengenome, und Nukleoproteine, welche mit infizierenden bakteriellen oder viralen Genomen assoziiert sind. Es ist bekannt, dass nicht-eukaryotische Genome in Nukleoproteinstrukturen organisiert sind. In eukaryotischen Zellen ist das Genom im Kern eingeschlossen. Entsprechend umfasst Kontakt eines Moleküls mit zellulärem Chromatin Einführen des Moleküls in den Kern einer Zelle. Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf das Remodeling von eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin.
  • Zellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, prokaryotische Zellen, eukaryotische Zellen und Achaea-Zellen.
  • Eukaryotische Zellen umfassen pflanzliche Zellen, Pilzzellen, protozoale und tierische Zellen, einschließlich Säugerzellen, Primatenzellen und humane Zellen.
  • In einer Ausführungsform wird die Modifizierung von Chromatin verwendet, um die Modulierung von Genexpression zu erleichtern. Modulierung kann sowohl Genaktivierung und Genrepression umfassen, als auch subtilere Erhöhungen oder Erniedrigungen des Genexpressionsniveaus. Eine Aktivierung von Genexpression kann beispielsweise durch die Aktivität einer Histonacetyltransferase vermittelt werden, welche an einer Region von Interesse mittels der hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen rekrutiert worden ist. Eine Repression von Genexpression kann beispielsweise vermittelt werden durch die Aktivität einer Histondeacetylase, welche an einer Region von Interesse mittels der hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen rekrutiert worden ist. Ohne dass es erwünscht ist, durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Modifizierung von Chromatin in der Nähe eines bestimmten Gens die genregulatorischen Sequenzen stärker (oder im Falle von Repression weniger) zugänglich für Transkriptionsaktivatoren macht. Alternativ könnte eine Chromatinmodifizierung regulatorische Sequenzen für Transkriptionsrepressoren zugänglicher machen oder weniger zugänglich für positive Transkriptionsregulationsfaktoren.
  • Entsprechend kann die Expression eines beliebigen Gens in einem beliebigen Organismus durch Chromatinmodifizierung, wie hierin offenbart, moduliert werden, einschließlich von therapeutisch relevanten Gene, Genen infizierender Mikroorganismen, viraler Gene und Genen, deren Expression im Prozess von Zielvalidierung moduliert wird. Derartige Gene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, vaskuloendothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), VEGF-Rezeptoren flt und flk, CCR-5, Lipoproteinrezeptor mit niedriger Dichte (LDLR), Östrogenrezeptor, HER-2/neu, BRCA-1, BRCA-2, Phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK), CYP7, Fibrinogen, Apolipoprotein A (ApoA), Apolipoprotein B (ApoB), Renin, Phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK), CYP7, Fibrinogen, nukleärer Faktor κB (NF-κB), Inhibitor von NF-κB (I-κB), Tumornekrosefaktoren (z.B. TNF-α, TNF-β), Interleukin-1 (IL-1 ), FAS (CD95), FAS-Ligand (CD95L), atrialer nutriuretischer Faktor, Plättchen-abgeleiteter Faktor (PDF), Amyloidvorläuferprotein (APP), Tyrosinase, Tyrosinhydroxylase, β- Aspartylhydroxylase, alkalische Phosphatase, Calpaine (z.B. CAPN10), neuronaler Pentraxin-Rezeptor, Adriamycinreaktionsrezeptor, Apolipoprotein E (apoE), Leptin, Leptinrezeptor, UCP-1, IL-1, IL-1-Rezeptor, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-15, Interleukinrezeptoren, G-CSF, GM-CSF, Kolonie-stimulierender Faktor, Erythropoietin (EPO), Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), PDGF-Rezeptor, Fibroblastwachstumsfaktor (FGF), FGF-Rezeptor, PAF, p16, p19, p53, Rb, p21, myc, myb, Globin, Dystrophin, Eutrophin, zystischer Fibrosetransmembrankonduktanzregulator (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) (CFTR), GNDF, Nervenwachstumsfaktor (NGF), NGF-Rezeptor, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), EGF-Rezeptor, transformierende Wachstumsfaktoren (z.B. TGF-α, TGF-β), Fibroblastwachstumsfaktor (FGF), Interferone (z.B. IFN-α, IFN-β und IFN-γ), Insulin-abgeleiteter Wachstumsfaktor-1 (IGF-1 ), Angiostatin, ICAM-1, Signaltransducer und Aktivator von Transkription (STAT), Androgenrezeptoren, e-Cadherin, Cathepsine (z.B. Cathepsin W), Topoisomerase, Telomerase, bcl, bcl-2, Bax, T-Zell-spezifische Tyrosinkinase (Lck), p38-Mitogen-aktivierte Proteinkinase, Proteintyrosinphosphatase (hPTP), Adenylatcyclase, Guanylatcyclase, α7 neuronaler nikotinerger Acetylcholinrezeptor, 5-Hydroxytryptamin (Serotonin)-2A-Rezeptor, Transkriptionselongationsfaktor-3 (TEF-3), Phosphatidylcholintransferase, ftz, PTI-1, Polygalacturonase, EPSP-Synthase, FAD2-1, Δ-9-Desaturase, Δ-12-Desaturase, Δ-15-Desaturase, Acetyl-Coenzym A-Carboxylase, Acyl-ACP-Thioesterase, ADP-Glucosepyrophosphorylase, Stärkesynthase, Zellulosesynthase, Saccharosesynthase, Fettsäurehydroxidlyase und Peroxisomproliferator-aktivierte Rezeptoren, wie beispielsweise PPAR-γ2.
  • Die Expression von humanen, Säuger-, Bakterien-, Pilz-, Protozoen-, Archaea-, pflanzlichen und viralen Genen kann moduliert werden; virale Gene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Hepatitisvirus-Gene, wie beispielsweise HBV-C, HBV-S, HBV-X und HBV-P; und HIV-Gene, wie beispielsweise tat und rev. Die Modulierung der Expression von Genen, welche Antigene eines pathogenen Organismus kodieren, kann unter Verwendung der offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen erreicht werden.
  • Zusätzliche Gene umfassen Gene, welche kodieren Cytokine, Lymphokine, Interleukine, Wachstumsfaktoren, mitogene Faktoren, apoptotische Faktoren, Cytochrome, chemotaktische Faktoren, Chemokinrezeptoren (z.B. CCR-2, CCR-3, CCR-5, CXCR-4), Phospholipasen (z.B. Phospholipase C), Kernrezeptoren, Retinoidrezeptoren, Organellenrezeptoren, Hormone, Hormonrezeptoren, Onkogene, Tumorsuppressoren, Cycline, Zellzykluskontrollpunktproteine (cell cycle checkpoint proteins) (z.B. Chk1, Chk2), Seneszenz-assoziierte Gene, Immunglobuline, Gene, welche schwere Metallchelatoren kodieren, Proteintyrosinkinasen, Proteintyrosinphosphatasen, Tumornekrosefaktor-Rezeptor-assoziierte Faktoren (z.B. Traf-3, Traf-6), Apolipoproteine, Thrombinfaktoren, vasoaktive Faktoren, Neurorezeptoren, Zelloberflächenrezeptoren, G-Proteine, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (z.B. Substanz K-Rezeptor, Angiotensin-Rezeptor, α- und β-adrenerge Rezeptoren, Serotoninrezeptoren und PAF-Rezeptor), Muscarinrezeptoren, Acetylcholinrezeptoren, GABA-Rezeptoren, Glutamat-Rezeptoren, Dopamin-Rezeptoren, Adhäsionsproteine (z.B. CAMs, Selektine, Integrine und Mitglieder der Immunoglobulin-Superfamilie), Ionenkanäle, Rezeptor-assoziierte Faktoren, hämopoetische Faktoren, Transkriptionsfaktoren und Moleküle, welche bei der Signaltransduktion eine Rolle spielen. Die Expression von mit Erkrankung in Zusammenhang stehenden Genen und/oder von einem oder mehreren Genen, welche für ein spezifisches Gewebe oder einen Zelltyp spezifisch sind, wie beispielsweise Gehirn, Muskel, Herz, Nervensystem, Kreislaufsystem, Fortpflanzungssystem, urogenitales System, Verdauungssystem und Atmungssystem können ebenfalls moduliert werden.
  • Die hierin offenbarten Fusionsmoleküle umfassen eine DNA-Bindungsdomäne, welche an eine Zielstelle bindet. In bestimmten Ausführungsformen liegt die Zielstelle in einer zugänglichen Region von zellulärem Chromatin vor. Zugängliche Regionen können bestimmt werden, wie es in der U.S.-Patentanmeldung mit dem Titel „Databases of Accessible Region Sequences; Methods of Preparation and Use Thereof", Referenz S15, beschrieben wird, welche ebenfalls Eigentum der Anmelderin ist und welche am gleichen Tag wie die vorliegende Anmeldung eingereicht wurde. In zusätzlichen Ausführungsformen kann die DNA-Bindungsdomäne eines Fusionsmoleküls an zelluläres Chromatin binden, unabhängig davon, ob sich seine Zielstelle in einer zugänglichen Region befindet oder nicht. Beispielsweise können derartige DNA-Bindungsdomänen an Linker-DNA und/oder nukleosomale DNA binden. Beispiele für diese Art von „Pionier"-DNA-Bindungsdomäne finden sich in einem bestimmten Steroidrezeptor und in dem Hepatocyten-nukleären Faktor 3 (HNF3). Cordingley et al., oben; Pina et al., oben; und Cirillo et al., oben.
  • Verfahren zur Chromatinmodifizierung in einer Region von Interesse können mit Verfahren kombiniert werden, welche die Bindung von endogenen oder exogenen Transkriptionsregulatoren in der Region von Interesse umfassen, um eine Modulierung von Genexpression zu erreichen. Eine Modulierung von Genexpression kann in Form einer Repression vorliegen, wie beispielsweise wenn das Zielgen in einem pathologisch infizierendem Mikroorganismus oder in einem endogenen Gen des Subjekts vorliegt, wie beispielsweise einem Onkogen oder einem viralen Rezeptor, welcher/welches zu einem Krankheitszustand beiträgt. Alternativ kann Modulierung in Form von Aktivierung vorliegen, wenn Aktivierung eines Gens (z.B. ein Tumorsuppressorgen) einen Krankheitszustand verbessern kann. Für derartige Anwendungen kann ein exogenes Molekül mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert werden, wie es dem Fachmann bekannt ist. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, 1985; und WO 00/42219, welche ebenfalls Eigentum der Anmelderin ist.
  • In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren die Verwendung eines Fusionsmoleküls umfassend eine DNA-Bindungsdomäne und eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes zur Modifizierung der Chromatinstruktur in einer Region von Interesse, in Kombination mit einem zweiten Molekül, welches Transkriptionsregulationsaktivität aufweist, welches an die Region von Interesse nur nach Modifizierung der Chromatinstruktur in der Region von Interesse bindet. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das zweite Molekül eine Fusion zwischen einer DNA-Bindungsdomäne und entweder einer Transkriptionsaktivierungsdomäne oder einer Transkriptionsrepressionsdomäne. Eine beliebige Polypeptidsequenz oder Domäne, welche Genexpression beeinflussen kann, welche an eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert werden kann, ist zur Verwendung geeignet. Aktivierungs- und Repressionsdomänen sind dem Fachmann wohl bekannt und werden beispielsweise in der WO 00/41566, welche ebenfalls Eigentum der Anmelderin ist, offenbart.
  • Beispiele für Aktivierungsdomänen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, VP16, VP64, p300, CBP, PCAF, SRC1, PvALF, AtHD2A und ERF-2. Siehe beispielsweise Robyr et al. (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood et al. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275; Leo et al. (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochem. Pol. 46:77-89; McKenna et al. (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik et al. (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; und Lemon et al. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504. Zusätzliche beispielhafte Aktivierungsdomänen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, -6, -7 und -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP und TRAB1. Siehe beispielsweise Ogawa et al. (Gene) 245:21-29; Okanami et al. (1996) Genes Cell 1:87-99; Goff et al. (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmason et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels et al. (2000) Plant J. 22:1-8; Gong et al. (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; und Hobo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353.
  • Beispielhafte Repressionsdomänen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, KRAB, SID, MBD2, MBD3, Mitglieder der DNMT-Familie (z.B. DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb und MeCP2. Siehe beispielsweise Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; und Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342. Weitere beispielhafte Repressionsdomänen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, ROM2 und AtHD2A. Siehe beispielsweise Chern et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; und Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27.
  • Es ist wahrscheinlich, dass viele Transkriptionsregulationsmoleküle, sowohl endogene als auch exogene, mit ihren Zielstellen nicht wechselwirken können (und daher nicht in der Lage sind, ihre regulatorischen Effekte auszuüben), wenn die Zielstelle in zellulärem Chromatin vorliegt. Ohne dass es erwünscht ist, durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass eine Chromatinmodifizierung in einer Region von Interesse solche Zielstellen für ihre Bindungsmoleküle zugänglich machen kann. Entsprechend ergänzen die hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen Verfahren zur in vivo-Genregulation unter Verwendung exogener Moleküle, für solche Fälle, in welchen die Zielstelle für exogene Moleküle in einer unzugänglichen Region in zellulärem Chromatin liegt. Verfahren zur Genregulation unter Verwendung von exogenen Molekülen werden beispielsweise in WO 00/41566 offenbart, welche ebenfalls Eigentum der Anmelderin ist. Diese umfassen Anwendungen zur Regulierung von Pflanzengenexpression, funktionalle Genomforschung (functional genomics) und transgene Tieren.
  • Gegenwärtig gibt es signifikante Schwierigkeiten in therapeutischen Situationen, in denen die Reaktivierung eines entwicklungsbedingt ruhenden (developmentally-silenced) Gens erfordern. Entwicklungsspezifisch-induzierte Geninaktivierung kann durch Methylierung von CpG-Inseln in der stromaufwärts liegenden Region eines Gens vermittelt werden. Daher kann die Verwendung einer Bindungsdomäne, welche für methylierte DNA spezifisch ist, als der DNA-Bindungsanteil einer Fusion, eine Rekrutierung eines Chromatin-Remodeling-Komplexes zu der stromaufwärts liegenden Region eines entwicklungsbedingt ruhenden Gens, wodurch das Gen für exogene Regulationsfaktoren zugänglich gemacht wird, erleichtern und zu einer therapeutischen Reaktivierung des Gens führen. In einer anderen Ausführungsform kann eine Fusion zwischen einer methylierten DNA-Bindungsdomäne und einer Demethylase zur Reaktivierung eines Gens, welches durch Methylierung abgeschaltet wurde, verwendet werden.
  • Die hierin offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren sind für zahlreiche Anwendungen nützlich und stellen Vorteile gegenüber existierenden Verfahren bereit. Diese umfassen die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verabreichung eines exogenen Moleküls an ein Subjekt und welche zur Modulierung der Expression eines Zielgens im Subjekt verwendet wird. Siehe beispielsweise die ebenfalls anhängige Druckschrift WO 00/41566. Die offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren können auch die Detektion von bestimmten Sequenzen durch Binden eines exogenen Moleküls an eine Bindungsstelle in zellulärem Chromatin erleichtern, wie beispielsweise in diagnostischen Anwendungen. Verfahren zur Detektion einer Zielsequenz unter beispielhafter Verwendung eines ZFP werden in WO 00/42219 beschrieben, welche ebenfalls Eigentum der Anmelderin ist. Beispielsweise kann ein exogenes Molekül, wie beispielsweise ein Sequenz-spezifisches DNA-Bindungsprotein verwendet werden, um Variantenallele zu detektieren, welche mit einer Erkrankung oder einem bestimmten Phänotyp in Patientenproben verbunden sind und um das Vorliegen von pathogenen Mikroorganismen in klinischen Proben zu detektieren. In einer Ausführungsform umfasst ein Variantenallel einen Einzelnukleotidpolymorphismus (single-nucleotide polymorphism) (SNP). In einer sich nicht gegenseitig ausschließenden Ausführungsform ist das Sequenz-spezifische DNA-Bindungsprotein ein ZFP. Exogene Moleküle können auch verwendet werden, um die Kopienzahl eines Gens in einer Probe zu quantifizieren. Beispielsweise ist die Detektion eines Verlusts einer Kopie eines p53-Gens in einer klinischen Probe ein Indikator für eine Prädisposition für Krebs. Darüber hinaus kann eine Identifizierung von transgenen Pflanzen und Tieren durch Detektion eines Transgens erreicht werden, wobei beispielsweise die Bindung eines Sequenz-spezifischen exogenen Moleküls (wie beispielsweise einem ZFP) als Assay verwendet wird. Alle dieser Arbeitsverfahren können verbessert werden durch Rekrutierung eines Chromatin-Remodeling-Komplexes an eine Region von Interesse in zellulärem Chromatin, um die Bindung eines Bindungsmoleküls in der Region von Interesse zu erleichtern.
  • Die offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen können, wenn sie in Verbindung mit Verfahren zur Bindung von exogenen Molekülen an zelluläres Chromatin verwendet werden, in Assays zur Bestimmung der Genfunktion und zur Bestimmung von Phänotypveränderungen verwendet werden, welche sich aus einer spezifischen Modifizierung der Genexpression ergeben. Siehe beispielsweise U.S.-Patent Nr. 6,599,692.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele werden als für den beanspruchten Gegenstand als veranschaulichend, nicht aber als beschränkend wirkend, präsentiert.
  • Beispiel 1: Entwurf, Synthese und Bindungseigenschaften einer Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, welche eine Zielsequenz im humanen VEGF-Gen erkennt
  • Zielstelle
  • Es wurde eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, welche das Gen des humanen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors-A (VEGF) erkennt, entworfen und entsprechend den Designregeln und Verfahren konstruiert, welche in WO 00/42219, WO 00/41566 und U.S.-Patent Nr. 7,030,215 offenbart sind, wobei diese Schutzrechte welche ebenfalls Eigentum der Anmelderin sind. Die Zielstelle, welche die Transkriptionsinitiationsstelle für das humane VEGF-A-Gen überlappt, ist unten als SEQ ID NO: 1 gezeigt, wobei der Pfeil die Transkriptionsstartstelle anzeigt.
  • Figure 00750001
  • Rückgratstruktur
  • Der humane SP-1-Zinkfingertranskriptionsfaktor wurde als Rückgrat für die Konstruktion einer entwickelten Drei-Finger-DNA-Bindungsdomäne, Veg1, verwendet, welche diese Sequenz erkennen kann. SP-1 weist eine Drei-Finger-DNA-Bindungsdomäne auf, welche mit dem gut untersuchten Zinkfingerprotein Zif268 aus Maus verwandt ist. Christy et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7857-7861. Ortsgerichtete Mutageneseexperimente unter Verwendung dieser Domäne haben gezeigt, dass Wechselbeziehungen zwischen der Aminosäuresequenz eines Zinkfingers und seiner Zielnukleotidsequenz, welche aus Analysen von Zif268 abgeleitet wurden, auch auf SP-1 anwendbar sind und daher verwendet werden können, um die Spezifität von SP-1 für DNA-Sequenzen, welche sich von seiner normalen Zielstelle unterscheiden, anzupassen. Desjarlais et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11099-11103. Der Teil der SP-1-Sequenz, welcher zur Konstruktion von entwickelten Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen verwendet wird, entspricht den Aminosäuren 533 bis 624.
  • Die Aminosäuresequenzen von entwickelten DNA-Bindungsdomänen sind in Tabelle 1 gezeigt. Wie der Tabelle entnommen werden kann, umfasst das entwickelte Veg1-Protein drei Zinkfinger (F1, F2 und F3), welche miteinander eine 9-Basenpaar-Zielstelle erkennen. Die Aminosäuresequenz der Erkennungshelix (Positionen –1 bis +6, wobei +1 die erste Aminosäure in der α-Helix ist) ist für jeden der DNA-Bindungsfinger angegeben. Tabelle 1: Zielstellen und ZFP DNA-Bindungsdomänen im humanen VEGF-A-Gen
    Figure 00760001
  • Sequenzen, welche die Veg1-DNA-Bindungsdomäne kodieren
  • Es wurde ein auf Polymerasekettenreaktion (PCR) basierendes Zusammensetzungsverfahren unter Verwendung von sechs überlappenden Oligonukleotiden zur Synthese eines synthetischen Gens, welches die Veg1-DNA-Bindungsdomäne kodiert, verwendet. Siehe 1. Drei der Oligonukleotide (1, 3 und 5 in 1) entsprechen „universellen" Sequenzen, welche Abschnitte der DNA-Bindungsdomäne zwischen den Erkennungshelices kodieren. Diese Oligonukleotide sind für ein beliebiges gegebenes Zinkfingerkonstrukt gleichbleibend. Die anderen drei „spezifischen" Oligonukleotide (2, 4 und 6 in 1) wurden entwickelt, um die Erkennungshelices zu kodieren. Diese Oligonukleotide enthielten verschiedene Sequenzen, welche die Aminosäuren an den Positionen –1, +2, +3 und 6 in jeder Erkennungshelix kodieren, in Abhängigkeit von ihrer Zieltripletsequenz. Es wurde eine Kodon-Ausrichtung gewählt, welche eine Expression sowohl in Säugerzellen als auch in E. coli ermöglicht.
  • Die Zusammensetzung von Veg1 kodierenden Sequenzen wurde wie im Folgenden beschrieben durchgeführt. Zuerst wurden die sechs Oligonukleotide (drei universelle und drei spezifische, wie oben beschrieben) kombiniert und bei 25°C zur Bildung eines DNA-Gerüsts mit Lücken einem Annealing unterzogen. Als nächstes wurden die Lücken durch Durchführung einer PCR-Reaktion mit vier Zyklen (unter Verwendung von Taq- und Pfu-thermostabilen DNA-Polymerasen) zur Erzeugung einer doppelsträngigen Matrize aufgefüllt. Diese Matrize wurde amplifiziert (für dreißig Zyklen), wobei ein Paar externer Primer, welche Kpn I- und Hind III-Restriktionsstellen enthielten, verwendet wurde. Die PCR-Produkte wurden direkt in die Kpn I- und Hind III-Stellen des Tac-Promotorvektors, pMaI-c2 (New England Biolabs, Beverly, MA) kloniert. Die Veg1-Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne wurde von diesem Vektor exprimiert und als eine Fusion mit dem Maltosebindungsprotein gemäß den Anweisungen des Herstellers (New England Biolabs, Beverly, MA) gereinigt.
  • Die Fehlerfreiheit des Veg1-Klons wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Veg1-Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sind wie im Folgenden gezeigt: Veg1-Nukleotidsequenz:
    Figure 00770001
  • Veg1-Aminosäuresequenz
    • VPIPGKKKQHICHIQGCGKVYGTTSNLRRHLRWHTGERPFMCTWSYCGK RFTRSSNLQRHKRTHTGEKKFACPECPKRFMRSDHLSRHIKTHQNKKGGS (SEQ ID NO: 11)
  • Expression von Veg1
  • Die Expression von entwickelten ZFPs wurde in zwei verschiedenen Systemen durchgeführt. Im ersten wurden die DNA-Bindungspeptide in E. coli mittels Insertieren in den kommerziell erhältlichen pET15b-Vektor (Novagen) exprimiert. Dieser Vektor enthält eine T7-Promotorsequenz, um die Expression von rekombinantem Protein zu lenken. Die Konstrukte wurden in E. coli-BL21/DE3 (lacIq)-Zellen eingeführt, welche eine IPTG-induzierbare T7-RNA-Polymerase enthalten. Die Kulturen wurden mit 50 μM ZnCl2 supplementiert, bei 37°C bis zu einer OD bei 600 nm von 0,5–0,6 aufgezogen, und die Proteinproduktion wurde durch IPTG für 2 Stunden induziert. Diese Proteine werden als „nicht-fusionierte" ZFPs bezeichnet.
  • Teilweise reine, nicht-fusionierte ZFPs wurden wie im Folgenden beschrieben hergestellt (adaptiert aus Desjarlais et al. (1992) Proteins: Structure, Function and Genetics 12:101-104). Ein gefrorenes Zellpellet wurde in 1/50 Volumen 1 M NaCl, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 μM ZnCl2, 5 mM DTT resuspendiert. Die Proben wurden für 10 Min gekocht und bei ~ 3.000 × g für 10 Min zentrifugiert. An diesem Punkt war das ZFP-Protein in Überstand > 50% rein (abgeschätzt durch Färben von SDS-Polyacrylamidgelen mit Coomassie-Blau) und das Produkt wanderte mit dem vorausgesagtem Molekulargewicht von etwa 11 kDa.
  • Das zweite Verfahren zur Herstellung von ZFPs war, sie als Fusionen mit dem E. coli-Maltosebindungsprotein (MBP) zu exprimieren. N-terminale MBP-Fusionen mit ZFPs wurden konstruiert durch PCR-Amplifizierung der pET15b-Klone und Insertieren in den Vektor pMal-c2 (New England Biolabs) unter der Kontrolle des Tac-Promotors. Die Fusion erlaubt eine einfache Aufreinigung und Detektion von rekombinantem Protein. Es ist zuvor beschrieben worden, dass Zinkfinger-DNA-Bindungsproteine von diesem Vektor aus in löslicher Form in hohen Mengen in E. coli exprimiert werden können und effizient an das entsprechende DNA-Ziel ohne Rückfaltung binden können. Liu et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5525-5530. Die Herstellung von MBP-fusionierten Proteinen war wie vom Hersteller beschrieben (New England Biolabs, Beverly, MA). Transformanten wurden in LB-Medium aufgezogen, welches mit Glucose und Ampicillin supplementiert war, und sie wurden mit IPTG für 3 Stunden bei 37°C induziert. Die Zellen wurden durch eine French Press lysiert, anschließend gegenüber Amyloseharz auf Grundlage von Agarose exponiert, welches spezifisch den MBP-Rest bindet, wodurch es als Aftinitätsharz für das MBP-Fusionsprotein wirkt. Das MBP-Fusionsprotein wurde mit 10 mM Maltose zur Freisetzung von ZFP mit > 50% Reinheit eluiert. In einigen Fällen wurde das Protein unter Verwendung einer Centricon 30-Filtereinheit (Amicon) weiter konzentriert.
  • Bestimmung von Bindungsaffinität
  • Teilweise gereinigte ZFPs (sowohl nicht-fusionierte als auch MBP-Fusionen) wurden durch elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays (EMSA) untersucht, um ihre Fähigkeit, an ihre Ziel-DNA-Sequenzen zu binden, zu bewerten. Proteinkonzentrationen wurden durch Bradford-Assay gemessen (BioRad). Da SDS-Polyacrylamidgele > 50% Homogenität an ZFP, welches durch eines der Reinigungsverfahren hergestellt worden war, zeigten, wurde in den Berechnungen keine Anpassung hinsichtlich der ZFP-Reinheit durchgeführt. Aus diesem Grund stellen die durch EMSA (unten gezeigt) erstellten Daten eine Unterbewertung der möglichen Affinität der Proteine für ihre Ziele dar (d.h. Kd wird überschätzt). Darüber hinaus könnte auch inaktives Protein in den Präparationen zu einer Unterbewertung der Bindungsaffinität der aktiven Moleküle in der Präparation beitragen. Es wurden zwei getrennte Proteinpräparationen zur Bestimmung von Kd verwendet, um so eine Kontrolle von Unterschieden hinsichtlich der ZFP-Aktivität zu unterstützen.
  • Ein 29-mer Duplexoligonukleotid wurde als Bindungsziel für eine elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsanalyse von Veg1 verwendet. Die Sequenz des Duplex war wie im Folgenden gezeigt (wobei VEGF-Sequenzen fettgedruckt und die Zielstelle unter-/überstrichen ist):
    5'-CATGCATAGCGGGGAGGATCGCCATCGAT-3'
    3'-GTACGTATCGCCCCTCCTAGCGGTAGCTA-5'
    (SEQ ID NO: 12)
  • Der obere Strang wurde vor dem Annealing mit Polynukleotidkinase und γ-32P ATP markiert. Der obere und der untere Strang wurden in einer Reaktion annealt, welche jedes Oligonukleotid mit 0,5 μM, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA und 50 mM NaCl enthielt. Dieses Gemisch wurde auf 95°C für 5 Min erwärmt und langsam über 60 Min auf 30°C abgekühlt. Die Duplexbildung wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese bestätigt. Freie Markierung und einzelsträngige DNA, welche in den Zielpräparationen zurückblieb, schien die Bindungsreaktionen nicht zu beeinträchtigen.
  • Assays zur Bindung von Veg1 an das Zieloligonukleotid (oben) wurden durch Titrieren von Protein gegen eine feste Menge an Duplexziel durchgeführt. Die Bindungsreaktionen enthielten 50 pM 5' 32P-markierte doppelsträngige Ziel-DNA, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol, 10 Glycerin, 200 μg/ml Rinderserumalbumin, 0,02 % NP-40, 20 μg/ml Poly-dI-dC (optional) und 100 μM ZnCl2 in einem Endvolumen von 20 μl. Protein wurde zu der Bindungsreaktion als Ein-Fünftel-Volumen aus einer Verdünnungsserie hinzugegeben, welche in 200 mM NaCl, 20 mM Tris (pH 7,5), 1 mM DTT durchgeführt worden war. Man ließ die Bindungsreaktion für 45 Minuten bei Raumtemperatur stattfinden. Es wurde Polyacrylamidgelelektrophorese bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei vorgefertigte 10% oder 10–20% Tris-HCl-Gele (BioRad, Hercules, CA) und Tris-Glycin-Laufpuffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, pH 8,3), welcher 0,1 mM ZnCl2 enthielt, verwendet wurden. Radioaktive Signale wurden mit einem Phosphorimager quantifiziert.
  • 2 zeigt die Ergebnisse einer EMSA-Analyse von Veg1, unter Verwendung einer Vierfach-Verdünnungsserie des Veg1-Proteins. Verschobenes Produkt, welches für markiertes Ziel mit gebundenem Protein Indikativ ist, wird durch einen Pfeil in 2A gezeigt. Die Menge an verschobenem Produkt wurde für jede Proteinkonzentration bestimmt und auf einem Phosphorimager (Molecular Dynamics) quantifiziert. Das relative Signal (Prozent maximaler Menge an verschobenem Produkt) wurde als Funktion einer log10-Proteinkonzentration aufgetragen. In diesem Fall betrug die Proteinkonzentration, welche halb-maximale Bindung von Veg1 an seine Zielstelle ergab (d.h. der anscheinende Kd) etwa 50 nM. MBP-fusionierte und nicht-fusionierte Versionen von Veg1 banden an die Zielstelle mit ähnlichen Affinitäten.
  • Beispiel 2: Konstruktion eines Gens, welches eine Fusion zwischen der Veg1-DNA-Bindungsdomäne und hBAF 155 kodiert
  • Die Veg1-DNA-Bindungsdomäne wird in einen eukaryotischen Expressionsvektor auf eine solche Art und Weise subkloniert, dass sie mit der hBAF 155-Untereinheit des brm/BRG-Chromatin-Remodeling-Komplexes fusioniert ist. Zuerst wird eine cDNA-Sequenz, welche ein Volllängen-BAF 155-Protein kodiert, unter Verwendung von Langstrecken-PCR kloniert. Barnes (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2216-2220; Cheng et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699. Reagenzien und Enzyme zur Durchführung einer Langstrecken-PCR sind von Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN) unter der Bezeichnung „Expand PCR System" erhältlich. Die Oligonukleotidprimer sind homolog zu Sequenzen gerade stromaufwärts des Translationsinitiationskodons bei Nukleotid 55 und gerade stromabwärts des Endkodons (Prolin bei Nukleotid 3366). (Das BAF155-Nummerierungsschema bezieht sich auf die Genbank Accession-Nummer U66615). Darüber hinaus enthält der Primer stromaufwärts von Nukleotid 55 eine BamHI-Stelle, welche so positioniert ist, dass, wenn stromaufwärts liegende Sequenzen, welche die Veg1-DNA-Bindungsdomäne kodieren, an BAF155-Sequenzen positioniert werden, der Translationsleserahmen erhalten bleibt. Darüber hinaus enthält der Primer stromabwärts von Nukleotid 3366 eine HindIII-Stelle gerade stromabwärts des Endkodons von BAF155, welche so positioniert ist, dass, wenn BAF155-Sequenzen an stromabwärts liegende Sequenzen, welche ein FLAG-Eipitoptag kodieren, fusioniert werden, der Translationsleserahmen erhalten bleibt.
  • PCR wird durchgeführt unter Verwendung von cDNA aus HeLa-Zellen als Matritze. Amplifiziertes Produkt mit einer Größe von etwa 3400 Basenpaaren wird Gel-gereinigt und direkt in einen Topo2-Klonierungsvektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Ortsgerichtete Mutagenese wird verwendet, um die BamHI-Stelle an BAF155-Position 2304 zu eliminieren, ohne die Kodierungskapazität oder den Translationsleserahmen des Gens zu ändern. Ein ähnlicher Ansatz wird verwendet, um die KpnI-Stellen an den Nukleotiden 2235 und 3243 sowie die HindIII-Stellen an den Nukleotiden 656 und 2365 zu eliminieren. Das klonierte und modifizierte BAF155-Gen wird anschließend aus dem Topo2-Vektor durch Verdau mit BamH1 und HindIII entfernt und Gel-gereinigt.
  • Der Expressionsvektor wird modifiziert aus pcDNA3.1 (–) (Invitrogen, Carlsbad, CA) durch Verdau mit EcoRI und HindIII und Insertieren eines doppelsträngigem Oligonukleotids, welches eine EcoRI-Stelle, eine Translationsinitiationssegenz (Kozak (1991) J. Biol. Chem. 266:19,867-19,870), ein Kernlokalisierungssignal (NLS), eine KpnI-Stelle, eine BamHI-Stelle und eine HindIII-Stelle kodiert. Das NLS ist aus dem SV40-Großen-T-Antigen abgeleitet (Kalderon et al. (1984) Cell 39:499-509) und weist die Aminosäuresequenz MAPKKKRKVGIHGV (SEQ ID NO: 13) auf.
  • Dieses Plasmid wird anschließend mit BamHI und HindIII verdaut, und das BamHI-HindIII-Fragment umfassend das BAF155-Gen (oben) wird insertiert. Ein doppelsträngiges Oligonukleotid, welches ein FLAG-Epitop (mit der Sequenz DYKDDDDK, SEQ ID NO: 14) kodiert und welches an beiden Enden HindIII-Stellen enthält, wird gleichzeitig mit dem BAF155-haltigen Fragment insertiert. Alternativ kann das FLAG-haltige HindIII-Fragment in einer getrennten nachfolgenden Ligation insertiert werden. Das sich ergebende Konstrukt umfasst, in der Reihenfolge, einen CMV-Intermediate Early Promotor, eine EcoRI-Stelle, eine Translationsinitiationssequenz, eine SV40-Großes-T-Antigen-Kernlokalisierungssequenz, eine KpnI-Stelle, eine BamHI-Stelle, eine hBAF155-kodierende Sequenz, eine HindIII-Stelle, ein FLAG-Epitop, eine HindIII-Stelle, ein Rinderwachstumshormon (bGH)-Polyadenylierungssignal, in einem pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)-Plasmidrückgrat. Der CMV-Promotor und das bGH-Polyadenylierungssignal sind aus dem ursprünglichen pcDNA3.1-Vektor abgeleitet, da es sich dabei um Sequenzen zur Replikation und Selektion handelt.
  • Als nächstes wird die Veg1 ZFP-DNA-Bindungsdomäne (siehe Beispiel 1) als ein KpnI-BamHI-Fragment in den Vektor, welcher im vorausgehenden Abschnitt beschrieben ist, zur Erzeugung eines Vektors insertiert, welcher ein Protein kodiert mit der Struktur (vom N- zum C-Terminus): Kernlokalisierungssequenz – Veg1 DNA-Bindungsdomäne – hBAF155 – FLAG-Epitoptag. Die Integrität dieses Konstrukts und die Erhaltung des Leserahmens werden auf jeder Stufe des Arbeitsverfahrens durch Nukleotidsequenzanalyse bestätigt. Nach Transfektion in Säugerzellen erzeugt dieser Vektor eine NLS-Veg1-BAF155-FLAG-Fusion, deren Transkription durch einen CMV-Immediate Early Promotor und ein Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignal kontrolliert wird.
  • Ähnliche Arbeitsverfahren werden verwendet, um ein Plasmid zu konstruieren, welches eine Fusion einer DNA-Bindungsdomäne mit einer beliebigen Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes kodiert. In Kürze, ein Polynukleotid, welches eine Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes (oder eines funktionellen Fragments davon) kodiert, wird durch PCR aus cDNA (oder ggf. genomischer DNA) unter Verwendung von Primern erhalten, welche flankierende BamHI- und HindIII-Stellen enthalten. BamHI-, KpnI- und HindIII-Stellen werden, falls sie im amplifizierten Produkt vorliegen, durch Ortsgerichtete Mutagenese entfernt, wobei der Leserahmen und die Kodierungskapazität im Verfahren erhalten werden. Das amplifizierte Gen wird in einen BamHI/HindIII-verdauten Expressionsvektor, welcher wie oben beschrieben konstruiert ist, eingeführt, ggf. zusammen mit einem HindIII-Fragment, welches ein FLAG-Epitop enthält. Das sich ergebende Konstrukt wird mit KpnI und BamHI verdaut und ein KpnI/BamHI-Fragment, welches eine DNA-Bindungsdomäne kodiert, vorzugsweise eine ZFP-DNA-Bindungsdomäne, wird insertiert. Sequenzen, welche Kernlokalisierungssequenzen und FLAG-Epitope kodieren, sind zur immunologischen Detektion des Fusionsproteins ggf. im Konstrukt eingeschlossen.
  • Plasmide, welche diese Fusionen kodieren, werden in einem beliebigen geeigneten Wirtsstamm vermehrt, vorzugsweise den E. coli-Stämmen JM109 oder HB101.
  • Beispiel 3: Entwurf und Synthese einer Sechs-Finger-ZFP DNA-Bindungsdomäne, welche Zielsequenzen im humanen VEGF-Gen erkennt
  • Zielstelle
  • Es wurde eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, welche das Gen des humanen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors-A (VEGF) erkennt, entworfen und entsprechend den Designregeln und Verfahren konstruiert, welche in WO 00/42219, WO 00/41566 und U.S.-Patent Nr. 7,030,215 offenbart sind, wobei diese Schutzrechte welche ebenfalls Eigentum der Anmelderin sind. Die Zielstelle, welche die Transkriptionsinitiationsstelle für das humane VEGF-A-Gen überlappt, ist unten als SEQ ID NO: 15 gezeigt, wobei der Pfeil die Transkriptionsstartstelle anzeigt.
  • Figure 00840001
  • Rückgratstruktur
  • Die Aminosäuren 533-624 des humanen SP-1-Zinkfingertranskriptionsfaktors wurden als Rückgrat für die Konstruktion einer entworfenen Sechs-Finger-DNA-Bindungsdomäne, Veg3a/1, verwendet, welche diese Sequenz erkennen kann.
  • Die Aminosäuresequenzen der entworfenen DNA-Bindungsdomänen sind in Tabelle 1 gezeigt. Wie der Tabelle entnommen werden kann, umfasst das entworfene Veg3a/1-Protein zwei Subdomänen, Veg1 und Veg3a, wobei jede drei Zinkfinger (F1, F2 und F3) umfasst und jede eine 9-Basenpaar-Unterstelle der Zielstelle erkennt, verbunden durch die Linkersequenz DGGGS (SEQ ID NO: 16). Die Aminosäuresequenz der Erkennungshelix (Positionen –1 bis +6, wobei +1 die erste Aminosäure in der α-Helix ist) ist für jeden der DNA-Bindungsfinger in Tabelle 1 angegeben.
  • Sequenzen, welche Veg1- und Vep3a-Subdomänen kodieren
  • Die Synthese der Veg1-Bindungsdomäne wurde in Beispiel 1 beschrieben. Die Zusammensetzung der Veg3a-kodierenden Sequenzen wurde wie oben für Veg1 beschrieben (Beispiel 1 und 1) durchgeführt, außer dass unterschiedlich spezifische Oligonukleotide verwendet wurden, um die Veg3a-Erkennungshelices zu kodieren.
  • Die Fehlerfreiheit des Veg3a-Klons wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Veg3a-Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sind wie im Folgenden gezeigt. Veg3a-Nukleotidsequenz:
    Figure 00850001
  • Veg3a-Aminosäuresequenz:
    • VPIPGKKKQHICHIQGCGKVYGQSSDLQRHLRWHTGERPFMCTWSYCGK RFTRSSNLQRHKRTHTGEKKFACPECPKRFMRSDELSRHIKTHQNKKGGS (SEQ ID NO: 18).
  • Die Erkennungsregionen des Veg3a-Polypeptids (Aminosäuren –1 bis +6 der Zinkfinger-Erkennungshelices) sind dick unterstrichen gezeigt.
  • Bestimmung von Veg3a-Bindungsaffinität
  • Die gereinigte Veg3a-Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne wird hinsichtlich ihrer Affinität für ihre DNA-Zielstelle durch elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsanalyse untersucht. Es wurde ein doppelsträngiges Zieloligonukleotid durch Annealing von komplementären 29-meren konstruiert und anschließend unter Verwendung von Polynukleotidkinase und γ-32P-ATP endmarkiert. Die Sequenz des Ziels war wie im Folgenden gezeigt (wobei VEGF-Sequenze in dick und Zielstellen unter-/überstrichen dargestellt sind):
    5' -CATGCATATCGCGGAGGCTTGGCATCGAT-3'
    3' -GTACGTATAGCGCCTCCGAACCGTAGCTA-5'
    (SEQ ID NO: 19)
  • Fusion von Veg1- und Veg3a-Subdomänen zur Bildung einer Veg3a/1-Bindungsdomäne
  • Veg1- und Veg3a-Bindungssubdomänen wurden miteinander verbunden, wobei die Linkersequenz DGGGS (SEQ ID NO: 16) verwendet wurde. Diese spezifische Linkersequenz wurde ausgewählt, da sie eine Bindung von zwei Drei-Finger-ZFP-Bindungssubdomänen an zwei 9-bp-Stellen erlaubt, welche durch eine Ein-Nukleotid-Lücke getrennt sind, wie es für die Veg1- und Veg3a-Stellen der Fall ist. Siehe auch Liu et al., oben.
  • Die 6-Finger-Veg3a/1-Protein-kodierende Sequenz wurde wie im Folgenden beschrieben erzeugt. Sequenzen, welche Veg3a-Erkennungshelices kodieren, wurden vom Veg3a-kodierenden Vektor (oben) mittels PCR amplifiziert, wobei die Primer SPE7 (5'-GAGCAGAATTCGGCAAGAAGAAGCAGCAC) (SEQ ID NO: 20) und SPEamp12 (5'-GTGGTCTAGACAGCTCGTCACTTCGC) (SEQ ID NO: 21) verwendet wurden, um ein doppelsträngiges Fragment zu erzeugen, welches durch EcoR1- und XbaI-Restriktionsstellen (in den Sequenzen der Primer unterstrichen) eingegrenzt war. Das Amplifizierungsprodukt wurde mit EcoRI- und XbaI verdaut. Sequenzen, welche Veg1-Erkennungshelices kodieren, wurden mittels PCR vom Veg1-kodierenden Vektor (Beispiel 1) unter Verwendung der Primer SPEamp13 (5'-GGAGCCAAGGCTGTGGTAAAGTTTACGG) (SEQ ID NO: 22) und SPEamp11 (5'-GGAGAAGCTTGGATCCTCATTATCCC) (SEQ ID NO: 23) amplifiziert, zur Erzeugung eines doppelsträngigen Amplifizierungsprodukts, welches durch StyI- und HindIII-Restriktionsstellen (in den Sequenzen der Primer unterstrichen) eingegrenzt war. Das sich ergebende Amplifizierungsprodukt wurde mit StyI und HindIII verdaut. Es wurde ein drittes doppelsträngiges Fragment konstruiert, wobei synthetische Oligonukleotide verwendet wurden, welche den DGGGS-Linker kodieren, flankiert durch die Reste der Veg1- und Veg3a-DNA-Bindungsdomänen und eingegrenzt durch XbaI- und StyI-Stellen. Die Sequenz dieses dritten Fragments ist wie im Folgenden gezeigt, wobei die XbaI- und StyI-Stellen unterstrichen sind:
  • Figure 00870001
  • Diese drei Fragmente wurden aneinander legiert, das Ligationsprodukt wurde mit den Primern SPE7- und SPEamp11 amplifiziert, und das sich ergebende Amplifizierungsprodukt wurde mit EcoR1 und HindIII verdaut und in die EcoRI- und HindIII-Stellen von pUC19 kloniert.
  • Die verknüpfe Veg3a- und Veg1-kodierende Sequenz im pUC19-Rückgrat wurde anschließend amplifiziert mit den Primern GB19 (5'-GCCATGCCGGTACCCATACCTGGCAAGAAGAAGCAGCAC) (SEQ ID NO: 26) und GB10 (5'-CAGATCGGATCCACCCTTCTTATTCTGGTGGGT (SEQ ID NO: 27), um KpnI- und BamHI-Stellen an den Enden des Amplifizierungsprodukts einzuführen (Restriktionsstellen sind unterstrichen). Die Amplifizierungsprodukte wurden anschließend mit KpnI und BamHI verdaut und in den oben beschriebenen modifizierten pMAL-c2-Expressionsvektor kloniert.
  • Die Nukleotidsequenz, welche das entwickelte 6-Finger ZFP Veg3a/1 kodiert, ist von der KpnI-Stelle zu der BamHI-Stelle:
    Figure 00870002
    Figure 00880001
  • Die VEGF3a/1-Aminosäuresequenz (unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes) ist:
    Figure 00880002
  • Das VEGF3a/1-Protein wurde wie oben beschrieben in E. coli als MBP-Fusion exprimiert, durch Affinitätschromatographie gereinigt und in EMSA-Experimenten untersucht. Ein markiertes doppelsträngiges Oligonukleotid umfassend die Zielstelle wurde hergestellt durch Synthese und Annealing von zwei überlappenden Oligonukleotiden, von welchen eines mit 32P markiert war. Die Oligonukleotide umfassten die im Folgenden gezeigten Sequenzen (wobei die Zielstelle über-/unterstrichen ist):
    AGCGAGCGGGGAGGATCGCGGAGGCTTGGGGCAGCCGGGTAG (SEQ ID NO: 30)
    TCGCCCCTCCTAGCGCCTCCGAACCCCGTCGGCCCATCTCGC (SEQ ID NO: 31)
  • Es wurde eine Bindungsanalyse wie in Beispiel 1 für das Veg1-Protein beschrieben durchgeführt.
  • Man ermöglichte Bindungsreaktion für 60 Min entweder bei Raumtemperatur oder bei 37°C und es wurde Polyacrylamidgelelektrophorese bei Raumtemperatur oder 37°C durchgeführt, wobei vorgefertigte 10 % oder 10–20 Tris-HCl-Gele (BioRad) und Standard-Tris-Glycin-Laufpuffern verwendet wurden. Die Assays bei Raumtemperatur ergaben einen offenkundigen Kd (bestimmt wie oben beschrieben) für das Veg3a/1-Protein von etwa 1,5 nM. Wenn die Bindungsreaktion und Elektrophorese bei 37°C durchgeführt wurden, betrug der offenkundige Kd von Veg3a/1 etwa 9 nM, wenn gegen das 18-bp Ziel untersucht wurde. Daher band das Sechs-Finger-Veg3a/1 ZFP mit höherer Affinität an seine Zielstelle.
  • Beispiel 4: Konstruktion eines Gens, welches eine Fusion zwischen einer ZFP-DNA-Bindungsdomäne und einem Protein mit Methylbindungsdomäne kodiert
  • Ein Plasmid, welches eine Fusion zwischen dem humanen MBD1-Gen und der Veg3a/1-DNA-Bindungsdomäne kodiert, wird konstruiert unter Verwendung von Verfahren, welche ähnlich zu denen sind, die oben für die BAF155/Veg1-Fusion beschrieben sind (Beispiel 2). Sequenzen, welche MBD1 (GenBank-Accession Nr. NM015846) kodieren, werden durch PCR aus genomischer DNA oder aus cDNA isoliert. Die Amplifizierungsprimer werden so entworfen, dass der Primer entsprechend der stromaufwärts liegenden Region des Gens eine BamHI-Stelle an seinem oder nahe an seinem stromaufwärts liegenden Terminus umfasst und der Primer entsprechend der stromabwärts liegenden Region des Gens eine HindIII-Stelle an oder nahe an seinem stromabwärts liegenden Terminus umfasst. Die Primer werden entworfen, um die Region zwischen den Nukleotiden 140 (MBD1-Initiationskodon) und 1957 (MBD1-Terminationskodon) zu amplifizieren und um den richtigen Leserahmen des MBD1-Gens zu erhalten, wenn das Amplifikationsprodukt als eine Komponente eines Fusionsgens inkorporiert wird. Das Amplifikationsprodukt wird ggf. kloniert, eine BamHI-Stelle an Nukleotid 264 der MBD1-Sequenz wird durch ortsgerichtete Mutagenese entfernt und das BamHI/HindIII-Fragment wird aus dem Klonierungsvektor freigesetzt und gereinigt. Sequenzen, welche die VEG3a/1 DNA-Bindungsdomäne kodieren, werden als ein KpnI/BamHI-Fragment (Beispiel 3) erhalten. Das MBD1-kodierende BamHI/HindIII-Fragment und das Veg3a/1-kodierende KpnI/BamHI-Fragment werden in pcDNA3.1(–) oder ein modifiziertes Derivat (Beispiel 2) insertiert. Gegebenenfalls sind ein Kernlokalisierungssignal und/oder ein FLAG-Epitop im Fusionskonstrukt eingeschlossen.
  • Das MBD1-Gen kann in wenigstens zwei funktionelle Fragmente aufgeteilt werden: eine methylierte DNA-Bindungsdomäne (kodiert durch die Nukleotide 158-322) und eine funktionelle Domäne. Entsprechend wird ein MBD/ZFP-Fusionsgen konstruiert, welchem die Sequenzen fehlen, die die methylierte DNA-Bindungsdomäne kodieren, aber welches die funktionelle Domäne des MBD1-Proteins enthält. In diesem Fall umfasst das BamHI/HindIII-terminierte Amplifizierungsprodukt die Nukleotide 322 bis 1957 des MBD1-Gens.
  • Es wird ein ähnliches Fusionsgen konstruiert, in welchen das MBD2-Gen (GenBank- Accession Nr. NM003927) oder ein funktionelles Fragment davon an eine ZFP DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist. In diesem Fall werden Amplifizierungsprimer entworfen, um die Region zwischen den Nukleotiden 230 (MBD2-Initiationskodon) und 1465 (MBD2-Terminationskodon) zu amplifizieren und um den richtigen Leserahmen des MBD2-Gens zu erhalten, wenn das Amplifizierungsprodukt als eine Komponente eines Fusionsgens inkorporiert wird. Das Amplifizierungsprodukt wird ggf. kloniert, eine KpnI-Stelle an Nukleotid 813 und eine HindIII-Stelle an Nukleotid 1308 der MBD1-Sequenz werden durch ortsgerichtete Mutagenese entfernt und das BamHI/HindIII-Fragment wird aus dem Klonierungsvektor freigesetzt und gereinigt. Die Sequenzen, welche die Veg3a/1-DNA-Bindungsdomäne kodieren, werden als ein KpnI/BamHI-Fragment (Beispiel 3) erhalten. Das MBD2-kodierende BamHI/HindIII-Fragment und das Veg3a/1-kodierende KpnI/BamHI-Fragment werden in pcDNA3.1(–) oder ein modifiziertes Derivat (Beispiel 2) insertiert. Gegebenenfalls sind ein Kernlokalisierungssignal und/oder ein FLAG-Epitop im Fusionskonstrukt eingeschlossen.
  • Die methylierte DNA-Bindungsdomäne des MBD2-Gens wird durch die Nukleotide 680-862 kodiert. Entsprechend wird ein MBD/ZFP-Fusionsgen konstruiert, welchem die Sequenzen fehlen, die die methylierte DNA-Bindungsdomäne kodieren, aber welches die funktionelle Domäne des MBD2- Proteins enthält, durch Entwerfen der Amplifizierungsprimer zur Amplifizierung der Region des MBD2-Gens, welche zwischen den Nukleotiden 862 und 1465 lokalisiert ist. Wie in den vorausgehenden Beispielen umfassen die Amplifizierungsprimer BamHI- und HindIII-Stellen an oder nahe an ihren Termini, um den MBD2-Leserahmen zu erhalten und um die Konstruktion des Fusionsproteins durch die oben beschriebenen Verfahren zu erleichtern. In diesem Fall wird die HindIII-Stelle an Nukleotid 1308 nach Amplifizierung und vor der Konstruktion der Fusionsnukleinsäure entfernt.
  • Beispiel 5: Einführen von Fusionsmolekülen in Zellen
  • Humane embryonale Nierenzellen (HEK 293) werden in DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium) aufgezogen, welchex mit 10 % fötalem Kälberserum supplementiert ist. Die Zellen werden in 10 cm Schalen mit einer Dichte von 2,5 × 106 pro Platte ausplattiert und für 24 Stunden in einem CO2-Inkubator bei 37°C aufgezogen. Zur Transfektion werden 10 μg Plasmid-DNA in 2,5 ml Opti-MEM (Life Technologies) verdünnt und 50 μl Lipofectamin 2000 werden in 2,5 ml Opti-MEM verdünnt. Die verdünnte DNA und das Lipid werden gemischt und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird das Medium von den Zellen entfernt und mit dem Lipid/DNA-Gemisch ersetzt. Die Zellen werden bei 37°C für 3 Stunden in einen CO2-Inkubator inkubiert, anschließend werden 10 ml DMEM+10% FBS zugegeben. Die Zellen werden 40 Stunden nach Transfektion zur Analyse der Chromatinstruktur (Beispiel 6) und Genexpression (Beispiel 7) geerntet.
  • Interkalator-Proteinfusionen, MGB-Proteinfusionen und/oder TFO-Proteinfusionen werden in Zellen nach Verkapselung in Liposomen eingeführt, wobei Standardverfahren verwendet werden, welche im Fachbereich bekannt sind.
  • Beispiel 6: Assays zum Chromatin-Remodeling
  • Die Rekrutierung eines Chromatin-Remodeling-Komplexes zu einer Region von Interesse in zellulärem Chromatin durch ein Fusionspolypeptid umfassend eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, welche entworfen oder ausgewählt worden ist, um die Zielstelle zu erkennen und eine enzymatische Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes, welche Histone kovalent modifiziert oder Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität aufweist, wird durch Veränderung der Chromatin-Struktur in der Region von Interesse nachgewiesen. Die Veränderung der Chromatin-Struktur, welche durch das oben beschriebene (Beispiel 2) Veg1-BAF155-Fusionsmolekül vermittelt wird, wird durch Untersuchen Nuklease-hypersensitiver Stellen in der Umgebung der Veg1-Bindungsstelle bewertet, wie es in diesem Beispiel beschrieben ist.
  • Zellwachstum und Isolierung von Nukleinsäuren zur Untersuchung von Nukleasehypersensitivität
  • Transformierte humane embryonale Nieren 293-Zellen werden in DMEM + 10 % fötalem Kälberserum, welches mit Penicillin und Streptomycin supplementiert ist, in einem 37°C Inkubator bei 5 % CO2 aufgezogen. Typischerweise werden zwei 255 cm2 Platten an Zellen in diesem Experiment verwendet. Wenn die Zellen mehr als 90 % Konfluenz erreichen (~ 2,5 × 107 Zellen pro Platte) wird das Medium entfernt und die Zellen werden zweimal mit 5 ml eiskaltem PBS (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) gewaschen. Die Zellen werden anschließend von den Platten in 5 ml eiskaltem PBS abgeschabt und in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen vereinigt. Die Platten werden mit 10 ml eiskaltem PBS gewaschen und die Waschlösungen werden zum Röhrchen hinzugegeben. Die Kerne werden durch Zentrifugation pelletiert (1400 Upm für 5 Min) und der Überstand wird entfernt. Das Pellet wird durch Vortexen gemischt und während des Vortexens werden 20 ml Lysepuffer (10 mM Tris pH 7,5, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 % IGEPAL CA-630 (Sigma), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM Dithiothreitol) zugegeben. Das Zellpellet wird in Lysepuffer durch Pipettieren resuspendiert und das Röhrchen wird bei 1400 Upm für 5 Min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet wird resuspendiert in 20 ml Lysepuffer und zentrifugiert wie zuvor. Das Endpellet wird in 1,5 ml Verdünnungspuffer (15 mM Tris pH 7,5, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM Dithiothreitol, 10 % Glycerin) resuspendiert, die Kerne werden unter einem Mikroskop gezählt und die Lösung wird so eingestellt, dass eine Konzentration von etwa 107-Kernen pro ml erhalten wird.
  • DNase-Behandlung von Kernen
  • Kerne mit einer Konzentration von 107 pro ml in Verdünnungspuffer werden mit verschiedenen Konzentrationen DNase I verdaut. DNase I-Verdünnungen werden hergestellt durch Verdünnen von Deoxyribonuklease I (Worthington, Freehold, NJ) in Verdünnungspuffer (oben), ggf. supplementiert mit 0,4 mM CaCl2. Zu 100 μl resuspendierter Kerne werden 25 μl einer DNase I-Verdünnung zugegeben, um DNase I-Endkonzentrationen im Bereich von 0,07 Units/ml bis 486 Units/ml in dreifachen Konzentrationserhöhungen zu ergeben. Die Verdaureaktionen werden bei Raumtemperatur für 5 Min durchgeführt. Die Verdaureaktionen werden anschließend durch Zugabe von 125 μl Puffer AL (Qiagen DNeasyTM Tissue Kit) und 12,5 μl einer 20 mg/ml Lösung von Proteinase K (Qiagen DNeasyTM Tissue Kit) und anschließender Inkubation bei 70°C für 10 Min gestoppt. Verdaute DNA wird unter Verwendung des DNeasyTM Tissue Kits (Qiagen, Valencia, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt.
  • Gereinigte DNase-behandelte DNA wird mit Restriktionsenzym bei 37°C über Nacht mit 40 Units Restriktionsenzym in Gegenwart von 0,4 mg/ml RNase A verdaut. Nach dem Verdau wird die DNA aus 0,3 M Natriumacetat Ethanolpräzipitiert.
  • Mikrococcus-Nuklease kann als Alternative zu DNase I zur Untersuchung der Chromatin-Struktur verwendet werden. Die Behandlung von Kernen, welche wie oben beschrieben erhalten werden, mit Mikrococcus-Nuklease wird durchgeführt, wie von Livingstone-Zatchej et al. in Methods in Molecular Biology, Bd. 119, Humana Press, Totawa, NJ, S. 363-378 beschrieben.
  • Behandlung von Kernen mit einer chemischen Sonde
  • Die Kerne werden mit MPE unter Verwendung des folgenden Arbeitsverfahrens, welches von Cartwright et al., oben, angepasst wurde, behandelt. Eine frisch verdünnte Stammlösung von 0,4 M N2O2 wird hergestellt durch Durchführen einer 25-fachen Verdünnung einer 30 % Stammlösung. Eine frisch hergestellte Stammlösung von 0,5 M Ferrommoniumsulfat wird 400-fach in Wasser verdünnt. Eine Lösung von Methidiumpropyl-EDTA (MPE) wird hergestellt durch Zugeben von 30 μl 5 mM MPE zu 90 μl Wasser. Zu dieser MPE-Lösung werden 120 μl der Ferroammoniumsulfat-Verdünnung und 2,5 μl 1 M Dithiothreitol (DTT, frisch hergestellt aus Pulver) zugegeben. Zu einer Suspension von Kernen, welche wie oben beschrieben erhalten wird, werden aufeinanderfolgend zugegeben: 3,5 μl 0,4 M H2O2 und 37,5 μl des MPE/Ferroammoniumsulfat/DTT-Gemischs. Die Reaktion wird nach einer entsprechenden Zeitspanne (empirisch bestimmt) gestoppt durch Zugabe von 40 μl 50 mM Bathophenanthrolindisulfonat, 0,1 ml 2,5 % Natriumdodecylsulfat/50 mM EDTA/50 mM Tris-Cl, pH 7,5 und 10 μl Proteinase K (10–14 mg/ml). Der Proteinaseverdau wird bei 37°C für wenigstens 8 Stunden durchgeführt und das Gemisch wird anschließend zweimal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert. Die Nukleinsäuren werden präzipitiert aus der wässrigen Phase durch Zugabe von Natriumacetat zu 0,3 M und 0,7 Volumen Isopropylalkohol, Inkubation auf Eis für wenigstens 2 Stunden und Zentrifugation. Das Pellet wird mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet, resuspendiert in 10 mM Tris-Cl, pH 8 und mit RNase A (etwa 0,1 mg/ml) fr 15 Min bei 37°C behandelt.
  • Blotten und Hybridisierung
  • Pellets von präzipitierter, verdauter DNA, welche nach Behandlung mit enzymatischen oder chemischen Sonden wie oben beschrieben erhalten werden, werden in 22 μl Ladepuffer, welcher Glycerin und Markierungsfarbstoffe (tracking dyes) („Gel loading solution", Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO) enthält, resuspendiert und bei 55°C für 3–4 Stunden inkubiert. 20 μl resuspendierte Probe werden auf einem 1 % Agarosegel aufgeladen, welches 1X TAE-Puffer und 0,5 μg/ml Ethidiumbromid enthält, und es wird Elektrophorese bei 22 Volt für 16 Stunden in Tris-Acetat-EDTA-Puffer durchgeführt. Nach der Elektrophorese wird das Gel mit Alkali behandelt, neutralisiert und auf eine Nytranmembran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) geblottet und die geblottete DNA wird durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht mit der Membran verknüpft.
  • Sonden werden unter Verwendung des Prime-It Random Primer Labeling Kits (Stratagene, La Jolla, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch "Random Priming" markiert. In einer typischen Markierungsreaktion werden 25–50 ng DNA-Matrize in einem Endvolumen von 50 μl verwendet. Typischerweise wird eine spezifische Aktivität von 109 cpm/μg erhalten. Die markierten Sonden werden auf einer NucTrap-Sondensäule (Stratagene #400702, La Jolla, CA) gereinigt.
  • Die Membran wird in einer Hybridisierungsflasche platziert und in Rapid Hybridization Bufffer (Amersham, Arlington Heights, IL) bei 65°C für 15 Min vorhybridisiert. Eine Sonde (ein 0,1 kb XbaI-KpnI-Fragment, siehe 1A) wird zugegeben (etwa 0,03 μg, welche etwa 3,3 × 107 cpm enthalten) und es wird eine Hybridisierung bei 65°C für 2 Stunden durchgeführt. Im Anschluss an die Hybridisierung wird die Membran einmal bei 65°C für 10 min mit 2X SSC + 0,1 SDS und zweimal bei 65°C für 10 min mit 0,1X SSC + 0,1% SDS gewaschen. Die Membran wird anschließend getrocknet und entweder durch Autoradiographie oder mit einem Phosphorimager analysiert.
  • Die Ergebnisse zur Analyse der DNase-Hypersensitivität in HEK293-Zellen innerhalb einer etwa 1000 Basenpaarregion stromaufwärts der humanen VEGF-A-Gentranskriptionsstartstelle sind in 3 gezeigt. Ansteigende DNase-Konzentration führte zur Erzeugung von zwei neuen Sätzen an DNA-Fragment-Duplets, zentriert bei etwa 500 und 1000 Nukleotiden, wobei dies das Vorliegen von zwei DNase-hypersensitiven Regionen anzeigt. Eine dieser Regionen ist bei etwa 500 Basenpaaren stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle zentriert; die andere ist an der Transkriptionsstartstelle zentriert.
  • Ein Remodeling von VEGF-Chromatin kann unter anderem einen Verlust von einer oder beiden dieser hypersensitiven Regionen umfassen, oder die Erzeugung von einer oder mehreren zusätzlichen hypersensitiven Regionen, entweder stromaufwärts oder stromabwärts der Transkriptionsstartstelle.
  • Beispiel 7: Assays zur Modulierung von Genexpression
  • Allgemeines.
  • Aktivierung oder Repression von Transkription, welche sich aus lokalisiertem Chromatin-Remodeling ergibt, wird durch Messung von RNA und/oder Proteingenprodukten bestimmt. Diese Verfahren sind dem Fachmann wohl bekannt.
  • Beispielsweise beschreiben Mizuguchi et al (1999) in Methods in Molecular Biology, Bd. 119, „Chromatin Protocols" (P. B. Becker, Hrg.) Humana Press, Totowa, 1999, S. 333-342, ein Verfahren zur in vitro-Transkription von Chromatin, welches durch den Drosophila-NURF-Komplex remodeliert worden ist. Dieser Assay kann verändert werden, um Veränderungen hinsichtlich von Transkriptionseigenschaften von Chromatin (entweder Aktivierung oder Repression), welche sich an Chromatin-Remodeling anschließen, zu detektieren.
  • Herstellung und Spezifität von RNA kann auch durch RNA-Blots, Nukleaseschutz (nuclease protection) und/oder quantitative Real-Time-PCR (umgangssprachlich bekannt als „Taqman"-Assay) bestimmt werden, wie es im Fachbereich bekannt ist. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., oben.
  • Die Proteinerzeugung kann gemessen werden durch Immunoassay (z.B. ELISA, Immunopräzipitierung), Gelelektrophorese und/oder immunologische Detektion von Proteinblots („Western"-Blots), wie es dem Fachmann bekannt ist. Siehe beispielsweise Ausubel et al., oben.
  • Reportergene, entweder chromosomal oder extrachromosomal, können ebenfalls verwendet werden, um die Aktivierung und/oder Repression von spezifischen Promotoren zu untersuchen. Entsprechend kann die Wirkung von Chromatin-Remodeling auf einen Promotor, welcher mit einem Reportergen operativ verknüpft ist (wie beispielsweise alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, β-Glucuronidase, Chloramphenicolacetyltransferase, Meerrettichperoxidase, Luciferase oder grün fluoreszierendes Protein) durch Messen der Mengen und/oder Aktivität des Reporters untersucht werden. Verfahren zur Fusion eines Promotors mit einem Reportergen und Verfahren zur Untersuchung von Reportergenprodukten sind dem Fachmann bekannt. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., oben.
  • RNA Analyse.
  • Eine transiente Transfektion von HEK293-Zellen, welche auf 6-Well-Platten ausgesät sind, wird wie in Beispiel 6 oben beschrieben durchgeführt. Die Zelllysate werden 40 Stunden nach Transfektion geerntet. Zur Untersuchung der Aktivierung des endogenen chromosomalen VEGF-Gens wird RNA-Blotting („Northern"-Blotting) verwendet, um die VEGF-mRNA-Mengen zu untersuchen. In Kürze, PolyA+RNA wird aus HEK293-Zellen, welche mit einem Fusionsplasmid transfiziert sind oder aus scheintransfizierten (mock transfected) HEK293-Zellen unter Verwendung des Oligotex-Kits (Qiagen, Valencia, CA) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert. Das Fusionsplasmid kodiert ein Fusionsprotein umfassend eine Kernlokalisierungssequenz, die Veg1-DNA-Bindungsdomäne, BAF155 und ein FLAG-Epitop (siehe Beispiel 2, oben). 7 μg RNA werden auf einem 2,4 Agarosegel aufgelöst, welches 2,4 M Formaldehyd enthält, und dieses Gel wird auf eine Nytran SuPerCharge-Membran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) unter Verwendung von 20X SSC geblottet. Die Membran wird bei 65°C für 1 Stunde in Rapid-Hyp-Puffer (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), welcher eine 32P-markierte VEGF-cDNA-Sonde enthält, hybridisiert. Das VEGF-cDNA-Konstrukt wird erzeugt durch Insertieren eines humanen VEGF-cDNA-Fragments, welches durch PCR-Amplifikation erhalten wird, in den pCDNA3.1-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) an den XbaI- und EcoRI-Stellen. Die Struktur des Klons wird durch Sequenzierung bestätigt. Nach der Hybridisierung wird die VEGF-Sonde von der Membran entfernt und der Blot wird mit einer 32P-markierten GAPDH DNA-Sonde rehybridisiert. Die VEGF-mRNA-Mengen, wie durch RNA-Blotting bestimmt, werden hinsichtlich GAPDH-mRNA-Mengen normalisiert.
  • Für eine quantitative Echtzeit-PCR („Taqman")-Analyse der mRNA-Menge, wird Gesamtzelluläre RNA aus transfizierten HEK293-Zellen unter Verwendung des Rneasy Kits (Qiagen, Valencia, CA) isoliert. RNA-Proben (25 ng) werden gemischt mit 0,3 μM eines jeden Primers, 0,1 μM Sonde, 5,5 mM MgCl2, 0,3 mM eines jeden dNTPs, 0,625 Units AmpIiTaq Gold RNA-Polymerase, 6,25 Units Multiscribe Reverse Transcriptase und 0,5 Units RNase-Inhibitor, in Taqman-Puffer A von Perkin Elmer. Reverse Transkription wird durchgeführt bei 48°C für 30 Minuten. Nach Denaturierung bei 95°C für 10 Minuten wird eine PCR durchgeführt für 40 Zyklen bei 95°C für 15 Sekunden und 60°C für eine Minute. Eine Analyse wird während der Amplifizierungsreaktion in einem 96 Well-Format auf einer ABI 7700 SDS-Maschine (PE Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt und die Daten werden mit SDS-Version 1.6.3 Software analysiert. Beispielhafte Sonden und Primer zur Analyse von VEGF- und GAPDH-Genen sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Primer- und Sondensequenzen zur Analyse von hydrolysierbaren Sonden
    Figure 00980001
  • Proteinanalyse.
  • Eine Analyse von Proteinmengen wird durch Auflösen von 10 μg Gesamtzelllysat auf einem 10–20% Polyacrylamidgel durchgeführt, welches man in Tris/Glycin/SDS-Puffer (BioRad, Hercules, CA) laufen lässt. Proteine, welche auf dem Gel getrennt werden, werden unter Verwendung von Tris/Glycin/SDS-Puffer, welcher mit 20 % Methanol supplementiert ist, auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und der Filter wird mit 5 % nicht-fetter Trockenmilch für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Der Blot wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Anti-Flag M2 monoklonalem Antikörper (Sigma, St. Louis, MO), verdünnt 1:1000 in 5 % (w/v) nicht-fetter Trockenmilch/0,1% PBS-Tween, sondenbehandelt und anschließend zweimal für 5 Sek und einmal für 15 Minuten mit 0,1 % PBS-Tween gewaschen. Alle Waschschritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Blot wird anschließend für eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Mausantikörper (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) inkubiert, welcher bei einer 1:3000 Verdünnung in 5 % (w/v) nicht-fetter Trockenmilch/0,1% PBS-Tween verwendet wird. Daran schließen sich zwei 5 Sekunden Waschschritte und ein 15 Min Waschschritt mit 0,1 % PBS-Tween an. Proteinbanden werden unter Verwendung des ECL-Systems (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) detektiert.
  • Zur Analyse von Proteinmengen durch ELISA werden Zelllysate hergestellt (wie oben beschrieben) oder Kulturmedium wird geerntet und analysiert, wobei ein kommerziell erhältlicher ELISA-Kit verwendet wird. Beispielsweise werden Mengen an sekretiertem VEGF-Protein bestimmt durch einen Assay von Kulturmedium unter Verwendung eines humanen VEGF-ELISA-Kits (R & D-Systems, Minneapolis, MN).
  • Ergebnisse.
  • Die Transfektion des Veg1/hBAF155-Fusionskonstrukts (Beispiel 2) in kultivierte HEK 293-Zellen führt zur Aktivierung von VEGF-Genexpression im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen, wie es durch Anstiege von VEGF-mRNA- und Proteinmengen belegt ist. Vektoren, welche die ZPF- und/oder BAF155-Teile der Fusion nicht aufweisen, werden als Kontrollen verwendet. Die Transfektionseftizienz wird gemessen durch Cotransfektion eines Expressionsvektors für grün fluoreszierendes Protein. Es wird auch eine Scheintransfektionskontrolle durchgeführt.
  • Die Einführung des Veg3a/1-MBD1 oder Veg3a/1-MBD2-Fusionskonstrukts in kultivierte HEK 293-Zellen durch Transfektion führt im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen zur Repression von VEGF-Genexpression, wie es durch Anstiege hinsichtlich VEGF-mRNA und Proteinmengen belegt ist. Es werden auch Kontrollen, welche zu den oben beschriebenen Kontrollen ähnlich sind, durchgeführt.
  • Beispiel 8: Assay für Chromatin-Remodeling-Komplexe
  • Verfahren zur Reinigung, Untersuchung und Charakterisierung von verschiedenen Chromatin-Remodeling-Komplexen sind dem Fachmann wohl bekannt. Siehe beispielsweise Methods in Enzymology, Bd. 304, „Chromatin" (P. M. Wassarman und A. P. Wolffe, Hrsg.), Academic Press, San Diego, 1999; und Methods in Molecular Biology, Bd. 119, „Chromatin Protocols" (P. B. Becker, Hrg.) Humana Press, Totowa, 1999.
  • Chromatin-Remodeling kann in Form von beispielsweise Ablagerung, Entfernung oder Repositionierung von Nukleosomen innerhalb von Chromatin auftreten. Mittel zur Detektion von Chromatin-Remodeling umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Detektion von Veränderungen hinsichtlich der Zugänglichkeit von spezifischen Stellen in Chromatin für sequenzspezifische Nukleasen, wie beispielsweise Restriktionsenzyme, Bestimmung des Auftretens oder Verschwindens eines sich regelmäßig wiederholenden Musters eines Chromatinverdaus durch nicht-sequenzspezifische Endonukleasen, wie beispielsweise Mikrococcus-Nuklease und DNase I, Bestimmung von Nukleosomabstand sowie Nukleosombindungsassays. Wie oben erwähnt, besitzen Chromatin-Remodeling-Komplexe auch ATPase-Aktivität; deshalb können ATP-Hydrolyseassays zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Chromatin-Remodeling-Komplexen verwendet werden.
  • Assays zur Zugänglichkeit von Restriktionsendonukleasen werden beschrieben von Logie et al., oben, und Varga-Weisz et al. (1999) Meth. Enzymology 304:742-757. Assays zum Nukleosomabstand, DNase I-Zugänglichkeit, ATPase-Aktivität und Nukleosombindung werden offenbart von Varga-Weisz et al., oben. Assays zur Detektion einer Erleichterung von Transkriptionsfaktorbindung werden beschrieben von Cote et al. (1994) Science 265:53-60 und Kwon et al. (1994) Nature 370:477-481. Assays zur Nukleosom-Repositionierung (d.h. „Verschiebung") werden offenbart von Hamiche et al. (1999) Cell 97:833-842.
  • Diese Assays und andere Assays können verwendet werden zur Reinigung und Charakterisierung von Chromatin-Remodeling-Komplexen aus verschiedenen Spezies, wie beispielsweise des Hefe-SWI/SNF-Komplex (Logie et al., oben), des Drosophila-CHRAC-Komplex (Varga-Weisz et al., oben) und des Drosophila-NURF-Komplex (Sandaltzopoulos et al., oben).
  • Beispiel 9: ATPase-Assay
  • Chromatin-Remodeling-Komplexe nutzen die Energie aus ATP-Hydrolyse, um die Chromatin-Struktur zu modifizieren. Folglich kann Nukleosom- oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität verwendet werden, um einen Chromatin-Remodeling-Komplex zu untersuchen.
  • Verfahren und Zusammensetzungen zur Durchführung von ATPase-Assays sind dem Fachmann wohl bekannt. Eine Messung von ATPase-Aktivität ist die Freisetzung von markiertem Pyrophosphat aus γ-32P-markiertem ATP. Die Freisetzung wird gemessen als die Menge an Radioaktivität, welche nicht an aktivierte Aktivkohle in 20 mM Phosphorsäure bindet.
  • Ein alternatives Verfahren zur Messung von Pyrophosphatfreisetzung ist es, markiertes Pyrophosphat direkt durch Dünnschichtchromatographie zu messen. Das Reaktionsgemisch enthält 0,02 μg/ml DNA (oder ein rekonstituierter nukleosomaler Array, siehe Beispiel 11 unten), 5 nM SWI/SNF-Komplex (oder einen anderen bekannten oder mutmaßlichen Chromatin-Remodeling-Komplex), 20 mM Tris, pH 8,0, 5 mM MgCl2, 0,2 mM Dithiothreitol, 0,1 % Tween, 5 Glycerin, 100 μg/ml Rinderserumalbumin, 100 μM ATP und 0,2 μCi (γ-32P)ATP (3 Ci/mmol) in einem Endvolumen von 20 μl und wird bei 37°C inkubiert. Am Ende des Assays (unter diesen Bedingungen ist die Reaktionsrate für 5–10 Minuten linear) wird 1 μl auf 1 Polyethylenimincellulose-Blatt pipettiert und das Blatt wird in einer Lösung von 0,75 M Kaliumphosphat, pH 3,5 entwickelt. In diesem System werden ATP und Pyrophosphat deutlich voneinander und vom Ursprung aufgelöst. Eine Quantifizierung wird entweder durch Autoradiographie, wobei sich Ausschneiden und Szintillationszählung markierter Punkte anschließt, oder durch Phosphorimaging durchgeführt.
  • Die vorausgehend beschriebenen Verfahren sind abgeleitet von den Verfahren, welche von Logie et al. (1999) Meth. Enzymology 304:726-741 beschrieben sind.
  • Ein alternatives Lösungsmittel zur Dünnschichtchromatographie ist 0,5 M LiCI/1 M Ameisensäure. In diesem System wird Pyrophosphat von nicht-hydrolysiertem ATP getrennt, welches am Ursprung zurückbleibt. Varga-Weisz et al. (1999) Meth. Enzymol. 304:742-757.
  • Beispiel 10: Herstellung von rekonstituierten nukleosomalen Arrays
  • Abscheidung gereinigter Histonocatamere auf einer spezifischen Matrize unter definierten Bedingungen kann einen nukleosomalen Array erzeugen, in welchem die Positionen von einem oder mehreren einzelnen Nukleosomen im Hinblick auf die Nukleotidsequenz der Matrize bekannt sind. Ein derartiger Array kann als Substrat in einem Assay zur Chromatin-Remodeling-Aktivität verwendet werden, durch Testen von Veränderungen hinsichtlich der Nukleosomposition im Hinblick auf die Nukleotidsequenz. Ein derartiger Test ist die Zugänglichkeit für Restriktionsendonukleasen. Siehe unten.
  • Die Herstellung von rekonstituierten nukleosomalen Arrays kann durchgeführt werden gemäß Logie et al., oben, und Varga-Weisz et al., oben. Zusätzliche Verfahren können gefunden werden in: Methods in Enzymology, Bd. 304, „Chromatin" (P. M. Wassarman und A. P. Wolffe, Hrgs.), Academic Press, San Diego, 1999; und Methods in Molecular Biology, Bd. 119, „Chromatin Protocols" (P. B. Becker, Hrg.) Humana Press, Totowa, 1999.
  • Beispiel 11: Konstruktion eines Gens, welches eine Fusion zwischen einer ZFP-Bindungsdomäne und der SWI-Chromatin-Remodeling-ATPase kodiert
  • SWI-kodierende Sequenzen wurden von einem rekombinanten Plasmid, welches Drosophila-SWI kodiert, amplifiziert. Corona et al. (1999) Mol. Cell 3:239-245. Einer der Primer enthielt, außerhalb der SWI-komplementären Region, Sequenzen, welche ein FLAG-Epitop kodieren und, am 5'-Terminus, eine 5'-Verlängerung, welche für Hind III- und Xba I-Stellen kodiert. Der andere Primer enthielt eine 5'-Verlängerung, welche eine Bam HI-Stelle kodiert. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt:
    Figure 01020001
  • Die Amplifizierung wurde ausgeführt bei 95°C für 2 Min, wobei sich 30 Cyclen von 95°C für 30 Sek, 55°C für 30 Sek, 72°C für 5 Min und ein abschließender Schritt von 72°C für 5 Min anschloss. Dies führte zur Erzeugung eines Amplifizierungsprodukts umfassend ISWI- und FLAG-kodierende Sequenzen, flankiert durch Bam HI- und Hind III-Stellen. Das Amplifizierungsprodukt wurde gereinigt unter Verwendung eines PCR-Cleanup Kits (Qiagen, Valencia, CA) entsprechend den Anweisungen des Herstellers und anschließend mit Bam HI und Hind III verdaut.
  • Ein Vektor, welcher ein Kernlokalisierungssignal (NLS), eine ZFP-Bindungsdomäne, welche auf das humane Erythropoietingen (Epo C2) zielausgerichtet ist, eine VP16-Aktivierungsdomäne und ein FLAG-Epitop kodiert, wurde mit Bam HI und Hind III zur Freisetzung von VP16- und FLAG-kodierenden Sequenzen verdaut. Das Bam HI/Hind III-Fragment, welches im vorausgehenden Absatz beschrieben ist, wurde in das Vektorrückgrat legiert, um einen Vektor zu erzeugen, welcher ein Fusionsprotein kodiert umfassend eine NLS, die Epo2C-Bindungsdomäne, ISWI und FLAG. Ein Vektor, welcher ein identisches Protein kodiert, mit Ausnahme des Vorliegens einer Epo3B-Bindungsdomäne anstelle von Epo2C, wurde durch ähnliche Verfahren zur Verwendung als Kontrolle konstruiert. Die Nukleotidsequenzen der Zielstellen und die Aminosäuresequenzen der Erkennungshelices (–1 bis +6) für die Epo2C- und Epo3B-Bindungsdomänen werden in Tabelle 3 bereitgestellt. Tabelle 3: Zielstellen- und Erkennungshelixsequenzen für Epo2C und Epo3B
    Figure 01030001
  • Beispiel 12: Aktivierung von EPO-Expression durch Fusion von SRC-1 mit einer Zinkfingerbindungsdomäne
  • Das Steroidrezeptorcoaktivator 1 (SRC1)-Protein ist eine Histonacetyltransferase, welche die p300 und CBP-Proteine (wobei es sich bei beiden ebenfalls um Histonacetyltransferasen handelt) rekrutieren kann. Liu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9485-9490; Sheppard et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:39-50 und darin zitierte Referenzen. Ein Konstrukt, welches einen Teil des SRC1s kodiert, welcher mit den a- und e-Isoformen gemeinsam ist (Aminosäuren 781 bis 1385, Kalkhoven et al. (1998) EMBO J. 17:232-243), fusioniert mit einer Zinkfingerbindungdomäne, welche auf das humane Erythropoietin (EPO)-Gen zielausgerichtet ist, wurde wie folgt konstruiert.
  • Ein SRC1-kodierendes Plasmid wurde als Matrize zur PCR-Amplifizierung unter Verwendung der folgenden Primer verwendet, und das Amplifizierungsprodukt wurde mit Not I verdaut.
    5'-GGATCCGGCCACCGCGGCCGCATGGATCCATGTAATACAAACCCAACC
    (SEQ ID NO: 48)
    5'-ATGAATTCGCGGCCGCCCTGGGTTCCATCTGCTTCTGTTTTGAG
    (SEQ ID NO: NO 49)
  • Der pVP16-EPOZFP-862c-Vektor, enthaltend eine Transkriptionseinheit kodierend ein Kernlokalisierungssignal (NLS), die EPO ZFP-862-Zinkfingerbindungsdomäne, eine VP16-Transkriptionsaktivierungsdomäne und ein FLAG-Epitop, unter Transkriptionskontrolle eines CMV-Promotors und eines Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignals, wurde mit Not I zur Freisetzung von VP16-kodierenden Sequenzen verdaut. Siehe Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:33850-33860 hinsichtlich des Entwurfs und den Eigenschaften von EPOZFP-862, welches an eine Stelle 862 Nukleotide stromaufwärts der EPO-Transkriptionsstartstelle bindet. Das Not I-verdaute Amplifizierungsprodukt, welches im vorausgehenden Absatz beschrieben ist, wurde in das ZFP-862c Vektorrückgrat durch Ligation insertiert, um ein Plasmid zu erzeugen, welches ein NLS, die EPO ZFP-862-Bindungsdomäne, die Aminosäuren 781-1385 von SRC1 und ein FLAG-Epitop kodiert. Die Struktur des sich ergebenden Konstrukts, pSRC1b-EPO2c, ist in 4 schematisch gezeigt.
  • Dieses Konstrukt wurde in humane HEK 293-Zellen durch Transfektion (200 μg Plasmid plus 5 μg Lipofectamin; Lipofectamin wurde von Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD erhalten) eingeführt. Etwa 12 Stunden nach Exposition der Zellen gegenüber Plasmid wurde das Medium entfernt und mit frischem DMEM, welches mit 10 % fötalem Rinderserum supplementiert war, ersetzt. Vierundzwanzig Stunden später wurde das Medium geerntet und nach sekretiertem EPO untersucht, wobei ein Erythropoietin-ELISA von R & D Systems (Minneapolis, MN) verwendet wurde.
  • Die Ergebnisse des Assays, welche in 5 gezeigt sind, zeigten, dass die Transfektion von 293-Zellen mit dem pSRC1b-EPO2c-Fusionsplasmid die Expression von EPO aktivierte, im Vergleich zu solchen Zellen, welche mit einem Kontrollplasmid (pcDNA3.1) transfiziert wurden, welches keine derartige Fusion kodierte.
  • Daher führte ZFP-zielgerichtete Bindung eines Proteins an das EPO-Gen, wobei das Protein zu Chromatin-Remodeling fähig ist (mittels seiner Histonacetyltransferase-Aktivität) und als Komponente von Chromatin-Remodeling-Komplexen dienen kann (aufgrunf seiner Fähigkeit an p300 und CBP zu binden) zur Aktivierung von Genexpression.
  • Beispiel 13: Repression von VEGF-Expression durch ZFP-MBD und ZFP-DNMT-Fusionen (nur zu veranschaulichenden Zwecken)
  • Proteine mit Methylbindungsdomäne (MBDs) nehmen teil an der Repression der Expression von bestimmten Genen durch Bindung an methylierte Cytosinreste, welche in CpG-Dinukleotiden vorliegen sowie an der Rekrutierung von Chromatin-Remodeling-Komplexen an die Bindungsstellen.
  • MBDs treten auch als eine Komponente von bestimmten Chromatin-Remodeling-Komplexen auf.
  • DNA-N-Methyltransferasen (DNMTs) methylieren Cytosinreste, welche in bestimmten CpG-Dinukleotidsequenzen in zellulärer DNA vorliegen. Eine derartige Methylierung kann zu Chromatin-Remodelierung an oder in der Nähe der methylierten Sequenzen) führen, beispielsweise durch Bindung von einem oder mehreren MBDs und begleitender oder nachfolgender Rekrutierung von Chromatin-Remodeling-Komplexen. Das DNMT1-Protein kann auch mit Histondeacetylasen (HDACs) assoziieren, welche selbst an Chromatin-Remodeling beteiligt sind.
  • Es wurde eine Serie von ZFP-MBD und ZFP-DNMT-Fusionen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Expression des humanen VEGF-A-Gens zu regulieren getestet. Entsprechend wurde eine Serie von Plasmiden konstruiert, in welchen die VEGF3a/1 ZFP-Bindungsdomäne (siehe Beispiel 3, oben) fusioniert wurde mit MBD2b, MBD3, MBD3S, MBD3L, DNMT1, DNMT3a oder DNMT3b. Siehe beispielsweise GenBank Accession Nummern AF072243, AF170347, AW872007 und NM013595. Die Fusionsgene umfassen auch ein Kernlokalisierungssignal und ein FLAG-Epitop, ähnlich zu den Konstrukten, welche in den Beispielen 11 und 12 beschrieben sind. 6 zeigt ein schematisches Diagramm dieser Konstrukte.
  • HeLa-Zellen wurden mit den in 6 gezeigten Konstrukten transfiziert. Zweiundsiebzig Stunden nach Transfektion wurden sekretierte VEGF-Mengen unter Verwendung eines VEGF-ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Es wurden Zellen mit einem grün fluoreszierendes Protein-kodierendem Plasmid cotransfiziert, um eine Messung der Transfektionseffizienz zu ermöglichen. Die Ergebnisse, welche in 7 dargelegt sind, zeigen, dass die Transfektion von HeLa-Zellen mit allen getesteten MBD- und DNMT-Fusionen zu einer Repression von VEGF-Expression führte. Wenn sie hinsichtlich der Transfektionseffizienz korregiert wurde (etwa 50 % in diesem Experiment), führte intrazelluläre Expression der MBD2b-VEGF3a/1-Fusion im Wesentlichen zu 100 % Repression an VEGF-Expression. Deshalb sind Fusionen zwischen einer zielgerichteten ZFP-Bindungsdomäne und Proteinen, deren Mechanismus zur Modulierung von Genexpression Chromatin-Remodeling umfasst, in der Lage, Genexpression zu reprimieren. Sequenzprotokoll
    Figure 01070001
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Claims (60)

  1. In vitro-Verfahren zur Veränderung einer Region von Interesse in eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin, wobei das Verfahren den Schritt des Inkontaktbringens des chromosomalen zellulären Chromatins mit einem Fusionspolypeptid, das an eine Zielstelle in der Region von Interesse bindet, umfasst, wobei das Fusionspolypeptid eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne und eine enzymatische Chromatin-Remodeling-Komplexkomponente, die Histone kovalent modifiziert oder eine Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität aufweist, oder ein funktionelles Fragment davon umfasst, und wobei die Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne entwickelt oder ausgewählt wurde, um die Zielstelle zu erkennen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das chromosomale zelluläre Chromatin in einer Pflanzenzelle vorliegt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das chromosomale zelluläre Chromatin in einer Tierzelle vorliegt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Tierzelle eine humane Zelle ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Chromatinveränderung den Nachweis einer Sequenz von Interesse erleichtert.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Sequenz von Interesse einen Einzelnukleotidpolymorphismus umfasst.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Chromatinveränderung die Aktivierung eines Gens von Interesse erleichtert.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Chromatinveränderung eine Repression eines Gens von Interesse erleichtert.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Chromatinveränderung eine Rekombination zwischen einer exogenen Nukleinsäure und chromosomalem zellulärem Chromatin erleichtert.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verfahren ferner den Schritt des Inkontaktbringens einer Zelle mit einem das Fusionspolypeptid codierenden Polynukleotid umfasst, wobei das Fusionspolypeptid in der Zelle exprimiert wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, ferner umfassend den Schritt des Identifizierens einer zugänglichen Region in dem chromosomalen zellulären Chromatin, wobei das Fusionspolypeptid an eine Zielstelle in der zugänglichen Region bindet.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Region von Interesse ein Gen umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Gen für ein Produkt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor, Erythropoietin, Androgenrezeptor, PPAR-γ2, p16, p53, pRb, Dystrophin und E-Cadherin, codiert.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, ferner umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des chromosomalen zellulären Chromatins mit einem zweiten Molekül.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das zweite Molekül ein Transkriptionsregulationsprotein ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das zweite Molekül ein Fusionsmolekül ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das zweite Molekül ein Fusionspolypeptid ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das zweite Molekül eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne umfasst.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das zweite Molekül ferner eine Transkriptionsaktivierungsdomäne umfasst.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das zweite Molekül ferner eine Transkriptionsrepressionsdomäne umfasst.
  21. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das zweite Molekül ferner eine Polypeptidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Histonacetyltransferase, einer Histondeacetylase, einem funktionellen Fragment einer Histonacetyltransferase und einem funktionellen Fragment einer Histondeacetylase, umfasst.
  22. Verfahren nach Anspruch 14, ferner umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des chromosomalen zellulären Chromatins mit einem dritten Molekül.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das dritte Molekül ein Transkriptionsregulationsprotein ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das dritte Molekül ein Fusionsmolekül ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das dritte Molekül ein Fusionspolypeptid ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das dritte Molekül eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne umfasst.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das dritte Molekül ferner eine Transkriptionsaktivierungsdomäne umfasst.
  28. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das dritte Molekül ferner eine Transkriptionsrepressionsdomäne umfasst.
  29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 7 bis 10, wobei die Chromatinveränderung zu der Erzeugung einer zugänglichen Region in dem chromosomalen zellulären Chromatin führt.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Erzeugung der zugänglichen Region die Bindung eines exogenen Moleküls erleichtert.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das exogene Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, Nukleinsäuren, Kleinmolekültherapeutika, Minor-Groove-Bindern, Major-Groove-Bindern und Interkalatoren.
  32. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Fusionspolypeptid, umfassend: a) eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, wobei die Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne entwickelt oder ausgewählt wurde, um eine bestimmte Zielstelle in eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin zu erkennen; und b) eine enzymatische Chromatin-Remodeling-Komplexkomponente, die Histone kovalent modifiziert oder eine Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität aufweist, oder ein funktionelles Fragment davon.
  33. Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei die Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne an eine Zielstelle in einem Gen bindet, das für ein Produkt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor, Erythropoietin, Androgenrezeptor, PPAR-γ2, p16, p53, pRb, Dystrophin und E-Cadherin, codiert.
  34. Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei die enzymatische Komponente eines Chromatin-Remodeling-Komplexes oder ein funktionelles Fragment davon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Mitglied der SWI/SNF-Komplex-Familie, einem Mitglied der Mi-2-Komplex-Familie, einem Mitglied der ISWI-Komplex-Familie, einem Mitglied der BRM-Familie, einem Mitglied der BRG/BAF-Komplex-Familie, einem Mitglied der Mot-1-Komplex-Familie, einem Mitglied der Chd-1-Familie, einem Mitglied der Chd-2-Familie, einem Mitglied der Chd-3-Familie, einem Mitglied der Chd-4-Familie, einer Histonacetyltransferase und einer Histondeacetylase.
  35. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polynukleotid, das für das Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 32 bis 34 codiert.
  36. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Zelle, umfassend das Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 32 bis 34.
  37. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Zelle, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 35.
  38. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31 zur Modulation der Expression eines Gens in vitro, wobei das Verfahren ferner den Schritt des Inkontaktbringens des chromosomalen zellulären Chromatins mit einem zweiten Molekül, das an eine Zielstelle in dem Gen bindet und die Expression des Gens moduliert, umfasst.
  39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Modulation eine Aktivierung der Expression des Gens umfasst.
  40. Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Modulation eine Repression der Expression des Gens umfasst.
  41. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 bis 40, wobei das zweite Molekül ein Polypeptid ist.
  42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei das zweite Molekül eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne umfasst.
  43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei das zweite Molekül ferner eine Aktivierungsdomäne umfasst.
  44. Verfahren nach Anspruch 42, wobei das zweite Molekül ferner eine Repressionsdomäne umfasst.
  45. Verfahren nach Anspruch 38, wobei das zweite Molekül ein Transkriptionsfaktor ist.
  46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei der Transkriptionsfaktor ein exogenes Molekül ist.
  47. Verfahren nach Anspruch 45, wobei der Transkriptionsfaktor ein endogenes Molekül ist.
  48. Verfahren nach Anspruch 38, wobei das erste Fusionspolypeptid und das zweite Molekül jeweils eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne umfassen.
  49. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 bis 48, wobei eine Vielzahl von ersten Fusionspolypeptiden mit chromosomalem zellulärem Chromatin in Kontakt gebracht wird, wobei jedes der ersten Fusionspolypeptide an eine unterschiedliche Bindungsstelle bindet.
  50. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 bis 49, wobei eine Vielzahl von zweiten Molekülen mit chromosomalem zellulärem Chromatin in Kontakt gebracht wird, wobei jedes der zweiten Moleküle an eine unterschiedliche Zielstelle bindet.
  51. Verfahren nach Anspruch 50, wobei wenigstens eines der zweiten Moleküle eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne umfasst.
  52. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 bis 51, wobei die Expression einer Vielzahl von Genen moduliert wird.
  53. Verfahren nach Anspruch 52, wobei eine Vielzahl von ersten Fusionspolypeptiden mit chromosomalem zellulärem Chromatin in Kontakt gebracht wird, wobei jedes der ersten Fusionspolypeptide an eine unterschiedliche Bindungsstelle bindet.
  54. Verfahren nach Anspruch 52, wobei eine Vielzahl von zweiten Molekülen mit chromosomalem zellulärem Chromatin in Kontakt gebracht wird, wobei jedes der zweiten Moleküle an eine unterschiedliche Bindungsstelle bindet.
  55. Verfahren nach Anspruch 54, wobei wenigstens eines der zweiten Moleküle ein Zinkfingerfusionspolypeptid ist.
  56. Verfahren nach Anspruch 52, wobei das erste Fusionspolypeptid an eine gemeinsame Bindungsstelle in zwei oder mehreren der Vielzahl von Genen bindet.
  57. Verfahren nach Anspruch 52, wobei das zweite Molekül an eine gemeinsame Zielstelle in zwei oder mehreren der Vielzahl von Genen bindet.
  58. Verfahren nach Anspruch 57, wobei das zweite Molekül ein Zinkfingerfusionspolypeptid ist.
  59. Verfahren zur Herstellung eines Fusionspolypeptids, wobei das Fusionspolypeptid eine Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, die entwickelt ist, um eine bestimmte Zielstelle in einer Region von Interesse in eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin zu erkennen, und eine enzymatische Chromatin-Remodeling-Komplexkomponente, die Histone kovalent modifiziert oder eine Nukleosom-, Histon- und/oder DNA-abhängige ATPase-Aktivität aufweist, oder ein funktionelles Fragment davon umfasst, wobei das Verfahren den Schritt des Exprimierens des dieses Fusionspolypeptid codierenden Polynukleotids in einer geeigneten Wirtszelle umfasst.
  60. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31 zur Bindung eines exogenen Moleküls an eine Bindungsstelle in vitro, wobei die Bindungsstelle innerhalb einer Region von Interesse in eukaryotischem chromosomalem zellulärem Chromatin vorliegt, wobei das Verfahren ferner das Einbringen des exogenen Moleküls in die Zelle, wodurch das exogene Molekül an die Bindungsstelle bindet, umfasst.
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