DE60119133T2

DE60119133T2 - BIOSENSOR

Info

Publication number: DE60119133T2
Application number: DE60119133T
Authority: DE
Inventors: Miwa Ako-gun HASEGAWA; Tomohiro Hirakata-shi YAMAMOTO; Motokazu Toyonaka-shi WATANABE; Shin Katano-shi Ikeda; Shiro Hirakata-shi Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2000-07-31
Filing date: 2001-07-26
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2021-07-27
Also published as: CN1201147C; US6966977B2; CN1444730A; EP1314978A4; WO2002010734A1; EP1314978A1; ES2260305T3; EP1314978B1; US20030132110A1; JP4184073B2; DE60119133D1

Description

Gebiet der ErfindungField of the invention

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor, insbesondere auf einen Cholesterinsensor, der leicht einen spezifischen Bestandteil in einer Probe mit einer hohen Geschwindigkeit und mit einer hohen Genauigkeit quantifizieren kann.The The present invention relates to a biosensor, in particular to a cholesterol sensor that is easily a specific ingredient in a sample at a high speed and with a high Can quantify accuracy.

Stand der TechnikState of the art

Als ein Beispiel für herkömmliche Biosensoren wird im Folgenden ein Glukosesensor beschrieben.When an example for conventional Biosensors will be described below a glucose sensor.

Ein allgemein bekanntes Verfahren für die Quantifizierung von Glukose ist ein System unter Verwendung einer Kombination von Glukoseoxidase mit einer Sauerstoffelektrode oder einer Wasserstoffperoxidelektrode. Glukoseoxidase oxidiert selektiv β-D-Glukose als ein Substrat zu D-Glukono-δ-Lakton unter Verwendung von Sauerstoff als ein Elektronenvermittler. Während dieses Reaktionsvorgangs wird Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert. Hierbei wird Glukose entweder durch Messung einer Menge des verbrauchten Sauerstoffs unter Verwendung der Sauerstoffelektrode, oder durch Messung der Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid unter Verwendung von z.B. einer Platinelektrode gemessen.One well-known method for The quantification of glucose is a system using a combination of glucose oxidase with an oxygen electrode or a hydrogen peroxide electrode. Oxidized glucose oxidase selectively β-D-glucose as a substrate to D-glucono-δ-lactone using of oxygen as an electron mediator. During this reaction process oxygen is reduced to hydrogen peroxide. This is glucose either by measuring an amount of oxygen consumed using the oxygen electrode, or by measuring the Amount of hydrogen peroxide produced using e.g. a platinum electrode measured.

Jedoch sind derartige wie vorher beschriebene Verfahren stark durch die gelöste Sauerstoffkonzentration im Falle eines bestimmten zu messenden Objekts beeinflusst, oder sind unmöglich bei Bedingungen, in denen kein Sauerstoff vorhanden ist. Folglich wurde ein Glukosesensor von einem derartigen Typ entwickelt, der als den Elektronenvermittler einen Metallkomplex oder eine organische Verbindung, wie etwa Kaliumferricyanid, ein Ferrocenderivat und ein Chinonderivat ohne Verwendung von Sauerstoff als dem Elektronenvermittler verwendet (siehe japanische offengelegte Patentschrift Hei 2-062952).however Such methods as described above are strong through the dissolved Oxygen concentration in the case of a specific object to be measured influenced, or are impossible in conditions where there is no oxygen. consequently For example, a glucose sensor of such a type has been developed as the electron mediator a metal complex or an organic Compound such as potassium ferricyanide, a ferrocene derivative and a quinone derivative without using oxygen as the electron mediator used (see Japanese Laid-Open Patent Hei 2-062952).

Für die Herstellung dieses Biosensors wird ein Elektrodensystem mit einer Messelektrode, einer Gegenelektrode und einer Referenzelektrode auf einer isolierenden Grundplatte z.B. durch Siebdruck gebildet, und dann wird eine Enzymreaktionsschicht einschließlich einem hydrophilen Polymer, einer Oxidoreductase und einem Elektronenvermittler auf dem Elektrodensystem gebildet. Falls notwendig, wird weiterhin ein Puffer zu dieser Enzymreaktionsschicht gegeben.For the production this biosensor becomes an electrode system with a measuring electrode, a counter electrode and a reference electrode on an insulating Base plate e.g. formed by screen printing, and then an enzyme reaction layer including a hydrophilic polymer, an oxidoreductase and an electron mediator formed on the electrode system. If necessary, will continue a buffer is added to this enzyme reaction layer.

Wenn eine Probenlösung einschließlich dem Substrat auf die Enzymreaktionsschicht dieses Sensors getropft wird, wird die Enzymreaktionsschicht gelöst und das Enzym reagiert mit dem Substrat, wodurch diese Reaktion die Reduktion des Elektronenvermittlers verursacht. Die Konzentration des Substrats in der Probenlösung kann durch einen Oxidationsstrom für das elektrochemische Oxidieren des folglich reduzierten Elektronenvermittlers nach dem Ende der Enzymreaktion bestimmt werden.If a sample solution including the substrate is added dropwise to the enzyme reaction layer of this sensor is, the enzyme reaction layer is dissolved and the enzyme reacts with the substrate, causing this reaction the reduction of the electron mediator caused. The concentration of the substrate in the sample solution can by an oxidation current for the electrochemical oxidation of the consequently reduced electron mediator be determined after the end of the enzyme reaction.

Gemäß dieser Art von Sensor wird die reduzierte Form des Elektronenvermittlers, die infolge der Enzymreaktion gebildet wird, durch die Elektrode oxidiert, und die Konzentration an Glukose kann durch den Oxidationsstrom bestimmt werden.According to this Type of sensor becomes the reduced form of the electron mediator, which is formed as a result of the enzyme reaction, through the electrode oxidized, and the concentration of glucose may be due to the oxidation current be determined.

Im Prinzip kann ein derartiger Biosensor für die Messung verschiedener Substanzen durch Verwendung eines Enzyms verwendet werden, dessen Substrat jeweils eine zu messende Substanz ist. Zum Beispiel kann ein Serumcholesterinspiegel, welcher als ein diagnostischer Index bei verschiedenen medizinischen Einrichtungen verwendet wird, unter Verwendung von Cholesterinoxidase oder Cholesterindehydrogenase und Cholesterinesterase als Oxidoreductase gemessen werden.in the Principle, such a biosensor for the measurement of various Substances can be used by using an enzyme, its substrate each is a substance to be measured. For example, a serum cholesterol level, which as a diagnostic index in various medical Facilities used, using cholesterol oxidase or cholesterol dehydrogenase and cholesterol esterase as oxidoreductase be measured.

Die Enzymreaktion von Cholesterinesterase schreitet sehr langsam voran. Durch Zugabe einer geeigneten oberflächenaktiven Substanz dazu kann Cholesterinesterase in ihrer Aktivität verstärkt werden, wodurch die für die Gesamtreaktion erforderliche Zeit verkürzt werden kann.The Enzyme reaction of cholesterol esterase proceeds very slowly. Cholesterol esterase can be added by adding a suitable surfactant in their activity reinforced become, by which the for the total reaction required time can be shortened.

Da dies jedoch dazu führt, dass das Reaktionssystem oberflächenaktive Substanz enthält, welche Hämocyten negativ beeinflusst, war es unmöglich Messungen unter Verwendung von Vollblut durchzuführen.There but this leads to that the reaction system is surface-active Contains substance, which hemocytes negatively influenced, it was impossible Perform measurements using whole blood.

Wie vorher beschrieben, in dem Fall der Messung eines Cholesterinspiegels in einem Blut, ist ein oberflächenaktiver Stoff in dem Reaktionssystem enthalten, und der oberflächenaktive Stoff beeinträchtigt stark die Erythrozyten im Blut. Dies machte es für Sensoren, wie etwa Glukosesensoren, unmöglich, Vollblut an sich zu messen. Es wurde daher ein Vorschlag gemacht, ein Filterelement in der Nähe einer Öffnung eines Probenzufuhrweges vorzusehen, um dazu nur Plasma des Bluts zuzuführen, wobei die Erythrozyten ausfiltriert wurden. Beispielen für ein derartiges System werden in US 5,609,749 ; US 5,658,444 ; JP 11344461 und EP 0856586 offenbart. Jedoch ist die Fließgeschwindigkeit des filtrierten Plasmas in das Innere des Sensors gering und ungleichmäßig, so dass der Ansprech- bzw. Reaktionswert schwankt, und oftmals werden Blasen erzeugt, wenn das Plasma in den Sensor eintritt, wodurch die Messung unmöglich wurde.As described above, in the case of measuring a cholesterol level in a blood, a surfactant is contained in the reaction system, and the surfactant greatly affects the erythrocytes in the blood. This made it impossible for sensors, such as glucose sensors, to measure whole blood by itself. Therefore, it has been proposed to provide a filter element in the vicinity of an opening of a sample supply path to supply only plasma of the blood, whereby the erythrocytes were filtered out. Examples of such a system are given in US 5,609,749 ; US 5,658,444 ; JP 11344461 and EP 0856586 disclosed. However, the flow rate of the filtered plasma into the inside of the sensor is small and uneven, so that the response value fluctuates, and bubbles are often generated when the plasma enters the sensor, making the measurement impossible.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, einen verbesserten Biosensor zur Verfügung zu stellen, der nicht die vorher beschriebenen Nachteile hat, und es Blutplasma mit daraus filtrierten Hämocyten ermöglicht, schnell das Elektrodensystem zu erreichen.An object of the present invention is to provide an improved biosensor which does not have the previously described disadvantages, and allowing blood plasma with hemocytes filtered therefrom to rapidly reach the electrode system.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, einen Cholesterinsensor zur Verfügung zu stellen, mit hoher Genauigkeit und welcher hervorragende Ansprecheigenschaften hat, und welcher es ermöglicht Vollblut als ein zu messendes Objekt zu verwenden.A Another object of the present invention is a cholesterol sensor to disposal with high accuracy and excellent response characteristics has, and which makes it possible To use whole blood as an object to be measured.

Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention

Ein erfindungsgemäßer Biosensor umfasst: eine isolierenden Grundplatte; ein Elektrodensystem mit einer Messelektrode und eine Gegenelektrode vorgesehen auf der Grundplatte; eine Reaktionsschicht mit wenigstens einer Oxidoreductase und einem Elektronenvermittler; einen Probenlösungszufuhrweg einschließlich dem Elektrodensystem und der Reaktionsschicht; eine Probenzufuhreinheit; und ein Filter, vorgesehen zwischen der Probenzufuhreinheit und dem Lösungszufuhrweg für das Ausfiltrieren von Hämocyten aus einem Blut, wobei das Plasma des Bluts, aus dem die Hämocyten durch das Filter ausfiltriert wurden, in das Innere des Probenlösungszufuhrwegs aufgrund eines Kapillarphänomens eingesaugt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Filter an seiner Stromaufwärtsseite eine Querschnittsfläche (F1) größer als die Querschnittsfläche einer Öffnung (S1) des Probenlösungszufuhrweg hat.One Inventive biosensor comprising: an insulating base plate; an electrode system with a measuring electrode and a counter electrode provided on the base plate; a reaction layer having at least one oxidoreductase and a Electron mediator; a sample solution delivery path including the Electrode system and the reaction layer; a sample delivery unit; and a filter provided between the sample supply unit and the solution delivery route for the Filtering out hemocytes from a blood, being the plasma of the blood from which the hemocytes filtered through the filter into the interior of the sample solution delivery path due to a capillary phenomenon is sucked in, characterized in that the filter on its Upstream side a cross-sectional area (F1) greater than the cross-sectional area an opening (S1) of the sample solution supply path Has.

Das hierbei verwendete Filter umfasst einen porösen Körper mit auf dreidimensionale Art und Weise verbundenen Poren. Dieser poröse Körper bewegt Blut aufgrund der Kapillarwirkung von der Probenzufuhreinheitsseite zu der Probenlösungszufuhrwegseite und hat die Funktion des Ausfiltrierens von Hämocyten aufgrund des Unterschieds in den Fließwiderständen zwischen dem Plasma und den Hämocyten. Für dieses Filter zu verwendende Materialien sind Vliesstoffe, Filterpapiere und andere poröse Körper, welche Fasern umfassen, bevorzugt hydrophile Fasern, wie etwa Glasfaser, Cellulose und Zellstoff.The used herein filter comprises a porous body with on three-dimensional Way connected pores. This porous body moves blood due to the Capillary action from the sample supply unit side to the sample solution supply path side and has the function of filtering out hemocytes due to the difference in the flow resistances between plasma and hemocytes. For this Filters to be used materials are nonwovens, filter papers and other porous ones Body, which Comprise fibers, preferably hydrophilic fibers, such as fiberglass, Cellulose and pulp.

Eine Querschnittsfläche des Filters an seiner Stromabwärtsseite ist bevorzugt gleich oder größer als die Querschnittsfläche an seiner Stromabwärtsseite, welche an der Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs angeordnet ist.A Cross sectional area the filter on its downstream side is preferably equal to or greater than the cross-sectional area on its downstream side, which at the opening the sample solution delivery route is arranged.

Kurze Beschreibung der ZeichnungenShort description of drawings

Die 1 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Biosensors gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.The 1 FIG. 10 is a vertical cross-sectional view of a biosensor according to an embodiment of the present invention. FIG.

Die 2 ist eine Draufsicht des gleichen Sensors, wobei eine Reaktionsschicht, ein Abstandskalter und eine Abdeckung entfernt wurden.The 2 FIG. 12 is a plan view of the same sensor with a reaction layer, a spacer and a cover removed. FIG.

Die 3 ist eine schräge, auseinandergezogene Ansicht des gleichen Sensors.The 3 is an oblique, exploded view of the same sensor.

Die 4 ist eine vergrößerte Querschnittsansicht eines Hauptteils des gleichen Sensors.The 4 FIG. 10 is an enlarged cross-sectional view of a main part of the same sensor. FIG.

Die 5 ist eine schematische, vertikale Querschnittsansicht, die Beispiele von Strukturen von Probenzufuhreinheiten für einen Sensor zeigen.The 5 Fig. 12 is a schematic vertical cross-sectional view showing examples of structures of sample supply units for a sensor.

Die 6 ist eine schematische Draufsicht, die Beispiele von Modifikationen von Filtern für einen Sensor zeigt.The 6 Fig. 12 is a schematic plan view showing examples of modifications of filters for a sensor.

Die 7 ist eine schematische vertikale Querschnittsansicht, die Beispiele von Modifikationen von Filtern für einen Sensor zeigt.The 7 Fig. 12 is a schematic vertical cross-sectional view showing examples of modifications of filters for a sensor.

Die 8 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Sensors gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.The 8th FIG. 12 is a vertical cross-sectional view of a sensor according to another embodiment of the present invention. FIG.

Die 9 ist eine schräge auseinandergezogene Ansicht des gleichen Sensors.The 9 is an oblique exploded view of the same sensor.

Die 10 ist eine schematische, vertikale Querschnittsansicht, die Beispiele von Modifikationen von Filtern für einen Sensor zeigt.The 10 Fig. 12 is a schematic vertical cross-sectional view showing examples of modifications of filters for a sensor.

Die 11 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Sensors gemäß eines Vergleichsbeispiels.The 11 FIG. 15 is a vertical cross-sectional view of a sensor according to a comparative example. FIG.

Die 12 ist eine Draufsicht des gleichen Sensors.The 12 is a plan view of the same sensor.

Die 13 ist eine graphische Darstellung, die Ansprecheigenschaften eines Beispiels der vorliegenden Erfindung und des Vergleichsbeispiels zeigt.The 13 Fig. 12 is a graph showing response characteristics of an example of the present invention and the comparative example.

Bevorzugte Ausführungsformen der ErfindungPreferred embodiments the invention

Wie vorher beschrieben dient die vorliegende Erfindung dazu, Hämocyten eines Bluts, die störende Substanzen sind unter Verwendung eines Filters zu entfernen, damit das Blutplasma schnell in ein Elektrodensystem eines Sensors fließen kann. Spezifischer wird ein Filter zwischen einer Probenzufuhreinheit und einem Probenlösungszufuhrweg vorgesehen, welcher ein Elektrodensystem und eine Reaktionsschicht enthält, wobei der Filter eine Funktion des Ausfiltrierens von Hämocyten hat und eine Querschnittsfläche einer Stromabwärtsseite davon hat, welcher größer als die Querschnittsfläche einer Öffnung des Probenlösungszufuhrweges ist. Dadurch wird aufgrund des Kapillarphänomens das Blutplasma mit daraus filtrierten Hämocyten in das Innere des Probenlösungszufuhrwegs gesaugt.As described above, the present invention serves to remove hemocytes of a blood which are interfering substances by using a filter so that the blood plasma can quickly flow into an electrode system of a sensor. More specifically, a filter is provided between a sample supply unit and a sample solution supply path including an electrode system and a reaction layer, the filter having a function of filtering out hemocytes and having a sectional area of a downstream side thereof greater than the cross-sectional area of an opening of the sample solution supply path. As a result, due to the capillary phenomenon, the blood plasma with hemocytes filtered from it into the interior of the Sucked sample solution supply path.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der Probenlösungszufuhrweg zwischen der Grundplatte und dem mit der Grundplatte kombinierten Deckelelement ausgebildet.According to one preferred embodiment the sample solution delivery route between the base plate and the combined with the base plate Cover element formed.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist wenigstens ein Teil des Deckelelements, welches das Filter und den Probenlösungszufuhrweg abdeckt, transparent.According to one another preferred embodiment is at least a part of the lid member which the filter and the sample solution delivery route covering, transparent.

Weiterhin werden die folgenden Bedingungen bevorzugt erfüllt, um das Blutplasma mit daraus abgetrennten Hämocyten in das Elektrodensystem einzubringen:

1) Die Querschnittsfläche des Probenlösungszufuhrwegs ist gleich oder kleiner als der Querschnitt der Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs;
2) Die Querschnittsfläche des Endteilbereichs des Filters an der Elektrodenseite ist gleich oder kleiner als jener der Seite auf der die Probenlösung eingebacht wird, d.h. die Seite stromaufwärts davon; und
3) Der Filter wird durch einen Haltekörper gehalten, so dass er nicht an der Expansion gehindert wird.

Furthermore, the following conditions are preferably fulfilled in order to introduce the blood plasma with hemocytes separated therefrom into the electrode system:

1) The cross-sectional area of the sample solution supply path is equal to or smaller than the cross-section of the opening of the sample solution supply path;
2) The cross-sectional area of the end portion of the filter on the electrode side is equal to or smaller than that of the side on which the sample solution is buried, ie, the upstream side thereof; and
3) The filter is held by a holding body so that it is not prevented from expanding.

Spezifischer ist es am meisten bevorzugt, dass die Querschnittsflächen eines Hohlteils und des Filters innerhalb des Sensors, wo die Probenlösung fließt, graduell von der Stromaufwärtsseite des Filters, welcher der Probenzufuhreinheit gegenüberliegt, zu der Belüftungsseite abnimmt, welche am Ende des Probenlösungszufuhrwegs offen ist.specific it is most preferred that the cross-sectional areas of a Hollow part and the filter within the sensor, where the sample solution flows, gradually from the upstream side the filter opposite the sample supply unit, to the ventilation side decreases, which is open at the end of the sample solution supply path.

Beispiele von Filtern mit geringen Querschnittsflächen an ihren vorderen Enden zu der Elektrodenseite sind z.B. diejenigen mit einer konvexen, konischen oder trapezartigen Form als Gesamtfilterform.Examples of filters with small cross-sectional areas at their front ends to the electrode side are e.g. those with a convex, conical or trapezoidal shape as a total filter shape.

Was mit einer geringeren Querschnittsfläche an dem vorderen Ende eines Filters gemeint ist, ist, dass ein Teil, welcher den vorderen Teilbereich des Filters an der Elektrodenseite stützt, schmaler wird je näher er dem Probenlösungszufuhrweg kommt.What with a smaller cross-sectional area at the front end of a Filters is meant that part of which is the front part supports the filter on the electrode side, the closer it gets to the narrower sample solution comes.

Um die Hämocyten vollständig zu entfernen, welche störende Substanzen sind, ist es bevorzugt, dass es wenigstens einen Teil des Filters gibt, wo das Filter ohne Kontakt mit einer filterhaltenden Einheit innerhalb eines Bereichs ist, der sich von der Probenzufuhreinheit zu dem Probenlösungszufuhrweg erstreckt, nämlich einen Teilbereich des Filters, an dem ein Raum die Oberfläche des Filters umfasst, so dass die Probenlösung durch den Filter ohne Ausnahme und Versagen durchtritt. Andererseits gibt es eine Möglichkeit, dass einige Hämocyten entlang der filterhaltenden Einheit laufen, ohne durch den Filter zu treten und in das Elektrodensystem fließen können.Around the hemocytes Completely to remove which disturbing Substances are, it is preferred that it is at least a part the filter indicates where the filter is out of contact with a filter-holding filter Unit within a range that is different from the sample delivery unit to the sample solution delivery path extends, namely a portion of the filter, where a space is the surface of the Includes filters, allowing the sample solution through the filter without Exception and failure passes. On the other hand, there is a possibility that some hemocytes run along the filter-holding unit without passing through the filter to kick and flow into the electrode system.

Nun lasst uns den Fall vergleichen, in dem das Filter stromabwärts eine Querschnittsfläche kleiner als die Querschnittsfläche stromaufwärts hat, mit dem Fall, wo der Filter eine gleiche Querschnittsfläche von der Stromaufwärts- zu der Stromabwärtsseite hat. In dem ersten Fall ist die Hämocytenseparationsposition näher zu der Stromaufwärtsseite verglichen mit dem letzteren Fall, wo die Hämocytenseparationsposition näher zu der Stromabwärtsseite ist. Demgemäß können im letzteren Fall einige Hämocyten möglicherweise in den Probenlösungszufuhrweg gelangen.Now let's compare the case where the filter downstream is one Cross sectional area smaller than the cross-sectional area upstream has, with the case where the filter has an equal cross-sectional area of the upstream to the downstream side Has. In the first case, the hemocyte separation position is closer to the upstream side compared with the latter case, where the hemocyte separation position closer to the downstream side is. Accordingly, in the latter case some hemocytes possibly get into the sample solution delivery path.

Unter Verwendung dieser Strukturen und Konfigurationen ist es möglich, störende Substanzen aus der Probenlösung zu entfernen und das Plasma kann schnell in das Innere des Sensors fließen.Under Using these structures and configurations it is possible to exclude interfering substances the sample solution remove and the plasma can quickly into the interior of the sensor flow.

In Bezug auf die relative Position zwischen dem vorderen Ende des Filters an der Elektrodenseite und den Elektroden, ist es bevorzugt, dass das Filter nicht in Kontakt mit den Elektroden ist.In Relative to the relative position between the front end of the filter on the electrode side and the electrodes, it is preferable that the filter is not in contact with the electrodes.

In Bezug auf eine Position, wo das Filterelement mit dem Biosensor vom Elektrodentyp verbunden ist, ist es gewöhnlich gut, derartige Positionen an der Öffnungsseite des Probenlösungszufuhrwegs auszuwählen, aber eine derartige Position kann zum Zwecke der Platzersparnis ebenfalls an der Entlüftungsseite gewählt werden. In einem derartigen Fall dient die Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs als eine Entlüftung.In Reference to a position where the filter element with the biosensor Of the electrode type, it is usually good to have such positions at the opening side of the sample solution delivery route, but such a position may also be for the purpose of saving space at the vent side chosen become. In such a case, the opening of the sample solution supply path serves as a vent.

Die filterhaltende Einheit, wie auch die Abdeckung und der Abstandskalter ist bevorzugt transparent. Dies ist so, damit eine visuelle Überprüfung des Vorgangs durchgeführt werden kann, in welchem die Probenlösung unter Verwendung des Filters filtriert wird, und des Vorgangs, in welchem die filtrierte Probenlösung in das Innere des Probenlösungszufuhrwegs aufgrund des Kapillarphänomens gesaugt wird, wodurch bestätigt werden kann, ob die Filtration erfolgreich durchgeführt wurde.The filter-holding unit, as well as the cover and the spacer is preferably transparent. This is so to allow a visual check of the operation carried out can be in which the sample solution using the filter is filtered, and the process in which the filtered sample solution in the interior of the sample solution delivery path due to the capillary phenomenon is sucked, thereby confirming can be used to determine if filtration has been successful.

Verwendbare Elektronenvermittler sind Kaliumferricyanid und diejenigen ausgewählt aus Redoxverbindungen mit einer Funktion Elektroden zu und von einer Oxidoreductase, wie etwa Cholesterinoxidase, zu transferieren.usable Electron mediators are potassium ferricyanide and those selected from Redox compounds with a function of electrodes to and from one Oxidoreductase, such as cholesterol oxidase to transfer.

Eine zu verwendende Oxidoreductase ist ein Enzym, dessen Substrat eine zu messende Zielsubstanz ist. Im Falle eines Sensors für die Messung von Glucose als ein Zielobjekt, ist Glucoseoxidase zu verwenden.A Oxidoreductase to be used is an enzyme whose substrate is a is to be measured target substance. In the case of a sensor for the measurement of glucose as a target, glucose oxidase is to be used.

Cholesterinoxidase oder Cholesterindehydrogenase, welches ein Enzym für die Katalyse der Oxidationsreaktion von Cholesterin ist, und Cholesterinesterase, welches ein Enzym für die Katalyse eines Vorgangs der Umwandlung von Cholesterinester zu Cholesterin sind, werden für die Messung eines Cholesterinspiegels verwendet, der als ein diagnostischer Index in Blutserum verwendet wird. Die Enzymreaktion der Cholesterinesterase schreitet sehr langsam voran. Durch Zugabe eines geeigneten oberflächenaktiven Stoffs dazu, kann Cholesterinesterase in ihrer Aktivität verstärkt werden, wodurch es möglich ist, die für die Gesamtreaktion erforderliche Zeit zu verkürzen. Diese wird auf oder in der Nähe des Elektronensystems angeordnet. Im Fall eines Sensors mit einem Deckelement, welches durch Kombination mit einer Grundplatte einen Probenlösungszufuhrweg zwischen dem Deckelement und der Grundplatte bildet, können sie ebenfalls an einem Teilbereich exponiert zu dem Probenlösungszufuhrweg oder an einer Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs vorgesehen werden. Wo immer eine derartige Position ist, ist es bevorzugt dass eine Reaktionsreagenzschicht leicht durch eine eingebrachte Probenlösung gelöst wird, um dadurch das Elektrodensystem zu erreichen. Um die Elektrode zu schützen, und um die Ablösung einer gebildeten Reaktionsschicht zu unterdrücken, ist es bevorzugt, dass eine hydrophile Polymerschicht in Kontakt mit der Oberfläche des Elektrodensystems gebildet wird. Ferner ist es neben dem Elektrodensystem bevorzugt, dass eine hydrophile Polymerschicht als eine Grundlage für die Bildung einer Reaktionsschicht gebildet wird, oder dass eine Reaktionsschicht, als eine unterste Schicht, ein hydrophiles Polymer enthält.Cholesterol oxidase or cholesterol dehydrate Rogenase, which is an enzyme for catalyzing the oxidation reaction of cholesterol, and cholesterol esterase, which is an enzyme for catalysis of a process of converting cholesterol ester to cholesterol, are used for the measurement of a cholesterol level used as a diagnostic index in blood serum , The enzyme reaction of cholesterol esterase proceeds very slowly. By adding a suitable surfactant thereto, cholesterol esterase can be enhanced in its activity, whereby it is possible to shorten the time required for the overall reaction. This is arranged on or in the vicinity of the electron system. In the case of a sensor having a cover member which forms a sample solution supply path between the cover member and the base plate by combination with a base plate, they may also be provided at a portion exposed to the sample solution supply path or at an opening of the sample solution supply path. Wherever such a position is, it is preferable that a reaction reagent layer is easily dissolved by an introduced sample solution to thereby reach the electrode system. In order to protect the electrode and to suppress the detachment of a formed reaction layer, it is preferred that a hydrophilic polymer layer be formed in contact with the surface of the electrode system. Further, besides the electrode system, it is preferable that a hydrophilic polymer layer is formed as a base for forming a reaction layer, or that a reaction layer, as a lowermost layer, contains a hydrophilic polymer.

Eine Schicht mit einem Elektronenvermittler wird bevorzugt von einem oberflächenaktiven Stoff getrennt, für den Zweck der Erhöhung der Löslichkeit davon. Ferner ist sie bevorzugt getrennt von der Cholesterinesterase, welches ein Enzym für die Katalyse der Oxidationsreaktion und Cholesterin ist, für den Zweck der Sicherung der Lagerungsstabilität.A Layer with an electron mediator is preferred by a surfactants Fabric separated, for the purpose of the increase the solubility of it. Further, it is preferably separated from the cholesterol esterase, which an enzyme for the catalysis of the oxidation reaction and cholesterol is for the purpose securing storage stability.

Im Fall von Biosensoren zur Messung des Blutzuckerspiegels gibt es ein Beispiel, in welchem eine Schicht, die ein Lipid enthält, gebildet wird, um z.B. eine auf dem Elektrodensystem gebildete Schicht abzudecken, für den Zweck der Erleichterung des Einführens der Probenlösung zu der Reaktionsschicht (siehe z.B. Japanische offengelegte Patentveröffentlichung Hei 2-062952). Ein erfindungsgemäßer Biosensor enthält einen oberflächenaktiven Stoff, welcher eine Funktion ähnlich zu der eines Lipids hat, so dass keine Lipidschicht benötigt wird.in the There is a case of biosensors for measuring blood sugar levels an example in which a layer containing a lipid is formed is used to to cover a layer formed on the electrode system, for the Purpose of facilitating insertion the sample solution to the reaction layer (see, for example, Japanese Laid-Open Patent Publication Hei 2-062952). A biosensor according to the invention contains a surfactant, which is similar to a function to that of a lipid, so that no lipid layer is needed.

Verwendbare hydrophile Polymere sind z.B. wasserlösliche Cellulosederivate, insbesondere Ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose und Carboxymethylcellulose als auch Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Gelatine, Polyacrylsäuren und ihre Salze, Stärke und ihre Derivate, Polymere von Maleinsäureanydrid und ihre Salze, Polyacrylamid, Methacrylharz und Poly-2-hydroxyethyl-methacrylat.usable hydrophilic polymers are e.g. water-soluble cellulose derivatives, in particular ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose and carboxymethylcellulose as well as polyvinylpyrrolidone, Polyvinyl alcohol, gelatin, polyacrylic acids and their salts, starch and their derivatives, polymers of maleic anhydride and their salts, Polyacrylamide, methacrylic resin and poly-2-hydroxyethyl methacrylate.

Oberflächenaktive Stoffe können ausgewählt werden aus n-Octyl-β-D-thioglucosid, Polyethylenglycolmonododecylether, Natriumcholat, Dodecyl-β-maltosid, Saccharosemonolaurat, Natriumdeoxycolat, Natriumtaurodeoxycholat, N,N-bis(3-Dglycon-amidepropyl))deoxycholamid und Polyoxyethylen(10)octylphenylether.surfactants Substances can to be selected from n-octyl-β-D-thioglucoside, Polyethylene glycol monododecyl ether, sodium cholate, dodecyl-β-maltoside, Sucrose monolaurate, sodium deoxycolate, sodium taurodeoxycholate, N, N-bis (3-D-glycidamidepropyl)) deoxycholamide and polyoxyethylene (10) octylphenyl ether.

Verwendbare Lipide sind Phospholipide, bevorzugt amphipathische Lipide, wie etwa Lecithin, Phosphatydylcholin und Phosphatydylethanolamin.usable Lipids are phospholipids, preferably amphipathic lipids, such as such as lecithin, phosphatydylcholine and phosphatydylethanolamine.

Als Verfahren für die Messung eines Oxidationsstroms gibt es ein Zwei-Elektronensystem nur unter Verwendung einer Messeelektrode und einer Gegenelektrode, und ein Drei-Elektrodensystem, welches zusätzlich eine Referenzelektrode verwendet. Das Drei-Elektrodensystem ermöglicht genauere Messungen.When Procedure for the measurement of an oxidation current, there is a two-electron system only using a measuring electrode and a counter electrode, and a three-electrode system which additionally has a reference electrode used. The three-electrode system allows more accurate measurements.

Hiernach wird die vorliegende Erfindung ausführlicher mit Bezug auf spezifische Ausführungsformen beschrieben.hereafter The present invention will be described in more detail with reference to specific embodiments described.

Die 1 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Biosensors gemäß einer Ausführungsform und die 2 ist eine Draufsicht, wobei seine Reaktionsschicht, der Abstandskalter und die Abdeckung entfernt wurden, während die 3 eine schräge auseinandergezogene Sicht des Biosensors ist, wobei seine Reaktionsschicht und das Filter entfernt wurden.The 1 FIG. 4 is a vertical cross-sectional view of a biosensor according to an embodiment and FIG 2 FIG. 12 is a plan view with its reaction layer, spacer and cover removed, while FIG 3 is an oblique exploded view of the biosensor with its reaction layer and filter removed.

Das Bezugszeichen 1 bezeichnet eine isolierende Grundplatte aus Polyethylenterephtalat. Diese Grundplatte 1 hat ein linkes Halbelement 1a mit einer geringeren Dicke und ein rechtes Halbelement 1b mit einer Dicke von etwa dem zweifachen der Dicke des linken Halbelements. Auf dem dünneren Element 1a wird eine Silberpaste gedruckt, um Leitungen 2, 3 und eine Grundlage für ein Elektrodensystem zu bilden. Ferner wird auf die Grundplatte 1 eine elektrisch leitfähige Kohlenstoffpaste mit einem Harzbindemittel gedruckt, um ein Elektrodensystem mit einer Messelektrode 4 und einer Gegenelektrode 5 zu bilden. Ferner wird eine isolierende Schicht 6 durch Drucken einer isolierenden Paste auf einen bestimmten Bereich gebildet. Die isolierende Schicht 6 definiert so die konstant exponierten Teile der Messelektrode 4 und der Gegenelektrode 5 und bedeckt teilweise die Leitungen 2 und 3. An dem dickeren Element 1b der Grundplatte 1 werden nach oben offene Aussparungen 7 und 8 vorgesehen.The reference number 1 denotes an insulating base plate of polyethylene terephthalate. This base plate 1 has a left half element 1a with a smaller thickness and a right half element 1b with a thickness of about twice the thickness of the left half-element. On the thinner element 1a A silver paste is printed to wires 2 . 3 and to form a basis for an electrode system. Further, on the base plate 1 printed an electrically conductive carbon paste with a resin binder to an electrode system with a measuring electrode 4 and a counter electrode 5 to build. Further, an insulating layer 6 formed by printing an insulating paste on a certain area. The insulating layer 6 defines the constantly exposed parts of the measuring electrode 4 and the counter electrode 5 and partly covers the pipes 2 and 3 , On the thicker element 1b the base plate 1 become upwardly open recesses 7 and 8th intended.

Ein mit der Grundplatte 1 zu kombinierender Abstandshalter 11 umfasst ein flaches Plattenelement 11a in einer Größe das es die isolierenden Schicht 6 auf der Grundplatte 1 im Wesentlichen abdeckt, und ein etwa Uförmiges Element 11b mit einer größeren Höhe für das Abdecken eines peripheren Teils des Elements 1b der Grundplatte und für die Bildung eines Raumteils, um einen später beschriebenen Filter auf der Grundplatte 1 zu enthalten. Das U-förmige Element 11b hat an seinem linken Endteil 16 eine Abschrägung 16, die kontinuierlich ihre Höhe vermindert, um so die gleiche Höhe wie die des flachen Plattenelements an einen Teilbereich davon zu haben, der mit dem flachen Plattenelement 11a verbunden wird. Überdies hat das U-förmige Element 11b ein Pressteilbereichg 19, um den Filter zu pressen, an einer Position oberhalb eines Teilbereichs entsprechend zu einem Abtrennungsteilbereich 9 zwischen den Aussparungen 7 und 8 der Grundplatte 1. Das flache Plattenelement 11a hat einen Schlitz 12, welcher von der Oberseite zu der Unterseite davon durchdringt, und welches zu der Seite des U-förmigen Elements offen ist.One with the base plate 1 to be combined spacers 11 includes a flat plate ment 11a in one size it's the insulating layer 6 on the base plate 1 essentially covers, and an approximately U-shaped element 11b with a greater height for covering a peripheral part of the element 1b the base plate and for the formation of a space part, to a filter described later on the base plate 1 to contain. The U-shaped element 11b has at its left end part 16 a bevel 16 which continuously reduces its height so as to have the same height as that of the flat plate member at a portion thereof, which coincides with the flat plate member 11a is connected. Moreover, the U-shaped element has 11b a press section 19 to press the filter at a position above a portion corresponding to a separation portion 9 between the recesses 7 and 8th the base plate 1 , The flat plate element 11a has a slot 12 which penetrates from the top to the bottom thereof and which is open to the side of the U-shaped member.

Eine Abdeckung 21 hat die Elemente 21a und 21b, welche entsprechend das flache Plattenelement 11a und das Element 11b des Abstandshalters 11 bedecken und an dem Element 21 einen geneigten Teilbereich 26 haben, welcher in Übereinstimmung mit dem schrägen Teilbereich 16 des Abstandshalters sich neigt. Die Abdeckung 21 hat ferner eine Entlüftung 22, die mit einem Ende des Schlitzes 12 der Grundplatte 1 zu verbinden ist, und ein durchgehendes Loch 28 hat, das mit der Aussparung 8 und dem offenen Teilbereich 18 an der rechten Seite des Pressteilbereichs 19 des Abstandshalters 11 zu verbinden ist.A cover 21 has the elements 21a and 21b , which correspond to the flat plate element 11a and the element 11b of the spacer 11 cover and on the element 21 a sloping section 26 which is in accordance with the oblique portion 16 of the spacer tips. The cover 21 also has a vent 22 with one end of the slot 12 the base plate 1 to connect, and a through hole 28 has that with the recess 8th and the open subarea 18 on the right side of the press section 19 of the spacer 11 to connect.

Ein in der 1 gezeigter Biosensor wird hergestellt durch: Bildung einer Reaktionsreagenzienschicht oder von Reaktionsreagenzienschichten auf der Grundplatte 1 und/oder an der Seite der Abdeckung 11; weiterhin Einsetzen eines Filters 20 auf die Grundplatte 1; und Kombinieren des Abstandshalters 11 und der Abdeckung 21 mit der Grundplatte 1. In der 1 bezeichnet das Bezugszeichen 10 ein Elektrodensystem. Das Filter 20 ist auf eine derartige Art und Weise fixiert, dass es an der Oberseite und Unterseite an einem hinteren Ende davon durch den abtrennenden Teilbereich 9 der Grundplatte 1 und dem Pressteilbereich 19 der Abdeckung 21 eingefasst ist; und ebenfalls an dem vorderen Ende davon durch den geneigten Teilbereich 26 der Abdeckung 21 bzw. eines Teilbereichs der Grundplatte 1 eingefasst wird, wobei der Teilbereich der Grundplatte benachbart zu einer Öffnung ihres Probenlösungszuführweges ist. Ferner liegt das Filter 20 an seinem vorderen Ende dem Probenlösungszufuhrweg gebildet durch den Schlitzteilbereich 12 des Abstandshalters 11 gegenüber.An Indian 1 The biosensor shown is made by: forming a reaction reagent layer or reaction reagent layers on the base plate 1 and / or on the side of the cover 11 ; continue to insert a filter 20 on the base plate 1 ; and combining the spacer 11 and the cover 21 with the base plate 1 , In the 1 denotes the reference numeral 10 an electrode system. The filter 20 is fixed in such a manner that it is at the top and bottom at a rear end thereof by the separating portion 9 the base plate 1 and the pressed part area 19 the cover 21 is enclosed; and also at the front end thereof through the inclined portion 26 the cover 21 or a portion of the base plate 1 wherein the portion of the base plate is adjacent to an opening of its Probenlösungszuführweges. Further, the filter is located 20 at its front end, the sample solution supply path formed by the slit portion 12 of the spacer 11 across from.

Das derartig fixierte Filter 20 ist an seiner einfassenden Oberfläche oberhalb der Aussparung 7 der Grundplatte 1 weder in Kontakt mit der Grundplatte noch mit dem Deckelement. Daher ist der Punkt, dass es einen Teilbereich des Filters 20 gibt, welcher ein Teilbereich ist, der nicht in Kontakt mit einer filterhaltenden Einheit ist, nämlich dass es einen Raumteilbereich gibt, welcher das Filter umfasst, wodurch Hämocyten daran gehindert werden entlang der filterhaltenden Einheit zu laufen, ohne das Filter zu durchtreten, und in das Elektrodensystem zu fließen.The thus fixed filter 20 is on its bordering surface above the recess 7 the base plate 1 neither in contact with the base plate nor with the cover element. Therefore, the point is that there is a subset of the filter 20 which is a portion that is not in contact with a filter-holding unit, that is, there is a space portion that includes the filter, whereby hemocytes are prevented from running along the filter-holding unit without passing through the filter, and into the filter Electrode system to flow.

In Bezug auf die 1 und 2 bezeichnet F1 eine Querschnittsfläche der Stromaufwärtsseite des Filters 20, während F2 die Querschnittsfläche der Stromabwärtsseite des Filters 20 bezeichnet, wobei die Stromabwärtsseite an der Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs angeordnet ist. Auf der anderen Seite bezeichnet S1 die Querschnittsfläche der Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs, während S2 die Querschnittsfläche des Probenlösungszufuhrwegs bezeichnet.Regarding the 1 and 2 F1 denotes a cross-sectional area of the upstream side of the filter 20 while F2 is the cross-sectional area of the downstream side of the filter 20 wherein the downstream side is located at the opening of the sample solution supply path. On the other hand, S1 denotes the cross-sectional area of the opening of the sample solution supply path, while S2 denotes the cross-sectional area of the sample solution supply path.

Die vorliegende Erfindung ist, eine Beziehung S1<F1 zu haben. Dadurch erreicht Blutplasma mit daraus ausfiltrierten Hämocyten schnell das Elektrodensystem. Ein bevorzugtes Verhältnis ist S2≤F1, bevorzugter F2≤F1.The The present invention is to have a relationship S1 <F1. As a result, blood plasma reaches with From this filtered hemocytes quickly the electrode system. A preferred ratio is S2≤F1, more preferred F2≤F1.

Um einen Cholesterinspiegel in einem Blut unter Verwendung dieses Sensors zu messen, wird ein Probenblut auf die Aussparung 8 der Grundplatte 1 durch das durchtretende Loch 28 der Abdeckung 21 gegeben. Das hier zugeführte Blut tritt in das Innere des Filters 20 von seinem Endteilbereich. Die Penetrationsgeschwindigkeit von der Hämocyten des Bluts in das Filter 20 ist langsamer als die des Plasmas, welches ein flüssiger Bestandteil ist. Daher sickert das Plasma aus dem Ende an der Elektrodensystemseite des Filters. Das derartig herausgesickerte Plasma füllt den gesamten Probenlösungszufuhrweg von der Nähe des Elektronensystems zu der Entlüftung 22, während das Reaktionsreagenz gelöst wird, welches z.B. Enzyme enthält und an einer Position getragen wird, um das Elektrodensystem oder eine hintere Oberfläche der Abdeckung gerade oberhalb der Position zu bedecken. Wenn die Gesamtheit des Probenlösungszufuhrwegs mit der Flüssigkeit gefüllt ist, stoppt der Zufluss der Flüssigkeit in das Filter 20. Ab diesem Augenblick erreichen die Hämocyten den Endteilbereich an der Elektrodensystemseite des Filters 20 nicht, und werden dann an ihren Positionen zurückgehalten. Demgemäss ist das Filter 20 so gestaltet, um einen Unterschied in dem Fließwiderstand zwischen dem Plasma und den Hämocyten zu einem derartigen Ausmaß zu ergeben, dass die Hämocyten nicht die Stromabwärtsseite des Filters erreichen, selbst nachdem das Plasma in einer derartigen Menge um die Gesamtheit des Probenlösungszufuhrweges auszufüllen dadurch getreten ist. Ein geeignetes erfindungsgemäßes Filter ist ein Tiefenfilter mit einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 1 bis 7 μm.To measure a cholesterol level in a blood using this sensor, a sample blood is applied to the recess 8th the base plate 1 through the passing hole 28 the cover 21 given. The blood supplied here enters the interior of the filter 20 from its final section. The rate of penetration of the hemocytes of the blood into the filter 20 is slower than that of the plasma, which is a liquid component. Therefore, the plasma seeps out of the end on the electrode system side of the filter. The thus-leaked plasma fills the entire sample solution supply path from the vicinity of the electron system to the vent 22 while dissolving the reaction reagent, which eg contains enzymes and is carried in position to cover the electrode system or a back surface of the cover just above the position. When the entirety of the sample solution supply path is filled with the liquid, the inflow of the liquid into the filter stops 20 , From this moment, the hemocytes reach the end portion on the electrode system side of the filter 20 not, and are then held back at their positions. Accordingly, the filter 20 designed so as to give a difference in the flow resistance between the plasma and the hemocytes to such an extent that the hemocytes do not reach the downstream side of the filter even after the plasma has passed through in such an amount to fill the entirety of the sample solution supply pathway. A suitable filter according to the invention is a depth filter having an average pore size of about 1 to 7 μm.

Nach einem derartigen Hämocyten-Filtrationsvorgang reagiert das durch das Plasma gelöste Reagenz chemisch mit einem zu messenden Bestandteil im Plasma, wobei der Bestandteil z.B. Cholesterin im Falle eines Cholesterinsensors ist. Nach Verstreichen einer bestimmten Zeit danach kann der Bestandteil ins Plasma durch Messung eines elektrischen Stromwertes auf der Grundlage einer Elektrodenreaktion quantifiziert werden. Die 4 zeigt ein Beispiel des Aufbaus der Reaktionsreagenzschicht in der Nähe des Elektrodensystems am Probenlösungszufuhrweg. Auf dem Elektrodensystem auf der Grundplatte 1 werden eine Schicht 30 eines Natriumsalzes der Carboxymethylcellulose (hiernach einfach als CMC bezeichnet) welches ein hydrophiles polymer ist, und eine Schicht 31a eines Reaktionsreagenz wie z.B. einem Elektronenvermittler, gebildet. Ferner wird eine Schicht eines oberflächenaktiven Stoffs 32 und eine Reaktionsreagenzschicht 31b mit einer Oxidoreductase an einer hinteren Oberfläche des Deckelelements mit der Abdeckung 21 kombiniert mit dem Abstandskalter 11 gebildet, wobei die hintere Oberfläche zu dem Probenlösungszufuhrweg hin exponiert ist.After such a hemocyte filtration process, the reagent dissolved by the plasma reacts chemically with a component to be measured in the plasma, the component being, for example, cholesterol in the case of a cholesterol sensor. After elapse of a certain time thereafter, the component can be quantified into the plasma by measuring an electric current value based on an electrode reaction. The 4 Fig. 14 shows an example of the structure of the reaction reagent layer in the vicinity of the electrode system on the sample solution supply path. On the electrode system on the base plate 1 become a layer 30 a sodium salt of carboxymethyl cellulose (hereinafter simply referred to as CMC) which is a hydrophilic polymer, and a layer 31a a reaction reagent such as an electron mediator. Further, a layer of a surfactant 32 and a reaction reagent layer 31b with an oxidoreductase on a back surface of the lid member with the cover 21 combined with the distance switch 11 formed with the rear surface exposed to the sample solution supply path.

Die 5, 6 und 7 sind schematische Zeichnungen, die Beispiele von Modifikationen des Sensors zeigen.The 5 . 6 and 7 Fig. 12 are schematic drawings showing examples of modifications of the sensor.

Die 5 zeigt verschiedene Beispiele von Probenzufuhreinheiten. Die 5(a) zeigt eine Struktur, bei welcher eine Probenzufuhreinheit 8 eine Aussparung hat, um wie in der 1 eine Probenlösung aufzunehmen. Die 5(b) zeigt ein Beispiel mit einer Probenzufuhreinheit 8, die in einer Art und Weise strukturiert ist, dass das Filter 20 an einer oberen Seite eines Endteilbereichs davon, einen exponierten Teilbereich hat, an welchem eine Probenlösung zuzuführen ist. Die 5(c) zeigt eine Struktur, das eine Oberseite eines Endteilbereichs davon und die Endoberfläche an der Stromabwärtsseite des Filters 20 exponiert sind. Folglich kann eine Probe nicht nur zu der Probenzufuhreinheit 8 zugegeben werden, sondern ebenfalls an der Oberseite des Endteilbereichs des Filters 20.The 5 shows various examples of sample supply units. The 5 (a) shows a structure in which a sample supply unit 8th has a recess to like in the 1 to receive a sample solution. The 5 (b) shows an example with a sample supply unit 8th that is structured in a way that the filter 20 on an upper side of an end portion thereof has an exposed portion to which a sample solution is to be supplied. The 5 (c) shows a structure including a top of an end portion thereof and the end surface on the downstream side of the filter 20 are exposed. Consequently, a sample can not only go to the sample supply unit 8th are added, but also at the top of the end portion of the filter 20 ,

Die 6 ist eine Draufsicht, die verschiedene Formen der Filter zeigt. Die 6(a) zeigt ein Beispiel, in welchem das Filter die gleiche Breite von der Stromaufwärtsseite zu der Stromabwärtsseite davon hat. Die 6(b) zeigt ein Beispiel, in welchem das Filter ein Abschrägung hat, um eine kontinuierlich abnehmende Breite von der Stromaufwärtsseite zu der Stromabwärtsseite zu haben, wobei dessen Form ungefähr trapezartig ist. Die 6(c) zeigt ein Beispiel, in welchem seine Breite an einem Mittelpunkt so geändert ist, dass die Breite an der Stromaufwärtsseite größer als die an der Stromabwärtsseite ist.The 6 Fig. 10 is a plan view showing various shapes of the filters. The 6 (a) shows an example in which the filter has the same width from the upstream side to the downstream side thereof. The 6 (b) shows an example in which the filter has a taper to have a continuously decreasing width from the upstream side to the downstream side, the shape of which is approximately trapezoidal. The 6 (c) shows an example in which its width at a center is changed so that the width on the upstream side is larger than that on the downstream side.

Die 7 zeigt Beispiele von Filtern mit verschiedenen Querschnittformen. In den 7(a) bis (c) werden derartige Abschrägungen vorgesehen, um die Querschnitte der Stromaufwärtsseiten größer als diejenigen der Stromabwärtsseiten zu machen. In den 7(d) und (e) hat jede Stromaufwärtsseite einen Querschnitt der gleich zu dem der Stromabwärtsseite ist.The 7 shows examples of filters with different cross-sectional shapes. In the 7 (a) to (c), such chamfers are provided to make the cross sections of the upstream sides larger than those of the downstream sides. In the 7 (d) and (e), each upstream side has a cross section equal to that of the downstream side.

Wie in den 1 und den 5 bis 7 vorher gezeigt, ist der Schlitz 12, welcher den Probenlösungszufuhrweg aufbaut, so gestaltet, um eine Querschnittsfläche zu haben, die senkrecht zu der Fließrichtung der Flüssigkeit ist, in jedem Fall kleiner als die Querschnittsfläche des Filters 20. Ferner hat das Filter 20 im Wesentlichen eine gleichmäßige durchgängige Dichte. Folglich ist erfindungsgemäß die Querschnittsfläche S2 des Probenlösungszufuhrwegs so gestaltet, um kleiner als die Querschnittsfläche F1 der Stromaufwärtsseite des Filters 20 zu sein, wodurch das Blutplasma ohne daraus filtrierte Hämocyten schnell aufgrund des Kapillarphänomens in den Probenlösungszufuhrweg gesaugt wird. Durch Verkleinerung der Querschnittsfläche des Filters an der Vorderseite davon wird ermöglicht, dass das Plasma schnell in das Innere des Sensors fließt.As in the 1 and the 5 to 7 previously shown is the slot 12 which constructs the sample solution supply path is designed so as to have a cross-sectional area perpendicular to the flow direction of the liquid, in any case smaller than the cross-sectional area of the filter 20 , Furthermore, the filter has 20 essentially a uniform continuous density. Thus, according to the present invention, the cross-sectional area S2 of the sample solution supply path is made to be smaller than the cross-sectional area F1 of the upstream side of the filter 20 whereby the blood plasma without hemocytes filtered therefrom is rapidly sucked into the sample solution delivery path due to the capillary phenomenon. Reducing the cross-sectional area of the filter at the front thereof allows the plasma to flow rapidly into the interior of the sensor.

Es wird ebenfalls möglich, dass das Plasma schnell in das Innere des Probenlösungszufuhrwegs fließt in dem Fall, dass jede in der 5 gezeigte Probenzufuhreinheit mit jeder in der 6 gezeigten flachen Form des Filters und/oder jeder in der 7 gezeigten Querschnittsfläche des Filters kombiniert wird.It also becomes possible for the plasma to quickly flow into the interior of the sample solution supply path in the case where each one in the 5 shown sample delivery unit with each in the 6 shown flat shape of the filter and / or each in the 7 shown cross-sectional area of the filter is combined.

Gemäß jedem derartigen, gezeigten Biosensor ist die Breite der Stromaufwärtsseite eines Filters bevorzugt nicht größer als 5mm und die Dicke davon ist nicht größer als 2mm. Die Breite der Öffnung des Probenlösungszufuhrwegs ist bevorzugt nicht größer als 2mm und die Dicke davon ist nicht größer als 200 μm.According to everyone such biosensor shown is the width of the upstream side a filter preferably not greater than 5mm and the thickness of it is not bigger than 2mm. The width of the opening of the sample solution supply path is preferably not greater than 2mm and the thickness thereof is not larger than 200 μm.

Die 8 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Biosensors gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, während die 9 eine auseinandergezogene schräge Ansicht mit einer davon entfernten Reagenzschicht ist.The 8th FIG. 15 is a vertical cross-sectional view of a biosensor according to another embodiment of the present invention, while FIGS 9 is an exploded oblique view with a reagent layer removed therefrom.

Auf einer isolierenden Grundplatte 31 werden Leitungen 32 und 33, eine Arbeitselektrode 34 und eine Gegenelektrode 35 verbunden mit den entsprechenden Leitungen als auch eine isolierende Schicht 36 in einer ähnlichen Art und Weise zu dem Fall der 1 gebildet. Mehrere Abstandskalter 41, 43, 45, 47 und 49 und eine Abdeckung 53 werden auf dieser Grundplatte 31 zusammengesetzt. Ein Filter 51 ist an einem Teilbereich mit durchgängigen Löchern 46, 48 und 50 zwischen dem Abstandskalter 43 und der Abdeckung 53 eingesetzt. Ein durchgängiges Loch 53 der Abdeckung 52 bildet einen Probenlösungszufuhrweg und die durchgängigen Löcher 42 und 44,m vorgesehen in den Abstandshaltern 41 und 42 bilden einen Probenlösungszufuhrweg. Die durchgängigen Löcher 46 und 50 der Abstandskalter 45 und 49 sind größer im Durchmesser als das Filter 51, so dass die durch die Bezugszeichen 55 und 56 bezeichneten Räume um das Filter 51 gebildet werden, um das Filter 51 zu umfassen. Der Abstandskalter 47 ist teilweise in Kontakt mit der äußeren Peripherie des Filters 51, um das Filter zu positionieren. Abstandskalter 41 hat ein paar Lüftungen 54, um eine terminale Seite des Endteilbereichs des Probenlösungszufuhrweges zu der äußeren Atmosphäre freizulassen. Folglich wird aufgrund des Kapillarphänomens eine Probenlösung in das Filter 51 eingebracht und in den Probenlösungszufuhrweg in einem Bereich der sich von dem durchgängigen Loch 53, welches als eine Probenzufuhreinheit dient, zu dem Elektrodensystem erstreckt. Die Bewegung der Probenlösung hört auf, wenn durch das Filter 51 filtriertes Plasma das Elektrodensystem erreicht.On an insulating base plate 31 become cables 32 and 33 , a working electrode 34 and a counter electrode 35 connected to the corresponding lines as well as an insulating layer 36 in a similar way to the case of 1 educated. Several distance switches 41 . 43 . 45 . 47 and 49 and a cover 53 be on this base plate 31 composed. A filter 51 is at a partial area with continuous holes 46 . 48 and 50 between the distance switch 43 and the cover 53 used. A continuous hole 53 the cover 52 forms a sample solution delivery path and the through holes 42 and 44, m provided in the spacers 41 and 42 form a sample solution delivery path. The continuous holes 46 and 50 the distance switch 45 and 49 are larger in diameter than the filter 51 , so that by the reference numerals 55 and 56 designated spaces around the filter 51 be formed to the filter 51 to include. The distance switch 47 is partially in contact with the outer periphery of the filter 51 to position the filter. distance Cold 41 has a few vents 54 to release a terminal side of the end portion of the sample solution supply path to the outside atmosphere. Consequently, due to the capillary phenomenon, a sample solution is introduced into the filter 51 and introduced into the sample solution supply path in a region extending from the through hole 53 serving as a sample supply unit to the electrode system. The movement of the sample solution ceases when passing through the filter 51 filtered plasma reaches the electrode system.

Hierbei ist jede Dicke der Abstandshalter 49 und 45, welche die Höhe der Räume 55 und 56 abgrenzt, bevorzugt nicht geringer als 100 μm. Der Abstandshalter 41 hat das durchgängige Loch 42, welches als ein Ort dient, wo die Probenlösung mit dem Reagenz reagiert. Die Dicke des Abstandshalters 41 ist bevorzugt nicht größer als 200 μm.Here, each thickness is the spacer 49 and 45 indicating the height of the rooms 55 and 56 delimits, preferably not less than 100 microns. The spacer 41 has the through hole 42 , which serves as a place where the sample solution reacts with the reagent. The thickness of the spacer 41 is preferably not greater than 200 microns.

In diesem Beispiel wird eine CMC-Schicht 61 und eine Elektronenvermittlerschicht 62 auf dem Elektrodensystem gebildet und eine Schicht 63 mit einem Enzym und einem oberflächenaktiven Stoff wird auf der hinteren Oberfläche des Abstandshalters 43 gebildet.This example becomes a CMC layer 61 and an electron mediator layer 62 formed on the electrode system and a layer 63 with an enzyme and a surfactant on the back surface of the spacer 43 educated.

Die 10 zeigt Beispiele von Filtern in Sensoren von einem derartigen Typ, wie er vorher beschrieben wird, wobei eine Probenlösung von einer Probenzufuhreinheit vorgesehen an der Abdeckungsseite, in Richtung eines Elektrodensystems in der Schwerkraftrichtung zugeführt wird. Die 10(a) zeigt ein Beispiel unter Verwendung eines Filters 51 mit einem gleichen Querschnittteilbereich an sowohl der Stromaufwärtsseite als auch der Stromabwärtsseite davon in der gleichen Art und Weise wie in der 8, wobei 10(b) ein Beispiel zeigt, das an seiner Stromabwärtsseite eine Querschnittsfläche kleiner als die Querschnittsfläche an seiner Stromaufwärtsseite hat.The 10 FIG. 14 shows examples of filters in sensors of such a type as described above, wherein a sample solution is supplied from a sample supply unit provided on the cover side in the direction of an electrode system in the direction of gravity. The 10 (a) shows an example using a filter 51 with a same cross-sectional portion at both the upstream side and the downstream side thereof in the same manner as in FIG 8th , in which 10 (b) shows an example having on its downstream side a cross-sectional area smaller than the cross-sectional area on its upstream side.

Hiernach wird ein Beispiel der vorliegenden Erfindung beschrieben.hereafter An example of the present invention will be described.

Beispiel 1example 1

Verfahren für die Herstellung eines Cholesterinsensors wird im Folgenden beschrieben, welcher eine in den 1 bis 4 gezeigte Struktur hat, wobei: eine Reaktionsschicht 31a einen Elektronenvermittler enthält; eine Reaktionsschicht 31b eine Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und einen oberflächenaktiven Stoff enthält; und eine Schicht 32 einen oberflächenaktiven Stoff umfasst.Process for the preparation of a cholesterol sensor is described below, which one in the 1 to 4 has shown structure, wherein: a reaction layer 31a contains an electron mediator; a reaction layer 31b a cholesterol oxidase, cholesterol esterase and a surfactant; and a layer 32 a surfactant.

Zunächst wurden 5 μl einer wässrigen Lösung mit 0,5 Gew.-% Natriumsalz der Carboxylmethylcellulose auf ein Elektrodensystem getropft und dann in einem Heißlufttrockner bei 50°C für 10 Minuten getrocknet, wobei eine CMC-Schicht 30 gebildet wurde. Als nächstes wurden 4 μl einer wässrigen Kaliumferricyanidlösung (entsprechend 70 mM Kaliumferricyanid) auf die CMC-Schicht 30 getropft und dann in einem Heißlufttrockner bei 50°C für 10 Minuten getrocknet, wobei eine Reaktionsschicht 31a mit Kaliumferricyanid gebildet wurde.First, 5 μl of an aqueous solution containing 0.5% by weight of sodium salt of the carboxylmethyl cellulose was dropped on an electrode system and then dried in a hot air drier at 50 ° C for 10 minutes to form a CMC layer 30 was formed. Next, 4 μl of a potassium ferricyanide aqueous solution (corresponding to 70 mM potassium ferricyanide) was applied to the CMC layer 30 dripped and then dried in a hot air dryer at 50 ° C for 10 minutes, using a reaction layer 31a was formed with potassium ferricyanide.

Eine Ethanollösung in einer Menge von 2 μl mit 2 Gew.-% Polyoxyethylen(10)octylphenlether (Triton X-100), welches ein oberflächenaktiver Stoff ist, wurde auf eine Aussparung, gebildet durch einen Schlitz einer Abdeckung kombiniert mit einem Abstandshalter, getropft und wurde bei Raumtemperatur für 3 Minuten getrocknet, wobei eine Schicht eines oberflächenaktiven Stoffs 32 gebildet wurde. Der vorher beschriebene Schlitz hatte eine Breite von 2mm und eine Länge von 4,5mm, während der Abstandshalter eine Dicke von 100 μm hat.An ethanol solution in an amount of 2 μl with 2% by weight of polyoxyethylene (10) octylphenol ether (Triton X-100), which is a surfactant, was dropped on a recess formed by a slot of a cover combined with a spacer was dried at room temperature for 3 minutes using a surfactant layer 32 was formed. The previously described slot had a width of 2mm and a length of 4.5mm, while the spacer has a thickness of 100μm.

Polyoxyethylen(10)octylphenylether (Triton X-100), welcher ein oberflächenaktiver Stoff ist, wurde zu einer wässrigen Lösung mit darin gelöster Cholesterinoxidase aus Nocardia (EC1.1.3.6, hiernach als ChOD bezeichnet) und Cholesterinesterase aus Pseudomonas (EC.3.1.1.13, hiernach als ChE bezeichnet) gegeben. Diese gemischte wässrige Lösung wurde in einer Menge von 1,5 μl auf die Schicht des oberflächenaktiven Stoffs 32 getropft und durch flüssigen Stickstoff bei -196°C gefroren und dann in einem Kjedahl-Kolben gelagert und in einem Gefriertrockner über Nacht getrocknet, wodurch eine Reaktionsschicht 31b gebildet wurde, die 480 Einheiten (E)/ml Cholesterinoxidase, 1.200 E/ml Cholesterinesterase und 2 Gew.-% des oberflächenaktiven Stoffs enthält. Auf der derartig gebildeten Grundplatte 1 einen Sensor wurde in einer in der 2 gezeigten Art und Weise ein Glasfaserfilterpapier, das so geschnitten wurde, um eine trapezartige Form zu haben mit einer oberen Seite von 2mm, einer unteren Seite von 4mm und einer Höhe von 3mm und einer Dicke von 600 μm und einer mittleren Porengröße von 2,3 μm so vorgesehen, um nicht in Kontakt mit einer Arbeitselektrode zu sein.Polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (Triton X-100), which is a surfactant, was added to an aqueous solution containing Nocardia cholesterol oxidase (EC1.1.3.6, hereinafter referred to as ChOD) and Pseudomonas cholesterol esterase (EC.3.1. 1.13, hereinafter referred to as CHE) given. This mixed aqueous solution was applied to the surfactant layer in an amount of 1.5 μl 32 was dropped and frozen by liquid nitrogen at -196 ° C and then stored in a Kjedahl flask and dried overnight in a lyophilizer to give a reaction layer 31b containing 480 units (E) / ml of cholesterol oxidase, 1,200 U / ml of cholesterol esterase and 2% by weight of the surfactant. On the base plate thus formed 1 a sensor was in one in the 2 As shown, a glass fiber filter paper cut to have a trapezoidal shape having an upper side of 2 mm, a lower side of 4 mm and a height of 3 mm and a thickness of 600 μm and an average pore size of 2.3 μm so as not to be in contact with a working electrode.

Danach wurde das vorgeschriebene Deckelelement auf der Grundplatte gebunden, wodurch ein Cholesterinsensor wie in der 1 hergestellt wurde.Thereafter, the prescribed lid member was bonded to the base plate, whereby a cholesterol sensor as in 1 was produced.

Vergleichsbeispiel 1Comparative Example 1

Ein zu dem des Beispiels 1 ähnlicher Cholesterinsensor wurde zusammengesetzt, außer dass der hier eingesetzte Sensor einen Filter 20' mit derartigen Abmessungen hat, dass seine Breite 2mm ist, seine Länge 27mm war und seine Dicke 100 μm war wie in der 11 und der 12 gezeigt.A cholesterol sensor similar to that of Example 1 was assembled, except that the sensor used here is a filter 20 ' with dimensions such that its width is 2mm, its length was 27mm and its thickness was 100μm as in the 11 and the 12 shown.

Die Cholesterinsensoren A und B gemäß dem Beispiel 1 bzw. dem Vergleichsbeispiel wurden jeweils mit 20 μl eines Vollblutes als eine Probenlösung versehen, welches in die Aussparung 8 der Grundplatte 1 durch das durchgängige Loch 28 der Abdeckung 21 gegeben wurde, wobei das durchgängige Loch ein Einlass für die Probenlösung ist. Zu einem Zeitpunkt 3 Minuten später wurde eine Pulsspannung von +0,5 V in der Anodenrichtung an die Messelektrode mit der Gegenelektrode als eine Referenz angelegt, wobei ein Wert eines fließenden elektrischen Stroms zu einem Zeitpunkt 5 Sekunden nach der Pulsspannungsanlegung zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode gemessen wurde. Die Ergebnisse derartiger Messungen werden in der 13 gezeigt. Jeder der beiden Filter in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 hatten ein apparentes Volumen von etwa 5,4 mm³.The cholesterol sensors A and B according to Example 1 and the Comparative Example were each provided with 20 ul of a whole blood as a sample solution, which in the recess 8th the base plate 1 through the continuous hole 28 the cover 21 with the through hole being an inlet for the sample solution. At a time 3 Minutes later, a pulse voltage of +0.5 V in the anode direction was applied to the measuring electrode with the counter electrode as a reference, and one value of a flowing electric current at a time 5 Seconds after pulse voltage application between the working electrode and the counter electrode. The results of such measurements are reported in the 13 shown. Each of the two filters in Example 1 and Comparative Example 1 had an apparent volume of about 5.4 mm ³ .

Wie aus der graphischen Darstellung ersichtlich kann mit einem erfindungsgemäßen Sensor eine gute Linearität zwischen den Cholesterinkonzentrationen und den Ansprechwerten erhalten werden.As can be seen from the graph can with a sensor according to the invention a good linearity between cholesterol levels and thresholds become.

Industrielle Anwendbarkeitindustrial applicability

Gemäß der vorliegenden Erfindung können Hämocyten eines Bluts, welche störende Substanzen durch ein Filter entfernt werden, und das Blut kann schnell zu dem Elektrodensystem geführt werden, um einen elektrochemischen Biosensor mit hervorragenden Antworteigenschaften zur Verfügung zu stellen.According to the present Invention can hemocytes a blood, which disturbing Substances are removed through a filter, and the blood can be fast led to the electrode system be an electrochemical biosensor with excellent Response properties available to deliver.

Claims

Biosensor comprising: an insulating base plate; an electrode system having a measuring electrode and a counter electrode provided on the base plate; a reaction layer comprising at least one oxidoreductase and an electron mediator; a sample solution delivery path including the electrode system and the reaction layer; a sample supply unit; and a filter ( 20 ) provided between the sample supply unit and the solution supply path for filtering hemocytes from a blood, wherein the plasma of the blood from which the hemocytes were filtered out through the filter is sucked into the interior of the sample solution supply path due to a capillary phenomenon Upstream side has a cross-sectional area (F1) larger than the cross-sectional area of an opening (S1) of the sample solution supply path and which is also larger than a cross-sectional area (F2) on a downstream side thereof, the downstream side being located at the opening of the sample solution supply path.

The biosensor of claim 1, wherein the sample solution delivery path a cross-sectional area (S1) is equal to or smaller than the sectional area (S2) of the opening of the Sample solution supply pathway Has.

Biosensor according to claim 1, wherein the cross-sectional area (F2) the filter on the downstream side equal to or greater than the cross-sectional area (S1) the opening the sample solution delivery path is.

Biosensor according to one of claims 1 to 3, wherein the filter a porous one body having pores connected in a three-dimensional manner, and being the porous one body the blood due to capillary action from one side of the sample delivery unit to one side of the sample solution delivery path moved, and the function has, the hemocytes due to the differences in the flow resistances between the Plasma and hemocytes filter out.

Biosensor according to one of claims 1 to 4, which is attached to a Part of the filter in an area extending from the feeder unit to the sample solution delivery path extends, comprises a space surrounding a surface of the filter.

A biosensor according to claim 1, wherein an end face the filter on its downstream side is in contact with the electrodes.

The biosensor of claim 1, wherein the sample solution delivery path between the base plate and one combined with the base plate Cover element is formed.

Biosensor according to claim 7, wherein at least a part the lid member containing the filter and the sample solution supply path covering, is transparent.

Biosensor according to claim 7, wherein a surface-active Cloth is worn or fixed on the lid member.