DE60038252T2 - Menschlicher Antikörper gegen Gangliosid GD3 für die Transplantationskomplentarität bestimmende Region und Derivate des Antikörpers gegen das Gangliosid GD3 - Google Patents

Menschlicher Antikörper gegen Gangliosid GD3 für die Transplantationskomplentarität bestimmende Region und Derivate des Antikörpers gegen das Gangliosid GD3 Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper und das Antikörperfragment, welcher/s spezifisch mit dem Gangliosid GD3 reagiert. Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine DNA-Sequenz, die den Antikörper oder das Antikörperfragment codiert. Die Erfindung betrifft einen Vektor, der die DNA-Sequenz umfasst und eine mit dem Vektor transformierte Zelle. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Antikörpers und des Antikörperfragments unter Verwendung der transformierten Zelle und ein diagnostisches Agens sowie einen therapeutischen Wirkstoff gegen Krebs unter Verwendung des Antikörpers und des Antikörperfragments.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es ist bekannt, dass ein aus einem nicht-menschlichen Tier stammender Antikörper, z. B. ein Maus-Antikörper bei Verabreichung an Menschen als Fremdsubstanz erkannt wird und damit im menschlichen Körper ein menschlicher Antikörper gegen den Maus-Antikörper induziert wird (menschlicher anti-Maus-Antikörper, nachfolgend als „HAMA" bezeichnet). Es ist bekannt, dass der HAMA mit dem verabreichten Maus-Antikörper reagiert, wodurch Nebenwirkungen hervorgerufen werden (J. Clin. Oncol. 2, 881 (1984); Blond 65, 1349 (1985); J. Natl. Cancer Inst. 80, 932 (1988); Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 1242 (1985)), wodurch der verabreichte Maus-Antikörper schneller aus dem Blut verschwindet (J. Nucl. Med. 26, 1011 (1985); Blond 65, 1349 (1985); J. Natl. Cancer Inst. 80, 937 (1988)) und die therapeutischen Effekte des Maus-Antikörpers herabgesetzt werden (J. Immunol. 135, 1530 (1985); Cancer Res. 46, 6489 (1986)).
  • Um diese Probleme zu lösen, sind Versuche durchgeführt worden, einen aus einem nicht-menschlichen Tier gewonnenen Antikörper gentechnisch in einen humanisierten Antikörper wie einen menschlichen chimären Antikörper oder einen Antikörper umzuwandeln, der durch Verpfanzung einer menschlichen Komplementarität bestimmenden Region (nachstehend als „CDR" bezeichnet) erzeugt wurde. Der menschliche chimäre Antikörper ist ein Antikörper, dessen variable Antikörper-Region (nachstehend als „V"-Region bezeichnet) aus dem Antikörper eines nicht-menschlichen Tieres stammt und dessen konstante Region (nachstehend als „C"-Region bezeichnet) aus einem menschlichen Antikörper stammt (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81, 6851 (1984)). Der menschliche, durch CDR-grafting erzeugte Antikörper ist ein Antikörper, bei dem die CDR-Aminosäuresequenz in der V-Region aus einem nicht-menschlichen tierischen Antikörper in eine geeignete Position eines menschlichen Antikörpers verpflanzt wird (Nature 321, 522, (1986)). Diese humanisierten Antikörper weisen im Vergleich zu Antikörpern nicht-menschlicher Tiere wie Maus-Antikörpern und ähnlichem verschiedene Vorteile bei der klinischen Verabreichung an Menschen auf. Beispielsweise ist über die Immunogenität und Stabilität im Blut berichtet worden, dass die Halbwertszeit eines menschlichen chimären Antikörpers bei Verabreichung an einen Menschen im Vergleich zu der eines Maus-Antikörpers etwa sechsfach erhöht ist (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 4220 (1989)). Über einen Test mit einem menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper in Affen ist berichtet worden, dass dessen Immunogenität vermindert und seine Halbwertszeit im Blut im Vergleich zu der eines Maus-Antikörpers vier- bis fünffach erhöht ist (J. Immunol. 147, 1352 (1991)). Man erwartet also, dass humanisierte Antikörper weniger Nebenwirkungen aufweisen und ihre therapeutischen Wirkungen im Vergleich zu Antikörpern nicht-menschlicher Tiere länger anhalten. Wenn Anwendungen insbesondere als anti-Tumor-Antikörper in Betracht gezogen werden, sind zusätzlich höhere zytotoxische Aktivitäten wie Komplement-abhängige Zytotoxizität (nachfolgend als „CDC" bezeichnet), Antikörper-abhängige Zell-vermittelte zytotoxische Aktivität (nachfolgend als „ADCC" bezeichnet) und andere, vermittels einer Antikörper-Fc-Region (Region in und hinter der Gelenk-Region einer schweren Kette eines Antikörpers) bewirkte Aktivitäten für die therapeutischen Wirkungen wichtig. Es ist über solche zytotoxischen Aktivitäten berichtet worden, dass die Fc-Region menschlicher Antikörper der Fc-Region nicht-menschlicher Antikörper im Menschen überlegen ist, da die Fc-Region die menschlichen Komplementbestandteile und menschliche Effektorzellen wirksamer aktivieren, die Fc-Rezeptoren von einkernigen Zellen, Makrophagen und NK-Zellen auf der Zelloberfläche aufweisen. Beispielsweise ist mitgeteilt worden, dass bei Umwandlung eines Maus-Antikörpers gegen GD3 (nachfolgend als „anti-GD3-Maus-Antikörper" bezeichnet) in einen menschlichen chimären Antikörper mit einer menschlichen Fc-Antikörperregion (nachfolgend als „chimärer anti-GD3-Antikörper" bezeichnet) seine inhibierende Wirkung auf Tumorzellwachstum durch menschliche Effektorzellen erhöht ist (J. Immunol. 144, 1382 (1990)). Ähnliche Ergebnisse sind für einen menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper gegen das CAMPATH-1 Antigen berichtet worden (Nature 332, 323 (1988)).
  • Diese Ergebnisse zeigen klar, dass humanisierte Antikörper nicht-menschlichen Antikörpern wie Maus-Antikörpern und ähnlichem für klinische Anwendungen im Menschen vorzuziehen sind.
  • Darüber hinaus können im Zuge der kürzlich erzielten Fortschritte in der Proteinmanipulation und der Genmanipulation Antikörperfragmente mit einem kleineren Molekulargewicht wie Fab, Fab', F(ab')2, einzelkettige Antikörper (Science 242, 423 (1988)), über Disulfidbrücken stabilisierte V-Region-Fragmente (Molecular Immunol. 32, 249 (1995)) und ähnliches hergestellt werden. Da diese Fragmente ein kleineres Molekulargewicht als vollständige Antikörpermoleküle aufweisen, können sie sehr gut in Zielgewebe eindringen (Cancer Res. 52, 3402 (1992)).
  • Man glaubt, dass diese von humanisierten Antikörpern abgeleiteten Fragmente wünschenswerter als die von nicht-menschlichen, tierischen Antikörpern wie Maus-Antikörpern abgeleiteten Fragmente in klinischen Anwendungen beim Menschen sind.
  • Gangliosid ist eine Glykolipid enthaltende Sialinsäure, Bestandteil der tierischen Zellmembran und hat eine Zuckerkette als eine hydrophile Seitenkette und ein Sphingosin und Fettsäure als hydrophobe Seitenketten als Bestandteile. Man weiß, dass die Arten und Expressionshöhen von Gangliosid von der Art der Zelle, der Organspezies, der Tierart und ähnlichem abhängen. Man weiß ferner, dass sich die Expression von Gangliosid quantitativ und qualitativ im Prozess der malignen Transformation von Zellen ändert (Cancer Res. 45, 2405 (1985)). Insbesondere ist das in Beziehung zur Erfindung stehende GD3 in normalen Zellen nur in äußerst geringen Mengen zu finden, in Krebszellen wie Melanomen, Sarkomen, Gliomen, Neuroblastomen und ähnlichem jedoch in großen Mengen (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 6114 (1980); J. Exp. Med. 155, 1133 (1982); Cancer Res. 45, 4401 (1985)) und man glaubt, dass ein Antikörper gegen GD3 (nachstehend als "anti-GD3-Antikörper" bezeichnet) für die Behandlung dieser Krebsarten nützlich ist (Melanoms Research 7, S115 (1997)). Testverabreichungen bei Melanompatienten sind mit R24 als anti-GD3-Maus-Antikörper bereits durchgeführt worden. Bei einem Teil der Patienten wurde zwar ein klinischer Effekt beobachtet, aber nicht in dem erwarteten Ausmaß, was auf das ziemlich rasche Verschwinden des Antikörpers aus dem Blut durch HAMA zurückzuführen ist (Melanoms Research 7, S115 (1997)). Unter diesen Umständen und um wirksamere klinische Anwendungen eines anti-GD3-Antikörpers im Menschen zu erreichen, haben die hier genannten Erfinder versucht, einen chimären anti-GD3-Antikörper mit einer ähnlichen Aktivität wie der von den Erfindern produzierte anti-GD3-Maus-Antikörper KM641 herzustellen. Sie waren dabei mit der Herstellung des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 erfolgreich (veröffentlichte, nicht geprüfte japanische Patentanmeldung 304989/93 ). Es ist davon auszugehen, dass die Immunogenität des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 im Vergleich zum anti-GD3-Maus-Antikörper im Menschen verringert ist, dass die Halbwertszeit im Blut erhöht ist und er eine stärkere anti-Tumorwirkung aufweist. Es ist jedoch als Ergebnis klinischer Studien mit anderen chimären anti-GD3-Antikörpern in Menschen gefunden worden, dass wegen der Induktion eines menschlichen Antikörpers gegen eine V-Region aus einem Maus-Antikörper in dem chimären anti-GD3-Antikörper allergische Reaktionen hervorgerufen werden (Cancer J. From Scientific American 3, S121 (1997)). Sogar bei dem von den Erfindern hergestellten chimären anti-GD3-Antikörper KM871 ist es nötig, die Ergebnisse aus klinischen Versuchen in Menschen abzuwarten, um zu wissen, ob ähnliche Reaktionen induziert werden oder nicht, und um die Möglichkeit des Auftretens eines derartigen Problems so niedrig wie möglich zu halten, ist es wünschenswert, einen menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper gegen GD3 herzustellen (nachfolgend als „durch CDR-grafting erzeugter anti-GD3-Antikörper" bezeichnet). Bei diesem glaubt man, dass er eine niedrigere Immunogenität als die chimären anti-GD3-Antikörper im Menschen hat. Bis heute gibt es jedoch keinen Bericht über die Herstellung eines durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers gegen GD3.
  • Hinsichtlich Antikörperfragmenten wurde ein einzelkettiger Antikörper hergestellt, der aus einem anti-GD2-Maus-Antikörper abgeleitet war (Hybridoma 16, 335 (1997)), es gibt jedoch keinen Bericht über die Herstellung anderer Antikörperfragmente. Betreffs Antikörperfragmenten aus einem anti-GD3-Antikörper gibt es keine Berichte über die Herstellung von Antikörperfragmenten, die aus einem Maus-Antikörper und einem humanisierten Antikörper abgeleitet sind. Sofern ein aus einem humanisierten Antikörper gegen CD3 (nachfolgend als „humanisierter anti-GD3-Antikörper" bezeichnet) abgeleitetes Antikörperfragment hergestellt werden kann, wird erwartet, dass es eine exzellente Fähigkeit zum Eindringen in Zielgewebe aufweist und dass die Immungenität vermindert ist.
  • Wie vorstehend beschrieben wird erwartet, dass ein humanisierter Antikörper und das Antikörperfragment einzeln einen Effekt bei diagnostischen und therapeutischen Verfahren zeigen. Die weitere Verbesserung der Wirkungen ist jedoch durch Verwendung in Kombination mit anderen Molekülen untersucht worden. Zykokin ist beispielsweise als eines dieser Moleküle eingesetzt worden. Zytokin ist ein allgemeiner Begriff für verschiedene wasserlösliche Faktoren, die gegenseitige interzelluläre Reaktionen in immunologischen Interaktionen kontrollieren. Die zytotoxischen Aktivitäten von Antikörpern wie CDC-Aktivität, ADCC-Aktivität und ähnliche sind bekannt und die ADCC-Aktivität wird durch Effektorzellen mit Fc-Rezeptoren auf der Zelloberfläche bewirkt, wie einkernigen Zellen, Makrophagen, NK-Zellen und ähnlichen (J. Immunol. 138, 1992 (1987)). Da verschiedene Arten von Zytokinen diese Effektorzellen aktivieren, hat man sie in Kombination mit Antikörpern verabreicht, um die ADCC-Aktivität und ähnliche Aktivitäten von Antikörpern zu erhöhen. Beispielsweise ist ein anti-GD2-Maus-Antikörper 14.G2a und ein chimärer anti-GD2-Antikörper ch14.18 Menschen in Kombination mit dem Zytokin menschliches Interleukin-2 (nachstehend als „hIL-2" bezeichnet) oder mit menschlichem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (nachstehend als „hGM-CSF" bezeichnet) verabreicht worden (Cancer 80, 317 (1997); Cancer J. From Scientific American 3, S121 (1997)). Ferner ist mit einem anti-GD3-Maus-Antikörper R24 eine Kombinationstherapie mit verschiedenen Arten von Zytokinen durchgeführt worden (Cancer Res. 50, 7490 (1990), Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1186, 345 (1992), J. Biol. Response Mod. 9, 319 (1990), Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1182, 344 (1992), Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1188, 346 (1992). Die Kombinationstherapien zeigen jedoch nicht die erwarteten Wirkungen, was auf die Immunogenität der Maus-Antikörper oder vom Zytokin herrührende Nebenwirkungen zurückzuführen ist. Daher hat man Derivate durch Konjugation eines Antikörpers oder des Antikörperfragmentes davon mit einem Radioisotop, einem Protein (Zytokin, Toxin, Enzym oder ähnlichem), einem niedermolekularen Wirkstoff und ähnlichem chemisch oder gentechnisch hergestellt und deren klinische Anwendungen untersucht (New Eng. J. Med. 329, 459 (1993), Anticancer Res. 17, 1735 (1997), Blond 78, 1173 (1991), J. Clin. Oncol. 15, 723 (1997), Bioconjugate Chem. 7, 606, (1997), Cancer 61, 881 (1988), Jpn. J. Cancer Res. 85, 167 (1994), Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 3, 60 (1990), Surgery 106, 533 (1989)). Man glaubt, dass diese Derivate ein Radioisotop, ein Protein (Zytokin, Toxin, Enzym oder ähnliches), einen niedermolekularen Wirkstoff und ähnliches in der Peripherie eines Zielgewebes entsprechend der Bindungsspezifität der Antikörper anreichern können, wodurch man wirksamere Diagnosen und Behandlungen mit weniger Nebenwirkungen erhalten kann. Mit hIL-2 beispielsweise, das unter den für die Kombinationstherapie ausgewählten Zytokinen einen gewissen Grad an anti-Tumor-Wirkung aufweist, hat man gentechnisch ein Fusionsprotein mit dem chimären anti-GD2-Antikörper ch14.18 hergestellt und gezeigt, dass dessen anti-Tumor-Wirkungen in Versuchen mit Mäusen gegenüber den Wirkungen von simultan verabreichtem chimären anti-GD2-Antikörper ch14.18 und hIL-2 überlegen waren (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1428 (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 9626 (1994), Cancer Immunol. Immunother. 42, 88 (1996), Blond 91, 1706 (1998)). Für einen anti-GD3-Antikörper gibt es jedoch keine Berichte über die Herstellung von Derivaten durch Konjugation mit einem Protein (Zytokin, Toxin, Enzym oder ähnlichem), einem Radioisotop, einem niedermolekularen Wirkstoff und ähnlichem. Daher kann auch für den humanisierten anti-GD3-Antikörper und das Antikörperfragment gemäß der Erfindung die Reduktion der Immunogenität, die Verminderung von Nebenwirkungen und können erhöhte anti-Tumor-Wirkungen in dem Bereich des Tumors bei Verabreichung an den menschlichen Körper erwartet werden, wenn mit einem Radioisotop, einem Protein (Toxin, Enzym oder ähnlichem), einem niedermolekularen Wirkstoff und ähnlichem konjugierte Derivate hergestellt werden können, einschließlich Fusionsproteinen mit verschiedenen Arten von Zytokinen.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß wurde eine Aminosäuresequenz für jede CDR in den Aminosäuresequenzen von H-Kette und L-Kette V-Regionen des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641 (veröffentlichte, nicht geprüfte japanische Patentanmeldung 304989/93 ) ermittelt, cDNAs, welche die V-Regionen der H-Kette und der L-Kette codieren, die die Aminosäuresequenzen der CDRs von KM641 und die Aminosäuresequenzen der Framework-Regionen (nachstehend als „FR" bezeichnet) von V-Regionen der H-Kette und der L-Kette menschlicher Antikörper umfassen, wurden in einen für tierische Zellen geeigneten Expressionsvektor cloniert, der eine die C-Regionen der H-Kette und der L-Kette menschlicher Antikörper codierende cDNA enthält und anschließend wurde der so konstruierte Vektor zur Expression des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers in eine tierische Zelle eingeführt. Dadurch wurde die Transformante KM8871 (FERM BP-6790) hergestellt, die einen durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper in einem Kulturüberstand erzeugt. Anschließend wurde der durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper KM8871 aus einem Kulturüberstand der Transformante KM8871 aufgereinigt, wodurch gefunden wurde, dass der durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper KM8871 eine Antigen-Bindungsspezifität und eine starke zytotoxische Aktivität gegenüber menschlichen Krebszelllinien hat, die denjenigen des chimären anti-GD3-Antikörpers KM781 ähnlich sind.
  • Darüber hinaus wurde eine cDNA konstruiert, wobei eine andere, hIL-2 codierende cDNA mit dem 3'-Ende der cDNA verknüpft wurde, die die H-Kette des anti-GD3-Antikörpers codiert, insbesondere des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8871. Anschließend wurden die cDNA und eine die L-Kette von KM8871 codierende cDNA in einen Expressionsvektor für tierische Zellen cloniert, wodurch ein Expressionvektor für ein Fusionsprotein aus durch CDR-grafting erzeugtem anti-GD3-Antikörper KM8871 und hIL-2 konstruiert wurde (nachstehend als „KM8871-hIL-2" bezeichnet). Eine KM8871-hIL-2 im Kulturüberstand produzierende Transformante KM8871hIL2 (FERM BP-6791) wurde durch Einschleusen des KM8871-hIL-2-Expressionsvektors in eine tierische Zelle hergestellt. Ferner wurde KM8871-hIL-2 aus dem Kulturüberstand der Transformante KM8871-hIL-2 aufgereinigt, wodurch heraus gefunden wurde, dass KM8871-hIL-2 eine Antigen-Bindungsaktivität und eine Antigen-Bindungsspezifität zeigt, die der des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8871 ähnlich sind sowie eine Wachstum fördernde Aktivität gegenüber Zelllinien, die ein hIL-2-abhängiges Wachstum zeigen, ähnlich der Aktivität von hIL-2. Danach wurde die vorliegende Erfindung durch den Befund gemacht, dass die zytotoxische Aktivität von KM8871-hIL-2 im Vergleich zu der des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8871 verbessert ist, wenn diese unter Verwendung einer humanen einkernigen Zellfraktion aus peripherem Blut gemessen wird.
  • Die Erfindung betrifft die folgenden Gegenstände (1) bis (12).
    • (1) Menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper oder das Antikörperfragment davon, der/das spezifisch mit Gangliosid GD3 reagiert, wobei die V-Region der H-Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 9 umfasst; und die V-Region der L-Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 54 umfasst, und wobei das Antikörperfragment ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fab, Fab', F(ab')2, scFv und dsFv.
    • (2) Menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper oder das Antikörperfragment davon gemäß Ausführungsform (1), wobei der menschliche, durch CDR-grafting erzeugte Antikörper ferner umfasst: eine C-Region der H-Kette und eine C-Region der L-Kette eines menschlichen Antikörpers.
    • (3) Menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper oder das Antikörperfragment davon gemäß Ausführungsform (1) oder (2), wobei der menschliche, durch CDR-grafting erzeugte Antikörper hergestellt wird von einer Transformante KM8871 (FERM BP-6790).
    • (4) DNA, die den menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper oder das Antikörperfragment davon codiert, welches spezifisch mit Gangliosid GD3 reagiert, gemäß einer der Ausführungsformen (1) bis (3).
    • (5) Rekombinanten Vektor umfassend die DNA gemäß Ausführungsform (4).
    • (6) Transformante, die durch das Einführen des rekombinanten Vektors gemäß Ausführungsform (5) in eine Wirtszelle hergestellt wird.
    • (7) Transformante KM8871 (FERM BP-6790), die den menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper gemäß Ausführungsform (3) herstellt.
    • (8) Verfahren zum Herstellen eines Antikörpers, das umfasst: Züchten der Transformante gemäß Ausführungsform (6) oder (7) in einem Kulturmedium, um den menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper oder das Antikörperfragment davon gemäß einer der Ausführungsformen (1) bis (3) herzustellen und in der Kultur anzureichern; und Gewinnen des Antikörpers oder des Antikörperfragments davon aus der Kultur.
    • (9) Arzneimittel, umfassend den menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper oder das Antikörperfragment davon gemäß einer der Ausführungsformen (1) bis (3).
    • (10) Verwendung des menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers oder des Antikörperfragments davon gemäß einer der Ausführungsformen (1) bis (3) für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.
    • (11) Diagnostisches Mittel, welches als einen Wirkstoff den menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper oder das Antikörperfragment davon gemäß einer der Ausführungsformen (1) bis (3) umfasst.
    • (12) Verwendung des menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers oder des Antikörperfragments davon gemäß einer der Ausführungsformen (1) bis (3) für die Herstellung einer Diagnosemittels zur Diagnose von Krebs.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch den humanen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper, der spezifisch mit dem Gangliosid GD3 reagiert oder das vorstehend beschriebene Antikörperfragment, konjugierbar mit einem Radioisotop, einem Protein oder einem niedermolekularen Wirkstoff. Dieser Antikörper ist ein monoclonaler Antikörper.
  • Beispiele für einen monoclonalen Antikörper schließen einen von einem Hybridom produzierten Antikörper, einen humanisierten Antikörper, einen menschlichen Antikörper und ähnliche ein.
  • Ein Hybridom ist eine Zelle, die dadurch erhalten wird, dass man eine durch Immunisierung eines nicht-menschlichen Säugers mit einem Antigen erzeugte B-Zelle mit einer Myelomzelle fusioniert, die aus einer Maus oder einem ähnlichen Tier stammt und die einen gewünschten monoclonalen Antikörper mit einer Antigenspezifität produziert.
  • Beispiele für den humanisierten Antikörper schließen einen menschlichen chimären Antikörper, einen humanen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper und ähnliche Antikörper ein.
  • Ein menschlicher chimärer Antikörper ist ein Antikörper, der eine V-Region einer H-Kette (nachstehend als „HV" oder „VH" bezeichnet) und eine V-Region einer L-Kette (nachstehend als „LV" oder „VL" bezeichnet) eines von einem nicht-menschlichen Tier stammenden Antikörpers, eine C-Region einer H-Kette eines menschlichen Antikörpers (nachstehend als „CH" bezeichnet) und eine C-Region einer L-Kette eines menschlichen Antikörpers (nachstehend als „CL" bezeichnet), umfasst. Als nicht-menschliches Tier kann jedes Tier wie eine Maus, Ratte, ein Hamster, Kaninchen oder ein ähnliches Tier verwendet werden, sofern daraus ein Hybridom präpariert werden kann.
  • Ein menschlicher chimärer Antikörper kann hergestellt werden durch Erhalt von VH und VL codierenden cDNAs aus einem Hybridom, das einen monoclonalen Antikörper produziert, der spezifisch mit GD3 reagiert, Konstruktion eines Expressionsvektors für einen menschlichen chimären Antikörper, wobei die cDNAs in einen Expressionsvektor für tierische Zellen eingefügt werden, der CH und CL aus menschlichen Antikörpern codierende Gene aufweist und Expression des Expressionsvektors durch Einführen in eine tierische Zelle.
  • Die CH eines menschlichen chimären Antikörpers kann jede zu einem menschlichen Immunglobulin (nachfolgend als „hIg" bezeichnet) gehörende Region sein, diejenigen der hIgG-Klasse sind jedoch geeignet und jede zu den Unterklassen der hIgG-Klasse, wie hIgG1, hIgG2, hIgG3 und hIgG4 gehörende kann ebenfalls eingesetzt werden. Ferner kann die CL eines menschlichen chimären Antikörpers jede Region sein, die zu hIg gehört und diejenigen der κ-Klasse oder der λ-Klasse können verwendet werden.
  • Beispiele für einen chimären anti-GD3-Antikörper schließen KM871 ein, der in der veröffentlichten, nicht geprüften japanischen Patentanmeldung 304989/93 beschrieben ist.
  • Ein menschlicher, durch CDR-grafting erzeugter Antikörper ist ein Antikörper, in dem Aminosäuresequenzen von CDRs aus VH und VL, die aus einem nicht-menschlichen, tierischen Antikörper stammen, in geeignete Positionen von VH und VL eines menschlichen Antikörpers eingeführt werden.
  • Der erfindungsgemäße, durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper kann hergestellt werden durch Konstruktion von V-Regionen codierenden cDNAs, in denen die CDR-Sequenzen von VH und VL eines aus einem nicht-menschlichen Tier stammenden Antikörpers, der spezifisch mit GD3 reagiert, als CDR-Sequenzen in VH und VL eines gegebenenfalls menschlichen Antikörpers eingeführt werden, Konstruktion eines Expressionsvektors für einen menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper, wobei die V-Regionen in einen Expressionsvektor für tierische Zellen eingefügt werden, der CH und CL aus menschlichen Antikörpern codiert und Expression des menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers durch Einführen des Expressionsvektors in eine tierische Zelle.
  • Die CH eines menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers kann jede zu einem hIg gehörende Region sein, diejenigen der hIgG Klasse sind jedoch geeignet und jede zu den Unterklassen der hIgG Klasse, wie hIgG1, hIgG2, hIgG3 und hIgG4, gehörende kann ebenfalls eingesetzt werden. Ferner kann die CL des menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers jede Region sein, die zu hIg gehört und diejenigen der κ Klasse oder der λ Klasse können verwendet werden.
  • Der erfindungsgemäße, durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper schließt den Antikörper KM8871 ein, bei dem die VH des Antikörpers die durch SEQ ID Nr.: 9 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, bei dem die CH eine Aminosäuresequenz der menschlichen IgG1-Unterklasse umfasst, bei dem die VL des Antikörpers die durch SEQ ID Nr.: 54 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst und bei dem die CL eine Aminosäuresequenz einer menschlichen κ-Klasse umfasst.
  • Im ursprünglichen Sinne ist ein menschlicher Antikörper ein Antikörper, der natürlicherweise im menschlichen Körper vorkommt. Umfasst sind auch Antikörper, die aus einer Phagengenbank humaner Antikörper und aus menschliche Antikörper produzierenden transgenen Tieren erhalten werden, hergestellt auf der Basis kürzlich erzielter Fortschritte in den Techniken der Genmanipulation, Zellmanipulation und Manipulation im Entwicklungsbereich.
  • Was den im menschlichen Körper vorkommenden Antikörper anbetrifft, so kann ein diesen Antikörper produzierender Lymphozyt durch Isolierung eines Lymphozyten aus peripherem Blut und Infektion mit EB-Virus oder ähnlichem kultiviert werden, wodurch immortalisiert wird und woran sich eine Clonierung anschließt. Der Antikörper kann aus dem Kulturgemisch aufgereinigt werden.
  • Die Phagengenbank humaner Antikörper ist eine Genbank, bei der Antikörperfragmente wie Fab, scFv und ähnliche durch Einfügen eines aus einer menschlichen B-Zelle präparierten Antikörpergens in ein Phagengen auf der Phagenoberfläche exprimiert werden. Aus der Genbank kann ein Phage, der ein gewünschtes Antikörperfragment mit der Bindungsaktivität für ein Antigen aufweist, gewonnen werden, wobei seine Aktivität zur Bindung an ein Antigen-immobilisiertes Substrat als Markierung eingesetzt wird. Das Antikörperfragment kann gentechnisch weiter in ein menschliches Antikörpermolekül umgewandelt werden, das zwei vollständige H-Ketten und zwei vollständige L-Ketten aufweist.
  • Ein transgenes nicht-menschliches Tier, das einen menschlichen Antikörper produziert, ist ein Tier, bei dem ein menschliches Antikörpergen in die Zellen eingeführt ist. Insbesondere kann ein nicht-menschliches transgenes Tier, das einen menschlichen Antikörper herstellt, produziert werden, indem ein menschliches Antikörpergen in eine Maus ES-Zelle eingeführt wird, die ES-Zelle in ein im frühen Stadium befindliches Embryo einer anderen Maus transplantiert wird und dieses zur Entwicklung gebracht wird. Was das Herstellungsverfahren für den menschlichen Antikörper mit dem transgenen, den menschlichen Antikörper produzierenden Tier angeht, kann der menschliche Antikörper in einem Kulturgemisch hergestellt und angesammelt werden durch Erhalt eines menschlichen Antikörper produzierenden Hybridoms durch ein Hybridom-Herstellungsverfahren, das üblicherweise in nicht-menschlichen Säugern ausgeführt wird und nachfolgende Züchtung.
  • Erfindungsgemäße Antikörperfragmente schließen Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ein CDR enthaltendes Peptid und ähnliches ein.
  • Ein Fab ist ein Antikörperfragment mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000, das Antigenbindungsaktivität aufweist und bei dem etwa die Hälfte der N-terminalen Seite der H-Kette sowie die gesamte L-Kette, unter Fragmenten, die durch Behandlung von IgG mit einer Protease, Papain (spaltet an dem Aminosäurerest 224 der H-Kette) erhalten werden, über eine Disulfidbindung miteinander verknüpft sind.
  • Das erfindungsgemäße Fab kann durch Behandlung eines Antikörpers, der spezifisch mit GD3 reagiert, mit der Protease Papain erhalten werden. Ferner kann das Fab hergestellt werden durch Einfügen der das Fab des Antikörpers codierenden DNA in einen Expressionsvektor für Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für Eukaryonten und Einführen des Vektors in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten, wodurch das Fab exprimiert wird.
  • Ein F(ab')2 ist ein Antikörperfragment mit einem Molekulargewicht von etwa 100.000, das Antigenbindungsaktivität aufweist, etwas größer als das Fab ist und über eine Disulfidbrücke der Gelenk-Region verbunden ist und ist unter Fragmenten, die durch Behandlung von IgG mit einer Protease, Pepsin (spaltet an dem Aminosäurerest 234 der H-Kette) erhalten werden.
  • Das erfindungsgemäße F(ab')2 kann durch Behandlung eines Antikörpers, der spezifisch mit GD3 reagiert, mit der Protease Pepsin erhalten werden. Ferner kann das F(ab')2 hergestellt werden durch Bindung der nachstehend beschriebenen Fab' durch eine Thioetherbindung oder eine Disulfidbindung.
  • Ein Fab' ist ein Antikörperfragment mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000 und Antigenbindungsaktivität, das durch Spaltung der Disulfidbrücke der Gelenk-Region des F(ab')2 erhalten wird.
  • Das erfindungsgemäße Fab' kann durch Behandlung von F(ab')2, das spezifisch mit GD3 reagiert, mit einem Reduktionsmittel, Dithiothreit, erhalten werden. Ferner kann das Fab' hergestellt werden durch Einfügen der das Fab'-Fragment des Antikörpers codierenden DNA in einen Expressionsvektor für Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für Eukaryonten und Einführen des Vektors in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten, wodurch das Fab' exprimiert wird.
  • Ein scFv ist eine VH-P-VL oder VL-P-VH Polypeptid, bei dem eine VH-Kette und eine VL-Kette über einen geeigneten Peptidlinker (nachfolgend als „P" bezeichnet) verknüpft sind. Die in dem erfindungsgemäß eingesetzten scFv verwendeten VH und VL können aus jedem Antikörper stammen, der von einem Hybridom produziert wird oder aber aus jedem humanisierten Antikörper oder jedem menschlichen Antikörper.
  • Das erfindungsgemäße scFv kann hergestellt werden durch Erhalt von die VH und VL eines Antikörpers codierenden cDNAs, der spezifisch mit GD3 reagiert, Konstruktion der das scFv codierenden DNA, Einfügen der DNA in einen Expressionsvektor für Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für Eukaryonten und nachfolgendes Einführen des Expressionsvektors in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten, wodurch das scFv exprimiert wird.
  • Ein dsFv wird durch Bindung von Polypeptiden, bei denen ein Aminosäurerest sowohl von VH als auch von VL gegen einen Cysteinrest ausgetauscht ist, über eine Disulfidbindung zwischen den Cysteinresten erhalten. Der gegen einen Cysteinrest auszutauschende Aminosäurerest kann auf der Grundlage der Einschätzung der dreidimensionalen Struktur des Antikörpers ausgewählt werden, wie im Verfahren von Reiter et al. beschrieben (Protein Engineering 7, 697 (1994)). Die in dem erfindungsgemäßen dsFv verwendeten VH und VL können aus jedem Antikörper stammen, der von einem Hybridom produziert wird oder aber aus jedem humanisierten Antikörper oder jedem menschlichen Antikörper.
  • Das erfindungsgemäße dsFv kann hergestellt werden durch Erhalt von die VH und VL eines Antikörpers codierenden cDNAs, der spezifisch mit GD3 reagieren kann, Konstruktion der das dsFv codierenden DNA, Einfügen der DNA in einen Expressionsvektor für Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für Eukaryonten und nachfolgendes Einführen des Expressionsvektors in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten, wodurch das dsFv exprimiert wird.
  • Ein CDR umfassendes Peptid besteht aus mindestens einer Region von H-Kette und L-Kette CDRs. Mehrere CDRs können direkt oder über ein geeignetes Linkerpeptid miteinander verbunden sein.
  • Das erfindungsgemäße CDR umfassende Peptid kann hergestellt werden durch Erhalt von die VH und VL eines Antikörpers codierenden cDNAs, der spezifisch mit GD3 reagieren kann, Einfügen der cDNA in einen Expressionsvektor für Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für Eukaryonten und nachfolgendes Einführen des Expressionsvektors in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten, wodurch das CDR umfassende Peptid exprimiert wird.
  • Das CDR umfassende Peptid kann ferner durch ein chemisches Syntheseverfahren wie das Fmoc-Verfahren (Fluorenylmethoxycarbonylverfahren) oder das tBoc-Verfahren (t-Butyloxycarbonylverfahren) hergestellt werden.
  • Ein Derivat des erfindungsgemäßen Antikörpers kann hergestellt werden durch chemische Konjugation eines Radioisotopen, eines Proteins, eines niedermolekularen Wirkstoffes oder ähnlichem an die N-terminale Seite oder die C-terminale Seite der H-Kette oder der L-Kette des spezifisch mit GD3 reagierenden Antikörpers oder Antikörperfragments, an einen geeigneten Substituenten oder eine geeignete Seitenkette des Antikörpers oder Antikörperfragments oder an eine Zuckerkette des Antikörpers oder Antikörperfragments (Antibody Engineering Handbook, herausgegeben von Osamu Kanemitsu, publiziert von Chijin Shokan (1994)).
  • Ferner können die Antikörperderivate gentechnisch hergestellt werden, wobei eine DNA, die einen Antikörper oder das Antikörperfragment codiert, der/das spezifisch mit GD3 reagiert, mit einer anderen DNA verknüpft wird, die ein zu bindendes Protein codiert, die DNA in einen Expressionsvektor eingeführt wird und der Expressionsvektor in eine Wirtszelle eingebracht wird.
  • Beispiele für Isotope schließen 131I, 125I und ähnliche ein. Diese können beispielsweise mit dem Chloramin T-Verfahren mit einem Antikörper verknüpft werden.
  • Beispiele für niedermolekulare Substanzen schließen ein anti-Krebs-Wirkstoffe wie alkylierende Wirkstoffe (z. B. Stickstoff-Lostverbindung („nitrogen mustard"), Cyclophosphamid etc.), metabolische Antagonisten (z. B. 5-Fluoruracil, Methotrexat etc.) Antibiotika (z. B. Daunomycin, Bleomycin, Mitomycin C, Daunorubicin, Doxorubicin etc.) Pflanzenalkaloide (z. B. Vincristin, Vinblastin, Vindesin etc.) hormonelle Wirkstoffe (z. B. Tamoxifen, Dexamethason etc.) und ähnliches (Clinical Oncology, herausgegeben von der Japanischen Gesellschaft für klinische Onkologie, veröffentlicht von Cancer and Chemotherapy (1996)); anti-inflammatorische Wirkstoffe wie steroide Wirkstoffe (z. B. Hydrocortison, Prednison etc.); nicht-steroide Wirkstoffe (z. B. Aspirin, Indometacin etc.) Immunmodulatoren (z. B. Aurothiomalat, Penicillamin etc.) immunsupprimierende Wirkstoffe, z. B. Cyclophosphamid, Azathioprin etc.) Antihistaminika (z. B. Chlorpheniraminmaleat, Clestamin etc.) und ähnliches (Inflammation and Anti-inflammatory Therapy, Ishiyaku Shuppan (1982)), etc. Beispiele eines Verfahrens zur Konjugation von Daunomycin mit einem Antikörper schließen ein Verfahren ein, bei dem Daunomycin und eine Aminogruppe eines Antikörpers über Glutaraldehyd konjugiert werden, ferner ein Verfahren, bei dem eine Aminogruppe von Daunomycin und eine Carboxylgruppe eines Antikörpers vermittels eines wasserlöslichen Carbodiimid verknüpft werden und ähnliche Verfahren.
  • Was das Protein betrifft, so ist ein Zytokin bevorzugt, das immunkompetente Zellen aktiviert. Beispiele schließen hIL-2, hGM-CSF, menschlichen Makrophagen Kolonie-stimulierenden Faktor (nachstehend als hM-CSF" bezeichnet), menschliches Interleukin-12 (nachstehend als hIL-12” bezeichnet) und ähnliches ein. Damit ferner die Krebszellen direkt geschädigt werden, können Toxine wie Ricin, Diphterietoxin und ähnliches verwendet werden. Beispielsweise kann eine Fusion aus Antikörper und Protein hergestellt werden, wobei eine einen Antikörper oder das Antikörperfragment codierende cDNA mit einer anderen, das Protein codierenden cDNA verknüpft wird, eine den Fusionsantikörper codierende DNA konstruiert wird, die cDNA in einen Expressionsvektor für Prokaryonten oder einen Expressionsvektor für Eukaryonten eingeführt wird und nachfolgend der Expressionsvektor in einen Prokaryonten oder einen Eukaryonten eingeschleust wird, wodurch der Fusionsantikörper exprimiert wird.
  • Beispiele für das Fusionsprotein aus menschlichem anti-GD3-Antikörper und Zytokin schließen ein Fusionsprotein des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8871 mit hIL-2 sowie ein Fusionsprotein des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 mit hIL-2 ein. Beispiele für das Fusionsprotein aus durch CDR-grafting erzeugtem anti-GD3-Antikörper KM8871 mit hIL-2 schließen KM8871-hIL-2 ein, bei dem die V-Region der H-Kette des mit hIL-2 konjugierten Antikörpers die in der SEQ ID Nr.: 53 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist, bei dem die V-Region der L-Kette des Antikörpers die in der SEQ ID Nr.: 54 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist und bei dem die C-Region der L-Kette eine Aminosäuresequenz der κ-Klasse menschlicher Antikörper hat. Beispiele für das Fusionsprotein aus chimärem anti-GD3-Antikörper KM871 mit hIL-2 schließen KM871-hIL-2 ein, bei dem die V-Region der H-Kette des mit hIL-2 konjugierten Antikörpers die in der SEQ ID Nr.: 57 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist, bei dem die V-Region der L-Kette des Antikörpers die in der SEQ ID Nr.: 56 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist und bei dem die C-Region der L-Kette eine Aminosäuresequenz der κ-Klasse menschlicher Antikörper hat.
  • Die Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Antikörpers, der spezifisch mit GD3 reagiert und von Derivaten eines Antikörpers oder des Antikörperfragments, die spezifisch mit GD3 reagieren, sind nachfolgend dargestellt.
  • 1. Herstellung eines humanisierten Antikörpers
  • (1) Konstruktion eines Expressionsvektors für einen humanisierten Antikörper
  • Der Expressionsvektor für einen humanisierten Antikörper ist ein für tierische Zellen geeigneter Expressionsvektor, in den die CH und CL eines menschlichen Antikörpers codierenden Gene eingefügt sind. Er kann durch Clonierung der CH und CL eines menschlichen Antikörpers codierenden Gene in einen Expressionsvektor für tierische Zellen hergestellt werden. Die C-Regionen eines menschlichen Antikörpers können jede CH und CL menschlicher Antikörper sein. Beispiele schließen die zur IgG1- Subklasse einer H-Kette eines menschlichen Antikörpers gehörende C-Region (nachstehend als „hCγ1" bezeichnet) und eine zur κ-Subklasse einer L-Kette eines menschlichen Antikörpers gehörende C-Region (nachstehend als „hCκ" bezeichnet) ein. Eine ein Exon und ein Intron umfassende chromosomale DNA kann als das CH und CL eines menschlichen Antikörpers codierende Gen verwendet werden. Gleichermaßen kann cDNA eingesetzt werden. Jeder Expressionsvektor für tierische Zellen kann verwendet werden, solange wie ein die C-Region eines menschlichen Antikörpers codierendes Gen eingeführt und exprimiert werden kann. Beispiele schließen pAGE107 (Cytotechnology 3, 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem. 101, 1307 (1987)), pHSG274 (Gene 27, 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 1527 (1981)), pSG1βd2-4 (Cytotechnology 4, 173 (1990)) und ähnliche Vektoren ein. Beispiele für den im Expressionsvektor für tierische Zellen eingesetzten Promotor und Enhancer schließen den frühen Promotor und Enhancer von SV40 (J. Biochem. 101, 1307 (1987)), den LTR Promotor und Enhancer von Moloney-Maus-Leukämievirus (Biochem. Biophys. Res. Comm. 149, 960 (1987)), den Promotor (Cell 41, 479 (1985)) und Enhancer (Cell 33, 717 (1983)) von Immunglobulin H-Ketten und ähnliches ein.
  • Der Expressionsvektor für humanisierte Antikörper kann entweder von der Art sein, dass ein die H-Kette des Antikörpers codierendes Gen und ein die L-Kette des Antikörpers codierendes Gen auf verschiedenen Vektoren sitzen oder von der Art, dass beide Gene auf demselben Vektor sitzen (Tandem-Typ). Was die Leichtigkeit der Konstruktion des Expressionsvektors für humanisierte Antikörper angeht, ferner die Leichtigkeit, mit der er in tierische Zellen eingeführt werden kann und das Gleichgewicht der Expressionshöhen zwischen H- und L-Ketten des Antikörpers in tierischen Zellen, wird ein Tandem-Typ des Expressionsvektors für humanisierte Antikörper stärker bevorzugt (J. Immunol. Methods 167, 271 (1994)). Beispiele für den Tandem-Typ des Expressionsvektors für humanisierte Antikörper schließen pKANTEX 93 ( WO97/10354 ), pEE18 (Hybridoma 17, 559 (1998)) und ähnliche ein. Der so konstruierte Expressionsvektor für humanisierte Antikörper kann zur Expression des menschlichen chimären Antikörpers und des menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers in tierischen Zellen verwendet werden.
  • (2) Herstellung von die V-Region eines aus einem nicht-menschlichen Tier stammenden Antikörpers codierender cDNA
  • cDNAs, die VH und VL eines Antikörpers codieren, der aus einem nicht-menschlichen Tier wie einer Maus stammt, werden wie folgt erhalten.
  • Aus den Maus-Antikörper oder ähnliches produzierenden Hybridomzellen wird mRNA zur Synthese von cDNA extrahiert. Die synthetisierte cDNA wird in einen Vektor, z. B. einen Phagen, ein Plasmid oder einen ähnlichen Vektor eingefügt, um eine cDNA-Genbank herzustellen. Jeweils ein rekombinanter Phage oder jedes rekombinante Plasmid enthaltend cDNA, die VH codiert und ein rekombinanter Phage oder ein rekombinantes Plasmid enthaltend cDNA, die VL codiert, wird aus der Genbank isoliert, wobei ein Teil einer C-Region oder ein Teil einer V-Region eines Maus-Antikörpers als DNA-Sonde eingesetzt wird. Die vollständigen Nucleotidsequenzen von VH und VL des interessierenden Maus-Antikörpers auf dem rekombinanten Phagen oder dem rekombinanten Plasmid werden ermittelt und die vollständigen Aminosäuresequenzen von VH und VL werden von den Nucleotidsequenzen abgeleitet.
  • Das nicht-menschliche Tier kann jedes Tier sein, wie eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Kaninchen oder dergleichen, so lange man damit Hybridomzellen herstellen kann. Beispiele für Verfahren, mit denen man Gesamt-RNA aus einer Hybridomzelle präparieren kann, schließen das Verfahren mit Guanidinthiocyanat-Cäsiumtrifluoracetat (Methods in Enzymol. 154, 3 (1987) und ähnliche Verfahren ein. Weiter schließen Beispiele für die Herstellung von mRNA aus Gesamt-RNA Verfahren unter Verwendung einer Zellulose-Säule, an die oligo(dT) immobilisiert wurde (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989), nachfolgend als "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" bezeichnet) und ähnliche Verfahren ein.
  • Ferner schließen Beispiele für einen Kit für die Präparation von mRNA aus einer Hybridomzelle den „Fast Track mRNA Isolation Kit" (hergestellt von Invitrogen) und den „Quick Prep mRNA Purification Kit" (hergestellt von Pharmacia) und ähnliche Kits ein.
  • Beispiele für Verfahren zur Synthese von cDNA und zur Herstellung einer cDNA-Genbank schließen bekannte Verfahren (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1–34), ein Verfahren unter Verwendung eines käuflich erwerbbaren Kits wie „Super Script® Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning" (hergestellt von GIBCO BRL), oder von ZAP-cDNA Kit ((hergestellt von Stratagene) usw. ein.
  • Der Vektor, in den die cDNA, welche unter Verwendung aus einer Hybridomzelle extrahierter mRNA als Matrize synthetisiert wurde, zur Herstellung einer cDNA-Genbank eingeführt wird kann jedweder Vektor sein, solange die cDNA darin eingefügt werden kann. Beispiele schließen ZAP Express (Strategies 5, 58 (1992)), pBluescript II SK(+) (Nucleic Acids Research 17, 9494 (1989)), λzapII ((hergestellt von Stratagene), λgt10 und λgt11 (DNA Cloning: A Practical Approach 1, 49 (1985)), Lambda BlueMid (hergestellt von Clontech), λExCell und pT7T3 18U ((hergestellt von Pharmacia), pcD2 (Mol. Cell. Biol. 3, 280 (1983)), pUC18 (Gene 33, 103 (1985)) und ähnliche Vektoren ein.
  • Zur Einschleusung der mit Hilfe eines Phagen- oder Plasmidvektors konstruierten cDNA-Genbank kann jeder E. coli eingesetzt werden, so lange die cDNA-Genbank eingeschleust, exprimiert und beibehalten werden kann. Beispiele schließen XL1-Blue MRF' (Strategies 5, 81 (1992)), C600 (Genetics 39, 440 (1954)), Y1088 und Y1090 (Science 222, 778 (1983)), NM552 (J. Mol. Biol. 166, 1 (1983)), K802 (J. Mol. Biol. 16, 118 (1966)), JM105 (Gene 38, 275 (1985)) und dergleichen ein.
  • Zur Selektion von cDNA-Clonen, die VH und VL eines aus einem nicht-menschlichen Tier stammenden Antikörpers codieren, aus der cDNA-Genbank kann ein Kolonie-Hybridisierungsverfahren oder ein Plaque-Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden, bei dem eine Isotopen- oder Fluoreszenz-markierte Sonde verwendet werden kann (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)). Ferner können die VH und VL codierenden cDNAs mit der Polymerase-Kettenreaktion (nachfolgend als „PCR" bezeichnet; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Current Protocols in Molecular Biology) durch Herstellung von Primern und unter Verwendung von aus mRNA hergestellter cDNA oder einer cDNA-Genbank als Matrize hergestellt werden.
  • Die Nucleotidsequenz der cDNA kann bestimmt werden durch Spaltung der durch die mit dem vorstehenden Verfahren selektierten cDNA mit geeigneten Restriktionsenzymen oder ähnlichem, Clonierung der Fragmente in ein Plasmid wie Bluescript SK(–) (hergestellt von Stratagene) oder ein ähnliches Plasmid, Umsetzung der Reaktion durch ein üblicherweise zur Analyse der Nucleotide verwendetes Verfahren wie das Dideoxy-Verfahren nach Sanger, F. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463 (1977)) oder ein ähnliches Verfahren und anschließende Analyse der Sequenz mit einem automatischen Nukleotidsequenz-Analysegerät wie dem A. L. F. DNA-Sequenziergerät (hergestellt durch Pharmacia) oder einem ähnlichen Gerät.
  • Ob die erhaltenen cDNAs die vollständigen Aminosäuresequenzen der VH und VL des Antikörpers codieren, der eine sekretorische Signalsequenz enthält, kann durch Abschätzung der vollständigen Aminosäuresequenzen der VH und VL aus der ermittelten Nucloetidsequenz und Vergleich mit vollständigen Aminosäuresequenzen der VH und VL bekannter Antikörper bestätigt werden (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991), nachstehend bezeichnet als „Sequences of Proteins of Immunological Interest").
  • (3) Analyse der Aminosäuresequenz der aus einem nicht-menschlichen Tier stammenden V-Region
  • Hinsichtlich der vollständigen Aminosäuresequenzen der VH und VL des Antikörpers, der eine sekretorische Signalsequenz enthält, können die Länge der sekretorischen Signalsequenz und der N-terminalen Aminosäuresequenzen durch Vergleich mit vollständigen Aminosäuresequenzen der VH und VL bekannter Antikörper abgeleitet werden (Sequences of Proteins of Immunological Interest) und die Untergruppen, zu der sie gehören, können ebenfalls bestimmt werden. Was die Aminosäuresequenz von jeder CDR der VH und VL angeht, so können diese durch Vergleich mit Aminosäuresequenzen der VH und VL bekannter Antikörper abgeleitet werden (Sequences of Proteins of Immunological Interest).
  • (4) Konstruktion eines Expressionsvektors für einen menschlichen chimären Antikörper
  • Ein Expressionsvektor für einen menschlichen chimären Antikörper kann durch Clonierung von VH und VL codierender cDNAs eines Antikörpers, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt, in den Bereich stromaufwärts der CH und CL des menschlichen Antikörpers codierenden Gene, in dem Expressionsvektor für einen humanisierten Antikörper, wie vorstehend in Abschnitt 1(1) beschrieben, konstruiert werden. Beispielsweise wird jede der VH und VL codierenden cDNAs eines Antikörpers, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt, mit synthetisch hergestellter DNA verknüpft, die Nucleotidsequenzen an den 3'-Enden der VH und VL eines Antikörpers, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt, sowie Nucleotidsequenzen an den 5'-Enden von CH und CL eines menschlichen Antikörpers umfasst und eine Erkennungssequenz für ein geeignetes Restriktionsenzym an beiden Enden aufweist. Jede cDNA wird so cloniert, dass sie in geeigneter Weise stromaufwärts von den CH und CL codierenden Genen im Expressionsvektor für einen humanisierten Antikörper exprimiert wird, wie in Abschnitt 1(1) beschrieben, wodurch ein Expressionsvektor für einen menschlichen chimären Antikörper konstruiert wird.
  • (5) Konstruktion einer cDNA, die die V-Region eines menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers codiert.
  • cDNAs, die VH und VL eines menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers codieren, können wie folgt gewonnen werden. Zunächst werden Aminosäuresequenzen von FRs in den VH und VL eines menschlichen Antikörpers ausgewählt, in die Aminosäuresequenzen von CDRs in VH und VL eines Antikörpers, der von einem Antikörper eines nicht-menschlichen Tieres stammt, eingefügt werden. Alle Aminosäuresequenzen von FRs in VH und VL eines menschlichen Antikörpers können eingesetzt werden, so lange sie vom Menschen stammen. Beispiele schließen Aminosäuresequenzen von FRs in VH und VL eines menschlichen Antikörpers ein, die in Datenbanken wie Protein Data Bank und ähnlichen Datenbanken registriert sind und Aminosäuresequenzen, die Untergruppen von FRs in VH und VL von menschlichen Antikörpern gemeinsam sind (Sequences of Proteins of Immunological Interest) und ähnliche. Um einen menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper mit starker Aktivität zu erzeugen, werden Aminosäuresequenzen mit hoher Homologie (mindestens 60% oder höher) zu Aminosäuresequenzen von FRs von VH und VL eines interessierenden Antikörpers, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt, bevorzugt ausgewählt. Anschließend werden die Aminosäuresequenzen von CDRs von VH und VL des Antikörpers, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt in die ausgewählten Aminosäuresequenzen von FRs von VH und VL eines menschlichen Antikörpers eingefügt, wodurch die Aminosäuresequenzen der VH und VL eines menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers gestaltet werden. Die so gestalteten Aminosäuresequenzen werden in DNA-Sequenzen umgewandelt, wobei die Häufigkeit der Codonverwendung Beachtung findet, die in den Nucleotidsequenzen von Antikörpergenen gefunden wird (Sequences of Proteins of Immunological Interest) und die DNA-Sequenzen, welche die Aminosäuresequenzen der VH und VL eines menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers codieren, werden so gestaltet. Verschiedene synthetisierte DNAs mit einer Länge von etwa 100 Nucleotiden werden synthetisch hergestellt und mit ihnen wird eine PCR durchgeführt. Dabei ist für die H-Kette wie auch für die L-Kette bevorzugt, dass angesichts der Reaktionseffizienz der PCR und der Länge der DNAs, die synthetisiert werden kann, 6 synthetische DNAs gestaltet werden.
  • Darüber hinaus können sie leicht in den Expressionsvektor für einen humanisierten Antikörper cloniert werden, der gemäß Abschnitt 1(1) konstruiert wurde, wobei die Erkennungssequenz eines geeigneten Restriktionsenzyms am 5'-Ende der synthetisch hergestellten DNAs eingefügt wird, die an beiden Enden vorkommen. Nach der PCR wird ein amplifiziertes Produkt in ein Plasmid wie pBluescript SK (–) (hergestellt von Stratagene) oder ein ähnliches Plasmid cloniert und die Nucleotidsequenzen werden gemäß dem in Abschnitt 1(2) beschriebenen Verfahren bestimmt. Hierdurch wird ein Plasmid erhalten, das DNA-Sequenzen aufweist, die VH und VL eines so gestalteten menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers codieren.
  • (6) Veränderung der Aminosäuresequenz der V-Region eines menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers
  • Es ist bekannt, dass bei Herstellung eines menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers durch einfaches Einfügen nur von CDRs von VH und VL eines Antikörpers, der von einem nicht-menschlichen Tier stammt in die FRs der VH und VL eines menschlichen Antikörpers, dessen Antigenbindungsaktivität im Vergleich zu der des ursprünglichen, von einem nicht-menschlichen Tier stammenden Antikörpers vermindert ist (BIO/TECHNOLOGY 9, 266 (1991)). Als Ursache dafür wird angesehen, dass verschiedene Aminosäurereste nicht nur in den CDRs, sondern auch in den FRs direkt oder indirekt mit der Antigenbindungsaktivität der VH und VL des ursprünglichen, von einem nicht-menschlichen Tier stammenden Antikörpers in Beziehung stehen und dass diese Aminosäurereste in andere Aminosäurereste geändert werden, die von FRs der VH und VL des menschlichen Antikörpers stammen. Um das Problem zu lösen, hat man versucht, in menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpern unter den Aminosäuresequenzen der FR der VH und VL der menschlichen Antikörper einen Aminosäurerest zu identifizieren, der direkten Bezug zur Bindung des Antikörpers hat, einen Aminosäurerest zu identifizieren, der mit einem Aminosäurerest einer CDR interagiert oder einen Aminosäurerest zu identifizieren, der zur Beibehaltung der dreidimensionalen Struktur des Antikörpers beiträgt und direkten Bezug zu seiner Bindung an des Antigen hat und die verminderte Antigenbindungsaktivität durch Austausch der Aminosäurereste in solche des ursprünglichen, von einem nicht-menschlichen Tier stammenden Antikörpers zu erhöhen (BIO/TECHNOLOGY 9, 266 (1991)). Bei der Herstellung eines menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers ist der wichtigste Punkt, diejenigen Aminosäurereste der FR wirksam zu identifizieren, die mit der Antigenbindungsaktivität in Beziehung stehen, so dass die Konstruktion und Analyse der dreidimensionalen Struktur der Antikörper durch Röntgenkristallographie (J. Mol. Biol. 112, 535 (1977)), Computermodellierung (Protein Engineering 7, 1501 (1994)) und ähnliche Verfahren durchgeführt wurden. Obwohl die Information über die dreidimensionale Struktur der Antikörper bei der Herstellung eines menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers nützlich war, ist bislang kein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers etabliert worden, das auf jeden Antikörper angewendet werden kann. Daher sind gegenwärtig verschiedene Ansätze nötig. Beispielsweise werden von jedem Antikörper verschiedene modifizierte Antikörper hergestellt und die Beziehung zwischen jedem der modifizierten Antikörper und seiner Antikörperbindungsaktivität wird ermittelt.
  • Der Austausch der Aminosäurereste der FR in der VH und VL eines menschlichen Antikörpers kann erreicht werden durch Ausführen der in Abschnitt 1(5) beschriebenen PCR, wobei für die Modifikation synthetisch hergestellte DNA verwendet wird. Für das durch PCR erhaltene, amplifizierte Produkt wird die Nucleotidsequenz mit dem in Abschnitt 1(2) beschriebenen Verfahren bestimmt, wodurch bestätigt wird, ob die Modifikation objektiv durchgeführt wurde.
  • (7) Konstruktion eines Expressionsvektors für einen menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper
  • Ein Expressionsvektor für einen menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper kann konstruiert werden, indem cDNAs, die VH und VL des menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers, konstruiert wie in den Abschnitten 1(5) und 1(6) beschrieben codieren, stromaufwärts von den CH und CL des menschlichen Antikörpers codierenden Genen im Expressionsvektor für den humanisierten Antikörper, der in Abschnitt 1(1) beschrieben wurde, cloniert werden.
  • Wenn beispielsweise Restriktionsspaltstellen für ein geeignetes Restriktionsenzym an den 5'-Enden synthetisch hergestellter DNAs eingeführt werden, die an beiden Enden synthetisch hergestellter DNAs sitzen, welche in der Konstruktion von VH und VL des menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers in den Abschnitten 1(5) und 1(6) verwendet werden, kann die Clonierung so ausgeführt werden, dass sie in geeigneter Weise stromaufwärts von den Genen exprimiert werden, die CH und CL des menschlichen Antikörpers im Expressionsvektor für einen humanisierten Antikörper codieren, wie in Abschnitt 1(1) beschrieben.
  • (8) Transiente Expression des humanisierten Antikörpers
  • Um die Antigenbindungsaktivität verschiedener produzierter humanisierter Antikörper wirksam auszuwerten, können die humanisierten Antikörper transient exprimiert werden, wobei ein Expressionsvektor für einen humanisierten Antikörper verwendet wird, wie in den Abschnitt 1(4) und 1(7) beschrieben oder ein dazu modifizierter Expressionsvektor. Jede Zelle kann als Wirtszelle verwendet werden, so lange sie einen humanisierten Antikörper exprimieren kann. Allgemein kann die COS-7 Zelle (ATCC CRL1651) aufgrund ihrer hohen Expressionswerte eingesetzt werden (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)). Beispiele für das Verfahren zur Einführung des Expressionsvektors in COS-7 Zellen schließen ein DEAE-Dextran-Verfahren (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)), ein Lipofektionsverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 7413 (1987) und ähnliche Verfahren ein.
  • Nach der Einführung des Expressionsvektors können das Expressionslevel und die Antigenbindungsaktivität des humanisierten Antikörpers im Kulturüberstand durch Enzym-Immuntests gemessen werden (nachstehend als „ELISA" bezeichnet; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Kapitel 14 (1988), nachfolgend bezeichnet als „Antibodies: A Laboratory Manual", Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996), nachfolgend bezeichnet als „Monoclonal Antibodies" (1996) und weitere Referenzen)
  • (9) Stabile Expression von humanisiertem Antikörper
  • Eine Transformante, die einen humanisierten Antikörper stabil produziert, kann durch Einführung des Expressionsvektors für einen humanisierten Antikörper, wie in den Abschnitten 1(4) und 1(7) beschrieben, in eine geeignete Wirtszelle erhalten werden.
  • Beispiele für das Verfahren zur Einführung des Expressionsvektors in eine Wirtszelle schließen Elektroporation (veröffentlichte, nicht geprüfte japanische Patentanmeldung 257891/90 , Cytotechnology 3, 133 (1990)) usw. ein.
  • Als Wirtszelle kann jede Zelle eingesetzt werden, in die der Expressionsvektors für einen humanisierten Antikörper eingeführt wird, so lange sie einen humanisierten Antikörper exprimieren kann. Beispiele schließen die Mauszelle SP2/0-Ag14 (ATCC CRL1581), die Mauszelle P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL1580), eine CHO-Zelle, in der das Dihydrofolatreduktasegen (nachstehend als „DHFR-Gen" bezeichnet) defekt ist (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4216 (1980)), die Rattenzelle YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (ATCC CRL 1662, nachstehend als „YB2/0-Zelle" bezeichnet) und ähnliche Zellen ein. Die YB2/0-Zelle ist bevorzugt, da die ADCC-Aktivität des humanisierten Antikörpers erhöht ist, wenn er darin exprimiert wird.
  • Nach der Einführung des Expressionsvektors werden Transformanten, die den humanisierten Antikörper stabil exprimieren, gemäß dem in der veröffentlichten, nicht geprüften japanischen Patentanmeldung 257891/90 veröffentlichten Verfahren selektioniert, wobei diese in einem Medium für tierische Zellkulturen gezüchtet werden, das einen Wirkstoff wie G418-Sulfat (nachstehend als „G418" bezeichnet, hergestellt von Sigma) oder einen ähnlichen Wirkstoff enthält. Beispiele für ein Medium für tierische Zellkulturen schließen RPMI1640-Medium (hergestellt von Nissui Pharmaceutical), GIT-Medium (hergestellt von Nissui Pharmaceutical), EX-CELL302-Medium (hergestellt von JRH), IMDM-Medium (hergestellt von GIBCO-BRL), Hybridom-SFM-Medium (hergestellt von GIBCO-BRL) ein sowie Medien, die durch Zugabe verschiedener Zusätze wie fötalem Rinderserumalbumin (nachstehend als „FBS" bezeichnet) zu diesen Medien erhalten werden, usw. Der humanisierte Antikörper kann in einem Kulturmedium produziert und darin angesammelt werden, indem die selektierten Transformanten in einem Medium gezüchtet werden. Die Expressionshöhe und die Antigenbindungsaktivität des humanisierten Antikörpers im Kulturüberstand können durch ELISA o. Ä. gemessen werden. Ferner kann in der Transformante die Expressionshöhe des humanisierten Antikörpers durch Verwendung des Dhfr-Amplifikationssystems o. Ä. durch Verwendung des in der veröffentlichten, nicht geprüften japanischen Patentanmeldung 257891/90 veröffentlichten Verfahrens erhöht werden.
  • Der humanisierte Antikörper kann aus dem Kulturüberstand der Transformante durch Verwendung einer Protein A-Säule aufgereinigt werden (Antibodies, A Laboratory Manual, Monoclonal Antibodies (1996)). Jedes andere übliche Verfahren für die Proteinaufreinigung kann eingesetzt werden. Beispielsweise kann der humanisierte Antikörper durch eine Kombination von Gelfiltration, Ionenaustauscherchromatographie, Ultrafiltration und ähnlichen Verfahren aufgereinigt werden. Das Molekulargewicht der H-Kette und der L-Kette des aufgereinigten humanisierten Antikörpers oder des Antikörpermoleküls als Ganzes wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (nachfolgend bezeichnet als „SDS-PAGE") (Nature 227, 680 (1970)), Western Blotting (Antibodies, A Laboratory Manual, Monoclonal Antibodies (1996)) und ähnliche Verfahren bestimmt.
  • (10) Evaluierung der Aktivität des humanisierten Antikörpers
  • Die Bindungsaktivität des gereinigten humanisierten Antikörpers für ein Antigen und die Bindungsaktivität des gereinigten humanisierten Antikörpers für kultivierte Krebszelllinien kann durch ELISA, ein Immunfluoreszenzverfahren (Cancer Immunol. Immunother. 36, 373 (1993)) und ähnliche Verfahren gemessen werden. Die zytotoxische Aktivität gegen eine für das Antigen positive kultivierte Zelllinie kann durch Messung der CDC-Aktivität, der ADCC-Aktivität oder ähnlichem gemessen werden (Cancer Immunol. Immunother. 36, 373 (1993)).
  • (11) Verfahren zur Anwendung des humanisierten Antikörpers
  • Es wird davon ausgegangen, dass er nützlich in der Diagnose und Behandlung von menschlichem Krebs und ähnlichem ist, wie Lungenkrebs, Melanomen, Gliomen, Neuroblastomen etc., da der humanisierte Antikörper spezifisch an GD3 bindet, das in kultivierten Krebszelllinien exprimiert wird, die vom Menschen stammen und zytotoxische Aktivität wie CDC-Aktivität, ADCC-Aktivität und ähnliche Aktivitäten zeigt. Da ferner der überwiegende Anteil des Antikörpers von der Aminosäuresequenz eines menschlichen Antikörpers stammt, verglichen mit dem Anteil, der von Antikörpern nicht-menschlicher Tiere stammt, geht man davon aus, dass er starke anti-Tumor-Wirkungen im menschlichen Körper aufweist und zwar ohne Immunogenität zu zeigen und dass die therapeutischen Wirkungen für einen verlängerten Zeitraum aufrecht erhalten werden.
  • Der erfindungsgemäße humanisierte Antikörper kann alleine verabreicht werden, es wird im allgemeinen jedoch bevorzugt, dass er in Form einer pharmazeutischen Formulierung bereitgestellt wird, die durch Vermischen des Antikörpers mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger gemäß einem im Bereich der Pharmazeutika wohl bekannten Verfahren hergestellt wird.
  • Bevorzugt ist, dass eine Verabreichungsroute gewählt wird, die am wirksamsten für die beabsichtigte Behandlung ist, wie orale Verabreichung oder parenterale Verabreichung, z. B. intraorale Verabreichung, tracheale Verabreichung, rektale Verabreichung, subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion, intravenöse Injektion und ähnliches. Für eine Antikörperformulierung ist die intravenöse Injektion bevorzugt.
  • Die Dosierungsform schließt Sprays, Kapseln, Tabletten, Granula, Sirup, Emulsionen, Zäpfchen, Injektionen, Salben, Verbände und ähnliches ein.
  • Beispiele für für die orale Verabreichung geeignete Formulierungen schließen Emulsionen, Sirup, Kapseln, Tabletten, Pulver, Granula und ähnliches ein.
  • Flüssige Präparate wie Emulsionen und Sirup können unter Verwendung von Zusätzen wie Wasser, Kohlenhydraten wie Sucrose, Sorbit, Fructose, etc., Glykolen wie Polyethylenglykol, Propylenglykol, etc., Ölen wie Sesamöl, Olivenöl, Sojaöl, etc., Antiseptika wie p-Hydroxybenzoat, etc., Geschmacksstoffen wie Erdbeergeschmack, Pfefferminze, etc., und ähnlichem hergestellt werden.
  • Kapseln, Tabletten, Pulver, Granula und ähnliches können unter Verwendung von Zusätzen wie Füllmitteln wie Lactose, Glucose, Sucrose, Mannit, etc., Aufschlussmitteln wie Stärke, Natriumalginat, etc., Schmiermitteln wie Magnesiumstearat, etc., Bindemitteln wie Polyvinylalkohol, Hydroxypropylcellulose, Gelatine, etc., grenzflächenaktiven Mitteln wie Fettsäuresestern etc., Plastifizierungsmitteln wie Glycerin, etc., und ähnlichem hergestellt werden.
  • Beispiele für Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, schließen Injektionen, Zäpfchen, Sprays, und ähnliches ein.
  • Injektionen können unter Verwendung eines Trägers wie einer Salzlösung, Glucoselösung oder einem Gemisch davon, oder ähnlichem hergestellt werden.
  • Zäpfchen können unter Verwendung eines Trägers wie Kakaobutter, gehärtetem Fett, einer Carbonsäure oder ähnlichem hergestellt werden.
  • Ferner können Sprays mit dem Antikörper oder dem Peptid selbst hergestellt werden oder unter Verwendung eines Trägers oder ähnlichem, der die Mund- und Atemwegsschleimhäute von Patienten nicht stimuliert und die Absorption des Antikörpers oder Peptids durch deren Dispersion als Kleinstpartikel erleichtern kann.
  • Beispiele für den Träger schließen Lactose, Glycerin und ähnliches ein. Abhängig von den Eigenschaften des einzusetzenden Antikörpers oder Peptids und Trägers können Aerosole, trockene Pulver und ähnliches hergestellt werden. Die beispielhaft für die oralen Präparate dargestellten Zusatzmittel können auch zu den parenteralen Präparaten gegeben werden.
  • Die Dosis und Häufigkeit der Verabreichung variieren abhängig von dem beabsichtigten therapeutischen Effekt, dem Verabreichungsverfahren, der Behandlungsdauer, dem Alter, dem Körpergewicht und ähnlichem. Jedoch beträgt die Dosis üblicherweise von 10 μg/kg pro Tag bis 8 mg/kg pro Tag für jeden Erwachsenen.
  • 2. Herstellung eines Fusionsproteins aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin
  • (1) Konstruktion eines Gens, das ein Fusionsproteins aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin codiert
  • Ein Gen, das ein Fusionsproteins aus einem Antikörper oder dem Antikörperfragment und Zytokin codiert, kann durch Verknüpfung eines ein Zytokin codierenden Gens mit dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende eines Gens, das die H-Kette oder die L-Kette eines Antikörpers oder des Antikörperfragments codiert, über eine geeignete synthetische DNA konstruiert werden. Ferner kann ein Gen, das ein Fusionsproteins aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin codiert, durch Einfügen einer geeigneten Spaltstelle für ein Restriktionsenzym in das 5'-Ende eines Primers für die Amplifikation konstruiert werden, wenn das das Zytokin codierende Gen durch PCR amplifiziert wird, und Verknüpfung des so erhaltenen Gens mit dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende eines Gens, welches die H-Kette oder die L-Kette eines Antikörpers oder des Antikörperfragments codiert. Als das das Zytokin codierende Gen kann irgendeine chromosomale DNA oder cDNA verwendet werden. Die Nucleotidsequenz des so konstruierten Gens, das ein Fusionsproteins aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin codiert, wird durch das in Abschnitt 1(2) beschriebene Verfahren ermittelt, wodurch bestätigt wird, dass es sich um die interessierende Sequenz handelt.
  • (2) Konstruktion eines Expressionsvektors für ein Fusionsproteins aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin
  • Ein Expressionsvektor für ein Fusionsprotein aus einem Antikörper oder dem Antikörperfragment und Zytokin kann durch teilweisen oder vollständigen Austausch eines Gens, das die H-Kette oder die L-Kette eines Antikörpers oder des Antikörperfragments auf dem in den Abschnitten 1(4) und 1(7) beschriebenen Expressionsvektor für den humanisierten Antikörper codiert, durch das Gen konstruiert werden, das ein Fusionsprotein aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin codiert und in Abschnitt 2(1) beschrieben ist. Wenn beispielsweise ein Fusionsprotein hergestellt wird, in dem das Zytokin mit dem C-Terminus der H-Kette eines Antikörpers konjugiert ist, kann der Expressionsvektor durch Verknüpfung eines das Zytokin codierenden Gens mit dem 3'-Ende eines die CH eines Antikörpers oder des Antikörperfragmentes codierenden Gens konstruiert werden, wodurch ein Gen konstruiert wird, das ein Fusionsprotein aus der CH eines Antikörpers oder des Antikörperfragments mit dem Zytokin gemäß Abschnitt 2(1) codiert und ferner durch Austausch eines die CH eines Antikörpers oder des Antikörperfragmentes codierenden Gens auf dem Expressionsvektor für den humanisierten Antikörper, beschrieben in den Abschnitten 1(4) und 1(7), mit dem Gen.
  • (3) Stabile Expression des Fusionsproteins aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin
  • Stabile Expression eines Fusionsproteins aus einem Antikörper oder dem Antikörperfragment und Zytokin gemäß des in Abschnitt 1(9) beschriebenen Verfahrens unter Verwendung des in Abschnitt 2(2) beschriebenen Expressionsvektors für ein Fusionsproteins aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin wird so durchgeführt, dass eine Transformante erhalten werden kann, die das Fusionsprotein aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin stabil exprimiert, das Fusionsprotein aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin aus dem Kulturüberstand aufgereinigt wird und sein Molekulargewicht und weitere Eigenschaften analysiert werden können.
  • (4) Auswertung der in vitro-Aktivität des Fusionsproteins aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin
  • Unter den Aktivitäten des so aufgereinigten Fusionsproteins aus einem Antikörper oder dem Antikörperfragment und Zytokin können Aktivitäten des Antikörperanteils und zwar die Bindungsaktivität an ein Antigen und die Bindungsaktivität gegenüber kultivierten Krebszelllinien mit ELISA, einem Immunfluoreszenzverfahren und ähnlichen Verfahren gemessen werden. Darüber hinaus können seine zytotoxischen Eigenschaften gegenüber Antigen-positiven kultivierten Krebszelllinien durch Messen seiner CDC-Aktivität, ADCC-Aktivität und ähnlichem ausgewertet werden. Andererseits kann die Aktivität des Zytokinanteils evaluiert werden, beispielsweise unter Verwendung der wachstumsunterstützenden Aktivität für eine Zelllinienkultur, die von der Zytokinkonzentration abhängiges Wachstum zeigt, als einen Index (Proc. Natl. Acd. Sci. U. S. A. 91, 9626 (1994)).
  • (5) Auswertung der in vivo-Aktivität des Fusionsproteins aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin
  • Die anti-Tumorwirkung des Fusionsproteins aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin kann durch Verabreichung an ein syngeneisches Maus-Verpflanzungsmodell ermittelt werden, bei dem eine Antigen exprimierende kultivierte Mauskrebszelllinie in eine Wildtyp-Maus mit normalem Immunsystem transplantiert wurde. Darüber hinaus kann seine anti-Tumorwirkung im lebenden Körper durch Vergleich derjenigen Fälle ermittelt werden, in denen dem syngeneischen Maus-Verpflanzungsmodell der Antikörper allein, das Cytokin allein und Antikörper und Zytokin gleichzeitig verabreicht wurden (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 7826 (1996)). Bis heute gibt es keine Berichte über GD2- oder GD3-positive kultivierte Mauszelllinien, die spezifisch in menschlichen Melanomen oder Neuroblastomen exprimiert werden. Eine GD2- oder GD3-positive Transformante kann jedoch durch Einführung eines interessierenden, spezifisch zu exprimierenden Gangliosidsynthasegens in eine kultivierte Mauszelllinie hergestellt werden, die GM2 oder GM3 als eine biosynthetische Vorstufe von GD2 und GD3 exprimiert (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 10455 (1994)). Ein syngeneisches Verpflanzungsmodell kann durch Transplantation dieser Transformante in eine Wildtyp-Maus mit normalem Immunsystem erzeugt werden.
  • Das so erzeugte Mausmodell kann in der Auswertung der in vivo-Bewertung eines Fusionsproteins aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin gegenüber einem interessierenden Gangliosid eingesetzt werden.
  • (6) Verfahren zur Anwendung von Fusionsproteinen aus humanisiertem Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin
  • Da das erfindungsgemäße Fusionsprotein aus Antikörper oder Antikörperfragment und Zytokin spezifisch an GD3 bindet, das in kultivierten Krebszelllinien menschlichen Ursprungs exprimiert wird und zytotoxische Aktivitäten wie CDC-Aktivität, ADCC-Aktivität und ähnliche Aktivitäten zeigt, wird es als nützlich für die Diagnose und Behandlung von Krebs im Menschen und ähnlichem wie Lungenkrebs, Melanomen, Gliomen, Neuroblastomen etc. betrachtet. Da der Großteil des erfindungsgemäßen humanisierten Antikörpers oder Antikörperfragmentes aus der Aminosäuresequenz eines menschlichen Antikörpers stammt, verglichen mit Antikörpern von nicht-menschlichen Tieren, wird erwartet, dass er starke anti-Tumorwirkungen im Menschen zeigt und zwar ohne Immunogenität zu zeigen und dass die therapeutischen Wirkungen für einen verlängerten Zeitraum beibehalten werden. Da er immunkompetente Zellen in der Peripherie eines Krebsgeschwulstes durch die Aktivität des konjugierten Zytokinbestandteiles aktivieren kann, werden stärkere anti-Tumorwirkungen erwartet, als wenn der Antikörper allein, das Zytokin allein oder Antikörper und Zytokin gleichzeitig verabreicht würden. Ferner wird eine Verminderung der Nebenwirkungen im Vergleich zur systemischen Verabreichung von Zytokin erwartet.
  • Das erfindungsgemäße Fusionsprotein aus einem humanisierten Antikörper oder dem Antikörperfragment und Zytokin kann allein verabreicht werden, es wird im allgemeinen jedoch bevorzugt, dass er in Form einer pharmazeutischen Formulierung bereitgestellt wird, die durch Vermischen des Antikörpers mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger gemäß einem im technischen Bereich der Pharmazeutika wohl bekannten Verfahren hergestellt wird. Bevorzugt ist, dass eine Verabreichungsroute gewählt wird, die am wirksamsten für die beabsichtigte Behandlung ist, wie orale Verabreichung oder parenterale Verabreichung, z. B. intraorale Verabreichung, tracheale Verabreichung, rektale Verabreichung, subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion, intravenöse Injektion und ähnliches. Für eine Proteinformulierung ist die intravenöse Injektion bevorzugt.
  • Die Dosierungsform schließt Sprays, Kapseln, Tabletten, Granula, Sirup, Emulsionen, Zäpfchen, Injektionen, Salben, Verbände und ähnliches ein.
  • Beispiele für für die orale Verabreichung geeignete Formulierungen schließen Emulsionen, Sirup, Kapseln, Tabletten, Pulver, Granula und ähnliches ein.
  • Flüssige Präparate wie Emulsionen und Sirup können unter Verwendung von Zusätzen wie Wasser, Kohlenhydraten wie Sucrose, Sorbit, Fructose, etc., Glykolen wie Polyethylenglykol, Propylenglykol, etc., Ölen wie Sesamöl, Olivenöl, Sojaöl, etc., Antiseptika wie p-Hydroxybenzoat, etc., Geschmacksstoffen wie Erdbeergeschmack, Pfefferminze, etc., und ähnlichem hergestellt werden.
  • Kapseln, Tabletten, Pulver, Granula und ähnliches können unter Verwendung von Zusätzen wie Füllmitteln wie Lactose, Glucose, Sucrose, Mannit, etc., Aufschlussmitteln wie Stärke, Natriumalginat, etc., Schmiermitteln wie Magnesiumstearat, etc., Bindemitteln wie Polyvinylalkohol, Hydroxypropylcellulose, Gelatine, etc., grenzflächenaktiven Mitteln wie Fettsäuresestern etc., Plastifizierungsmitteln wie Glycerin, etc., und ähnlichem hergestellt werden.
  • Beispiele für Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, schließen Injektionen, Zäpfchen, Sprays, und ähnliches ein.
  • Injektionen können unter Verwendung eines Trägers wie einer Salzlösung, Glucoselösung oder einem Gemisch davon, oder ähnlichem hergestellt werden.
  • Zäpfchen können unter Verwendung eines Trägers wie Kakaobutter, gehärtetem Fett, einer Carbonsäure oder ähnlichem hergestellt werden.
  • Ferner können Sprays mit dem Antikörper oder dem Peptid selbst hergestellt werden oder unter Verwendung eines Trägers oder ähnlichem, der die Mund- und Atemwegsschleimhäute von Patienten nicht stimuliert und die Absorption des Antikörpers oder Peptids durch deren Dispersion als Kleinstpartikel erleichtern kann. Beispiele für den Träger schließen Lactose, Glycerin und ähnliches ein. Abhängig von den Eigenschaften des einzusetzenden Antikörpers oder Peptids und Trägers können Aerosole, trockene Pulver und ähnliches hergestellt werden. Die beispielhaft für die orale Präparate dargestellten Zusatzmittel können auch zu den parenteralen Präparaten gegeben werden.
  • Die Dosis und Häufigkeit der Verabreichung variieren abhängig von dem beabsichtigten therapeutischen Effekt, dem Verabreichungsverfahren, der Behandlungsdauer, dem Alter, dem Körpergewicht und ähnlichem. Jedoch beträgt die Dosis üblicherweise von 10 μg/kg pro Tag bis 8 mg/kg pro Tag für jeden Erwachsenen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids phKM641H zeigt.
  • 2 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids phKM641L zeigt.
  • 3 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids pT796H641L zeigt.
  • 4 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids pBS641H zeigt.
  • 5 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids pT641 zeigt.
  • 6 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids pT641HCDR zeigt.
  • 7 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion der Plasmide pT641LCDR und pT641HLCDR zeigt.
  • 8 ist eine Darstellung, die die Evaluierung der Aktivität eines chimären anti-GD3-Antikörpers und eines durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers durch ihre transiente Expression unter Verwendung der Plasmide pT641, pT641HCDR, pT641LCDR und pT641HLCDR zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen den Namen des Expressionsvektors bzw. die relative Aktivität (%) dar, wenn die Aktivität des chimären anti-GD3 Antikörpers als 100 definiert wird.
  • 9 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids phKM641Lm-69 zeigt.
  • 10 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion der Plasmide pT641HLCDRNL, pT641HLCDRLm-1, pT641HLCDRLm-4, pT641HLCDRLm-6, pT641HLCDRLm-7, pT641HLCDRLm-8, pT641HLCDRLm-9 und pT641HLCDRLm-69 zeigt.
  • 11 ist eine Darstellung, die die Evaluierung der Aktivität eines chimären anti-GD3-Antikörpers und eines durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers durch ihre transiente Expression unter Verwendung der Plasmide pT641, pT641HLCDR, pT641HLCDRNL, pT641HLCDRLm-1, pT641HLCDRLm-4, pT641HLCDRLm-6, pT641HLCDRLm-7, pT641HLCDRLm-8, pT641HLCDRLm-9 und pT641HLCDRLm-69 zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen den Namen des Expressionsvektors bzw. die relative Aktivität (%) dar, wenn die Aktivität des chimären anti-GD3-Antikörpers als 100 definiert wird.
  • 12 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion der Plasmide pKANTEX641HLCDR, pKANTEX641HLCDRLm-9 und pKANTEX641HLCDRLm-69 zeigt.
  • 13 ist eine Darstellung, die SDS-PAGE (unter Verwendung eines 4 bis 15% Gradientengels) Elektrophoresemuster der gereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871 zeigt. Die linke Seite zeigt Ergebnisse einer Elektrophorese, die unter nicht reduzierenden Bedingungen durchgeführt wurde und die rechte Seite zeigt diejenigen unter reduzierenden Bedingungen. Die Spuren 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 zeigen Elektrophoresemuster von Markern mit hohem Molekulargewicht, KM8869, KM8870, KM8871, Markern mit niedrigem Molekulargewicht, KM8869, KM8870 und KM8871.
  • 14 ist eine Darstellung, die die Bindungsaktivität von gereinigtem chimären anti-GD3-Antikörper KM871 und gereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern KM8869, KM8870 und KM8871 gegenüber GD3 zeigt, gemessen anhand der Änderung der Antikörperkonzentration. Die Ordinate und die Abszisse stellen die Bindungsaktivität gegenüber GD3 bzw. die Antikörperkonzentration dar. „o", „•", „☐" und „
    Figure 00340001
    " zeigen die Aktivitäten von KM871, KM8869, KM8870 bzw. KM8871.
  • 15 ist eine Darstellung, die die Bindungsaktivität von gereinigtem chimären anti-GD3-Antikörper KM871 und gereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern KM8869, KM8870 und KM8871 gegenüber GD3 zeigt, gemessen anhand der Änderung der an eine Platte zu adsorbierenden Menge an GD3. Die Ordinate und die Abszisse stellen die Bindungsaktivität gegenüber GD3 bzw. die an die Platte adsorbierte Menge an GD3 dar. „o", „•", „☐" und „
    Figure 00340002
    " zeigen die Aktivitäten von KM871, KM8869, KM8870 bzw. KM8871.
  • 16 ist eine Darstellung, die die Reaktivität von gereinigtem chimären anti-GD3-Antikörper KM871 und gereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern KM8869, KM8870 und KM8871 gegenüber verschiedenen Gangliosiden zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen die Art des Gangliosids bzw. die Bindungsaktivität dar. AcGM2, GcGM2, AcGM3 und GcGM3 bezeichnen N-acetylGM2, N-glykolylGM2, N-acetylGM3 und N-glycolylGM3. „☐", „☐", „☐" und „
    Figure 00340003
    zeigen die Reaktivitäten von KM871, KM8869, KM8870 bzw. KM8871.
  • 17 ist eine Darstellung, die die Reaktivität von gereinigtem chimären anti-GD3-Antikörper KM871 und gereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3- Antikörpern KM8869, KM8870 und KM8871 gegenüber den menschlichen Melanomzelllinien G-361 und SK-MEL-28 zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen die Anzahl an Zellen und die Fluoreszenzintensität dar. Die Graphen zeigen die Reaktivitäten der Kontrolle, von KM871, KM8869, KM8870 und KM8871, von unten her.
  • 18 ist eine Darstellung, die die CDC-Aktivität von gereinigtem chimären anti-GD3-Antikörper KM871 und gereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern KM8869, KM8870 und KM8871 gegenüber den menschlichen Melanomzelllinien G-361 und SK-MEL-28 zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen die zytotoxische Aktivität bzw. die Antikörperkonzentration dar. „☐", „☐", „☐" und „
    Figure 00350001
    " zeigen die Reaktivitäten von KM871, KM8869, KM8870 bzw. KM8871.
  • 19 ist eine Darstellung, die die ADCC-Aktivität von gereinigtem chimären anti-GD3 Antikörper KM871 und gereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern KM8869, KM8870 und KM8871 gegenüber den menschlichen Melanomzelllinien G-361 und SK-MEL-28 zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen die zytotoxische Aktivität bzw. die Antikörperkonzentration dar. „☐", „☐", „☐" und „
    Figure 00350002
    " zeigen die Aktivitäten von KM871, KM8869, KM8870 bzw. KM8871.
  • 20 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids pBSA-B zeigt.
  • 21 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids pBSΔhCγ1-IL-2 zeigt.
  • 22 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids pBShCγ1-IL-2 zeigt.
  • 23 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids pKANTEX8871-hIL-2 zeigt.
  • 24 ist eine Darstellung, die SDS-PAGE (unter Verwendung eines 4–15%igen Gradientengels) Elektrophoresemuster von gereinigtem, durch CDR-grafting erzeugtem anti-GD3-Antikörper KM8871 und gereinigtem Fusionsprotein KM8871-hIL-2 zeigt. Die linke Seite und die rechte Seite zeigen Ergebnisse einer Elektrophorese, die unter nicht reduzierenden Bedingungen bzw. unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt wurde. Die Spuren 1, 2, 3, 4, 5 und 6 zeigen Elektrophoresemuster von Markern mit niedrigem Molekulargewicht, KM8871, KM8871-hIL-2, Markern mit niedrigem Molekulargewicht, KM8871 bzw. KM8871-hIL-2.
  • 25 ist eine Darstellung, die die Bindungsaktivität von gereinigtem, durch CDR-grafting erzeugtem anti-GD3-Antikörper KM8871 und gereinigtem Fusionsprotein KM8871-hIL-2 gegenüber GD3 zeigt, gemessen anhand der Änderung der Antikörperkonzentration. Die Ordinate und die Abszisse stellen die Bindungsaktivität gegenüber GD3 bzw. die Antikörperkonzentration dar. „o" und „•" zeigen die Aktivitäten von KM8871 bzw. KM8871-hIL-2.
  • 26 ist eine Darstellung, die die Reaktivität von gereinigtem, durch CDR-grafting erzeugtem anti-GD3-Antikörper KM8871 und gereinigtem Fusionsprotein KM8871-hIL-2 gegenüber verschiedenen Gangliosiden zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen die Art des Gangliosids und die Bindungsaktivität dar. AcGM2, GcGM2, AcGM3 und GcGM3 bezeichnen N-acetylGM2, N-glykolylGM2, N-acetylGM3 und N-glycolylGM3. „☐" und „
    Figure 00360001
    " zeigen die Reaktivitäten von KM8871 bzw. KM8871-hIL-2.
  • 27 ist eine Darstellung, die die Reaktivität von gereinigtem, durch CDR-grafting erzeugtem anti-GD3-Antikörper KM8871 und gereinigtem Fusionsprotein KM8871-hIL-2 gegenüber der menschlichen Melanomzelllinie G-361 zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen die Anzahl an Zellen und die Fluoreszenzintensität dar. Die Darstellungen zeigen die Reaktivitäten von KM8871 und KM8871-hIL-2, von der oberen Säule her.
  • 28 ist eine Darstellung, die die wachstumsfördernde Aktivität von hIL-2 und gereinigtem Fusionsprotein KM8871-hIL-2 gegenüber der hIL-1-abhängigen Zelle CTLL-2 zeigt, gemessen durch Änderung der Konzentration von jedem Protein. Die Ordinate und die Abszisse stellen die wachstumsfördernde Aktivität bzw. die Proteinkonzentration dar. „o" und „•" zeigen die Aktivitäten von hIL-2 und KM8871-hIL-2.
  • 29 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse der Aktivierungsmessung und der damit verbundenen zytotoxischen Aktivität menschlicher Effektorzellen durch gereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8871 und gereinigtes Fusionsprotein KM8871-hIL-2 zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen die zytotoxische Aktivität bzw. das eingesetzte Protein dar. „☐" und „
    Figure 00360002
    " zeigen die Aktivitäten von KM8871 bzw. KM8871-hIL-2.
  • 30 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids pKANTEX871-hIL-2 zeigt.
  • 31 ist eine Darstellung, die SDS-PAGE (unter Verwendung eines 4–15%igen Gradientengels) Elektrophoresemuster von chimärem anti-GD3 Antikörper KM871 und gereinigten Fusionsprotein KM871-hIL-2 zeigt. Die linke Seite und die rechte Seite zeigen Ergebnisse einer Elektrophorese, die unter reduzierenden Bedingungen bzw. unter nicht reduzierenden Bedingungen durchgeführt wurde. Die Spuren 1, 2, 3, 4, 5 und 6 zeigen Elektrophoresemuster von Markern mit niedrigem Molekulargewicht, KM871, KM871-hIL-2, Markern mit niedrigem Molekulargewicht, KM871 und KM871-hIL-2.
  • 32 ist eine Darstellung, die die Bindungsaktivität von chimärem anti-GD3-Antikörper KM8871 und gereinigtem Fusionsprotein KM871-hIL-2 gegenüber GD3 zeigt, gemessen anhand der Änderung der Antikörperkonzentration. Die Ordinate und die Abszisse stellen die Bindungsaktivität gegenüber GD3 bzw. die Antikörperkonzentration dar. „•" und „☐" zeigen die Aktivitäten von KM871 bzw. KM871-hIL-2.
  • 33 ist eine Darstellung, die die Reaktivität von chimärem anti-GD3-Antikörper KM871 und gereinigtem Fusionsprotein KM871-hIL-2 gegenüber verschiedenen Gangliosiden zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen die Art des Gangliosids und die Bindungsaktivität dar. AcGM2, GcGM2, AcGM3 und GcGM3 bezeichnen N-acetylGM2, N-glykolylGM2, N-acetylGM3 und N-glycolylGM3. „☐" und „
    Figure 00370001
    " zeigen die Reaktivitäten von KM871 bzw. KM871-hIL-2.
  • 34 ist eine Darstellung, die die Reaktivität von chimärem anti-GD3-Antikörper KM871 und gereinigtem Fusionsprotein KM871-hIL-2 gegenüber den menschlichen Melanomzelllinien G-361 und SK-MEL-28 zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen die Anzahl an Zellen und die Fluoreszenzintensität dar. Die Graphen zeigen die Reaktivitäten von KM871 gegenüber der G361-Zelle, von KM871-hIL-2 gegenüber der G361-Zelle, von KM871 gegenüber SK-MEL-2 und von KM871-hIL-2 gegenüber SK-MEL-2 von der oberen Säule her.
  • 35 ist eine Darstellung, die die wachstumsfördernde Aktivität von hIL-2 und gereinigtem Fusionsprotein KM871-hIL-2 gegenüber der hIL-2-abhängigen Zelle CTLL-2 zeigt, gemessen durch Änderung der Konzentration von jedem Protein. Die Ordinate und die Abszisse stellen die wachstumsfördernde Aktivität bzw. die Proteinkonzentration dar. „•" und „o" zeigen die Aktivitäten von hIL-2 und KM871-hIL-2.
  • 36 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse der Aktivitätsmessung und der damit verbundenen zytotoxischen Aktivität menschlicher Effektorzellen durch den chimären anti-GD3-Antikörper KM 871 und gereinigtes Fusionsprotein KM871-hIL-2 zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen die zytotoxische Aktivität bzw. das eingesetzte Protein dar. „
    Figure 00380001
    " und „☐" zeigen die Aktivitäten von KM871 bzw. KM871-hIL-2.
  • 37 ist eine Darstellung, die die Schritte in der Konstruktion des Plasmids pKANTEXGD3 zeigt.
  • 38 ist eine Darstellung, die die Reaktivität von chimärem anti-GD3-Antikörper KM871 gegenüber den B16-Zelllinien B16.29-10 und B16.8-3 zeigt, in die das GD3-Synthasegen eingeführt worden war und gegenüber der parentalen Zelllinie B16.F10. Die Ordinate und die Abszisse stellen die Anzahl an Zellen und die Fluoreszenzintensität dar. Die Darstellungen zeigen die Reaktivitäten der B16.F10-Zelle, von B16.29-10 und B16.8-3, von der oberen Säule her.
  • 39 ist eine Darstellung, die die Messergebnisse der anti-metastatischen Wirkungen von chimärem anti-GD3-Antikörper KM871 und KM871-hIL-2 bei BL/6-Mäusen zeigen, in die die GD3-positive B16-Zelllinie B16.29-10 transplantiert wurde. Die Ordinate und der Balken des Graphen stellen die Anzahl metastatischer Foci auf der Lungenoberfläche bzw. den Mittelwert jeder Gruppe dar. Keine Verabreichung bezeichnet eine Kontrollgruppe, an die der Antikörper nicht verabreicht wurde. „♢", „o" und „•" bezeichnen die Anzahlen an metastasierenden Foci in der Lunge bei Mäusen der Kontrollgruppe, der Gruppe, an die KM871-hIL-2 verabreicht wurde und der Gruppe, an die KM871 verabreicht wurde.
  • 40 ist eine Darstellung, die ein Messergebnis der anti-metastatischen Wirkungen von chimärem anti-GD3-Antikörper KM871 und von KM871-hIL-2 bei BL/6-Mäusen zeigt, in die die GD3-positive B16-Zelllinie B16.8-3 transplantiert wurde. Die Ordinate und der Balken des Graphen stellen die Anzahl metastatischer Foci auf der Lungenoberfläche bzw. den Mittelwert jeder Gruppe dar. Keine Verabreichung bezeichnet eine Kontrollgruppe, an die der Antikörper nicht verabreicht wurde. „♢", „o" und „•" bezeichnen die Anzahlen an metastasierenden Foci in der Lunge bei Mäusen der Kontrollgruppe, der Gruppe, an die KM871-hIL-2 verabreicht wurde und der Gruppe, an die KM871 verabreicht wurde.
  • 41 ist eine Darstellung, die die Messergebnisse der anti-metastatischen Wirkungen nach kombinierter Verabreichung des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 mit hIL-2 und Verabreichung von KM871-hIL-2 an BL/6-Mäuse zeigt, in die die GD3-positive B16-Zelllinie B16.29-10 transplantiert wurde. Die Ordinate und der Balken des Graphen stellen die Anzahl metastatischer Foci auf der Lungenoberfläche und den Mittelwert jeder Gruppe dar. Keine Verabreichung bezeichnet eine Kontrollgruppe, an die der Antikörper nicht verabreicht wurde. „♢", „o" und „•" bezeichnen die Anzahlen an metastasierenden Foci in der Lunge bei Mäusen der Kontrollgruppe, der Gruppe, an die KM871-hIL-2 verabreicht wurde und der Gruppe, an die die Kombination KM871-hIL-2 verabreicht wurde.
  • 42 ist eine Darstellung, die die Messergebnisse der wachstumsinhibierenden Wirkungen von KM871-hIL-2 auf ein Modell für einen Tumor im frühen Stadium bei BL/6-Mäusen zeigt, in die die GD3-positive B16-Zelllinie B16.29-10 subkutan transplantiert wurde. Die Ordinate und die Abszisse des Graphen zeigen das Verhältnis des Mittelwertes an Tumorvolumina in jeder Gruppe zum Mittelwert an Tumorvolumina in der Kontrollgruppe bzw. Tagen nach Beginn der Verabreichung des Wirkstoffes. Gepunktete Linie, „☐", „Δ" und „o" stellen die Kontrolle, die Gruppe, an die KM871 verabreicht wurde, die Gruppe, an die hIL-2 verabreicht wurde und die Gruppe, an die KM871-hIL-2 verabreicht wurde, dar.
  • 43 ist eine Darstellung, die die Messergebnisse der wachstumsinhibierenden Wirkungen von KM871-hIL-2 auf ein Modell für einen Tumor im fortgeschrittenen Stadium bei BL/6-Mäusen zeigt, in die die GD3-positive B16-Zelllinie B16.29-10 subkutan transplantiert wurde. Die Ordinate des Graphen zeigt das Verhältnis des Mittelwertes von V/V0-Werten in jeder Gruppe zum Mittelwert der V/V0-Werte in der Kontrollgruppe. V/V0 bezeichnet das Verhältnis des Tumorvolumens in jeder Maus an jedem gemessenen Tag zum Tumorvolumen am ersten Tag der Verabreichung. Die Abszisse zeigt die Tage nach Beginn der Verabreichung des Wirkstoffs. Gepunktete Linie, „Δ", „☐", „
    Figure 00390001
    ", „o" und „•" stellen die Kontrolle, die Gruppe, an die hIL-2 verabreicht wurde, die Gruppe, an die KM871 zu 50 μg/Tag verabreicht wurde, die Gruppe, an die KM871 zu 200 μg/Tag verabreicht wurde, die Gruppe, an die KM871-hIL-2 zu 24 μg/Tag verabreicht wurde und die Gruppe, an die KM871-hIL-2 zu 60 μg/Tag verabreicht wurde, dar.
  • 44 ist eine Darstellung, die die Messergebnisse der wachstumsinhibierenden Wirkungen der kombinierten Verabreichung des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 und von KM871-hIL-2 auf ein Modell für einen Tumor im fortgeschrittenen Stadium bei BL/6-Mäusen zeigt, in die die GD3-positive B16-Zelllinie B16.29-10 subkutan transplantiert wurde. Die Ordinate des Graphen zeigt das Verhältnis des Mittelwertes von V/V0-Werten in jeder Gruppe zum Mittelwert der V/V0-Werte in der Kontrollgruppe. V/V0 bezeichnet das Verhältnis des Tumorvolumens in jeder Maus an jedem gemessenen Tag zum Tumorvolumen am ersten Tag der Verabreichung. Die Abszisse zeigt die Tage nach Beginn der Verabreichung des Wirkstoffs. Gepunktete Linie, „Δ", „
    Figure 00400001
    ", „o" und „•" stellen die Kontrolle, die Gruppe, an die hIL-2 verabreicht wurde, die Gruppe, an die KM871 verabreicht wurde, die Gruppe, an die die Kombination KM871 und KM871-hIL-2 zu 15 μg/Tag verabreicht wurde und die Gruppe, an die die Kombination KM871 und KM871-hIL-2 zu 60 μg/Tag verabreicht wurde, dar.
  • 45 ist eine Darstellung, die die Messergebnisse der Aktivierung und damit verbundenen Erhöhung der zytotoxischen Aktivität durch hIL-2 oder KM871-hIL-2 bei Milzzellen von BL/6-Mäusen zeigt. Die Ordinate und die Abszisse stellen die zytotoxische Aktivität und die Konzentration von bei der Messung der zytotoxischen Aktivität eingesetztem KM871 dar. Schwarzer Balken, weißer Balken, grauer Balken und schattierter Balken stellen die Aktivitäten dar, wenn Milzzellen von Kontrollmäusen eingesetzt wurden, an die nicht verabreicht wurde, wenn Milzzellen von Mäusen eingesetzt wurden, an die hIL-2 fünfmal verabreicht wurde, wenn Milzzellen von Mäusen eingesetzt wurden, an die KM871-hIL-2 einmal verabreicht wurde und wenn Milzzellen von Mäusen eingesetzt wurden, an die KM871-hIL-2 fünfmal verabreicht wurde.
  • 46 ist eine Darstellung, die das Verhältnis der Anzahl von Zellen jeder Gruppe in Milzzellen von BL/6-Mäusen zeigt, an die hIL-2 oder KM871-hIL-2 verabreicht wurde, gemessen durch ein Fluoreszenzverfahren. Die Ordinate und die Abszisse stellen das Verhältnis von Milzzellen in jeder Zellgruppe und jeder Zellgruppe dar. Weißer Balken, grauer Balken, schwarzer Balken und schattierter Balken stellen das Verhältnis von Milzzellen von Kontrollmäusen eingesetzt dar, an die nicht verabreicht wurde, von Milzzellen von Mäusen, an die hIL-2 fünfmal verabreicht wurde, von Milzzellen von Mäusen, an die KM871-hIL-2 fünfmal verabreicht wurde und von Milzzellen von Mäusen, an die KM871-hIL-2 zweimal verabreicht wurde.
  • 47 ist eine Darstellung, die ein Messergebnis der zytotoxischen Aktivität durch Milzzellen bei Verabreichung von KM871-hIL-2 an BL/6-Mäuse zeigt, bei denen NK-Zellen, CD4-positive T-Zellen und CD8-positive T-Zellen entfernt wurden. Die Ordinate stellt die zytotoxische Aktivität dar. Weißer Balken, schwarzer Balken, grauer Balken und schattierter Balken stellen die zytotoxische Aktivität von Mausmilzzellen dar, bei denen nicht entfernt wurde, die zytotoxische Aktivität von Mausmilzzellen, bei denen NK-Zellen entfernt wurden, die zytotoxische Aktivität von Mausmilzzellen, bei denen CD4-positive T-Zellen entfernt wurden und die zytotoxische Aktivität von Mausmilzzellen, bei denen CD8-positive T-Zellen entfernt wurden.
  • 48 ist eine Darstellung, die die Messergebnisse der anti-metastatischen Wirkungen von KM871-hIL-2 bei BL/6-Mäusen zeigt, in die die GD3-positive B16-Zelllinie B16.29-10 transplantiert wurde, wobei den Mäusen NK-Zellen, CD4-positive T-Zellen und CD8-positive T-Zellen entfernt worden waren. Die Ordinate stellt die Anzahl metastatischer Foci dar. „o", „•", horizontaler Balken und der Wert im Graph bezeichnen die Anzahlen an metastasierenden Foci in der Lunge bei Mäusen, die Anzahlen an metastasierenden Foci in der Lunge bei Mäusen, an die KM871-hIL-2 verabreicht wurde, den Mittelwert jeder Gruppe und das Verhältnis der Inhibition von Metastasen nach Verabreichung von KM871-hIL-2.
  • Beste Art und Weise zur Ausführung der Erfindung
  • Beispiele für die Erfindung sind nachfolgend dargestellt, obwohl der Schutzbereich der Erfindung dadurch nicht beschränkt ist.
  • Beispiel 1
  • Herstellung eines durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers
  • 1. Analyse der Aminosäuresequenz der V-Region des Maus-anti-GD3-Antikörpers KM641
  • Eine vollständige Aminosäuresequenz von VH des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641, offenbart in der veröffentlichten, nicht geprüften japanischen Patentanmeldung 304989/93 ist in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt und eine vollständige Aminosäuresequenz von VL davon ist in SEQ ID Nr.: 2 dargestellt. Basierend auf dem Vergleich beider Sequenzen mit analytischen Ergebnissen von Aminosäuresequenzen bekannter Antikörper (Sequences of Proteins of Immunological Interest) und N-terminalen Aminosäuresequenzen der H- und L-Kette von gereinigtem anti-GD3-Maus-Antikörper KM641 wurde bestätigt, dass die Positionen (–19) bis (–1) in der Aminosäuresequenz der H-Kette und die Positionen (–20) bis (–1) in der Aminosäuresequenz der L-Kette sekretorische Signalsequenzen darstellen. Die vollständigen Aminosäuresequenzen der sekretorischen VH und VL sind in SEQ ID Nr.: 55 und SEQ ID Nr.: 56 dargestellt. Ferner wurde gefunden, dass die CDRs 1, 2 und 3 von VH Aminosäuresequenzen aufweisen, die durch die SEQ ID Nr.: 3, 4 und 5 dargestellt sind und die CDRs 1, 2 und 3 von VL diejenigen aufweisen, die durch die SEQ ID Nr.: 6, 7 und 8 dargestellt sind.
  • 1. Messung der Antikörper-Bindungsaktivität an verschiedene Ganglioside (ELISA)
  • Die Antikörper-Bindungsaktivität an verschiedene Ganglioside wurde wie folgt gemessen.
  • Jedes Gangliosid (2 nMol) wurde in 2 ml einer Ethanollösung gelöst, die 10 μg Dipalmitoylphosphatidylcholin (hergestellt von Sigma) und 5 μg Cholesterin (hergestellt von Sigma) enthielt. In jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen für die Verwendung für ELISAs (hergestellt von Greiner) wurden 20 μl der Lösung (entspricht 20 pMol/Vertiefung) oder 20 μl der Lösung, verdünnt mit Ethanol gefüllt. Danach wurde unter Luftzufuhr getrocknet und anschließend wurde PBS enthaltend 1% BSA (nachstehend bezeichnet als „1% BSA-PBS") zu 100 μl pro Vertiefung zugegeben. Es erfolgte eine Umsetzung bei Raumtemperatur für eine Stunde, um verbleibende aktive Gruppen zu blockieren. Nach dem Verwerfen des 1% BSA-PBS wurden Kulturüberstände von Transformanten oder verdünnte Lösungen von humanisierten Antikörpern zu 50 μl/Vertiefung zugegeben und eine Umsetzung erfolgte eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde jede Vertiefung mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween 20 enthielt (nachstehend bezeichnet als „Tween-PBS"). Dann wurde ein Lösung von mit Peroxidase markiertem Ziege-anti-Mensch-IgG-(γ)Antikörper (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories), eintausendfach mit 1% PBS-BSA verdünnt als sekundäre Antikörperlösung zu 50 μl Vertiefung zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach der Reaktion und anschließendem Waschen mit Tween-PBS wurde eine ABTS-Substratlösung (eine Lösung, die durch Lösen von 0,55 g 2,2'-Azinobis(3-Ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure) in 110,1 M Citratpuffer (pH 4,2) und Zugabe von 1 μl/ml Wasserstoffperoxid direkt vor der Verwendung hergestellt wurde) zu 50 μl/Vertiefung hinzugegeben, um die Farbe zu entwickeln und die Absorption bei 415 nm (nachstehend als „OD415" bezeichnet) gemessen.
  • 2. Konstruktion von cDNAs, die VH und VL von durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern codieren
  • (1) Design von Aminosäuresequenzen von VH und VL von durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern
  • Zunächst wurde eine Aminosäuresequenz von VH eines durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers wie folgt geplant. Um die CDR- Aminosäuresequenzen von VH des in Abschnitt 1 von Beispiel 1 identifizierten anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641 zu verpflanzen, wurde eine FR-Aminosäuresequenz von VH eines menschlichen Antikörpers ausgewählt. Kabat et al. haben die VH verschiedener bekannter menschlicher Antikörper in drei Untergruppen (HSG I bis III) klassifiziert und zwar auf Basis der Homologie der Aminosäuresequenzen und dann über Konsensussequenzen unter den jeweiligen Untergruppen berichtet (Sequences of Proteins of Immunological Interest). Da bei diesen Konsensussequenzen die Möglichkeit besteht, dass die Immunogenität im Menschen vermindert ist wurde entschieden, dass eine VH-Aminosäuresequenz eines durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers auf der Grundlage dieser Konsensussequenzen geplant würde. Um einen durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper mit höherer Aktivität herzustellen, wurde entschieden, eine FR-Aminosäuresequenz auszuwählen, die die höchste Homologie mit der FR-Aminosäuresequenz von VH von KM641, unter den FR-Aminosäuresequenzen der Konsensussequenzen der drei Untergruppen an VH menschlicher Antikörper aufweist. Ergebnisse der Homologiesuche sind in Tabelle 1 dargestellt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, weisen die FR-Aminosäuresequenzen von VH von KM641 die höchste Homologie mit der Untergruppe III auf. Tabelle 1 Homologie zwischen der FR-Aminosäuresequenz der Konsensussequenz jeder Untergruppe der V-Region der H-Kette menschlicher Antikörper und der FR-Aminosäuresequenz der V-Region der H-Kette von KM641
    HSGI HSGII HSGIII
    62,1% 56,3% 78,2%
  • Auf der Grundlage der vorstehenden Ergebnisse wurde eine Aminosäuresequenz HV.0 von VH des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers durch Übertragung der CDR-Aminosäuresequenz der VH des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641 in eine geeignete Position der FR-Aminosäuresequenz der Untergruppe III-Konsensussequenz der VH des menschlichen Antikörpers gestaltet.
  • Daraufhin wurde eine Aminosäuresequenz für die VL des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers wie folgt geplant. Um die CDR-Aminosäuresequenz von VL des in Abschnitt 1 von Beispiel 1 identifizierten anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641 zu übertragen, wurde eine FR-Aminosäuresequenz von VL eines menschlichen Antikörpers ausgewählt. Kabat et al. haben die VL verschiedener bekannter menschlicher Antikörper basierend auf der Homologie der Aminosäuresequenzen in vier Untergruppen (HSG I bis IV) klassifiziert und dann über Konsensussequenzen in den jeweiligen Untergruppen berichtet (Sequences of Proteins of Immunological Interest). Entsprechend wurde wie bei der schweren Kette entschieden, eine FR-Aminosäuresequenz auszuwählen, die die höchste Homologie mit der FR-Aminosäuresequenz von VL von KM641, unter den FR-Aminosäuresequenzen der Konsensussequenzen der vier Untergruppen an VL menschlicher Antikörper aufweist. Ergebnisse der Homologiesuche sind in Tabelle 2 dargestellt. Wie in Tabelle 2 gezeigt, zeigen die FR-Aminosäuresequenzen von VL von KM641 die höchste Homologie mit der Untergruppe I. Tabelle 2 Homologie zwischen der FR-Aminosäuresequenz der Konsensussequenz jeder Untergruppe der V-Region der L-Kette menschlicher Antikörper und der FR-Aminosäuresequenz der V-Region der L-Kette von KM641
    HSGI HSGII HSGIII HSGIV
    76,2% 60,0% 62,5% 67,5%
  • Auf der Grundtage der vorstehenden Ergebnisse wurde eine Aminosäuresequenz LV.0 von VL des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers durch Übertragung der CDR-Aminosäuresequenz der VL des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641 in eine geeignete Position der FR-Aminosäuresequenz der Untergruppe I Konsensussequenz der VL des menschlichen Antikörpers gestaltet.
  • Die so gestalteten Aminosäuresequenzen HV.0 von VH und LV.0 von VL des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper sind Sequenzen, bei denen nur die CDR-Aminosäuresequenzen des anti-GD3-Maus-Antikörpers in die FR-Aminosäuresequenzen des ausgewählten menschlichen Antikörpers übertragen werden. Im Allgemeinen ist die Antigenbindungsaktivität bei menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpern in vielen Fällen vermindert, wenn lediglich die CDR-Aminosäuresequenz des Maus-Antikörpers übertragen wird. Um die Verminderung der Antigenbindungsaktivität von Antikörpern zu vermeiden, werden daher unter den zwischen einem menschlichen Antikörper und einem Maus-Antikörper verschiedenen FR-Aminosäureresten diejenigen, welche vermutlich einen Einfluss auf die Antigenbindungsaktivität ausüben, zusammen mit einer CDR-Aminosäuresequenz übertragen. Dementsprechend wurden FR-Aminosäurereste, welche vermutlich einen Einfluss auf die Aktivität ausüben, identifiziert.
  • Zunächst wurde eine dreidimensionale Struktur einer Antikörper-V-Region, die aus der Aminosäuresequenz HV.0 von VH und der Aminosäuresequenz LV.0 von VL des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers bestand, gestaltet wie vorstehend beschrieben (nachstehend bezeichnet als „HV0LV0"), unter Verwendung von Computermodellierung konstruiert. Die Herstellung der Koordinaten der dreidimensionalen Struktur wurde mit der Software AbM (hergestellt von Oxford Molecular) durchgeführt und die Darstellung der dreidimensionalen Struktur wurde mit der Software Pro-Explore (hergestellt von Oxford Molecular) gemäß den jeweiligen Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Ferner wurde in gleicher Weise ein Computermodell der dreidimensionalen Struktur der V-Region des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641 konstruiert. Darüber hinaus wurde ein Modell der dreidimensionalen Struktur eines modifizierten HV0LV0 mit einer Aminosäuresequenz konstruiert, bei der mindestens ein Aminosäurerest, der unterschiedlich zu einem entsprechenden in der FR-Aminosäuresequenz von VH und VL von HV0LV0 im anti-GD3-Maus-Antikörper KM641 ist, ausgetauscht wurde gegen die Aminosäurereste in den entsprechenden Positionen des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641. Die dreidimensionalen Strukturen der V-Regionen des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641, von HV0LV0 und dem modifizierten Produkt wurden verglichen. Im Ergebnis wurden die Aminosäurereste, welche vermutlich einen Einfluss auf die Antigenbindungsaktivität durch Veränderung der dreidimensionalen Struktur der Antigenbindungsregion ausüben, aus den FR-Aminosäureresten von HV0LV0 ausgewählt. Als ein Resultat des Austausches der so gewählten FR-Aminosäurereste von HV0LV0 durch die in dem Maus-Antikörper KM641 gefundenen Aminosäurereste wurde eine Aminosäuresequenz hKM641H von VH des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers gestaltet, dargestellt durch die SEQ ID Nr.: 9, sowie eine Aminosäuresequenz hKM641L von VL des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers, dargestellt durch die SEQ ID Nr.: 10. Bei hKM641H wurden Gly in Position 10, Leu in Position 11, Leu in Position 20, Thr in Position 28, Asn in Position 84, Thr in Position 91, Tyr in Position 95, Ala in Position 97 und Val in Position 115 der FR-Aminosäuresequenz von HV.0 durch Asp, Phe, Val, Ala, Arg, Ser, Phe, Thr bzw. Leu ausgetauscht, diejenigen Aminosäurereste in den entsprechenden Positionen der VH des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641. Bei hKM641L wurden Tyr in Position 49, Ser in Position 65 und Phe in Position 71 der FR-Aminosäuresequenz von LV.0 durch Tyr, Ser bzw. Phe ausgetauscht, diejenigen Aminosäurereste in den entsprechenden Positionen der VL des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641.
  • (2) Konstruktion einer cDNA, die VH des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers codiert
  • Eine cDNA, die die VH-Aminosäuresequenz hKM641H des in Abschnitt 3(1) von Beispiel 1 gestalteten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers codiert, wurde wie folgt konstruiert.
  • Zunächst wurde die so gestaltete Aminosäuresequenz mit der sekretorischen Signalsequenz der H-Kette des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641, dargestellt durch SEQ ID Nr.: 1 ligiert, wodurch eine vollständige Antikörper-Aminosäuresequenz hergestellt wurde. Anschließend wurde die Aminosäuresequenz in genetische Codons umgewandelt. Wenn es zwei oder mehr genetische Codons für einen Aminosäurerest gab, wurde das entsprechende genetische Codon durch Berücksichtigung der Häufigkeit der Codonverwendung bestimmt, die in den Nucleotidsequenzen von Antikörpergenen gefunden wird (Sequences of Proteins of Immunological Interest). Eine Nucleotidsequenz der cDNA, die die gesamte Antikörper-V-Region-Aminosäuresequenz codiert, wurde durch Ligation der so bestimmten genetischen Codons gestaltet und Nucleotidsequenzen von Primerbindungsstellen zur Verwendung in der PCR-Amplifikation (einschließlich Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme zur Clonierung in einen Expressionsvektor für einen humanisierten Antikörper) wurden an das 5'-Ende und das 3'-Ende angefügt. Die so gestaltete Nucleotidsequenz wurde vom 5'-Ende her in insgesamt 6 Nukleotidsequenzen aufgeteilt, von denen jede etwa 100 Basen aufwies (aneinander grenzende Nucleotidsequenzen wurden so gestaltet, dass die Enden sich über etwa 20 Basen hinweg überlappten). Sie wurden in abwechselnder Reihenfolge hinsichtlich der Sinn-Kette und der Anti-Sinn-Kette synthetisiert, wobei ein automatisches DNA-Synthesegerät eingesetzt wurde (380A, hergestellt von Applied Biosystems).
  • Insbesondere wurden 6 synthetische DNA-Fragmente von SEQ ID Nr.: 11 bis SEQ ID Nr.: 16 synthetisiert. Jede DNA wurde zu 50 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,001% Gelaine, 200 μM dNTPs, 0,5 μM M13-Primer RV (hergestellt von Takara Shuzo, 0,5 μM M13-Primer M4 (hergestellt von Takara Shuzo) und 2 Einheiten TaKaRa Taq-DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo) enthielt, wodurch eine Endkonzentration von 0,1 μM erhalten wurde. Die Lösung wurde mit 50 μl Mineralöl überdeckt und in einen DNA-Thermalzyklusgerät (PJ480, hergestellt von Perkin Elmer) gesetzt, um 30 Zyklen der Reaktion durchzuführen, wobei jeder Zyklus 2 Minuten bei 94°C, 2 Minuten bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C einschloss. Die Reaktionslösung wurde unter Verwendung des QIAquick PCR-Reinigungskits (hergestellt von Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt und in 30 μl eines Puffers gelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01% Triton X-100 enthielt und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden weiterhin zugegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 0,2 μg eines ApaI-NotI-Fragmentes von etwa 0,44 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pBluescript SK(–) zu 10 μl eines Puffers zugegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01% Triton X-100 enthielt und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden weiterhin zugegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines ApaI-NotI-Fragmentes von etwa 2,95 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments des PCR-Produktes der VH des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers und 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments des Plasmids pBluescript SK(–), beide wir vorstehend beschrieben erhalten, zu 20 μl Gesamtvolumen sterilem Wasser zugegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Mit der so erhaltenen Lösung an rekombinanter Plasmid-DNA wurde die Escherichia coli-Linie HB 101 transformiert. Von 10 Clonen der Transformanten wurde Plasmid-DNA präpariert und mit dem AutoRead Sequenzierkit (hergestellt von Pharmacia) gemäß der Anleitung des Herstellers umgesetzt. Anschließend wurde die Nucleotidsequenz mit dem A. L. F. DNA-Sequenziergerät (hergestellt von Pharmacia) gemäß Anleitung des Herstellers unter Durchführung einer Elektrophorese ermittelt. Im Ergebnis wurde das in 1 dargestellte Plasmid phKM641H mit der interessierenden Nucleotidsequenz erhalten.
  • (3) Konstruktion einer cDNA, die VL des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers codiert
  • Eine cDNA, die die VL-Aminosäuresequenz hKM641L des in Abschnitt 3(1) von Beispiel 1 gestalteten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers codiert, wurde wie folgt konstruiert, wobei PCR in gleicher Weise wie bei VH eingesetzt wurde. Im diesem Falle wurde die Aminosäuresequenz der L-Kette des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641, dargestellt durch die SEQ ID Nr.: 2, als sekretorische Signalsequenz eingesetzt.
  • Zunächst wurden 6 synthetische DNA-Fragmente von SEQ ID Nr.: 17 bis SEQ ID Nr.: 22 synthetisiert, wobei ein automatisches DNA-Synthesegerät (380A, hergestellt von Applied Biosystems) eingesetzt wurde. Jedes der so hergestellten DNA-Fragmente wurde zu 50 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,001% Gelaine, 200 μM dNTPs, 0,5 μM M13-Primer RV (hergestellt von Takara Shuzo), 0,5 μM M13-Primer M4 (hergestellt von Takara Shuzo) und 2 Einheiten TaKaRa Taq-DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo) enthielt, wodurch eine Endkonzentration von 0,1 μM erhalten wurde. Die Lösung wurde mit 50 μl Mineralöl überdeckt und in einen DNA-Thermalzyklusgerät (PJ480, hergestellt von Perkin Elmer) gesetzt, um 30 Zyklen der Reaktion durchzuführen, wobei jeder Zyklus 2 Minuten bei 94°C, 2 Minuten bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C einschloss. Die Reaktionslösung wurde unter Verwendung des QIAquick PCR-Reinigungskits (hergestellt von Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt und in 30 μl eines Puffers gelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthielt. 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und SplI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 0,2 μg eines EcoRI-SplI-Fragmentes von etwa 0,39 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pBSL3, beschrieben in der veröffentlichten, nicht geprüften japanischen Patentanmeldung 257893/98 , zu 10 μl eines Puffers zugegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und des Restriktionsenzyms SplI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines EcoRI-SplI-Fragmentes von etwa 2,95 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments des PCR-Produktes der VL des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3 Antikörpers und 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments des Plasmids pBSL3, beide wir vorstehend beschrieben erhalten, zu 20 μl Gesamtvolumen sterilem Wasser zugegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Mit der so erhaltenen Lösung an rekombinanter Plasmid-DNA wurde die Escherichia coli-Linie HB 101 transformiert. Von 10 Clonen der Transformanten wurde Plasmid-DNA präpariert und mit dem AutoRead Sequenzierkit (hergestellt von Pharmacia) gemäß der Anleitung des Herstellers umgesetzt. Anschließend wurde die Nucleotidsequenz mit dem A. L. F. DNA-Sequenziergerät (hergestellt von Pharmacia) gemäß Anleitung des Herstellers unter Durchführung einer Elektrophorese ermittelt. Im Ergebnis wurde das in 2 dargestellte Plasmid phKM641L mit der interessierenden Nucleotidsequenz erhalten.
  • 3. Bewertung der Aktivität des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers durch transiente Expression unter Verwendung von Tierzellen
  • Um die Bewertung der Aktivität des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers schneller durchzuführen, wurde eine transiente Expression des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers unter Verwendung von COS-7 Zellen (ATCC CRL 1651) wie folgt ausgeführt.
  • (1) Konstruktion des Expressionsvektors pT641 für die transiente Expression des chimären anti-GD3 Antikörpers KM871
  • Um ihn als eine positive Kontrolle für die Bewertung der Aktivität des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers durch transiente Expression zu verwenden, wurde der Expressionsvektor pT641 für die transiente Expression des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 wie folgt konstruiert.
  • Da die Effizienz der transienten Expression bei Verwendung von tierischen Zellen allgemein von der Anzahl der Kopien des eingeführten Expressionsvektors abhängt, wurde überlegt, dass ein kleinerer Expressionsvektor eine höhere Expressionseffizienz aufweist. Dementsprechend wurde der transiente Expressionsvektor pT641 für den chimären anti-GD3-Antikörper KM871 wie folgt konstruiert, wobei der transiente Expressionsvektor pT796 für den chimären anti-Gangliosid-GM2-Antikörper KM966, beschrieben in der, veröffentlichten, nicht geprüften japanischen Patentanmeldung 257893/98 und das Plasmid pKM641HF1 mit der VH des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641 wie auch das Plasmid pKM641LA2 mit der VL des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641, beschrieben in der veröffentlichten, nicht geprüften japanischen Patentanmeldung 304989/93 eingesetzt wurden.
  • Zunächst wurden 3 μg Plasmid pKM641LA2 mit der VL des anti-GD3-Maus-Antikörpers KM641, beschrieben in der veröffentlichten, nicht geprüften japanischen Patentanmeldung 304989/93 zu 10 μl eines Puffers enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT zugegeben und die Lösung wurde ferner gemischt mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (hergestellt von Takara Shuzo, wodurch die Reaktion eine Stunde bei 37°C durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt und zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT enthielt und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden weiterhin zugegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 0,2 μg eines HindIII-EcoRI-Fragmentes von etwa 0,35 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des transienten Expressionsvektors pT796 für den chimären anti-Gangliosid-GM2-Antikörper KM966, beschrieben in der veröffentlichten, nicht geprüften japanischen Patentanmeldung 257893/98 , zu 10 μl eines Puffers zugegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und des Restriktionsenzyms SplI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner zu der Lösung gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines EcoRI-SplI-Fragmentes von etwa 9,20 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden synthetische DNA-Fragmente mit den in den SEQ ID Nr.: 23 und 24 dargestellten Nucleotidsequenzen mit einem automatischen DNA-Synthesegerät (380A, hergestellt von Applied Biosystems) synthetisch hergestellt. 0,3 μg von jedem der so erhaltenen synthetischen DNA-Fragmente wurden zu 15 μl sterilem Wasser gegeben und 5 Minuten auf 65°C erhitzt. Die Reaktionslösung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, anschließend mit 2 μl einer 10 × Pufferlösung (500 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT) und 2 μl 10 mM ATP gemischt und dann mit 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase gemischt, wodurch die Reaktion 30 Minuten bei 37°C für die Phosphorylierung des 5'-Endes durchgeführt wurde.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des HindIII-EcoRI-Fragments, abgeleitet vom Plasmid pKM641LA2, 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments, abgeleitet vom Plasmid pT796 und 0,05 μg der phosphorylierten synthetischen DNA, wir vorstehend beschrieben erhalten, zu 20 μl Gesamtvolumen sterilem Wasser zugegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Mit der so erhaltenen Lösung an rekombinanter Plasmid-DNA wurde E. coli HB 101 transformiert, wodurch das Plasmid pT796H641L, dargestellt in 3, erhalten wurde. Das so erhaltene Plasmid (10 μg) wurde mit dem AutoRead Sequenzierkit (hergestellt von Pharmacia) gemäß der Anleitung des Herstellers umgesetzt. Anschließend wurde die Nucleotidsequenz mit dem A. L. F. DNA-Sequenziergerät (hergestellt von Pharmacia) gemäß Anleitung des Herstellers unter Durchführung einer Elektrophorese ermittelt. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass ein Plasmid erhalten worden war, in das die interessierende DNA cloniert worden war.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pBluescript SK(–) (hergestellt von. Stratagene) zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XbaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 30 μl eines Puffers gegeben, der 30 mM Natriumacetat (pH 5,0), 100 mM Natriumchlorid, 1 mM Zinkacetat und 5% Glycerin enthielt. Ferner zugemischt wurden 30 Einheiten des modifizierenden Enzyms Mungbohnen-Nuclease (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 25°C für 15 Minuten durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden weiterhin zugemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines ApaI-Fragments mit glatten Enden von etwa 2,95 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Als nächstes wurden 3 μg des Plasmids pKM641HF1 zu 10 μl eines Puffers enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT zugegeben und der Lösung wurden ferner 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) zugemischt, wodurch die Reaktion 1 Stunde bei 37°C durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt und das 5'-überstehende, durch den Restriktionsverdau gebildete Ende wurde unter Verwendung des „DNA Blunting Kit" (hergestellt von Takara Shuzo) in ein glattes Ende überführt. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt und zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden weiterhin zugemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 0,2 μg eines ApaI-Fragmentes von etwa 0,44 kB mit glatten Enden mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg des ApaI-Fragments mit glatten Enden, abgeleitet aus dem Plasmid pBluescript SK(–) und 0,1 μg des ApaI-Fragments mit glatten Enden, abgeleitet aus dem Plasmid pKM641HF1, wie vorstehend beschrieben erhalten, zu einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilem Wasser zugegeben und mit Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB 101 transformiert, wodurch das in 4 gezeigte Plasmid pBS641H erhalten wurde.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pT796H641L, wie vorstehend beschrieben erhalten, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA sowie 0,01 % Triton X-100 enthielt. Ferner zugemischt wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 0,2 μg eines ApaI-NotI-Fragments von etwa 9,16 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pBS641H, wie vorstehend beschrieben erhalten, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner zu der Lösung gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA sowie 0,01 % Triton X-100 enthielt. Ferner zugemischt wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines ApaI-NotI-Fragments von etwa 0,44 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments, abgeleitet aus dem Plasmid pT796H641L und 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments, abgeleitet aus dem Plasmid pBS641H, wie vorstehend beschrieben erhalten, zu einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilem Wasser zugegeben und mit Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB 101 transformiert, wodurch das in 5 gezeigte Plasmid pT641 erhalten wurde.
  • (2) Konstruktion des Expressionsvektors für die transiente Expression des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM871
  • Ein transienter Expressionsvektor für den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper wurde wie folgt konstruiert, wobei der in Abschnitt 4(1) von Beispiel 1 beschriebene transiente Expressionsvektor pT641 für den chimären anti-GD3-Antikörper und die Plasmide phKM641H und phKM641L, beschrieben in den Abschnitten 3(2) und (3) von Beispiel 1, eingesetzt wurden.
  • Zunächst wurden 3 μg des Plasmids phKM641H, wie vorstehend in Abschnitt 3(2) von Beispiel 1 beschrieben erhalten, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner zu der Lösung gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA sowie 0,01% Triton X-100 enthielt. Ferner zugemischt wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 0,2 μg eines ApaI-NotI-Fragments von etwa 0,44 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pT641, wie vorstehend in Abschnitt 4(1) von Beispiel 1 beschrieben erhalten, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner zu der Lösung gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA sowie 0,01% Triton X-100 enthielt. Ferner zugemischt wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines ApaI-NotI-Fragments von etwa 9,16 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments, abgeleitet aus dem Plasmid phKM641H und 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments, abgeleitet aus dem Plasmid pT641 zu einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilem Wasser gegeben und mit Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB 101 transformiert, wodurch das in 6 gezeigte Plasmid pT641HCDR erhalten wurde.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids phKM641L, wie vorstehend in Abschnitt 3(3) von Beispiel 1 beschrieben erhalten, zu 10 μl eines Puffers zugegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und des Restriktionsenzyms SplI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner zu der Lösung gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 0,2 μg eines EcoRI-SplI-Fragmentes von etwa 0,39 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden je 3 μg des Plasmids pT641, wie vorstehend in Abschnitt 4(1) von Beispiel 1 beschrieben erhalten, und des Plasmids pT641HCDR, wie vorstehend erhalten, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und des Restriktionsenzyms SplI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines EcoRI-SplI-Fragmentes von etwa 9,20 kB, abgeleitet von beiden Plasmiden, mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments, abgeleitet aus dem Plasmid phKM641L und 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments, abgeleitet aus dem wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmid pT641 zu einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilem Wasser gegeben und mit Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Ferner wurden 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments, abgeleitet aus dem Plasmid phKM641L und 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments, abgeleitet aus dem wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmid pT641HCDR zu einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilem Wasser gegeben und mit Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB 101 transformiert, wodurch die in 7 dargestellten Plasmide pT641LCDR und pT641HLCDR erhalten wurden.
  • (3) Bewertung der Aktivität des chimären anti-GD3-Antikörpers und des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers durch transiente Expression unter Verwendung von tierischen Zellen
  • Die transiente Expression der Antikörper wurde mit dem transienten Expressionsvektor pT641 für den chimären anti-GD3-Antikörper, mit dem transienten Expressionsvektor pT641 HLCDR für den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper und den transienten Expressionsvektoren pT641HCDR und pT641LCDR für die anti-GD3-Hybrid-Antikörper mit V-Regionen eines Maus-Antikörpers und CDRs, die aus einem menschlichen Antikörper übertragen worden waren, erhalten in den Abschnitten 4(1) und (2) von Beispiel 1, durchgeführt.
  • COS-7 Zellen (ATCC CRL 1651) wurden bei einer Dichte von 1 × 105 Zellen/ml in 2 ml in eine Platte mit 6 Vertiefungen (hergestellt von Falcon) verteilt und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Durch Zugabe von 2 μg von jedem Expressionsvektor zu 100 μl OPTI-MEM Medium (hergestellt von GIBCO BRL) und weitere Zugabe einer Lösung, in der 10 μl des LIPOFECTAMINE-Reagens (hergestellt von GIBCO BRL) zu 100 μl OPTI-MEM Medium gegeben wurden, wurde die Reaktion 40 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt, wodurch die Bildung eines DNA-Liposomen-Komplexes erreicht wurde. Die über Nacht kultivierten COS-7-Zellen wurden zweimal mit 2 ml des OPTI-MEM Mediums (hergestellt von GIBCO BRL) gewaschen, mit einer Lösung gemischt, die durch Zugabe von 0,8 ml OPTI-MEM Medium zu der den Komplex enthaltenden Lösung hergestellt wurde und 7 Stunden bei 37°C gezüchtet. Dann wurde die Lösung verworfen, die Zellen wurden mit 2 ml 10% FBS enthaltendem DME-Medium (hergestellt von GIBCO-BRL) gemischt und bei 37°C kultiviert. Nach der Einführung jedes Expressionsvektors wurde der Kulturüberstand 72 Stunden später gewonnen, bei Bedarf konzentriert und die Bindungsaktivität des humanisierten anti-GD3-Antikörpers für GD3 (hergestellt von DIA-IATRON) im Kulturüberstand mit dem in Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschriebenen ELISA-Verfahren gemessen. Dabei wurde die Konzentration des humanisierten anti-GD3-Antikörpers im Kulturüberstand mit dem nachstehend in Abschnitt 4 beschriebenen ELISA-Verfahren ermittelt und die Aktivität anhand der gemessenen Werte als relative Aktivität (%) berechnet, wobei die Aktivität der positiven Kontrolle des chimären anti-GD3-Antikörpers als 100 definiert wurde. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Wie in 8 gezeigt, wies der vom transienten Expressionsvektor pT641HCDR stammende anti-GD3-Hybrid-Antikörper (VH stammt von einem menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper und VL stammt von einem chimären Antikörper) fast die gleiche Bindungsaktivität auf wie der vom transienten Expressionsvektor pT641 stammende anti-GD3-Hybrid-Antikörper. Allerdings zeigte der vom transienten Expressionsvektor pT641LCDR stammende anti-GD3-Hybrid-Antikörper (VH stammt von einem chimären Antikörper und VL stammt von einem menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper) eine Bindungsaktivität, die bei etwa 50% derjenigen des chimären anti-GD3-Antikörpers lag. Darüber hinaus zeigte der durch CDR-grafting erzeugte, vom transienten Expressionsvektor pT641 HLCDR stammende anti-GD3-Antikörper eine Bindungsaktivität, die lediglich bei etwa 5% derjenigen des chimären anti-GD3-Antikörpers lag, was eine beträchtliche Minderung der Aktivität bedeutet.
  • Im Ergebnis ist die Bindungsaktivität des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers mit den in Abschnitt 3(1) von Beispiel 1 gestalteten VH und VL stark vermindert und die Hauptursache der Aktivitätsminderung wird der VL zugeschrieben. Da jedoch etwa 50% der Aktivität durch ihre Kombination mit der VH des chimären anti-GD3-Antikörpers gefunden wird, wurde vorgeschlagen, dass es ein Problem insbesondere in dem mit der VH interagierenden Bereich gibt. Dementsprechend wurde ein Versuch unternommen, die Aktivität des Antikörpers dadurch zu erhöhen, dass die Aminosäurereste der in Abschnitt 3(1) von Beispiel 1 gestalteten VL weiter modifiziert wurden.
  • (4) Messung der Konzentration an humanisiertem Antikörper im Kulturüberstand der transienten Expression mittels ELISA
  • Eine durch 400-fache Verdünnung eines Ziege-anti-Mensch-IgG-Antikörpers (γ-Kette; hergestellt von Medical & Biological Laboratories) in PBS hergestellte Lösung (50 μl) wurde in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen für die Durchführung eines ELISA (hergestellt von Greiner) gegeben. Die Umsetzung der Reaktion erfolgte über Nacht bei 4°C. Nach dem Verwerfen der Antikörperlösung wurde 1% BSA-PBS zu 100 μl/Vertiefung zugegeben und die Reaktion erfolgte 1 Stunde bei Raumtemperatur, wodurch die verbleibenden aktiven Gruppen blockiert wurden. Nach dem Verwerfen des 1% BSA-PBS wurden die in Abschnitt 4(3) von Beispiel 1 erhaltenen Kulturüberstände der transienten Expression oder verdünnte Lösungen des gereinigten chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 ad 50 μl/Vertiefung zugegeben und die Reaktion erfolgte 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde jede Vertiefung mit Tween-PBS gewaschen und anschließend eine Lösung zu 50 μl/Vertiefung zugegeben, die durch 500-fache Verdünnung eines mit Peroxidase markierten Maus-anti-Mensch-K-L-Kette-Antikörpers (hergestellt von Zymed) in PBS hergestellt worden war. Die Reaktion erfolgte 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion und anschließendem Waschen mit Tween-PBS wurde eine ABTS-Substratlösung (eine Lösung, die durch Lösen von 0,55 g 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6 Sulfonsäure) in 1 L 0,1 M Citratpuffer (pH 4,2) und Zugabe von 1 μl/ml Wasserstoffperoxid direkt vor der Verwendung hergestellt worden war) zu 50 μl/Vertiefung zugesetzt, um die Farbe zu entwickeln und die OD415 wurde gemessen.
  • 4. Erhöhung der Bindungsaktivität durch Modifizierung von Aminosäureresten der VL des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antkörpers
  • Die Erhöhung der Bindungsaktivität durch Modifizierung von Aminosäureresten der VL des durch CDR-grafting erzeugten, in Abschnitt 3(1) von Beispiel 1 gestalteten anti-GD3-Antikörpers wurde wie folgt durchgeführt.
  • (1) Modifikation von Aminosäureresten der VL des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers und Konstruktion einer cDNA, die die modifizierte VL codiert
  • Zuerst wurden Aminosäurereste, die im Interaktionsbereich von VH und VL befindlich sind und Aminosäurereste, von denen man annimmt, dass sie die dreidimensionale Struktur von jeder CDR der VL beeinflussen und die sich von den Aminosäureresten des Maus-Antikörpers in der VL des menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers unterscheiden, mit Hilfe von Computermodellen der dreidimensionalen Strukturen verschiedener Antikörper, die in Abschnitt 3(1) von Beispiel 1 konstruiert worden waren, identifiziert. Im Ergebnis wurde Ser in Position 7, Pro in Position 8, Ser in Position 12, Gly in Position 41, Pro in Position 44, Thr in Position 72, Ser in Position 77, Phe in Position 83 und Tyr in Position 87 von hKM641L als der Aminosäuresequenz von VL des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers, dargestellt durch SEQ ID Nr.: 10, identifiziert. Durch Austausch dieser Aminosäurereste gegen im Maus-Antikörper gefundene Aminosäurereste wurden 8 VL des modifizierten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers gestaltet. Das bedeutet, dass Pro in Position 8, Ser in Position 12, Pro in Position 44 und Tyr in Position 87 in der Aminosäuresequenz von hKM641L durch Ala, Pro, Val und Phe im Falle von hKM641NL und Ser in Position 7, Pro in Position 8 und Ser in Position 12 in der Aminosäuresequenz von hKM641L durch Thr, Ala und Pro im Falle von hKM641Lm-1, Tyr in Position 87 in der Aminosäuresequenz von hKM641L durch Phe im Falle von hKM641Lm-4, Gly in Position 41 und Pro in Position 44 in der Aminosäuresequenz von hKM641L durch Asp und Val im Falle von hKM641Lm-6, Thr in Position 72, Ser in Position 77 und Phe in Position 83 in der Aminosäuresequenz von hKM641L durch Ser, Ala und Ile im Falle von hKM641Lm-7, Ser in Position 77 in der Aminosäuresequenz von hKM641L durch Asn im Falle von hKM641Lm-8, Phe in Position 83 und Tyr in Position 87 in der Aminosäuresequenz von hKM641L durch Ile und Phe im Falle von hKM641Lm-9, Gly in Position 41, Pro in Position 44 und Phe in Position 83 in der Aminosäuresequenz von hKM641L durch Asp, Val und Ile im Falle von hKM641Lm-69 ausgetauscht wurden. Unter diesen modifizierten VL wurden cDNAs wie folgt durch PCR-assistierte Mutagenese konstruiert, die mit Ausnahme von hKM641NL und hKM641Lm-69 alle 6 modifizierten VL codieren. Für die Einführung der Mutationen wurde somit Antisinn-Ketten- und Sinn-Ketten-DNA-Primer mit einem automatischen DNA-Synthesegerät (380A, hergestellt von Applied Biosystems) synthetisiert. Eine erste PCR wurde gemäß dem in Abschnitt 3(2) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei 1 ng des Plasmids phKM641L als Matrize sowie 0,5 μM (Endkonzentration) M13-Primer RV (hergestellt von Takara Shuzo) und der Antisinn-Kette-DNA-Primer und M13-Primer M4 (hergestellt von Takara Shuzo) und der Sinn-Kette-DNA-Primer eingesetzt wurden. Sämtliche Reaktionslösungen wurden mit dem QIAquick PCR-Reinigungskit (hergestellt von Qiagen) gemäß Herstelleranleitung aufgereinigt, wobei mit 20 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) eluiert wurde. Anschließend wurde eine zweite PCR mit 5 μl von jedem Eluat gemäß dem in Abschnitt 3(2) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde mit dem QIAquick PCR-Reinigungskit (hergestellt von Qiagen) gemäß Herstelleranleitung aufgereinigt und in 30 μl eines Puffers überführt, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) enthielt und das Restriktionsenzym SplI (hergestellt von Takara Shuzo) wurde ferner zugegeben, wodurch die Reaktion 1 Stunde bei 37°C durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 0,2 μg eines EcoRI-SplI-Fragments von etwa 0,39 kB unter Verwendung des QIAquick Gelextraktionskits (hergestellt von Qiagen) gemäß Herstelleranleitung erhalten wurden.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments der PCR-Produktes der VL des modifizierten, wie vorstehend erhaltenen, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers und 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments des Plasmids pBSL3, erhalten wie in Abschnitt 3(3) von Beispiel 1 beschrieben, zu 20 μl Gesamtvolumen sterilem Wasser gegeben und mit Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert. Plasmid-DNA wurde von 10 Transformantenclonen präpariert und mit dem AutoRead Sequenzierkit (hergestellt von Pharmacia) gemäß der Anleitung des Herstellers umgesetzt. Anschließend wurde die Nucleotidsequenz mit dem A. L. F. DNA-Sequenzierer (hergestellt von Pharmacia) unter Durchführung einer Elektrophorese ermittelt. Es wurde ein Plasmid mit einer cDNA erhalten, bei der die beabsichtigte Modifikation umgesetzt worden war.
  • Insbesondere wurde ein Plasmid phKM641Lm-1 mit der in der SEQ ID Nr.: 27 dargestellten Nucleotidsequenz erhalten, wobei eine Reihe der vorstehend beschriebenen Arbeitsvorgänge durchgeführt wurden und die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 25 als Antisinn-Kette-DNA-Primer und die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 26 als Sinn-Kette-DNA-Primer eingesetzt wurden. hKM641Lm-1 als durch die Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz ist ebenfalls in der SEQ ID Nr.: 27 dargestellt.
  • Ein Plasmid phKM641Lm-4 mit der in der SEQ ID Nr.: 30 dargestellten Nucleotidsequenz wurde durch Durchführung einer Reihe der vorstehend beschriebenen Arbeitsvorgänge erhalten, wobei die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 28 als Antisinn-Kette-DNA-Primer und die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 29 als Sinn-Kette-DNA-Primer eingesetzt wurden. hKM641Lm-4 als durch die Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz ist ebenfalls in der SEQ ID Nr.: 30 dargestellt.
  • Ein Plasmid phKM641Lm-6 mit der in der SEQ ID Nr.: 33 dargestellten Nucleotidsequenz wurde durch Durchführung einer Reihe der vorstehend beschriebenen Arbeitsvorgänge erhalten, wobei die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 31 als Antisinn-Kette-DNA-Primer und die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 32 als Sinn-Kette-DNA-Primer eingesetzt wurden. hKM641Lm-6 als durch die Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz ist ebenfalls in der SEQ ID Nr.: 33 dargestellt.
  • Ein Plasmid phKM641Lm-7 mit der in der SEQ ID Nr.: 36 dargestellten Nucleotidsequenz wurde durch Durchführung einer Reihe der vorstehend beschriebenen Arbeitsvorgänge erhalten, wobei die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 34 als Antisinn-Kette-DNA-Primer und die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 35 als Sinn-Kette-DNA-Primer eingesetzt wurden. hKM641Lm-7 als durch die Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz ist ebenfalls in der SEQ ID Nr.: 36 dargestellt.
  • Ein Plasmid phKM641Lm-8 mit der in der SEQ ID Nr.: 39 dargestellten Nucleotidsequenz wurde durch Durchführung einer Reihe der vorstehend beschriebenen Arbeitsvorgänge erhalten, wobei die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 37 als Antisinn-Kette-DNA-Primer und die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 38 als Sinn-Kette-DNA-Primer eingesetzt wurden. hKM641Lm-8 als durch die Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz ist ebenfalls in der SEQ ID Nr.: 39 dargestellt.
  • Ein Plasmid phKM641Lm-9 mit der in der SEQ ID Nr.: 42 dargestellten Nucleotidsequenz wurde durch Durchführung einer Reihe der vorstehend beschriebenen Arbeitsvorgänge erhalten, wobei die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 40 als Antisinn-Kette-DNA-Primer und die synthetische DNA von SEQ ID Nr.: 41 als Sinn-Kette-DNA-Primer eingesetzt wurden. hKM641Lm-9 als durch die Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz ist ebenfalls in der SEQ ID Nr.: 42 dargestellt.
  • Unter den modifizierten VL wurde die hKM641NL codierende cDNA durch Synthese von 6 synthetisch hergestellten DNA-Fragmenten der SEQ ID Nummern: 17, 22 und 43 bis 46 unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegerätes (380A, hergestellt von Applied Biosystems) und Durchführung des in Abschnitt 3(3) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens und Einsatz dieser Fragmente konstruiert. Im Ergebnis wurde ein Plasmid phKM641NL mit der in der SEQ ID Nr.: 47 dargestellten Nucleotidsequenz erhalten, in dem die gewünschte Modifikation umgesetzt war. hKM641NL als durch die Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz ist ebenfalls in der SEQ ID Nr.: 47 dargestellt.
  • Unter den modifizierten VL wurde die hKM641Lm-69 codierende cDNA wie folgt erhalten, wobei die wie vorstehend erhaltenen Plasmide phKM641Lm-6 und phKM641Lm-9 mit einer modifizierte VL codierenden cDNA eingesetzt wurden.
  • Zunächst wurden 3 μg des Plasmids phKM641Lm-6 zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und PstI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 0,3 μg eines EcoRI-PstI-Fragments von etwa 0,30 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids phKM641Lm-9 zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und PstI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines EcoRI-PstI-Fragments von etwa 3,05 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-PstI-Fragments, abgeleitet aus dem Plasmid phKM641Lm-6 und 0,1 μg des EcoRI-PstI-Fragments, abgeleitet aus dem Plasmid phKM641Lm-9, jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten, zu einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilem Wasser gegeben und mit Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB 101 transformiert, wodurch das in 9 dargestellte Plasmid phKM641Lm-69 erhalten wurde. Die Reaktion wurde mit 10 μg des so erhaltenen Plasmids mit dem AutoRead Sequenzierkit (hergestellt von Pharmacia) gemäß der Anleitung des Herstellers umgesetzt. Anschließend wurde die Nucleotidsequenz mit dem A. L. F. DNA-Sequenzierer (hergestellt von Pharmacia) gemäß Anleitung des Herstellers unter Durchführung einer Elektrophorese des erhaltenen Gemisches ermittelt. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass es die Nucleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 48 aufweist, in der die beabsichtigte Modifikation umgesetzt worden war. phKM641Lm-69 als durch die Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz ist ebenfalls in der SEQ ID Nr.: 48 dargestellt.
  • (2) Konstruktion eines transienten Expressionsvektors für durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper mit modifizierten VL
  • Transiente Expressionsvektoren für durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper mit verschiedenen modifizierten VL wurden wie folgt konstruiert, wobei die Plasmide mit cDNA-Molekülen, die verschiedene modifizierte VL codieren, erhalten wie in Abschnitt 5(1) von Beispiel 1 beschrieben, und der transiente Expressionsvektor pT641HCDR für anti-GD3-Hybrid-Antikörper, erhalten in Abschnitt 4(2) von Beispiel 1, eingesetzt wurden.
  • Zunächst wurden jeweils 3 μg der Plasmide phKM641NL, phKM641Lm-1, phKM641Lm-4, phKM641Lm-6, phKM641Lm-7, phKM641Lm-8, phKM641Lm-9 und phKM641Lm-69, wie vorstehend in Abschnitt 5(1) von Beispiel 1 beschrieben erhalten, zu 10 μl eines Puffers zugegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) und des Restriktionsenzyms SplI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 0,2 μg eines EcoRI-SplI-Fragmentes von etwa 0,39 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg von jedem der so erhaltenen EcoRI-SplI-Fragmente der verschiedenen modifizierten VL und 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments des transienten Expressionsvektors pT641HCDR für den anti-GD3-Hybrid-Antikörper, erhalten wie beschrieben in Abschnitt 4(2) von Beispiel 1 zu einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilem Wasser gegeben und mit Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Mit den so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösungen wurde E. coli HB 101 transformiert, wodurch die in 10 dargestellten transienten Expressionsvektoren für durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper mit unterschiedlich modifizierten VL, pT641HLCDRNL, pT641HLCDRLm-1, pT641HLCDRLm-4, pT641HLCDRLm-6, pT641HLCDRLm-7, pT641HLCDRLm-8, pT641HLCDRLm-9 und pT641HLCDRLm-69 erhalten wurden.
  • (3) Bewertung der Aktivität des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers mit modifizierten VL durch transiente Expression unter Verwendung von tierischen Zellen
  • Die transiente Expression und Bewertung von allen Antikörpern wurde gemäß den in Abschnitt 4(3) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren mit dem transienten Expressionsvektor pT641 für den chimären anti-GD3-Antikörper und dem transienten Expressionsvektor pT641HLCDR für den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper durchgeführt, beide erhalten wie in Abschnitt 4(2) von Beispiel 1 beschrieben, sowie mit den transienten Expressionsvektoren pT641HLCDRNL, pT641HLCDRLm-1, pT641HLCDRLm-4, pT641HLCDRLm-6, pT641HLCDRLm-7, pT641HLCDRLm-8; pT641HLCDRLm-9 und p641HLCDRLm-69 für durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper mit unterschiedlichen modifizierten VL, erhalten wie in Abschnitt 5(2) von Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in 11 dargestellt. Wie in 11 gezeigt, zeigten die modifizierten, durch CDR-grafting erzeugten und von den transienten Expressionsvektoren pT641HLCDRLm-6, pT641HLCDRLm-7, pT641HLCDRLm-9 und pT641HLCDRLm-69 stammenden anti-GD3-Antikörper eine erhöhte Bindungsaktivität im Vergleich zu den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern vor der Modifikation. Insbesondere zeigte der modifizierte, durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper, der von dem transienten Expressionsvektor pT641HLCDRLm-69 abgeleitet war, eine Bindungsaktivität von etwa 80% im Vergleich zu dem chimären anti-GD3-Antikörper. Andererseits zeigten die modifizierten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper, die von anderen transienten Expressionsvektoren stammten, keine erhöhte Bindungsaktivität im Vergleich zu den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern vor der Modifikation. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde gefunden, dass unter den modifizierten Aminosäureresten der VL, die in Abschnitt 5(1) von Beispiel 1 identifiziert wurden, die Position 41, die Position 44, die Position 83 und die Position 87 unter den Aminosäureresten in hohem Maße zu der Erhöhung der Bindungsaktivität beitragen. Darüber hinaus wurde gefunden, dass der gleichzeitige Austausch von zwei Aminosäureresten in der Position 41 und der Position 44, oder der Position 83 und der Position 87 zu einer synergistischen Erhöhung der Aktivität beiträgt und dass die gleichzeitige Modifikation von vier Aminosäureresten in den Positionen 41, 44, 83 und 87 ebenfalls zu einer synergistischen Erhöhung der Aktivität beiträgt. Auf der Grundlage der Computermodelle der dreidimensionalen Strukturen von V-Regionen verschiedener in Abschnitt 3(1) von Beispiel 1 konstruierter Antikörper wurde vorgeschlagen, dass die Aminosäurereste in Position 41 und Position 44 einen Einfluss auf die Interaktion mit VH haben und die Aminosäurereste in Position 83 und 87 auf die dreidimensionale Struktur der CDR3 von VL. Es wurde in Erwägung gezogen, dass die dreidimensionale Struktur eines Antikörpers als Ganzes in geeigneter Weise beibehalten wird, wenn diese Aminosäurereste in Aminosäurereste umgewandelt werden, die in einem Maus-Antikörper gefunden werden, wodurch im Ergebnis die Bindungsaktivität erhöht wird. Diese Information zeigt, dass es notwendig ist, die interagierenden Regionen von VH und VL auch in Betracht zu ziehen, wenn ein menschlicher, durch CDR-grafting erzeugter Antikörper hergestellt werden soll und dass es nötig ist, verschiedene Untersuchungen zur Identifikation dieser interagierenden Regionen durchzuführen, die auf der Information über die dreidimensionalen Strukturen von Antikörper-V-Regionen beruhen. Bei Betrachtung dieser interagierenden Regionen kann durch Analogie leicht festgestellt werden, dass sie in verschiedenen Antikörpern unterschiedlich sind und dass es gegenwärtig schwierig ist, eine allgemeine Regel zu finden, so dass es nötig ist, Versuch-und-Irrtum Versuche durchzuführen, um den Antikörper von Interesse zu finden.
  • 5. Stabile Expression der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper unter Verwendung einer tierischen Zelle
  • Auf der Grundlage der in Abschnitt 5(3) von Beispiel 1 beschriebenen Ergebnisse wurde vorgeschlagen, dass die von den transienten Expressionsvektoren pT641HLCDRLm-9 und pT641HLCDRLm-69 herrührenden, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper im Vergleich zu chimären anti-GD3-Antikörpern etwa 20% bzw. etwa 80% Bindungsaktivität für GD3 aufweisen. Um daher die Aktivität dieser durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper genauer zu untersuchen, wurden transformierte Zelllinien, die durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper stabil exprimieren können, mit dem nachfolgend beschriebenen Verfahren erhalten. Die Aufreinigung der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper aus den Kulturüberständen der transformierten Zelllinien wurde ebenfalls durchgeführt. Ferner wurde zum Vergleich die stabile Expression und Aufreinigung des von dem transienten Expressionsvektor pT641HLCDR herrührenden, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers in gleicher Weise durchgeführt.
  • (1) Konstruktion eines Expressionsvektors für die stabile Expression von durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern
  • Expressionsvektoren für die stabile Expression wurden durch Einführung eines Resistenzgens gegen den Wirkstoff G418 und des DHFR-Gens in verschiedene Vektoren für die transiente Expression, deren Konstruktion in Abschnitt 5(2) von Beispiel 1 beschrieben wurde, konstruiert.
  • Zunächst wurden 3 μg des Expressionsvektors pKANTEX93 für einen humanisierten Antikörper, beschrieben in der WO97/10354 zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 mM Kaliumchlorid enthielt. 10 Einheiten der Restriktionsenzyme BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) und XhoI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 1 μg eines BamHI-XhoI-Fragments von etwa 8,68 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden je 3 μg der transienten Expressionsvektoren pT641HLCDRLm-9, pT641HLCDRLm-69 und pT641HLCDR zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 mM Kaliumchlorid enthielt. 10 Einheiten der Restriktionsenzyme BamHI (hergestellt von Takara Shuzo), XhoI (hergestellt von Takara Shuzo) und StuI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 1 μg eines BamHI-XhoI-Fragments von etwa 4,90 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg des BamHI-XhoI-Fragments, abgeleitet aus dem Plasmid pKANTEX93 und 0,1 μg des BamHI-XhoI-Fragments, abgeleitet aus jedem der vorstehend beschriebenen transienten Expressionsvektoren zu einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilem Wasser gegeben und mit Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (hergestellt von Pharmacia) ligiert. Mit jeder der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösungen wurde E. coli HB 101 transformiert, wodurch die in 12 dargestellten Expressionsvektoren pKANTEX641HLCDRLm-9, pKANTEX641HLCDRLm-69 und pKANTEX641HLCDR für die stabile Expression von durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern erhalten wurden.
  • (2) Stabile Expression von durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern in tierischen Zellen
  • Mit den verschiedenen, in Abschnitt 6(1) von Beispiel 1 erhaltenen Expressionsvektoren für die stabile Expression von durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern wurde die Expression von durch CDR-grafting erzeugtem anti-GD3-Antikörper in tierischen Zellen wie folgt durchgeführt.
  • Jeder der Vektoren für die Expression von durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern (4 μg) wurde mit dem Elektroporationsverfahren (Cytotechnology 3, 133 (1990)) in 4 × 106 Zellen der Ratten-Myelomzelllinie YB2/0 (ATCC CRL 1662) eingeführt. Die Zellen wurden in 40 ml RPMI640-FBS(19) (RPMI1640-Medium, das 10% foetales Rinderserum (FBS) enthält) suspendiert und zu 200 μl/Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von Sumitomo Bakelite) verteilt. Nach Kultivierung für 24 Stunden bei 37°C in einem 5% CO2-Inkubator wurde G418 zugesetzt, wodurch sich eine Konzentration von 0,5 mg/ml ergab und anschließend 1 bis Wochen lang kultiviert. Die Kulturüberstände wurden aus denjenigen Vertiefungen entnommen, in denen Kolonien der G418-Resistenz zeigenden Transformanten gebildet und konfluent wurden und die Antigenbindungsaktivität der verschiedenen, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper in den Überständen wurde mit dem in Abschnitt 2 von Beispiel 1 dargestellten ELISA gemessen (ein mit Peroxidase markierter Ziege-anti-Mensch-IgG(γ)-Antikörper wurde als sekundärer Antikörper eingesetzt).
  • Um bei denjenigen Transformanten in Vertiefungen, bei denen die Expression der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper in den Kulturüberständen nachgewiesen wurde, die Quantität der Antikörperexpression durch Einsatz des Dhfr-Gen-Amplifikationssystems zu erhöhen, wurden diese in RPMI1640-FBS(10)-Medium suspendiert, das 0,5 mg/ml G418 und 50 mM Methotrexat (nachfolgend als „MTX" bezeichnet, hergestellt von Sigma) als Inhibitor des Dhfr-Genprodukts Dihydrofolatreduktase (nachstehend als „DHFR" bezeichnet) enthielt, wobei auf eine Zelldichte von 1 bis 2 × 105 Zellen/ml eingestellt und ad 2 ml in eine Platte mit 24 Vertiefungen (hergestellt von Greiner) verteilt wurde. Nach Züchtung für 1 bis 2 Wochen bei 37°C in einem 5% CO2-Inkubator wurden Transformanten, die 50 nM MTX-Resistenz zeigten, induziert. Wenn die Transformanten konfluent wurden, wurde die Antigenbindungsaktivität verschiedener, durch CDR-grafting erzeugter anti-GD3-Antikörper in den Überständen durch den ELISA, wie in Abschnitt 2 von Beispiel 1 dargestellt, gemessen. Bei den Transformaten in Vertiefungen, bei denen die Expression der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper in den Kulturüberständen gefunden wurde, wurde die MTX-Konzentration auf 100 nM und dann auf 200 nM erhöht, wobei ein ähnliches Verfahren wie vorstehend beschrieben eingesetzt wurde und Transformanten, die in RPMI1640-FBS(10)-Medium, das 0,5 mg/ml G418 und 200 nM MZX enthielt, wachsen konnten und durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper stark exprimierten, wurden schließlich erhalten. Mit den so erhaltenen Transformanten wurden einzelne Zellen zweimal durch Grenzverdünnungsanalyse isoliert (Clonierung). Die transformierten Zellclone, die durch Einführen der stabilen Expressionsvektoren pKANTEX641HLCDRLm-9, pKANTEX641HLCDRLm-69 und pKANTEX641HLCDR erhalten wurden, wurden als KM8870, KM8871 und KM8869 bezeichnet. Die Expressionswerte der transformierten Zellclone für durch. CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper lagen bei etwa 5 μg/106 Zellen/24 Stunden, etwa 10 μg/106 Zellen/24 Stunden und etwa 30 μg/106 Zellen/24 Stunden.
  • (3) Aufreinigung von durch CDR-grafting erzeugtem anti-GD3-Antikörper aus Kulturfiltrat
  • Jeder der transformierten, wie vorstehend in Abschnitt 6(2) von Beispiel 1 beschrieben erhaltenen Zellclone KM8870, KM8871 und KM8869, die verschiedene durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper exprimieren, wurde in GIT-Medium (hergestellt von Nippon Pharmaceutical) suspendiert, das 200 mM MTX enthielt, wodurch eine Dichte von 1 bis 2 × 105 Zellen/ml erhalten wurde und in 200 ml in 175 cm2-Flaschen (hergestellt von Greiner) verteilt. Die Zellen wurden 5 bis 7 Tage bei 37°C gezüchtet, bis sie konfluent wurden und der Kulturüberstand wurde anschließend entnommen. Alle durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper wurden unter Verwendung einer Prosep-A-(hergestellt von Bioprocessing)Säule nach Herstelleranleitung aufgereinigt. Etwa 3 mg des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8870 wurden aus 500 ml Kulturüberstand von KM8870 erhalten, etwa 25 mg des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8871 wurden aus 1600 ml Kulturüberstand von KM8871 erhalten und etwa 65 mg des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8869 wurden aus 1000 ml Kulturüberstand von KM8869 erhalten. Etwa 4 μg der so erhaltenen, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper wurden einer Elektrophorese gemäß einem bekannten Verfahren (Nature 227, 680 (1970)) zugeführt, um ihr Molekulargewicht und ihren Aufreinigungsgrad zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 13 dargestellt. Wie in 13 gezeigt, betrug das Molekulargewicht aller aufgereinigten durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper etwa 150 Kilodalton (nachstehend bezeichnet als „kD") unter nicht-reduzierenden Bedingungen und unter reduzierenden Bedingungen wurden zwei Banden von etwa 50 kD und etwa 25 kD gefunden. Die Molekulargewichte stimmten fast mit den von den cDNA-Nucleotidsequenzen der H-Kette und der L-Kette des Antikörpers abgeleiteten Molekulargewichten überein (H-Kette: etwa 49 kD, L-Kette; etwa 24 kD, Gesamtmolekül: etwa 146 kD). Sie stimmten ferner mit den Berichten überein, dass ein Antikörper vom IgG-Typ ein Molekulargewicht von etwa 150 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen aufweist und unter reduzierenden Bedingungen durch die Spaltung der Disulfidbindung (nachstehend bezeichnet als „S-S-Bindung") im Molekül (Antibodies: A Laboratory Manual, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice) zu H-Ketten mit einem Molekulargewicht von etwa 50 kD und L-Ketten mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kD abgebaut wird. Somit wurde bestätigt, dass alle durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper als Antikörpermolekül mit korrekter Struktur exprimiert wurden. Durch Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenzen der H-Kette wie auch der L-Kette der gereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper über Edman-Abbau unter Verwendung eines Protein-Sequenziergerätes (470A, hergestellt von Applied Biosystems) wurde ferner bestätigt, dass sie mit den N-terminalen Aminosäuresequenzen der H-Ketten und L-Ketten übereinstimmen, die von den entsprechenden cDNA-Nucleotidsequenzen abgeleitet worden sind.
  • 6. Untersuchung der Aktivität des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers
  • (1) Reaktivität des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers mit GD3 (ELISA)
  • Die Reaktivität der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871 mit GD3 (hergestellt von DIA-IATRON) wurde mit dem in Abschnitt 2 von Beispiel 1 dargestellten ELISA gemessen. 14 zeigt ein Ergebnis der Prüfung der Reaktivität, die durch Festlegung der an jede Vertiefung einer ELISA-Platte zu adsorbierenden GD3-Menge auf 20 pMol/Vertiefung und Änderung der Konzentration des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 und der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871 durchgeführt wurde, die jeweils zuzugeben waren. Wie in 14 dargestellt, zeigte KM8871 unter den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern die höchste Bindungsaktivität, die etwa ½ mal so hoch war, wie die des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871. 15 zeigt ein Ergebnis der Prüfung der Reaktivität einer konstanten Konzentration (10 μg/ml) des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 und der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871, bei der die Menge an an jede Vertiefung einer ELISA-Platte zu adsorbierendem GD3 verändert wurde. Wie in 15 dargestellt, zeigte KM8871 unter den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern die höchste Bindungsaktivität, die der des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 entsprach. 16 zeigt ein Ergebnis der Untersuchung der Reaktivität einer konstanten Konzentration (10 μg/ml) des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 und der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871, die unter Abänderung der Art des Gangliosids durchgeführt wurde, das an jede Vertiefung einer ELISA-Platte zu adsorbieren war (Adsorptionsmenge: 20 pMol/Vertiefung). Insgesamt wurden 11 verschiedene Ganglioside eingesetzt, nämlich GM1, N-Acetyl-GM2 (hergestellt von Boehringer Mannheim, nachstehend als „AcGM2" bezeichnet), N-Glycolyl-GM2 (nachstehend als „GcGM2" bezeichnet), N-Acetyl-GM3 (nachstehend als „AcGM3" bezeichnet), N-Glycolyl-GM3 (nachstehend als „GcGM3" bezeichnet), GD1a und GD1b (hergestellt von DIA-IATRON), GD2 und GD3 (hergestellt von DIA-IATRON), GQ1b (hergestellt von DIA-IATRON) und GT1b (hergestellt von Funakoshi). GM1 und GD1a wurden dabei aus Rinderhirn aufgereinigt, N-Glycolyl-GM2 und N-Glycolyl-GM3 aus Mausleber, N-Acetyl-GM3 aus Hunde-Erythrozyten und GD2 aus der menschlichen Neuroblastom-Kulturzelllinie IMR32 (ATCC CCL 127), jeweils gemäß vorbeschriebenen Verfahren (J. Biol. Chem. 263, 10915 (1988)). Wie in 16 dargestellt, band jeder der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871, ähnlich wie der chimäre anti-GD3-Antikörper KM871, GD3 stark und GQ1b schwach, jedoch an keines der anderen Ganglioside. Damit wurde gezeigt, dass sie die Bindungsspezifität des chimären Antikörpers KM871 beibehalten.
  • (2) Reaktivität des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers mit menschlichen Krebszellen (Immunfluoreszenzverfahren)
  • Die Reaktivität von aufgereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern KM8869, KM8870 und KM8871 mit menschlichen Krebszellen wurde wie folgt gemessen. Jeweils 106 Zellen der menschlichen Melanom-Kulturzelllinien G-361 (ATCC CRL 1424) und SK-MEL-28 (ATCC HTB 72) wurden in PBS suspendiert, in Mikroröhrchen übertragen und zentrifugiert (2000 UpM für 2 Minuten). Die so gewaschenen Zellen wurden nach Zugabe von 50 μl des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 oder der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 oder KM8871 gerührt (eine Lösung, die mit 1% BSA-PBS auf 5 μg/ml eingestellt worden war). Anschließend ließ man eine Stunde bei 4°C reagieren. Nach der Reaktion und darauf folgender dreimaliger Zentrifugation mit PBS zum Waschen wurden 20 μl Kaninchen-anti-menschliches IgG (H + L)-F(ab')2-Lösung (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, verwendet nach dreißigfacher Verdünnung mit 1% BSA-PBS), das mit Fluoresceinisothiocyanat (nachstehend als „FITC" bezeichnet) fluoreszenzmarkiert war, zugegeben. Nachfolgend wurde gerührt und die Reaktion dann eine Stunde bei 4°C durchgeführt. Nach der Reaktion und darauf folgender dreimaliger Zentrifugation mit PBS zum Waschen wurden die Zellen wiederum in PBS suspendiert, um die Analyse mit einem Flusscytometer EPICS Elite (hergestellt von COULTER) durchzuführen. Als Kontrolle wurde die Analyse mit dem gleichen Verfahren ohne Zugabe von Antikörpern durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 17 dargestellt. Wie in 17 dargestellt, zeigte der chimäre anti-GD3-Antikörper KM871 wie auch jeder der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871 Reaktivität mit beiden Zelllinien. Unter den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern zeigte KM8871 die stärkste Reaktivität. Diese Ergebnisse belegen, dass die durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper in der Diagnose, Behandlung usw. von GD3-positiven menschlichen Tumoren einschließlich Melanomen einsetzbar sind.
  • (3) In vitro zytotoxische Aktivität von durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern (CDC-Aktivität)
  • Um die zytotoxische Aktivität der gereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871 in vitro zu bestimmen, wurde die CDC-Aktivität mit dem folgenden Verfahren gemessen.
  • a. Präparation einer Zielzellsuspension
  • Die beiden menschlichen Melanom-Kulturzelllinien G-361 (ATCC CRL 1424) und SK-MEL-28 (ATCC HTB 72) wurden in RPMI1640-FBS(10)-Medium gezüchtet und auf 5 × 106 Zellen eingestellt. Die Zellen wurden durch Zugabe von einer 3,7 MBq äquivalenten Menge der radioaktiven Substanz Na2 51CrO4 und Durchführung der Reaktion eine Stunde bei 37°C mit Isotopen markiert. Nach der Reaktion wurden die Zellen drei Mal durch ihre Suspension in RPMI1640-FBS(10)-Medium und Zentrifugation gewaschen, in dem Medium resuspendiert und dann auf Eis 30 Minuten bei 4°C inkubiert, wodurch die radioaktive Substanz spontan freigesetzt wurde. Nach einer Zentrifugation wurde der Niederschlag durch Zugabe von 5 ml RPMI1640-FBS(10)-Medium auf 1 × 106 Zellen/ml eingestellt und als Zielzellsuspension verwendet.
  • b. Präparation einer Komplement-Lösung
  • Seren von drei gesunden Personen wurden gemischt und als Quelle für menschliches Komplement eingesetzt. Wenn die Zeit für ihre Verwendung gekommen war, wurden sie zu 15 Vol.-% mit RPMI1640-FBS(10)-Medium verdünnt und als Komplementlösung eingesetzt.
  • c. Messung der CDC-Aktivität
  • Zu jeder Vertiefung einer Platte mit 96 U-Boden-förmigen Vertiefungen (hergestellt von Falcon) wurden 50 μl der in „a" aufbereiteten Zielzellsuspension gegeben (5 × 104 Zellen/Vertiefung). Anschließend wurden der chimäre anti-GD3-Antikörper KM871 oder einer der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871 zugegeben, wodurch eine Endkonzentration von 0,05 bis 50 μg/ml erhalten wurde und die Umsetzung erfolgte 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde die Platte zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen und 150 μl der in „b" hergestellten menschlichen Komplementlösung wurden zugegeben und die Reaktion wurde eine Stunde bei 37°C durchgeführt. Nach einer Zentrifugation wurde die Menge an in den Überstand freigesetztem 51Cr mit einem γ-Zähler gemessen. Die Menge des spontan dissoziierten 51Cr wurde dadurch berechnet, dass das gleiche Verfahren unter Verwendung lediglich von Medium anstelle der Antikörper-Lösung und der Komplementlösung durchgeführt und die Menge an 51Cr im Überstand gemessen wurde. Die Menge des insgesamt dissoziierten 51Cr wurde dadurch berechnet, dass das gleiche Verfahren unter Zugabe lediglich von Medium anstelle der Antikörper-Lösung und 5 N Natriumhydroxid anstelle der Komplementlösung durchgeführt und die Menge an 51Cr im Überstand gemessen wurde. Die CDC-Aktivität wurde mit folgender Gleichung berechnet.
  • Figure 00740001
  • Die Ergebnisse sind in 18 dargestellt. Wie in 18 dargestellt, zeigten sowohl der chimäre anti-GD3-Antikörper KM871 wie auch jeder der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871 CDC-Aktivität gegenüber beiden Zelllinien und eine besonders starke zytotoxische Aktivität gegenüber der menschlichen Melanom-Kulturzelllinie G-361. Unter den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern zeigte KM8871 die stärkste zytotoxische Aktivität, die etwa ein Drittel der des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 betrug.
  • (4) In vitro zytotoxische Aktivität von durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern (ADCC-Aktivität)
  • Um die zytotoxische Aktivität der gereinigten, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern KM8869, KM8870 und KM8871 in vitro zu bestimmen, wurde die ADCC-Aktivität mit dem folgenden Verfahren gemessen.
  • a. Präparation einer Zielzellsuspension
  • Die beiden menschlichen Melanom-Kulturzelllinien G-361 (ATCC CRL 1424) und SK-MEL-28 (ATCC HTB 72) wurden in RPMI1640-FBS(10)-Medium gezüchtet und auf 1 × 106 Zellen eingestellt. Die Zellen wurden durch Zugabe von einer 1,85 MBq äquivalenten Menge der radioaktiven Substanz Na2 51CrO4 und Durchführung der Reaktion eine Stunde bei 37°C mit Isotopen markiert. Nach der Reaktion wurden die Zellen drei Mal durch ihre Suspension in RPMI1640-FBS(10)-Medium und Zentrifugation gewaschen, in dem Medium resuspendiert und dann auf Eis 30 Minuten bei 4°C inkubiert, wodurch die radioaktive Substanz spontan freigesetzt wurde. Nach einer Zentrifugation wurde der Niederschlag durch Zugabe von 5 ml RPMI1640-FBS(10)-Medium auf 2 × 105 Zellen/ml eingestellt und als Zielzellsuspension verwendet.
  • b. Präparation einer Suspendion von Effektorzellen
  • Venöses Blut (50 ml) von drei gesunden Personen wurde gesammelt und 0,5 ml an Natriumheparin (hergestellt von Takeda Pharmaceutical) vorsichtig zugegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde unter Verwendung von Polymorphprep (hergestellt von Nycomed Pharma AS) nach Herstelleranleitung zentrifugiert (1500 bis 1800 × G für 30 Minuten), wodurch eine Schicht einkerniger Zellen abgetrennt wurde. Die abgetrennten Zellen wurden drei Mal zentrifugiert (1500 bis 1800 × G für 5 Minuten), wobei RPMI1640-FBS(10)-Medium zum Waschen eingesetzt wurde und anschließend in dem Medium resuspendiert, wodurch eine Dichte von 5 × 106 Zellen/ml erzielt wurde, die als Effektorzellsuspension einzusetzen war.
  • c. Messung der ADCC-Aktivität
  • Zu jeder Vertiefung einer Platte mit 96 U-Boden-förmigen Vertiefungen (hergestellt von Falcon) wurden 50 μl der in „a" aufbereiteten Zielzellsuspension gegeben (1 × 104 Zellen/Vertiefung). Dann wurden 100 μl der in „b" hergestellten Effektorzellsuspension zugegeben (5 × 105 Zellen/Vertiefung, wodurch ein Verhältnis an Effektorzellen zu Zielzellen von 50:1 erreicht wurde). Anschließend wurden der chimäre anti-GD3-Antikörper KM871 und jeder der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871 zugegeben, wodurch eine Endkonzentration von 0,05 bis 50 μg/ml erhalten wurde und die Umsetzung erfolgte 4 Stunden bei 37°C. Nach der Reaktion wurde die Platte zentrifugiert und die Menge an in den Überstand freigesetztem 51Cr mit einem γ-Zähler gemessen. Die Menge des spontan dissoziierten 51Cr wurde dadurch berechnet, dass das gleiche Verfahren unter Verwendung lediglich von Medium anstelle der Effektorzellsuspension und der Antikörperlösung durchgeführt und die Menge an 51Cr im Überstand gemessen wurde. Die Menge des insgesamt dissoziierten 51Cr wurde dadurch berechnet, dass das gleiche Verfahren unter Zugabe lediglich von Medium anstelle der Antikörper-Lösung und 5 N Natriumhydroxid anstelle der Effektorzellsuspension durchgeführt und die Menge an 51Cr im Überstand gemessen wurde. Die ADCC-Aktivität wurde mit folgender Gleichung berechnet.
  • Figure 00760001
  • Die Ergebnisse sind in 19 dargestellt. Wie in 19 dargestellt, zeigten sowohl der chimäre anti-GD3-Antikörper KM871 wie auch jeder der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8869, KM8870 und KM8871 starke ADDC-Aktivität gegenüber beiden Zelllinien. Zwischen dem chimären anti-GD3-Antikörper KM871 und den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern KM8869, KM8870 und KM8871 wurde kein Unterschied in der zytotoxischen Aktivität gefunden.
  • Diese Ergebnisse belegen, dass die durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper in der Diagnose, Behandlung usw. von GD3-positiven menschlichen Tumoren in ähnlicher Weise wie der chimäre anti-GD3-Antikörper KM871 einsetzbar sind. Darüber hinaus wird erwartet, dass die Immunogenität der durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper im Menschen vermindert und weiterhin die Wirkung verlängert ist.
  • Der transformierte Zellclon KM8871, der KM8871 produzieren kann, der die höchste Aktivität unter den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpern zeigte, wurde am 22. Juli 1999 als FERM BP-6790 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan) hinterlegt.
  • Beispiel 2
  • Herstellung eines Fusionsproteins aus durch CDR-grafting erzeugtem anti-GD3-Antikörper und menschlichem Zytokin
  • Als ein Beispiel eines Fusionsproteins aus durch CDR-grafting erzeugtem anti-GD3-Antikörper und menschlichem Zytokin wurde ein Fusionsprotein aus durch CDR-grafting erzeugtem anti-GD3-Antikörper KM8871 und menschlichem IL-2, KM8871-hIL-2, wie folgt erzeugt und die Bewertung der Aktivität durchgeführt.
  • 1. Konstruktion einer cDNA, die ein Fusionsprotein aus hCγ1 und hIL-2 codiert
  • (1) Konstruktion eines Plasmids pBSΔhCγ1-IL-2 mit einer cDNA von etwa 65 Basen des 3'-Endes von hCγ1-cDNA und cDNA voller Länge von reifem hIL-2
  • Das Plasmid pBluescript SK(–) (3 μg, hergestellt von Stratagene) wurde zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner zur Lösung gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 mM Kaliumchlorid enthielt. Ferner zugemischt wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 30°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines ApaI-BamHI-Fragments von etwa 2,95 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden synthetische DNA-Fragmente mit den durch die SEQ ID Nummern: 49 und 50 dargestellten Nucleotidsequenzen unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegerätes (380A, hergestellt von Applied Biosystems) hergestellt. 0,3 μg von jedem der so erhaltenen synthetischen DNA-Fragmente wurden zu 15 μl sterilem Wasser gegeben und 5 Minuten auf 65°C erhitzt. Nachdem die Reaktionslösung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen worden war, wurde sie mit 2 μl einer 10 x-Pufferlösung (500 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT) und 2 μl 10 mM ATP vermischt. Ferner wurden 10 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase (hergestellt von Takara Shuzo) beigemischt, wodurch die Reaktion zur Phosphorylierung des 5'-Endes 30 Minuten bei 37°C durchgeführt wurde.
  • Dann wurden 0,1 μg des ApaI-BamHI-Fragments, abgeleitet aus dem Plasmid pBluescript SK(–) und 0,05 μg der phosphorylierten, synthetisch hergestellten DNA, beides wie vorstehend beschrieben erhalten, zu einem Gesamtvolumen von 10 μl sterilem Wasser gegeben und mit dem DNA-Ligationskit Ver. 2 (hergestellt von Takara Shuzo) nach Herstelleranleitung ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli DH5α (hergestellt von Stratagene) transformiert, wodurch das in 20 gezeigte Plasmid pBSA-B erhalten wurde. Das so erhaltene Plasmid (10 μg) wurde mit dem AutoRead Sequenzierkit (hergestellt von Pharmacia) gemäß der Anleitung des Herstellers umgesetzt. Anschließend wurde die Sequenz mit dem A. L. F. DNA-Sequenziergerät (hergestellt von Pharmacia) unter Durchführung einer Elektrophorese ermittelt. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass ein Plasmid erhalten worden war, in das die DNA von Interesse cloniert worden war.
  • Anschließend wurden 3 μg des so erhaltenen Plasmids pBSA-B zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner zu der Lösung gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 33 mM Tris-Acetat (pH 7,9), 66 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthielt und ferner mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SmaI (hergestellt von Takara Shuzo) versetzt, wodurch die Reaktion eine Stunde bei 30°C durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines EcoRI-SmaI-Fragmentes von etwa 3,00 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurde die folgende PCR durchgeführt, wobei das Plasmid pILL4 eingesetzt wurde, das die cDNA voller Länge von reifem hIL-2 (Agric. Biol. Chem. 51, 1135 (1987)) als Matrize enthielt. Das Plasmid pILL4 (1 ng) wurde zu 100 μl einer Reaktionslösung (1 × konzentrierter Ex Taq-Puffer (hergestellt von Takara Shuzo), 200 μM dNTPs, 1,0 μM rev1-Primer (SEQ ID Nr.: 51), 1,0 μM fw2-Primer (SEQ ID Nr.: 52) und 2,5 Einheiten an TaKaRa Ex Taq-DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo) gegeben und die Lösung wurde mit 100 μl Mineralöl überdeckt und in ein DNA-Thermalzyklusgerät (PJ480, hergestellt von Perkin Elmer) gesetzt, um die Reaktion 3 Minuten bei 94°C durchzuführen und nachfolgend 30 Zyklen der Reaktion durchzuführen, wobei jeder Zyklus 30 Sekunden bei 96°C, 1 Minute bei 55°C, 1 Minute bei 72°C einschloss und eine abschließende Reaktion 7 Minuten bei 72°C. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 30 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 33 mM Tris-Acetat (pH 7,9), 66 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthielt und ferner mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SmaI (hergestellt von Takara Shuzo) versetzt, wodurch die Reaktion eine Stunde bei 30°C durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 1 μg eines EcoRI-SmaI-Fragmentes von etwa 0,41 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg des so erhaltenen EcoRI-SmaI-Fragments aus dem Plasmid pBSA-B und 0,1 μg des EcoRI-SmaI-Fragments des PCR-Produktes von cDNA voller Länge von reifem hIL-2 zu 10 μl Gesamtvolumen von sterilem Wasser gegeben und mit dem DNA-Ligationskit Ver. 2 (hergestellt von Takara Shuzo) nach Herstelleranleitung ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli DH5α transformiert. Plasmid-DNA wurde von 10 Transformantenclonen präpariert und mit dem AutoRead Sequenzierkit (hergestellt von Pharmacia) gemäß der Anleitung des Herstellers umgesetzt. Anschließend wurde die Nucleotidsequenz der eingeführten cDNA mit dem A. L. F. DNA-Sequenziergerät (hergestellt von Pharmacia) gemäß Anleitung des Herstellers unter Durchführung einer Elektrophorese ermittelt. Im Ergebnis wurde das in 21 dargestellte Plasmid pBSΔhCγ1-IL-2 mit der interessierenden Nucleotidsequenz erhalten.
  • (2) Konstruktion eines Plasmids pBShCγ1-IL-2 mit einer cDNA aus hCγ1-cDNA voller Länge und cDNA voller Länge von reifem hIL-2
  • Zuerst wurden 3 μg des in der veröffentlichten, nicht geprüften japanischen Patentanmeldung 257893/98 beschriebenen Plasmids pBShCγ1 zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 mM Kaliumchlorid enthielt. Ferner zugemischt wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoT22I (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 30°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 1 μg eines ApaI-EcoT22I- Fragments von etwa 0,92 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pBSΔhCγ1-IL-2, erhalten wie in Abschnitt 1(1) von Beispiel 2 beschrieben, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner zur Lösung gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 mM Kaliumchlorid enthielt. Ferner zugemischt wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoT22I (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 30°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines ApaI-EcoT22I-Fragments von etwa 3,40 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg des so erhaltenen ApaI-EcoT22I-Fragments aus pBShCγ1 und 0,1 μg des ApaI-EcoT22I-Fragments aus pBSΔhCγ1-IL-2 zu 10 μl Gesamtvolumen an sterilem Wasser gegeben und mit dem DNA-Ligationskit Ver. 2 (hergestellt von Takara Shuzo) nach Herstelleranleitung ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli DH5α transformiert, wobei das in 22 dargestellte Plasmid pBShCγ1-IL-2 erhalten wurde. Das so erhaltene Plasmid (10 μg) wurde mit dem AutoRead Sequenzierkit (hergestellt von Pharmacia) gemäß der Anleitung des Herstellers umgesetzt. Anschließend wurde die Nucleotidsequenz der eingeführten cDNA mit dem A. L. F. DNA-Sequenziergerät (hergestellt von Pharmacia) gemäß Anleitung des Herstellers unter Durchführung einer Elektrophorese ermittelt. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass ein Plasmid mit der interessierenden Nucleotidsequenz erhalten worden war.
  • 2. Stabile Expression von KM8871-hIL-2 unter Verwendung von tierischen Zellen
  • (1) Konstruktion eines Vektors für die stabile Expression von KM8871-hIL-2
  • Ein Vektor für die stabile Expression von KM8871-hIL-2 wurde unter Verwendung des Vektors pKANTEX641HLCDRLm-69, der in Abschnitt 6(1) von Beispiel 1 für die stabile Expression des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8871 erhalten worden war und des Plasmids pBShCγ1-IL-2, das in Abschnitt 1(2) von Beispiel 2 erhalten worden war und eine das Fusionsprotein aus hCγ1 und hIL-2 codierende cDNA aufwies, wie nachfolgend beschrieben konstruiert.
  • Das Plasmid pKANTEX641 HLCDRLm-69 (3 μg), erhalten wie in Abschnitt 6(1) von Beispiel 1 beschrieben, wurde zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner zur Lösung gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt und zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 mM Kaliumchlorid enthielt. Ferner zugemischt zur Lösung wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines ApaI-BamHI-Fragments von etwa 12,57 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pBShCγ1-IL-2, erhalten wie in Abschnitt 1(2) von Beispiel 2 beschrieben, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner zur Lösung gemischt, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 mM Kaliumchlorid enthielt. Ferner zugemischt zur Lösung wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines ApaI-BamHI-Fragments von etwa 1,45 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg des so erhaltenen ApaI-BamHI-Fragments aus dem Plasmid pKANTEX641HLCDRLm-69 und 0,1 μg des ApaI-BamHI-Fragments aus dem Plasmid pBShCγ1-IL-2 zu 10 μl Gesamtvolumen an sterilem Wasser gegeben und mit dem DNA-Ligationskit Ver. 2 (hergestellt von Pharmacia) nach Herstelleranleitung ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli DH5α transformiert, wobei der in 23 dargestellte stabile Expressionsvektor pKANTEX8871-hIL-2 für KM8871-hIL-2 erhalten wurde. Das so erhaltene Plasmid (10 μg) wurde mit dem AutoRead Sequenzierkit (hergestellt von Pharmacia) gemäß der Anleitung des Herstellers umgesetzt. Anschließend wurde die Nucleotidsequenz mit dem A. L. F. DNA-Sequenziergerät (hergestellt von Pharmacia) gemäß Anleitung des Herstellers unter Durchführung einer Elektrophorese ermittelt. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass ein Plasmid erhalten worden war, in das die interessierende DNA cloniert worden war.
  • (2) Expression von KM8871-hIL-2 in tierischen Zellen
  • YB2/0-Zellen (ATCC CRL 1581) wurden mit 4 μg des Expressionsvektors pKANTEX8871-hIL-2 für die stabile Expression von KM8871-hIL-2, erhalten wie in Abschnitt 2(1) von Beispiel 2 beschrieben, nach dem in Abschnitt 6(2) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren transformiert und die Selektion wurde letztendlich mit G418 (0,5 mg/ml) und MTX (200 nM) durchgeführt. Hierdurch wurde ein transformierter Zellclon KM8871hIL2 erhalten, der eine Expressionshöhe von etwa 4 μg/106 Zellen/24 Stunden aufwies. KM8871hIL2 wurde ferner am 22. Juli 1999 als FERM BP-6791 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan) hinterlegt.
  • (3) Aufreinigung von KM8871-hIL-2 aus Kulturüberstand
  • Gemäß dem in Abschnitt 6(3) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde der transformierte Zellclon KM8871hIL2, der wie in Abschnitt 2(2) von Beispiel 2 beschrieben erhalten wurde und KM8871-hIL-2 exprimieren konnte, gezüchtet, wodurch etwa 10,0 mg gereinigtes KM8871-hIL-2 aus etwa 3 L Kulturüberstand erhalten wurden. Das Ergebnis einer SDS-PGE mit gereinigtem KM8871-hIL-2 ist in 24 dargestellt. Wie in 24 gezeigt, betrug das Molekulargewicht des aufgereinigten KM8871-hIL-2 unter nicht-reduzierenden Bedingungen etwa 180 kD und unter reduzierenden Bedingungen wurden zwei Banden von etwa 65 kD und etwa 25 kD gefunden. Die Molekulargewichte stimmten fast mit den von den cDNA-Nucleotidsequenzen der H-Kette von KM8871-hIL-2 und hIL-2 und der L-Kette abgeleiteten Molekulargewichten überein (H-Kette und hIL-2: etwa 64 kD, L-Kette; etwa 24 kD, Gesamtmolekül: etwa 176 kD). Es wurde ferner bestätigt, dass die Struktur als Antikörpermolekül nach der Fusion mit hIL-2 erhalten blieb.
  • 3. Evaluierung der Aktivität von KM8871-hIL-2
  • (1) Reaktivität von KM8871-hIL-2 mit GD3 (ELISA-Verfahren)
  • Die Reaktivität von gereinigtem KM8871-hIL-2 mit GD3 (hergestellt von DIA-IATRON) wurde gemäß dem in Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessen. Dabei wurde ein mit Peroxidase markierter Ziege-anti-Mensch-IgG-(H & L)Antikörper (hergestellt von American Qualex, eingesetzt nach 3000-facher Verdünnung in 1% BSA-PBS) als sekundäre Antikörperlösung verwendet. In 25 ist ein Untersuchungsergebnis der Reaktivität dargestellt, wobei die Menge an an jede Vertiefung einer ELISA-Platte zu adsorbierendem GD3 auf 20 pMol/Vertiefung festgesetzt wurde und die Konzentration des zuzusetzenden, durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8871 und von KM8871-hIL-2 variiert wurde. Wie in 25 gezeigt, wurde gefunden, dass KM8871-hIL-2 eine Bindungsaktivität für GD3 aufweist, die der des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8871 gleicht oder höher ist. 26 stellt ein Untersuchungsergebnis der Reaktivität einer konstanten Konzentration (10 μg/ml) des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8871 und von KM8871-hIL-2 dar, wobei die Arten an an jede Vertiefung einer ELISA-Platte zu adsorbierenden Gangliosiden (adsorbierte Menge: 20 pMol/Vertiefung) variiert wurden. Wie in 26 gezeigt, wurde gefunden, dass KM8871-hIL-2 stark an GD3 bindet und zwar in ähnlicher Weise wie der durch CDR-grafting erzeugte anti-GD3-Antikörper KM8871. Ferner wurde gefunden, dass KM8871-hIL-2 auch stark an GD2 bindet. Was den Grund für die Kreuzreaktivität von KM8871-hIL-2 mit GD2 angeht, so kommt die Möglichkeit der Bindung von hIL-2 an GD2, wie auch die Möglichkeit einer Änderung in der Bindungsspezifität, verursacht durch eine Änderung in der dreidimensionalen Struktur der Antikörper-V-Region als Folge der Fusion mit hIL2 in Frage, ferner die Möglichkeit der Veränderung der Reaktivität des sekundären Antikörpers, verursacht durch eine Änderung in der dreidimensionalen Struktur der Antikörper-C-Region als Folge der Fusion mit hIL2 wie auch ähnliche Möglichkeiten.
  • (2) Reaktivität von KM8871-hIL-2 mit GD3 auf der Zelloberfläche (Immunfluoreszenzverfahren)
  • Die Reaktivität von gereinigtem KM8871-hIL-2 mit menschlichen Krebszellen wurde gemäß dem in Abschnitt 7(2) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in 27 dargestellt. Wie in 27 gezeigt, wies KM8871-hIL-2 eine starke Reaktivität mit der menschlichen Melanom-Kulturzelllinie G361 auf, die fast identisch war mit der des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8871. Dieses Ergebnis belegt, dass KM8871-hIL-2 in der Behandlung usw. von GD3-positiven menschlichen Tumoren einschließlich Melanomen eingesetzt werden kann.
  • (3) Bewertung der hIL-2-Aktivität von KM8871-hIL-2
  • Die Aktivität von gereinigtem KM8871-hIL-2 als hIL-2 wurde mit dem nachfolgend beschriebenen Verfahren gemessen. Die Maus-T-Zelllinie CTLL-2 (ATCC TIB214), deren Wachstum Abhängigkeit von der hIL-2-Konzentration zeigt, wurde in einer Dichte von 2 × 105 Zellen/ml in RPMI1640-FBS(10)-Medium suspendiert und in 50 μl/Vertiefung in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von Sumitomo Bakelite) verteilt. Eine Lösung (50 μl), die durch Verdünnung von hIL-2 (hergestellt von R & D Systems) oder gereinigtem KM8871-hIL-2 mit RPMI1640-FBS(10)-Medium auf verschiedene Konzentrationen hergestellt worden war, wurde in jede Vertiefung gegeben und es wurde 30 Stunden bei 37°C in einem 5%-CO2-Inkubator gezüchtet. Nach der Kultivierung wurde die Anzahl intakter Zellen mit dem Cell Counting Kit (hergestellt von Dojindo Laboratories) nach Herstelleranleitung gezählt. Die Ergebnisse sind in 28 dargestellt. Wie in 28 gezeigt, wies KM8871-hIL-2 eine biologische Aktivität hinsichtlich der Förderung des CTLL-2-Wachstums auf, die der von hIL-2 glich. Diese Ergebnisse belegen, dass die Aktivität von KM8871-hIL-2 hinsichtlich hIL-2 nach seiner Fusion mit dem durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8871 beibehalten wird.
  • (4) Aktivierung menschlicher Effektorzellen und Erhöhung der zytotoxischen Aktivität durch KM8871-hIL-2
  • Um die Aktivierung menschlicher Effektorzellen und die gleichzeitige Erhöhung der zytotoxischen Aktivität durch den hIL-2-Anteil von KM8871-hIL-2 in vitro zu ermitteln, wurde die zytotoxische Aktivität mit dem folgenden Verfahren gemessen.
  • a. Herstellung der Zielzellsuspension
  • Gemäß dem in „a" von Abschnitt 7(4) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde eine menschliche Melanom-Kulturzelllinie, G-361, auf eine Dichte von 2 × 105 Zellen/ml eingestellt und als Zielzellsuspension verwendet.
  • b. Herstellung einer menschlichen Effektorzellsuspension
  • Gemäß dem in „b" von Abschnitt 7(4) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden einkernige Zellen aus venösem Blut gesunder Patienten abgetrennt und in einer Dichte von 5 × 106 Zellen/ml resuspendiert, um als Effektorzellsuspension eingesetzt zu werden.
  • c. Aktivierung menschlicher Effektorzellen
  • Die in „b" hergestellte Effektorzellsuspension (100 μl) wurde in alle Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen in U-Bodenform (hergestellt von Falcon) verteilt (5 × 104 Zellen/Vertiefung). Darüber hinaus wurden 50 μl des durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörpers KM8871 oder von KM8871-hIL-2 zugegeben, wodurch eine Endkonzentration von 11,1 nM erhalten wurde. Die Reaktion erfolgte 24 Stunden bei 37°C in einem Inkubator bei einer Atmosphäre von 5% CO2.
  • d. Messung der zytotoxischen Aktivität
  • Die in „a" hergestellte Zielzellsuspension (50 μl) wurde in alle Vertiefungen der in „c" präparierten Platte gegeben (1 × 104 Zellen/Vertiefung). Dadurch wurde das Verhältnis von Effektozellen zu Zielzellen auf 5:1 eingestellt. Nach der Reaktion bei 37°C für vier Stunden wurde die Platte zentrifugiert und die Menge an 51Cr im Überstand mit einem γ-Zähler gemessen. Die Menge des spontan dissoziierten 51Cr wurde dadurch berechnet, dass das gleiche Verfahren unter Verwendung lediglich von Medium anstelle der Effektorzellsuspension und der Antikörper-Lösung durchgeführt und die Menge an 51Cr im Überstand gemessen wurde. Die Menge des insgesamt dissoziierten 51Cr wurde dadurch berechnet, dass das gleiche Verfahren unter Zugabe lediglich von Medium anstelle der Antikörper-Lösung und 1 N Salzsäure anstelle der Effektorzellsuspension durchgeführt und die Menge an 51Cr im Überstand gemessen wurde. Die zytotoxische Aktivität wurde mit folgender Gleichung berechnet.
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Die Ergebnisse sind in 29 dargestellt. Wie in 29 dargestellt, wurde gefunden, dass die durch KM8871-hIL-2 induzierte zytotoxische Aktivität stärker war als die durch den durch CDR-grafting erzeugten anti-GD3-Antikörper KM8871 induzierte Aktivität. Dieses Ergebnis belegt, dass menschliche Effektorzellen durch Verwendung von KM8871-hIL-2 aktiviert und die zytotoxische Aktivität durch Verwendung von KM8871-hIL-2 erhöht werden kann. Dies deutet darauf hin, dass ähnliche Wirkungen bei seinem klinischen Einsatz im Menschen erwartet werden können.
  • Beispiel 3
  • Herstellung eines Fusionsproteins aus chimärem anti-GD3-Antikörper und menschlichem Zytokin
  • Als ein Beispiel eines Fusionsproteins aus chimärem anti-GD3-Antikörper und menschlichem Zytokin wurde ein Fusionsproteins aus chimärem anti-GD3-Antikörper KM871 und menschlichem IL-2, KM871-hIL-2 wie folgt erzeugt und die Bewertung der Aktivität durchgeführt.
  • 1. Stabile Expression von KM871-hIL-2 unter Verwendung von tierischen Zellen
  • (1) Konstruktion eines Vektors für die stabile Expression von KM871-hIL-2
  • Ein Vektor für die stabile Expression von KM871-hIL-2 wurde unter Verwendung des Vektors pKANTEX641 für die stabile Expression des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 (veröffentlichte, nicht geprüfte japanische Patentanmeldung 304989/93 ) und des Plasmids pBShCγ1-IL-2, das wie in Abschnitt 1(2) von Beispiel 2 beschrieben erhalten worden ist und eine das Fusionsprotein aus hCγ1 und hIL-2 codierende cDNA aufweist, wie nachfolgend beschrieben konstruiert.
  • Das Plasmid pKANTEX641 (3 μg), erhalten wie in Abschnitt 6(1) von Beispiel 1 beschrieben, wurde zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt und zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 mM Kaliumchlorid enthielt. Ferner zugemischt wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 30°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines ApaI-BamHI-Fragments von etwa 12,57 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pBShCγ1-IL-2, erhalten wie in Abschnitt 1(2) von Beispiel 2 beschrieben, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 mM Kaliumchlorid enthielt. Ferner zugemischt wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines ApaI-BamHI-Fragments von etwa 1,45 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg des so erhaltenen ApaI-BamHI-Fragments aus dem Plasmid pKANTEX641 und 0,1 μg des ApaI-BamHI-Fragments aus dem Plasmid pBShCγ1-IL-2 zu 10 μl Gesamtvolumen an sterilem Wasser gegeben und mit dem DNA-Ligationskit Ver. 2 (hergestellt von Pharmacia) nach Herstelleranleitung ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli DH5α transformiert, wobei der in 30 dargestellte stabile Expressionsvektor pKANTEX871-hIL-2 für KM871-hIL-2 erhalten wurde. Das so erhaltene Plasmid (10 μg) wurde mit dem AutoRead Sequenzierkit (hergestellt von Pharmacia) gemäß der Anleitung des Herstellers umgesetzt. Anschließend wurde die Nucleotidsequenz mit dem A. L. F. DNA-Sequenziergerät (hergestellt von Pharmacia) gemäß Anleitung des Herstellers unter Durchführung einer Elektrophorese ermittelt. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass ein Plasmid erhalten worden war, in das die interessierende DNA cloniert worden war.
  • (2) Expression von KM871-hIL-2 in tierischen Zellen
  • YB2/0-Zellen (ATCC CRL 1581) wurden mit 4 μg des Expressionsvektors pKANTEX871-hIL-2 für die stabile Expression von KM871-hIL-2, erhalten wie in Abschnitt 1(1) von Beispiel 3 beschrieben, nach dem in Abschnitt 6(2) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren transformiert und die Selektion wurde letztendlich mit G418 (0,5 mg/ml) und MTX (200 nM) durchgeführt. Hierdurch wurde ein transformierter Zellclon KM871hIL2 erhalten, der eine Expressionshöhe von etwa 4 μg/106 Zellen/24 Stunden aufwies. KM871hIL2 wurde ferner am 19. Oktober 1999 als FERM BP-6918 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan) hinterlegt.
  • (3) Aufreinigung von KM871-hIL-2 aus Kulturüberstand
  • Gemäß dem in Abschnitt 6(3) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde der transformierte Zellclon KM871hIL2, der wie in Abschnitt 1(2) von Beispiel 3 beschrieben erhalten wurde und KM871-hIL-2 exprimiert, gezüchtet, wodurch etwa 10 mg gereinigtes KM871-hIL-2 aus etwa 3 L Kulturüberstand erhalten wurden. Das Ergebnis einer SDS-PAGE mit gereinigtem KM871-hIL-2 ist in 31 dargestellt. Wie in 31 gezeigt, betrug das Molekulargewicht von aufgereinigtem KM871-hIL-2 unter nicht-reduzierenden Bedingungen etwa 180 kD und unter reduzierenden Bedingungen wurden zwei Banden von etwa 65 kD und etwa 25 kD gefunden. Diese Molekulargewichte stimmten fast mit den von den cDNA-Nucleotidsequenzen der H-Kette von KM8871-hIL-2 und hIL-2 und der L-Kette abgeleiteten Molekulargewichten überein (H-Kette und hIL-2: etwa 64 kD, L-Kette; etwa 24 kD, Gesamtmolekül: etwa 176 kD). Es wurde ferner bestätigt, dass die Struktur als Antikörpermolekül nach der Fusion mit hIL-2 erhalten blieb.
  • 2. In vitro-Evaluierung von KM871-hIL-2
  • (1) Reaktivität von KM871-hIL-2 mit GD3 (ELISA-Verfahren)
  • Die Reaktivität von gereinigtem KM871-hIL-2 mit GD3 (hergestellt von DIA-IATRON) wurde gemäß dem in Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessen. Dabei wurde ein mit Peroxidase markierter Ziege-anti-Mensch-IgG-(H & L) Antikörper (hergestellt von American Qualex, eingesetzt nach 3000-facher Verdünnung in 1% BSA-PBS) als sekundäre Antikörperlösung verwendet. In 32 ist das Untersuchungsergebnis zur Reaktivität dargestellt, wobei die Menge an an jede Vertiefung einer ELISA-Platte zu adsorbierendem GD3 auf 20 pMol/Vertiefung festgesetzt wurde und die Konzentration des zuzusetzenden, chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 und von KM871-hIL-2 variiert wurde. Wie in 32 gezeigt, wurde gefunden, dass KM871-hIL-2 eine Bindungsaktivität für GD3 aufweist, die der des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 gleicht oder höher ist. 33 stellt Untersuchungsergebnisse der Reaktivität einer konstanten Konzentration (6,7 nM) des chimären anti-GD3-Antikörpers KM8871 und von KM8871-hIL-2 dar, wobei die Arten an an jede Vertiefung einer ELISA-Platte zu adsorbierenden Gangliosiden (adsorbierte Menge: 20 pMol/Vertiefung) variiert wurden. Wie in 33 gezeigt, wurde gefunden, dass KM871-hIL-2 stark an GD3 bindet und zwar in ähnlicher Weise wie der chimäre anti-GD3-Antikörper KM871. Ferner wurde bestätigt, dass die Anheftung von hIL-2 keinen großen Einfluss auf die Antigenspezifität von KM871 hat.
  • (2) Reaktivität von KM871-hIL-2 mit GD3 auf der Zelloberfläche (Immunfluoreszenzverfahren)
  • Die Reaktivität von gereinigtem KM871-hIL-2 mit menschlichen Krebszellen wurde gemäß dem in Abschnitt 7(2) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in 34 dargestellt. Wie in 34 gezeigt, wies KM871-hIL-2 eine starke Reaktivität mit der menschlichen Melanom-Kulturzelllinie G361 und SK-MEL-28 auf, die fast identisch war mit der des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871. Diese Ergebnisse belegen, dass KM871-hIL-2 in der Behandlung usw. von GD3-positiven menschlichen Tumoren einschließlich Melanomen eingesetzt werden kann.
  • (3) Bewertung der hIL-2-Aktivität von KM871-hIL-2
  • Die Aktivität von gereinigtem KM871-hIL-2 als hIL-2 wurde mit dem in Abschnitt 3(2) von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in 35 dargestellt. Wie in 35 gezeigt, wies KM871-hIL-2 eine biologische Aktivität hinsichtlich der Förderung des CTLL-2-Wachstums auf, die der von hIL-2 glich. Diese Ergebnisse belegen, dass die hIL-2-Aktivität von KM8871-hIL-2 nach der Fusion mit dem chimären anti-GD3-Antikörper KM871 beibehalten wird.
  • (4) Aktivierung menschlicher Lymphozyten durch KM871-hIL-2
  • Um die Aktivierung menschlicher Lymphozyten und die gleichzeitige Erhöhung der zytotoxischen Aktivität durch den hIL-2-Anteil von KM871-hIL-2 in vitro zu ermitteln, wurde die zytotoxische Aktivität mit dem folgenden Verfahren gemessen, bei dem das in Abschnitt 7(4) von Beispiel 1 beschriebene Verfahren teilweise abgeändert wurde.
  • a. Herstellung der Zielzellsuspension
  • Gemäß dem in „a" von Abschnitt 7(4) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde eine menschliche Melanom-Kulturzelllinie, G-361, auf eine Dichte von 2 × 105 Zellen/ml eingestellt und als Zielzellsuspension verwendet.
  • b. Herstellung einer Effektorzellsuspension
  • Gemäß dem in „b" von Abschnitt 7(4) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden einkernige Zellen aus venösem Blut gesunder Patienten abgetrennt und in einer Dichte von 1 × 107 Zellen/ml resuspendiert, um als Effektorzellsuspension eingesetzt zu werden.
  • c. Aktivierung von Lymphozyten
  • Die in „b" hergestellte Effektorzellsuspension (50 μl) wurde in alle Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen in U-Bodenform (hergestellt von Falcon) verteilt (5 × 104 Zellen/Vertiefung). Darüber hinaus wurden 50 μl an RPMI1640-FBS(10)-Medium zugegeben, zu dem der chimäre anti-GD3-Antikörper KM871 oder KM871-hIL-2 zugegeben worden war, wodurch eine Endkonzentration von 1 nM erhalten wurde (das Molekulargewicht von KM871 wurde zu 150 kD berechnet und das Molekulargewicht von KM871-hIL-2 zu 180 kD). Die Inkubation erfolgte 72 Stunden bei 37°C in einem Inkubator bei einer Atmosphäre von 5% CO2.
  • d. Messung der zytotoxischen Aktivität
  • Die in „a" hergestellte Zielzellsuspension (50 μl) wurde in alle Vertiefungen der in „c" präparierten Platte gegeben (1 × 104 Zellen/Vertiefung). Dadurch wurde das Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen auf 5:1 eingestellt. Darüber hinaus wurden 50 μl an RPMI1640-FBS(10)-Medium zugegeben, zu dem der chimäre anti-GD3- Antikörper KM871 oder KM871-hIL-2 zugegeben worden war, wodurch eine Endkonzentration von 1 nM erhalten wurde. Nach der Reaktion bei 37°C für vier Stunden wurde die Platte zentrifugiert und die Menge an 51Cr im Überstand mit einem γ-Zähler gemessen. Die Menge des spontan dissoziierten 51Cr wurde dadurch berechnet, dass das gleiche Verfahren unter Verwendung lediglich von Medium anstelle der Effektorzellsuspension und der Antikörper-Lösung durchgeführt und die Menge an 51Cr im Überstand gemessen wurde. Die Menge des insgesamt dissoziierten 51Cr wurde dadurch berechnet, dass das gleiche Verfahren unter Zugabe lediglich von Medium anstelle der Antikörper-Lösung und 1 N Salzsäure anstelle der Effektorzellsuspension durchgeführt und die Menge an 51Cr im Überstand gemessen wurde. Die zytotoxische Aktivität wurde mit dem in „b" von Abschnitt 7(4) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren berechnet und die Ergebnisse sind in 36 dargestellt. Wie in 36 dargestellt, wurde gefunden, dass die durch KM871-hIL-2 induzierte zytotoxische Aktivität stärker war als die durch KM871 induzierte Aktivität. Auf der Grundlage dieses Ergebnis wird erwartet, dass KM871-hIL-2 die therapeutischen Wirkungen von KM871 in der klinischen Anwendung bei GD3-positiven Tumoren auch verbessert, indem menschliche Lymphozyten durch den hIL-2-Anteil aktiviert werden.
  • 3. In vivo-Evaluierung von KM871-hIL-2
  • (1) Herstellung von B16-Zell-Transfektanten, in die das GD3-Synthasegen eingeführt wurde, für ein syngeneisches Maus-Modell
  • a. Konstruktion eines Vektors für die stabile Expression des GD3-Synthasegens
  • Der Vektor pAMo-GD3 (3 μg; WO94/23020 ) für die Expression des GD3-Synthasegens in tierischen Zellen wurde zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt und zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01% Triton X-100 enthielt. Ferner zugemischt wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt und das durch die Spaltung mit dem Restriktionsenzym gebildete 5'-überhängende Ende wurde mit dem DNA Blunting Kit (hergestellt von Takara Suzo) in ein glattes Ende überführt. Die Reaktionslösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines HindIII-NotI-Fragments mit glatten Enden von etwa 2,1 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Anschließend wurden 3 μg des Vektors pKANTEX641 für die Expression des chimären anti-GD3-Antikörpers zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) wurden ferner dazu gegeben, wodurch die Reaktion bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt und das durch die Spaltung mit dem Restriktionsenzym gebildete 5'-überhängende Ende wurde mit dem DNA Blunting Kit (hergestellt von Takara Suzo) in ein glattes Ende überführt. Die Reaktionslösung wurde mit Ethanol gefällt, zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 10 mM Magnesiumchlorid enthielt. Der Lösung ferner zugemischt wurden 10 Einheiten eines das 5'-Ende dephosphorylierenden Enzyms, aus Kälberdarm stammender alkalischer Phosphatase (hergestellt von Takara Shuzo), wodurch die Reaktion zur Dephosphorylierung des 5'-Endes bei 37°C für eine Stunde durchgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Phenol behandelt and anschließend durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, wodurch etwa 2 μg eines EcoRI-NruI-Fragments mit glatten, dephosphorylierten Enden von etwa 9,4 kB mit dem QIAquick Gelextraktionskit (hergestellt von Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers gewonnen wurden.
  • Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-NruI-Fragments aus dem Plasmid pKANTEX641 und 0,1 μg des HindIII-NotI-Fragments aus dem Plasmid pAMoGD3, beide wie vorstehend beschrieben erhalten, zu 10 μl Gesamtvolumen an sterilem Wasser gegeben und mit dem DNA-Ligationskit Ver. 2 (hergestellt von Takara Shuzo) nach Herstelleranleitung ligiert. Mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli DH5α transformiert, wobei der in 37 dargestellte Expressionsvektor pKANTEXGD3 für die stabile Expression von GD3-Synthase erhalten wurde.
  • b. Einführung des Expressionsvektors für die Expression von GD3-Synthase in B16-Zellen
  • Mit 4 μg des Expressionsvektors pKANTEXGD3 für die stabile Expression von GD3-Synthase, erhalten wie in „a" von Abschnitt 3(1) von Beispiel 3 beschrieben, wurden B16.F10-Zellen (ATCC CRL 1581) gemäß dem in Abschnitt 6(2) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren transformiert und die Selektion wurde schlussendlich mit G418 (0,5 mg/ml) durchgeführt, wodurch die Transfektantenclone B16.8-3 und B16.29-30 erhalten wurden.
  • c. Analyse der GD3-Expressionshöhe der GD3 exprimierenden Linie mit einem Immunfluoreszenzverfahren
  • Jeweils 1 × 106 Zellen der GD3-Synthasegen-Transfektanten B16.8-3 und B16.29-10, erhalten in „b" von Abschnitt 3(1) von Beispiel 3 und der parentalen Zelllinie B16.F10 wurden in PBS suspendiert, in Mikroröhrchen überführt und zentrifugiert (2000 UpM für 2 Minuten). Die so gewaschenen Zellen wurden nach Zugabe von 50 μl des chimären anti-GD3-Antikörpers KM871 (einer Lösung, die durch Einstellen auf 5 μg/ml mit 1% BSA-PBS hergestellt wurde, die Negativkontrolle war 1% BSA-PBS allein) gerührt und die Reaktion lief anschließend eine Stunde bei 4°C ab. Nach der Reaktion und anschließender dreimaliger Zentrifugation mit PBS für Waschzwecke wurden die Zeilen mit 100 μl einer Lösung von Biotin-markiertem Ziege-anti-Mensch-IgG (H + L) (hergestellt von VEKTOR, eingesetzt nach 400-fachen Verdünnung in 1% BSA-PBS) vermischt, gerührt und anschließend 1 Stunde bei 4°C umgesetzt. Nach dreimaliger Zentrifugation mit PBS für Waschzwecke wurden 100 μl einer Lösung von Streptavidin-markiertem Cy5-Pigment (Streptavidin-RED670, hergestellt von GIBCO, eingesetzt nach durch 100-facher Verdünnung in 1% BSA-PBS) zugegeben und man ließ die Reaktion eine Stunde bei 4°C ablaufen. Nach der Reaktion und anschließender dreimaliger Zentrifugation mit PBS für Waschzwecke wurden die Zellen erneut in PBS resuspendiert, woraufhin die Analyse unter Verwendung des Flußzytometers EPICS Elite (hergestellt von COULTER) durchgeführt wurde. Wie in 38 dargestellt, reagierte der chimäre anti-GD3-Antikörper KM871 lediglich mit B16.8-3 und B16.29-10, zeigte aber keine Reaktivität mit Zellen der parentalen Linie B16.F10. Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass beide Transfektanten B16.8-3 und B16.29-10 GD3 auf ihrer Oberfläche exprimieren und als Modell zur in vivo- Messung der anti-Tumorwirkungen von KM871-hIL-2 dienen können, indem sie in C57 BL/6-Mäuse als Ursprung der B16-Zellen transplantiert werden.
  • (2) Messung der in vivo-anti-Tumorwirkungen von KM871-hIL-2
  • a. Auswertung bei Mäusen, die mit der GD3-exprimierenden Transformante B16.29-10 transplantiert worden waren
  • Die GD3-exprimierende B16-Zelle B16.29-10, erhalten in „b" von Abschnitt 3(1) von Beispiel 3 wurde in PBS suspendiert, wodurch eine Dichte von 2,5 × 106 Zellen/ml erhalten wurde und 100 μl der Suspension wurden über die Schwanzvene in eine C57 BL/6 Cr slc-Maus (Weibchen, 8 Wochen alt, erhältlich von Japan SLC) injiziert. Ferner wurden, beginnend mit dem Tag der Tumortransplantation, 50 oder 200 μg KM871 pro Tag oder 20 oder 50 μg KM871-hIL-2 pro Tag kontinuierlich einmal täglich über einen Zeitraum von 5 Tagen intravenös verabreicht. Die Lungen wurden am fünfzehnten Tag nach der Tumortransplantation entnommen und sichtbare schwarze metastatische Foci auf der Oberfläche gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und 39 dargestellt. Tabelle 3
    Gruppe Anzahl metastatischer Foci auf der Lungenoberfläche Durchschnittswert
    Gruppe ohne Verabreichung 147/136/106/72/70 106,2
    KM871-hIL-2 20 μg 20/15/11/2/2/1 8,5
    KM871-hIL-2 50 μg 15/12/5/2/0/0 5,7
    KM871 50 μg 185/114/86/77 115,5
    KM871 200 μg 113/87/86/86/77/55 84
  • Wie in Tabelle 3 und 39 gezeigt, zeigte KM871-hIL-2 eine klar bessere anti-metastatische Wirkung als KM871 im Mausmodell mit dem Clon B16.29-10.
  • b. Auswertung bei Mäusen, die mit der GD3-exprimierenden Transformante B16.8-3 transplantiert worden waren
  • Mit der GD3-exprimierenden B16-Zelle B16.8-3, erhalten in „b" von Abschnitt 3(1) von Beispiel 3, wurde die anti-metastatische Wirkung von KM871-hIL-2 gemäß dem in „a" von Abschnitt 3(2) von Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gemessen. Die Dosis betrug 40 oder 100 μg/Tag sowohl für KM871 wie auch für KM871-hIL-2. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 und 40 dargestellt. Tabelle 4
    Gruppe Anzahl metastatischer Foci auf der Lungenoberfläche Durchschnittswert
    Gruppe ohne Verabreichung 170/128/113/66/42/16/0 76,4
    KM871-hIL-2 40 μg 1/0/0 0,3
    KM871-hIL-2 100 μg 3/0/0 1
    KM871 40 μg 128/70/30 76
    KM871 100 μg 26/20/17 21
  • Wie in Tabelle 4 und 40 dargestellt, zeigte KM871-hIL-2 eine bessere anti-metastatische Wirkung als KM871 im Mausmodell mit dem Clon B16.8-3.
  • c. Vergleich mit kombinierter Verabreichung von KM871 und hIL-2
  • GD3-exprimierende B16-Zellen B16.29-10, erhalten in „b" von Abschnitt 3(1) von Beispiel 3 wurden in PBS suspendiert, wodurch eine Dichte von 2,5 × 106 Zellen/ml erhalten wurde und 100 μl der Suspension wurde über die Schwanzvene in eine C57 BL/6 Cr slc-Maus (Weibchen, 8 Wochen alt, erhältlich von Japan SLC) injiziert. Ferner wurden, beginnend mit dem Tag der Tumortransplantation, 6 μg/Tag (0,0333 nMol) oder 18 μg/Tag (0,1 nMol) an KM871-hIL-2 kontinuierlich einmal täglich über einen Zeitraum von 5 Tagen intravenös verabreicht. Unter Verwendung anderer Gruppen wurde eine gemischte Lösung von KM871 und hIL-2 (hergestellt von Peprotech), die der Menge an verabreichtem KM871-hIL-2 entsprach (5 μg (0,0333 nMol) an KM871 und 1 μg (0,0667 nMol an hIL-2 oder 15 μg (0,1 nMol) an KM871 und 3 μg (0,2 nMol) an hIL-2), beginnend mit dem Tag der Tumortransplantation kontinuierlich einmal täglich über einen Zeitraum von 5 Tagen intravenös verabreicht. Die Lungen wurden am fünfzehnten Tag nach der Tumortransplantation entnommen und sichtbare schwarze metastatische Foci auf der Oberfläche gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und 41 dargestellt. Tabelle 5
    Gruppe Anzahl metastatischer Foci auf der Lungenoberfläche Durchschnittswert
    Gruppe ohne Verabreichung 163/132/97/95/88/57 105,3
    KM871-hIL-2 6 μg 26/26/17/12/8 17,8
    KM871-hIL-2 18 μg 43/34/28/13/2 24
    KM871+hIL-2 5 μg + 1 μg 215/117/97/85/56 114
    KM871+hIL-2 15 μg + 3 μg 92/61/48/46/42 57,8
  • Wie in Tabelle 5 und 41 dargestellt, zeigte KM871-hIL-2 eine bessere anti-metastatische Wirkung als die verabreichte Kombination äquivalenter Mengen an KM871 und hIL-2 im Mausmodell mit dem Clon B16.29-10. Die Ergebnisse belegen, dass die in vivo von KM871-hIL-2 gezeigte anti-Tumorwirkung kein einfach additiver Effekt von KM871 und hIL-2 ist, sondern das Ergebnis der wirksamen Induktion einer anti-Tumorimmunität als Folge der Aktivierung peripherer Lymphozyten durch den hIL-2 Anteil von im Tumor akkumuliertem KM871-hIL-2. Somit ist eine Möglichkeit aufgezeigt, dass KM871-hIL-2 ein therapeutischer Wirkstoff werden wird, der eine höhere therapeutische Wirksamkeit aufweist, als die übliche Verabreichung von hIL-2 allein oder seine Verwendung in Kombination mit einem Antikörper und der gleichzeitig verminderte, von hIL-2 stammende Nebenwirkungen aufweist.
  • d. Evaluierung durch das Modell für feste Tumore im frühen Stadium von B16.29-10-Zellen
  • Die GD3-exprimierende B16-Zelle B16.29-10, erhalten in „b" von Abschnitt 3(1) von Beispiel 3, wurde in PBS resuspendiert, wobei eine Dichte von 1 × 107 Zellen/ml erhalten wurde. 50 μl dieser Suspension wurde: subkutan in C57 BL/6-Mäuse (Männchen, 7 Wochen alt, beziehbar über Charles River Japan) transplantiert. Die folgenden Verabreichungsgruppen wurden bereitgestellt und jeder Wirkstoff wurde kontinuierlich über einen Zeitraum von 5 Tagen einmal am Tag und zwar beginnend mit dem Tag der Tumortransplantation intravenös verabreicht. Gruppe, an die nicht verabreicht wurde
    hIL-2: 10 μg/Tag (0,667 nMol)
    KM871: 50 μg/Tag (0,333 nMol)
    KM871-hIL-2: 60 μg/Tag (0,333 nMol)
  • Der Test wurde unter Verwendung von 5 Tieren pro Gruppe durchgeführt. Jeder Wirkstoff wurde durch Verdünnen mit einem Citratpuffer auf eine Konzentration von 200 μl/Tier eingestellt. Fünf Tage nach der Transplantation wurde der Tumordurchmesser periodisch unter Verwendung eines Schiebe-Tastzirkels gemessen und die anti-Tumorwirkung wurde auf der Grundlage der Verhältnisses des Durchschnittswertes der Tumorvolumina in jeder Gruppe, an die verabreicht wurde, zum Durchschnittswert der Tumorvolumina in der Gruppe bewertet, an die nicht verabreicht wurde und der Anzahl von Tagen nach Beginn der Verabreichung, die die Mäuse überlebten. Das Tumorvolumen wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet: Tumorvolumen = (Breite)2 × Länge × 0,5
  • Der Durchschnittswert der Tumorvolumina in jeder Gruppe ist in Tabelle 6 dargestellt, die Ergebnisse des Verhältnisses des Durchschnittswertes der Tumorvolumina in jeder Gruppe zum Durchschnittswert der Tumorvolumina in der Gruppe, an die nicht verabreicht wurde sind in Tabelle 7 und 42 gezeigt und die Ergebnisse der Anzahl von Tagen, die die Mäuse überlebten, sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 6
    Tage nach der Verabreichung Gruppe ohne Verabreichung KM871 hIL-2 KM871-hIL-2
    0 0 0 0 0
    5 75 60 36 49
    7 131 82 67 34
    9 306 146 115 87
    11 756 494 359 231
    12 1325 939 489 332
    14 2333 1701 1147 733
    16 3656 3331 2268 1432
    20 7799 8345 5765 3381
  • Einheit ist mm3 Tabelle 7
    Tage nach der Verabreichung Gruppe ohne Verabreichung KM871 hIL-2 KM871-hIL-2
    0 1,000 1,000 1,000 1,000
    5 1,000 0,796 0,484 0,656
    7 1,000 0,624 0,510 0,261
    9 1,000 0,477 0,376 0,285
    11 1,000 0,654 0,475 0,305
    12 1,000 0,709 0,369 0,251
    14 1,000 0,729 0,492 0,314
    16 1,000 0,911 0,620 0,392
    20 1,000 1,070 0,739 0,434
    Tabelle 8
    Gruppe Überlebenstage nach Beginn der Verabreichung (Tage) Durchschnittswert (Tage)
    Gruppe ohne Verabreich. 24/27/27/30/30 27,6
    hIL-2 26/28/32/32/33 30,2
    KM871 27/30/30/32/35 30,8
    KM871-hIL-2 32/32/43/51/57 43,0
  • Wie in den Tabellen 6, 7 und 8 sowie 42 dargestellt, zeigte KM871-hIL-2 eine stärkere Wirkung auf die Wachstumsinhibierung und Lebensverlängerung als hIL-2 allein oder der Antikörper allein.
  • e. Evaluierung durch das Modell für feste Tumore im fortgeschrittenen Stadium von B16.29-10-Zellen
  • Die GD3-exprimierende B16-Zelle B16.29-10 wurde in PBS resuspendiert, wobei eine Dichte von 1 × 108 Zellen/ml erhalten wurde. 50 μl dieser Suspension wurde subkutan in C57 BL/6-Mäuse (Männchen, 7 Wochen alt, beziehbar über Charles River Japan) transplantiert. Die folgenden Verabreichungsgruppen wurden bereitgestellt und die Tumorvolumina wurden am sechsten Tag nach der Tumortransplantation mit dem in „d" von Abschnitt 3(2) von Beispiel 3 beschriebenen Messverfahren berechnet, um Individuen im Bereich von 10 bis 80 mm3 auszuwählen und anschließend wurde jeder der folgenden Wirkstoffe kontinuierlich über einen Zeitraum von 8 Tagen einmal am Tag intravenös verabreicht. Gruppe, an die nicht verabreicht wurde
    hIL-2: 10 μg/Tag (0,667 nMol)
    KM871: 50 μg/Tag (0,333 nMol)
    KM871: 200 μg/Tag (1,33 nMol)
    KM871-hIL-2: 24 μg/Tag (0,133 nMol)
    KM871-hIL-2: 60 μg/Tag (0,333 nMol)
  • Der Test wurde unter Verwendung von lediglich 3 Tieren in der Gruppe, in der 60 μg KM871-hIL-2 pro Tag verabreicht wurden und 5 Tieren pro Gruppe bei den anderen Gruppen durchgeführt. Jeder Wirkstoff wurde durch Verdünnen mit Citratpuffer auf eine Konzentration von 200 μl/Tier eingestellt. Mit Beginn des Tages der Transplantation wurde der Tumordurchmesser periodisch unter Verwendung von Schiebe-Tastzirkeln gemessen und die anti-Tumorwirkung wurde auf der Grundlage des Verhältnisses des Durchschnittswertes der Tumorvolumina am Tag, an dem gemessen wurde und der Tumorvolumina am Tag des Beginns der Verabreichung an jede Maus in jeder Behandlungsgruppe (nachstehend bezeichnet als „V/V0") zu V/V0 der Gruppe, an die nicht verabreicht wurde und der Anzahl von Tagen nach Beginn der Verabreichung, die die Mäuse überlebten, beurteilt.
  • Die Ergebnisse von V/V0 in jeder Gruppe sind in Tabelle 9 dargestellt, die Ergebnisse des Verhältnisses von V/V0 in jeder Gruppe zu V/V0 der Gruppe, an die nicht verabreicht wurde, sind in Tabelle 10 und 43 dargestellt und die Ergebnisse der Anzahl von Tagen nach Beginn der Verabreichung, die die Mäuse überlebten, sind in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 9
    Tage Gruppe ohne Verabreichung hIL-2 10 μg KM871 50 μg KM871 200 μg KM871-hIL-2 24 μg KM871-hIL-2 60 μg
    0 1,00 1.00 1,00 1,00 1,00 1,00
    2 2,15 3,03 2,57 1,86 2,09 1,54
    4 5,36 6,15 6,37 4,98 3,79 2,88
    6 13,18 14,31 14,43 9,35 8,12 6,85
    7 16,45 17,68 18,99 11,22 10,05 8,58
    8 21,09 21,31 24,05 16,56 13,04 11,50
    9 28,95 28,42 33,43 21,08 16,10 15,19
    11 54,97 48,52 56,07 42,65 29,13 27,01
    13 93,70 86,85 100,34 74,16 58,17 49,80
    Tabelle 10
    Tage Gruppe ohne Verabreichung hIL-2 10 μg KM871 50 μg KM871 200 μg KM871-hIL-2 24 μg KM871-hIL-2 60 μg
    0 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000
    2 1,000 1,406 1,196 0,862 0,973 0,718
    4 1,000 1,147 1,187 0,928 0,706 0,537
    6 1,000 1,086 1,096 0,710 0,616 0,520
    7 1,000 1,075 1,155 0,682 0,611 0,522
    8 1,000 1,011 1,141 0,785 0,619 0,545
    9 1,000 0,982 1,155 0,728 0,556 0,525
    11 1,000 0,883 1,020 0,776 0,530 0,491
    13 1,000 0,927 1,071 0,791 0,621 0,531
    Tabelle 11
    Gruppe Überlebenstage nach Beginn der Verabreichung (Tage) Durchschnittswert (Tage)
    Gruppe ohne Verabreichung. 15/23/23/24/34 23,8
    hIL-2 15/15/18/27/29 20,8
    KM871 50 μg 19/20/23/30/34 25,2
    KM871 200 μg 18/19/23/27/34 24,2
    KM871-hIL-2 24 μg 29/38/39/41/49 39,2
    KM871-hIL-2 60 μg 29/32/37 32,7
  • Wie in den Tabellen 9, 10 und 11 sowie 43 dargestellt, zeigte KM871-hIL-2 eine stärkere Wirkung auf die Wachstumsinhibierung und Lebensverlängerung als hIL-2 allein oder der Antikörper allein.
  • f. Wirkung der kombinierten Verwendung von KM871 und KM871-hIL-2 im Modell für feste Tumore im fortgeschrittenen Stadium von B16.29-10-Zellen
  • Die GD3-exprimierende B16-Zelle B16.29-10, erhalten in „b" von Abschnitt 3(1) von Beispiel 3 wurde in PBS resuspendiert, wobei eine Dichte von 1 × 108 Zellen/ml erhalten wurde. 50 μl dieser Suspension wurde subkutan in C57 BL/6-Mäuse (Männchen, 7 Wochen alt, beziehbar über Charles River Japan) transplantiert. Die folgenden Verabreichungsgruppen wurden bereitgestellt und die Tumorvolumina wurden am sechsten Tag nach der Tumortransplantation (Tag 0) mit dem in „d" von Abschnitt 3(2) von Beispiel 3 beschriebenen Messverfahren berechnet, um Individuen im Bereich von 10 bis 100 mm3 auszuwählen und anschließend wurde jeder der folgenden Wirkstoffe intravenös verabreicht. Gruppe, an die nicht verabreicht wurde
    hIL-2: 10 μg/Tag × 5 Tage kontinuierliche Verabreichung (Tag 0 bis Tag 4)
    KM871: 800 μg/Tag × einmalige Verabreichung (Tag 0)
    KM871 + KM871-hIL-2: 800 μg/Tag × einmalige Verabreichung (Tag 0) + 15 μg/Tag × 5 Tage kontinuierliche Verabreichung (Tag 0 bis Tag 4)
    KM871 + KM871-hIL-2: 800 μg/Tag × einmalige Verabreichung (Tag 0) + 60 μg/Tag × 5 Tage kontinuierliche Verabreichung (Tag 0 bis Tag 4)
  • Der Test wurde unter Verwendung von 5 Tieren pro Gruppe durchgeführt. Jeder Wirkstoff wurde durch Verdünnen mit einem Citratpuffer auf eine Konzentration von 200 μl/Tier eingestellt. Mit Beginn des Tages der Transplantation wurde der Tumordurchmesser periodisch unter Verwendung von Schiebe-Tastzirkeln gemessen und die anti-Tumorwirkung wurde auf der Grundlage des Verhältnisses von V/V0 in jeder behandelten Gruppe zu V/V0 der Gruppe, an die nicht verabreicht wurde und der Anzahl von Tagen nach Beginn der Verabreichung, die die Mäuse überlebten, beurteilt. Die Ergebnisse von V/V0 in jeder Gruppe sind in Tabelle 12 dargestellt, die Ergebnisse des Verhältnisses von V/V0 in jeder Gruppe zu V/V0 in der Gruppe, an die nicht verabreicht wurde, sind in Tabelle 13 und 44 dargestellt und die Ergebnisse der Anzahl von Tagen, die die Mäuse überlebten, sind in Tabelle 14 gezeigt. Tabelle 12
    Tage Gruppe ohne Verabreichung hIL-2 10 μg × 5 KM871 800 μg × 1 KM871 + KM871-hIL-2 800 μg × 1 + 15 μg × 5 KM871 + KM871-hIL-2 800 μg × 1 + 60 μg × 5
    0 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
    2 3,09 2,76 1,81 1,68 1,49
    4 8,54 4,10 4,10 2,56 2,68
    6 17,48 9,96 14,17 6,42 6,03
    8 46,84 20,63 25,08 11,62 10,58
    10 63,99 33,09 49,33 22,98 17,65
    12 104,89 57,06 75,47 38,46 27,76
    Tabelle 13
    Tage Gruppe ohne Verabreichung hIL-2 10 μg × 5 KM871 800 μg × 1 KM871 + KM871-hIL-2 800 μg × 1 + 15 μg × 5 KM871 + KM871-hIL-2 800 μg × 1 + 60 μg × 5
    0 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
    2 1,00 0,89 0,59 0,54 0,48
    4 1,00 0,48 0,48 0,30 0,31
    6 1,00 0,57 0,81 0,37 0,34
    8 1,00 0,44 0,54 0,25 0,23
    10 1,00 0,52 0,77 0,36 0,28
    12 1,00 0,54 0,72 0,37 0,26
    Tabelle 14
    Gruppe Überlebenstage nach Beginn der Verabreichung (Tage) Durchschnittswert (Tage)
    Gruppe ohne Verabreich. 9/12/16/16/29 16,4
    hIL-2 17/17/24/32/36 25,2
    KM871 8/16/17/26/31 19,6
    KM871 + KM871-hIL-2 15 μg 17/24/29/32/43 29,7
    KM871 + KM871-hIL-2 60 μg 29/29/36/36/43 34,6
  • Wie in Tabelle 12, Tabelle 13, 44 und Tabelle 14 dargestellt, zeigte die kombinierte Verabreichung von KM871 und KM871-hIL-2 einen stärker inhibierenden Effekt auf das Wachstum und einen stärkeren Effekt auf die Verlängerung des Lebens als hIL-2 allein oder der Antikörper allein. Diese Ergebnisse zeigen die Möglichkeit auf, dass die kombinierte Verabreichung von KM871-hIL-2 und KM871 ein ausgezeichnetes Verfahren zur Therapie von GD-3-positiven Tumoren wird.
  • 4. Analyse des in vivo-anti-Tumor-Mechanismus von KM871-hIL-2
  • (1) Aktivierung von Maus-Effektorzellen und Erhöhung der zytotoxischen Aktivität von KM871-hIL-2
  • Um die Aktivierung von Maus-Effektorzellen durch den hIL-2-Anteil von KM871-hIL-2 und die damit einhergehende Erhöhung der zytotoxischen Aktivität zu bewerten, wurde die zytotoxische Aktivität gemäß nachstehend beschriebenem Verfahren gemessen.
  • a. Präparation der Maus-Effektorzellsuspension
  • Die folgenden Verabreichungsgruppen wurden unter Verwendung von C57 BL/6-Mäusen (weiblich, 8 Wochen alt, Japan SLC) aufgestellt und jeder Wirkstoff wurde intravenös verabreicht. Gruppe, an die nicht verabreicht wurde
    hIL-2: 10 μg (0,667 nMol)/Tag × 5 Tage kontinuierlicher Verabreichung (Tag 0 bis Tag 4)
    KM871-hIL-2: 60 μg (0,333 nMol)/Tag × einmalige Verabreichung (zweiter Tag)
    KM871-hIL-2: 60 μg (0,333 nMol)/Tag × zwei Verabreichungen (Tag 0 und Tag 2)
  • Nach Abschluss aller Verabreichungen am vierten Tag wurde die Milz entfernt, unter Verwendung eines Objektträgerglases in 6 ml RPMI1640-FBS(10) zerkleinert und anschließend durch ein Nylonnetz mit einer Maschenweite von 70 μm (hergestellt von Falcon) passagiert, wodurch eine Suspension von Splenozyten hergestellt wurde. Ein Dichte-Trennmedium für Mauslymphozyten (5 ml), Lympholite-M, wurde in ein 15 ml Röhrchen gegeben, vorsichtig mit 5 ml der so erhaltenen Splenozytensuspension überschichtet und dann 20 Minuten bei Raumtemperatur und 1000 × g zentrifugiert. Die Lymphozytenschicht der Phasengrenzfläche wurde unter Verwendung einer Tropfpipette entnommen, es wurden 10 ml RPMI1640-FBS(10)-Medium zugesetzt und das Gemisch wurde zentrifugiert (800 × g, 4°C, 10 Minuten). Anschließend wurde der Überstand zum Waschen entfernt. Nach nochmaligem Wiederholen des Waschvorgangs wurde eine Effektorzellsuspension hergestellt, wobei eine Enddichte von 2 × 107 Zellen/ml durch Zugabe von RPMI1640-FBS(10)-Medium erzielt wurde.
  • b. Präparation der Zielzellsuspension
  • Gemäß dem in in „a" von Abschnitt 7(4) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde die die in „b" von Abschnitt 3(1) von Beispiel 3 erhaltene GD3 exprimierende B16-Zelle B16.29-10 mit 51Cr markiert, wodurch 2 × 105 Zellen/ml einer Zielzellsuspension erhalten wurden.
  • c. Messung der zytotoxischen Aktivität
  • Jeweils 100 μl der in „a" präparierten Effektorzellsuspension, 50 μl der in „b" präparierten Zielzellsuspension (1 × 104 Zellen/Vertiefung) und seriell mit RPMI1640-FBS(10)-Medium verdünnter KM871, wobei eine Endkonzentration von 0, 0,05, 0,5 oder 50 μg/ml erzielt wurde, wurden zu jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen mit U-förmigem Boden gegeben. Dabei betrug das Verhältnis der Effektorzellen zu den Zielzellen 200:1. Nach der Reaktion für 10 Stunden bei 37°C wurde die Platte zentrifugiert und die Menge an 51Cr im Überstand wurde mit einem γ-Zähler gemessen. Die Menge des spontan dissoziierten 51Cr wurde dadurch berechnet, dass das gleiche Verfahren unter Verwendung lediglich von Medium anstelle der Effektorzellsuspension und der Antikörper-Lösung durchgeführt und die Menge an 51Cr im Überstand gemessen wurde. Die Menge des insgesamt dissoziierten 51Cr wurde dadurch berechnet, dass das gleiche Verfahren unter Zugabe lediglich von Medium anstelle der Antikörper-Lösung und 1 N Salzsäure anstelle der Effektorzellsuspension durchgeführt und die Menge an 51Cr im Überstand gemessen wurde. Die zytotoxische Aktivität wurde mit dem in „b" von Abschnitt 7(4) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren berechnet. Ergebnisse sind in 45 gezeigt. Wie in 45 dargestellt, wurde gefunden, dass KM871-hIL-2 die zytotoxische Aktivität sowohl nach einmaliger wie auch nach zweimaliger Verabreichung stärker induziert als die fünfmalige Verabreichung von hIL-2.
  • (2) Analyse der durch KM871-hIL-2 aktivierten Effektorzellen (Immunfluoreszenzverfahren)
  • Um die Einflüsse der Verabreichung von KM871-hIL-2 auf Effektorzellen zu messen, die den Antitumoreffekt im Mausmodell betreffen, wurde eine Flusszytometeranalyse gemäß folgendem Verfahren durchgeführt. Die GD3 exprimierende, in „b" von Abschnitt 3(1) von Beispiel 3 erhaltene B16-Zelle B16.29-10 wurde in PBS suspendiert, wobei eine Dichte von 1 × 107 Zellen/ml erhalten wurde und 50 μl der Suspension wurde unter die Bauchhaut einer C57 BL/6-Maus (männlich, 7 Wochen alt, erhältlich von Charles River Japan) transplantiert. Durch Aufstellen der nachfolgend genannten Verabreichungsgruppen wurde jeder Wirkstoff einmal am Tag kontinuierlich 5 Tage lang intravenös verabreicht, wobei am Tag der Tumortransplantation begonnen wurde. Gruppe, bei der nicht verabreicht wurde
    hIL-2 10 μg/Tag (0,667 nMol)
    KM871-hIL-2: 60 μg/Tag (0,333 nMol)
  • Bei KM871-hIL-2 (60 μg/Tag) wurde auch eine Gruppe aufgestellt, bei der die Häufigkeit der Verabreichung auf zwei Mal vermindert wurde (am Tag der Transplantation und am dritten Tag nach der Transplantation). Der Test wurde unter Verwendung von zwei Tieren pro Gruppe durchgeführt. Nach Abschluss aller Verabreichungen am vierten Tag nach der Transplantation wurde die Milz entfernt, unter Verwendung eines Objektträgerglases in 6 ml RPMI1640-FBS(10) zerkleinert und anschließend durch ein Nylonnetz mit einer Maschenweite von 70 μm (hergestellt von Falcon) passagiert, wodurch eine Suspension von Splenozyten hergestellt wurde. Ein Dichte-Trennmedium für Mauslymphozyten (5 ml), Lympholite-M, wurde in ein 15 ml Röhrchen gegeben, vorsichtig mit 5 ml der so erhaltenen Splenozytensuspension überschichtet und dann 20 Minuten bei Raumtemperatur und 1000 × g zentrifugiert. Die Lymphozytenschicht der Phasengrenzfläche wurde unter Verwendung einer Tropfpipette entnommen, es wurden 10 ml RPMI1640- FBS(10)-Medium zugesetzt und das Gemisch wurde zentrifugiert (800 × g, 4°C, 10 Minuten). Anschließend wurde der Überstand zum Waschen entfernt. Nach nochmaligem Wiederholen des Waschvorgangs wurde eine Milzlymphozytensuspension hergestellt, wobei eine Enddichte von 3 × 107 Zellen/ml durch Zugabe von 1% BSA-PBS enthaltend 5% Mausserum (hergestellt von Chemicon) erzielt wurde. Die Lymphozytensuspension wurde ad 50 μl in eine Platte mit 96 Vertiefungen und U-förmigem Boden zugetropft und jeder der nachfolgend genannten Fluoreszenz-markierten Antikörper wurde auch dazugegeben, wodurch die Reaktion eine Stunde bei 4°C durchgeführt wurde.
    Phycoerythrin (nachfolgend als „PE" bezeichnet) – markierter Ratten-anti-Maus-CD4-Antikörper (hergestellt von CEDERLANE): 3 μl
    FITC-markierter Ratten-anti-Maus-CD8-Antikörper (hergestellt von Serotec): 5 μl
    FITC-markierter Ratten-anti-Maus-NK-Zell-Antikörper (hergestellt von Serotec): 15 μl
    FITC-markierter Ratten-anti-Maus-Makrophagen-Antikörper (hergestellt von Serotec): 10 μl
    PE-markierter Ratten-anti-Maus-Neutrophilen-Antikörper (hergestellt von Caltac): 5 μl
  • Mittels eines Flusszytometers EPICS ELITE (hergestellt von Coulter) wurde das Verhältnis der mit jedem Antikörper gefärbten Gruppe zur Gesamtzahl intakter Zellen berechnet und die Ergebnisse sind in Tabelle 15 und 46 dargestellt. Jede Zahl in der Tabelle zeigt den Durchschnittswert von zwei Tieren in jeder Gruppe (Einheit: %) Tabelle 15
    CD4+ T-Zelle CD8+ T-Zelle NK-Zelle Makrophage Neutrophile
    Keine Behandlung 28,5 21,7 3,71 0,643 7,63
    hIL-2 5 × Verabreichung 21,3 20,7 16,2 0,448 13,9
    KM871-hIL-2 5 × Verabreichung 16,1 20,9 18,6 0,392 7,26
    KM871-hIL-2 2 × Verabreichung 27,2 28,8 17,0 0,498 6,06
  • Wie in Tabelle 15 und 46 dargestellt, wurde eine Erhöhung im Verhältnis von NK-Zellen in den Milzlymphozyten durch Verabreichung sowohl von hIL-2 wie auch von KM871-hIL-2 beobachtet. Die Ergebnisse zeigen eine Möglichkeit auf, dass die anti-Tumorwirkung von KM871-hIL-2 durch die Proliferation von NK-Zellen erhöht wird.
  • (3) Effektorzell-Analyse der anti-Tumorwirkung unter Verwendung eines in vivo Depletionsverfahrens (in vitro-zytotoxische Aktivität)
  • Die mechanistische Analyse der anti-Tumorwirkung von KM871-hIL-2 wurde mit dem nachfolgend dargestellten Verfahren durchgeführt. Dabei wurden Mäuse eingesetzt, die durch Verabreichung von Antikörpern gegen NK-Zellen, CD4-positive T-Zellen (Helfer-T-Zellen) und CD8-positive T-Zellen (zytotoxische T-Zellen), als auf IL-2 reagierende Effektorzellen in der anti-Tumorimmunität, in Mäusen präpariert wurden, wodurch die jeweiligen Zellgruppen aus dem Tierkörper eliminiert wurden. Die GD3-exprimierende B16-Zelle B16.29-10, erhalten in „b" von Abschnitt 3(1) von Beispiel 3, wurde in einer Dichte von 5 × 106 Zellen/ml in PBS suspendiert und 100 μl der Suspension wurden intravenös in C57 BL/6-Mäuse (männlich, 7 Wochen alt, beziehbar von Charles River Japan) injiziert. Ferner wurde KM871-hIL-2 intravenös bei einer Dosis von 24 μg/Tag einmal am Tag an fünf aufeinanderfolgenden Tagen (Tag null bis vierter Tag) verabreicht, wobei am Tag der Tumortransplantation begonnen wurde (Tag null). Gleichzeitig wurde die Gruppe, an die nicht verabreicht wurde, als Kontrollgruppe eingesetzt. Darüber hinaus wurden die Gruppen, an die KM871-hIL-2 verabreicht wurde sowie die Gruppen, an die nicht verabreicht wurde, in gleicher Weise auf Mäuse eingestellt, in die jeweils anti-Maus-NK1.1-Antikörper, anti-Maus-CD4-Antikörper und anti-Maus-CD8-Antikörper durch intraperitoneale Injektion drei Mal mit einer Dosis von 0,5 mg/Tag verabreicht wurden (– dritter Tag, erster Tag und dritter Tag). Fünf Tage nach der Tumortransplantation wurde die Milz entfernt und die zytotoxische Aktivität wurde mit dem in Abschnitt 4(1) von Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gemessen. Dabei wurde die Konzentration von KM871 zum Zeitpunkt des Tests auf 10 μg/ml festgesetzt und die Testzeit wurde auf 4 Stunden eingestellt. Die Ergebnisse sind in 47 dargestellt. Wie in 47 gezeigt, wurde gefunden, dass die Haupteffektorzelle der anti-Tumorwirkung von KM871-hIL-2 im Mausmodell die NK-Zelle ist.
  • (4) Effektorzell-Analyse der anti-Tumorwirkung unter Verwendung eines in vivo Depletionsverfahrens (in vivo anti-Tumorwirkung)
  • Die mechanistische Analyse der anti-Tumorwirkung von KM871-hIL-2 wurde mit dem nachfolgend dargestellten Verfahren durchgeführt. Dabei wurden Mäuse eingesetzt, die durch Verabreichung von Antikörpern gegen NK-Zellen, CD4-positive Zellen (Helfer-T-Zellen) und CD8-positive Zellen (zytotoxische T-Zellen), als auf IL-2 reagierende Effektorzellen in der anti-Tumorimmunität, in Mäusen präpariert wurden, wodurch die jeweiligen Zellgruppen aus dem Tierkörper eliminiert wurden. Die GD3-exprimierende B16-Zelle B16.29-10, erhalten in „b" von Abschnitt 3(1) von Beispiel 3 wurde in einer Dichte von 5 × 106 Zellen/ml in PBS suspendiert und 100 μl der Suspension wurden intravenös in C57 BL/6-Mäuse (männlich, 7 Wochen alt, beziehbar von Charles River Japan) injiziert. Ferner wurde KM871-hIL-2 intravenös bei einer Dosis von 24 μg/Tag einmal am Tag an fünf aufeinanderfolgenden Tagen (Tag null bis vierter Tag) verabreicht, wobei am Tag der Tumortransplantation begonnen wurde (Tag null). Gleichzeitig wurde die Gruppe, an die nicht verabreicht wurde, als Kontrollgruppe eingesetzt. Darüber hinaus wurden die Gruppen, an die KM871-hIL-2 verabreicht wurde sowie die Gruppen, an die nicht verabreicht wurde, in gleicher Weise auf Mäuse eingestellt, in die jeweils anti-Maus-NK1.1-Antikörper, anti-Maus-CD4-Antikörper und anti-Maus-CD8-Antikörper durch intraperitoneale Injektion vier Mal mit einer Dosis von 0,5 mg/Tag verabreicht wurden (– dritter Tag, erster Tag, dritter Tag und siebter Tag). Am 15. Tag nach der Tumortransplantation wurden die Lungen entfernt und die sichtbaren schwarzen metastatischen Foci auf der Oberfläche wurden gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 und 48 dargestellt. Tabelle 16
    Verabreichung Eliminierung Anzahl metastatischer Foci Durchschnittswert Inhibierung Metastase Verhältnis (%)
    Keine Keine NK-Zelle CD4+-T-Zelle CD8+-T-Zelle 302 274 269 234 177 176 173 443 430 389 380 373 361 359 291 271 218 211 197 176 115 112 266 226 191 191 182 144 73 229,3 390,7 198,9 181,9 0,0 0,0 0,0 0,0
    KM871-hIL-2 24 μg Keine NK-Zelle CD4+-T-Zelle CD8+-T-Zelle 77 54 46 46 36 422 384 358 356 352 164 134 103 95 47 88 67 53 35 21 51,8 374,4 108,6 52,8 77,4 4,2 45,4 71,0
  • Wie in Tabelle 16 und 48 gezeigt, wurde gefunden, dass die Haupteffektorzelle der anti-Tumorwirkung von KM871-hIL-2 im Tiermodell die NK-Zelle ist. Da ferner die partielle Inhibierung der anti-Tumorwirkung im Zuge der Eliminierung der CD4-positiven T-Zellen beobachtet wurde, wird die Möglichkeit vorgeschlagen, dass CD4-positive T-Zellen direkt in die anti-Tumorwirkung von KM871-hIL-2 involviert sind und zwar durch Aktivierung von NK-Zellen.
  • Industrielle Anwendung
  • Erfindungsgemäß werden ein menschlicher, durch CDR-grafting erzeugter Antikörper, der spezifisch mit GD3 reagiert oder das Antikörperfragment davon und Derivate eines Antikörpers gegen das Gangliosid GD3 oder das Antikörperfragment davon bereitgestellt.
  • Freier Text der Sequenzlisten
    • SEQ ID Nr.: 9 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Aminosäuresequenz, erhalten mit synthetisch hergestellter DNA
    • SEQ ID Nr.: 10 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Aminosäuresequenz, erhalten mit synthetisch hergestellter DNA
    • SEQ ID Nr.: 11 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 12 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 13 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 14 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 15 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 16 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 17 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 18 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 19 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 20 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 21 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 22 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 23 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 24 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 25 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 26 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 27 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 28 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 29 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 30 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 31 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 32 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 33 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 34 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 35 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 36 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 37 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 38 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 39 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 40 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 41 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 42 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 43 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 44 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 45 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 46 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 47 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 48 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 49 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 50 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 51 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 52 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Synthetisch hergestellte DNA
    • SEQ ID Nr.: 53 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Aminosäuresequenz, erhalten mit synthetisch hergestellter DNA
    • SEQ ID Nr.: 54 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Aminosäuresequenz, erhalten mit synthetisch hergestellter DNA
    • SEQ ID Nr.: 57 – Erläuterung der künstlichen Sequenz: Aminosäuresequenz, erhalten mit synthetisch hergestellter DNA
  • SEQUENZLISTE
    Figure 01130001
  • Figure 01140001
  • Figure 01150001
  • Figure 01160001
  • Figure 01170001
  • Figure 01180001
  • Figure 01190001
  • Figure 01200001
  • Figure 01210001
  • Figure 01220001
  • Figure 01230001
  • Figure 01240001
  • Figure 01250001
  • Figure 01260001
  • Figure 01270001
  • Figure 01280001
  • Figure 01290001
  • Figure 01300001
  • Figure 01310001
  • Figure 01320001
  • Figure 01330001
  • Figure 01340001
  • Figure 01350001
  • Figure 01360001
  • Figure 01370001
  • Figure 01380001
  • Figure 01390001
  • Figure 01400001
  • Figure 01410001
  • Figure 01420001
  • Figure 01430001
  • Figure 01440001
  • Figure 01450001
  • Figure 01460001
  • Figure 01470001
  • Figure 01480001
  • Figure 01490001
  • Figure 01500001
  • Figure 01510001
  • Figure 01520001
  • Figure 01530001
  • Figure 01540001

Claims (12)

  1. Menschlicher, durch CDR-grafting erzeugter Antikörper oder das Antikörperfragment davon, das spezifisch mit Gangliosid GD3 reagiert, wobei die V-Region der H-Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 9 umfasst; und die V-Region der L-Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 54 umfasst, und wobei das Antikörperfragment ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fab, Fab', F(ab')2, scFv und dsFv.
  2. Menschlicher, durch CDR-grafting erzeugter Antikörper oder das Antikörperfragment davon gemäß Anspruch 1, wobei der menschliche, durch CDR-grafting erzeugte Antikörper ferner umfasst: eine C-Region der H-Kette und eine C-Region der L-Kette eines menschlichen Antikörpers.
  3. Menschlicher, durch CDR-grafting erzeugter Antikörper oder das Antikörperfragment davon gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der menschliche, durch CDR-grafting erzeugte Antikörper hergestellt wird von einer Transformante KM8871 (FERM BP-6790).
  4. DNA, die den menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper oder das Antikörperfragment davon codiert, welches spezifisch mit Gangliosid GD3 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 reagiert.
  5. Rekombinanter Vektor umfassend die DNA gemäß Anspruch 4.
  6. Transformante, die durch das Einführen des rekombinanten Vektors gemäß Anspruch 5 in eine Wirtszelle hergestellt wird.
  7. Transformante KM8871 (FERM BP-6790), die den menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper gemäß Anspruch 3 herstellt.
  8. Verfahren zum Herstellen eines Antikörpers, das umfasst: Züchten der Transformante gemäß Anspruch 6 oder 7 in einem Kulturmedium, um den menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper oder das Antikörperfragment davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 herzustellen und in der Kultur anzureichern; und Gewinnen des Antikörpers oder des Antikörperfragments davon aus der Kultur.
  9. Arzneimittel, umfassend den menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper oder das Antikörperfragment davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
  10. Verwendung des menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers oder des Antikörperfragments davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.
  11. Diagnostisches Mittel, welches als einen Wirkstoff den menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörper oder das Antikörperfragment davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
  12. Verwendung des menschlichen, durch CDR-grafting erzeugten Antikörpers oder des Antikörperfragments davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung eines Diagnosemittels zur Diagnose von Krebs.
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