DE60035977T2 - MIT FTA BESCHICHTETER TRäGER ZUR VERWENDUNG ALS MOLEKULARES DIAGNOSEMITTEL - Google Patents

MIT FTA BESCHICHTETER TRäGER ZUR VERWENDUNG ALS MOLEKULARES DIAGNOSEMITTEL Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung, Medien sowie Verfahren zur DNA-Evaluation.
  • STAND DER TECHNIK
  • Genotypisierung ist das wissenschaftliche Gebiet der Identifizierung des Genoms eines Einzeln in Bezug auf Allele und/oder Mutationen, die für eine Krankheit spezifisch sind, und die als Auswirkung einer elterlichen Verbindung auftreten. Die schnelle Reinigung menschlicher genomischer DNA ist ein essentieller Teil des Genotypisierungsverfahrens, wobei die genomische DNA eines Einzelnen die strukturelle Einheit für die gesamte DNA-Sequenz jedes exprimierten Alleles ist.
  • Menschliche genomische DNA kann nicht direkt sequenziert werden. Um eine Sequenzanalyse in Chromosomenregionen auszuführen, die Abschnitte von mutations- oder krankheits-spezifischen Sequenzen enthalten, werden ausgewählte Abschnitte mittels PCR amplifiziert, und die amplifizierten Produkte sequenziert. Die ausgewählten Abschnitte auf den Chromosomen, die amplifiziert werden, werden durch die spezifische Sequenz der Primer vorgegeben, die bei der PCR-Amplifizierung eingesetzt werden. Die Primersets, die bei den Genotypisierungs-Studien eingesetzt werden, sind kommerziell erhältlich und sind für das zu untersuchende Chromosom repräsentativ. Wenn durch Verbindungsuntersuchungen herausgefunden wird, dass eine mit einer Krankheit verbundene Sequenz auf einem bestimmten Chromosom liegt, dann werden viele Primersets für dieses Chromosom eingesetzt, um genetisches Material für die Sequenzierung zu erhalten. Die resultierenden PCR-Produkte können das gesamte untersuchte Chromosom gut repräsentieren. Aufgrund der bedeutenden Länge der Chromosomen werden viele PCR-Reaktionen auf genomischen DNA-Templates eines einzelnen Patienten aufgeführt.
  • Menschliche genomische DNA kann durch eine Vielzahl von Verfahren gereinigt werden (Molecular Cloning, Sambrook et al. (1989)). Konsequenterweise stellen viele Hersteller kommerzieller Kits Produkte für solche Techniken bereit, wie beispielsweise: AmpReadyTM (Promega, Madison, Wisconsin), DNeasyTM (Qiagen, Valencia, California) und Split SecondTM (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana). Diese Produkte basieren auf der Verwendung spezialisierter Matrizes oder Puffersysteme für die schnelle Isolierung genomischer DNA-Moleküle.
  • Kürzlich erschienen mikroporöse, auf Filtern basierende Techniken auf dem Markt, die Werkzeuge sowohl für die Reinigung genomischer DNA als auch für eine ganze Reihe von Nukleinsäuren geeignet sind. Der Vorteil von Filter-basierten Matrices liegt darin, dass sie für viele Formate ausgebildet werden können, die Röhrchen, Zentrifugenröhrchen, Folien und Mikrowell-Platten mit einschließen. Mikroporöse Filtermembranen haben als Reinigungsträgermatrices im Stand der Technik auch andere Vorteile. Mit ihnen wird ein kompaktes, einfach zu handhabendes System bereitgestellt, mit welchem das erwünschte Molekül eingefangen werden kann, sowie unerwünschte Komponenten in einer flüssigen Phase mit einem höheren Durchsatz und mit einer schnelleren Verarbeitungszeit entfernt werden können, als dies mit der Säulenchromatographie möglich wäre. Dies ist auf die schnellen Diffusionsraten zurückzuführen, die auf den Filtermembranen möglich sind. Nukleinsäuren, die mittels Southern-Blot auf Membranen übertragen werden, und anschließend hierauf gebacken werden, können unter Verwendung von Enzym-konjugierten Polyethylenimin detektiert werden, das als markierte Sonde fungiert (Matsuhisa A et al. (1994) J. Biochem; 116(3):478-81).
  • Nukleinsäuremoleküle sind auf Filtermembranen entweder im Allgemeinen durch eine einfache Adsorption oder durch eine chemische Reaktion zwischen komplementären reaktiven Gruppen eingefangen worden, welche auf der Filter membran vorliegen, oder auf einem an den Filter gebundenen Liganden, was zu einer Bildung einer kovalenten Bindung zwischen den Liganden und der erwünschten Nukleinsäure führt.
  • Die Materialien der porösen Filtermembranen, die für eine nicht-kovalente Nukleinsäurenimmobilisierung verwendet werden, schlossen Materialien wie Nylon, Nitrocellulose, hydrophobes Polyvinylidenfluorid (PVDF) und Glasmikrofasern mit ein. Eine Anzahl an Verfahren und Reagenzien wurden entwickelt, welche ebenfalls die direkte Verbindung der Nukleinsäuren auf feste Träger ermöglichen, wie beispielsweise Oligonukleotide und Primer (eg. J.M. Coull et al., Tetrahedron Lett. Band 27, Seite 3991; B.A.Conolly, Nucleic Acids Res.; Band 15, Seite 3131, 1987; B.A.Conolly und P. Rider, Nucleic Acids Res., Band 12, Page 4485, 1985; Yang et al. P.N.A.S. Band 95: 5462-5467) ferner wurde eine UV-Quervernetzung von DNA (Church et al., PNAS, Band 81, Seite 1991, 1984), The Generation Capture Column Kit (Gentra Systems, Minneapolis, MN) und von RNA (Khandjian, et al., Anal. Biochem, Band 159, Seiten 227, 1986) an Nylonmembranen berichtet.
  • Viele chemische Verfahren wurden für die Immobilisierung von Molekülen wie beispielsweise Nukleinsäure an Filtermembranen, eingesetzt. Beispiele hierfür sind aktiviertes Papier (TransBind.TM, Schleicher & Schuell Ltd., Keene, N.H.), Carbodimidazol-aktivierte Hydrogel-beschichtete PVDF-Membran (Immobilin-IAV.TM, Millipore Corp., Redford, Mass.), MAP paper (Amersham, Littlechalfont Rucks, Wisconsin), aktiviertes Nylon (BioDyne. TM, Pall Corp., (Glen Cove,. N.Y.), DVS- und Zyanogen-Bromid-aktivierte Nitrocellulose. Ferner sind Membranen mit spezifischen Liganden bekannt, wie beispielsweise die SAM2TM Biotin Capture Membran (Promega) welche biotinylierte Moleküle basierend auf deren Affinität an Streptavidin bindet, oder das MAC-Affinitätsmembransystem (Protein A/G) (Amicon, Redford, Massachusetts). Einige der Nachteile einer kovalenten Bindung von Biomolekülen an aktivierte Membranen sind:
    • a) Die Molekülimmobilisierung ist oftmals langsam und benötigt 20-180 Minuten zur Vervollständigung.
    • b) Für eine schnelle Immobilisierung werden hohe Konzentrationen des Liganden und des Biomoleküls benötigt.
    • c) Während des Immobilisierungsverfahrens ist ein ständiges Bewegen vonnöten, was zu einer Denaturierung und Deaktivierung des Biomoleküls führen kann.
    • d) Sobald der Immobilisierungsprozess vollständig ist, ist oftmals ein Blockierungs (Cappings-)Schritt notwendig, um die restlichen kovalenten Bindungsstellen abzudecken.
    • e) Die kovalent gebundenen Moleküle können von der Filtermembran nicht wieder gewonnen werden.
  • In verschiedenen spezifischen Gebieten, wie beispielsweise in der Gerichtsmedizin, besteht ein Bedürfnis an Medien zur Nukleinsäurenimmobilisierung und an Verfahren, welche die hohe Spezifität einer kovalenten Immobilisierung auf Filtermembranen bieten, ohne die Notwendigkeit der Verwendung von scharfen chemischen Reaktionen und langen Inkubationszeiten, welche auch an den Tatorten selber eingesetzt werden können, und zwar für die Archivierung von Blutproben und anderen verwandten Einsatzgebieten. In der Gerichtsmedizin besteht insbesondere ein Bedürfnis für das Einfangen und Trennen von Nukleinsäuren aus einer Mischung in einer flüssigen Phase auf eine Filtermembranmatrix. Dabei ist die Fähigkeit zum Lagern oder Archivieren der gebundenen Nukleinsalzsäuren auf der Filtermembranmatrix für solche Zwecke von besonderem Interesse.
  • Kürzlich konnte von Glasmikrofasern gezeigt werden, dass diese spezifische Nukleinsäuren aus verschiedenen Nukleinsäure-enthaltenden Bezugsquellen sehr effektiv binden (siehe beispielsweise Itoh et al. (1997): Simple and rapid preparation of plasmid template by filtration method using microtiter filter plates. NAR, Band 25, Nr. 6: 1315-1316; Andersson, B. et al. (1996) Method for 96-well M13 DNA template preparations for large-scale sequencing, BioTechniques Band 20: 1022-1027): Die Nukleinsäuren binden unter den korrekten Salz- und Pufferbedingungen mit hoher Spezifität an Glas oder Kieselsäure.
  • Basierend auf den US-Patenten 5,496,562 ; 5,756,126 und 5,807,527 konnte gezeigt werden, dass Nukleinsäuren oder genetisches Material auf einem auf Zellulose basierenden trockenen Träger oder Filter immobilisiert werden kann (FTA-Filter). Der darin beschriebene feste Träger wird mit einer chemischen Zusammensetzung behandelt, die verschiedene Funktionen ausführen kann: (i) Lysieren des intakten zellulären Materials nach Inkontaktbringen, Freisetzen des genetischen Materials, (ii) Bereitstellen und Ermöglichen der Bedingungen, die die Immobilisierung des genetischen Materials an den festen Träger erleichtern (vermutlich durch eine mechanische und chaotrophische Kombination), (iii) Aufrechterhalten des immobilisierten genetischen Materials in einem stabilen Zustand, ohne dessen Verletzung aufgrund von Abbau, Endonukleaseaktivität, UV-Interferenz und mikrobiellen Angriff, und (iv) Aufrechterhalten des genetischen Materials als an dem Träger gebundene Moleküle, die vom festen Träger während jeglicher Strömungs-Verarbeitung nicht entfernt werden (wie von Del Rio et al. (1995) BioTechniques, Band 20: 970-974 gezeigt).
  • Die Nützlichkeit des sogenannten FTA-Zellulose Filtermaterials, das in den US-Patenten 5,496,562 ; 5,756,126 und 5,807,527 beschrieben wurde, konnte auch für mehrere Nukleinsäuretechniken gezeigt werden, wie beispielsweise die bakterielle Ribotypisierung (Rogers, C. & Burgoyne, L. (1997) Anal. Biochem. Band 247: 223-227), die Detektion von Unterschieden einzelner Basen in viraler und menschlicher DNA (Ibrahim et al. (1998) Anal. Chem. Band 70: 2013-2017), die DNA-Datenbankerstellung (Ledray et al. (1997) J. Emergency Nursing, Band 23, Nr. 2: 156-158), die automatisierte Prozessierung für die STR-Elektrophorese (Belgrader, B & Marino, M (1996) L.R.A. Band 9: 3-7, Belgrader et al. (1995) BioTechniques, Bandk 19, Nr. 3: 427-432) und das Oligonukleotidligationsassay in der Diagnostik (Baron et al. (1996) Nature Biotech. Band 14: 1279-1282).
  • Es wurde auch gezeigt, dass Nukleinsäuren oder genetisches Material, das auf FTA-Filter aufgetragen und immobilisiert wird, nicht einfach entfernt oder vom festen Träger eluiert werden kann, wenn es einmal gebunden ist (Del Rio et al (1995) BioTechniques, Band 20: 970-974). Dies ist ein großer Nachteil für Anwendungen, bei welchen mehrere nachfolgende Verfahren von ein und der gleichen Probe nötig werden, wie beispielsweise bei der STR Profil-Erstellung und Genotypisierung.
  • Gegenwärtig wird das zelluläre Material auf FTA-Filtermedien aufgetragen und das zelluläre Material bildet im Allgemeinen, wenn es einmal aufgetragen ist, einen Punkt auf dem FTA-Filter. Aus diesem Punkt können kleine Ausstanzer entnommen werden, wobei bei jedem Ausstanzer genügend Nukleinsäure- oder genetisches Material immobilisiert vorliegen wird, um ein einzelnes nachfolgendes Verfahren, wie beispielsweise eine PCR-Reaktion, zu ermöglichen. Da die beiden Primer, die bei einer PCR-Reaktion hinzugefügt werden, in Lösung vorliegen, hat es keine Konsequenzen, dass das zelluläre Nukleinsäure-Template an den Filter immobilisiert ist. Jedes Amplicon wird in Lösung gebildet werden. Anschließend können die Amplicons aus der Reaktion dadurch entfernt werden, dass die flüssige Phase von dem Ausstanzer des festen FTA-Filters abgesaugt wird. Daher müssen für vielfache Verfahren aus einer einzelnen Probe viele Ausstanzer entnommen werden. Das vielfache Ausstanzen ist sehr zeitaufwändig und hat bis jetzt noch nicht zu einer vereinfachten Automatisierung geführt.
  • Daher ist es sehr wünschenswert, Nukleinsäuren als eine lösliche Fraktion bereitzustellen, von welcher Aliquots einfach zu so vielen Reaktionen hinzugefügt werden können, wie benötigt werden. Die automatisierte Handhabung der Flüssigkeit dieser Art ist eine grundlegende Technik innerhalb der pharmazeutischen und anderen Industrien (siehe beispielsweise Armstrong et al. (1998) J. Biomolecular Screening, Band 3, Nr. 4: 271-275).
  • Es ist wünschenswert, die vorliegende Technologie anzupassen und sie zur spezifischen Verwendung in der Gerichtsmedizin zu modifizieren. Darüber hinaus wäre es vorteilhaft, Nukleinsäuren auf Medien schnell zu qualifizieren und quantifizieren, entweder in Korrelation mit solchen Verwendungen oder unabhängig davon.
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zum Reinigen von Nukleinsäuren bereitgestellt mit: (i) einem Substrat zum Lysieren von Zellen und zum Reinigen von Nukleinsäuren mit einer festen Matrix, die Nitrocellulose aufweist, wobei die feste Matrix mit einer chemischen Beschichtung beschichtet ist, welche eine schwache Base aufweist, ferner einen Chelatbildner sowie einen anionischen oberflächenaktiven Stoff oder ein Detergenz, das die zelluläre Lyse erleichtert; und (ii) Anzeigemitteln zur Anzeige des Vorliegens der Nukleinsäure, wobei die Anzeigemittel eine Polyethylenimin-Konjugat oder ein Enzym-gekoppelter Immunadsorptionstest (Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA), bei welchem gegen menschliche DNA gerichtete Antikörper verwendet werden, sind.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren bereitgestellt, mit den folgenden Schritten: (i) Auftragen einer Probe, die eine Nukleinsäure enthält, auf ein Substrat, welches eine feste Matrix mit einer Nitrocellulose aufweist, wobei die feste Matrix mit einer chemischen Beschichtung beschichtet ist, die eine schwache Base aufweist, ferner einen Chelatbildner sowie einen anionischen oberflächenaktiven Stoff oder ein Detergenz, das die zelluläre Lyse erleichtert; (ii) Einfangen der Nukleinsäure innerhalb des Substrats; (iii) wahlweise Fixieren der Nukleinsäure an das Substrat; (iv) Auftragen von Indikatormitteln zur Anzeige des Vorliegens der Nukleinsäure; (v) Erzeugen eines Signals zur Anzeige des Vorliegens der Nukleinsäure, wobei das Signal durch ein Polyethylenimin-Konjugat oder durch einen Enzym-gekoppelten Immunadsorptionstest (enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) gebildet wird, bei welchem gegen menschliche DNA gerichtete Antikörper verwendet werden.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine Blutkarte zur Markierung von Bluttransfusionsbeuteln bereitgestellt, welche das oben beschriebene Kit sowie Mittel zur Aufrechterhaltung der Integrität aufweist.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden einfach abgeschätzt werden können, da diese nachstehend unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung verstanden wird, wenn sie in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen berücksichtigt wird, in welchen:
  • 1 eine Querschnittsansicht einer Filtermembran ist, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde; und
  • 2 ein Querschnitt einer Vorrichtung ist, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde;
  • 3 ein Foto ist, welches die Farbintensität des löslichen Produkts zeigt, welches sich auf den DNA-Proben entwickelt hat, die auf die FTA-Membran geladen waren, und zwar durch ein Polyethylenimid-Peroxidase-Konjugatassay; und
  • 4 ein Foto ist, das die Farbintensität des unlöslichen Produkts zeigt, welches auf DNA-Proben entwickelt wurde, die auf die FTA-Membran geladen waren, und zwar durch ein Polyethylenimid-Peroxidase-Konjugatassay.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die Matrix kann zur Immobilisierung eines genetischen Materials hierauf und für eine Ermöglichung einer nachfolgenden Elution des genetischen Materials hiervon verwendet werden. Eine Beschichtung wie oben definiert ist funktionell mit der Matrix verbunden, um eine zelluläre Lyse zu ermöglichen, und um das genetische Material aus den lysierten Zellen freizusetzen, während gleichzeitig das immobilisierte und freigesetzte genetische Material stabilisiert wird. Die vorliegende Erfindung ist hervorragend für verschiedene neue Verwendungen der Technologie geeignet. Genauer gesagt, wird mit der vorliegenden Erfindung ein Produkt bereitgestellt, mit welchem (1) das Vorliegen einer Nukleinsäure auf einem Substrat nachgewiesen werden kann, und zwar äußerst schnell; (2) die Integrität des Substrats aufrechterhalten werden kann; und (3) welches in neuen Ausführungsformen eingesetzt werden kann, bei welchem diese Verbesserungen vorteilhafterweise genutzt werden.
  • Die chemische Zusammensetzung des Substrats erleichtert die Lyse der ganzen Zellen und das nachfolgende Einfangen der freigesetzten Nukleinsäuren. Die chemische Zusammensetzung unterstützt ferner die Langzeitaufbewahrung der Nukleinsäuren. Die Zusammensetzung des Substrats ist derart, dass eine schnelle Reinigung der eingefangenen Nukleinsäuren ausgeführt werden kann. Dies liegt darin, dass das Substrat selber über einen Elutionsschritt die Freisetzung der Nukleinsäure hiervon ermöglicht, wodurch eine lösliche Nukleinsäurefraktion bereitgestellt wird. Wie nachstehend detaillierter beschrieben werden wird und wie nachstehend in den folgenden Beispielen ausgeführt, ist die vorliegende Erfindung bezüglich der Elution von Gesamt-DNA aus der Probe besonders effizient. Dennoch kann auch nur eine Nukleinsäure oder eine Nukleinsäurepopulation spezifisch eluiert werden.
  • Wenn das Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung verarbeitet wird, um ein Filtermaterial für die Nukleinsäureelution bereitzustellen, wird dadurch eine Reihe von Vorteilen und Anwendungen bereitgestellt. Daher werden mit der Verwendung des Substrats der vorliegenden Erfindung Vorteile hinsichtlich der Identifizierung und Quantifizierung von Nukleinsäure-enthaltenden biologischen Flüssigkeiten bereitgestellt, ebenso wie ein vielfaches Verarbeiten von Fluiden.
  • Die vorliegende Erfindung, die in 1 allgemein mit 10 gezeigt ist, schließt die folgenden Komponenten mit ein:
    • (i) eine geeignete Matrix, vorzugsweise eine Filtermembran 12;
    • (ii) eine chemische Beschichtung 14; und
    • (iii) Mittel zum Aufrechterhalten der Integrität.
  • Die Reaktion der Filtermembran mit der Lösung der chemischen Beschichtung führt zur Filtermembran gemäß der vorliegenden Erfindung. Wenn die Membran faserartig ist, stellt diese Beschichtung eine Beschichtung der Filterfasern dar, nicht die Filteroberfläche. Alternativ kann die Beschichtung die Fasern imprägnieren.
  • Die Matrix der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine Nitrocellulose oder Nylonmembran. Die Matrix weist Nitrocellulose auf.
  • Das Medium, das für die Filtermembran der vorliegenden Erfindung verwendet wird, inhibiert nicht die Anhaftung der Lösung der chemischen Beschichtung, und inhibiert nicht die Lagerung, Elution und nachfolgende Analyse von hinzugefügtem Nukleinsäure-enthaltendem Material. Hierbei sind flache trockene Matrices oder eine Matrix, kombiniert mit einem Bindemittel mit eingeschlossen. Es ist bevorzugt, dass die Filtermembran der vorliegenden Erfindung porös ist, um die Immobilisierung der Nukleinsäuren zu erleichtern. Im Gegensatz zu Trägern des Standes der Technik, ermöglicht es der Träger der vorliegenden Erfindung, das genetische Material hiervon derart zu eluieren, dass dieses für nachfolgende Analysen verwendet werden kann. Unerwarteterweise ist eine solche Elution ein zeiteffizienter Schritt, mit welchem nahezu sofort eine Analyse bereitgestellt wird.
  • Der Ausdruck „chemische Beschichtungslösung", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine chemische Zusammensetzung, welche an die oben erwähnten Filtermembranen absorbieren kann. Die Zusammensetzung der chemischen Beschichtungslösung ist wie zuvor beschrieben und bezieht sich auf diejenige, die in den US-Patenten 5,756,126 ; 5,807,527 und 5,496,562 dargelegt ist. Die Adsorption der chemischen Beschichtungslösung an ausgewählte Filtermembranen resultiert in die Bildung der Filtermembran gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Die chemische Lösung schließt eine schwache Base mit ein, ferner einen Chelatbildner sowie einen anionischen oberflächenaktiven Stoff oder ein Detergens, und wahlweise Harnsäure und Urat, wie in dem oben zitierten US-Patent 5,807,527 im Detail diskutiert. Vorzugsweise kann die schwache Base ein Tris sein, Trishydroxymethylmethan, entweder als eine freie Base oder als das Karbonat, und der Chelatbildner kann EDTA sein, und das anionische Detergenz kann Natriumdodecylsulfat sein. Andere Beschichtungen mit ähnlichen Funktionen können ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Das anionische Detergenz kann aus der Gruppe ausgewählt sein, welche Natriumdodecylsulfat (SDS) mit einschließt. SDS ist in verschiedenen Formen erhältlich, wie beispielsweise als C12-Form und als Laurylsulfat. Andere anionische Detergenzien können eingesetzt werden, wie beispielsweise Alkylarylsulfonate, Natriumtetradecylsulfat-langkettige (fett) Alkoholsulfate, Natrium 2-Ethylhexysulfat Olefinsulfate, Sulfosuccinate oder Phosphatester. Das anionische Detergenz, wie beispielsweise SDS, kann mit verschiedenen Konzentrationen auf die Filtermatrix aufgebracht werden.
  • Im Allgemeinen kann 5%-10% SDS gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Erhöhte Konzentrationen an SDS, nämlich bis zu 10%, die nicht innerhalb eines FTA-Cocktails untergebracht werden können, wie in den Patenten des Standes der Technik zuvor diskutiert, sorgten beispielsweise für eine größere kritische Mitzellenkonzentration, wodurch die Lysis-Fähigkeit erhöht, und dadurch auch eine größere Ausbeute an Target-Nukleinsäuren erzielt wurde, wie in dem Beispielsabschnitt nachstehend gezeigt. Eine definierte optimale SDS-Konzentration wird im Bereich von 5-7,5% SDS zur Beschichtung besonderer Glasmikrofasern erreicht, um unterschiedliche Plasmidpopulationen direkt aus flüssigen Kulturen in einem Multi-Well-Format anzureichern und zu reinigen, wobei diese Formate im Stand der Technik hinreichend bekannt sind.
  • Der Ausdruck „funktionell assoziiert mit" bedeutet, dass die Beschichtung aufgebracht, absorbiert oder anderweitig mit dem Träger der vorliegenden Erfindung verbunden ist, und zwar derart, dass der Träger und die Beschichtung zusammen für die Immobilisierung der Nukleinsäure darauf sorgen, und zwar durch den Vorrang der zellulären Lyse der Zellen, die auf dem Träger präsentiert werden. Dies bedeutet, dass die Beschichtung adsorbiert, absorbiert, beschichtet wird über, oder anderweitig in funktioneller Beziehung mit dem Medium aufgebracht werden kann. So kann beispielsweise der Träger in Form einer Filtermembran in eine Lösung mit der chemischen Lösung eingebracht werden. Wie oben erwähnt ist der Träger der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein poröses Filtermedium und kann in Form eines flachen, trockenen Mediums vorliegen. Das Medium kann mit einem Bindemittel kombiniert werden, wobei Beispiele für Bindemittel im Stand der Technik hinreichend bekannt sind, beispielsweise Polyvinylacrylamid, Polyvinylacrylat, Polyvinylalkohol, Gelatine.
  • Die Matrix der vorliegenden Erfindung kann geeignet sein, das darauf immobilisierte genetische Material durch eine Hitzeelution freizusetzen. Eine solche Hitzeelution wird vorzugsweise durch das Aussetzen des Trägers mit dem genetischen Material darauf gegenüber erhitztem Wasser erreicht, wobei das Wasser nukleasefrei ist. Die Fähigkeit, eine Elution zu ermöglichen, charakterisiert die verschiedenen Trägermaterialien der vorliegenden Erfindung.
  • Die Filtermembran der vorliegenden Erfindung ist derart, dass zu jedem Zeitpunkt während der Lagerungszeit, die schnelle Reinigung der immobilisierten Nukleinsäure ermöglicht werden kann. Die Erfindung ist derart, dass die immobilisierte Nukleinsäure in Form einer löslichen Fraktion gesammelt wird, was mit einem einfachen Elutionsprozess erfolgen kann, währenddessen die immobilisierte Nukleinsäure von der Filtermembran gemäß der vorliegenden Erfindung freigesetzt wird. Die Filtermembran der vorliegenden Erfindung führt zu Nukleinsäuren hinreichender Qualität, so dass nachfolgende Analysen, wie beispielsweise eine Polymerasekettenreaktion (PCR), eine Ligasekettenreaktion (LCR), eine Transkriptions-vermittelte Amplifizierung (TMA), eine reverse Transkriptase-initiierte PCR, DNA oder RNA-Hybridisierungstechniken, eine Sequenzierung und Ähnliches nicht behindert wird.
  • Die Nukleinsäuren-Immobilisierung an einen festen Träger, obgleich dieses ein geeignetes Template für einzelne PCR-Reaktionen darstellt, kann nicht durch herkömmliche Techniken, wie beispielsweise optische Dichte oder Fluoreszenz, gemessen oder detektiert werden. Nukleinsäuren müssen für diese Techniken in Lösung sein. Andere Techniken, die sich der Reinigung anschließen, und bei welchen die Nukleinsäure in löslicher Form vorliegen soll, schließen die Klonierung, Hybridisierungs-Schutzassays, bakterielle Transformation, Säugetierzellentransfektion, Transkriptions-vermittelte Amplifizierung und andere solche Verfahren mit ein. Mit der vorliegenden Erfindung kann die Nukleinsäure in einer solchen löslichen Form bereitgestellt werden. Darüber hinaus wird mit dem Signal, das durch die Anzeigemittel der vorliegenden Erfindung generiert wird, eine positive Identifizierung des Vorliegens der Nukleinsäure auf dem Substrat bereitgestellt.
  • Die Herkunft der Nukleinsäure kann eine biologische Probe sein, die ganze Zellen enthält. Die ganze Zelle kann beispielsweise Blut sein, eine bakterielle Kultur, bakterielle Kolonien, Speichel, Urin, Trinkwasser, Plasma, Stuhlproben und Sputum sein, ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Die Proben können durch verschiedene im Stand der Technik bekannten Techniken gesammelt, zu dem Substrat geführt und anschließend darauf aufgetragen werden. Alternativ kann das Substrat in Form einer Probensammlungsvorrichtung vorliegen, wie beispielsweise ein Tupfer, Folienmaterial, Ball oder Ähnliches, und die Probe kann direkt von der Bezugsquelle gewonnen werden. In anderen Worten kann das Substrat in Form einer Vorrichtung vorliegen, mit welcher die Zellprobe von einer Bezugsquelle gewischt oder anderweitig erhalten werden kann. Die Bezugsquelle kann ein Probenröhrchen sein, das eine flüssige Probe, eines Organs, wie beispielsweise aus Mund, Ohr oder einem anderen Teil von Mensch oder Tier enthält, ein Probenpool, wie beispielsweise eine Blutprobe, die an einem Tatort oder Ähnlichem gewonnen wurde, oder andere verschiedene Bezugsquellen von Zellen, die im wissenschaftlichen Gebiet, in der Forensik und anderen Gebieten bekannt sind.
  • Darüber hinaus kann die faserartige Filtermatrix der vorliegenden Erfindung mit verschiedenen Formen hergestellt werden. So kann beispielsweise die fasrige Filtermatrix in Form eines Blattes hergestellt sein, wodurch es in verschiedenen Formaten vorliegen kann, wie beispielsweise als Multiwellplatte, Zentrifugenröhrchen, Objektträger, Einsätzen, Tupfer und Polster.
  • Der Ausdruck „Integritäts-Aufrechterhalter" oder „Mittel zum Aufrechterhalten der Integrität", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein verschließbares Element, das den Abbau und/oder Verlust der Matrix verhindert. Der Integritätsaufrechterhalter der vorliegenden Erfindung bewirkt vorzugsweise eine luftdichte Abdichtung, wodurch verhindert wird, dass Luft, Bakterien oder andere verunreinigenden Stoffe in Kontakt mit der Matrix und der gereinigten Nukleinsäure kommen. Der Integritätsaufrechterhalter kann in Form eines Plastikbeutels vorliegen, mit oder ohne Verschluss, in Form von Zellophan, einem verschließbaren Behältnis, Parafilm und Ähnlichem.
  • Der Integritätsaufrechterhalter kann geöffnet werden, um die Auftragung einer Probe auf die Matrix zu ermöglichen. Anschließend wird er verschlossen und abgedichtet, wodurch die Substrate aufgenommen werden. Dementsprechend wird das Substrat, wenn es älter und brüchig wird, darin aufbewahrt und geht nicht verloren. Alternativ kann der Integritätsaufrechterhalter über dem Substrat angewandt werden, nachdem die Probe aufgetragen wurde.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Isolierung und Archivierung von Nukleinsäuren bereit, und zwar durch die allgemeinen Schritte der Auftragung einer Nukleinsäureprobe auf ein Substrat, welches aus der an die Matrix fixierten Beschichtungen besteht, wobei das Substrat die Nukleinsäure physikalisch einfängt, und dann die Nukleinsäure an das Substrat gebunden wird. Anschließend wird ein Signal gebildet, wenn die Nukleinsäure an das Substrat bindet. Der Bindungsschritt wird durch Erhitzen des Substrats mit der daran gebundenen Nukleinsäure erreicht, und zwar durch das oben beschriebene Verfahren.
  • Der Auftragungsschritt kann durch Auftragen ganzer Zellen an das Substrat erreicht werden. Das Substrat selber induziert tatsächlich die Lyse der Zellen, wodurch die Nukleinsäure in das Substrat freigesetzt wird. Da das Substrat porös ist, stellt das Substrat eine ausgedehnte Oberfläche dar, an welche die Nukleinsäure gebunden ist.
  • Ein Waschschritt, beispielsweise mit verschiedenen Puffern, wie sie in dem Beispielabschnitt beschrieben, jedoch nicht hierauf beschränkt sind, kann vorgenommen werden und wird nach der Zelllyse durchgeführt. Das Substrat fängt anschließend die Nukleinsäure physiklaisch innerhalb dessen Zwischenräume.
  • Die gebundene Nukleinsäure kann von dem Substrat zum Zwecke einer weiteren Bearbeitung und Analyse freigesetzt werden. Die Freisetzung wird durch Waschschritte bei erhöhten Temperaturen erreicht, wie in den Beispielen nachstehend gezeigt. Unerwarteterweise kann eine Anreicherung unterschiedlicher Populationen an Nukleinsäuren aus der gleichen Zellen-Bezugsquelle unter Verwendung von Inkrement-artig ansteigenden Temperaturbereichen erreicht werden. So kann beispielsweise Plasma-DNA aus bakteriellen Kolonien unter Verwendung des Substrats der vorliegenden Erfindung isoliert und angereichert werden. Populationen, wie beispielsweise größere Populationen an Supercoil-Plasmid, gefolgt von Nick-Plasmid und schließlich von linearem Plasmid, das oben auf dem Isoliergel wandert, können unter Verwendung von Inkrement-Erhöhungen in der Inkubationstemperatur erreicht werden.
  • Es ist bekannt, dass der FTA-Beschichtungscocktail des Standes der Technik 2% SDS enthält. Es ist unwahrscheinlich, dass dieser Prozentsatz erhöht werden kann, was auf die Sättigungspunkte in Verbindung mit anderen Komponenten des Cocktails zurückzuführen ist. Dies beschränkt die Lysis-Fähigkeit der FTA-beschichteten Filter des Standes der Technik, da eine kritische Mizellen-Konzentration von SDS leicht erreicht werden kann, wenn eine große Anzahl von Zellen, wie beispielsweise mit einer bakteriellen Kolonie, Kontakt hergestellt wird. Daher ermöglichen Substrate, die eine größere Konzentration des lysierenden Stoffes und des anionischen Detergens enthalten, höhere Lysis-Fähigkeiten und wiederum höhere Nukleinsäuren-Gewinne. Dies wird in den Beispielen nachstehend dargestellt.
  • Die Filtermembran gemäß der vorliegenden Erfindung kann die gleichen chemischen Komponenten wie FTA besitzen, welche die Wirkung der zellulären Lyse begründen sowie die Nukleinsäurenfreisetzung nach der Probenauftragung. Die chemische Komponente sorgt über Protein-denaturierende Stoffe, einer Falle für freie Radikale und durch virale-mikrobielle Inhibitoren für die Stabilität der Nukleinsäure. Der Unterschied zwischen den festen FTA-Trägern des Standes der Technik und der Filtermembran der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass der feste Grundträger, oder Filter, verändert wurde im Vergleich zu demjenigen, der für die FTA-Produkte beschrieben wurde. Diese Veränderung in dem festen Trägermaterial, oder Filter, hat es erleichtert, nach einem vereinfachten Hitze-Eluierungsschritt das gebundene Nukleinsäurenmaterial von der Filtermembran gemäß der Erfindung zu entfernen, wohingegen es von dem festen FTA-Träger nicht entfernt werden kann (siehe Del Rio et al. (1995) BioTechniques, Band 20: 970-974). Die von der Filtermembran gemäß der Erfindung freigesetzte Nukleinsäure wird daher als lösliche Fraktion präsentiert, die für verschiedene nachfolgende Verfahren, wie beispielsweise eine PCR-Amplifizierung einfach in Aliquots aufgeteilt werden kann. Die eluierte lösliche Nukleinsäure kann auch bei Techniken eingesetzt werden, bei welchen lösliche Nukleinsäuren eine Notwendigkeit ist, wie beispielsweise die Analyse der optischen Dichte, die Fluoreszenzdetektion, Klonierung, Transformation und Ähnliches. Diese hinzugefügte Technik der Elution ermöglicht verschiedene Verarbeitungsvorschriften mit hohem Durchsatz, wie beispielsweise die Genotypisierung.
  • Die vorliegende Erfindung kann in verschiedenen Gebieten der Genomik eingesetzt werden. So sorgt die vorliegende Erfindung beispielsweise für die Möglichkeit, gebundenes genetisches Material zu eluieren und schnell zu reinigen, welches dann in irgendeiner Anzahl gerichtsmedizinischer Anwendungen eingesetzt werden kann, wie beispielsweise die Identifizierung, Vaterschafts-/Mutterschafts-Tests, und am Tatort eines Verbrechens.
  • In verschiedenen Ländern müssen Häftlinge genetische Proben (Blut oder Backeninnenseiteabstrichproben) für DNA-Fingerprintingzwecke abgeben. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung stellt Mittel für die längere Aufbewahrung von genetischem Material von Häftlingen bereit. Falls notwendig, kann das genetische Material sofort nach Entnahme oder aber auch viele Jahre nach einer Lagerung getestet werden. Das genetische Material kann entweder als eine lösliche oder als eine feste Phasen-Fraktion erhalten werden, wenn es einmal auf dem Filtermedium der vorliegenden Erfindung isoliert vorliegt.
  • Die vorliegende Erfindung kann für die Vaterschafts-/Mutterschafts-Tests eingesetzt werden, mit einem besonderen Nutzen für eine Mutter oder ein Krankenhaus, wenn ein Neugeborenes im Krankenhaus verlegt wurde. Durch die Möglichkeit der vorliegenden Erfindung, schnell eine gereinigte genetische Probe bereitzustellen, wird eine noch größere Nützlichkeit dann begründet, wo eine schnelle Identifizierung eines verlegten Kindes von Vorteil wäre.
  • Die vorliegende Erfindung ist ein bedeutender Beitrag für das gegenwärtige Verfahren zur Herstellung von löslichem genetischen Material, was andererseits zeitaufwendig ist und oftmals zu unpassenden Templates führt, die beschädigt oder verunreinigt sind. Die vorliegende Erfindung stellt hohe Erträge an gereinigtem genetischem Material mit höchster Qualität in weniger als zwanzig Minuten Laborzeit bereit. Das schnell gereinigte genetische Material kann für jede Nahrungsmittel-/landwirtschaftliche Anwendung eingesetzt werden, wie beispielsweise für die Überwachung, das Züchten, die Identifizierung und Klonierung.
  • Die Effizienz, mit welcher Nahrungsmittelhersteller pathogenetische Ausbrüche in ihrem Viehbestand und in den Endprodukten detektieren, ist der Maßstab für eine erfolgreiche Firma. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung als ein Tupfer, der einfach gegen das Nahrungsmittel gepresst werden kann, oder die Verwendung einer Karte, auf welcher Tierblut aufgebracht werden kann, ermöglicht Verwendungen der vorliegenden Erfindung zur schnellen Isolierung und Detektion des Vorliegens von pathogenem genetischen Material. Zeitaufwendige Assaytechniken des Standes der Technik und die hierbei involvierten Nukleinsäurepräparationen brauchen nicht durchgeführt werden, wenn die vorliegende Erfindung eingesetzt wird. Das gesammelte pathogene Nukleinsäurematerial kann als eine lösliche Fraktion oder als Festphasenfraktion mit der Wahl eines Elutionssteps verwendet werden.
  • Die Überwachung von Tierkadavern, sei es aus rechtlichen oder gesundheitlichen Gründen, ermöglicht es den Herstellern, die Kontrolle über ihre Produkte zu bewahren. Wenn im Schlachthaus getötet werden muss, kann eine Karte, die die vorliegende Erfindung nützt, an den Tierkadaver angebracht werden, auf welcher das Blut des Kadavers aufgebracht wurde. Zur gleichen Zeit kann eine zweite Karte mit dem gleichen Blut versehen werden und als Archiv im Schlachthaus aufbewahrt werden. Wenn aus bestimmten Gründen Tierkadaver identifiziert werden müssen, kann die genetische Aufzeichnung des Tierkadavers und des Schlachthauses eingesetzt werden. Wenn die Karte des Tierkadavers irrtümlich entfernt wird, ist eine Identifizierung immer noch möglich, und zwar durch ein einfaches Pressen von Tierkadaverfleisch auf eine solche Karte.
  • Die Identifizierung der gewünschten Gene und Merkmale, die für eine nachfolgende Generation einer Pflanze oder eines Tieres benötigt werden, verlangt eine zeiteffektive und verlässliche Generierung von Nukleinsäuren aus möglichen Eltern. Die vorliegende Erfindung kann für die Isolierung von entweder löslichen oder Festphasen genetischen Materials eingesetzt werden, um effektive und verlässliche Ergebnisse bei einer solchen Notwendigkeit bereitzustellen. Ähnlich kann die vorliegende Erfindung auch in Form von Mikroplatten, Röhrchen oder Chips zur Herstellung und Detektion von genetischem Material eingesetzt werden. Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für eine überragende Template-Präparation bereitgestellt, mit der Zeit-(sei die Präparation löslich oder fest) und kosteneffektiv archiviert werden kann.
  • Das Aufpressen eines Mediums, in Form eines Tupfers oder anderweitig ermöglicht es dem Verwender, irgendeine verunreinigte Mikrobe auf Nahrungsmittelprodukten irgendeines Typs abzupicken. Das dann von dem Medium isolierte genetische Material kann für irgendein diagnostisches Verfahren eingesetzt werden, je nachdem, ob lösliches genetisches Material oder genetisches Material, das auf Festphasen vorliegt, notwendig ist. Diese Analyse kann effektiv beinahe sofort vorgenommen werden, ganz im Gegensatz zu den Techniken aus dem Stand der Technik.
  • Durch die Verwendung von genetischen Manipulationstechniken, sind Nahrungsmittel mit ansteigender Größe, Geschmack, Reifegrad und Zuckergehalt hergestellt worden. Viele Länder verbieten den Verkauf von genetisch modifizierten Nahrungsmittelprodukten, weshalb eine Testung durchgeführt werden muss. Da man nach spezifischen Genen forscht, die diese Charakteristika verursachen, ist genetisches Material von Nöten. Die vorliegende Erfindung kann dazu eingesetzt werden, eine schnelle Reinigung von sowohl löslichem genetischem Material als auch von genetischem Material, das auf Festphasen vorliegt, bereitzustellen.
  • Vor diesem Hintergrund findet die vorliegende Erfindung Anwendung in verschiedenen Gebieten der Genomik.
  • Anfangsversuche wurden durchgeführt, um die Möglichkeit der Verwendung von FTA-beschichteten Materialien, wie beispielsweise Membranen, zur Quantifizierung und Detektion von DNA zu demonstrieren. Erste Experimente zeigten, dass ganze Zellen auf FTA-beschichteten Membranen, wie beispielsweise Zellulosenitrat, aufgebracht werden können, wobei eine Zelllyse und die Nukleinsäuren-Bindung nach Inkontaktbringen sofort durchgeführt wurde. Die immobilisierte DNA kann unter Verwendung von spezifischen und nicht spezifischen DNA-Sonden oder anderen Signalerzeugern und einer Art eines Immunoassays detektiert (und quantifiziert) werden.
  • Verwendet wurde ein FTA-beschichtetes Substrat, auf welches angenommenes leukozytendepletiertes Blut gespottet wurde. Die Nukleinsäurenkomponente der Probe wird an das Substrat gebunden und steht für eine direkte Messung mit einer Sonde, wie beispielsweise PEI, zur Verfügung. Wenn die Detektion unter einem unteren Limit liegt, dann wird von der Probe angenommen, dass sie Leukozytendepletiert ist. Ein solches System bietet eine große Zeitersparnis für Blutbanken, die gegenwärtig die Mikroskopie zur Charakterisierung von Depletionseffizienzen einsetzen. Aufgrund eines Trends in Richtung einer Leukozytendepletion des Blutes direkt an der Bezugsquelle eher als am Krankenbett, ist eine einfache Detektionsmethode sehr nützlich.
  • Es gibt viele Flüssigkeiten in den unterschiedlichen industriellen Gebieten, die zum Zeitpunkt des Verkaufs keinerlei Biokontamination enthalten sollten. Ferner werden Flüssigkeiten auch dahingehend beobachtet, ob die Biokontamination über die Zeit ansteigt. Flüssigkeiten können auch biologische Proben enthalten, bei welchen das Vorliegen von Mikroben eine Krankheit oder Infektion aufzeigen kann. Eine Probe einer Flüssigkeit würde zu einem FTA-beschichteten Substrat hinzugefügt, Zellen innerhalb der Probe, einschließlich unerwünschtes biologisches Material, wird nach Kontakt mit dem Substrat lysieren, wobei sich die Nukleinsäuren sofort fixieren. Eine direkte Detektion mit entweder einer allgemeinen DNA-Sonde kann dazu eingesetzt werden, um das Vorliegen zellulärer Kontamination aufzuzeigen, oder es kann eine Sonde eingesetzt werden, die für eine Spezies spezifisch ist, wonach durch Hybridisierung das Vorliegen von ungewünschten Zellen in einer multizellulären Probe nachgewiesen werden kann. Diese Art von System kann in der Nahrungsmittelindustrie eingesetzt werden, und zwar mit Flüssigkeiten einschließlich Milch, Wein, Bier und Säften. In der Medizin können für das System Urin, Blut sowie Stuhlextrakte eingesetzt werden, wobei die Detektion der immobilisierten Nukleinsäure mit Spezies-spezifischen Sonden durchgeführt wird. In der Umwelttechnologie kann Trinkwasser, Seewasser und Flusswasser mit dem vorgeschlagenen System untersucht werden.
  • Eine Krankheit wie Lupus wird durch das Vorliegen von doppelsträngiger DNA im Blutstrom charakterisiert. Eine Person, die an Lupus leidet, wird daher in ihrem System Antikörper vorliegen haben, die in Gegenwart des dsDNA-Antigens erhöht sein wird. Menschliche dsDNA, die auf eine FTA-beschichtete Membran gespottet und fixiert wird, kann daher als Plattform zur Durchführung eines direkten ELISA eingesetzt werden, wenn die eingesetzte Probe Lupus-Antikörper enthält. Langwierige Immobilisierungsschritte zur Durchführung eines „traditionellen" ELISA werden mit dem FTA-Ansatz vermieden.
  • Eine detaillierte Beschreibung des FTA-beschichteten Materials und von Verfahren zur Verwendung der Medien ist in den nachstehenden Beispielen und den hierin beigefügten Figuren dargestellt.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1:
  • Menschliche weiße Blutzellen und gereinigte DNA wurden als Proben eingesetzt, zur Beladung auf Stückchen einer FTA-behandelten Membran für ein ELISA-Assay, das auf der ionischen Wechselwirkung zwischen Polyethylenimin-Peroxidasekonjugat (PEI-PO) und DNA beruht.
  • Das Ziel des Experiments war es, zu bestätigen, dass die DNA an die FTA-Membran für eine nachfolgende Detektion aufgebracht werden konnte, um zu bestätigen, dass die DNA von der Zelle freigesetzt und an eine Membran fest genug angebracht werden kann, um diese nachfolgend zu detektieren.
  • MATERIALIEN UND PROTOKOLL
  • Vier Membranen wurden eingesetzt. Die Membranen waren wie folgt: 1. Nitrocellulosemembran, Porengröße 0,2 μm, Schleicher und Schull; 2. Nylonmembran, Porengröße 0,2 μm, Osmonics; 3. Nylonmembran, Porengröße 1,2 μm Osmonics; und 4. FTA-Glas, Grad F572-08, Whatman (für Vergleichszwecke).
  • Die Membranen wurden mit der FTA-Lösung zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln getränkt, vollständig bei Raumtemperatur getrocknet und bei 80°C eine Stunde lang gebacken.
  • DNA-Proben von WBC mit 5 × 103 Zellen/μl, 5 Zellen/μl, und DNA 2μg/μl wurden eingesetzt.
  • Protokoll:
  • Alle Assayschritte wurden in einer 96-Wellplatte durchgeführt. Die kreisförmigen Ausschnitte jeder Membran, 0,5 mm im Durchmesser, wurden auf den Boden der Wells gelegt. Es wurden jeweils 3 μl DNA-Proben pro Well aufgetragen, und zwar jeweils zweifach. Anschließend wurde die Platte mit PBS/BSA/Tween-20-Lösung blockiert, mit einem Polyethylenimin-Peroxidasekonjugat inkubiert, mit PBS/BSA/ Tween-20-Lösung gewaschen und schließlich mit unterschiedlichen Substraten für die Peroxidase inkubiert, um gefärbte lösliche oder unlösliche Produkte zu entwickeln.
  • ERGEBNISSE:
  • DNA-positive und DNA-negative Proben entwickelten unterschiedliche Farbintensitäten auf den FTA-Nylon und FTA-Nitrocellulosemembranen, welche beide eine Porengröße von 0,2 μm hatten, wenn das Ergebnis der Enzymreaktion ein lösliches Produkt war (Tabelle 1, Bild 1).
  • Die DNA-positiven und DNA-negativen Proben entwickelten nur dann unterschiedliche Farbintensitäten auf FTA-Nitrocellulosemembranen mit einer Porengröße von 0,2 μm, wenn das Ergebnis der Enzymreaktion ein unlösliches Produkt war (Tabelle 2, Bild 2).
  • Vorteile oder unerwartete Merkmale
  • DNA kann auf FTA- oder SDS-behandelten Membranen für eine spätere Verwendung in einer ELISA-Bestimmung aufgebracht werden. Darüber hinaus kann DNA aus WBC auf FTA-behandelten Membranen (0,2 μm Porengröße) für nachfolgende analytische Bestimmungen freigesetzt werden.
  • Physikalisch und chemische Eigenschaften der FTA-behandelten Membran (wie beispielsweise Porengröße oder Membranzusammensetzung) sind für deren Anwendung für die DNA-Evaluation kritisch. So zeigte beispielsweise die FTA-Nylonmembran mit einer Porengröße von 0,2 μm die besten Ergebnisse bei der Messung einer unterschiedlichen Menge an DNA und bei der Unterscheidung von DNA-positiven und DNA-negativen Proben. Farbintensität, entwickelt mit dem auf die FTA-Materialien geladenen Proben durch ein PEI-PO-Assay mit dem löslichen Produkt von PO; Ablesen bei 490 nm, Test vom 13. Januar 2000
    A 5 × 103 WBC/μl B 5 × 10 WBC/μl C 2μg/μl DNA D 0-Kontrolle
    I vergleichend 0,2 μm Nylon 1,131 0,58 Über-Lesen 0,511
    II vergleichend 1,2 μm Nylon 2,279 1,445 1,92 2,408
    III vergleichend FTA-Glas Über-Lesen Über-Lesen Über-Lesen Über-Lesen
    IV 0,2 μm Nitrocellulose 1,034 0,506 2,208 0,327
  • Ein Über-Lesen tritt dann auf, wenn die optische Dichte der Probe größer als 3,000 ist. In jedes Well wurden 3 μl Probe gegeben.
  • Visuelle Schätzung der Farbentwicklung auf den Proben, die auf FTA-Materialien geladen wurden, mittels PEI-PO-Assays mit dem unlöslichen Produkt von PO, Test vom 13. Januar 2000
  • 0,2 μm Nylon (vergleichend)
  • Ein dunkelbrauner Ring entwickelte sich in der Mitte der Membran, wenn diese mit 5 × 103 WBC/μl behandelt wurde. Ein heller brauner Hintergrund ohne Ring entwickelte sich, wenn 5 × 10 WBC/μl hinzugefügt wurden. Wenn 2 μg/μl DNA hinzugefügt wurden, entwickelte die 0,2 μm Nylonmembran einen dunklen braunen Hintergrund. Schließlich entwickelte sich in der Kontrolle ein heller brauner Hintergrund.
  • 1,2 μm Nylon (vergleichend)
  • Bei den sämtlichen oben genannten Konzentrationen war der Hintergrund aller Stückchen der gleiche dunkle Braunton. Zwischen der Farbe der DNA-positiven Membran und der Kontrollmembran gab es keinen Unterschied.
  • FTA-Glas (vergleichend)
  • Wie mit dem 1,2 μm Nylonmaterial war der Hintergrund aller Stückchen ein gleicher dunkler Braunton. Zwischen der Farbe der DNA-positiven Membran und der Kontrollmembran gab es keinen Unterschied.
  • 0,2 μm Nitrocellulose
  • Mit der Hinzufügung von 5 × 103 WBC/μl entwickelte sich ein dunkler brauner Ring in der Mitte der Membran mit einem sehr leichten Hintergrund. Ein sehr leichter brauner Ring in der Mitte der Membran entwickelte sich, wenn 5 × 10 WBC/μl hinzugefügt wurde. Ein dunkler brauner Hintergrund entwickelte sich, wenn 2 μl/μl DNA hinzugefügt wurde. Ein sehr leichter brauner Hintergrund entwickelte sich in der Kontrollsituation.
  • BEISPIEL 2:
  • FTA-ZELLULOSE-NITRATMEMBRAN
  • ANWENDUNG ZUR DNA-BESTIMMUNG
  • Membranen
  • Whatman Zellulose-Nitratmembranen mit einer Porengröße von 0,1, 0,2, 0,45 und 0,8 μm wurden für die folgenden Versuche eingesetzt. Die Membranen wurden mit der FTA-Lösung eine Stunde lang bei 80°C unter leichtem Schütteln getränkt, vollständig bei Raumtemperatur getrocknet und eine Stunde lang bei 80°C gebacken.
  • DNA-Proben
  • Drei DNA-Proben wurden für die folgenden Experimente eingesetzt. Diese Proben schließen die Folgende mit ein: 1. Einzelsträngige DNA, 1 μg/μl; 2. Einzelsträngige DNA, 0,2 μg/μl; und 3. DNA-Negativprobe-PBS mit 3% BSA-Lösung.
  • Protokoll
  • 2 μl der einzelsträngigen DNA-Lösungen mit einer DNA-Konzentration von 1 μg/μl und 0,2 μg/μl wurden auf die Membranstückchen in einer 96-Wellplatte fixiert. Die Platte wurde mit PBS-BSA-Tween-20-Pufferlösung blockiert, mit einem Polyethylenimin-Peroxidat (PEI-PO)-Konjugat inkubiert und dreimal vor Inkubation mit den Substratlösungen gewaschen.
  • Die an die FTA-Membran angeheftete DNA wurde – in einem Set der Wells – direkt auf der Membran visualisiert, wenn das unlösliche Produkt von PO nach der Inkubation mit 3,3'-Dianisidin entwickelt wurde. Ein doppeltes Set der Wells wurde mit 1,2-Ortophenylendiamin-Dihydrochlorid (OPD) inkubiert, und die Farbentwicklung im Überstand wurde bei 490 nm abgeschätzt.
  • Ergebnisse
  • Die sich entwickelte Farbintensität auf der FTA-Membran korreliert direkt mit der Menge der pro Well geladenen DNA. Die beste Auflösung zwischen DNA-positiven Proben mit unterschiedlichen DNA-Konzentrationen und DNA-Negativproben wurde auf der Membran mit einer Porengröße von 0,8 μm erreicht, wobei bei 490 μm wie folgt abgelesen wurde: DNA-negative Wells 0,204; 0,2 μg DNA/Well 1,070; 1 μg DNA/Well 1,776.
  • Wenn das unlösliche PO-Produkt die Menge an DNA anzeigte, wurden die herausragendsten Unterschiede zwischen DNA-positiven Proben mit unterschiedlicher DNA-Konzentration und DNA-negativen Proben auf der Membran mit einer Porengröße von 0,1 μm erreicht.
  • BEISPIEL 3:
  • FTA-NYLON UND NITROCELLULOSEMEMBRANEN
  • ANWENDUNG FÜR WBC-BESTIMMUNG
  • Membranen
  • Für die folgenden Experimente wurden vier Membranen eingesetzt. Diese Membranen waren wie folgt: Nitrocellulosemembran, Porengröße 0,2 μm, Schleicher & Schull; Nylonmembran, Porengröße 0,2 μm, Osmonics; Nylonmembran, Porengröße 1,2 μm, Osmonics; und FTA-Glas, Grad F572-08, Whatman (für Vergleichszwecke eingesetzt).
  • Die Membranen wurden mit der FTA-Lösung zwei Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln getränkt, vollständig bei Raumtemperatur getrocknet und bei 80°C eine Stunde lang gebacken.
  • WBC-Proben
  • Proben verschiedener Konzentrationen wurden in dem Experiment eingesetzt. Diese Konzentrationen schlossen mit ein: WBC, 5 × 103 Zellen/μl; WBC 5 Zellen/μl; DNA-Positivkontrolle, 2 μg/μl einzelsträngige DNA in Wasser; und WBC-Negativkontrolle, 3% BSA in PBS.
  • Protokoll
  • Alle Assayschritte wurden in einer 96-Wellplatte durchgeführt. Die kreisförmigen Stückchen jeder Membran, 0,5 mm im Durchmesser, wurden auf den Boden jedes Well gelegt. WBC-Proben mit 3 μl wurden in jedes Well gegeben, und zwar im doppelten Ansatz. Anschließend wurde die Platte mit PBS/BSA/Tween-20-Lösung blockiert, mit Polyethylenimin-Peroxidasekonjugat inkubiert, mit PBS/BSA/Tween-20-Lösung gewaschen und schließlich mit unterschiedlichen Substraten für die Peroxidase inkubiert, um farbige lösliche oder unlösliche Produkte entwickeln zu lassen.
  • Ergebnisse
  • WBC-positive und WBC-negative Proben entwickelten unterschiedliche Farbintensitäten auf den FTA-Nylon- und FTA-Nitrocellulose-Membranen, von denen jede eine Porengröße von 0,2 μm hatte. Die Farbintensität entwickelte sich, wenn das Ergebnis der Enzymreaktion ein lösliches Produkt war.
  • DNA-positive und DNA-negative Proben entwickelten unterschiedliche Farbintensitäten auf der FTA-Nitrocellulosemembran mit einer Porengröße von 0,2 μm. Auch hier entwickelte sich wiederum eine Farbintensität, wenn das Ergebnis der Enzymreaktion ein unlösliches Produkt war.
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • Die Farbintensität entwickelte sich auf den FTA-Membranen in den 96-Wellplatten als ein Ergebnis des PEI-PO-Assays. Dies korreliert direkt mit der Menge an WBC. Die DNA kann aus WBC auf FTA-behandelten Membranen für eine nachfolgende analytische Bestimmung freigesetzt werden.
  • Physikalische und chemische Eigenschaften der FTA-behandelten Membran, wie beispielsweise Porengröße, sind wichtig für die DNA-Evaluation. Auf Basis zweier Experimente könnte gezeigt werden, dass die Membran mit einer Porengröße von 0,8 μm die beste für die DNA-Bestimmung ist, wohingegen die Membran mit einer Porengröße von 0,1 μm vielversprechender für die WBC-Evaluation ist. Die in den 2 Tabellen und 2 Abbildungen dargestellten Ergebnisse sind wie folgt bezeichnet
    Reihe:
    I 0,2 μm Nylonmembran (vergleichend)
    II 1,2 μm Nylonmembran (vergleichend)
    III FTA-Glaspapier (vergleichend)
    IV 0,2 μm Nitrocellulose
    Säulen: A B C D
    Konzentration 5 × 103 WBC/μl 5 WBC/μl 2μg/μg DNA 0-Kontrolle
  • Es wird bemerkt, dass 3 μl der Proben in die Wells gegeben wurden.
  • Die Vorteile schließen eine erleichterte Nukleinsäurenherstellung mit ein. Ferner ermöglichen auch GC-Adapter auf den genspezifischen Primern eine Immobilisierung an die feste Phase (Siehe Yang et al. (1998) PNAS, Band 95, Seiten 5462-5467). Darüber hinaus kann die DNA auf die FTA-behandelte Membran für eine nachfolgende ELISA-Bestimmung geladen werden, und die DNA kann aus WBC auf FTA-behandelten Membranen (0,2 μm Porengröße) für eine nachfolgende analytische Bestimmung freigesetzt werden.
  • BEISPIEL 4:
  • Das Detektionslimit des PEI-PO-Assays auf einer FTA-Zellulosenitratmembran für einzel- und doppelsträngige DNA wurde analysiert.
  • GEGENSTÄNDE:
  • Eine Whatman Zellulosenitratmembran mit einer Porengröße von 0,8 μm wurde mit FTA-Lösung behandelt. Sieben unterschiedliche Variablen wurden untersucht, um für die DNA-Bestimmung die empfindlichen Stellen jedes Schrittes des PEI-PO-Assays in einer 96-Wellplatte herauszufinden, und eingesetzt, um das Detektionslimit des Verfahrens für gereinigte DNA zu bestimmen. DNA-Proben wurden als einzel- und doppelsträngige DNA-Lösungen auf die FTA-behandelten Membranen in einer 96-Wellplatte mit 40 pg – 400 ng DNA/Well fixiert. Alle Schritte und Inhaltstoffe des Assays, die Plattenvorbehandlung, der Backschritt nach der Beladung mit DNA, und der Blockierungspuffer können zur Assaysensitivität beitragen. Erste Ergebnisse legten nahe, dass das Detektionslimit dieses Verfahrens auf Zellulosenitratmembran mit einer Porengröße von 0,8 40 pg/Well für einzelsträngige DNA und 400 pg für doppelsträngige DNA ist.
  • MATERIALIEN
  • Membranen
  • Zellulosenitratmembranen wurden von der Arbor Technologies Probenbibliothek erhalten. Membranen mit einer Porengröße von 0,8 μm wurden für die folgenden Experimente eingesetzt. Die Membranen wurden mit FTA eine Stunde lang bei 80°C getränkt, vollständig bei Raumtemperatur getrocknet und bei 80°C für eine Stunde gebacken.
  • DNA-Proben:
  • Einzelsträngige humane genomische DNA mit den folgenden Konzentrationen wurde eingesetzt: 20 ng/μl, 2 ng/μl, 200 pg/μl, 20 pg/μl. DEPC-behandeltes Wasser wurde als DNA-Negativkontrolle eingesetzt. 2 μl jeder DNA-Konzentrations probe wurde auf Stückchen der FTA-Zellulosenitratmembran aufgebracht. Die Proben wurden in doppelter oder dreifacher Ausführung aufgetragen.
  • Blockierungslösungen aus PBS, 3% BSA, 0,1% Tween-20 (Blockierungslösung Nr. 1), PBS, 3% BSA (Blockierungslösung Nr. 2) und 10 × Denhardt's Lösung (1% Ficoll 400, 1% Polyvinylpyrolidon, 1% BSA), 4 × SET (NaCl, EDTA, Tris-HCl, pH 8,0), 0,1% SDS (Blockierungslösung Nr. 3) wurden bei der Durchführung dieser Experimente eingesetzt.
  • Alle diese Variablen wurden ausgewählt, um die sensitiven Stellen jedes Schrittes des PEI-PO-Assays für die DNA-Bestimmung in einer 96-Wellplatte herauszufinden.
  • Zwei Experimente wurden mit FTA-Zellulosenitratmembran zur DNA-Bestimmung durchgeführt. Das Ziel des ersten Experiments war es, das Detektionslimit des Verfahrens für doppel- und einzelsträngige DNA gemäß dem folgenden Protokoll herauszufinden. Zunächst wurde 2 μl der unterschiedlichen DNA-Lösungen auf die Membranstückchen in 96-Wellplatten in doppelter Ausführung fixiert. Die Platte wurde eine Stunde lang bei 80°C gebacken. Anschließend wurde die Platte mit Blockierungslösung 1 für eine Stunde bei 37°C blockiert. Anschließend wurde die Platte mit PEI-PO-Konjugat eine Stunde lang bei 37°C inkubiert, dann dreimal mit PBS, 01% Tween jeweils zehn Minuten lang bei 37°C gewaschen. Die DNA in einem Set der Wells wurde direkt auf der Membran visualisiert, wenn unlösliches Produkt von PO nach Inkubation mit 3,3'-Dianisidin gebildet wurde. Ein doppeltes Set der Wells wurde mit 1,2-Ortophenylendiamin Dihydrochlorid (OPD) inkubiert, und die Farbentwicklung im Überstand bei 490 nm abgeschätzt.
  • Das Ziel des zweiten Experiments war es, die Bestimmung des Detektionslimits zu wiederholen, und die Ergebnisse nach Inkubation der Platten mit unterschiedlichen Blockierungslösungen zu vergleichen. In diesem Experiment wurden unbehandelte Platten und Platten, die mit 0,1% Tween-20 behandelt wurden, eingesetzt. Die Membran bei jeder Art Platte wurde nach der DNA-Beladung entweder gebacken oder nicht gebacken.
  • ERGEBNISSE
  • Die Kombination der Waschung der Platte mit Tween-20 und die Verwendung der Blockierungslösung Nr. 1 erzielte die besten Ergebnisse mit einem niedrigen unspezifischen Hintergrund. Die Hintergrundmessung bei 490 nm betrug lediglich 0,200 auf DNA-Negativmembranen. Die Blockierungslösungen Nr. 2 und Nr. 3 erhöhten eine unspezifische Sorption von PEI-PO. Die Hintergrundsmessung bei 490 nm betrug 0,6-0,8. Das Detektionslimit des Verfahrens lag bei 40 pg/Well für einzelsträngige DNA und 400 pg/Well für doppelsträngige DNA. Der Backschritt erwies sich als notwendig für die Bestimmung reiner DNA bei dem PRI-PO-Assay auf der Zellulose Nitratmembran.
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • Die Platte sollte mit 0,1% Tween-20-Lösung vor Bestimmung der DNA auf der FTA-Membran vorbehandelt werden, um einen unspezifischen niedrigen Hintergrund zu erhalten. Unter den drei Puffern erwies sich lediglich die Blockierungslösung Nr. 1 (PBS, 3% BSA, 0,1% Tween-20) als geeignete Blockierungslösung für die unspezifische PEI-PO Sorption an die FTA-Membran.
  • Die Ergebnisse legten nahe, dass das Detektionslimit dieses Verfahrens auf Zellulosenitratmembranen mit einer Porengröße von 0,8 40 pg/Well für einzelsträngige DNA und 400 pg für doppelsträngige DNA ist.
  • BEISPIEL 5:
  • Zwei ELISA-Modifizierungen wurden eingesetzt, um zu bestätigen, dass die DNA aus weißen Blutzellen (WBC) auf einer FTA-behandelten Zellulosenitratmembran für nachfolgende quantitative Bestimmungen freigesetzt werden kann.
  • Whatman Zellulosenitrat- und Nylonmembranen mit einer Porengröße von 0,2 μm wurden mit FTA-Lösung behandelt. Zwei Versionen der FTA-Behandlung wurden verwendet. Zunächst wurden die Membranen mit FTA in 96-Wellplatten behandelt, und zur DNA-Bestimmung in der gleichen Platte eingesetzt. Zweitens wurden Membranen mit FTA-Lösung behandelt, getrocknet, in Stückchen geschnitten auf die Platte geladen und anschließend für die DNA-Bestimmung eingesetzt.
  • Zwei ELISA-Modifizierungen wurden verwendet, um zu bestätigen, dass die DNA aus weißen Blutzellen (WBC) auf FTA-behandelten Zellulosenitratmembranen für nachfolgende analytische Bestimmungen freigesetzt werden kann.
  • MATERIALIEN
  • Membranen
  • Whatman Zellulosenitratmembranen, mit einer Porengröße von 0,2, 0,8 μm und Whatman Nylonmembranen, Standard und SP, beide mit einer Porengröße von 0,2 μm wurden eingesetzt.
  • FTA-Behandlung
  • Zwei Behandlungen wurden angewandt: Erstens – die Membranstückchen, 5 × 10 cm, wurden mit der FTA-Lösung (ohne Harnsäure) 15 Minuten lang getränkt, und anschließend bei 80°C für eine Stunde gebacken. Zweitens – die Membranen wurden zwischen bloßem Papier in Plastiktüten gelagert. Die Membranen wurden in runde Plättchen mit 0,5 mm Durchmesser geschnitten und in die 96-Wellplatten gelegt. 10 μl der FTA-Lösung wurde auf jedes Well auf die Membran aufgetragen. Die Platte wurde vollständig bei 80°C getrocknet.
  • DNA-Proben
  • Einzelsträngige menschliche genomische DNA der folgenden Konzentrationen wurde eingesetzt: 2 ng/μl, 200 pg/μl, 20 pg/μl; ebenso wie DEPC-behandeltes Wasser, das als DNA-Negativkontrolle eingesetzt wurde.
  • WBC-Proben
  • WBC wurden aus frischem menschlichen Blut nach einer Lysierung der roten Blutkörperchen mit Ammoniumchloridpuffer und dreimaligem Waschen mit PBS, 1,5% BSA, isoliert. Die WBC-Suspension wurde auf Zellkonzentrationen von 8 × 103, 4 × 102 und 2 Zellen pro μl verdünnt. 2 μl jeder WBC-Konzentrationsproben wurden auf die FTA-Membranstückchen in doppelter oder dreifacher Ausführung aufgetragen.
  • DESIGN DER STUDIE UND VERFAHREN
  • Das Ziel der Experimente war es, die optimale FTA-Behandlung der Membranen für die DNA-Bestimmung in einer 96-Wellplatte herauszufinden. Das Ziel des zweiten Experiments war es, zwei unterschiedliche ELISA-Assays für die WBC-Bestimmung auf der Zellulosenitrat- und Nylonmembran zu vergleichen.
  • Ein ELISA wurde auf Basis von Antikörpern gegen menschliche DNA durchgeführt, und wurde nach der Optimierung sämtlicher folgender Schritte angepasst: Das Experiment begann mit der Beladung der WBC und den DNA-Proben auf die FTA-Membranstückchen in eine 96-Wellplatte. Anschließend wurde die Platte eine Stunde lang bei 80°C gebacken. Als nächstes wurde mit Blockierungslösung, PBS, 3% BSA, 0,1% Tween-20 inkubiert. Anschließend wurde mit menschlichen monoklonalen Antikörpern (Abs), die spezifisch für menschliche DNA sind, inkubiert, einschließlich 1 ug Abs/ml für eine Stunde bei 37°C oder über Nacht im Kühlschrank. Anschließend wurde drei Mal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Die Inkubation mit Maus-Antikörpern, die spezifisch für humanes IgG, und mit Biotin konjugiert sind, erfolgte mit einer Verdünnung von 1:15.000 eine Stunde lang bei 37°C. Anschließend wurden sie dreimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Anschließend erfolgte eine Inkubation mit Avidin-Poly-HRP, mit einer Verdünnung von 1:5.000, für 45 Minuten bei 37°C. Anschließend wurden sie dreimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Das OPD-Substrat wurde 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Inkubation wurde mit 3M Schwefelsäure gestoppt. Der Überstand wurde von den Wells auf Replikaplatten übertragen. Anschließend wurde die Leseplatte bei 490 nm analysiert.
  • ERGEBNISSE
  • Ein sehr hoher positiver Hintergrund entwickelte sich auf allen Membranen, die mit FTA in der Platte behandelt waren. Zwischen DNA-positiven und DNA-negativen Wells wurden bei den Membranen keine statistischen Unterschiede beobachtet, welche mit FTA in der Platte behandelt wurden. Wenn die Membranen mit FTA vor Aufbringen in die Platte behandelt wurden, bildeten sich sehr dunkle braune Ringe auf dem Zellulosenitratmembran, die mit WBC, 8 × 103 Zellen pro μl während des PEI-PO-Assays beladen waren. Die gleichen hellen Ringe für diese WBC-Konzentration, ebenso wie für die Konzentration von 40 × 102, wurden auf der Zellulosenitratmembran mit einem Assay beobachtet, das auf Antikörpern gegen menschliche DNA basiert. Auf den Membranen, die mit reiner DNA oder 20 WBC pro μl Proben beladen waren, wurden keine Ringe beobachtet. Die Farbintensität, die in den Platten nach PEI-PO und Assays mit Antikörpern gegen menschliche DNA gemessen wurden, sind bei 490 nm in der folgenden Tabelle wiedergegeben. Farbintensität, entwickelt auf WBC-Proben, die auf FTA-Zellulosenitratmembranen geladen waren, in ELISA-Assays, Ablesen bei 490 nm, 10. März – 14 Tests
    PEI-PO-Assay Abs gegen menschliche DNA
    Mittelwert SD Mittelwert SD
    8 × 103 Zellen/μl 1,491 0,152 2,013 0,771
    4 × 102 Zellen/μl 1,255 0,214 0,645 0,104
    20 Zellen/μl 1,079 0,204 0,303 0,041
    DNA-positiv Kontrolle 1,120 0,290 0,405 0,026
    DNA-negativ Kontrolle 0,830 0,117 0,324 0,042
  • Die Farbintensität, die sich auf WBC-Positivmembranen entwickelte, hängt direkt von der WBC-Konzentration ab. Der unspezifische Hintergrund war nach einem Assay, der auf Antikörpern gegen menschliche DNA basiert, niedriger. Mit beiden Assays konnte eine ähnliche Intensität zwischen DNA-positiven und DNA-Negativproben erzielt werden, 0,74 für das PEI-PO-Assay und 0,8 für das Assay mit Antikörpern gegen menschliche DNA. Im Falle der Verwendung spezifischer Antikörper wurde jedoch zwischen Proben mit unterschiedlichen WBC-Konzentrationen ein bedeutender Unterschied beobachtet.
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • Aus WBC kann auf FTA-behandelten Zellulosenitratmembranen DNA für nachfolgende Bestimmungen freigesetzt werden. Die Farbintensität, die sich auf den WBC-positiven Membranen entwickelt, hängt von der Zellkonzentration ab.
  • Immunoassays, die auf der Wechselwirkung zwischen DNA und Polyethylenimin (unspezifisch) oder DNA und monoklonalen Antikörpern gegen DNA (spezifisch) basieren, können für die DNA-Bestimmung auf FTA-Zellulosenitratmembranen in einer 96-Wellplatte eingesetzt werden. Die Behandlung der Membran mit FTA direkt in den Wells der Platte resultiert in eine sehr hohe nicht-spezifische Anhaftung von PEI an die Membran.
  • Nylonmembranen, sowohl Standard als auch SP, mit einer Porengröße von 0,2, besitzen einen sehr hohen unspezifischen Hintergrund nach Inkubation mit PEI-PO und Assays mit Antikörpern gegen menschliche DNA. In dem vorliegenden Testaufbau konnten diese Membranen nicht für die DNA-Bestimmung mit ELISA-Assays empfohlen werden.
  • BEISPIEL 6
  • FTA-Nitrocellulosemembran-Anwendungen zur Messung des Antikörper-Levels gegen menschliche DNA. Diagnostizierung der Krankheit Lupus.
  • Versuchsaufbau:
  • Doppelsträngige genomische DNA oder eine Suspension von WBC wurde als Bezugsquelle menschlicher DNA auf Stückchen der FTA-Nitrocellulosemembran in einer 96-Wellplatte gegeben. Die Platte wurde mit Antikörpern (Abs) inkubiert, die spezifisch gegen humane DNA gerichtet sind, und die von Patienten mit der Lupus-Krankheit gewonnen wurden.
  • Die Konzentration der Antikörper betrug 1 μg Antikörper/ml. Ein ELISA-Assay basierend auf dem Maus Anti-menschlichen Antikörper, konjugiert mit Biotin und Polyavidin-HRP wurde auf der Platte durchgeführt. Eine Farbintensität entwickelte sich in den Wells mit Antikörpern gegen menschliche DNA sowie in den Kontroll-Wells, wobei die Messung bei 490 nm erfolgte.
  • ERGEBNISSE
  • Farbintensität, entwickelt auf der FTA-Zellulosenitratmembran, in Wells mit gegen menschliche DNA gerichtete Antikörpern mittels ELISA-Assay, Ablesen bei 490 nm
    Abs gegen menschliche DNA Kontrolle
    WBC als Bezugsquelle 2,013+/–0,777 0,324+/–0,042
    Genomische DNA als DNA-Quelle 0,405+/–0,026 0,324+/–0,042
  • SCHLUSSFOLGERUNG
  • Eine FTA-behandelte Membran kann zum Beladen von DNA für die nachfolgenden Bestimmungen von Antikörpern, welche spezifisch gegen menschliche DNA gerichtet sind, im Plasma von Patienten mit der Lupus-Erkrankungverwendet werden.
  • FTA-beschichtete Filtermaterialien sind im Stand der Technik als Werkzeuge für die Analyse von genetischen Materialien (Flinders Patente) bekannt, insbesondere für genomische DNA von irgendeiner Anzahl an Bezugsquellen. Die Nukleinsäure von Blutproben kann gereinigt sein, zurückgewonnen, und direkt für die PCR auf einem FTA-beschichteten Material eingesetzt werden, wie beispielweise Zellulose 3IET oder Glasmikrofasern. Das genetische Material, das an die FTA-Filter gebunden ist, kann in einem einsetzbaren Zustand bei Raumtemperatur über einen großen Zeitraum gelagert werden (bis zu 10 Jahren aus heutiger Sicht).
  • Es existieren viele Wege, auf welche FTA-beschichtete Materialien zur Beseitigung der zuvor erwähnten Bedenken eingesetzt werden können. Solche Verwendungen würden mit einschließen:
  • 1. FTA-Tags an Beutel für gespendetes Blut
  • Eine Blutprobe vom Spender, die auf eine FTA-Karte aufgetragen wird, und welche an einen Blutbeutel angebracht wird, in welche der Spender sein Blut spendet, würde die Probleme der Nachverfolgung, Archivierung und Sicherheit der Handhabung (Pathogene werden vollständig inaktiviert auf FTA) lösen. Es müsste daher kein Blut aus dem Beutel für eine NAT entnommen werden, wodurch das Bedürfnis für aufwändige QC-Messungen vermieden wird, um sich überkreuzende Verunreinigungen benachbarter Blutproben zu vermeiden.
  • 2. Mit FTA wird ein schnelles Verfahren zur Nukleinsäurenreinigung bereitgestellt.
  • In der Bluttransfusionsmedizin wird gegenwärtig Nukleinsäure aus gespendeten Proben durch herkömmliche Techniken isoliert, was bis zu 90+ Minuten dauern kann. Die Herstellung von verwendbaren Nukleinsäuren unter Verwendung von FTA-Material dauert lediglich 10 Minuten. Materialien, wie beispielsweise eine 96-Well Mikroplatte oder ein Röhrchen mit FTA-Filtern, könnten durch die Blutbanken für eine schnelle Preparation eingesetzt werden. Ferner ist vorgesehen, die Technik der Eluierung der Nukleinsäure vom FTA-Filter mit einzuschließen, wenn eine lösliche Fraktion für einige der Pathogen-Detektionssysteme nützlich ist, wie beispielsweise die Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA).
  • 3. 96 Gepoolte Proben
  • Eine 96-Well Mikroplatte mit FTA-Filtermaterial könnte eingesetzt werden, um eine Poolanalyse bereitzustellen, die länger ist als diejenige, die gegenwärtig vorge nommen wird (24 ist normal). Der Vorteil eines 96-Well FTA-Werkzeugs ist es, dass alle Proben als eine Probe verarbeitet werden können, jedoch einzelne Ergebnisse erzielen, wodurch das Bedürfnis für eine schrittweise Analyse vollständig vermieden wird, wenn der herkömmliche Pool als pathogen-positiv identifiziert wurde. Ferner bestünde auch ein geringeres Risiko für „falsch-positive" Ergebnisse, die auftreten, wenn irrtümlicherweise der falsche Weg eingeschlagen wird.
  • 4. Blutarchivkarten
  • Dies stellt eine Erweiterung der Idee der Blutbeutel-Markierung dar, bei welcher ein Abschnitt des ursprünglichen Tags für Nachuntersuchungen archiviert wird, wenn neue Pathogene entdeckt werden und von Interesse sind. Die FTA-Festphasenlagerung der Nukleinsäure erzielt nachgewiesenermaßen auch nach zehn Jahren bei einer Lagerung bei Raumtemperatur verwertbare Ergebnisse. Daher könnte die Lagerung/Archivierung in einem Aktenschrank anstelle von gefrorenen Aliquots vorgenommen werden.
  • 5. NAT vor der Blutspende
  • Hier wird ein Blutstropfen (Spender) auf eine bereitgestellte Karte gegeben, (oder welche vom Spender mitgebracht wird). NTA wird getestet und wenn dieses negativ ist, wird nach dieser Testung das gespendete Blut entnommen. Der Vorteil hierbei ist, dass lediglich sicheres Blut in die Blutbank aufgenommen wird.
  • 6. Tests nach verschiedenen Pathogenen
  • Spenderblut, das in eine FTA-Vorrichtung eingebracht wird, kann hinsichtlich vieler Pathogene zur gleichen Zeit durch PCR-Techniken getestet werden. Mit einer 50 μl Blutprobe kann eine große Oberfläche auf einem Filter generiert werden, von welchen viele Ein-Millimeter-Ausstanzungen vorgenommen werden können. Ferner besteht die Möglichkeit, unterschiedliche, spezifische PCR-Reaktionen auf der gleichen Ausstanzung vorzunehmen.
  • 7. Transport von Blutproben
  • Einrichtungen, die Blutspenden durchführen, führen nicht notwendigerweise auch NAT durch. Teure Messungen müssen daher vorgenommen werden, um Blut in Röhrchen abzufüllen, und diese zu NAT-Testcenter einzuschicken. Eine FTA-Vorrichtung mit einer Blutprobe kann mittels regulärer US-Post bei Raumtemperatur ohne zusätzliche Ausgaben versendet werden.
  • 8. Ambulante FTA-Karten
  • Opfer von Unfällen, etc., können sehr schnell NAT-gestestet werden, wenn das Blut der Opfer auf einer FTA-Karte archiviert wird, die von den Notfallhelfern mitgeführt wird.

Claims (11)

  1. Kit zum Reinigen von Nukleinsäuren mit: (i) einem Substrat zum Lysieren von Zellen und zum Reinigen von Nukleinsäuren mit einer festen Matrix, die Nitrocellulose aufweist, wobei die feste Matrix mit einer chemischen Beschichtung beschichtet ist, welche eine schwache Base aufweist, ferner einen Chelatbildner sowie einen anionischen oberflächenaktiven Stoff oder ein Detergens, das die zelluläre Lyse erleichtert; und (ii) Anzeigemitteln zur Anzeige des Vorliegens der Nukleinsäure, wobei die Anzeigemittel ein Polyethylenimin-Konjugat oder ein Enzym-gekoppelter Immunadsorptionstest (enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA) unter Verwendung von gegen menschliche DNA gerichteten Antikörpern sind.
  2. Kit nach Anspruch 1, wobei die beschichtete Matrix eine Form aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend im Wesentlichen aus einem Tupfer, einem Blatt, einer Karte und einem Ball.
  3. Kit nach Anspruch 1, wobei die feste Matrix eine Nitrocellulosemembran ist.
  4. Kit nach Anspruch 1, wobei das Kit ferner ein Mittel zur Aufrechterhaltung der Integrität aufweist, zur Konservierung der Matrix und Reinigung der Nukleinsäure.
  5. Kit nach Anspruch 4, wobei das Mittel zur Aufrechterhaltung der Integrität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend im Wesentlichen aus einem Plastikbeutel, Zellophan, einem verschließbaren Behältnis, einer Kassette und einem Parafilm.
  6. Kit nach Anspruch 4, wobei das Mittel zur Aufrechterhaltung der Integrität ein Plastikbehälter ist, wenn das Substrat ein Blatt ist.
  7. Verfahren zum Reinigen einer Nukleinsäure mit den folgenden Schritten: (i) Auftragen einer Probe, die eine Nukleinsäure enthält, auf ein Substrat, welches eine feste Matrix mit einer Nitrocellulose aufweist, wobei die feste Matrix mit einer chemischen Beschichtung beschichtet ist, die eine schwache Base aufweist, ferner einen Chelatbildner sowie einen anionischen oberflächenaktiven Stoff oder ein Detergens, das die zelluläre Lyse erleichtert; (ii) Einfangen der Nukleinsäure innerhalb des Substrats; (iii) wahlweise Fixieren der Nukleinsäure an das Substrat; (iv) Auftragen von Indikatormitteln zur Anzeige des Vorliegens der Nukleinsäure; (v) Erzeugen eines Signals zur Anzeige des Vorliegens der Nukleinsäure, wobei das Signal durch ein Polyethylenimin-Konjugat oder durch einen Enzym-gekoppelten Immunadsorptionstest (enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA) unter Verwendung von gegen menschliche DNA gerichteten Antikörpern gebildet wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Schritt des Erzeugens eines Signals ferner definiert wird als die Erzeugung eines fluoreszierenden Signals, einer Farbanzeige oder einer fotometrischen Anzeige.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die feste Matrix eine Nitrocellulosemembran ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, welches ferner den Schritt der Analyse der Menge der Nukleinsäure mit einschließt, welche durch Quantifizierung des erzeugten Signals erfasst wird.
  11. Blutkarte zur Markierung von Bluttransfusionsbeuteln, welche das Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie Mittel zur Aufrechterhaltung der Integrität aufweist.
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