DE60013277T2

DE60013277T2 - Design eines bioreaktors und verfahren zur manipulation von zellgewebe

Info

Publication number: DE60013277T2
Application number: DE60013277T
Authority: DE
Inventors: M. Jeffrey MACDONALD; P. Stephen WOLFE
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; University of North Carolina System
Priority date: 1999-06-03
Filing date: 2000-06-05
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2020-06-06
Also published as: DE60013277D1; HK1045323A1; ES2226850T3; CA2376039A1; EP1185612A2; JP4656789B2; ATE274571T1; AU5180100A; ZA200109939B; WO2000075275A3; WO2000075275A2; AU780160B2; EP1185612B1; JP2003501078A

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Vorrichtungen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Zellkultur-Vorrichtungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Vorrichtungen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Vorrichtungen zum Wachstum und zur Pflege von eukaryotischen Zellen. Eine Ausführungsform der Erfindung übernimmt Funktionen der menschlichen Leber.
2. Hintergrund der Erfindung und Erkennung der Probleme
Ein Leberschaden wird in verschiedene Haupttypen mit akutem Leberschaden, chronischem Leberleiden und multiplem Organversagen eingeteilt. Die Hauptursachen für Leberschäden sind virale Hepatitis und von Medikamenten und Toxinen verursachte Hepatotoxizität. Fortgeschrittene Leberschäden haben Enzephalopathie und Koma zur Folge und können tödlich sein. Eine Behandlung konzentriert sich auf die Stabilisierung des Patienten bis zur spontanen Wiederaufnahme der Leberfunktion oder bis zu einer Lebertransplantation. Insgesamt beläuft sich die auf Leberschäden zurückzuführende Sterberate in den USA auf über 27.000 pro Jahr.
Künstliche Organe, welche vollständig aus nicht-biologischem Material gefertigte Vorrichtungen darstellen, sind in der medizinischen Versorgung weit fortgeschritten. Künstliche Organe und Gewebeersatz wie Dialysemaschinen für Nieren, mechanische Beatmungsgeräte, Herzschrittmacher und mechanische Herzpumpen haben vielen Menschen mit schweren lebensbedrohlichen Krankheiten geholfen. Der Nutzen solcher künstlichen Organe zeigt sich in ihrer weit verbreiteten Verwendung. Beispielsweise fungieren Herzschrittmacher an Stelle ihrer biologischen Entsprechung ausgezeichnet.
Die manchmal als Dialysemaschine für Nieren bezeichnete künstliche Niere zeigt sowohl die Vorteile als auch Unzulänglichkeiten von rein künstlichen Organen auf. Dialysemaschinen für Nieren sind bei der Entfernung von Harnstoff, Kreatinin, Wasser und überschüssigen Salzen aus dem Blut wirksam, womit sie eine Hauptfunktion der normalen Niere teilweise erbringen. Künstliche Nieren haben den Tod von Patienten mit Nierenversagen klar hinausgezögert. Dialysemaschinen für Nieren sind jedoch nicht ausreichend selektiv und entfernen biologische Komponenten wie Steroidhormone nur unzureichend, was funktionsfähige natürliche Nieren nicht tun. Folglich kann eine Dialyse über einen längeren Zeitraum zu Knochenverlust, Gerinnungsstörungen, Immundefekten und Sterilität führen.
Anders als bei einem Patienten mit Nierenversagen kann ein Patient mit Leberversagen nicht spezifisch behandelt werden. Die Nierendialyse, welche die Behandlung von Nierenversagen revolutionierte, hat derzeit keine Entsprechung für die Leber. Die einzig zur Zeit für ein hartnäckiges Leberversagen zur Verfügung stehende Behandlung ist eine Lebertransplantation. Viele Patienten mit Leberversagen eignen sich wegen einer begleitenden Infektion oder einem anderen Organversagen nicht für eine Transplantation. Wegen Organmangels und langer Wartelisten sterben selbst oft solche Patienten, die sich für eine Lebertransplantation eignen, während sie auf ein Allotransplantat warten. UCLA berichtete, dass ein Viertel ihrer Kandidaten für eine Transplantation starben, bevor eine Leber erhalten werden konnte. Für eine Transplantation geeignete Organe in der Altersgruppe von Kindern sind sogar noch seltener (Busuttil, R. W. et al., Ann. Surg. 1987, 206„ 387).
Die natürliche Leber verfügt über vier Hauptarten biologischer Funktionen. Erstens biosynthetisiert die Leber ein breites Spektrum von Proteinen, welche nicht zellgebundene Hauptkomponenten des Blutes, wie z.B. Serumalbumin, alpha-Antitrypsin, alpha-Makroglobulin, Enzyme, Gerinnungsfaktoren, Trägermoleküle für Spurenelemente und die Apolipoproteine umfassen. Die Leber übergibt dann diese Komponenten an den Blutkreislauf. Die Leber sorgt auch für passende Plasmakonzentrationen von Amino- und Fettsäuren. Zweitens spielt die Leber bei Entgiftungsreaktionen eine Hauptrolle. Die Leber oxidiert oder konjugiert viele schädliche externen Gifte, ein Prozess der gewöhnlich, aber nicht immer, die giftigen Eigenschaften von Toxinen verringert. Die Leber baut auch überschüssiges Hämoglobin ab, metabolisiert die Porphyrinmoleküle des Hämoglobins und rezyklisiert die Eisenkomponente. Drittens werden Abfallprodukte wie Bilirubin konjugiert und über das Gallengangssystem ausgeschieden. Viertens synthetisiert und sezerniert die Leber Salze der Gallensäuren, welche als Netzmittel dienen und das Emulgieren und die Verdauung von Lipiden begünstigen. Die Vielfalt und Biochemie der Leberfunktionen erhöhen in breitem Umfang die Komplexität einer extrakorporalen Unterstützung der Leber.
Bioartifizielle Organe sind künstliche Organe, die entworfen wurden, um eine lebensfähige biologische Komponente aufzunehmen und in Gang zu halten. Viele biologische Funktionen sind sogar komplexer als die Erzeugung eines Spannungspotentials in regelmäßigen Abständen, wie dies bei den einfachsten Schrittmachern der Fall ist. Beispiele sind die Biosynthese von Blutbestandteilen und die Verstoffwechselung von schädlichen Agenzien. Die Leber, die endokrinen Drüsen, das Knochenmark und die Niere ragen bei solchen spezialisierten biochemischen Funktionen heraus. Künstliche Organe ohne eine biologische Komponente sind nicht im Stande, die von diesen Organen ausgeführten biochemischen Funktionen nachzuahmen.
Historisch war ein nicht biologischer künstlicher Leberersatz auf Hämodialyse und Hämoperfusion angewiesen, dies waren jedoch nur von sehr kurzzeitigem und sehr beschränktem Nutzen ((Abe, T. et al., Therapeutic Apheresis 2000, 4:26). Im Gegensatz zu rein künstlichen Organen muss ein wirksamer Leberersatz eine biologische Komponente haben. Außer den verteilten Organen, wie die Haut, die Eingeweide, das Blutbildungssystem und das Gefäßsystem stellt die Leber das massivste Organ im menschlichen Körper dar. Bei der Versorgung einer großen Masse funktionierender Leberzellen in vitro steht man vor einer Reihe von Hürden. Bei der Entwicklung einer funktionsfähigen bioartifiziellen Leber lassen sich mindestens acht Hauptprobleme angeben: 1) Wachstum und Erhalt geeigneter lebensfähiger Zellen; 2) Vorsehen einer kritischen Minimalmasse von Zellen; 3) Versorgung der Zellen mit Sauerstoff; 4) Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und wirksame Entfernung der Zellabbauprodukte; 5) Beschränkung der Scherkräf te und des hydrostatischen Drucks; 6) Versehen oder Ausstatten eines differenzierten Zellphänotyps mit der Fähigkeit zur Biosynthese und Biotransformation von Toxinen; 7) Aufrechterhaltung von Sterilität und 8) Verhinderung der Abstoßung des Lebergewebes oder einer Lyse durch das Complementsystem.
1) Wachstum und Erhalt geeigneter lebensfähiger Zellen. Leberzellen zur potentiellen Verwendung in bioartifiziellen Lebern können etablierte Zelllinien, primäre Isolate aus menschlichen oder tierischen Lebern oder ursprüngliche Leberzellen sein, die Absonderung Tumor-bildender Faktoren jedoch wirkt sich negativ auf die Zustimmung der FDA für eine BAL-Ausführung unter Einbeziehung von Zelllinien aus (Xu, A.S.L. et al, 2000 in Lineage Biology and Liver, Lanza, R.P Langer R. und Vacanti, J. (Ed.). Academic Press, San Diego, SS. 559–597). Es sind Leberzelllinien erhältlich, z.B. HepG2 und C3A, die viele Funktionen differenzierter Lebern zeigen. Zelllinien bieten die Möglichkeit der Anzucht einer genügenden Zahl von Zellen in einem extrakorporalen Zellkultursystem oder Bioreaktor zur Versorgung eines Patienten, weil das Wachstum der Zelllinien nicht durch Zellalterung sondern durch die Verfügbarkeit von Nahrung beschränkt wird. Primäre menschliche oder tierische Zellen lassen sich auch in der Anzahl erhalten, die für eine funktionsfähige bioartifizielle Leber benötigt wird. Die Verwendung von menschlicher Leber für die Präparation von Zellen ist durch den Verfügbarkeitsmangel beschränkt und die Verwendung von tierischer Leber für die Präparation von Zellen weist den Nachteil einer gewissen Zellunverträglichkeit auf. Eine akute Zellunverträglichkeit ist die Folge der Bindung von Antikörpern, die fremde Zellen erkennen, gefolgt von der Bindung von Proteinen des Komplement-Systems und einer Lyse der fremden Zellen. Es gibt auch Mechanismen einer zellulären Langzeit-Unverträglichkeit, diese sollten jedoch keine Probleme für die Verwendung von Bioreaktoren als medizinische Zwischen- oder „Überbrückungs"-Produkte verursachen. Eine mögliche Alternative zu einer anfänglichen Beimpfung mit einer großen Masse von differenzierten Zellen besteht in der Expansion von Leber-Stammzellen, welche Vorläuferzellen von reifen Leberzellen darstellen. Jüngste Berichte deuten darauf hin, dass Leber-Vorläuferzellen auf ihrem Weg zur Reifung und Differenzierung eine Anzahl von Zellteilungen eingehen i (Brill, S. et al., Differentiation 1995, 59, 95; Sigai S.H. et al., Differentiation 1995, 59, 35). Mit einer geeigneten Kontrolle des Wachstums- und Differenzierungsprozesses mit gradueller Verwendung geeigneter Cytokine lässt sich eine klinisch brauchbare Menge von Zellen präparieren.
2) Vorsehen einer kritischen Minimalmasse von Zellen. Die Leber eines erwachsenen Menschen hat ein Gewicht von etwa 1400 – 1600 Gramm und verfügt über eine beträchtliche Reserve- oder Redundanzkapazität. Es wird geschätzt, dass menschliches Überleben mit etwa 15 – 20% des Gesamtgewichts der Leber möglich ist. 20% des Lebergewichts entsprechen etwa 5 × 10¹⁰ Zellen (Kasai et al. Artif. Organs 1994,18,348). Die meisten, wenn nicht alle, früheren Konstruktionen einer bioartifiziellen Leber leiden daran, dass sie nur eine erbärmlich geringe Zellkapazität aufweisen. das heißt, solche Vorrichtungen können weit weniger als 5 × 10¹⁰ Zellen zur Verfügung stellen, oft um Größenordnungen weniger. Ohne die für die Biosynthese von Plasmakomponenten und die Entgiftungsreaktionen kritische Zellmasse sind diese anderen Konstruktionen nur von geringem klinischen Nutzen.
3) Versorgung der Zellen mit Sauerstoff. Die funktionellen Einheiten der meisten Organe, wie z.B. das Nephron, der Acinus, die Alveolen, die Mikrovilli, die Haut usw. bestehen aus Kapillarbetten, über welche ein physikalischchemischer Gradient angelegt ist. Diese Gradienten werden über Stoffaustausch-Effekte kontrolliert. Sauerstoff ist der die Zellkulturen beschränkende Hauptnährstoff (Macdonald, J.M. et al. NMR Biomed 1998,11,1; Glacken M.W. et al. Ann NYAcad Sci 1983, 413, 355). Die "integrale" Oxygenierung oder Aeration im Innern des das betreffende biologische oder chemische Material enthaltenden Bioreaktors bringt in großem Ausmaß den Stoffaustausch von Sauerstoff und Carbonsäure voran. Die Bildung der letzteren kann zur Kontrolle des pH-Werts herangezogen werden.
In der EP-A-O 113 328 wird ein Bioreaktor zum Halten von Zellen im Stadium der Proliferation und kontinuierlichen Sekretion von Produkten beschrieben mit (i) einem eine Kammer definierenden zylindrischen Gehäuse sowie einem darin integrierten Ein- und Auslass zur Versorgung mit sauerstoffhaltigem Gas, (ii) einer darin untergebrachten ersten flüssigkeitsdurchlässigen Hohlröhre zur Versorgung mit einem Nährmedium, (iii) einer koaxial zur ersten Röhre angeordneten zweiten flüssigkeitsdurchlässigen Hohlröhre mit unterschiedlicher Permeabilität zur Abgabe von Zellprodukten, (iv) eine in der Kammer untergebrachte und um beide koaxialen Röhren gewundene gasdurchlässige Röhre und (v) ein in der Kammer durch den nicht von Röhren besetzten Raum definierten Abschnitt, in dem zur Aufnahme der Zellen eine halbfeste Matrix vorgesehen ist.
In der US-A-4,833,083 wird ein Bioreaktor beschrieben, der (i) ein Gehäuse und (ii) eine Anzahl von Modulen aus porösen röhrenförmigen Elementen umfasst, wobei jedes Modul zwei poröse röhrenförmige koaxial angeordnete Elemente aufweist.
Weder der Bioreaktor der EP-A-0 113 328 noch der Bioreaktor der US-A-4,833,083 sind mit irgendwelchen Mitteln zur Regulierung der durch die unterschiedlichen Abschnitte des Moduls fließenden Flüsse versehen.
In der EP-A-0 909 811 wird ein Bioreaktor für die Kultur menschlicher Hepatozyten beschrieben, mit (i) einem mindestens einen Einlass und einen Auslass aufweisenden Gehäuse, (ii) einer darin angeordneten makroporösen Hohlzylinder-Struktur, dessen Innen- und Außenfläche mit zwei semipermeablen Membranen bedeckt sind; dadurch sind die Membranen koaxial angeordnet und definieren im Inneren des Gehäuses frei ringförmige Räume und (iii) zwei Durchlassöffnungen zum Einführen von Zellen in die makroporöse Struktur. Dieser Bioreaktor enthält nur ein Hohlfasermodul und das Gehäuse ist weder mit irgend welchen Mitteln zum Einleiten/Abziehen von Gas versehen noch mit irgend welchen Mitteln zum Regulieren des durch die unterschiedlichen Abschnitte des Moduls fließenden Flüssigkeitsstromes.
Im allgemeinen ist Sauerstoff der beschränkende Nährstoff in bioartifiziellen Lebern aus Hohlfasern (Catapano, G. et al. Int J Art Organs 1996, 19, 61), vor allem weil Hepatozyten höchst aerobe Zellen sind, die Probleme beim Stoffaustausch von Sauerstoff verursachen. Sauerstoff weist einen relativ hohen Diffusionskoeffizienten auf und der Stoffaustausch von Blut in den Sinusoidgefäßen der Leber bis zu den Hepatozyten wird eher durch Diffusion als durch Konvektion bestimmt (d.h. die Konvektion und Perfusion werden durch Druckgradienten hervorgeru fen). Diese Effekte treten auf, weil ein Sauerstoffmolekül viel kleiner als ein anderer Nährstoff wie z.B. ein Glucosemolekül oder als Biosyntheseprodukte wie Proteine ist und weil die Hepatozyten in bioartifiziellen Lebern für steile Konzentrationsgradienten sorgen. Bei bekannten Diffusionsgeschwindigkeiten für Sauerstoff und dem Sauerstoffverbrauch sowie bei plausibler Veranschlagung der Zelldichte ist der Diffusionsabstand, bei welchem die Sauerstoffverwendung der geschwindigkeitsbestimmende Wachstumsfaktor wird, nahezu 200 μm (Macdonald, J.M. et al.,1999, in Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, Kuhtreiber, W., Lanza, R.P. and Chick, W.L. (Hrg.) Birkhauser Boston, Cambridge, SS. 252-286). In bioartifiziellen Lebern mit Serienoxygenierung mittels Luftzufuhr wird Sauerstoff in Perfusionsmedien über 25 mm axial limitierend (Macdonald et al., 1999, oben).
Hepatozyten weisen einen hohen Stoffwechselumsatz auf und erfordern eine kontinuierliche Sauerstoffzufuhr. Der Sauerstoffverbrauch reicht von 0,59 bis 0,7 mMol/sec/10⁶ Zellen für HepG2-Zellen (Smith, M.D. et al. Int J Artif Organs 1996, 19, 36) und beträgt 0,42 mMol/sec/10⁶ Zellen für isolierte Hepatozyten; (Rotem, A. et al. Biotech Bioeng 1992, 40, 1286). Eine integrale Oxygenierung, d.h. eine kontinuierliche Sauerstoffzufuhr über den Versorgungsweg der Zellen mit Medium, ist wesentlich für die Lieferung von Sauerstoff an die Zellen. Eine serielle Oxygenierung, welche eine Oxygenierung an einer oder wenigen Stellen in der Flüssigkeitszuleitung für die Versorgung mit Medium darstellt, kann nicht die Masse an Leberzellen versorgen, die für eine effektive bioartifizielle Leber benötigt werden. Eine Schwierigkeit bei der seriellen Oxygenierung besteht darin, dass die Löslichkeit von Sauerstoff in wässrigen Medien, die nicht mit Sauerstoffüberträgern ergänzt sind, so niedrig ist, dass jeder vorhandene Sauerstoff schnell über den Zellstoffwechsel entfernt wird. So verlieren in einem Längsfluss entlang einer Membran eines herkömmlichen Bioreaktors die Hepatozyten ihren Sauerstoff auf ihrem Weg innerhalb von 2,5 cm und daher bedeutet ein konvektiver Massentransfer von Sauerstoff über einen zunehmenden Starling-Fluss eine Verbesserung. Zunehmende Fließgeschwindigkeiten durch herkömmliche Bioreaktoren können ein Verschließen der Fasern hervorrufen und so die Hepatozytenfunktion ungünstig beeinflussen (Callies, R. et al., Bio/Technology 1994, 12; 75). Somit können Ausführungen von bioartifiziellen Lebern, die für keine ausreichende Sauerstoff-Zufuhr sorgen, nur eine begrenzte Zahl von Zellen versorgen. Darüber hinaus bringt der Sauerstofffluss in einem System mit eingeschränkter Diffusion die Zellen dazu, sehr nahe (weniger als etwa 0,2 mm) an der Sauerstoffversorgung zu wachsen. Beispielsweise beschreibt das US-Patent 5,622,857 von Goffe einen Bioreaktor mit einigen koaxialen und einigen parallelen semipermeablen Hohlfasern. Der Goffe-Aufbau erlaubt eine integrale Oxygenierung, erzwingt aber nicht die Dicke des Abschnitts mit den Zellen. Der Faser/Faser-Abstand in dieser Ausführung beträgt 3–5 mm, so dass es keine genaue Kontrolle des Sauerstoff-Diffusionsabstands gibt. Ähnlich offenbart das US-Patent 5,183,566 von Darnell und Mitarbeitern einen Bioreaktor mit parallelen Hohlfaserbündeln. Mit der Ausführung von Darnell und Mitarbeitern lässt sich keine Vielzahl von einzelnen mehrfach koaxialen Faserbündeln mit genauen und reproduzierbaren Diffusionsabständen einrichten und die Ausführung ist nicht leicht maßstabsgerecht übertragbar. Die Ausführung von Darnell und Mitarbeitern verwendet Bündel paralleler Fasern, welche auf das Problem der Sauerstoff-Diffusion wieder nicht wirkungsvoll eingehen. Es bleibt daher das Bedürfnis nach einem Bioreaktor, der effektiv die diffusionslimitierende Wirkung der Dicke der Zellmasse berücksichtigt, indem eine kritische Zellmasse vorgesehen ist und Sauerstoff über die gesamte Länge des Bioreaktors ohne nachteilige Scherkraft-Effekte geliefert wird.
4) Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und wirksame Entfernung der Zellabbauprodukte. Das Problem der Versorgung mit Nährstoffen wie Kohlenhydraten, Lipiden, Mineralstoffen und Vitaminen ist von einigen Varianten in der Hohlfasertechnolgie erfolgreich gelöst worden und diese Merkmale lassen sich in jede lebensfähige bioartifizielle Leber oder Ausführung eines bioartifiziellen Organs mit Erfolg einbauen. Auf ähnliche Weise erfolgt die Entfernung von Stoffwechsel-Abfallprodukten gewöhnlich mit dem gleichen System, das auch die Nährstoffe zuführt. Der Verbrauch von Glutamat, Pyruvat und Glucose liegt, eine vernünftige Zelldichte und Wachstumsgeschwindigkeit vorausgesetzt, typischerweise im Bereich von 0,03 bis 0,3 nMol/sec/10⁶ Zellen (Cremmer, T. et al. JCell Physiol 1981, 106, 99; Imamura, T. et al. Anal Biochem 1982, 124, 353; Glacken, M. Dissertation 1987). Die Diffusionsgeschwindigkeiten des Sauerstoffs in Gewebe sind ähnlich denen des Pyruvats in Wasser und größer als die von Glucose. Da deren Verbrauch geringer ist als der Verbrauch an Sauerstoff, ist Sauerstoff unter den meisten Bedingungen der limitierende Nährstoff.
5) Beschränkung der Scherkräfte und des hydrostatischen Drucks. Für einen gegebenen Bioreaktor existiert ein optimales Gleichgewicht zwischen Konvektion und Diffusion für einen passen Massentransfer von Sauerstoff, ohne dass größere Sauerstoffgradienten entstehen. Beispielsweise sollte in einem nicht toxischen Sauerstoffbereich von < ,4 mM (die Löslichkeitskonstante ist 1,06 mM/Atm.; die Löslichkeit von Luft beträgt 0,2 mM bei 37°C) ab einer Entfernung von der Sauerstoffzufuhr von > 0,2 mm mit zunehmender Entfernung die konvektive Komponente des Massentransfers von Sauerstoff erhöht sein (Macdonald et al., 1999, oben). Obwohl der Sauerstoff-Partialdruck im Sinusoid der Leber in der Nähe des Periportalfeldes etwa 70 mm Hg beträgt und in der Näher der Zentralvene auf 20 mm Hg absinkt, was einem Bereich von 0,096 bis 0,027 mM an freiem Sauerstoff gleichkommt, liegt an Hämoglobin gebundener Sauerstoff im Bereich von 6,26 bis 2,91 mMol. Die Geschwindigkeit des Blutflusses im Sinusoid der Leber beträgt 0,02 cm/sec, während der Diffusionskoeffizient von Sauerstoff um ca. 4 Größenordnungen oder 2 × 10^–6 cm²/sec kleiner ist. Mit zunehmenden Scherkräften wird jedoch die Leberfunktion beeinträchtigt und in vivo-Hepatozyten durch eine Endothelschicht und eine extrazelluläre Matrix im Disse-Raum geschützt. Ausreichende Scherkräfte töten Hepatozyten ab. Andere haben herausgefunden, dass Scherkräfte spezifische Cytochrom P450-Einheiten induzieren (Multi N.A. und Shuler, M.L., Biotechnol. Prog., 1995, 77, 659). Eine Untersuchung jüngeren Datums hat gezeigt, dass die Leber mit 90% Hepatektomie schneller regeneriert als mit 70% Hepatektomie, was den größeren Scherkräften zugeschrieben wurde (Sato, Y. et al., Surg. Today, 1997, 27,518). Diese schnellere Regenerierung könnte jedoch auch auf einen höheren Massentransfer von Sauerstoff, Nährstoff und Agonist zurückzuführen sein. Es gibt daher eine gewisse Höchstgrenze für Scherkräfte, welche Hepatozyten bei noch optimaler Funktionsfähigkeit auszuhalten in der Lage sind. Diese Höchstgrenze kann höher liegen, falls eine Endothelschicht die Hepatozyten schützt.
Zur Steigerung der Konvektion werden die hydrostatischen Druckgradienten erhöht. Höhere hydrostatische Drücke können Hepatozyten zum Implodieren brin gen. Es ist daher wichtig, unterhalb dieser Drücke zu bleiben. Es ist möglich, an isolierten Ratten-Hepatozyten eine Sterblichkeit von 100% hervorzurufen, wenn man beim Inokulieren dieser Zellen in einen koaxialen Bioreaktor mit Hilfe einer Spritze hydrostatische Drücke von über 7 psi (> 300 mm Hg) über mehr als 2 Minuten aufrecht erhält.
6) Versehen oder Ausstatten eines differenzierten Zellphänotyps mit der Fähigkeit zur Biosynthese und Biotransformation von Toxinen. Der Einsatz des differenzierten Phänotyps der Leberzellen ist notwendig, um eine brauchbare bioartifizielle Leber herzustellen, weil die spezialisierten Funktionen der Leber, einschließlich der Biosynthese von Blutkomponenten und der Entgiftung von Toxinen, mit dem differenzierten Phänotyp assoziiert sind. Diese spezialisierten Funktionen der Leber gehen während der Differenzierung der Zellen ganz oder teilweise verloren, was oft bei isolierten primären Zellkulturen der Fall ist. Im Gegensatz dazu ist die zu schnellem Wachstum befähigte Form der Leberzellen der differenzierte Phänotyp, was dann den Mann der Praxis dazu nötigt, zwischen zwei entgegengesetzten Anforderungen zu lavieren (Enat, R. et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81, 1411). In einigen Schriften wird davon berichtet, dass sich der Phänotyp von Leberzellen durch die Gegenwart von Cytokinen und extrazellulären Matrixkomponenten modifizieren lässt. Insbesondere können die an Kollagen IV und Laminin reichen extrazellulären Matrixkomponenten, die von Engelbrech-Holm-Sarkomzellen (EHS-Zellen) produziert werden und unter der Bezeichnung MATRIGEL^TM kähflich bezogen werden können, bei Einsatz mit hormonhaltigen Medien einen differenzierten Phänotyp induzieren ; (Enat, R. et al., oben; Bissell, D. M. Scan J Gasterenterol-Suppl 1988, 757, 1; Brill, S. et al. Proc Soc Exp Biol Med 1993, 204, 261).
7) Aufrechterhaltung der Sterilität. Die Durchführung leicht vorzunehmender Sterilisierungsverfahren für Bioreaktoren und angeschlossener Komponenten ist für den klinischen Nutzen von extrakorporalen bioartifiziellen Organen wesentlich. Glücklicherweise sind die Sterilisierungsverfahren gut eingeführt, einschließlich der Standardmethoden für sowohl die Sterilisierung von extrakorporalen Vorrichtungen als auch für die Aufrechterhaltung einer Asepsis mittels standardisierter Einbaufilter.
8) Verhinderung einer Abstoßung von Lebergewebe oder einer Lyse durch das Complementsystem. Die Abstoßung von fremdem Gewebe kann schnell mit einem als Complement-vermittelte Lyse bezeichneten Prozess erfolgen, in welchem sich zirkulierende Antikörper an die Oberfläche von Fremdzellen binden, die Proteine des Complementsystems sich anheften und die angegriffenen Zellen lysiert werden. Das zellvermittelte Immunsystem ist für verzögerte Abstoßungsreaktionen verantwortlich. Das zellvermittelte Immunsystem sollte jedoch in Bioreaktorsystemen, welche keinen direkten Kontakt von Wirts- und Donorzellen gestatten, nicht die Hauptrolle spielen. Fremdkörper-Reaktionen wie z.B. gegen die strukturellen Komponenten des Bioreaktors sind ebenfalls zellvermittelt und sollten daher kein wesentliches Hindernis darstellen.
Benötigte Verbesserungen.
Angesichts der obigen Ausführungen besteht eine klare Nachfrage nach bioartifiziellen Lebern zur Versorgung von Patienten mit Leberversagen. Speziell besteht eine Nachfrage nach einer verbesserten Version einer bioartifiziellen Leber mit einer hohen biologischen Zellkapazität in sehr dünnen Zellschichten, welche für Sauerstoff und Nährstoffe leicht zugänglich sind. Es besteht eine Nachfrage nach einem Gerät oder Bioreaktor, der für eine große Zellmasse in Zellkultur eine wirksame Sauerstoff-Versorgung vorsieht und den Transfer von nützlichen biosynthetischen Zellprodukten an den Patienten gewährleistet. Entsprechend besteht auch eine Nachfrage nach wirksamen Verfahren zur Verwendung eines solchen Gerätes.
Die Probleme mit bestehenden Ausführungen von Bioreaktoren sind eine unzureichende Oxygenierung, eine minimale Kapazität für die biologischen Zellkomponenten, eine beschränkte Fähigkeit zur Entfernung von Toxinen, übermäßige Scherkräfte und hydrostatische Kräfte sowie die Schwierigkeit beim Transfer von biosynthetischen Zellprodukten zur Verwertung durch den Patienten. Zusätzlich kümmerten sich bestehende Ausführungen von Bioreaktoren nicht wirksam um die diffusionsbeschränkende Dicke der Zellmasse, wobei eine kritische Zellmasse vorgesehen ist, sowie um die Sauerstoffversorgung über die gesamte Länge des Bioreaktors.
3. Zusammenfassung der Erfindung
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verschiedene Ausführungsformen einer Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, welche an eine große Zellmasse einer Zellkultur in einem Bioreaktor eine genügend große Sauerstoffversorgung liefert sowie Verfahren und Anwendungen hierfür.
Eine weiter Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, in welcher Zellen in einem dünnen ringförmigen Raum aufgenommen werden können, welcher einem kontinuierlich oxygenierten und fließenden Nährmedium benachbart ist, das den unentbehrlichen Sauerstoff und Nährstoffe liefert und Stoffwechselprodukte abtransportiert.
Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung für das Sammeln der Biosyntheseprodukte großer Zellmassen in einem Bioreaktor zur Verfügung zu stellen.
Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Gerät zum Zusammenbau einer Vorrichtung zur Entgiftung von Blut oder Plasma eines Patienten zur Verfügung zu stellen, welcher zur Entfernung oder Inaktivierung diese Toxine nicht mehr in der Lage ist.
Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein als Leberersatz dienendes Gerät zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung stellt einen umschlossenen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor zur Verfügung, mit einem Gehäuse, das eine Innenseite und eine Reihe von etwa 20 bis etwa 400 Hohlfasermodulen umfasst, wobei jedes Modul mindestens drei koaxiale semipermeable Hohlfasern aufweist. Das Hohlfasermodul weist eine innerhalb einer zweiten Faser untergebrachte erste Faser auf, die zweite Faser ist innerhalb einer dritten Faser untergebracht, usw. Jeder Filter weist eine Innen- und eine Außenseite auf. Ein erstes Kompartiment wird durch die Innenseite der ersten Faser definiert und weist mindestens eine erste Einlassöffnung und mindestens eine erste Auslassöffnung auf. Ein zweites Kompartiment wird durch einen ersten ringförmigen Raum zwischen der Außenseite der ersten Faser und der Innenseite der zweiten Faser definiert und weist mindestens eine zweite Einlassöffnung und mindestens eine zweite Auslassöffnung auf. Ein drittes Kompartiment wird durch einen zweiten ringförmigen Raum zwischen der Außenseite der zweiten Faser und der Innenseite der dritten Faser definiert und weist mindestens eine dritte Einlassöffnung und mindestens eine dritte Auslassöffnung auf. Durch die angrenzenden Fasern werden aufeinander folgende Kompartimente definiert. Ein äußerstes Kompartiment zur integralen Belüftung wird durch einen ringförmigen Raum zwischen der Außenseite der äußersten Faser und der Innenseite des Gehäuses definiert und weist mindestens eine äußerste Einlassöffnung und mindestens eine äußerste Auslassöffnung auf. Das Gehäuse weist mindestens einen Einlassverteiler und mindestens einen Auslassverteiler für jedes Kompartiment auf.
Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat einen seriell verbundenen Bioreaktor mit mehreren umschlossenen Bioreaktoren mit mehrfach koaxialen Hohlfasern zum Gegenstand, in welchen zwei oder mehr Kompartimente kontinuierlich und seriell miteinander verbunden sind. Diese Ausführüngsform ist sowohl für die Biotransformation von Toxinen im Patientenplasma als auch für die Biosynthese von Plasmakomponenten zur Ergänzung des Patientenbluts besonders geeignet.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst einen einseitigen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor, der besonders für NMR-Untersuchungen und -Verwendungen geeignet ist, bei dem der Zugang zu allen Durchlassöffnungen von einer Seite oder einem Ende erforderlich ist.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst einen zweiseitigen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor, der sich besonders für Untersuchungen in kleinem Umfang eignet.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst einen eng gepackten Hohlfaser-Bioreaktor. Diese Ausführungsform ist besonders für Kulturen mit hoher Zelldichte in einer kompakten Anordnung von Nutzen und eignet sich sowohl für die Transformation von Toxinen im Plasma als auch für die Biosynthese von Plasmakomponenten, die als Ergänzung des Patientenbluts eingesetzt werden sollen.
Bei Verwendung als bioartifizielle Leber weist der Bioreaktor der vorliegenden Erfindung einen modularen Aufbau auf, um eine leichte Einstellung der funktionellen Leberkapazität zu ermöglichen, die vom Gewicht des Patienten, je nachdem, ob dieser ein Kleinkind, Kind, Heranwachsender, Erwachsener, männlich oder weiblich ist, und dem Grad der verbliebenen Leberfunktion im Patienten abhängt. Der Bioreaktor der vorliegenden Erfindung weist Kompartimente für sowohl Plasma als auch Nährmittel auf, um die Biotransformation von Toxinen im Patientenplasma zu ermöglichen und um Mittel des Bioreaktors in die Lag zu versetzen, den wirkungsvollen Transfer biosynthetischer Produkte von der bioartifiziellen Leber zum Patienten zu beschleunigen. Werden Leberzellen oder andere Zellen verwendet, ist die Erfindung bei der Herstellung von Biosyntheseprodukten für die Patienten, bei experimenteller Verwendung und zur Verwendung als zusätzliche Biotransformations-Vorrichtung zur Entgiftung des Blutes von Nutzen. Die Toxine im Blut können, jedoch keinesfalls ausschließlich, Stoffwechsel-Abfallprodukte, Produkte aus der Zell- oder Erythrozyten-Auflösung, Überdosen rezeptpflichtiger Pharmaka wie Acetaminophenon und Überdosen von verbotenen Pharmaka sein. Die leichte erfindungsgemäße Herstellung ermöglicht eine kostengünstige kommerzielle Entwicklung.
Die bedeutenderen Merkmale der Erfindung wurden ziemlich breit dargelegt, damit die folgende genaue Beschreibung besser verstanden und der damit erreichte Beitrag zum Stand der Technik besser gewürdigt werden kann. Es gibt natürlich noch zusätzliche Merkmale der Erfindung, die im Folgenden beschrieben werden und Gegenstand der beigefügten Ansprüche sind.
Der Fachmann wird zu würdigen wissen, dass die Konzeption der Erfindung, auf welcher die Offenbarung beruht, leicht als Grundlage für den Entwurf weiterer Strukturen, Verfahren und Systeme zur Ausführung der verschiedenen Zwecke der vorliegenden Erfindung herangezogen werden kann Diese und andere Gegenstände der Erfindung zusammen mit den zahlreichen Neuheitsmerkmalen, welche die Erfindung kennzeichnen sind besonders in den beigefügten Ansprüchen angegeben, welche einen Teil der Offenbarung darstellen. Für ein besseres Verständnis der Erfindung, ihre Vorteile bei der Ausführung und die bei ihrer Anwendung erhältlichen speziellen Gegenstände wird auf die anliegenden Zeichnungen nebst Beschreibung Bezug genommen, in denen bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen veranschaulicht werden.
4. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A zeigt eine Teilansicht einer mehrfach koaxialen Fasereinheit mit mehreren Kompartimenten.
1B zeigt eine graphische Darstellung von radial verlaufenden Sauerstoffkonzentrationen.
1C zeigt eine graphische Darstellung von axial verlaufenden Sauerstoffkonzentrationen.
2A zeigt einen Aufriss eines Bioreaktors mit mehrfach koaxialen Fasern.
2B zeigt ein vergrößertes Bild eines Ausschnitts einer mehrfach koaxialen Faser- Einheit.
3A zeigt einen Satz von Komponenten zur Zentrierung der Fasern.
3B zeigt eine Einzelheit des Abstandshalters.
3C zeigt die Faserhalter.
3D zeigt einen Ausschnitt der Anordnung der Verteiler für den Bioreaktor.
3E zeigt eine alternative Darstellung der Verteiler.
4 zeigt die vier Hauptschritte für zwei Verfahren, die zur Konstruktion von mehrfach koaxialen Bioreaktoren eingesetzt werden.
5 zeigt ein allgemeines Verfahren zum thermoplastischen Verschweißen von Hohlfasern.
6A zeigt eine perspektivische Ansicht einer zweiseitigen Ausführungsform für einen Bioreaktor.
6B zeigt eine Einzelheit der Vorderseite des ersten Verteilers.
6C zeigt eine Einzelheit der Rückseite des ersten Verteilers.
6D zeigt ein Explosionsbild des ersten Verteilers und zugehöriger Bauteile.
6E zeigt eine Einzelheit der Vorderseite des zweiten Verteilers.
6F zeigt eine Einzelheit der Vorderseite des zweiten Verteilers.
6G zeigt eine Einzelheit der Rückseite des zweiten Verteilers.
6H zeigt eine Manschette und eine Einzelheit des Verteilers.
6I ist ein Querschnitt durch den zweiten Verteiler.
6J zeigt eine Einzelheit der Vorderseite des dritten Verteilers.
6K zeigt eine Vorderansicht des dritten Verteilers.
6L zeigt eine Rückansicht des dritten Verteilers.
6M zeigt einen Querschnitt durch den zweiten und dritten Verteiler.
6N zeigt die Ansicht eines Plans für den vollständigen Zusammenbau eines zweiseitigen Bioreaktors.
7 zeigt ein Gestell für massenproduzierende Bioreaktoren.
8 zeigt eine perspektivische Ansicht eines einseitigen Bioreaktors.
9 zeigt einen kleinen einseitigen Bioreaktor mit integraler Oxygenierung.
10A zeigt ferner einen seriell verbundenen Bioreaktor mit Höhenansicht.
10B zeigt den radialen Fluss der seriell verbundenen bioartifiziellen Leber mit Detailansicht.
10C zeigt den radialen Fluss der seriell verbundenen bioartifiziellen Leber mit Detailansicht.
11A zeigt die bei der Verwirklichung des Darcy-Gesetzes verwendeten Variablen.
11B zeigt den Zusammenhang zwischen radialer Fließgeschwindigkeit und Druckdifferenz.
11C zeigt den Zusammenhang zwischen radialer Fließgeschwindigkeit und dem Druck in einem Kompartiment für die Zellen.
12 zeigt den Algorithmus zur Auswahl der Hohlfaser-Charakteristiken um eine bessere physiologische Funktion und Lebensfähigkeit der Zellen zu erzielen.
13A zeigt einen Querschnitt durch einen mehrfach koaxialen Bioreaktor.
13B zeigt einen Querschnitt durch eine alternative Ausführungsform eines mehrfach koaxialen Bioreaktors.
14 zeigt die perspektivische Ansicht einer Ausführungsform eines Bioreaktors.
15 zeigt die perspektivische Ansicht einer bei der Konstruktion eines Bioreaktors verwendeten Vorrichtung.
5. Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
5.1 Definitionen
Ringförmiger Raum.
Der radiale Abstand, der zwei benachbarte Hohlfasern voneinander trennt.
BAL.
Bioartifizielle Leber. Auch spezielle erfindungsgemäße Ausführungsformen: der umschlossene mehrfach koaxiale Hohlfaser-Bioreaktor; der dicht gepackte Hohlfaser-Bioreaktor oder der seriell verbundene Bioreaktor mit Leberzellen, Nährmedium und Gasen.
Bioreaktor-Modul.
Koaxial angeordnete semipermeable Hohlfasern. Ein Modul bildet den Kern des Bioreaktors aus mehrfach koaxialen Hohlfasern, während der umschlossene Bioreaktor aus mehrfach koaxialen Hohlfasern viele Module aufweist.
Biotransformation.
Die metabole Entgiftung von Blut oder Plasma durch Gewebe oder Zellen.
Viertes Kompartiment.
Das Kompartiment, falls vorhanden, in einer Ausführungsform eines Bioreaktors, das von der Außenseite der dritten Hohlfaser und der Innenseite der vierten d.h. angrenzenden Hohlfaser begrenzt wird und mit zwei Durchlassöffnungen, der Einlassöffnung des vierten Kompartiments und der Auslassöffnung des vierten Kompartiments verbunden ist.
Erstes Kompartiment.
Das Kompartiment in jeder Ausführungsform des Bioreaktors, das zu einem Teil von der Innenseite der ersten und innersten koaxialen Hohlfaser begrenzt wird und mit zwei Durchlassöffnungen, der Einlassöffnung des ersten Kompartiments und der Auslassöffnung des ersten Kompartiments verbunden ist
Integrale Belüftung.
Beaufschlagung mit einem Gas, typischerweise Luft oder Sauerstoff mit Kohlendioxid, an fast allen Punkten längs eines Flüssigkeitsweges. Die integrale Belüftung ist von der seriellen Belüftung zu unterscheiden, bei welcher an einem Punkt im Flüssigkeitskreislauf ein Rührer oder eine Gasaustauschvorrichtung zwischengeschaltet ist.
Verteiler.
Ein an einem Ende der Fasern angeordneter Teil des Bioreaktors zum physikalischen Auftrennen der Kompartimente und Aufspalten des Flüssigkeitsstromes.
Hohlfaser aus Mikrofaser oder mit Mikrobohrung.
Semipermeable Hohlfaser von 200 bis 500 μm Außendurchmesser.
Mehrfach koaxialer Hohlfaser-Mikroreaktor.
Der Bioreaktor mit von einem Hohlgehäuse eingeschlossenen drei oder mehr koaxial angeordneten halbdurchlässigen Hohlfasern.
Nährmedium.
Die mit Zuckern, Spurenelementen, Vitaminen und Wachstumsfaktoren angereicherten ausgewogenen Elektrolytlösungen. Jede besondere Formulierung ist vom oder für den Formulator benannt, manchmal mit schrulligen oder nicht gerade erhellenden Bezeichnungen. Nährmedien sind, jedoch nicht ausschließlich, RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute, Formulierung # 1640), Ham's F-12 (die zwölfte Formulierung von Dr. Ham in seiner F Serie), DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) und CMRL-1415 (Connaught Medical Research Laboratory Formulierung #1415). Nährmedien werden routinemäßig durch Zusatz von dem Fachmann bekannten Hormonen, Mineralstoffen und Faktoren angereichert, wie beispielsweise, jedoch keineswegs ausschließlich, Insulin, Selen, Transferrin, Serum und Plasma.
Einseitiger mehrfach koaxialer Hohlfaser-Bioreaktor.
Die Version eines mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktors, bei dem sich sowohl die Einlass- als auch die Auslassöffnung auf derselben Endplatte befinden. Diese Version ist insbesondere an NMR-Untersuchungen und an Untersuchungen angepasst, wo ein Zugang zu allen Durchlassöffnungen von einer Seite aus erforderlich ist.
Äußerstes Kompartiment.
Das Kompartiment in jedem der Bioreaktoren, das von der Außenseite der äußersten Hohlfaser und der Innenseite des Gehäuses eingegrenzt wird und an zwei Durchlassöffnungen, der Einlassöffnung für das äußerste Kompartiment und der Auslassöffnung für das äußerste Kompartiment, angeschlossen ist.
Potten.
Ein Fachausdruck, der das Verbinden von Bauteilen bedeutet, wie z.B. durch Verkleben oder durch irgend ein anderes geeignetes Mittel.
Umschlossener mehrfach koaxialer Hohlfaser-Bioreaktor.
Bioreaktor mit Gruppierungen von ca. 20 bis ca. 400 Modulen koaxial angeordneter semipermeabler Hohlfasern, wobei der gesamte Satz von Modulen von einem hohlen Gehäuse umgeben ist.
Zweites Kompartiment.
Das Kompartiment in einer Ausführungsform des Bioreaktors, welches von der Außenseite der ersten und innersten koaxialen Hohlfaser und der Innenseite der zweiten, d.h. benachbarten, Hohlfaser begrenzt wird und an zwei Durchlassöffnungen, der Einlassöffnung für das zweite Kompartiment und der Auslassöffnung für das zweite Kompartiment, angeschlossen ist. Beim einseitigen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor und bei einigen Faserausführun gen mit toten Enden bietet nur eine Durchlassöffnung Zugang zum Kompartiment 2.
Seriell verbundener Bioreaktor.
Das System mit einer Anzahl von umschlossenen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktoren oder mit dicht gepackten Hohlfaser-Bioreaktoren oder einer Kombination derselben, in welchem zwei oder mehr Kompartimente kontinuierlich und in Reihe miteinander verbunden sind. In diesem Kontext wird jeder umschlossene Bioreaktor als Bioreaktor-Untereinheit bezeichnet.
Drittes Kompartiment.
Das Kompartiment in jeder der Ausführungsformen des Bioreaktors, welches von der Außenseite der zweiten koaxialen Hohlfaser und der Innenseite der dritten, d.h. benachbarten, Hohlfaser begrenzt wird und an zwei Durchlassöffnungen, der Einlassöffnung für das dritte Kompartiment und der Auslassöffnung für das dritte Kompartiment, angeschlossen ist.
Dicht gepackter Hohlfaser-Bioreaktor.
Der umschlossene Bioreaktor mit Gruppierungen von ca. 20 bis ca. 400 Modulen von koaxial angeordneten semipermeablen Hohlfasern. Mikrofasern zur Belüftung sind zueinander parallel und benachbart zu den Modulen angeordnet und das Ganze ist von einem Hohlgehäuse umschlossen.
5.2 Bauteile des Gerätes
Die vorliegende Erfindung umfasst einen modularen mehrfach koaxialen Bioreaktor mit theoretisch unbeschränkter Zahl von koaxialen Fasern. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein umschlossener mehrfach koaxialer Bioreaktor mindestens zwei Sätze von Verteilern, mindestens drei Hohlfasergrößen, mindestens zwei Sätze von Endkappen sowie ein Gehäuse. Diese Ausführungsform des Bioreaktors enthält mindestens vier separate Kompartimente. Die modulare Ausführung setzt sich aus zwei Sätzen von Verteilern zusammen, wobei jeweils ein Verteilerpaar mit jeweils einem Faserende verbunden ist. Quer über die Sätze von Verteilern ist eine Reihe von ca. 20 bis ca. 400 Löchern koaxial angeordnet, wel che zu den Fasern koaxial ausgerichtet sind. Die Verteiler umfassen wahlweise Verzweigungen für den Fluss, so dass die Geschwindigkeiten der Flüssigkeiten und Gase durch die Fasern annähernd gleich sind. Die Verteiler-Gruppierungen aus Fasern werden in radialer Richtung von den größten zu den kleinsten Durchmessern und in axialer Richtung von den kleinsten zu den größten Faserdurchmessern angebracht. Fasern mit kleinerem Durchmesser werden in Fasern mit größerem Durchmesser eingesetzt und die jeweiligen Verteiler werden zusammen abgedichtet. Zur Ausrichtung der Fasern werden zwei oder mehr Passstifte durch präzise gebohrte Löcher in den drei Verteilern eingeführt oder die Verbindung erfolgt über Nut und Feder an angrenzenden Verteilern.
Die Bioreaktoren der vorliegenden Erfindung kombinieren auf vorteilhafte Weise eine ,integrale' Oxygenierung mit definierten Diffusionsabständen, weisen Durchlassöffnungen auf, um eine mögliche Gallengangbildung aufnehmen zu können und/oder sind leicht zu verschließen. Mit einer integralen Oxygenierung lassen sich ein effizienter Massentransfer gelöster Gase und die Kontrolle des pH-Werts erzielen. Mit definierten Diffusionsabständen lassen sich axiale und radiale physikalisch-chemisch-biologische Parameter voraussagen, wie z.B. Scherkräfte, die Verfügbarkeit von Nährstoffen und der pH-Wert. Bei Anwendung an Patienten kann eines oder mehrere der mindestens vier Kompartimente für das Blutplasma des Patienten verwendet werden, während ein anderes zur Perfusion von Zellen mit integral oxygeniertem Medium verwendet werden kann. Wahlweise lassen sich zwei oder mehr Bioreaktor-Einheiten in Serie miteinander verbinden, so dass in einer Einheit Toxine aus dem Plasma radial durch die Zellmasse perfundieren und in der nächsten Einheit synthetische Faktoren infundieren können. Es besteht das Potential, ein Gallensystem zu bilden, indem die Durchlassöffnungen als Ausgangsöffnungen für den Gallengang verwendet werden.
1A zeigt eine erfindungsgemäße mehrfach koaxiale Fasereinheit mit einer Anzahl von Kompartimenten. Die innerste Faser 102 stellt einen inneren Kapillarraum oder ein erstes Kompartiment 104 für die Aufnahme von Standardmedium oder Plasma zur Verfügung. Die mittlere Faser 106 stellt einen ringförmigen Raum oder ein erstes mittleres Kompartiment 108 für die Aufnahme von Zellen, wie z.B. Leberzellen, zur Verfügung. Die äußere Faser 110 liefert einen Extraka pillarraum oder ein zweites mittleres Kompartiment 112 für die Aufnahme von Medium. Das Gehäuse 114 definiert die äußerste Peripherie der mehrfach koaxialen Fasereinheit. Der Raum oder das äußerste Kompartiment 116 zwischen dem Gehäuse 114 und der Außenfaser 110 kann ein Gas aufnehmen. Der Diffusionsabstand 118 beträgt die Hälfte der Breite des ersten mittleren Kompartiments 108. Die radiale Perfusion 120 ist der radiale Fluss von, z.B., gelöstem Sauerstoff durch die Fasereinheit, während die axiale Perfusion 122 der axiale Fluss von, z.B., gelöstem Sauerstoff durch die Fasereinheit ist.
1B zeigt einen radialen Sauerstoffgradienten quer durch das erste mittlere Kompartiment 108 eines koaxialen Bioreaktors mit lebensfähigen Zellen und integraler Oxygenierung, wobei die Sauerstoffkonzentration im ersten Kompartiment 104 und dem zweiten mittleren Kompartiment 112 gleich ist und ein ringförmiger Raum von 0,4 mm (Millimeter) zwischen den Trennwänden 102 und 106 liegt. Wie gezeigt nähert sich der Sauerstoffgehalt 124 der 0%-Marke, wenn der Abstand 126 sich dem Diffusionsabstand 118 von 0,2 mm annähert. Nähert sich der Abstand 0,4 mm, nähert sich der Sauerstoffanteil 124 wegen der Sauerstoffdiffusion aus dem zweiten mittleren Kompartiment 112 wieder der 100%-Marke an.
1C zeigt axiale Sauerstoffgradienten, die bei Verwendung von bioartifiziellen Leber-Bioreaktorausführungen mit einer Oxygenierung entweder „in Serie" oder parallel erhalten wurden. Wie gezeigt, nimmt der Prozentsatz des Sauerstoffs 128 mit dem Abstand 130 ab, wenn eine Oxygenierung „in Serie" 132 eingesetzt wird, bleibt aber nahezu konstant, wenn eine „parallele" Oxygenierung 134 eingesetzt wird, wodurch die Abnahme des axialen Sauerstoffgradienten in Folge einer integralen Oxygenierung demonstriert wird.
Mit dieser Erfindung kann man eine genaue Kontrolle der gewünschten Diffusionsabstände in Verbindung mit einer integralen Oxygenierung durchführen und mit der modularen Ausführung mit dem Material zum Potten können Fasern von jeder Zusammensetzung in einer gewünschten mehrfach koaxialen Gruppierung angeordnet werden. Materialien zum Potten sind im Stand der Technik bekannt, wie z.B. die im US-Patent 4,227,295 von Bodnar und Mitarbeitern offenbarten.
Werden thermoplastische Fasern eingesetzt, wie z.B. Polypropylen, Polyethylen, Polysulfon usw., können Bioreaktoren unter Einsatz einer thermischen Verbindungsmethode wie die von Robinson im US-Patent 5,015,585 beschriebene gebaut werden.
2A zeigt einen umschlossenen mehrfach koaxialen Bioreaktor mit einer Anzahl von mehrfach koaxialen Fasereinheiten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Bioreaktor ca. 20 bis ca. 400 mehrfach koaxiale Fasemodule, die im Gehäuse 202 enthalten sind. Theoretisch besteht jedoch keine Beschränkung für die Anzahl der koaxialen Fasern. Wie gezeigt, weist das Gehäuse 202 eine Länge 204 von 17 cm bei einem Durchmesser 206 von 8 cm auf, obwohl auch alternative Abmessungen in Frage kommen. Beispielsweise kann die Länge der Fasern ca. 2 cm bis ca. 50 cm und der Durchmesser ca. 1 cm bis ca. 100 cm betragen. Das Gehäuse 202 z.B. umfasst drei Sätze von Verteilern 208 sowie einen Satz Endkappen 210, jeweils einen für jedes Ende des Bioreaktors. Für jeden Satz Hohlfasern wird ein Satz von Verteilern benötigt. Das Gehäuse besteht aus Glas, Polycarbonat, Polypropylen, Polyethylen, Delrin, Teflon, Stahl, Messing, Keramik oder jedem anderen geeigneten Material. Die Verteiler 208 und die Endkappen 210 können aus Acryl, einem Thermoplasten, Keramik oder jedem anderen geeigneten Material gebildet oder maschinell hergestellt sein. Die in einem mehrfach koaxialen Fasermodul jeweils enthaltenen Fasern sind vorzugsweise semipermeabel und bestehen beispielsweise jeweils aus drei Größen: aus Polysulfon von annähernd 5 mm Außendurchmesser, aus Polysulfon von annähernd 3 mm Außendurchmesser und aus Celluloseacetat von annähernd 1 mm Außendurchmesser. Auf eine koaxiale Fasereinheit kommen somit drei Fasern und auf ein Fasermodul drei Verteiler, wobei die Verteiler jeweils mit einem Ende der Fasern verbunden sind. Das gewünschte ΔP lässt sich auch verwirklichen, indem beispielsweise die aus der Durchlassöffnung 212 austretende Fließgeschwindigkeit mittels eines Nadelventils reduziert wird. Die Erfindung betrifft auch Ausführungsformen mit mehr als drei koaxialen Fasern pro Fasermodul mit den entsprechenden Verteilern und Durchlassöffnungen.
Jeder Bioreaktor mit den oben angegebenen oder ähnlichen Abmessungen kann bis zu 160 g Gewebe aufnehmen. Ferner wird in einer weiteren Ausführungsform eine größere Kapazität an Zellmasse aufgenommen, indem für das Kompartiment für die Zellen ein größeres ringförmiges Kompartiment und/oder längere Fasern eingesetzt werden. Eine ringförmige Ausführung für das Kompartiment für die Zellen weist gegenüber der Verwendung von einfachen Röhren den zusätzlichen Vorteil auf, dass eine um Größenordnungen größere Biomasse erhalten werden kann. Beispielsweise würde eine von Hu und Mitarbeitern im US-Patent 5,605,835 beschriebene bioartifizielle Leber, bei der im innersten Zwischenkapil-lar-Kompartiment Hepatozyten in Kollagen verkapselt vorliegen, 44.860 aus Celluloseacetat bestehende Hohlfasern mit 200 μm Durchmesser benötigen, um etwa 120 g Gewebe zu erhalten, das als extrakorporale Leber erforderlich ist. Im Gegensatz dazu werden in der in 2 gezeigten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine um den Faktor 150 kleinere Anzahl von Fasern eingesetzt.
Zu Durchlässen führende Öffnungen erlauben die Bewegung von Materialien. Durch die innersten Durchlassöffnungen 212 kann Medium oder Plasma durch den Bioreaktor hindurchfließen. Die ersten mittleren Durchlassöffnungen 214 erlauben den Fluss von Medium durch den Bioreaktor. Schließlich kann durch die äußersten Durchlassöffnungen 218 Gas durch den Bioreaktor fließen. Alternative Verwendungen der Durchlassöffnungen sind ebenfalls vorgesehen. Beispielsweise können Medium durch die Durchlassöffnungen 218, Zellen in oder durch die Durchlassöffnungen 216, Medium oder Plasma durch 214 und Sauerstoff oder andere Gase durch 212 fließen.
2B zeigt eine vergrößerte Ansicht einer mehrfach koaxialen Fasereinheit mit einer Anzahl von innerhalb des mehrfach koaxialen Bioreaktors angeordneten Kompartimenten. Wie gezeigt kann in dem ersten Kompartiment 104 befindliches Medium oder Plasma entweder zur innersten Durchlassöffnung 212 fließen oder von dieser aufgenommen werden. Auf ähnliche Weise können (1) in dem ersten mittleren Kompartiment 108 befindliche Zellen entweder zur ersten mittleren Durchlassöffnung 214 fließen oder von dieser aufgenommen werden, (2) in dem zweiten mittleren Kompartiment 112 befindliches Medium entweder zur zweiten mittleren Durchlassöffnung 216 fließen oder von dieser aufgenommen werden oder (3) im äußersten Kompartiment 116 befindliches Gas entweder zur äußersten Durchlassöffnung 218 fließen oder von dieser aufgenommen werden. Ebenfalls gezeigt wird ein Modul aus Hohlfasern, welches aus einer innersten Faser 220, einer mittleren Faser 222 und einer äußersten Faser 224 besteht. Ausführungsformen mit mehr als einer Mittelfaser sind ebenfalls vorgesehen.
3A zeigt einen Satz von Verteilern mit einem ersten Verteiler 302, einem zweiten Verteiler 304 und einem dritten Verteiler 306. Die Verteiler bestehen jeweils aus einem ringförmigen Abschnitt mit einem Durchmesser von etwa 15 cm, wobei jeder ca. 20 bis ca. 400 Löcher aufweist, obwohl jede Zahl von Löchern möglich ist. Die Löcher weisen je nach dem Außendurchmesser der jeweiligen Fasern drei verschiedene Durchmesser auf. Damit erhält man pro Reihe 20 Löcher mit 2 mm Abständen zwischen den Löchern, obwohl optimale Lochmuster von der Anzahl der gewünschten Fasermodule abhängen. Diese Fasern können aus jeder gewünschten Hohlfaser oder Röhre mit geeigneten Änderungen in der Ausführungsart der jeweiligen Teile bestehen, um zu den jeweiligen Faserdurchmessern zu passen.
Es werden zwei beispielhafte Verfahren zum Potten beschrieben, eines das zentrierte Koaxialfasern ergibt und eines das dies nicht tut. In beiden Verfahren werden die Fasern in die entsprechenden Verteiler 208 eingeführt. Die Außenfaser 110 kann aus jedem luftdurchlässigen Material bestehen, wie z.B. Silicon, Keramik Glas usw. Als Beispiel können äußere Hohlfasern aus Polypropylen zusammen mit thermoplastischem Verschweißen eingesetzt werden.
Das zum Zentrieren der Fasern eingesetzte Potting-Verfahren erfordert drei zusätzliche Sätze von Teilen, die in den 3A, 3B und 3C gezeigt sind: (1) eine erste Hohlfaser-Führung 314 für den ersten Verteiler, eine zweite Hohlfaser-Führung 316 für den zweiten Verteiler und eine dritte Hohlfaser-Führung 316 für den dritten Verteiler, (2) Abstandhalter 320 und (3) Hohlfaserklammern (eine äußere 322, mittlere 324 und innere 326) für jeweils eine entsprechende Hohlfasergröße (die äußere 110, mittlere 106 und innere 102). Die Hohlfaserführungen können aus jedem Material bestehen, das bei 3 mm Dicke steif bleibt. Die Verteiler- und Hohlfaserführungen werden gegeneinander gesetzt, sequentielle Verteilerlöcher werden mit Passstiften ausgerichtet die Außenfasern 110 durch die Löcher des Verteilers und sodann durch die Hohlfaserführung so eingeführt, dass die Enden der Fasern mindestens 1 cm über die Hohlfaserführung hinaus stehen. Die Fasern werden in das Gehäuse 202 eingesetzt und das andere Ende der Außenfasern wird in den nächsten ersten Verteiler 302 und die nächste erste Hohlfaserführung eingesetzt. Die Hohlfaserführung wird um einen gewissen Abstand weg vom Verteiler gezogen, damit das Abstandhalterpaar 320 zwischen den Verteiler und die Hohlfaserführung geschoben werden kann. Die Abstandhalter 320 werden auf den entsprechenden Seiten auf angrenzende Verlängerungen 330 der angrenzenden Verteiler aufgeleimt. Sind die Verteiler 208, der Abstandhalter 320 und die Hohlfaserführung erst einmal befestigt, werden die Hohlfasern mit einem Band oder Klammern befestigt. Die jeweils zu einer Fasergröße passenden äußeren 322, mittleren 324 und inneren 326 Faserklammern werden quer über die jeweilige Faserreihe eingesetzt und dienen dazu, die Fasern zur Bewahrung ihrer koaxialen Ausrichtung straff zu halten und das Innenlumen zusammenzudrücken, so dass das Epoxy während des Pottens die Hohlfasern nicht verstopft. Daher weisen die Klammern je nach der Länge einer Reihe unterschiedliche Längen auf. Die befestigten Fasern, der Abstandhalter und die Hohlfaserführung werden in einen Gießtiegel 312 eingeführt, der auf den Verteiler 208 aufgeschraubt oder mit diesem versiegelt wird und dazu dient, das Epoxy während des Pottens aufzunehmen. Das zusammengebaute Teil wird aufrecht gestellt mit dem Gießtiegel 312 nach unten und in einem 10 bis 45°-Winkel nach unten zur Durchlassöffnung 305 gekippt, das Potting-Material, z.B. Epoxy, wird in die Seitendurchlassöffnung 305 eingespritzt und rinnt an der Seite des Verteilers 208 abwärts durch die Löcher 332 und füllt die im Gießtiegel 312 enthaltenen Hohlräume 334. Zur Entfernung von Gasblasen wird der Boden des Gießtiegels 312 leicht angetippt. Eine geeignete Menge an Epoxy wird zugesetzt, damit die Hohlräume ausgefüllt werden und bis zu einer Höhe, wo beide Seiten des Verteilers 308 bedeckt sind aufgefüllt. Ist das Epoxy fast ausgehärtet, wird die Hohlfaserführung, der Abstandhalter 320, der Gießtiegel 312 und das Epoxy abgeschnitten unter Zurücklassung einer sehr dünnen Schicht Epoxy 308 über dem Verteiler. Daher dienen die Abstandshalter 320, die Hohlfaserführungen 314, 316, 318 und die Faserklammern 322, 324 und 326 zwei Zielen: (1) sie halten während des Pottens die Fasern straff und zentriert und (2) sie schaffen für das Epoxy einen Bereich, wo es zwischen den Zwischenräumen der Hohlfasern aushärten kann, die abgeschnitten werden können unter Zurücklassung einer Epoxyschicht 308 über den Verteilern.
Zum Zentrieren der inneren Faser lassen sich andere Verfahren einsetzen. In einem ersten Beispiel wird zur Zentrierung ein fester Stab in das Lumen der Innenfaser eingeführt. Sodann werden Zellen mit einer temperaturabhängigen Gelierungsmatrix, wie z.B. Collagen, gemischt und die Matrix zum Gelieren veranlasst. Dann wird der Stab entfernt. Im zweiten Beispiel dient ein Monofilament mit dem gleichen Durchmesser wie der benötigte Faserabstand als Abstandshalter. Das aus Polypropylen, Polyethylen oder einem anderen geeigneten Material bestehende Monofilament ist helixartig mit z.B. einer vollständigen Windung pro cm um die Innenfaser gewunden. Die Innenfaser mit ihrer Monofilamentwindung wird sodann in die Mittelfaser eingeführt. Damit lassen sich die Innen- und Mittelfaser achssymmetrisch ausrichten. Darum unterliegen die eingeimpften Zellen einem korkenzieherartigen Weg. Das Monofilament wird unter Verwendung des Bauteils 306 mit der Innenfaser vergossen.
3D zeigt eine ausgeschnittene und vergrößerte Ansicht einer mehrfach koaxialen Fasereinheit mit einer Anzahl von Kompartimenten, die im mehrfach koaxialen Bioreaktor sitzen und nach dem Verfahren der zentrierten koaxialen Faser gebildet wurden. Somit wird der erste Verteiler 302 oben und unten durch Epoxy 308 begrenzt und definiert zum Teil das äußerste Kompartiment 116 und die zweite mittlere Durchgangsöffnung 216. Der zweite Verteiler 304 ist oben und unten durch Epoxy 308 begrenzt und definiert zum Teil die zweite mittlere Durchgangsöffnung 216 und die erste mittlere Durchgangsöffnung 214. Der dritte Verteiler 306 ist oben und unten durch Epoxy 308 begrenzt und definiert zum Teil die innerste Durchgangsöffnung 212.
Das Potten, das zu nicht zentrierten Fasern führt, benötigt keine Hohlfaserführungen, ein Monofilament oder einen Abstandshalter sondern eine Zentrifuge. 3E ist eine Darstellung von drei Verteilersätzen 208 mit einem ersten Verteiler 302, einem zweiten Verteiler 304, einem dritten Verteiler 306 und einem Gießtiegel 312. Es ist zu bemerken, dass der zweite Verteiler 304 und der dritte Verteiler 306 keine Löcher aufweisen und die Fasern nicht koaxial ausrichten. Das Epoxy-Potten wird von Bodnar und Mitarbeitern (US-Patent 4,227,295) beschrieben. In diesem Verfahren werden die Faserenden in die zwei entsprechenden Verteiler eingeführt. Die Faserenden werden geordnet und dann und mit einem Band, ei nem Faden oder mit einem anderem Material befestigt und versiegelt. Sodann werden die Gießtiegel an beiden Enden angebracht. Das zusammengefügte Bauteil wird an seinem Achszentrum am Rotor einer Zentrifuge befestigt. Über dem zusammengefügten Bauteil wird ein flacher Behälter angebracht, der an jedem Ende Löcher aufweist, die an den Durchgangsöffnungen 305 an jedem Ende des zusammengefügten Bauteils angebracht werden. Bei rotierender Zentrifuge wird Epoxy in die Mitte des Behälters gegeben, das nach außen zu den Enden des Behälters gezwungen wird, durch die Löcher des Behälters und durch die Durchgangsöffnungen 305 in die Gießtiegel 312 gelangt, wo die Zwischenräume des Faserbündels ausgefüllt werden. Sobald die passende Menge an Epoxy in die Gießtiegel 312 geflossen ist, fährt das zusammengefügte Bauteil fort sich zu drehen, bis Epoxy teilweise hart geworden ist. Dann werden an beiden Enden das überschüssige Epoxy und die Gießtiegel 312 abgeschnitten, wobei an beiden Enden des zusammengefügten Bauteils an den Hohlfasern offene Löcher bleiben, sodann wird der nächste Schritt beim Epoxy-Potten durchgeführt. Um sicher zu gehen, dass zwischen den Verteilern keine Leckagen auftreten, werden die Verteiler 208 an ihren Rändern verschweißt oder epoxydiert.
4 ist eine Darstellung, welche die vier Hauptschritte für beide Verfahren zum Zusammenbau eines erfindungsgemäßen Moduls wiedergibt, das aus drei Sätzen von Fasern zusammengesetzt ist. Im ersten Schritt 401 des Verfahrens werden die Enden der Außenfaser 110 in Löcher im ersten Verteiler 302 eingeführt, dann der erste Verteiler 302 am Gehäuse 202 befestigt und die Faserenden vergossen. Im nächsten Schritt 402 wird der zweite Satz von Fasern oder die mittleren Fasern 106 in die Außenfaser 110 eingesetzt, die Faserenden in Löcher im zweiten Verteiler 304 eingeführt und die Faserenden vergossen. Im nächsten Schritt 403 werden die inneren Fasern 102 in die mittleren Fasern 106 eingesetzt, die Faserenden in Löcher im dritten Verteiler 306 eingeführt und vergossen. Im letzten Schritt 404 werden die Endkappen angebracht. Während des zweiten 402 und dritten 403 Schritts werden mindestens zwei Passstifte über die Passstiftlöcher 310 in die aneinandergrenzenden Verteiler eingesetzt, um die in diesen befindlichen Löcher auszurichten. Der zweite Verteiler 304 weist vier Passstiftlöcher 310 auf, da mindestens 2 mit einer Hohlfaser gefüllt werden, welche dafür sorgt, dass das Passstiftloch 310 nach Beendigung des Pottens leer bleibt, so dass ein Passstift eingesetzt werden und der zweite Verteiler 304 richtig nach dem dritten Verteiler 306 ausgerichtet werden kann. Thermoplastisches Schweißen lässt sich mit ähnlichen Materialien durchführen, daher besteht in der vorliegenden Erfindung der erste Verteiler 302 aus Polypropylen, um ihn mit Polypropylen-Fasern zu verschweißen.
5 zeigt das allgemeine Schweißverfahren. Ein Stopfen 501 aus Teflon wird in den Innendurchmesser der Hohlfaser 502 eingeführt und drückt die Faserwände gegen die Wand der Löcher 503 im Verteiler 208. Eine Heißluftpistole oder ein thermoplastisches Schweißgerät 504 werden verwendet, um die Faserwand 502 und die Wand der Löcher 503 gleichzeitig zu verschmelzen. Nach Abkühlung der so zusammengesetzten Teile wird der Teflonstopfen entfernt. An die Löcher des ersten Verteilers 302 angepasste überstehende Teflonstecker werden verwendet, um die Enden der äußeren Fasern mit dem entsprechenden ersten Verteiler 302 zu verschweißen. Beide Enden des Gehäuses 313 verfügen über einen Schlitz, in welchen der erste Verteiler 302 passt. Ähnliche zum zweiten 304 und dritten 306 Verteiler passende überstehende Teflonstecker können verwendet werden, um alle drei Sätze von Fasern thermoplastisch miteinander zu verschweißen, falls die Fasern aus demselben Material wie die Verteiler bestehen, was höchstwahrscheinlich zu nicht zentrierten koaxialen Fasern führt. Im ersten Schritt 401 wird der erste Verteiler 302 an das Gehäuse 313 geschweißt. Im zweiten Schritt 402 wird der zweite Verteiler 304 an den Verteiler 302 geschweißt. Im dritten Schritt 403 wird der dritte Verteiler 306 an den zweiten Verteiler 304 geschweißt. Im vierten Schritt 404 werden die Endkappen 210 an den dritten Verteiler 306 geschweißt.
6A zeigt einen zweiseitigen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor. Der Bioreaktor wird unter Verwendung von Teilen zusammengebaut, die aus Polypropylen maschinell gefertigt oder gebildet sind oder aus anderem maschinell hergestellten oder geformten Material, wobei jedes Teil in zweifacher Ausfertigung eingesetzt wird, nämlich für jedes entsprechende Ende des Bioreaktors eine Ausfertigung, sowie unter Verwendung von drei semipermeablen Fasern und einem NMR-Rohr von nahezu 8 bis 10 mm Durchmesser (erhältlich z.B. von Wilmad Inc., Buena, N.J.). Die für die Konstruktion des Bioreaktors verwendeten Hohlfasern weisen einen Außendurchmesser von 8 mm mit einer Wandstärke von 0,5 mm, einen Außendurchmesser von 2,6 mm mit einer Wandstärke von 0,4 mm und einen Außendurchmesser von 0,8 mm mit einer Wandstärke von 0,2 mm auf und bestehen aus Polypropylen mit einer Porengröße von 0,2 μm (z.B. zu beziehen durch Akzo-Nobel, Deutschland). Die entsprechenden Fasern können aus einem Siliconschlauch von 8 mm Außendurchmesser (z.B. zu beziehen durch Dow Corning, Midland, MI) und Polysulfon-Hohlfasern mir Außendurchmessern von 3 und 1,3 mm (z.B. zu beziehen durch AG/Technologies, Inc. Wilmington, DE) und Wandstärken von 0,4 bzw. 0,2 mm und Porengrößen von 0,1 bzw. 0,65 μm bestehen. Alternativ kann für die Außenfaser 110 ein Siliconschlauch mit kleinerem Außendurchmesser und dünnerer Wand eingesetzt und über ein perforiertes festes Rohr gezogen werden, um strukturelle Festigkeit zu erlangen. Da die Diffusion von Sauerstoff umgekehrt proportional zur Wandstärke ist, lässt sich mit dem dünnwandigeren Siliconschlauch ein höherer Massentransfer für Sauerstoff erzielen. Die Polypropylenfaser mit einem Außendurchmesser von 2,6 mm kann durch eine Polysulfonfaser mit einem Außendurchmesser von 3 mm, einer Wandstärke von 0,5 mm und einer Porengröße von 0,65 μm ersetzt werden. Diese Fasern können aus jeder gewünschten Hohlfaser oder Schlauch mit geeigneten Änderungen in der Spezifikation für den Aufbau der jeweiligen Teile zur Anpassung an die jeweilige Faser bestehen. Die Fasern werden so abgeschnitten, dass sie mindestens 2 mm länger sind als die endgültige Länge beim Zusammenbau.
Die Außenfaser 110 kann mit einem perfluorierten Polymer beschichtet werden, um die Poren zur Vermeidung von „Benetzen" oder einer Sättigung mit Wasser oder offenen Poren zu überbrücken oder zu verstopfen sowie ein Verdampfen von Wasser aus dem Medium auszuschließen, wobei ein von Compact Membrane Systems (Wilmington, Delaware) zur Verfügung gestelltes Verfahren oder ein anderes ähnliches Verfahren zum Füllen der Poren eingesetzt wird. Das beschichten kann ebenfalls an dem in 3 beschriebenen umschlossenen mehrfach koaxialen Bioreaktor durchgeführt werden. Für die Zwecke des Massentransfers erscheint die Beschichtung auf der Faserseite mit dem Medium. Falls keine Beschichtung durchgeführt wurde, muss das Kompartiment mit der Luft einen höheren Druck aufweisen als die Angrenzenden Kompartimente mit dem Medium, um zu vermeiden, dass die Poren nass werden und der Gasstrom sollte wärmer sein als der Strom des Mediums, um das Verdampfen und Kondensieren zu verringern In der vorliegenden Erfindung wird der zweiseitige mehrfach koaxiale Bioreaktor mit der größten Außenfaser 110 (z.B. 5 mm Innendurchmesser, 8,1 mm Außendurchmesser) und dem ersten Verteiler 302 zusammengebaut. Befestigungsmittel wie das Polyurethan-Epoxy- oder das thermoplastische Schweißen oder eine Kombination derselben werden eingesetzt, um die Fasern an den jeweiligen Teilen zu befestigen. Das Gehäuse, ein NMR-Rohr 604, wird mittels der Manschette 606 und der O-Ringe 602 am ersten Verteiler 302 befestigt.
Ferner zeigen die 6B, 6C und 6D den ersten Verteiler. Wie in 6B gezeigt, weist die Vorderseite einen ersten ringförmigen ausgesparten Bereich 610 auf, während die Rückseite, wie in 6C gezeigt, einen ersten ringförmigen erhabenen Bereich 612 aufweist. Sowohl der erste ringförmige ausgesparte Bereich 610 als auch der erste ringförmige erhabene Bereich 612 legen teilweise den ersten Hohlraum 614 fest. Wie in 6D gezeigt, wird der O-Ring 602 in den ersten ringförmigen ausgesparten Bereich 610 eingelegt. Die Manschette 606 wird daran befestigt. Die äußerste Durchlassöffnung 218 wird ebenfalls gezeigt.
Die 6E, 6F, 6G und 6H zeigen ferner den zweiten Verteiler. Wie in 6F gezeigt, weist die Vorderseite einen zweiten ringförmigen ausgesparten Bereich 620 auf, während die Rückseite, wie in 6G gezeigt, einen zweiten ringförmigen erhabenen Bereich 622 aufweist. Sowohl der zweite ringförmige ausgesparte Bereich 620 als auch der zweite ringförmige erhabene Bereich 622 legen teilweise den zweiten Hohlraum 624 fest. Um sicher zu stellen, dass sich in dem Raum zwischen dem ersten Verteiler 302 und dem dritten Verteiler 304 keine Zellen ansammeln, kann eine Manschette 306 über die mittlere Faser 106 geschoben werden, die sich dem zweiten Hohlraum 624 und dem vorderen Hohlraum 636 des dritten Verteilers 304 fest anschmiegt. Die zweite mittlere Durchgangsöffnung 216 wird ebenfalls gezeigt. 6C zeigt auch die Art und Weise, wie der erste Verteiler 302 mit dem zweiten Verteiler 304 verbunden ist.
Die 6I zeigt eine perspektivische Ansicht des zweiten Verteilers und veranschaulicht den zweiten Hohlraum 624, die zweite mittlere Durchgangsöffnung 216 sowie die erste mittlere Durchgangsöffnung 214.
Ferner zeigen die 6J, 6K und 6L den dritten Verteiler. Wie in den 6J und 6K gezeigt, weist die Vorderseite einen dritten ringförmigen ausgesparten Bereich 630 auf der zum Teil den dritten Hohlraum 634 festlegt. In 6L wird auch die dritte mittlere Durchgangsöffnung 214 gezeigt. 6M gibt auch einen Querschnitt des vollständigen zusammengesetzten Bauteils wieder und zeigt, wie der zweite Verteiler 304 mit dem dritten Verteiler 306 verbunden ist.
6N ist eine Aufsicht auf das vollständige zusammengesetzte Bauteil eines zweiseitigen Bioreaktors mit allen vier Einlass- und Auslassöffnungen auf einer Seite des Verteilers und zeigt den ersten Verteiler 302, den zweiten Verteiler 304, den dritten Verteiler 306, die Durchgangsöffnung für das Medium 212, die Durchgangsöffnung für die Zellen 214, die Durchgangsöffnung für das Medium 216, die Durchgangsöffnung für das Gas 218 und die Manschette 606.
Unter Verwendung eines in 7 gezeigten Ständers oder Halters lässt sich der Bioreaktor in Massenproduktion herstellen. Der Ständer hält den Verteiler 208 und die Faserachse 703 in einem Spalt 701 fest, so dass die Achse der Faser 703 in einem Winkel von 90° senkrecht auf der die Lochöffnung 705 für die Faser enthaltenden Verteilerebene 704 steht. Sodann werden die Fasern befestigt, indem der Verteiler/Faser-Raum 706 mit Epoxy gefüllt wird oder, wie in 5 gezeigt, mit einem thermoplastischen Schweißverfahren. Bei Verwendung von Epoxy wird dieses schnell in einem Ofen ausgehärtet und sodann die andere Seite gepottet und die gesamte in 7 gezeigte Verfahrensweise wiederholt. Das Verfahren lässt sich für eine Massenproduktion automatisieren, wo das in 4 gezeigte Verfahren zum Zusammenbau des Bioreaktors mit Robotern ausgeführt wird. In einem in Massenproduktion hergestellten zweiseitigen Bioreaktor werden die O-Ringe 602, die Manschetten 610 und das Schraubengewinde auf dem ersten Verteiler 302, die zum Abdichten mit dem 10 mm NMR-Glasrohr 604 verwendet werden, durch die Verwendung eines aus Polypropylen oder einem geeigneten Material zusammengesetzten Rohres als Ersatz für das 10 mm NMR-Glasrohr 604 ausgetauscht und zur Schaffung einer Dichtung thermoplastisch verschweißt oder epoxydiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Außenfaser 110 verschweißt und die beiden Innenfasern 102 und 106 epoxydiert. Bezüglich der Ko axialfasern werden die zusammengebauten Faserverteiler 208 (6) radial vom größten bis zum kleinsten Faserdurchmesser und axial vom kleinsten bis zum größten Faserdurchmesser befestigt. Die Außenfaser 110 wird in 2 O-Ringe 602, zwei Manschetten 606, ein 10 mm NMR-Rohr 604 und dann in den ersten Verteiler eingesetzt. Die beiden Manschetten werden abgedichtet und sodann die ersten Verteiler 302 an beiden Enden des Bioreaktoraufbaus in die Spalten 701 des Ständers 702 eingesetzt. Die Außenfasern 110 werden an Ort und Stelle thermoplastisch verschweißt, indem beispielsweise das in 5 beschriebene Verfahren zur Anwendung kommt. Der Bioreaktor, der nun die Gestalt einer Hantel angenommen hat, kann dann mit dem zweiten Verteiler 304 verbunden werden.
Eine zweite Faser aus Polypropylen mit einem Außendurchmesser von etwa 2,6 mm oder aus Polysulfon mit einem Außendurchmesser von etwa 3 mm wird in die Außenfaser mit einem Außendurchmesser von 5 mm eingeführt und nach dem in 7 gezeigten Epoxy-Verfahren mit dem zweiten Verteiler 304 verbunden. Der erste Verteiler 302 und der zweite Verteiler 304 werden längs ihrer Ränder verschweißt. Eine dritte Faser mit einem Außendurchmesser von 0,8 mm wird in die zweite Faser aus Polypropylen mit 1,8 mm Innendurchmesser oder aus Polysulfon mit 2 mm Innendurchmesser eingeführt und, wie oben beschrieben, mit dem dritten Verteiler 306 verbunden. Während der Befestigung der Fasern am Verteiler nur am zweiten Ende des Bioreaktors werden die Fasern auf gleicher Höhe mit ihren entsprechenden Verteilern oder Teilzahlen abgeschnitten. Eine Endkappe 210 oder eine mit Gewinde versehene Schlauchabdeckung wird an jedem Ende am dritten Verteiler 306 angeklebt bzw. angeschraubt.
8 zeigt einen koaxialen Bioreaktor mit einer Einlassöffnung 802 und einer Auslassöffnung 804 auf einer Seite des Bioreaktors. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieser Bioreaktor axial weniger als 40 mm lang und die Fasern sind mit Verteilern oder Endkappen verbunden, welche versenkte koaxiale Löcher aufweisen, die zu den Faserdurchmessern bis auf eine Genauigkeit von ! 0,143 mm (! 4,5 mil eines Zolls) passen. Wahlweise zentrieren Hepatozyten die Innenfaser und machen damit die Konstruktion leichter und erlauben eine axiale Umschließung. Je nach dem Beimpfungs-Verfahren kann der Bioreaktor teilweise gefüllt sein. Der Bioreaktor wird aus einer Innenfaser 102, einer mittleren Faser 106 einer Außenfaser 110 und Verteilern 208 auf ähnliche Weise wie der zweiseitige mehrfach koaxiale Hohlfaser-Bioreaktor zusammengebaut, mit der Ausnahme, dass nur eine Einlassöffnung und eine Auslassöffnung vorkommen. Im einseitigen mehrfach koaxialen Bioreaktor der 8 werden die gleichen Fasern und NMR-Rohr verwendet, wie die oben für den zweiseitigen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor beschrieben ist. In dieser Ausführungsform ist das Gehäuse 114 ein NMR-Rohr. Die spezielle Ausführung lässt sich in eine 10 mm NMR-Sonde einführen, wie sie bei herkömmlichen vertical-bore Magneten zum Einsatz kommt. Durch Vertauschen der Einlassöffnung 802 mit der Auslassöffnung 804 lässt sich die Fließrichtung 806 umkehren. Die Fließgeschwindigkeit im Außenring wird teilweise vom Durchmesser und der Anzahl von Löchern 808, welche als Kreis um die drei Verteiler angeordnet sind, kontrolliert. Die Verteiler und Fasern werden wie oben für den zweiseitigen einzelnen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor beschrieben zusammengebaut. Ebenfalls gezeigt werden die Öffnung 810 zum Beimpfen und der Luftfluss 812.
Eine zusätzliche Ausführung eines einseitigen mehrfach koaxialen Holfaser-Bioreaktors kann man konstruieren, indem man die Innenfaser 102 tot enden lässt und die Löcher 808 am unteren Verteiler 812 weglässt. Dies verändert die Konfiguration des Flusses, indem der Fließweg gezwungen wird, vom inneren Kompartiment 104 durch das erste mittlere Kompartiment 108, in welchem sich die Zellen befinden, zu verlaufen und durch das zweite mittlere Kompartiment 112 auszutreten, oder umgekehrt. Da in der vorliegenden Erfindung die Oxygenierung im äußeren Kompartiment erfolgt, ist der Fluss vom zweiten mittleren Kompartiment 112 zum inneren Kompartiment 104 bevorzugt, so dass das Medium auf passende Weise oxygeniert wird bevor es auf die Zellmasse trifft.
Zur Erhöhung der NMR-Empfindlichkeit kann der einseitige Bioreaktor so hergestellt werden, dass er in ein NMR-Rohr von kleinerem Durchmesser wie z.B. von 8 bis 15 mm passt. Um einen kleineren Durchmesser zu erzielen, dient in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform eine Belüftungsfaser mit einer Mikrobohrung von 200 bis 500 μm Außendurchmesser als Innenfaser 102, eine mit 1 bis 1,3 mm Außendurchmesser als mittlere Faser 106 und eine mit 3 bis 4 mm Außendurchmesser als Außenfaser 110. Der bevorzugt Fließweg verläuft vom ersten mittleren Kompartiment 108 durch die Zellmasse in das zweite mittlere Kompartiment 112 und tritt durch das Außenkompartiment 116 aus, wobei die Oxygenierung durch das innere Kompartiment 104 erfolgt. Die Gaskammer des mittleren Kompartiments 104 weist ein totes Ende auf und das Gas strömt von den Kompartimenten mittels Diffusion zu einem fließenden Luftstrom, der oben am Bioreaktor mit der Gaskammer über ein T-Verbindungsstück verbunden ist. Um durch den Bioreaktor zirkulierende Luft zu erhalten, benötigt man durch die Ausführung einen Luftstromdurchfluss. Die Innenfaser 102 in 9 verzweigt sich am Boden des Bioreaktors und mindesten eine 200 μm bis 500 μm Belüftungsfaser mit Mikrobohrung 902 zur Rückführung wird in den Löchern 808 in den das Außenkompartiment 116 begrenzenden Verteilern mit Epoxidharz verklebt und für die Rückführung des Mediums verwendet. Alternativ wird ein zweifaseriger koaxialer Bioreaktor aus einem Innenfaser-Minioxygenator, der aus 0,8 mm Polypropylenfasern zusammengesetzt ist, aufgebaut, in einer Reihe zu dem einseitigen Bioreaktor angeordnet und Gas wird über eine Wasserummantelung erhitzt, um ein Ausgasen in Folge von Temperaturänderungen und/oder Unterschieden zwischen der Oxygenierungsvorrichtung und dem Bioreaktor zu vermeiden.
10A zeigt die seriell verbundene bioartifizielle Leber. Sie enthält mindestens zwei bioartifizielle Leber-Untereinheiten mit möglicherweise bis zu 160 g Gewebe pro Untereinheit. Über die Öffnungen 1006 und/oder 1014 und 1024 und/oder 1032 werden Zellsuspensionen und die entsprechenden ringförmigen Kompartimente eingeleitet und sich an den ringförmigen Kompartimenten verankern gelassen. Es werden radiale Flüsse verwendet, um die Medien vom Plasma zu den Zellen mit Biotransformationsfunktion zu perfundieren. In der zweiten Untereinheit wird das Fließschema gewechselt, so dass synthetische Faktoren von den Zellen zurück zum Plasma fließen können. Ein radialer Fluss wird später weiter unten beschrieben.
Wie in 10A gezeigt, tritt Plasma 1001 vom Patienten in die erste Untereinheit 1002 der bioartifiziellen Leber durch die erste Plasma-Einlassöffnung 1004 ein, das Medium 1054 tritt in die erste Untereinheit 1002 der bioartifiziellen Leber durch die Einlassöffnung für das Medium 1008 ein und das Gas tritt in die erste Untereinheit 1002 der bioartifiziellen Leber durch die erste Einlassöffnung für das Gas 1010 ein. Ein radialer Fluss wird erzeugt, indem Hohlfasern mit charakteristischen Porengrößen und Porenzahl so ausgesucht werden, dass die hydraulische Permeabilität der Faser relativ hoch ist und über die Fasern ein wesentlicher Druckgradient aufgebaut wird, wie er in dem weiter unten diskutierten hydrodynamischen Modell ermittelt wird. 10B zeigt den Plasmafluss unter Bedingungen, wo das Plasma-Kompartiment 1042 einen höheren Druck aufweist als das Kompartiment für die Zellen 1044 und das Kompartiment für das Medium 1046. Unter diesen Bedingungen fließt einiges Plasma radial von der Einlassöffnung 1004 zum Kompartiment für das Plasma 1042, durch die in dem Kompartiment für die Zellen 1044 enthaltene Zellmasse in das Kompartiment für das Medium 1046 und aus der Auslassöffnung 1016 für das Medium. Das verbleibende Plasma tritt dann aus der ersten Untereinheit 1002 der bioartifiziellen Leber durch die erste Auslassöffnung 1012 für das Plasma aus und wird am T-Stück 1048 aufgetrennt. Das Medium tritt aus der ersten Untereinheit 1002 der bioartifiziellen Leber durch die erste Auslassöffnung für das Medium 1016 aus und das Gas aus der ersten Untereinheit 1002 der bioartifiziellen Leber durch die erste Auslassöffnung für das Gas 1018. Der erhöhte Druck im Plasma-Kompartiment 1042, der zur Schaffung von ΔP als Antrieb für den radialen Fluss benötigt wird, wird dadurch geschaffen, dass der Plasmastrom am T-Stück 1048 aufgetrennt und das Plasma mittels einer die Eintrittsöffnung für das Plasma 1004 mit der Auslassöffnung 1012 für das Plasma 1012 verbindenden Umwälzpumpe 1013 schnell durch das Plasma-Kompartiment 1042 zirkulieren gelassen wird. Die Fließgeschwindigkeiten oder Geschwindigkeiten schaffen an der Einlassöffnung 1004 für das Plasma einen genügend großen Kopfdruck und die Pumpengeschwindigkeit wird auf den gewünschten ΔP eingestellt, der von den Druckmessern 1048 an den Öffnungen 1004 und 1008 gemessen wird. Der gewünschte ΔP kann auch geschaffen werden, indem ein Nadelventil 1054 in die Leitung zwischen der Auslassöffnung 1012 für das Plasma und das T-Stück 1048 eingesetzt wird. Auf diese Weise kann die Fließgeschwindigkeit des Plasmas durch die erste Untereinheit 1002 der bioartifiziellen Leber konstant bleiben und der gewünschte ΔP wird durch Abstimmung des Flusses durch das Nadelventil erzielt. Das gleiche Prinzip kann zur Kontrolle des radialen Flusses in der zweiten Untereinheit 1020 der bioartifiziellen Leber zur Anwendung kommen. In einer alternativen Ausführungsform weist das Kom partiment 1042 ein totes Ende auf, indem die Ausgangsöffnung 1012 für das Plasma weggelassen wurde.
Das Fließschema wird dann in der zweiten Untereinheit umgedreht, so dass die Flüssigkeit aus der Ausgangsöffnung 1016 durch die zweite Eintrittsöffnung 1022 für das Medium in die zweite Untereinheit 1020 der bioartifiziellen Leber eintritt, das Plasma durch die zweite Eintrittsöffnung 1026 für das Plasma in die zweite Untereinheit 1020 der bioartifiziellen Leber eintritt und das Gas durch die zweite Eintrittsöffnung 1028 für das Gas in die zweite Untereinheit 1020 der bioartifiziellen Leber eintritt. Ein Teil des Mediums fließt radial von der Eintrittsöffnung 1022 durch die ringförmige Zellschicht in die Plasma-Kompartiment. Das verbleibende Medium tritt dann durch die zweite Austrittsöffnung 1030 für das Medium aus der zweiten Untereinheit der bioartifiziellen Leber aus und die Flüssigkeit wird am T-Stück 1050 aufgetrennt und ein Teil zu einem Mittel zur Rückführung an den Patienten 1052 geleitet. Die Zellen treten wahlweise durch die zweite Austrittsöffnung 1032 für die Zellen aus der zweiten Untereinheit der bioartifiziellen Leber aus, das Plasma tritt durch die zweite Ausgangsöffnung 1034 für das Plasma aus der zweiten Untereinheit 1020 der bioartifiziellen Leber aus und das Gas tritt durch die zweite Ausgangsöffnung 1036 für das Gas aus der zweiten Untereinheit 1020 der bioartifiziellen Leber aus. 10C zeigt den Fluss des plasmahaltigen Mediums, wobei das Kompartiment 1046 für das Medium nun mit dem Kompartiment 1042 für das Plasma vertauscht wurde. Wie oben beschrieben wird ΔP im Kompartiment für das Medium 1046 aufgebaut, indem das plasmahaltige Medium durch die Pumpe 1031 umgewälzt wird, um für einen genügenden Kopfdruck zu sorgen. ΔP wird mit den Druckmessinstrumenten 1049 an den Durchgangsöffnungen 1022 und 1026 gemessen. In einer alternativen Ausführungsform wird für einen ausreichenden Kopfdruck gesorgt, indem der Fluss durch die zweite Ausgangsöffnung 1030 für das Medium unterbunden oder gedrosselt wird (unter Verwendung eines Nadelventils oder einer ähnlichen Vorrchtung).
Um einen radialen Fluss zu erzeugen, sind mehrere Konzeptionen für den Fluss möglich. Die Unterschiede in den Fließgeschwindigkeiten in zwei Kompartimen ten stammen von einer Druckdifferenz (ΔP), die einen radialen Fluss durch den ringförmigen Raum hervorruft, in dem Darcy's Gesetzt herrscht: vr = k ΔP / ηL (I)worin v_r die radiale Fließgeschwindigkeit, k die hydraulische Permeabilität, eine von den physikalischen Gegebenheiten der Hohlfaser (mit Porengröße und Porenzahl), dem Lösungsmittel und dem gelösten Stoff abhängige Konstante, n die Viskosität der Lösung und L die Kontaktlänge zwischen den beiden Kompartimenten, hier im wesentlichen die Faserlänge, sind. Es kann jede unterschiedliche Porengröße ausgewählt werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, 10^–6 m, 0,1 × 10^–6 m und 0,05 × 10^–6 m. Somit lässt sich ein radialer Fluss durch geeignete Wahl der Fasern mit einer hydraulischen Permeabilität und durch Abänderung der Fließgeschwindigkeiten erhöhen.
Bei gegebenen hydraulischen Permeabilitäten der inneren Faser 102 und der mittleren Faser 106 kann man mit einem auf Darcy's Gesetz basierenden Modell den Zusammenhang zwischen der Druckdifferenz und dem radialen Fluss berechnen. Das Modell geht von nicht komprimierbaren und Newton'schen Flüssigkeiten aus und davon, dass der axiale Druckgradient vernachlässigbar ist und dass die Fließgeschwindigkeit durch die Fasern konstant war. Aus dieser Gleichung für zwei konzentrische Hohlfasern lässt sich die folgende Beziehung ableiten:
11A definiert die in der Gleichung verwendeten Variablen. Q ist die durch den hydrostatischen Druck P₁ charakterisierte radiale Fließgeschwindigkeit aus dem Kompartiment 1102 durch die über die hydraulische Permeabilität charakterisierten Poren in der Faser 1104 durch das dazwischen liegende Kompartiment 1106, sodann durch die mit der hydraulische Permeabilität K₂ charakterisierten Poren in der zweiten Faser 1108 zu dem durch den hydrostatischen Druck P₂ charakterisierten Kompartiment 1110. Der radiale Abstand von der Mittellinie zur Innenseite der Faser 1104 ist r_a, zur Außenseite der Faser 1104 r_b, zur Innenseite der Faser 1108 r_c und zur Außenseite der Faser 1108 r_d. Es ist darauf hinzuweisen, dass die Richtung des radialen Flusses von jedem chemischen Bestandteil, ein schließlich, jedoch nicht ausschließlich Sauerstoff, Kulturmedium, Plasma und Biosyntheseprodukte, von der Richtung der Druckdifferenz abhängt. Die Richtungen des Flusses und die entsprechenden radialen Flussgeschwindigkeiten können entweder positiv oder negativ sein und werden durch das Vorzeichen des Flusses oder von Q wiedergegeben. Die Erfindung befasst sich mit Werten von Q, die dem Fluss vom inneren Kompartiment zum äußeren Kompartiment entsprechen und gleichermaßen mit Werten von Q, die dem Fluss vom äußeren Kompartiment zum inneren Kompartiment entsprechen. In 11B werden die Versuchsergebnisse des radialen Flusses vom zweiten mittleren Kompartiment 112 zum inneren Kompartiment 104 als Funktion der Druckdifferenz mit den Modelldaten unter Verwendung experimentell ermittelter Werte von K₁ und K₂ verglichen. 11C zeigt den Druck im Kompartiment 1106 für die Zellen entsprechend dem in 11B gezeigten Versuch. Ein Vergleich der 11B mit der 11C zeigt, dass die hauptsächliche Transmembran-Druckdifferenz über die mittlere Faser 106 stattfindet und dass dies auf die relativ große hydraulische Permeabilität und Wandstärke der mittleren Faser 106 zurückzuführen ist. Daher werden die Zellen vor der schädlichen Einwirkung eines im zweiten mittleren Kompartiment 112 erzeugten hohen Drucks geschützt und bei steigendem hydraulischer Permeabilität der mittleren Faser 106 wird der Druck leichter in das erste mittlere Kompartiment 108 übertragen und die Zellen werden vor dem Druck im mittleren zweiten Kompartiment weniger geschützt. Daher lässt sich dieses Modell allgemein für den Betrieb des Bioreaktors einsetzen, um für vorgegeben hydraulische Permeabilitäten der inneren 102 und mittlere 106 Fasern die geeignete Druckdifferenz vorherzusagen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Vorrichtung ein Software-Programm dieses Vorhersage-Modells, das bei der Auswahl der Kulturbedingungen bezüglich der radialen Flussgeschwindigkeiten und hydrostatischen Drücke in den Kompartimenten für die Zellen behilflich ist.
Ein Verfahren zur Auswahl einer radialen Fließgeschwindigkeit in einem Bioreaktor mit semipermeablen Fasern zur Verbesserung der Lebensfähigkeit von Zellen umfasst: das Messen eines ersten zu einer ersten semipermeablen Faser gehörenden hydraulischen Drucks sowie eines zweiten zu einer zweiten semipermeablen Faser gehörenden hydraulischen Drucks, um eine Druckdifferenz zu erhalten und Einstellen des ersten hydraulischen Drucks, des zweiten hydraulischen Drucks oder von beiden, um eine oder mehr radiale Fließgeschwindigkeiten zur Verbesserung der Lebensfähigkeit der Zellen auszuwählen.
Somit umfasst eine Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Auswahl einer radialen Fließgeschwindigkeit in einem Bioreaktor mit semipermeablen Fasern zur Verbesserung der Lebensfähigkeit der Zellen mit: Messen eines ersten zu einer ersten semipermeablen Faser gehörenden hydraulischen Drucks sowie eines zweiten zu einer zweiten semipermeablen Faser gehörenden hydraulischen Drucks, um eine Druckdifferenz zu erhalten und Einstellen des ersten hydraulischen Drucks, des zweiten hydraulischen Drucks oder von beiden, um eine oder mehr radiale Fließgeschwindigkeiten zur Verbesserung der Lebensfähigkeit der Zellen auszuwählen. Die erste und zweite Faser können koaxial sein. In einer besonderen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Auswahl einer radialen Fließgeschwindigkeit die Auswahl der radialen Fließgeschwindigkeit nach der Formel:
in welcher ΔP die Druckdifferenz, Q die radiale Fließgeschwindigkeit, L die Länge der kürzeren der ersten und zweiten Faserlängen, r_a der radiale Abstand von der Mittellinie des Bioreaktors zu inneren Oberfläche der ersten Faser, r_b der radiale Abstand von der Mittellinie des Bioreaktors zu äußeren Oberfläche der ersten Faser, r_c der radiale Abstand von der Mittellinie des Bioreaktors zu inneren Oberfläche der zweiten Faser, r_d der radiale Abstand von der Mittellinie des Bioreaktors zu äußeren Oberfläche der zweiten Faser, K₁ die hydraulische Permeabilität der ersten Faser und K₂ die hydraulische Permeabilität der zweiten Faser sind.
Die Software kann, wie in 12 gezeigt, in Form eines Algorithmus vorliegen und wird zur Auswahl der Bedingungen für den Massentransfer spezifischer Zelltypen verwendet. Die Anfangswerte für ΔP werden aus der Kenntnis der Bioreaktor-Eigenschaften erhalten, welche sowohl den Diffusionsabstand 118 und die Faserlänge als auch bekannte physiologische Bedingen des verwendeten Gewebes umfassen.
Eine genaue Beschreibung des Algorithmus für den radialen Fluss wird in 12 angegeben. Der im Block S20 gezeigte erste Schritt beginnt mit dem Input von Parametern über den Bioreaktor mit der Geometrie und den Abmessungen des Bioreaktors sowie Parametern über die Zellen mit dem Widerstand gegen die hydrostatischen Drücken und der Scherkraft. Die Druckdifferenz wird sodann in Block S22 gespeichert. Im nächsten Schritt ist zu bestimmen, ob die Druckdifferenz innerhalb der Grenzen für hydrostatischen Druck liegt und mit der fortgesetzten Lebensfähigkeit der im System verwendeten Zellen zu vereinbaren ist, wie dies im Block S24 gezeigt wird. Liegt der Druckunterschied nicht innerhalb zulässiger Grenzen, wird der Druckunterschied, wie in Block S26 gezeigt, eingestellt. Dann wird der hydrostatische Druck erneut gemessen, um zu entscheiden, ob er innerhalb zulässiger Grenzen liegt, wie dies in Block S28 gezeigt wird.
Falls die Entscheidung entweder von Block S24 oder von Block S28 so ausfällt, dass der hydrostatische Druck mit der Lebensfähigkeit der Zellen kompatibel ist, wird, wie in Block S30 gezeigt, der radiale Fluss gemessen.
Im nächsten Schritt wird eine Entscheidung gefordert, ob die mit dem radialen Fluss zusammenhängenden Scherkräfte innerhalb der Grenzen für die Lebensfähigkeit des verwendeten Zelltyps liegen, wie dies in Block S32 gezeigt wird. Falls die Scherkräfte außerhalb der zulässigen Grenzen liegen, wird die ΔP und die radiale Flussgeschwindigkeit Q betreffende obige Formel II angewandt, wie dies in Block S34 gezeigt wird. Als Ergebnis der Berechnung in Block S34 wird eine geeignetere Permeabilität K₁ und/oder hydraulische Permeabilität K₂ bestimmt, wie dies S36 nötig macht.
Wie bei Block S34 angegeben, kehrt das System nach Abänderung von einem oder mehr hydraulischen Permeabilitäten zu Block S24 zurück, um den ersten hydrostatischen Druck und die Scherkraft weiter auszuwerten.
Ist der hydrostatische Druck innerhalb der Grenzen für die Lebensfähigkeit der Zellen wie entweder in Block S24 oder 528, dann wird die radiale Fließgeschwindigkeit Q wie in Block S30 angegeben gemessen. Sind die mit dem radialen Fluss einhergehenden Scherkräfte mit der Lebensfähigkeit der Zellen vereinbar, dann herrschen Bedingungen für das Überleben von Zellen, wie dies in Block S38 angedeutet ist. Durch Festlegung geeigneter enger Grenzen für einen zulässige Druck und Scherkraft, wird eine optimale Bedingung für ein längeres Überleben der Zellen erreicht.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann ein computerlesbares Medium mit Instruktionen zur Berechnung der radialen Fließgeschwindigkeit in einem Bioreaktor mit semipermeablen Fasern enthalten sein, wobei diese Instruktionen die Schritte umfassen: (a) Empfang der Messungen der hydraulischen Permeabilität für jede der mindestens zwei semipermeablen Fasern, (b) Empfang der mit einer Druckdifferenz für mindestens zwei koaxiale semipermeable Fasern zusammenhängenden Messungen des hydraulischen Drucks, (3) Berechnung dieser radialen Fließgeschwindigkeit zwischen den koaxialen semipermeablen Fasern.
13A zeigt einen Querschnitt durch einen mehrfach koaxialen Bioreaktor mit drei ineinander gesteckten koaxialen Hohlfasern. 13A zeigt die innerste Faser 102, die mittlere Faser 106, die Außenfaser 110 und das Gehäuse 114.
13B zeigt einen Querschnitt durch eine alternative Ausführungsform eines mehrfach koaxialen Bioreaktors. 13B zeigt die innerste Faser 102, die mittlere Faser 106, kleinere Belüftungsfasern 1302 und das Gehäuse 114. Die kleineren Belüftungsfasern 1302 befinden sich in den Räumen, die durch das Stapeln der koaxialen Fasern mit einer innersten Faser 102 und einer mittleren Faser 106 gebildet werden. Somit wird von der Außenwand der innersten Faser 102 ein erstes Kompartiment gebildet. Ein zweites Kompartiment wird durch die Außenwand der innersten Faser 102 und die Innenwand der mittleren Faser 106 festgelegt. Ein drittes Kompartiment wird durch die Außenwand der mittleren Faser 106 und das Gehäuse 114 festgelegt. Ein viertes Kompartiment wird durch die Innenwand der kleineren Belüftungsfasern 1202 gebildet. In alternativen Ausführungsformen kann ein fünftes Kompartiment für Belüftungszwecke geschaffen werden, indem in die innerste Faser 102 eine vierte kleine Belüftungsfaser eingeführt wird.
Die 14 zeigt eine Ausführungsform eines Bioreaktors. Es werden die folgenden Bauteile gezeigt: ein erster Verteiler 302, ein zweiter Verteiler 304, eine Endkappe 210, ein Einlass für das innere Kompartiment 1408, ein Auslass für das innere Kompartiment 1410, ein Kompartiment für die Zellen 1412, ein Gaseinlass 1414, ein Gasauslass 1416, ein Einlass für das äußerste Kompartiment 1418, ein Auslass für das äußerste Kompartiment 1420 und ein Gehäuse 202.
15 zeigt eine bei der Konstruktion eines Bioreaktors verwendete Vorrichtung. Die gezeigten Bauteile umfassen eine Anzahl von Fasern 1502, einen zweiten Verteiler 204, einen ersten Verteiler 302, einen O-Ring 416, einen Vakuumkopf 1504 und ein Gitter 1506. Das Vakuum sorgt für ein schnelles Einführen der kleineren Fasern in die größeren Fasern. Das Gitter 1506 hält die Fasern an Ort und Stelle.
In umschlossenen Versionen des mehrfach koaxialen Bioreaktors bestehen die Verteiler aus vielen koaxialen Löchern für die verschiedenen Fasern und in die genau auf den Verteilern angeordneten Löcher werden Passstifte eingesetzt, um sicher zu stellen, dass alle Einheiten aus Mehrfachfasern koaxial sind. Da wegen der koaxialen Ausführung die Einheiten aus Mehrfachfasern genau reproduziert werden, werden die Versuchsparameter von einer einzigen Mehrfachfaser direkt für den umschlossenen Bioreaktor verwendet.
Die Konstruktion eines Bioreaktors kann viele Variationen umfassen , die für den Fachmann auf der Hand liegen. Beispielsweise können die Hohlfasern in der Porengröße, der Länge, der Wandstärke und der Zusammensetzung variieren und das oben in 11 gezeigte hydrodynamische Modell kann eingesetzt werden, um die optimalen Eigenschaften einer Hohlfaser zu bestimmen. Die Hohlfasern können aus beliebigen Materialien einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Polysulfon, Celluloseacetat, gemischten Celluloseethern, regenerierter Cellulose, Polyvinylalkohol, Polyurethan, Polypropylen, Polycarbonat und Polyamid gefertigt sein. Celluloseacetat ist durchlässiger für das Nährmedium und Polypropylen ist durchlässiger für Gase und der Fachmann wird passende Fasern auf Grundlage dieser und anderer Eigenschaften auswählen. Die Mittel zur Bildung von Poren und zur Kontrolle der Porengröße liegen für den Fachmann auf der Hand und können sein, jedoch keineswegs ausschließlich, ein Neutronenbeschuss, eine kontrollierte Polymerisation und der Einbau von wieder auswaschbaren Agenzien. Jeder Klebstoff einschließlich Epoxy-Polyurethan kann zum Potten der Fasern eingesetzt werden und der Fachmann kennt dafür passende Klebstoffe.
6. Beispiele
Die folgenden speziellen Beispiele sollen dem besseren Verständnis der verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen dienen. Da diese speziellen Beispiele nur zur Veranschaulichung gedacht sind, sollte nichts in der folgenden Beschreibung als eine wie auch immer geartete Einschränkung der Erfindung betrachtet werden. Solche Beschränkungen werden natürlich allein durch die anhängenden Ansprüche definiert.
6.1 NMR Analyse der Leberzellfunktion im einseitigen mehrfach koaxialen Hohlfase-Bioreaktor.
Sprague-Dawley-Ratten werden mit Pentobarbital (50 mg/kg intraperitoneal) narkotisiert. Die Leber wurde durch einen ventralen Medianschnitt freigelegt und in die Pfortader zur Infusion einer Zelldissoziationslösung eine Kanüle eingeführt. Die Leberzellen wurden durch aufeinander folgende Infusionen von Ethylendiamintetraacetat (50 mM) und Kollagenase (1 bis 29 mg/ml) in einem Krebs-Henseleit-Puffer von pH 7,4 dissoziiert. Eine ausreichende Perfusion der Leber wird durch gleichförmiges Bleichen der Leber angezeigt. Isolierte Zellen werden gesammelt und in das Kompartiment für die Zellen (Kompartiment 2) des einseitigen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktors eingeführt.
Es wird eine Kernmagnetische Resonanz (NMR) durchgeführt, indem eine Ausführung einer NMR-Sonde verwendet wird, die aus zwei auf ein flexibles mit Kupfer beschichtetes Composit mittels Photoätzung aufgetragenen Helmholtz-Spulen zusammengesetzt ist. Die zwei auf geeignete Weise isolierten Spulen werden um den Bioreaktor gewickelt und im rechten Winkel zueinander ausgerichtet. Die innere Spule wird zur Untersuchung des über die Änderungen im ³¹P-Spektrum gemessenen Energiestoffwechsels auf 81 MHz abgestimmt. Die Sonde und der Bioreaktoraufbau werden für einen optimalen Vergleich der Spektren auf einem Zentrierungsgestell im Isozentrum des Magneten plaziert. Das belüftete Nährmedium wird der Einlassöffnung des ersten Kompartiments des Bioreaktors zugeführt. Durch den Fluss einer Mischung aus 95% Luft und 5% CO₂ durch die mit dem äußersten oder vierten Kompartiment des Bioreaktors verbundene Einlassöffnung 4 wird für eine integrale Belüftung gesorgt. Durch das Kompartiment 3 wird mit einer peristaltischen Pumpe Ham's F-12-Nährmedium gepumpt. Mit Hilfe eines temperaturüberwachten Wasserbades wird die Temperatur des Behälters für das Medium bei 42°C gehalten, so dass die Temperatur des Bioreaktors auf 37°C gehalten wird. Das NMR-Signal von γ-³¹P-Nucleotidtriphosphat und β-³¹P-Nucleotiddiphosphat, andere Zellkomponenten des Energiestoffwechsels und die Biosynthese werden analysiert. Das NMR-Signal wird als Funktion des durch die Fließgeschwindigkeit des Gases und den prozentualen Sauerstoffgehalt, die Fließgeschwindigkeit des Nährmediums und die Ladungsdichte der Zellen hervorgerufenen Massentransfer aufgezeichnet.
6.2 Sauerstofffluss ohne Zellen
Sauerstoff-Mikroelektroden werden mit einem Messwandler und Workbench^TM-Software verbunden und sodann gegen bekannte Standards kalibriert. Die kalibrierten Sauerstoff-Mikroelektroden werden in Abständen entlang der Faserlänge im Kompartiment 2 des mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktors angebracht. An die Einlassöffnung von Kompartiment 1, dem innersten Kompartiment des mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktors, wird ein Plasmabehälter angeschlossen. An die Einlassöffnung von Kompartiment 3 wird ein Behälter für RPMI 1640-Nährmedium angeschlossen. Peristaltische Pumpen werden zwischengeschaltet, um das Plasma und Nährmedium umzuwälzen. Das Kompartiment 2 wird ebenfalls mit Nährmedium gefüllt. Die Signale von jeder Mikroelektrode werden in 10-Sekunden-Abständen empfangen und von der Software zur Umwandlung in Sauerstoffdrücke weiter verarbeitet. Die Gasphase wird in ausgesuchten Intervallen zwischen 95% Luft mit 5% CO₂ und 95% N₂ mit 5% CO₂ umgeschaltet. Die Beträge für die Abnahme und Wiedereinstellung des Sauerstoffdrucks werden bei unterschiedlichen Fließgeschwindigkeiten gemessen, um den Sauerstofffluss mit und ohne Zellen auszuwerten.
6.3 Verwendung als extrakorporales Leber-Hilfsgerät zur Bestimmung von Bilirubin.
Hintergrund
Das Rattenmodell von Gunn, welches das Tiermodell für das Crigler-Naijar-Syndrom beim Menschen ist, stellt ein ideales Modell für die Demonstration der Wirksamkeit des Bioreaktors als extrakorporales Leber-Hilfsgerät dar. Die Gunn-Ratte weist einen Defekt auf, der als autosomales rezessives Merkmal in Wistar-Ratten vererbt wurde. Der in homozygoten rezessiven Tieren vorkommende Defekt liegt auf dem die UDP-Glucuronyltransferase kodierenden Gen, ein für die Konjugation und Gallenausscheidung von Bilirubin (ein Abbauprodukt von Hämoglobin in alternden roten Blutzellen) notwendiges Enzym. Eine Gunn-Ratte kann daher Bilirubin nicht konjugieren und ausscheiden und wird hyperbilirubinämisch mit Serum-Bilirubinspiegeln von etwa 5–20 mg/dl, im Vergleich zu 1 mg/dl in normalen Ratten.
Versuchsprotokoll
Ein umschlossener mehrfach koaxialer Hohlfaser-Bioreaktor wird für den Zusammenbau einer Vorrichtung verwendet, die als extrakorporales Leber-Hilfsgerät bei Gunn-Ratten wirkt. Die Lebern von heterozygoten (phänotypisch normalen) Gunn-Ratten werden perfundiert und die Zellen isoliert. Die Zellen werden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suspendiert und 10⁹ Zellen in das zweite Kompartiment des Bioreaktors eingeführt. Blut aus der Oberschenkelarterie einer Gunn-Ratte (gesamtes mittleres Blutvolumen ca. 10–12 ml) wird durch das Kompartiment 3 des Bioreaktors, das vom ringförmigen Raum für die Leberzellen durch die Wand der Hohlfaser getrennt ist, mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,5–0,8 ml/min perfundiert. Zur selben Zeit wird das Kompartiment 1 des Bioreaktors mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,5 ml/min von DMEM durchflossen. Aus dem Bioreaktor ausfließendes Blut wird zur Ratte zurückgeführt.
Die Spiegel von nicht konjugiertem und konjugiertem Bilirubin im den Bioreaktor verlassenden Blut werden über einen Zeitraum von 6 Stunden unter Verwendung der Sigma Total and Direct Bilirubin-Nachweismethode nach den von Sigma chemical Company (Sigma Procedure #522/553) gelieferten Instruktionen ermittelt.
6.4 Biosynthetische Hepatozytenfunktion in einem umschlossenen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor/BAL.
Wie in Beispiel I isolierte Leberzellen werden in einem Sucrose-Dichtegradienten mittels Zonenzentrifugation aufgetrennt. Den Parenchymzellen entsprechende Dichtefraktionen werden gesammelt und in das aseptische Kompartiment für die Zellen (Kompartiment 2) des umschlossenen mehrfach koaxialen Bioreaktors eingeführt.
Die Parenchymzellen werden bewahrt, indem warmes Ham's F-12-Nährmedium durch die Kompartimente 1 und 3 sowie 95% Luft mit 5% CO₂ durch Kompartiment 4 zirkulieren gelassen werden. Der Ausfluss aus Kompartiment 1 wird gesammelt und Fraktionen nach Parametern der biosynthetischen Leberfunktion analysiert. Die Albuminsynthese wird mit dem Enzym-gebundenen Immunadsorbens-Assay gemessen.
6.5 Biotransformatorische Funktion in einem umschlossenen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor/BAL.
Die gemäß Beispiel 1 isolierten Leberzellen werden über eine Zonenzentrifugation in Sucrose-Dichtegradienten aufgetrennt. Die den Kupffer'schen Zellen entsprechenden Dichtefraktionen wurden gesammelt und in Kompartiment 2 (Kompartiment für die Zellen) des umschlossenen mehrfach koaxialen Bioreaktors eingeführt.
Die Zellen im Bioreaktor werden bewahrt, indem DMEM (ohne Phenolrot) durch die Einlass- und Auslassöffnungen der Kompartimente 1 und 3 sowie 95% Luft mit 5% CO₂ durch die Einlassöffnung von Kompartiment 4 zirkulieren gelassen werden. Die Zellen werden im Kompartiment sich anheften gelassen und sodann freies Hämoglobin (1–10 mg/ml) in Kompartiment 1 eingeführt. Das Auftreten von Hämoglobin sowie die Stoffwechselprodukte des Hämoglobins in Kompartiment 3 werden mit einem zwischengeschalteten Spektralphotometer überwacht.
6.6 Seriell verbundener Bioreaktor mit menschlichen Zellen.
Menschliche Hepatom C3A-Zellen werden wie beschrieben (Michelson, J.K. et al., Hepatology 1995, 22, 866) kultiviert und in alle zweiten Kompartimente des seriell verbundenen Bioreaktors eingeführt. Das Nährmedium und 95% Luft mit 5% CO2 werden durch die dritten bzw. äußersten Kompartimente gepumpt und das Zellwachstum mittels Einsatz von Glucose überwacht. Wenn die Zellen die Plateau- oder stationäre Wachstumsphase erreicht haben, wird der Albumin-Output überwacht.
Das Blut eines unter Leberversagen leidenden Patienten wird mittels Plasmapherese in Plasma und Zellen aufgetrennt und das Plasma in das erste Kompartiment der ersten bioartifiziellen Leberuntereinheit gepumpt. Ein Teil des Plasmas fließt radial vom ersten Kompartiment durch das Kompartiment mit den Zellen in das dritte Kompartiment zur Bildung eines biotransformierten Ausflusses. Das Plasma verlässt das erste Kompariment der ersten Untereinheit der bioartifiziellen Leber und fließt in das dritte Kompartiment der zweiten bioartifiziellen Leberuntereinheit. Der biotransformierte Ausfluss aus dem dritten Kompartiment der ersten bioartifiziellen Leberuntereinheit fließt in das erste Kompartiment der zweiten bioartifiziellen Leberuntereinheit. Der radiale Fluss in der ersten bioartifiziellen Leberuntereinheit entgiftet einen Teil des Plasmas und der radiale Fluss in der zweiten bioartifiziellen Leberuntereinheit liefert an das Plasma Biosyntheseprodukte zur Bildung von ergänztem Plasma. In regelmäßigen Zeitabständen wird auf Lebenszeichen, Ikterus und Toxin-Blutspiegel hin überwacht. Die Fließgeschwindigkeiten von Plasma und Medium werden eingestellt, um die Biotransformation zirkulierender Toxine zu maximieren. Die Überlebensfähigkeit des Patienten wird gemessen.
6.7 Wirkung der extrazellulären Matrix auf die Differenzierung von Hepatozyten im umschlossenen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor.
Parenchymzellen werden wie oben in Beispiel IV mittels Zonenzentrifugation isoliert, in rekonstituierter Basalmatrix aus dem Engelbreth-Holm-Swarm Maussarkom suspendiert und in das Kompartiment 2 (Kompartiment für die Zellen) des umschlossenen mehrfach koaxialen Bioreaktors eingeführt. Durch Anheften an die Basalmatrix werden die Hepatozyten in einem G₀-Stadium gehalten und im normalen hepatischen Phänotyp bewahrt (Rana et al., 1994). Das hochdiffenzierte Stadium wird durch die Synthese von Albumin und von Leber-Transskriptionsfaktoren wie C/EBP charakterisiert. Die Parenchymzellen werden bewahrt, indem warmes Ham's F-12-Nährmedium durch die Kompartimente 1 und 3 sowie 95% Luft mit 5% CO₂ durch Kompartiment 4 zirkulieren gelassen werden. Der Ausfluss aus Kompartiment 1 wird gesammelt und Fraktionen nach Parametern der biosynthetischen Leberfunktion analysiert. Die Albuminsynthese wird mit dem Enzym-gebundenen Immunadsorbens-Assay gemessen.
6.8 Wachstum und Differenzierung menschlicher Hepatozyten im umschlossenen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor.
Menschliche parenchymale Hepatozyten werden nach der Methode von (Block, G.D. et al., J. Cell Biol. 1996, 132, 1133) isoliert und in Kompartiment 2 des umschlossenen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktors eingeführt. Die Parenchymzellen werden vermehrt, indem sie dem Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF/SF), dem epidermalen Wachstumsfaktor und dem transformierenden Wachstumsfaktor α in HGM-Nährmedium, das in Kompartiment 3 eingeführt wurde, und in Luft:CO₂ (19:1), das in Kompartiment 4 eingeführt wurde, ausgesetzt werden. Das Verhältnis des Transkriptionsfaktors C/EBP zu C/EBP nimmt durch dieses Verfahren ab und die Zellsynthese von Albumin nimmt ebenfalls ab. Das durch Kompartiment 3 fließende Medium ist so modifiziert, dass es in der beschriebenen Formulierung (Sanchez, A. et al., Exp. Cell Res., 1998, 242, 27) noch den transformierenden Wachstumsfaktor und den epidermalen Wachstumsfaktor enthält, um die Differenzierung der Zellen und die Synthese von Albumin zu induzieren.
6.9 Biosynthese von Hormonen und Faktoren im umschlossenen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktor.
Aseptische, zerstückelte und mit Kollagenase behandelte Nebenschilddrüsen werden wie beschrieben (Hornicek, F.L. et al., Bone Miner, 1988, 4, 157) erhalten. Die dispergierten Zellen werden in mit fötalem Kälberserum angereichertem CMRL-1415-Nährmedium suspendiert und in Kompartiment 2 des umschlossenen mehrfach koaxialen Bioreaktors eingeführt. Durch die Öffnung 4 wird eine Mischung von 95% Luft mit 5% CO₂ gepumpt. Durch die Öffnungen 1 und 3 wird warmes Medium gepumpt und der Ausfluss aus der Kammer mittels Ultrafiltration zum Sammeln des Hormons der Nebenschilddrüse, des Hypertonie-Faktors der Nebenschilddrüse und anderer Zellprodukte aufkonzentriert. Die Hormone und Faktoren werden durch Immunfällung und Chromatographie gereinigt.
6.10 Der fünf Kompartimente umfassende seriell verbundene Bioreaktor mit menschlichen Zellen.
Menschliche Hepatom C3A-Zellen wurden wie oben in Beispiel VI wachsen gelassen mit Ausnahme des dritten Kompartiments eines fünf Kompartimente umfassenden seriell verbunden Bioreaktors. Da innerste Kompartiment (Kompartiment 1) und das äußerste Kompartiment (Kompartiment 5) mit einer Gasmischung aus 95% Luft mit 5% CO₂ suffundiert. Das Nährmedium wird durch das zweite bzw. vierte Kompartiment gepumpt und das Zellwachstum durch Einsatz von Glucose überwacht. Wenn die Zellen die Plateau- oder stationäre Wachstumsphase erreicht haben, wird der Albumin-Output überwacht.
Das Blut eines unter Leberversagen leidenden Patienten wird mittels Plasmapherese in Plasma und Zellen aufgetrennt und das Plasma durch die seriell verbundenen zweiten Kompartimente des Bioreaktors gepumpt. In regelmäßigen Zeitabständen wird auf Lebenszeichen, Ikterus und Toxin-Blutspiegel hin überwacht. Die Fließgeschwindigkeiten von Plasma und Medium werden eingestellt, um die Biotransformation zirkulierender Toxine zu maximieren. Die Überlebensfähigkeit des Patienten wird gemessen.
6.11 Konstruktion des fünf Kompartimente umfassenden seriell verbunden Bioreaktors mit dicht gepackter Faseranordnung und Verwendung menschlicher Zellen.
Es werden Bioreaktor-Untereinheiten mit 300 äußersten koaxialen Fasern (3 mm Außendurchmesser) zusammengebaut, die einen Teil der Außenbegrenzung der ringförmigen Kompartimente für die Zellen bilden. Eine Hohlfaser mit 1,3 mm Außendurchmesser wird in jede der 3 mm-Fasern eingesetzt und bildet einen Teil der Innenbegrenzung des ringförmigen Kompartiments für die Zellen und einen Teil der Außenbegrenzung des Kompartiments 2. Eine Hohlfaser mit Mikrobohrung (300 um Außendurchmesser) wird in jede der 1,3 mm-Fasern als das innerste Kompartiment eines jeden koaxialen Fasermoduls eingeführt und ein anderer Satz von 300 Mikrofasern wird parallel und benachbart zu den koaxialen Modulen angeordnet. Beide Sätze von Mikrofasern transportieren Belüftungsgas zur Oxygenierung des Plasmas und des Mediums. Das äußerste Kompartiment ist das Kompartiment 4 und wird von der Außenseite der äußersten koaxialen Fasern (3 mm Außendurchmesser), der Außenseite der den koaxialen Modulen benachbarten Mikrofasern und der Innenseite des Gehäuses gebildet.
Der seriell verbundene Bioreaktor und die Anschlussschläuche und – verbindungen werden sterilisiert.
Menschliche Hepatozyten werden wie in Beispiel VIII isoliert und in die ringförmigen Kompartimente für die Zellen (Kompartimente 3) von jeder der beiden Bioreaktor-Untereinheiten eingeführt. Die Hepatozyten werden vermehrt, indem sie wie in Beispiel VIII Nährmedium und Wachstumsfaktoren ausgesetzt werden bis die Zelldichte für die Behandlung eines Patienten mit Leberversagen ausreichend ist. Die Bioreaktor-Untereinheiten zusammen mit lebensfähigen Leberzellen werden nun als BAL-Untereinheiten bezeichnet.
Wird der Bioreaktor für den Zusammenbau einer Vorrichtung zur Behandlung eines Patienten eingesetzt, tritt Plasma durch die erste Einlassöffnung für Plasma in das Kompartiment 2 der ersten BAL-Untereinheit ein, das Medium tritt durch die erste Einlassöffnung für Medium in Kompartiment 4 der ersten BAL-Untereinheit ein und das Gas tritt durch die erste Einlassöffnung für Gas in die erste BAL-Untereinheit ein. Der radiale Fluss in der ersten Untereinheit wird von einem Druckgradienten über die Fasern hervorgerufen, so dass der hydraulische Druck im Kompartiment für das Plasma höher ist als der Druck in den Kompartimenten für die Zellen oder das Medium. Als Folge davon fließt ein Teil des Plasmas von Kompartiment 2 durch das ringförmige Kompartiment für die Zellen in das Kompartiment 4. In diesem Verfahren können die Leberzellen im Kompartiment für die Zellen das durch das Kompartiment für die Zellen hindurch tretende Plasma entgiften. Wenn das entgiftete Plasma in das Kompartiment 4 fließt, wird das Medium mit einer entgifteten Plasmakomponente modifiziert. Das verbleibende Plasma tritt dann durch die erste Ausgangsöffnung für Plasma aus der ersten BAL-Untereinheit aus, das Medium tritt durch die Ausgangsöffnung für das erste Kompartiment 4 aus der ersten BAL-Untereinheit aus und das Gas tritt durch die erste Ausgangsöffnung für Gas aus der ersten BAL-Untereinheit aus. Das Flussschema wird sodann auf die zweite Untereinheit umgestellt, so dass die von der Ausgangsöffnung für das erste Kompartiment 4 kommende Flüssigkeit (entgiftetes Plasma enthaltendes Medium) in die zweite BAL-Untereinheit durch die Eingangsöffnung für das zweite Kompartiment 2 eintritt. Auf ähnliche Weise tritt das aus der Auslassöffnung des ersten Kompartiments 2 kommende Plasma durch die Eingangsöffnung für das zweite Kompartiment 4 in die zweite BAL-Untereinheit ein und das Gas tritt in die zweite BAL-Untereinheit durch die zweite Einlassöffnung für Gas ein. Ein Teil des Mediums fließt radial von der Einlassöffnung des Kompartiments durch die ringförmige Zellschicht in das zweite Kompartiment 4. Die Leberzellen fügen Proteine und andere Biosyntheseprodukte dem durch das Kompartiment für die Zellen in Untereinheit 2 fließenden Medium hinzu. Wenn dieses angereicherte Medium in das verbleibende Plasma fließt, ist das resultierende modifizierte Plasma teils entgiftet und teils mit Biosyntheseprodukten angereichert. Das verbleibende Medium tritt dann durch die Ausgangsöffnung des zweiten Kompartiments 2 aus der zweiten BAL-Untereinheit aus, das modifizierte Plasma tritt durch die Ausgangsöffnung des zweiten Kompartiments 4 aus der zweiten BAL-Untereinheit aus und das Gas tritt aus der zweiten BAL-Untereinheit durch die zweite Auslassöffnung für Gas aus. Das aus dem zweiten Kompartiment 4 ausfließende modifizierte Plasma wird zu einem Mittel zur Rückführung an den Patienten geleitet, um dessen Leben aufrecht zu erhalten.
6.12 Herstellung eines umschlossenen mehrfach koaxialen Hohlfaser-Bioreaktors.
Es wird eine Apparatur zum Zusammenbau eines Bioreaktors verwendet, in welchem ein notwendigerweise an eine Unterdruckquelle angeschlossener Vakuumkopf ein Bündel Hohlfasern gegen ein Gitter hält, um kleinere Fasern schneller einführen zu können. Das entgegengesetzte Ende der Hohlfasern wird in einen Verteiler eingesetzt und in ein Gefäß gelegt. Es wird ein Polyurethan-Epoxy-Harz verwendet, um die Hohlfasern an den Verteiler zu binden und der zusammengesetzte Verteiler, das Epoxy und die Hohlfasern werden einer Zentrifugalkraft ausgesetzt, um Epoxy aus dem Innern der Fasern zu entfernen. Nach dem Aushärten werden die freien Enden der Hohlfasern mit einer Säge zurechtgeschnitten. Der Vorgang wird zum Einsetzen des nächst kleineren Satzes von Hohlfasern wiederholt, indem ein Vakuum angelegt wird und die Enden mit dem nächsten Verteiler verklebt, zentrifugiert und zurechtgeschnitten werden.

Claims

Bioreaktor, umfassend: (a) ein Gehäuse mit einer Innenseite, umfassend: ein in dem Gehäuse integrales Mittel zur Gaseinführung und ein in dem Gehäuse integrales Mittel zur Gasausströmung, (b) eine Anordnung einer Vielzahl Hohlfasermodule, die sich in dem Gehäuse befindet, wobei jedes Modul umfasst: (i) eine Vielzahl koaxialer Hohlfasern, wobei jede eine Innenseite und eine Außenseite besitzt, einschließlich einer innersten Hohlfaser und einer äußersten Hohlfaser, (ii) eine Vielzahl Kompartimente, umfassend: ein erstes Kompartiment, das durch die Innenseite der innersten Hohlfaser definiert ist, und (iii) mindestens ein zusätzliches Kompartiment, das durch einen jeweiligen annularen Zwischenabstand zwischen benachbarten Fasern der Vielzahl koaxialer Hohlfasern definiert ist, und (c) ein äußerstes Kompartiment, das durch einen Zwischenraum innerhalb der Innenseite des Gehäuses definiert ist, welcher nicht durch die Vielzahl Module eingenommen wird, und (d) wobei das erste Kompartiment, das mindestens eine zusätzliche Kompartiment und das äußerste Kompartiment jedes weiterhin mindestens eine Einlassöffnung und mindestens eine Auslassöffnung umfassen, und (e) wobei das Gehäuse weiterhin umfasst: (i) mindestens einen Einlassverteiler und mindestens einen Auslassverteiler für das erste Kompartiment, und (ii) mindestens einen Einlassverteiler und mindestens einen Auslassverteiler für jedes zusätzliche Kompartiment.
Bioreaktor nach Anspruch 1, worin die Hohlfasern semipermeabel sind.
Bioreaktor nach Anspruch 2, worin die Hohlfasern ein Material umfassen, das ausgewählt ist aus Polysulfon, Polypropylen, Nylon, Polyester, Polytetrafluorethylen, Zelluloseacetat und den gemischten Estern von Zellulose.
Bioreaktor nach Anspruch 1, wobei der Bioreaktor weiterhin mindestens 10⁹ Zellen umfasst.
Bioreaktor nach Anspruch 4, worin die Zellen Leberzellen sind.
Bioreaktor nach Anspruch 5, worin die Leberzellen ausgewählt sind aus Schweineleberzellen und menschlichen Leberzellen.
Bioreaktor nach Anspruch 1, worin der mindestens eine Verteiler weiterhin einen Strömungsverteiler umfasst.
Bioreaktor nach Anspruch 7, worin mindestens ein Kompartiment weiterhin eine extrazelluläre Matrix umfasst.
Bioreaktor nach Anspruch 1, worin mindestens ein annularer Zwischenabstand etwa 0,2 mm bis etwa 0,8 mm beträgt.
Bioreaktor nach Anspruch 1, wobei der Bioreaktor sterilisiert ist mit einem Mittel, das ausgewählt ist aus einem Autoklaven, Ethylenoxid und Gammastrahlung.
Bioreaktor nach Anspruch 1, worin die innerste Hohlfaser eine Länge von etwa 2 cm bis etwa 50 cm besitzt.
Bioreaktor nach Anspruch 1, worin das Gehäuse ein erstes Ende und ein zweites Ende besitzt und worin jede Einlassöffnung und jede Auslassöffnung sich an dem ersten Ende des Gehäuses befinden.
Bioreaktor nach Anspruch 1, weiterhin umfassend: Mikrofasern, die im wesentlichen parallel zu den Hohlfasermodulen sind.
Bioreaktor nach Anspruch 13, worin die Mikrofasern weiterhin mindestens eine Belüftungseinlassöffnung und mindestens eine Belüftungsauslassöffnung umfassen.
Bioreaktor nach Anspruch 1, worin mindestens eine koaxiale Hohlfaser mit Perfluorkohlenstoff getränkt ist.
Bioreaktor nach Anspruch 1, worin mindestens eine koaxiale Hohlfaser eine Porengröße von weniger als 1 × 10^–6 m besitzt.
Bioreaktor nach Anspruch 1, worin mindestens eine koaxiale Hohlfaser eine Porengröße von weniger als 0,1 × 10^–6 m besitzt.
Bioreaktor nach Anspruch 1, worin mindestens eine koaxiale Hohlfaser eine Porengröße von weniger als 0,05 × 10^–6 m besitzt.
Bioreaktor nach Anspruch 1, worin mindestens ein Kompartiment weiterhin Zellen umfasst, die mit einer extrazellulären Matrix gemischt sind.
Verwendung des Bioreaktors nach Anspruch 1 zum Aufbau einer Vorrichtung zur Zuführung von Zellbiosyntheseprodukten an einen Patienten, der diese benötigt, und welche umfasst: Mittel zum Pumpen intravenöser Zufuhrlösung durch ein Kompartiment des Bioreaktors, Mittel zum Sammeln des Ausstoßes und Mittel zur intravenösen Zuführung des Ausstoßes an den Patienten.
Seriell verknüpfter Bioreaktor, umfassend eine Vielzahl von Bioreaktoruntereinheiten, wobei jede Bioreaktoruntereinheit umfasst: (a) ein Gehäuse mit einer Innenseite, umfassend: ein in dem Gehäuse integrales Mittel zur Gaseinführung und ein in dem Gehäuse integrales Mittel zur Gasausströmung, (b) eine Anordnung einer Vielzahl Hohlfasermodule, die sich in dem Gehäuse befindet, wobei jedes Modul umfasst: (i) eine Vielzahl koaxialer Hohlfasern, wobei jede Faser eine Innenseite und eine Außenseite besitzt, einschließlich einer innersten Hohlfaser und einer äußersten Hohlfaser, (ii) eine Vielzahl Kompartimente, umfassend: ein erstes Kompartiment, das durch die Innenseite der innersten Hohlfaser definiert ist, und mindestens ein zusätzliches Kompartiment, das durch einen jeweiligen annularen Zwischenabstand zwischen benachbarten Fasern der Vielzahl koaxialer Hohlfasern definiert ist, und (c) ein äußerstes Kompartiment, das durch einen Zwischenraum innerhalb der Innenseite des Gehäuses definiert ist, welcher nicht durch die Vielzahl Module eingenommen wird, und (d) wobei das erste Kompartiment, das mindestens eine zusätzliche Kompartiment und das äußerste Kompartiment jedes weiterhin mindestens eine Einlassöffnung und mindestens eine Auslassöffnung umfassen, und (e) wobei das Gehäuse weiterhin umfasst: (i) mindestens einen Einlassverteiler und mindestens einen Auslassverteiler für das erste Kompartiment, und (ii) mindestens einen Einlassverteiler und mindestens einen Auslassverteiler für jedes zusätzliche Kompartiment, und (f) mindestens ein Kompartiment von einer Bioreaktoruntereinheit, das seriell mit mindestens einem Kompartiment von mindestens einer anderen Bioreaktoruntereinheit verknüpft ist.
Bioreaktor nach Anspruch 21, worin jede Bioreaktoruntereinheit weiterhin mindestens 10⁹ Zellen umfasst.
Bioreaktor nach Anspruch 22, worin die Zellen Leberzellen sind.
Bioreaktor nach Anspruch 23, worin die Zellen ausgewählt sind aus menschlichen Leberzellen und Schweineleberzellen.
Bioreaktor nach Anspruch 22, worin mindestens ein Kompartiment von jeder Bioreaktoruntereinheit weiterhin eine extrazelluläre Matrix umfasst.
Verwendung des seriell verknüpften Bioreaktors aus Anspruch 21 zum Aufbau einer Vorrichtung zur Bereitstellung ergänzter Plasmaprodukte für einen Patienten, der diese benötigt, umfassend: (a) Mittel zur Einführung von Plasma eines Patienten in eine Bioreaktoruntereinheit des seriell verknüpften Bioreaktors aus Anspruch 21, (b) Mittel, die mindestens einen Teil des Plasmas in einen radialen Fluss durch ein Zellkompartiment der Bioreaktoruntereinheit zwingen, um einen biotransformierten Ausfluss zu bilden, (c) Mittel zur Einführung des biotransformierten Ausflusses in eine zweite Bioreaktoruntereinheit des Bioreaktors aus Anspruch 21, (d) Mittel, die mindestens einen Teil des biotransformierten Ausflusses in einen radialen Fluss durch ein Zellkompartiment der zweiten Bioreaktoruntereinheit zwingen, um ergänztes Plasma zu bilden, und (e) Mittel zur Rückführung des ergänzten Plasmas in das Kreislaufsystem des Patienten.
Multi-koaxialer Hohlfaser-Bioreaktor, umfassend: (a) ein Gehäuse, das eine Innenseite umfasst, und (b) ein Modul von Hohlfasern, umfassend: mindestens drei koaxiale semipermeable Hohlfasern, einschließlich einer innersten Faser mit einer Innenseite, wobei die Innenseite ein erstes Kompartiment definiert, das mindestens eine innerste Einlassöffnung und mindestens eine innerste Auslassöffnung umfasst, eine Vielzahl Kompartimente, wobei jedes Kompartiment durch einen jeweiligen annularen Zwischenraum zwischen benachbarten Fasern der mindestens drei Hohlfasern definiert ist, einschließlich mindestens einer äußeren Einlassöffnung und mindestens einer äußeren Auslassöffnung, wobei jedes Kompartiment ein Mittel zur Fließverbindung zwischen dem jeweiligen annularen Zwischenraum, der jeweiligen äußeren Einlassöffnung und der jeweiligen äußeren Auslassöffnung umfasst und worin einer der annularen Zwischenräume eukaryotische Zellen enthält, und (c) ein äußerstes Kompartiment, das durch einen Zwischenraum zwischen der Außenseite der äußersten Faser der mindestens drei Hohlfasern und der Innenseite des Gehäuses definiert ist und mindestens eine äußerste Einlassöffnung und mindestens eine äußerste Auslassöffnung umfasst, (d) wobei das Gehäuse mindestens einen Einlassverteiler und mindestens einen Auslassverteiter für jedes der Kompartimente umfasst, und (e) worin mindestens eines der Kompartimente eukaryotische Zellen enthält.
Verwendung des Bioreaktors nach Anspruch 27 zum Aufbau einer Vorrichtung für die Zellkultur, umfassend: Mittel zur Einführung lebensfähiger Zellen in ein Kompartiment des Bioreaktors und Mittel zur Durchleitung von Nahrungsmittelmedium durch koaxiale benachbarte Hohlfasern.