DE3920043C2

DE3920043C2 - Fluorescence microscope

Info

Publication number: DE3920043C2
Application number: DE19893920043
Authority: DE
Inventors: Walter Geis; Klaus Boettger
Original assignee: Carl Zeiss SMT GmbH; Carl Zeiss AG
Current assignee: Carl Zeiss SMT GmbH; Carl Zeiss AG
Priority date: 1989-06-20
Filing date: 1989-06-20
Publication date: 2000-09-21
Anticipated expiration: 2009-06-21
Also published as: DE3920043A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop mit einem Interferenz-Sperrfilter im Beobachtungsstrahlengang gemäß dem Oberbegriff des Anspruches 1. Ein derartiges Fluoreszenzmikroskop ist aus der DE 23 34 724 B2 bekannt.The invention relates to a fluorescence microscope with an interference filter in the Observation beam path according to the preamble of claim 1. Such Fluorescence microscope is known from DE 23 34 724 B2.

Fluoreszenzmikroskope sind in der Regel so aufgebaut, daß im Beleuchtungsstrahlengang ein Erregerfilter angeordnet ist, welches die für die Anregung des Präparats erforderliche Wellenlänge aus dem Spektrum der verwendeten Lichtquelle ausfiltert. In Auflichtmikroskopen folgt auf das Erregerfilter ein Farbteiler, d. h. ein dichroitischer Spiegel, der die Anregungsstrahlung in den Beobachtungsstrahlengang verlustfrei einkoppelt und die vom Präparat emittierte, längerwellige Fluoreszenzstrahlung ungehindert passieren läßt. Weiterhin ist im Beobachtungsstrahlengang zwischen dem Farbteiler und dem Tubus ein Sperrfilter angeordnet, das noch vorhandene Anteile der Anregungsstrahlung und zum Teil auch bestimmte Spektralbereiche der Fluoreszenzemission unterdrückt. Eine Übersicht über die gebräuchlichsten Fluoreszenzverfahren und dafür geeigente Ausrüstungen gibt die Firmenschrift K 41-005-d Druckvermerk CM-H-III/85 der Anmelderin mit dem Titel "Was man von der Fluoreszenz-Mikroskopie wissen sollte". Neben den dort angeführten Methoden gewinnen neue Fluoreszenztechniken mit Farbstoffemissionen im langwelligen Spektralgebiet zunehmend an Bedeutung.Fluorescence microscopes are usually constructed in such a way that one in the illumination beam path Exciter filter is arranged, which is necessary for the excitation of the preparation Filtered out wavelength from the spectrum of the light source used. In Incident light microscopes are followed by a color splitter on the excitation filter. H. a dichroic mirror, which couples the excitation radiation into the observation beam path without loss and the longer-wave fluorescence radiation emitted by the preparation can pass unhindered. Furthermore, there is an between the color splitter and the tube in the observation beam path Blocking filter arranged, the remaining portions of the excitation radiation and in part also suppresses certain spectral ranges of the fluorescence emission. An overview of the most common fluorescence methods and the appropriate equipment are available Company name K 41-005-e printed note CM-H-III / 85 by the applicant with the title "Was one should know about fluorescence microscopy ". In addition to the methods listed there gain new fluorescence techniques with dye emissions in the long-wave spectral range increasingly important.

Als Anregungs- und Sperrfilter werden in größerem Umfang Interferenzfilter verwendet, da diese sich durch eine große Kantensteilheit auszeichnen und deshalb Anregungs- und Fluoreszenzstrahlung scharf trennen. Weiterhin geht der Trend dahin, aus Gründen der Präparatschonung sowie möglichst geringer Autofluoreszenz des Untergrundes Fluoreszenzfarbstoffe zu verwenden, deren Anregung und Emission im längerwelligen Teil des sichtbaren Spektralbereiches bzw. im nahen Infrarot liegen. Interference filters are used to a large extent as excitation and blocking filters, since these are characterized by a large edge steepness and therefore excitation and Separate fluorescent radiation sharply. The trend continues for reasons of Protection of the preparation and the lowest possible autofluorescence of the substrate To use fluorescent dyes, their excitation and emission in the longer-wave part of the visible spectral range or in the near infrared.

Verwendet man nun ein Interferenzsperrfilter, das beispielsweise als Langpaßfilter ausgebildet ist und dessen Absorptionskante im langwelligen sichbaren Spektralbereich liegt, so tritt folgender störender Effekt auf:If an interference blocking filter is used, which is designed, for example, as a long-pass filter and whose absorption edge lies in the long-wave visible spectral range, occurs the following disruptive effect on:

Licht, das direkt in die Okulare des Mikroskops oder durch Reflexion am Auge des Beobachters in die Okulare einfällt, wird von dem Sperrfilter im Beobachtungsstrahlengang an dessen Rückseite praktisch total reflektiert und überlagert im Sehfeld das in der Regel ohnehin schwache Fluoreszenzlicht. Der Untergrund des Sehfeldes, der im Idealfalle völlig schwarz sein sollte, wird hierdurch in äußerst störender Weise aufgehellt. Entsprechend ist der Kontrast des beispielsweise mittels einer Kamera aufgenommenen Fluoreszenzbildes nicht optimal.Light that shines directly into the eyepiece of the microscope or through reflection at the eye of the Observer falls into the eyepieces, is blocked by the blocking filter in the observation beam path on the back practically totally reflected and usually superimposed on the field of view weak fluorescent light anyway. The underground of the field of view, which in the ideal case completely should be black, is brightened in an extremely disturbing manner. The is accordingly Contrast of the fluorescence image recorded, for example, by means of a camera is not optimal.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese störende Aufhellung des Bildfeldes zu vermeiden, bzw. in die Okulare des Mikroskops einfallendes Falschlicht wirkungsvoll zu unterdrücken.The present invention has for its object this annoying brightening Avoid image field, or false light entering the microscope eyepieces to suppress effectively.

Diese Aufgabe wird durch ein Fluoreszenzmikroskop mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst.This object is achieved by a fluorescence microscope with the features of claim 1 solved.

Infolge der Kombination eines Interferenzfilters im Beobachtungsstrahlengang mit einem zusätzlichen Absorptionsfilter wird das durch die Okulare einfallende Falschlicht wirkungsvoll unterdrückt. Auf die nachzuweisende Fluoreszenzstrahlung hat dieses zusätzliche Filter keine nachteilige Wirkung, wenn die Kantenlagen der beiden Filter so aufeinander abgestimmt sind, daß die Kantenlage des absorbierenden Filters etwas kurzwelliger als die des Interferenz filters ist.As a result of the combination of an interference filter in the observation beam path with one the false light entering through the eyepieces becomes an additional absorption filter effectively suppressed. This has to do with the fluorescence radiation to be detected additional filters have no adverse effect if the edges of the two filters are like this are coordinated that the edge position of the absorbent filter somewhat shortwave than that of interference filters is.

Zwar ist aus der US 39 47 092 ein Fluoreszenzmikroskop bekannt, dessen dichroitischer Teilerspiegel aus zwei verschiedenen Filtertypen, einem Farbglas und einem Interferenzfilter zusammengesetzt ist. Dort dient das Farbglas jedoch dazu, das Reflexionsband des Interferenzfilters einzuschränken. Das Problem von in die Okulare einfallendem Falschlicht ist dort nicht angesprochen und läßt sich mit einem objektivseitig vor dem Teilerspiegel angeordneten Farbglas auch nicht lösen.US 39 47 092 is a fluorescence microscope known, whose dichroic divider consists of two different filter types, a colored glass and a Interference filter is composed. That serves there Colored glass, however, the reflection band of the Restrict interference filter. The problem of in the Eyepieces of incident false light are not addressed there and can be placed on the lens side in front of the divider mirror do not loosen the colored glass.

Zweckmäßig besitzt das absorbierende Filter die Eigenschaften eines Langpaßfilters, welches das Falschlicht im gesamten sichtbaren Spektralbereich auf der kürzerwelligen Seite der Fluoreszenzstrahlung unterdrückt. Der gleiche Effekt läßt sich aber auch durch ein Bandpaßfilter erreichen, das hinsichtlich seiner Transmission auf den Wellenlängenbereich der Fluoreszenzstrahlung abgestimmt ist.The absorbent filter expediently has the properties a long pass filter, which the false light in the whole visible spectral range on the shorter-wave side of the Fluorescence radiation suppressed. The same effect leaves but can also be achieved through a bandpass filter with regard to its transmission on the wavelength range the fluorescence radiation is matched.

Als absorbierendes Filter ist vorteilhaft ein Farbglas oder eine Filterfolie verwendet. Es ist jedoch auch möglich, eine Küvette mit einer absorbierenden Lösung für diesen Zweck einzusetzen.A colored glass or is advantageous as an absorbing filter used a filter film. However, it is also possible to use one Cell with an absorbent solution for this purpose to use.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Absorptionsfilter und das Interferenzfilter zu einer Baueinheit zusammengefaßt sind. Dies läßt sich entweder dadurch erreichen, daß die beiden Filter miteinander verkittet werden, oder die Interferenzschichten direkt auf das Farbglas aufgedampft werden. Die Filterkombination kann dann ohne weiteres in dem betreffenden Filterschieber des Mikroskops untergebracht werden.It when the absorption filter and the interference filter combined into one unit are. This can be achieved either by the fact that two filters are cemented together, or the Interference layers are deposited directly onto the colored glass become. The filter combination can then easily in the concerned filter slide of the microscope become.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispiels anhand der Fig. 1-4 der beigefügten Zeichnungen. Further advantages result from the following description of an embodiment with reference to FIGS. 1-4 of the accompanying drawings.

Fig. 1 ist eine Prinzipskizze, in der die wesentlichen Komponenten im Auflichtstrahlengang eines Fluoreszenzmikroskops dargestellt sind; Fig. 1 is a schematic diagram in which the essential components in the reflected light path of a fluorescence microscope are shown;

Fig. 2 ist eine vereinfachte Prinzipskizze des Strahlverlaufs im Mikroskop nach Fig. 1; FIG. 2 is a simplified schematic diagram of the beam path in the microscope according to FIG. 1;

Fig. 3 zeigt das anstelle des Sperrfilters (7) im Mikroskop nach Fig. 1 bzw. Fig. 2 einzusetzende Sperrfilter gemäß der Erfindung; FIG. 3 shows the blocking filter to be used instead of the blocking filter ( 7 ) in the microscope according to FIG. 1 or FIG. 2 according to the invention;

Fig. 4 ist ein Diagramm, in dem die Kennlinien des Filters aus Fig. 3 zusammen mit dem Absorptions- und Emissionsspektrum eines Präparats beispielhaft dargestellt sind. FIG. 4 is a diagram in which the characteristic curves of the filter from FIG. 3 together with the absorption and emission spectrum of a preparation are exemplified.

Von dem in Fig. 1 dargestellten Mikroskop ist der Ein fachheit halber nur der Auflichtbeleuchtungsstrahlengang sowie der Beobachtungsstrahlengang skizziert. Das zu unter suchende Objekt (2) befindet sich auf dem am Stativ (1) des Mikroskop befestigten Präparattisch (14). Die Erreger strahlung wird von einer nicht dargestellten Lichtquelle ausgehend über den mit (4) bezeichneten Auflicht- Beleuchtungsstrahlengang geführt. Ein Anregungsfilter (6) filtert den für die Erregung des Präparats gewünschten Spektralbereich aus der Anregungsstrahlung aus. Auf das filter (6) folgt ein dichroitischer Teilerspiegel (5), über den die Anregungsstrahlung in den Beobachtungsstrahlengang eingekoppelt wird, und ein Objektiv (13) am Revolver (3) des Mikroskops, das die Anregungsstrahlung auf das Präparat (2) fokussiert.For the sake of simplicity, the microscope shown in FIG. 1 shows only the incident light beam path and the observation beam path. The object ( 2 ) to be examined is located on the preparation table ( 14 ) attached to the stand ( 1 ) of the microscope. The excitation radiation is led from a light source, not shown, via the incident light illumination beam path denoted by ( 4 ). An excitation filter ( 6 ) filters out the spectral range desired for excitation of the specimen from the excitation radiation. The filter ( 6 ) is followed by a dichroic splitter mirror ( 5 ), via which the excitation radiation is coupled into the observation beam path, and an objective ( 13 ) on the revolver ( 3 ) of the microscope, which focuses the excitation radiation on the specimen ( 2 ).

Im Beobachtungsstrahlengang ist oberhalb des Teilerspiegels (5) ein Sperrfilter (7) angeordnet. Auf das Sperrfilter (7) folgt ein Tellerprisma (8), das den Beobachtungsstrahlengang einmal in den Okulartubus (11) und zum anderen in den Photo tubus (9) mit der daran angesetzten Kamera (10) aufteilt. Eines der beiden Okulare des Okulartubus (11) ist mit (12) bezeichnet.A blocking filter ( 7 ) is arranged in the observation beam path above the divider mirror ( 5 ). A blocking prism ( 8 ) follows the blocking filter ( 7 ) and divides the observation beam path into the eyepiece tube ( 11 ) and into the photo tube ( 9 ) with the attached camera ( 10 ). One of the two eyepieces of the eyepiece tube ( 11 ) is labeled ( 12 ).

Die Durchlaßcharakteristik des Anregungsfilters (6) ist in der Darstellung nach Fig. 4 durch die mit IA bezeichnete Kurve repräsentiert. Sie deckt sich im wesentlichen mit der Absorptionscharakteristik A des Fluoreszenz-Farbstoffes. Ent sprechend wird vom Filter (6) nur Strahlung in diesem Wellen längenbereich durchgelassen. Dies ist in Fig. 2 durch den Strahl mit kleinerem Durchmesser ausgedrückt, der durch das Filter (6) hindurchtritt und am Teilerspiegel (5) in Richtung auf das Objektiv reflektiert wird.The pass characteristic of the excitation filter ( 6 ) is represented in the illustration according to FIG. 4 by the curve labeled IA. It essentially coincides with the absorption characteristic A of the fluorescent dye. Accordingly, only radiation in this wavelength range is let through by the filter ( 6 ). This is expressed in Fig. 2 by the beam with a smaller diameter, which passes through the filter ( 6 ) and is reflected on the divider mirror ( 5 ) in the direction of the lens.

Neben der vom Präparat ausgehenden Fluoreszenzstrahlung ge langt jedoch auch noch ein Teil der Anregungsstrahlung sowie Autofluoreszenz des Untergrundes in den Beobachtungsstrahlen gang und wird nicht vollständig durch den Teilerspiegel (5) zurückreflektiert. Zur Unterdrückung dieses restlichen An regungslichtes dient das Filter (7) mit der in Fig. 4 als IF bezeichneten Transmissionscharakteristik. Dieses Filter (7) ist ein Interferenzfilter und hat die spektralen Eigen schaften eines Langpaß- oder Bandpaßfilters, indem es den Spektralbereich der mit E bezeichneten Fluoreszenzemission des Präparats zwar ungehindert passieren läßt, alle kürzer welligen Strahlanteile, insbesondere also das restliche An regungslicht reflektiert. Der bisher beschriebene Aufbau des Fluoreszenzmikroskops ist an sich bekannt.In addition to the fluorescent radiation emanating from the preparation, however, some of the excitation radiation and autofluorescence of the background reach the observation beams and are not completely reflected back by the divider mirror ( 5 ). To suppress this remaining excitation light, the filter ( 7 ) with the transmission characteristic designated as IF in FIG. 4 is used. This filter ( 7 ) is an interference filter and has the spectral properties of a long-pass or band-pass filter by allowing the spectral range of the fluorescence emission denoted by E to pass unhindered, reflecting all shorter wavy beam components, in particular the rest of the excitation light. The structure of the fluorescence microscope described so far is known per se.

In Fig. 2 ist auch vereinfacht skizziert, wie das durch die Okulare einfallende Falschlicht FL über das Teilerprisma (8) auf die Rückseite des Interferenzfilters (7) hin umge lenkt wird. Auch dieses Licht aus dem sichtbaren Spektralbe reich wird nun von dem Interferenzfilter (7) entsprechend seiner Filtercharakteristik IF reflektiert und gelangt rückwärts zurück in den Okularstrahlengang und in den Photo tubus, wo es die Fluoreszenzstrahlung überlagert und den Kontrast mindert.In Fig. 2 is also outlined in a simplified manner how the false light FL incident through the eyepieces is deflected via the divider prism ( 8 ) to the rear of the interference filter ( 7 ). This light from the visible spectral range is now reflected by the interference filter ( 7 ) according to its filter characteristic IF and goes backwards into the eyepiece beam path and into the photo tube, where it overlays the fluorescent radiation and reduces the contrast.

Dem wird gemäß der Erfindung folgendermaßen begegnet:This is countered according to the invention as follows:

Anstelle des einfachen Interferenzfiltes (7) ist das in Fig. 3 gezeigte kombinierte Filter (17) in den Beobachtungs strahlengang des Mikroskops eingesetzt. Dieses Filter (17) besteht aus einem transparenten Träger (19) aus Glas, auf den neben den Interferenzschichten (20) ein absorbierendes Farb filter (18) auf der den Okularen zugewandten Seite aufge bracht ist, das zusätzlich außen noch mit einer (nicht darge stellten) Entspiegelungsschicht versehen sein kann. Dieses Filter (18) besitzt die in Fig. 4 mit FG bezeichnete Charakteristik eines Kantenfilters. Im Vergleich zudem aus den Schichten (20) bestehenden Interferenzfilter ist die Absorptionskante der Farbschicht (18) etwas zum kürzer welligen hin verschoben, so daß die nachzuweisende Fluoreszenzstrahlung durch das Absorptionsfilter nicht ge schwächt wird. Die Kantensteilheit des Farbfilters ist üblicherweise geringer als die Steilheit des Interferenz filters.Instead of the simple interference filter ( 7 ), the combined filter ( 17 ) shown in FIG. 3 is inserted into the observation beam path of the microscope. This filter ( 17 ) consists of a transparent support ( 19 ) made of glass, on which in addition to the interference layers ( 20 ) an absorbing color filter ( 18 ) is brought up on the side facing the eyepieces, which is additionally outside with a (not Darge provided) anti-reflective layer can be provided. This filter ( 18 ) has the characteristic of an edge filter designated FG in FIG. 4. In comparison also consisting of the layers ( 20 ) interference filter, the absorption edge of the color layer ( 18 ) is slightly shifted towards the shorter wavy, so that the fluorescent radiation to be detected is not weakened by the absorption filter. The edge steepness of the color filter is usually less than the steepness of the interference filter.

Nach Durchführung der beschriebenen Maßnahme wird das durch die Okulare einfallendes Falschlicht beim Auffallen auf die Rückseite des Sperrfilters in der Absorptionsschicht (18) vollständig absorbiert. Das Falschlicht wird somit wirkungsvoll vom Sehfeld in den Okularen und von der Bildebene der angesetzten Kamera (10) des Mikroskops ferngehalten.After the measure described has been carried out, the false light incident through the eyepieces is completely absorbed in the absorption layer ( 18 ) when it strikes the rear side of the blocking filter. The false light is thus effectively kept away from the field of view in the eyepieces and from the image plane of the attached camera ( 10 ) of the microscope.

In einem konkreten Beispiel wurden für das zusammengesetzte Sperrfilter (17) ein Interferenzfilter mit der Bezeichnung LP 590 und ein Farbglasfilter mit der Bezeichnung OG 570 (Fa. Schott, Mainz) miteinander kombiniert, um die Fluoreszenz strahlung von Rhodamin bei einer Wellenlänge von 590 nm bis ca. 650 nm gegen die Anregungsstrahlung bei einer Wellenlänge von 546 nm zu diskriminieren und gleichzeitig das von den Okularen einfallende Außenlicht (Falschlicht) zu absorbieren.In a specific example, an interference filter with the designation LP 590 and a colored glass filter with the designation OG 570 (from Schott, Mainz) were combined with one another for the composite blocking filter ( 17 ) in order to reduce the fluorescence radiation of rhodamine at a wavelength of 590 nm Discriminate approx. 650 nm against the excitation radiation at a wavelength of 546 nm and at the same time absorb the external light (false light) from the eyepieces.

Claims

1. fluorescence microscope,

with a beam path for excitation of a sample ( 2 ) for the emission of fluorescent radiation,
- With an objective ( 13 ) which feeds the light coming from the sample ( 2 ) to two eyepieces ( 12 )
and with an interference blocking filter ( 7 ) which is arranged between the objective ( 13 ) and the eyepieces ( 12 ) and which blocks the wavelength range (IA) of the excitation radiation and shorter wavelengths, characterized in that
- That an absorption filter ( 18 ) is provided on the side of the interference-blocking filter ( 7 ) facing the eyepieces ( 12 ), which transmits the wavelength range (E) of the fluorescent radiation and absorbs the shorter-wave range relative thereto
- And thus stray light that falls through the eyepieces ( 12 ) through the back of the interference filter ( 7 ) weakens in this shorter-wave range.

2. Fluorescence microscope according to claim 1, characterized in that the absorption filter ( 18 ) is designed as an edge filter with an edge position directly on the shorter-wave side of the fluorescent radiation.

3. Fluorescence microscope according to claim 1, characterized in that the interference blocking filter ( 7 ) is designed as a long-pass filter or as a band-pass filter.

4. Fluorescence microscope according to claim 1, characterized in that the absorption filter ( 18 ) together with the interference cut filter ( 7 ) is combined to form a structural unit.

5. Fluorescence microscope according to one of claims 1 to 4, characterized in that the absorption filter ( 18 ) is alternatively designed as a colored glass or as a filter film or as a cuvette with an absorbent solution.