DE3721400A1

DE3721400A1 - METHOD FOR THE EXAMINATION OF A CELLULAR BIOLOGICAL LIQUID ON CELLULAR ONCOGEN DNA OR THEIR FRAGMENTS

Info

Publication number: DE3721400A1
Application number: DE19873721400
Authority: DE
Inventors: Viktor Dr Dr Med Balazs; Margit Dr Rer Balazs-Froehlich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-06-29
Filing date: 1987-06-29
Publication date: 1989-01-12
Also published as: EP0370032A1; WO1989000206A1

Abstract

In the process, the DNA in the whole of the acellular biological fluid, preferably blood plasma, is concentrated or separated, the DNA product so obtained is denatured, and in this form is either immobilized on a solid carrier or left free in solution. The DNA is brought into contact with labelled oncogen DNA or oligonucleotide samples, with which it is hybridized if complementary sequences are present. The excess and non-specifically bound labelled oncogen DNA or oligonucleotide samples are removed, and the product tested for the presence of labelled DNA or oligonucleotide. Following concentration or separation of the DNA, enzymatic amplification in vitro of the plasma DNA can be carried out, in order to augment the specific target sequences of the oncogens. The process is suitable as a universal malignity test.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von zellularer Onkogen- DNA, bzw. deren Fragmente, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a method for the detection of cellular oncogene DNA, or its fragments, according to the preamble of claim 1.

Verfahren zur Feststellung der zellularen Onkogen-DNA einschließlich Trennung von DNA, Denaturierung und Hybridisierung und dgl. sind auf dem Gebiet der molekularbiologischen Forschung bekannt. Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit, Spezifizität und extreme Sensitivität der in vitro Hybridisierung zwischen DNA und DNA sowie zwischen RNA und DNA sind aus der Literatur bekannt, die als Standardmethode für spezifische Problemlösungen Anwendung gefunden hat.Methods of detecting cellular oncogene DNA including Separation of DNA, denaturation and hybridization and the like are on the Known in the field of molecular biological research. Reproducibility, Reliability, specificity and extreme sensitivity of in vitro Hybridization between DNA and DNA and between RNA and DNA are over known in the literature as the standard method for specific problem solving Has found application.

Die Hybridisierung mit DNA unter Verwendung von festem Substrat zur Immobilisierung ist seit 1965 bekannt (J. Mol. Biol. 12: 829-942; 1965). Seitdem wurden mehrere Verbesserungen dieser Methode sowie der Methoden der Trennung der DNA aus Zellen und Geweben veröffentlicht.Hybridization with DNA using solid substrate Immobilization has been known since 1965 (J. Mol. Biol. 12: 829-942; 1965). Since then, several improvements have been made to this method as well as the methods the separation of DNA from cells and tissues.

Die erhöhte Aktivität von zwei oder mehreren zellularen Onkogenen durch Mutation, Verstärkung (Amplifikation) oder andere Störungen der Gen- Regulation ist eine wesentliche Ursache der malignen Transformation und der Diversifikation der bösartigen Zellen.The increased activity of two or more cellular oncogenes Mutation, amplification (amplification) or other disorders of the genetic Regulation is a major cause of malignant transformation and diversification of malignant cells.

Amplifikation der zellularen Onkogene auf z. B. das Zweifache bis Hundertfache, kommen als Ursache der malignen Transformation am Anfang in Frage oder treten während der Progression oder der Diversification der bösartigen Zellen in Fällen von 30% bis 50% der bösartigen Krankheiten auf. Nicht alle Sorten von Onkogenen haben die Neigung zu Amplifikation. Interessanterweise haben diejenige Onkogene diese Neigung, die in aktivierter Form am häufigsten in bösartigen Krankheiten vorkommen; drei aus vier in Gruppe A, zwei aus acht in Gruppe B und null aus sechs in Gruppe C, die Gruppen sind auf Seite 17 angegeben.Amplification of the cellular oncogenes on e.g. B. twice to a hundred times, come in as the cause of the malignant transformation in the beginning Question or occur during the progression or diversification of the malignant cells in cases from 30% to 50% of malignant diseases on. Not all types of oncogenes tend to amplify. Interestingly, those oncogenes have this tendency, those in activated Form most often occur in malignant diseases; three out of four in group A, two out of eight in group B and zero out of six in Group C, the groups are given on page 17.

Durch Punkt-Mutation entstehende, neue, in normalem Zustand nicht vorhandene Onkogene sind in 15% bis 30% der Fälle von bösartigen Krankheiten mit dem Transfektionsverfahren in 3T3 NIH Zellen nachweisbar. Es ist neuerdings bekannt, daß die Mutation in wesentlich höherem Prozentsatz der bösartigen Krankheiten eine bedeutende Rolle spielt.Point mutation creates new, not existing in normal condition Oncogenes are malignant diseases in 15% to 30% of cases detectable in 3T3 NIH cells with the transfection method. It is recently known that the mutation in a much higher percentage of malignant diseases plays an important role.

Die folgenden Ursachen und Umstände kann man als maßgebend betrachten, für den erhöhten bzw. qualitativ veränderten DNA-Inhalt des Blutplasmas in bösartigen Krankheiten möglicherweise verantwortlich zu sein:The following causes and circumstances can be considered authoritative, for the increased or qualitatively changed DNA content of the blood plasma may be responsible in malignant diseases:

1. Amplification of the oncogenes that are several times up to several hundred times of normal condition.
2. New oncogenes that occur through mutation and in normal cells are nonexistent.
3. Increased leakage of DNA or its fragments from the malignant cells

a) from living cells through defective membranes,

b) from dying or dead malignant cells.
4. Increased cell turnover in malignant states.
5. Greater malignant cell death rate.
6. Increased permeability of the capillaries and vessels in the malignant Tumors for cells and macromolecules because of the unsuitable and incomplete Development of the otherwise abundant vessels.
7. accumulation of malignant cells, mainly dying cells, in the capillaries and arterioles of malignant tumors, so can cell elements and macromolecules directly into the bloodstream without major degradation long.
8. Increased resistance of DNA to degrading enzymes because they are protected because of

a) binding to proteins,

b) binding to RNA as DNA-RNA complexes and

c) Presence in ds.DNA form.
9. Longer stay in the bloodstream because of the clearance mechanisms those for the removal of the DNA or its fragments from the circulation are responsible because of the constant '' flooding '' of the circulation with these substances in the malignant states or because of not yet known causes are exhausted.

Diese Ursachen und Umstände sind in verschiedenen Kombinationen und in verschiedenem Maße in den verschiedenen Sorten von bösartigem Krankheiten und in deren verschiedenen Phasen für den veränderten DNA-Inhalt in der Blutbahn verantwortlich.These causes and circumstances are in different combinations and in different degrees in different varieties of malignant diseases and in their different phases for the changed DNA content in responsible for the bloodstream.

Da die rechtzeitige Erkennung die wichtigste Voraussetzung für eine Remission bzw. für die Heilung bösartiger Krankheiten ist, ist ein Universal-Malignitätsrest notwendig, der im breiten Spektrum maligner Krankheiten schon kleine Mengen maligner Zellen aufspüren bzw. nachweisen kann.Because timely detection is the most important requirement for a Remission or for the healing of malignant diseases is a Universal malignancy residue necessary in the broad spectrum malignant Detect or detect diseases even small amounts of malignant cells can.

Einen derartigen universalen Test gibt es noch nicht. Nur zwei Verfahren haben bis jetzt als Verlaufskontrolltest routinemäßig Anwendung gefunden: Der Alpha-Feto-Proteintest für Leberkrebs und Teratocarzinom und das carcionoembryonale Antigen (CEA) für Krebssorten des digestiven Systems.There is no such universal test yet. Only two procedures have been used routinely as a follow-up test: The Alpha Feto Protein Test for Liver Cancer and Teratocarcinoma and the carcionoembryonic antigen (CEA) for cancers of the digestive Systems.

In 1985 wurde ein Flotationsverfahren nach 16stündigem Ultrazentrifugieren des Serums bekannt, das eine auf Krebs charakteristische Lipoprotein- Fraktion nachweisen kann, die auch RNA mit Poly(A)⁺RNA Komponenten enthält. Dieses Verfahren wurde aber in präkanzerösen Zuständen, in benignen monoklonalen Gammopathien und in vielen anderen Zuständen noch nicht erprobt. Die Sensitivität dieses Flotationsverfahrens ist realtiv gering, 0,2 mikrogramm/ml, im Vergleich zu dem hochgradig sensitiven Hybridisierungsverfahren. Damit kann man vielleicht erklären, daß das Flotationsverfahren in einigen klinisch gesicherten Krebsfällen negativ ausgefallen ist. Es ist wahrscheinlich, daß die RNA in der Lipoprotein Fraktion nur ein Teil der Gesamt-Plasma-RNA ist, die aus den bösartigen Zellen in die Blutbahn gelangt sind (Gesamt-Plasma-RNA bösartigen Ursprungs). Ferner ist die lange Ultrazentrifugation ein großer Nachteil des Flotationsverfahrens.In 1985 a flotation process was started after 16 hours of ultracentrifugation of the serum known to have a lipoprotein Fraction can also detect the RNA with poly (A) ⁺RNA components contains. However, this procedure was performed in precancerous conditions, in benign monoclonal gammopathies and in many other conditions not tried. The sensitivity of this flotation process is realistic low, 0.2 micrograms / ml, compared to the highly sensitive Hybridization process. Perhaps this can explain that Flotation procedures negative in some clinically proven cancer cases has failed. It is likely that the RNA in the lipoprotein Fraction is only part of the total plasma RNA that comes from the malignant Cells have entered the bloodstream (total plasma RNA malignant Origin). Long ultracentrifugation is also a major disadvantage of the flotation process.

Jüngstens wurden auch zwei Immuntests als diagnostische Krebs-Test vorgeschlagen. Ein Verfahren für die Isolierung des sogenannten ′′Cancer Associated Protein′′ (CAP) wurde veröffentlicht mit der Absicht der Verwendung als ein Krebstest (Immuntest).Recently, two immunoassays have also been proposed as diagnostic cancer tests. A process for the isolation of the so-called '′ Cancer Associated Protein ′ ′ (CAP) has been published with the intention of using it as a cancer test (immunoassay).

In 1985 wurde als Möglichkeit für Krebstests der Nachweis im Urin von Onkogen-Polypeptiden durch monoklonalen Antikörper mittels Immunoblot gedacht. Mit Polypeptiden von drei Onkogenen durchgeführte Untersuchungen haben gezeigt, daß der Unterschied zwischen normalen und phathologischen Werten nicht sehr goß ist und die Schwangerschaft höhere Werte produziert als eine bösartige Krankheit. Für die vollständige Beurteilung muß jedes Onkogen-Polypeptid für verschiedene Größen untersucht werden, was ein sehr großer Zeit- und Materialaufwand ist. Ferner zeigten die normalen Werte eine große Streuung, und so kann ein bedeutendes Überlappen der normalen und der pathologischen Werte vorkommen. Zum Beispiel Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern gegen nur ein Onkogen- Polypeptid zeigten positive Werte in 25-29% der bösartigen und in 6-9% der nicht-bösartigen Fälle.In 1985, the possibility for cancer tests was the detection in the urine of Oncogene polypeptides by monoclonal antibodies using immunoblot thought. Studies performed with polypeptides from three oncogenes have shown the difference between normal and phathological Values are not very good and pregnancy is higher produced as a malignant disease. For the full assessment each oncogene polypeptide must be examined for different sizes become, which is a very large expenditure of time and material. Also showed the normal values have a large spread, and so can be a significant one Overlap of normal and pathological values occur. To the Example investigations with monoclonal antibodies against only one oncogene Polypeptide showed positive values in 25-29% of malignant and in 6-9% of non-malignant cases.

Ein sehr wesentlicher Nachteil dieses wie jeder anderen Methode, die auf dem immunologischen Nachweis der Proteine oder Polypeptiden von Krebszellursprung basieren, ist, daß die Anwesenheit von spezifischen Antikörpern, die durch den Wirt gebildet, oder für Therapiezwecke eingeführt werden, unrealistische Ergebnisse verursachen und überhaupt ein bedeutender Störfaktor sein können.A very significant disadvantage of this like any other method based on immunological detection of proteins or polypeptides from cancer cell origin is that the presence of specific antibodies, formed by the host, or introduced for therapeutic purposes will cause unrealistic results and be significant at all Can be a disruptive factor.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis der DNA, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen in einer azellularen biologischen Flüssigkeit, wie Blutplasma anzugeben. Da es hierfür notwendig ist, erst die DNA aus dem Blutplasma zu trennen, ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein zuverlässiges Verfahren zur Trennung der DNA aus dem Blutplasma anzugeben.The invention has for its object a method for the detection of DNA, or its fragments, from cellular oncogenes in an acellular biological fluid, such as specifying blood plasma. Since it is necessary for this is to first separate the DNA from the blood plasma, it is one further object of the invention, a reliable method for separation to indicate the DNA from the blood plasma.

Durch die Behandlung des Blutplasmas zur Trennung des DNA-Inhaltes, durch Immobilisierung der DNA in denaturierter Form an einem festen Substrat und durch Kontakt des festen Substrats mit der markierten denaturierten Onkogen-DNA um diese miteinander, wenn die Plasma-DNA und Onkogen-DNA-Probe komplementäre Sequenz(en) haben, zu binden (zu hybridisieren), wird ein zuverlässiges Nachweisverfahren erreicht. Diese Tatsache wird durch den Nachweis der Markierungssubstanz, oder im Falle der radioisotopischen Markierung durch Autoradiographie bestimmt.By treating the blood plasma to separate the DNA content, by immobilizing the DNA in a denatured form on a solid Substrate and by contact of the solid substrate with the marked denatured oncogene DNA around these when the plasma DNA and Oncogene DNA sample have complementary sequence (s) to bind (hybridize), a reliable detection method is achieved. These The fact is proven by the detection of the labeling substance, or in the case the radioisotopic labeling determined by autoradiography.

Die in die Blutbahn gelangte DNA, deren Fragmente aus dem Blutplasma extrahiert werden können, kann dessen Onkogen-Inhalt durch in vitro molekulare Hybridisierung nachgewiesen werden. Der Nachweis von Onkogenen bzw. deren Fragmente im Blutplasma in vitro ist um so mehr geeignet für diesen Zweck, weil sie nicht nur äußerst spezifisch sondern auch hochgradig empfindlich ist und so wenig wie 0,5 bis 1 pg DNA/ml spezifisch nachgewiesen werden kann.The DNA that got into the bloodstream, its fragments from the blood plasma can be extracted, its oncogene content by in vitro molecular hybridization can be detected. Detection of oncogenes or their fragments in blood plasma in vitro is all the more suitable for this purpose because they are not only extremely specific but also is highly sensitive and as little as 0.5 to 1 pg DNA / ml specific can be demonstrated.

Erfindungsgemäß werden die Gesamt-Plasma DNA wie die in die Blutbahn gelangte DNA, bzw. deren Fragmente aus dem Blutplasma von Patienten mit bösartigen Krankheiten isoliert und auf die Anwesenheit der DNA zellularer Onkogene mit in vitro molekularer Hybridisierung untersucht.According to the invention, the total plasma DNA is like that in the bloodstream DNA, or its fragments from the blood plasma of patients Malignant diseases are isolated and cellular based on the presence of DNA Oncogenes investigated with in vitro molecular hybridization.

Man konnte feststellen, daß Plasma-DNA in nicht-malignen und malignen Zuständen isoliert werden kann. Wenn die isolierte DNA des Blutplasmas auf Onkogen-Inhalt durch molekulare Hybridisierung in vitro mit markierten Onkogen-DNA Proben untersucht wurde, konnten wesentliche Unterschiede (qualitative und quantitative) zwischen bösartigen und nichtbösartigen Krankheiten festgestellt werden.It was found that plasma DNA is non-malignant and malignant Conditions can be isolated. If the isolated DNA of the blood plasma labeled oncogene content by molecular hybridization in vitro with Oncogene DNA samples examined could reveal significant differences (qualitative and quantitative) between malignant and non-malignant Diseases are detected.

Die qualitativen und quantitativen Unterschiede ermöglichen, daß erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung der Onkogen DNA im Blutplasma als Nachweis auf aktive maligne Prozesse angewendet werden kann. Die praktische Anwendbarkeit des Verfahrens zur Feststellung der DNA, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen aus menschlichen Blutplasma ist ein Universal-Malignitätstest für den Nachweis bösartiger Prozesse.The qualitative and quantitative differences allow that Method according to the invention for examining the oncogene DNA in blood plasma can be used as evidence of active malignant processes. The practical applicability of the method for determining the DNA, or their fragments, from cellular oncogenes from human blood plasma is a universal malignancy test for the detection of malignant Processes.

Der wesentlichste Vorteil dieser Erfindung ist es, daß sie ein Verfahren angibt, das als Universial-Malignitätstest dienen kann: Dieser Test beruht auf den Grundprinzipien der bösartigen Transformation durch die Aktivierung von zellularen Onkogenen und der Besonderheiten der bösartigen Zellen und Tumore.The main advantage of this invention is that it is a process indicates that can serve as a universal malignancy test: This test is based on the basic principles of malicious transformation through the Activation of cellular oncogenes and the peculiarities of the malignant Cells and tumors.

Der zweite bedeutende Vorteil dieses Verfahrens ist die große Empfindlichkeit (1 pg/ml).The second significant advantage of this method is the great sensitivity (1 pg / ml).

Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Erfindung ist im Gegenteil zu Immuntests, daß die spezifische Antikörper, die sich durch den Wirt gebildet haben, oder für Therapiezwecke in die Blutbahn eingeführt wurden, die Ergebnisse nicht beeinflussen können.Another significant advantage of the invention is on the contrary Immunoassays that indicate the specific antibody that is found by the host have formed, or introduced into the bloodstream for therapeutic purposes that cannot affect the results.

Gegenüber Nachweisverfahren, die auf immunologischem Nachweis der Proteine oder Polypeptiden von Krebszellursprung basieren, hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß eine Störung des Ergebnisses durch spezifische Antikörper entfällt.Compared to detection methods based on immunological detection of the proteins or based on cancer cell origin polypeptides has the invention Procedure has the advantage of disrupting the outcome due to specific antibodies.

Dieses Verfahren hat Vorteile auch gegenüber dem Nachweis der Onkogen Transkripte aus dem Plasma als Malignitätstest. Die Gefahr des Abbaus der DNA ist wesentlich kleiner als bei den RNA-Transkripten, wo das ubiquitäre RNase-Enzym eine Reihe von Vorsichtsmaßnahmen während des ganzen Prozesses verlangt, die bei dem Onkogen DNA Nachweise nicht notwendig sind.This method also has advantages over the detection of oncogenes Plasma transcripts as a malignancy test. The danger of dismantling the DNA is much smaller than that of the RNA transcripts, where the ubiquitous RNase enzyme takes a number of precautions during the whole process, which is not the case with the oncogene DNA evidence are necessary.

Der größte Vorteil gegenüber dem Malignitätstest durch Nachweis der Onkogen-Transkripte bzw. deren Fragmente ist: Der Nachweis der Onkogen- DNA ist fähig zu beweisen, daß die Aktivierung des Onkogens durch Punkt-Mutation verursacht wurde und zeigt ferner, welcher Punkt des Onkogens durch Mutation verändert wurde. Aus diesem Grund kann man wissen, wie das Onkogen-Produkt (OKP) verändert ist. Die Mutation betrifft besondes das ras^Ki Onkogen, und zwar in der Position Codon 12. Diese Veränderung führt zu einem Onkogenprodukt, in dem die Aminosäure gly in der Position 12 (p12) mit val (besonders in Kolon und Harnblase-Krebs), arg (besonders in Lungenkrebs) oder mit cys (besonders in Lungenkrebs) verwechselt wird. Oligonukleotid-Proben für diese Onkogene zum Zweck dieser Hybridisierung sind im Handel erhältlich (Oncogene Science Inc., Mineola, NY 11501).The biggest advantage over the malignancy test by detecting the oncogene transcripts or their fragments is: The detection of the oncogene DNA is able to prove that the activation of the oncogene was caused by point mutation and also shows which point of the oncogene by mutation was changed. For this reason, you can know how the oncogene product (OKP) is changed. The mutation particularly affects the ras ^Ki oncogene, in position codon 12. This change leads to an oncogene product in which the amino acid gly in position 12 (p12) with val (especially in colon and bladder cancer) arg ( especially in lung cancer) or with cys (especially in lung cancer). Oligonucleotide samples for these oncogenes for the purpose of this hybridization are commercially available (Oncogene Science Inc., Mineola, NY 11501).

Da dieses Onkogen-Produkt nur in den Tumorzellen vorhanden ist und in den normalen Zellen überhaupt nicht anwesend ist, bietet dieses durch Mutation veränderte Onkogen-Produkt diagnostisch und therapeutisch einen einmaligen ausschließlichen spezifischen Angriffspunkt an den bösartigen Zellen.Since this oncogene product is only present in the tumor cells and in is not present at all in the normal cells, offers this through Mutation changed oncogene product diagnostically and therapeutically a unique, exclusive point of attack to the malignant cells.

So kann man, zum Beispiel, durch Immunoimaging, intravenöse Verwendung von monoklonalen Anti-Onkogen-Produkt Antikörpern, verbunden mit einem Radioisotop, bösartige Zellen im Körper schon in einem Stadium der bösartigen Krankheit, wenn die üblichen bildgebenden Maßnahmen noch negative Resultaten geben, visualisieren.So you can, for example, by immunoimaging, intravenous use of monoclonal anti-oncogene product antibodies linked to one Radioisotope, malignant cells in the body at a stage of malignant disease if the usual imaging measures still Give negative results, visualize.

Mit monoklonalen anti-OKP spezifischen Antikörpern, allein oder in Verbindung mit radioaktiven oder chemotherapeutisch wirkenden Substanzen, kann man ausschließlich nur die bösartigen Zellen beeinflussen bzw. vernichten, ohne die normalen Zellen zu beschädigen.With monoclonal anti-OKP specific antibodies, alone or in combination with radioactive or chemotherapeutic substances, you can only influence the malignant cells or destroy without damaging the normal cells.

Der Nachweis zellularer Onkogen-DNA bzw. deren Fragmente aus dem Blutplasma bietet weitere, für die Therapie maßgebende Informationen:The detection of cellular oncogene DNA or its fragments from the Blood plasma offers further information that is relevant for therapy:

1. a. The basic character of malignant processes and their behavior in the host is largely determined by which oncogenes were activated (Genetic Scripture, cell oncogene profile). So far, this has only been possible histologically in tumor tissues by in vitro nucleic acid hybridization be determined. The malignancy residue according to the invention can provide this information at least in part from the blood plasma (Plasma oncogene profile) long before the relatively small tumor cell mass visualizable and accessible for histological examinations is.
b. During the malignant processes in vitro as well as during the existence The malignant disease in patients can add new oncogenes be activated, resulting in a significant progression of the Malice can result. This risk can be eliminated with the malignancy test can be recognized early during the follow-up, that a new oncogene DNA is identified from the blood plasma, which was previously not available in the plasma.
c. The detection of the oncogene DNA is particularly suitable for the amplification to examine and observe the oncogene. During the The course of the disease can be an amplification (amplification) of the activated Oncogenes occur, causing a significantly increased aggressiveness and progression of malignant cells can. The occurrence of such reinforcement can be quantified with the Maglignity test carried out early during the Follow-up control can be observed. That means a subclone the tumor cells that have the amplified oncogene early, before it could spread and the forecast would deteriorate a lot could be recognized. This subclone can be in the early stages influenced by specific immunotherapy or immunochemotherapy and possibly destroyed. Amplification of the cellular oncogenes (two to hundred times) occurs either in the primary tumor or during progression and diversification of the malignant cells and in approximately 30% to 50% of the Cases of malignant diseases.
2. Gene products of the activated cellular oncogenes play an important, even vital function in the transformed malignant cells, many of them act as protein kinase enzymes in the cell membrane.

Die Veränderung bzw. Beeinträchtigung dieser Funktion durch Angriff auf die bösartigen Zellen immunspezifisch, gezielt auf ihre Onkogenprodukte mit monoklonalen Antikörpern allein oder gebunden mit radioaktiv oder chemotherapeutisch wirkenden Substanzen kann zur heilenden Wirkung führen, bevor die Tumorzellmasse sich verbreiten konnte. Ein Plasma-Onkogenprofil bei Früherkennung zeigt die spezifischen Therapiemöglichkeiten. Die Verlaufskontrolle mit neuen Onkogen-Proben ermöglicht es, neu aufgetretene Onkogen-DNA zu erkennen. Ein quantitativ durchgeführter Malignitätstest bietet während des Krankheitsverlaufs eine Früherfassung einer eventuellen Amplifizierung eines zellularen Onkogens und gibt spezifische Hinweise, wie man diesen neuen Subklon von bösartigen Zellen unterdrücken bzw. vernichten kann, bevor eine größere Progression oder Agressivität verursacht ist.The change or impairment of this function by attack immune-specific to the malignant cells, targeted to their oncogene products with monoclonal antibodies alone or bound with radioactive or chemotherapeutic substances can be used for healing Effect before the tumor cell mass could spread. A Plasma oncogene profile for early detection shows the specific therapy options. The follow-up with new oncogene samples enables to recognize newly emerged oncogene DNA. A quantitative malignancy test performed during the course of the disease an early detection of a possible amplification of a cellular Oncogene and gives specific guidance on how to use this new subclone suppress or destroy malignant cells before one greater progression or aggressiveness.

Im folgenden wird die Erfindung genauer erläutert.The invention is explained in more detail below.

Aus dem frischgewonnenen Blut wird das Plasma schnell separiert. Dann wird das Plasma mit einem Detergens, wie Natriumduodezylsulphat (SDS) und einem proteolytischen Enzym, wie Proteinase K (Boehringer Mannheim) mit einem wäßrigen Medium vermischt und wird dann bei 37 Grad C für 60 min in einer Pufferlösung (pH 7,5) inkubiert. Die viskose Mischung wird durch Vortexing periodisch umgerührt. Nach der Inkubation wird durch organisches Lösungsmittel, wie Phenol, dreimal extrahiert. Das Ergebnis ist eine organische Phase, die den größten Anteil der Proteine, und eine wäßrige Phase, die im wesentlichen die gesamte DNA enthält. Phenol wird nach Zentrifugieren entfernt. Die Interphase wird mit zusätzlichem Phenol und Puffer reextrahiert. Nach der dritten Extraktion wird die DNA in Anwesenheit von 0,25 M Na-azetat bei pH 5,2 mit eiskaltem Äthanol bei -20 Grad C inkubiert, prezipitiert und zentrifugiert. Das DNA-Sediment (das nicht immer sichtbar ist) wird in dem gewünschten Puffer gelöst.The plasma is quickly separated from the freshly obtained blood. Then the plasma with a detergent such as sodium duodezyl sulphate (SDS) and a proteolytic enzyme, such as Proteinase K (Boehringer Mannheim) mixed with an aqueous medium and is then at 37 degrees C. incubated for 60 min in a buffer solution (pH 7.5). The viscous Mixture is stirred periodically by vortexing. After incubation is extracted three times by organic solvent such as phenol. The result is an organic phase that accounts for the largest share of the proteins, and an aqueous phase that is essentially all Contains DNA. Phenol is removed after centrifugation. The interphase is re-extracted with additional phenol and buffer. After the third Extract the DNA in the presence of 0.25 M Na acetate at pH 5.2 incubated with ice-cold ethanol at -20 degrees C, precipitated and centrifuged. The DNA sediment (which is not always visible) is in the desired buffer.

Die DNA wird einer DNase-Enzym-freien RNase-Behandlung bei 37 Grad C für 1 h unterzogen. Danach wird die DNA zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Äthanol wie oben prezipitiert und in dem gewünschten Lösungsmittel gelöst.The DNA undergoes DNase enzyme-free RNase treatment at 37 degrees C. subjected for 1 h. Then the DNA is washed twice with phenol / chloroform extracted and precipitated with ethanol as above and in the desired Solvent dissolved.

Die im Wasser gelöste DNA wird denaturiert durch Erhitzen auf 100 Grad für 10 min und durch Mischen mit gleichem Volumen 1 M NaOH, und bei Zimmertemperatur 20 min inkubiert. Dann wird das Alkali neutralisiert auf einen neutralen Wert (pH 8,0) durch Zumischung von 1 M HCl und die Salzkonzentration wird durch Zugabe von 1 M NaCl, 0,3 M Nazitrat, 0,5 M Tris. CL (pH 8,0) erhöht. Dann wird in Eis gekühlt. Die Erhöhung der Salzkonzentration dient der Erhöhung der Bindefähigkeit der DNA an das feste Substrat (siehe unten).The DNA dissolved in the water is denatured by heating to 100 degrees for 10 min and by mixing with the same volume of 1 M NaOH, and incubated at room temperature for 20 min. Then the alkali is neutralized to a neutral value (pH 8.0) by adding 1 M HCl and the salt concentration is determined by adding 1 M NaCl, 0.3 M Nazitrate, 0.5 M tris. CL (pH 8.0) increased. Then it is cooled in ice. The Increasing the salt concentration serves to increase the binding ability the DNA to the solid substrate (see below).

Die resultierende Lösung von denaturierter DNA wird in gewünschter Menge auf einem festen Substrat, wie reine Nitrozellulose, aufgetragen, um eine Immobilisierung der denaturierten DNA an dem festen Substrat zu bewirken. Das resultierende feste Substrat wird einer Wäsche bei Zimmertemperatur mit 50 ml vol 6 × SSC unterzogen und getrocknet, dann in einem Vakuumherd bei 80 Grad C für 2 h gebacken. Das gebackene feste Substrat wird danach behandelt, um ein weiteres Binden von Nukleinsäure an das feste Substrat zu verhindern.The resulting solution of denatured DNA is in the desired Applied to a solid substrate, such as pure nitrocellulose, to immobilize the denatured DNA on the solid Effect substrate. The resulting solid substrate becomes one Wash at room temperature with 50 ml vol 6 × SSC and dried, then baked in a vacuum oven at 80 degrees C for 2 h. The baked solid substrate is then treated for another Prevent binding of nucleic acid to the solid substrate.

Die (radioisotopisch oder nicht-radioisotopisch) markierte Onkogen DNA-Probe wird denaturiert und in einer Lösung mit dem festen Substrat, auf dem die Plasma-DNA schon immobilisiert ist, in Kontakt gebracht, um damit unter ausgewählten thermischen und chemischen Bedingungen zu hybridisieren. So wird bewirkt, daß die markierte Onkogen DNA-Probe durch Wasserstoffbindungen mit der komplementären Sequenz(en) der auf dem festen Substrat imobilisierenden Plasma-DNA, wenn sie diese komplementären Sequenzen haben, verbunden (hybridisiert) ist.The (radioisotopic or non-radioisotopic) labeled oncogene DNA sample is denatured and in a solution with the solid Substrate on which the plasma DNA is already immobilized brought to use among selected thermal and chemical Hybridize conditions. This causes the marked Oncogene DNA sample through hydrogen bonds with the complementary Sequence (s) of the plasma DNA immobilizing on the solid substrate, if they have these complementary sequences linked (hybridized) is.

Nach einem vorbestimmten Zeitraum wird das feste Substrat einer Wäsche unterzogen, um die nicht spezifisch gebundene, markierte Onkogen DNA- Probe zu entfernen.After a predetermined period of time, the solid substrate becomes a laundry subjected to the non-specifically bound, labeled oncogene DNA Remove sample.

Das feste Substrat wird anschließend einer Analyse unterzogen, um das Stattfinden der Hybridisierung zwischen der Plasma-DNA und der markierten Onkogen-DNA Probe nachzuweisen. Das wird im Falle der radioisotopischen Markierung durch Autoradiographie, im Falle der nichtradioisotopischen Markierung durch Nachweis der Markierungssubstanz mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion bestimmt.The solid substrate is then subjected to analysis to determine the The hybridization takes place between the plasma DNA and the labeled one Detect oncogene DNA sample. That will be the case with the radioisotopic Marking by autoradiography, in the case of non-radioisotopic Labeling by detection of the labeling substance determined by an enzyme affinity test by color reaction.

Eine Menge von gereinigter molekularisch klonierter DNA, die die Sequenz als Kode für Onkogen enthält, wird entweder radioisotopisch oder nicht-radioisotopisch markiert. Die radioisotopische Markierung wird durch Nick-Translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113: 237-251, 1977) durchgeführt, um hohe spezifische Aktivität zu erreichen. Für diese Verfahrensweise verwendbare Radioisotope sind beispielsweise besonders 32^P aber auch I¹²⁵, I¹³¹ und H³.An amount of purified molecularly cloned DNA containing the sequence as a code for oncogene is labeled either radioisotopically or non-radioisotopically. The radioisotopic labeling is carried out by nick translation according to Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113: 237-251, 1977) to achieve high specific activity. Radioisotopes that can be used for this procedure are, for example, particularly 32 ^P but also I¹²⁵, I¹³¹ and H³.

Die nicht-radioisotopische Markierung der Onkogen-DNA Proben wird beispielsweise mit Biotin, auch durch Nick-Translation (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633-6637, 1981) und jüngstens mit Photobiotin (Nucleic Acid Research 13: 745-761, 1985) durchgeführt. Die Markierung mit Photobiotin ist besonders unkompliziert, schnell und preisgünstig. Ein Photobiotin-Markierungs- und Nachweis-Kit wird kommerziell angeboten (BRESA, Adelaide, South Australia). Die Markierung mit Biotin hat einen sehr wichtigen Vorteil: Abgesehen davon, daß sie nicht radioaktiv ist, kann man Ergebnisse innerhalb einiger Stunden durch Farbreaktion sehen. Man muß nicht Tage warten, wie bei der Autoradiographie.The non-radioisotopic labeling of the oncogene DNA samples is done for example with biotin, also by nick translation (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633-6637, 1981) and more recently with photobiotin (Nucleic Acid Research 13: 745-761, 1985). The mark with photobiotin is particularly uncomplicated, fast and inexpensive. A photobiotin labeling and detection kit becomes commercial offered (BRESA, Adelaide, South Australia). The mark with biotin has a very important advantage: apart from the fact that it is not radioactive, you can get results within a few hours see through color reaction. You don't have to wait days like with the Autoradiography.

Onkogen-DNA Proben, Onkogen-Oligonucleotid-Proben, markiert oder unmarkiert, sind kommerziell erhältlich (ONCOR, Inc. Gaithersburgh, Ma. USA 20877; ONCOGENE SCIENCE Inc. Mineola, NY. 11501 USA).Oncogene DNA samples, oncogene oligonucleotide samples, labeled or unlabeled, are commercially available (ONCOR, Inc. Gaithersburgh, Ma USA 20877; ONCOGENE SCIENCE Inc.Mineola, NY. 11501 USA).

Das folgende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken: The following example serves to explain the invention further, without limiting it:

example

Es wird 20 ml Blut mit 20 IE/ml Heparin entnommen, und das Blutplasma wird so schnell wie möglich separiert. Es wird in zwei Einweg-Plastik- Zentrifugen-Röhrchen je 5 ml Blutplasma pipettiert. Eines wird tiefgekühlt für eventuelle Wiederholung oder für ergänzende Untersuchungen als Reserve aufbewahrt. Das andere wird gleich in Bearbeitung genommen.20 ml of blood with 20 IU / ml of heparin are taken, and the blood plasma will be separated as soon as possible. It comes in two disposable plastic Pipette 5 ml blood plasma into the centrifuge tube. One is frozen for possible repetition or for additional examinations kept as a reserve. The other is being processed.

Es wird ein Gemisch aus 0,4 M Tris. Cl (pH 7,5); 50 mM Äthylendiaminotetraessigsäure (EDTA); 0,6 M NaCl; 2% (Gew.-/Vol) Natriumduodecylsulfat (SDS) und Proteinase K (Endkonzentration 200 mikrogramm/ml, Boehringer) hinzugefügt und bei 37 Grad C für 60 Min inkubiert mit häufigem Vortexing.It becomes a mixture of 0.4 M Tris. Cl (pH 7.5); 50 mM ethylenediaminotetraacetic acid (EDTA); 0.6 M NaCl; 2% (w / v) sodium duodecyl sulfate (SDS) and Proteinase K (final concentration 200 micrograms / ml, Boehringer) added and incubated at 37 degrees C for 60 min with frequent vortexing.

Anschließend wird gleiches Volumen von Phenol und Chloroform-Isoamylalkohol (24 : 1) eingemischt und durch Schütteln extrahiert, sodann durch Zentrifugieren die organische und die unorganische (wäßrige) Phase getrennt. Die unorganische Phase wird separiert und aufbewahrt. Die Interphase wird mit Phenol-Chloroform wie oben extrahiert. Die wäßrigen Phasen werden gemeinsam wieder mit Phenol und Chloroform noch zweimal extrahiert.Then the same volume of phenol and chloroform-isoamyl alcohol (24: 1) mixed in and extracted by shaking, then by Centrifuge the organic and the inorganic (aqueous) phase Cut. The inorganic phase is separated and saved. The Interphase is extracted with phenol-chloroform as above. The watery Phases are still together with phenol and chloroform extracted twice.

Nach der dritten Extraktion wird zu der wäßrigen Phase Natriumazetat von 2,5 M (pH 5,2) zugemischt, um die Endkonzentration von 0,25 M zu erreichen. Zwei Volumina von eiskaltem Äthanol werden zugefügt, gut vermischt und bei -20 Grad C inkubiert und danach zentrifugiert.After the third extraction, the aqueous phase becomes sodium acetate of 2.5 M (pH 5.2) was added to give the final concentration of 0.25 M to reach. Two volumes of ice cold ethanol are added, well mixed and incubated at -20 degrees C and then centrifuged.

Das DNA-Sediment (nicht immer sichtbar!) wird in TE (pH 8,0) (10 mM Tris. Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0) gelöst und mit DNase-freier RNase (Endkonzentration 10 mikrogramm/ml) bei Zimmertemperatur für 60 min inkubiert, danach wird mit Phenol-Chloroform zweimal extrahiert und mit Äthanol wie oben präzipitiert.The DNA sediment (not always visible!) Is in TE (pH 8.0) (10 mM Tris. Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA pH 8.0) dissolved and with DNase-free RNase (Final concentration 10 micrograms / ml) at room temperature for 60 min incubated, then extracted twice with phenol-chloroform and with Ethanol precipitated as above.

Die Extrahierung der DNA ist wesentlich erleichtert, und es wird eine serienweise Untersuchung ermöglicht durch die Anwendung des Instruments "Nucleic Acid Extractor" (Analytic System, Foster City, Ca, 94404, USA). Das oben geschriebene Verfahren ist leicht adaptierbar für den "Nucleic Acid Extractor". Hiermit kann eine Person in drei Stunden die DNA aus acht Blutplasmen simultan isolieren.Extracting the DNA is much easier, and it becomes one serial examination made possible by using the instrument "Nucleic Acid Extractor" (Analytic System, Foster City, Ca, 94404, UNITED STATES). The method written above is easily adaptable for the "Nucleic Acid Extractor". This allows a person to do the in three hours Isolate DNA from eight blood plasmas simultaneously.

Die DNA gelöst im Wasser in der gewünschten Konzentration wird auf 100 Grad C für 10 min erhitzt, dann schnell in Eis gekühlt, mit gleichem Volumen von 1 M NaOH gemischt und bei Zimmertemperatur für 20 min inkubiert. Damit wurde die Denaturierung der DNA erreicht.The DNA dissolved in water in the desired concentration is reduced to 100 Degree C heated for 10 min, then quickly chilled in ice, with the same Volume of 1 M NaOH mixed and incubated at room temperature for 20 min. The denaturation of the DNA was thus achieved.

Die denaturierte DNA wird mit einer Lösung von 1 M NaCl, 0,3 M Nazitrat, 0,5 M Tris. Cl (pH 8,0) und 1 M HCl gemischt, dann in Eis gekühlt.The denatured DNA is mixed with a solution of 1 M NaCl, 0.3 M Nazitrate, 0.5 M tris. Cl (pH 8.0) and 1 M HCl mixed, then cooled in ice.

Ein entsprechendes Volumen von der resultierenden Lösung (10 mikrogramm DNA) wird auf einem festen Substrat wie reines Nitrozellulose aufgetragen, wobei das entsprechende Volumen von der denaturierter DNA Lösung in eine Vertiefung einer "Mikrofilter"-Platte mit 96 Vertiefungen eingebracht (Minifold I Filtration und Inkubations-Platte, Schleicher & Schüll, Keene, New Hampshire, 03431, USA) (Bio-Rad, Richmond, Ca, 94 804, USA) und unter gelindem Vakkum unter Bildung eines Flecks von 3,0 mm Durchmesser, filtriert wird. Der resultierende Filter wird von einer Lösung von 50 ml von 6 × SSC bei Zimmertemperatur gewaschen, getrocknet und bei 80 Grad C für 2 h im Vakuumherd gebacken.A corresponding volume of the resulting solution (10 micrograms DNA) is applied to a solid substrate such as pure nitrocellulose, the corresponding volume from the denatured DNA solution placed in a well of a "microfilter" plate with 96 wells (Minifold I filtration and incubation plate, Schleicher & Schull, Keene, New Hampshire, 03431, USA) (Bio-Rad, Richmond, Ca, 94 804, USA) and under a gentle vacuum to form a 3.0 mm spot Diameter, is filtered. The resulting filter is from a Solution of 50 ml of 6 × SSC washed at room temperature, dried and baked at 80 degrees C for 2 h in a vacuum oven.

Nach dem Backen wird der resultierende Filter einer Behandlung, der sogenannten Prehybridisierung in Prehybridisierungslösung unterzogen. Prehybridisierungslösung: Formamid 50% (Vol/Vol); 5 × Denhardt's Lösung; 5 × SSPE; 0,1% SDS; 100 mikrogramm/ml denaturierte DNA aus Heringssperma und 1 mikrogramm/ml Poly A. (Denhardt's Lösung: Ficoll 5 g; Polyvinylpirrololidon 5 g; Rinderserumalbumin (Pentax Fraktion V. 5 g und H₂O zu 500 ml). Der Filter wird in dieser Prehybridisierungslösung bei 42 Grad C für 6-8 h inkubiert. (20 × SSPE: 174 g NaCl; 27,6 g NaH₂PO₄; 7,4 g EDTA ad 1 l H₂O, pH 7,4).After baking, the resulting filter becomes a treatment that so-called prehybridization in prehybridization solution. Prehybridization solution: formamide 50% (vol / vol); 5 × Denhardt's Solution; 5 x SSPE; 0.1% SDS; 100 micrograms / ml denatured DNA Herring sperm and 1 microgram / ml poly A. (Denhardt's solution: Ficoll 5 g; Polyvinyl pirrololidone 5 g; Bovine serum albumin (Pentax fraction V. 5 g and H₂O to 500 ml). The filter is in this prehybridization solution incubated at 42 degrees C for 6-8 h. (20 x SSPE: 174 g NaCl; 27.6 g NaH₂PO₄; 7.4 g EDTA ad 1 l H₂O, pH 7.4).

Die markierte DNA-Onkogen Probe wird durch Erwärmung auf 100 Grad C für 5 min denaturiert und schnell in Eis abgekühlt. In denaturierter Form wird zu die Prehybridisierungslösung, in der der Filter schon inkubiert ist, zugemischt und weiter inkubiert bei 42 Grad C für 12-20 h.The labeled DNA oncogene sample is heated to 100 degrees C for Denatured for 5 min and quickly cooled in ice. In denatured form becomes the prehybridization solution in which the filter is already incubated is admixed and further incubated at 42 degrees C for 12-20 h.

Nach der Inkubierung wird die Lösung, in der die Inkubation durchgeführt wurde, weggegossen und der Filter 3-4mal für 5-10 min (je Wäsche) einer Wäsche bei Zimmertemperatur im großen Volumen von 2 × SSC und 0,1% SDS unterzogen. Der Filter wird zwei weiteren Wäschen für 1-1,5 h in einer Lösung von 1 × SSC und 0,1% SDS bei 68 Grad C unterworfen. Wenn der Hintergrund noch immer hoch ist, sind weitere Wäschen bei höheren Stringenzien (Schärfen) notwendig: Für 60 min in einer Lösung von 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 60 Grad C.After the incubation, the solution in which the incubation is carried out was poured away and the filter 3-4 times for 5-10 min (each Laundry) a laundry at room temperature in a large volume of 2 × SSC and subjected to 0.1% SDS. The filter does two more washes for 1-1.5 h in a solution of 1 × SSC and 0.1% SDS at 68 degrees C. If the background is still high, there are more washes necessary for higher stringencies (sharpening): for 60 min in one Solution of 0.2 × SSC and 0.1% SDS at 60 degrees C.

Das folgende, gut bekannte, käufliche 18 molekularisch klonierte menschliche Onkogen wurde als Onkogen-DNA Probe gebraucht, die hier ungefähr nach Häufigkeit ihres Vorkommens mit erhöhter Aktivität in menschlichen Bösartigkeiten gruppiert sind:The following, well known, commercially available 18 molecularly cloned human oncogene was used as an oncogene DNA sample, which is here roughly according to the frequency of their occurrence with increased activity in human malignancies are grouped:

Oligonucleotid-Proben: ras^Ki (codon 12), siehe auch S. 9. Die Proben wurden radioisotopisch mit P³² markiert (spezifische Aktivität: 10⁸ cpm/ mikrogramm) durch Nick-Translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) oder unmarkiert erhalten. Die unmarkierten DNA Proben wurden entweder mit Biotin (nach Leary, Proc. Nat. Acad. Sci. 80 : 4045-4049, 1983) oder mit Photobiotin markiert. Reagenzien für die nicht-radioisotopische Markierung durch Nick-translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) mit Biotin und für die Visualisierung der Resulate der Hybridisierung mit Enymaffinitätsverfahren durch Farbreaktion werden in Handel angeboten (Amersham, Little Chalfont, England). Markierungen mit Photobiotin erfolgt nach Vorschrift des Herstellers (BRESA, Adelaide, South Australia): Nach kurzer Bestrahlung mit sichtbarem Licht geht Photobiotin eine stabile Bindung mit Nukleinsäuren ein. Die so mit Biotin markierte DNA kann mit 2-Butanol Extraktion mit Äthanol- Precipitation isoliert werden und kann als stabile markierte Probe für ein halbes Jahr in 0,1 mM EDTA bei -15 Grad C stabil aufbewahrt werden.Oligonucleotide samples: ras ^Ki (codon 12), see also p. 9. The samples were radioisotopically labeled with P³² (specific activity: 10⁸ cpm / microgram) by nick translation according to Rigby et al. (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) or unlabeled. The unlabeled DNA samples were either labeled with biotin (according to Leary, Proc. Nat. Acad. Sci. 80: 4045-4049, 1983) or with photobiotin. Reagents for non-radioisotopic labeling by nick translation according to Rigby et al. (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) with biotin and for the visualization of the results of hybridization with enymaffinity processes by color reaction are commercially available (Amersham, Little Chalfont, England). Labeling with photobiotin is carried out according to the manufacturer's instructions (BRESA, Adelaide, South Australia): After brief exposure to visible light, photobiotin forms a stable bond with nucleic acids. The DNA so labeled with biotin can be isolated with 2-butanol extraction with ethanol precipitation and can be stored as a stable labeled sample for half a year in 0.1 mM EDTA at -15 ° C.

Das Nitrocellulose-Papier im Falle radioisotopischer Markierung wird zwischen klaren Azetatfolien eingesetzt und in die Nähe eines für die Röntgenstrahlen empfindlichen Filmes gebracht. Ein Verstärkerschirm wird an der entgegengesetzten Seite angebracht und lichtdicht verpackt. Nach einer bestimmten Zeit wird der Film entwickelt. Die Anwesenheit der DNA bzw. deren Fragmente, die mit der Onkogen-DNA Probe hybridisieren, wird durch die Anwesenheit eines Flecks auf dem Film bestimmt.The nitrocellulose paper in the case of radioisotopic labeling will inserted between clear acetate foils and close to one for the X-rays brought sensitive film. An intensifying screen will attached on the opposite side and packed light-tight. To the film is developed at a certain time. The presence of the DNA or their fragments that hybridize with the oncogene DNA sample determined by the presence of a spot on the film.

Im Falle nicht-radioisotopisch markierter Onkogen-DNA Proben, wie im Falle der mit Photobiotin markierten Onkogen-DNA Proben, werden die DNA Proben in 0,1 M EDTA aufgetragen, sonst wird die Prehybridisierung so ausgeführt wie mit radioisotopisch markierten DNA Proben, aber die Dauer der Prehybridisierung ist kürzer: 4-8 h. Die Hybridisierung wird durchgeführt wie mit radioaktiven Proben, aber bei höherer Temperatur (55 Grad C) für 20 h in einer Lösung: 4 Vol Prehybridisierungspuffer; 1 Vol von etwa 0,5 g/ml Natrium Dextransulfat und 20 ng/ml Biotin-markierte DNA Probe (Onkogen-DNA Probe).In the case of non-radioisotopically labeled oncogene DNA samples, as in In the case of oncogene DNA samples labeled with photobiotin, the DNA Samples are applied in 0.1 M EDTA, otherwise the prehybridization will be like this carried out as with radioisotopically labeled DNA samples, but the duration prehybridization is shorter: 4-8 h. The hybridization will performed as with radioactive samples, but at a higher temperature (55 degrees C) for 20 h in a solution: 4 vol prehybridization buffer; 1 vol of about 0.5 g / ml sodium dextran sulfate and 20 ng / ml biotin-labeled DNA probe (oncogene DNA probe).

Die getrockneten Nitrocellulose-Papiere werden bei 42 Grad C für 30 min in STMT Puffer (1 M NaCl; 0,1 M Tris. Cl, pH 7,5; 2 mM MgCl₂ 0,05%v/v Triton X-100) mit 30 mg von Bovin Serum Albumin inkubiert. Nachdem das Nitrocellulose-Papier getrocknet ist, wird es bei Zimmertemperatur für 10 min in STMT-Puffer mit 1 mikrogramm/ml Sigma Avidin-alkalische Phosphatase- Komplex inkubiert, dann wird mit häufigem Schütteln in STMT Puffer (3 × 10 min) und STM Puffer (1 m NaCl, Tris. Cl, pH 9,5, 5 mM MgCl₂) für 2 × 5 min inkubiert. The dried nitrocellulose papers are at 42 degrees C for 30 min in STMT buffer (1 M NaCl; 0.1 M Tris. Cl, pH 7.5; 2 mM MgCl₂ 0.05% v / v Triton X-100) incubated with 30 mg of Bovin Serum Albumin. After that Nitrocellulose paper is dried, it is left at room temperature for 10 min in STMT buffer with 1 microgram / ml Sigma avidin-alkaline phosphatase Incubate complex, then shake frequently in STMT buffer (3 × 10 min) and STM buffer (1 M NaCl, Tris. Cl, pH 9.5, 5 mM MgCl₂) for Incubated 2 × 5 min.

Für Farbreaktionen wird das Nitrocellulose Papier bei Zimmertemperatur im Dunkeln mit Substrat-Lösung (STM Puffer aber nur mit 0,1 M NaCl) mit 0,33 mg/ml Nitro-blau-tetrazolium, 0,17 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphat und 0,33% v/v N,N-dimethylformamid vermischt. Die Reaktion wird durch Waschen des Nitrocellulose Papiers mit 10 mM Tris. Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA beendet.For color reactions, the nitrocellulose paper is used at room temperature in the dark with substrate solution (STM buffer but only with 0.1 M NaCl) 0.33 mg / ml nitro blue tetrazolium, 0.17 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl Phosphate and 0.33% v / v N, N-dimethylformamide mixed. The reaction is obtained by washing the nitrocellulose paper with 10 mM Tris. Cl, pH 7.5; 1mM EDTA terminated.

Die erfindungsgemäße Arbeitsweise zum Nachweis der DNA-Transkripten, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen im menschlichen Blutplasma umfaßt mehrere günstige Reaktionsweisen und Schritte, um eine hohe Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit zu ergeben.The procedure according to the invention for the detection of DNA transcripts, or their fragments, from cellular oncogenes in human blood plasma includes several convenient ways and steps to get one high reliability and reproducibility.

Die Verwendung von Proteinase K erleichtert die Entfernung der Proteine, die Guanidinium-Isothiocyanat-Behandlung die Denaturierung der Proteine sowie die Spaltung der DNA-Protein Komplexe. Der Rest der Proteine wird durch organische Extraktion entfernt. Der Abbau und das Entfernen der RNA wird durch RNase-Behandlung erreicht, weil die RNA sonst bei der Hybridisierung interferieren könnte. Das Backen sorgt für die Zuverlässigkeit der festen Bindung der DNA an das Nitrocellulose- Filter. Die Behandlung des Nitrocellulose-Filters nach dem Backen verhindert unspezifische Bindungen und sorgt auch für Zuverlässigkeit. Die Wäsche des Nitrocellulose-Filters nach Hybridisierung entfernt überflüssige, oder unspezifisch gebundene, markierte Onkogen-DNA Proben und trägt auch zur Zuverlässigkeit bei.The use of Proteinase K facilitates the removal of the proteins, the guanidinium isothiocyanate treatment denaturing the Proteins and the cleavage of the DNA-protein complexes. The rest of Proteins are removed by organic extraction. The dismantling and that Removal of the RNA is achieved through RNase treatment because of the RNA otherwise could interfere with hybridization. Baking ensures the reliability of the tight binding of the DNA to the nitrocellulose Filter. The treatment of the nitrocellulose filter after baking prevents non-specific bindings and also ensures reliability. The Washing the nitrocellulose filter after hybridization removes unnecessary, or non-specifically bound, labeled oncogene DNA samples and also contributes to reliability.

Es sind zahlreiche Modifizierungen möglich.Numerous modifications are possible.

Eine quantitative Auswertung des positiven Tests ist möglich.A quantitative evaluation of the positive test is possible.

Eine semiquantitative Auswertung kann auch durchgeführt werden. In diesem Fall wird die Intensität des schwarzen Flecks am Röntgenfilm durch Densitometrie gemessen und können quantitative Vergleiche gemacht werden (Reflectance Densitometer, Bio-Rad, Richmond CA 94804, USA).A semi-quantitative evaluation can also be carried out. In this The intensity of the black spot on the X-ray film is shown by Densitometry is measured and quantitative comparisons can be made (Reflectance Densitometer, Bio-Rad, Richmond CA 94804, USA).

Quantitative test

Wenn ein Blutplasma-DNA mit einer Onkogen Probe einen positiven Test gezeigt hat, kann die relative Menge durch das Dilutionsverfahren bestimmt werden. In diesem Fall wird aus der Blutplasma-DNA eine 1 : 2-Serialverdünnung gemacht und wird jede Verdünnung durch Hybridisierung getestet. Die höchste Verdünnung, aus der noch ein positives Signal ausgeht, ist der Titer. So können bei der Verlaufskontrolle eines Patienten, während der Beobachtungszeit, quantitative Vergleiche durchgeführt werden. Auf diese Weise kann man z. B. die Amplifizierung eines der aktivierten Onkogene beobachten: Wenn während der Verlaufskontrolle der Titer eines Onkogens unproportionell erhöht wird im Vergleich zu anderen Onkogenen, bedeutet das die Amplifizierung dieses Onkogens.If a blood plasma DNA with an oncogene sample does a positive test has shown, the relative amount can be determined by the dilution method will. In this case, the blood plasma DNA becomes a 1: 2 serial dilution made and any dilution is made by hybridization tested. The highest dilution, from which still a positive signal going out is the titer. So during a patient’s follow-up, during the observation period, quantitative comparisons were made will. In this way you can e.g. B. the amplification of a observe the activated oncogenes: if during the follow-up the titer of an oncogene is increased disproportionately compared to other oncogenes, this means the amplification of this oncogene.

Der Test ist positiv:The test is positive:

1. If one of the mutated oncogene samples (oligonucleotide Sample) gives a positive signal with the plasma DNA.
2. If, two or more cellular oncogenes that are not mutated activated, are detectable in the blood plasma.
3. If, the presence of one of the oncogenes that is not by mutation is activated, is detectable in higher titer.

Die Möglichkeiten 2 oder 3 können aber gelegentlich auch in nichtbösartigen Krankheiten vorkommen, besonders in Zuständen mit Fieber und großem Zellabbau. In diesen Fällen wird der Zeitablauf entscheidend sein: In bösartigen Krankheiten bleibt die Positivität, oder steigt sie sogar, während sie in den nicht-bösartigen Fällen abklingt.However, options 2 or 3 can occasionally also be used in non-malicious ones Diseases occur, especially in conditions with fever and large cell degradation. In these cases the timing becomes crucial be: In malignant diseases, the positivity remains or increases even as it subsides in the non-malicious cases.

Im allgemeinen bekommt man einen positiven Test im Fall einer bösartigen Krankheit meistens, wenn die Plasma-DNA erst nur mit der Onkogen- Gruppe A (siehe oben) hybridisierte, weil diese Onkogene in allen bzw. beinahe in allen Sorten von Bösartigkeiten aktiviert sind. Seltener braucht man die Hybridisierung auf die Gruppe B auszuweiten.In general, you get a positive test in the case of a malicious one Disease mostly when the plasma DNA only with the oncogene Group A (see above) hybridized because these oncogenes in all or almost all types of malignancy are activated. Less common the hybridization needs to be extended to group B.

Wenn man die Krebsart kennt (in der Verlaufskontrolle) oder Verdacht hat auf eine Krebsart, kann man solche Onkogene als Proben verwenden, die in dieser Krebsart besonders häufig aktiviert sind. Es werden noch immer neue Onkogene entdeckt. Diese kann man zukünftig gegebenenfalls auch als Probe benutzen.If you know the type of cancer (in the follow-up) or suspected has a cancer, you can use such oncogenes as samples, which are particularly often activated in this type of cancer. There will still be always discovered new oncogenes. This can be done in the future if necessary also use as a sample.

Wenn man aber wissen möchte, welche aktivierten Onkogene in der Blutbahn anwesend sind (Plasma-Onkogen-Profil), muß man die Blutplasma- DNA mit allen Onkogenen von Gruppe A und B und seltener von Gruppe C hybridisieren. Dasselbe muß man tun, wenn man das Erscheinen von neuen Onkogenen in der Blutbahn während der Krankheitsablauf erfassen möchte, was aufgrund der prognostischen und therapeutischen Bedeutung sehr wichtig ist.But if you want to know which activated oncogenes in the Bloodstream are present (plasma oncogene profile), the blood plasma DNA with all oncogenes from groups A and B and less often from group C hybridize. You have to do the same when you see the appearance of new ones Want to capture oncogenes in the bloodstream during the course of the disease, which is very important due to its prognostic and therapeutic importance important is.

Claims

1.Method for examining an acellular biological fluid for the presence of cellular oncogene DNA or its fragments, in which

a) separating the DNA from the acellular biological fluid and immobilizing the DNA on a solid support in denatured form,
b) contacting the solid support with labeled oncogene DNA samples in order to hybridize them with the plasma DNA if there is a complementary sequence, and
c) the product is determined for the presence of labeled DNA.

2. The method according to claim 1, characterized in that the acellular biological fluid is human blood plasma.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the Sample is radioisotopically labeled oncogene DNA.

4. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the Sample not radioisotopically labeled, preferably labeled with biotin Is oncogene DNA.

5. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the Blood plasma before separating the DNA and immobilizing the DNA treated on the solid support with an organic solvent to remove protein material in an organic phase and to get the DNA in the aqueous phase.

6. The method according to claim 3 and 5, characterized in that the Determination of the presence of labeled DNA using autoradiographic Technique is performed.

7. The method according to claim 4 and 5, characterized in that the Determination of the presence of labeled DNA using an enzyme affinity test is carried out by color reaction.

8. The method according to claim 5, characterized in that one as a solid Pure nitrocellulose substrate is used.

9. The method according to claim 5, characterized in that for the immobilization a vacuum is used.

10. The method according to claim 2, characterized in that one

a) contacting the plasma with a detergent and proteolytic enzyme;
b) the product of stage a) is mixed and treated with a protein-denaturing solution such as guanidinium isothiocyanate;
c) extracting the product of step b) with an organic solvent to form an essentially protein-free aqueous phase containing the DNA;
d) contacting the product of step c) with a detergent and a proteolytic enzyme, incubating, and then the extraction of step c) is repeated;
e) the product of stage d) is precipitated with (2 vol) ethanol, washed and dissolved in sterile water;
f) the product of stage e) is subjected to an RNase enzyme treatment and the existing DNA is broken down and removed and the extraction of stage d) is then repeated.

11. The method according to claim 10, characterized in that

a) the product of stage f) is treated and then denatured;
b) the product of stage a) is applied to a solid substrate and immobilized by baking in a vacuum;
c) contacting the solid substrate of step b) with a solution of labeled oncogene DNA sample in order to hybridize it with the DNA immobilizing on the solid substrate;
d) the product of step c) in the case of radioisotopically labeled oncogene DNA sample, determined by autoradiography;
e) the product of step c) in the case of non-isotopically labeled oncogene DNA sample is determined by an enzyme affinity test by a color reaction.

12. The method according to claim 11, characterized in that the solid Stage b) substrate treated for further binding of nucleic acid to prevent it.

13. The method according to claim 11, characterized in that the solid Stage c) substrate washes to labeled non-specifically bound Remove oncogene DNA.

14. The method according to claim 11, 12 or 13, characterized in that the remaining radioactivity associated with the plasma DNA determined by autoradiography.

15. The method according to claim 11, characterized in that the remaining non-radioactive marker substance of the solid Substrate by the hybridization between plasma DNA and the labeled oncogene DNA is bound by means of enzyme affinity residue determined by color reaction.

16. The method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that as an oncogene DNA sample, an individual oncogene DNA or takes a mixture of individual oncogene DNAs.