DE3315195A1 - METHOD FOR ALIGNING PARTICLES IN A FLUID SAMPLE - Google Patents
METHOD FOR ALIGNING PARTICLES IN A FLUID SAMPLEInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ausrichten von Teilchen in einer Fluidprobe.The invention relates to a method for aligning particles in a fluid sample.
Es sind bereits bedeutende Fortschritte zur Automatisierung des Zählens von Blutzellen in einer Serumprobe gemacht worden. Das bekannteste Gerät für Blutzählungen ist der sogenannte Coulter-Zähler bei dem Blutzellen in einer einzigen Reihe durch eine Öffnung geleitet werden und durch die Art, in der sich die elektrischen Eigenschaften an der Öffnung ändern, festgestellt und gezählt werden. Bisher gibt es jedoch keine automatisierten Geräte zum Analysieren und Auswerten von multiplen Zellen, z.B. normalen Zellen, Targetzellen, Sichelzellen usw., die in einem strömenden Fluß einer gegebenen Blutprobe enthalten sein können. Wenn al so Information über multiple Zellen dieser Art erwünscht ist, ist es normal und handelsüblich, diese Angaben dadurch zu erhalten, daß ein Objektträger vorbereitet wird, bei dem die Zellen in einer Bildebene festliegen, und daß eine Bedienungsperson oder eine Maschine, die geeignet ist, Muster zu erkennen, statistisch signifikante Anzahlen von Zellen zählt, während diese, jeweils eine zur Zeit, durch ein Mikroskop auf dem Objektträger betrachtet werden, siehe z.B. US-PS 4 175 860 und k 199Significant advances have been made in automating the counting of blood cells in a serum sample. The best-known device for counting blood is the so-called Coulter counter, in which blood cells are passed in a single row through an opening and are determined and counted by the way in which the electrical properties change at the opening. However, to date there have been no automated devices for analyzing and evaluating multiple cells, for example normal cells, target cells, sickle cells, etc., which can be contained in a flowing stream of a given blood sample. Thus, when information on multiple cells of this type is desired, it is normal and customary to obtain such information by preparing a slide with the cells fixed in an image plane and having an operator or machine appropriate To recognize patterns, count statistically significant numbers of cells while viewing them, one at a time, through a microscope on the slide, see e.g. US Pat. Nos. 4,175,860 and k 199
In den vergangenen Jahren sind bereits Versuche zur optischen Analyse von in einem Strömungsfluß fließenden Partikeln unternommen worden. So zeigen Kay et al., "Journal of Histochemistry and Cytochemistry", Bd. 27, S. 329 (1979) eine Öffnung nach Art von Coulter für in einer einzigen Reihe bewegte Zellen, die auf ein Vidikon vergrößert werden. Außerdem zeigen Kachel et al., "Journal of Histochemistry and Cytochemistry;1 Bd. 27, S. 335, eine Vorrichtung, mit der Zellen in Einzelreihe durch einen mikroskopischen Bereich bewegt werden, wo sie photographiert werden. Von diesen Leuten ist zwar für die Automatisierung der Teilchenanalyse in einer einzigen Reibe Arbeit geleistet worden, aber es istIn recent years, attempts have been made to optically analyze particles flowing in a flow stream. Kay et al., "Journal of Histochemistry and Cytochemistry", Vol. 27, p. 329 (1979) show a Coulter-style opening for cells moving in a single row which are enlarged to a vidicon. In addition, Kachel et al., "Journal of Histochemistry and Cytochemistry; 1 vol. 27, p. 335, show a device with which cells are moved in single rows through a microscopic area where they are photographed. Of these people, while for the Automating particle analysis in a single grater job has been done, but it is
nichts darüber "berichtet worden9 daß eine automatisierte Teilchenanalyse in einem Strömungsfluß "bewerkstelligt wurde, ohne daß dazu die Teilchen in einem Strom in Einfachreihe angeordnet werden mußten, siehe z.B. "Flow Cytometry and Sorting", Melaned et al., John Wiley & Sons 1979, Kapitel 1 und US-PS 3 819 270.nothing has "been reported 9 that automated particle analysis in a flow" was accomplished without the need to arrange the particles in a stream in a single row; see, for example, "Flow Cytometry and Sorting", Melaned et al., John Wiley & Sons 1979 , Chapter 1 and U.S. Patent 3,819,270.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren geschaffen, um Teilchen in einer Fluidprobe auszurichten, die in einer Richtung durch eine Strömungszelle bewegt wird. Die Zelle hat eine Breite und eine Dicke, und zwar jeweils rechtwinklig zur Strömungsrichtung. Jedes der Teilchen der Fluidprobe hat ein Massezentrum. Das Verfahren gemäß der Erfindung sieht vor, die Fluidprobe durch die Strömungszelle zu transportieren. Dabei fließt ein umhüllendes Fluid bzw. Scheidenfluid durch die Strömungszelle in der Strömungsrichtung und befindet sich an einer Seite der Fluidprobe. Der Durchsatz des Scheidenfluids ist so eingestellt, daß die Teilchen im wesentlichen so ausgerichtet sind, daß sich ihre minimale Querschnittsfläche in Querrichtung zur Strömungsrichtung und ihre maximale Querschnittsfläche im wesentlichen parallel zur Breite erstreckt( und daß die Massezentren der Teilchen alle im wesentlichen in einer Ebene liegen.In accordance with the invention, a method is provided for aligning particles in a fluid sample that is moved in one direction through a flow cell. The cell has a width and a thickness, each at right angles to the direction of flow. Each of the particles in the fluid sample has a center of mass. The method according to the invention provides for the fluid sample to be transported through the flow cell. An enveloping fluid or vaginal fluid flows through the flow cell in the flow direction and is located on one side of the fluid sample. The flow rate of the sheath fluid is adjusted so that the particles are substantially oriented such that their minimum cross-sectional area is transverse to the direction of flow and their maximum cross-sectional area is substantially parallel to the width ( and that the centers of mass of the particles are all substantially coplanar .
Wenn die Massezentren der Teilchen im wesentlichen in einer Ebene liegen, können die Teilchen durch eine Mikroskopeinrichtung beobachtet werden, die auf diese eine Ebene scharfeingestellt ist. Ferner können die Teilchen durch Fokussieren des Mikroskops in eine andere als die genannte Ebene optisch getrennt werden, so daß Teilchen einer Größe unscharf sind, während Teilchen einer anderen Größe im wesentlichen in Scharfeinstellung bleiben.If the centers of mass of the particles lie essentially in one plane, the particles can be viewed through a microscope device observed, which is focused on this one plane. Furthermore, the particles can be focused by focusing of the microscope can be optically separated into a plane other than that mentioned, so that particles of one size are out of focus while particles of a different size remain essentially in focus.
Im Folgenden ist die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten anhand eines schematisch dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:The invention is described below with further advantageous details on the basis of an exemplary embodiment shown schematically explained in more detail. In the drawings shows:
Fig. 1 eine perspektivische Ansicht einer Vorrichtung zum Prüfen eines Strömungsflusses gemäß der Erfindung; Fig. 1 is a perspective view of an apparatus for checking a flow flow according to the invention;
Fig. 2 eine Draufsicht auf die in Fig. 1 enthaltene Strömungskammer; FIG. 2 is a plan view of the flow chamber contained in FIG. 1; FIG.
Fig. 3 einen Querschnitt durch die in Fig. 2 gezeigte Vorrichtung in der mit 3-3 bezeichneten Ebene;3 shows a cross section through the device shown in FIG. 2 in the plane designated by 3-3;
Fig. H- ein Schaltschema des im Fall der Vorrichtung gemäß Fig. 1 verwendeten elektronischen Prozessors;FIG. H shows a circuit diagram of the electronic processor used in the case of the device according to FIG. 1; FIG.
Fig. 5 ist eine stark vergrößerte Seitenansicht eines bekannten Verfahrens zum Anordnen von Teilchen auf einem Mikroskop für die Untersuchung·,Fig. 5 is a greatly enlarged side view of a known method of arranging particles on a microscope for examination,
Fig. 6 ist eine stark vergrößerte Seitenansicht der Strömung von Teilchen in der erfindungsgemäßen Vorrichtung in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren.Figure 6 is a greatly enlarged side view of the flow of particles in the apparatus of the present invention in accordance with the method of the invention.
Wie aus den Zeichnungen, insbesondere aus Fig. 1 hervorgeht, weist die Vorrichtung ein Gehäuse 10 auf, welches eine Strömungskammer mit einem Einlaß 12 für eine Fluidprobe, wie Blut oder Urin und einem Auslaß 14 enthält, wobei sich zwischen dem Einlaß und dem Auslaß ein Kanal 16 an einem Abbildungs- bzw. Prüfbereich 18 vorbei erstreckt. Der Kanal 16 hat einen Einlaß mit einer Leitung 20, die zum Anschluß an einen Behälter 22 für Salzlösung geeignet ist. Wie Fig. und 3 zeigen, ist im Einlaß 12 für die Fluidprobe eine Nadel %k im Kanal 16 in Strömungsrlchtung hinter der Leitung 20 vorgesehen, die an einen Behälter 26 angeschlossen ist, der die zu analysierende Fluidprobe enthalten kann.As can be seen from the drawings, in particular from FIG. 1, the device has a housing 10 which contains a flow chamber with an inlet 12 for a fluid sample, such as blood or urine, and an outlet 14, with a space between the inlet and the outlet Channel 16 extends past an imaging or test area 18. The channel 16 has an inlet with a conduit 20 which is suitable for connection to a container 22 for saline solution. As shown in Fig. And 3, is in the inlet 12 for the fluid sample a needle% k in the channel 16 in Strömungsrlchtung behind the line 20 which is connected to a container 26 which may contain fluid to be analyzed sample.
Die Querschnittsfläche wird mit zunehmender Entfernung vom Einlaß 12 zum Abbildungsbereich 18 progressiv kleiner. Die Dicke nimmt gleichfalls vom Einlaß 12 zum Abbildungsbereich 18 ab. Die Breite nimmt vom Einlaß 12 ab und dann erheblich zu zum Abbildungsbereich 18. So hat der Kanal 16, wie aus Fig. 2 und 3 hervorgeht, eine Breite und Tiefe von ca. 5 000 /im"am Einlaß 12 und eine Breite und Tiefe von ca. 5 00 μη an einer Mittelstelle 28 und eine Tiefe von 100 μΐη im Prüfbereich 18, wo die Breite 5 000 um übersteigt.The cross-sectional area increases with increasing distance from Inlet 12 to imaging area 18 progressively smaller. The thickness also increases from inlet 12 to the imaging area 18 from. The width decreases from the inlet 12 and then increases considerably to the imaging area 18. Thus, the channel 16 has, as shown in FIG 2 and 3, a width and depth of approx. 5,000 / in "at the inlet 12 and a width and depth of approx. 5 00 μη at a central point 28 and a depth of 100 μΐη in test area 18 where the width exceeds 5,000 µm.
Es ist klar, daß der Strömungsfluß durch den PrüfbereichIt is clear that the flow flow through the test area
um ein Vielfaches tiefer sein kann als die größten Zellen und die Breite um ein Vielfaches breiter als die breitesten Teilchen, z.B. mehr als hundert mal so breit wie das breiteste Teilchen. Allerdings ist bei einem auf die beschriebene Weise gestalteten Strömungsweg der durch den Einlaß 12 eintretende Strom auf einen stabilen Strömungsweg minimaler Scherung im Prüfbereich 18 eingeschränkt. Vorzugsweise ist die Querschnittsfläche minimaler Scherung nicht bedeutend größer als die minimale Querschnittsfläche der Teilchen, wodurch die Teilchen im Strömungsfluß so ausgerichtet werden, daß ihre minimale Querschnittsfläche sich quer zur Strömungsrichtung erstreckt und ihre maximale Querschnittsfläche parallel zur Breite (d.h. sichtbar in der Ebene der Fig. 2). Der hier verwendete Ausdruck "minimale Scherung" soll das "minimale Geschwindigkeitsgefälle" bezeichnen, so daß ein im Strom bewegtes Teilchen die Tendenz hat, sich mit der Strömungsrichtung auszurichten, ganz ähnlich wie ein in einem Fluß treibender Baumstamm oder Balken sich in Strömungsrichtung ausrichtet, wenn ein Fließgradient besteht. Die im Kanal l6 herrschenden Strömungscharakteristiken können durch Einstellen des Fluiddrucks in den Behältern 22 und 26, entweder automatisch oder durch Einstellen der statischen Höhe derselben, gesteuert werden.can be many times deeper than the largest cells and the width many times wider than the widest particle, e.g. more than a hundred times as wide as the widest Particle. However, in the case of a flow path configured in the manner described, that through the inlet 12 incoming current is restricted to a stable flow path of minimal shear in the test area 18. Preferably the Minimum shear cross-sectional area not significantly larger than the minimum cross-sectional area of the particles, thereby reducing the Particles in the flow are aligned so that their minimum cross-sectional area is transverse to the direction of flow and its maximum cross-sectional area parallel to the width (i.e. visible in the plane of Figure 2). This here The term "minimum shear" used is intended to denote the "minimum velocity gradient" so that a moving in the flow Particle has a tendency to align itself with the direction of flow, much like one floating in a river Tree trunk or beam aligns itself in the direction of flow when there is a flow gradient. The in channel l6 prevailing flow characteristics can be adjusted by adjusting the fluid pressure in containers 22 and 26, either automatically or by adjusting the static level thereof, being controlled.
Auf den Prüfbereich 18 wird ein Mikroskop 30 fokussiert und der Prüfbereich 18 von unten mittels eines Strobe-Lichts 32 beleuchtet, bei dem es sich vorzugsweise um das Modell 3018 der US Scientific Instrument Corporation handelt, welches eine 2UPl.5 Lampe enthält. Der Ausgang des Mikroskops 30 wird auf eine ladungsgekoppelte (CCD-) Kamera 3^ fokussiert, als welche vorzugsweise eine CCD-Kamera des Modells Nr, TCII60BD der Fa. RCA dient. Der Ausgang der ladungsgekoppelten Kamera Jk wird in eine Serie von Steh- bzw. Standbildern umgewandelt, und zum Auswerten dieser Abbildungen sind entsprechende elektronische Prozessoren vorgesehen. Ein hierfür verwendbarer Prozessor ist der unter der Bezeichnung Image Analysis System,A microscope 30 is focused on the test area 18 and the test area 18 is illuminated from below by means of a strobe light 32, which is preferably the model 3018 from the US Scientific Instrument Corporation, which contains a 2UPl.5 lamp. The output of the microscope 30 is focused on a charge-coupled (CCD) camera 3 ^, which is preferably used as a CCD camera of model no. TCII60BD from RCA. The output of the charge-coupled camera Jk is converted into a series of still or still images, and appropriate electronic processors are provided to evaluate these images. A processor that can be used for this is the one known as the Image Analysis System,
Modell C-1285 von Hamamatsu Systems, Inc., Waltham, Massachusetts auf den Markt gebrachte Prozessor. Vorzugsweise liegt der Ausgang der ladungsgekoppelten Kamera 3^ &n einem elektronischen Prozessor 36 an, der in Fig. 4 mehr im einzelnen gezeigt ist, und zu dem ein schwarzweiß Fernsehüberwachungsgerät „ d.h. ein Monitor 38 sowie ein Bilderfasser gehört, der Standbilder des mittels der ladungsgekoppelten Kamera betrachteten Objekts speichert. Der Bilderfasser 40 ist vorzugsweise ein als Modell FG08 von der Matrox Corporation, Montreal, vertriebener Bilderfasser, dessen Ausgang an einem Bildwiederholspeicher 42, Modell RQB 256 der Matrox Corporation anliegt, die beide mit einem Multibus 44Model C-1285 from Hamamatsu Systems, Inc., Waltham, Massachusetts processor put on the market. Preferably, the output of the charge coupled camera is 3 ^ & n one electronic processor 36, which is shown in more detail in FIG and to which a black and white television monitor "i.e. a monitor 38 and an image capture device." that stores still images of the object viewed by the charge-coupled camera. The Image Compiler 40 is preferably an imager sold as Model FG08 by Matrox Corporation, Montreal, the output of which is on a frame buffer 42, model RQB 256 from Matrox Corporation, both with a Multibus 44
einer Zentraleinheit 46 gekoppelt sind, als welcher vorzugsweise ein Intel 80/20 Computer dient. Der Multibus 44 ist außerdem mit einem 48K Speicher 48 mit direktem Zugriff der Electronics Solutions Inc. und mit einem 16ka central unit 46 are coupled, which is preferably an Intel 80/20 computer. The multibus 44 also comes with 48K memory 48 with direct access from Electronics Solutions Inc. and with a 16k
Dual-Port-Speicher 50 mit direktem Zugriff, Modell RM"11.7 der Data Cube Corporation^verbunden. Der Ausgang des Bildwiederholspeichers liegt außerdem an einem Farbmonitor 52 an, der benutzt werden kann, um digital aufbereitete Videobilder einzelner Standbilder zwecks menschlicher Untersuchung zu liefern.Dual port memory 50 with direct access, model RM "11.7 of the Data Cube Corporation ^ connected. The output of the frame buffer is also connected to a color monitor 52 which can be used to deliver digitally processed video images of individual still images for the purpose of human examination.
Der zweite Ausgang des Dual-Port-Speichers 50 mit direktem Zugriff ist mit einemThe second output of the dual port memory 50 with direct access is with a
Multibus 54 verbunden^ der auch verbunden ist mit einer Zentraleinheit (CPU) 56 der Applied Micro Devices, einem 48K Speicher 58 mit direktem Zugriff der Electronics Solutions, Inc. sowie mit einem entnehmbaren Speicher in Form eines Floppy-Disc-Controller 60, ζ-·Β. demMultibus 54 connected ^ which is also connected to a Central processing unit (CPU) 56 from Applied Micro Devices, a 48K memory 58 with direct access to electronics Solutions, Inc. and with a removable memory in the form of a floppy disc controller 60, ζ- · Β. to the
Modell 8/8 der Advanced Micro Devices sowie zwei Einheiten .eines Shugart Floppy-Disc-Speichers 62.Model 8/8 of the Advanced Micro Devices and two units Shugart floppy disk storage 62.
Zur Weiterverarbeitung von Bildern mit der in Fig. 4 gezeigten Vorrichtung kann auf vielfältigste Weise programmiert werden, je nach der besonderen Aufgabe, die ein Be-For further processing of images with the device shown in FIG. 4, programming can be carried out in the most varied of ways depending on the particular task that a
nutzer durchführen möchte. Wie schon erwähnt, kann die Programmierung des Hamamatsu Systems 1285 verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch wie folgt programmiert ιuser wants to perform. As already mentioned, programming can of the Hamamatsu System 1285 can be used. However, programming is preferably carried out as follows
Die Aufgaben werden zunächst unterteilt in diejenigen, die jedes Bildeleraent einer gegebenen Abbildung adressierenThe tasks are first divided into those that address each image element of a given image
müssen, und diejenigen, die nur eine kleine Untermenge des Gesamten adressieren müssen. Da für die erste Klasse von Aufgaben viel Zeit aufgewendet wird, werden sie in Assemblersprache am Schnittstellen-Prozessor 46 (dem Intel 80/20 gemäß Fig. k) programmiert. Der Ausgang dieser Operationen wird dann über den Dual-Port-Speicher 50 mit direktem Zugriff an die Hauptmaschine, nämlich die Zentraleinheit 56 weitergegeben. Auf Seiten der Hauptmaschine wird nahezu die gesamte notwendige Programmierung zweckmäßigerweise in einer Sprache höheren Niveaus, z.B. Pascal vorgenommen (im Prinzip wäre auch BASIC oder FORTRAN geeignet). Zu den Arten von Aufgaben, die in Assemblersprache gelöst werden, gehören Grauskalen-Transformationen, Konvolutionen, und Grauskalen-Histogrammberechnungen. Zu den an der Hauptmaschine durchgeführten Aufgaben gehört die Gesamtsteuerung der anderen Vorrichtungen, die Identifizierung und Segmentierung des interessierenden Objekts im Gesichtsfeld, die Berechnung von derartigen Objekten zugeordneten Parametern sowie das Formatieren des Ausgangs der erzielten Ergebnisse. Eine andere Art, die Trennung der Aufgaben in dieser Weise zu betrachten, besteht darin, Aufgaben, die mit größerer Geschwindigkeit durchgeführt werden müssen als der einer menschlichen Bedienungsperson, in Assemblersprache durchzuführen. Aufgaben, die entweder kompliziert sind oder mit weniger als der maximalen Geschwindigkeit durchgeführt werden können, kann man in der höheren Sprache programmieren. Objekte werden im Gesichtsfeld hauptsächlich dadurch aufgefunden, daß eine Grauskalen-Fenster funk ti on für Werte eingestellt wird, von denen bekannt ist, daß sie für das gewünschte Objekt charakteristisch sind. Diese Werte können entweder aufgrund früherer Kenntnis oderand those who only need to address a small subset of the whole. Since a lot of time is expended for the first class of tasks, they are programmed in assembly language on the interface processor 46 (the Intel 80/20 according to FIG. K). The output of these operations is then passed on via the dual-port memory 50 with direct access to the main machine, namely the central processing unit 56. On the main machine side, almost all of the necessary programming is expediently carried out in a higher-level language, e.g. Pascal (in principle, BASIC or FORTRAN would also be suitable). The types of tasks solved in assembly language include gray scale transforms, convolutions, and gray scale histogram calculations. The tasks performed on the main machine include overall control of the other devices, identifying and segmenting the object of interest in the field of view, calculating parameters associated with such objects, and formatting the output of the results obtained. Another way of looking at the separation of tasks in this way is to use assembly language to perform tasks that must be performed at a faster rate than that of a human operator. Tasks that are either complicated or can be performed at less than maximum speed can be programmed in the higher language. Objects are found in the field of view primarily by setting a gray scale window function for values known to be characteristic of the desired object. These values can either be based on previous knowledge or
anhand allgemein bekannter Histogrammtechnilcen festgesetzt werden. Wenn ein zu einem Objekt gehörendes Bildelement im Gesichtsfeld lokalisiert worden ist, wird ein Randbestimmungsprogramm ausgelöst, um das ganze diesem Bildelement zugehöriga Objekt zu umreißen. Sobald der Rand gefunden worden ist, können viele relevante Parameter, beispielsweise die Lage, Fläche, die integrierte optische Dichte und verschiedene Momente ohne weiteres berechnet werden. Anhand dieser abgeleiteten Parameter kann mittels der üblichen Entscheidungstheorie die Wahrscheinlichkeit der Mitgliedschaft in zuvor definierten Untergruppen bestimmt werden. Definitionen für die Klassifizierung der Blutzellenmorphologie , werden von geschulten Beobachtern festgelegt. Diese Befinitionen werden dann als Basis der gewählten Algorithmen verwendet. Die Exaktheit der Methode wird anhand eines Vergleichs der Maschinenergebnisse mit denen geschulter Beobachter festgestellt, die die gleichen Proben untersuchen. Die Ausgabe der Ergebnisse kann so programmiert sein, daß sie in einer großen Vielfalt von Formaten erfolgt, Histogramme, Kurvendarstellungen und lÄbellenartige Zusammenfassungen stehen für besondere Erfordernisse zur Verfügung.based on well-known histogram techniques will. When a picture element belonging to an object has been located in the field of view, an edge determination program is used triggered to outline the entire object belonging to this picture element. Once the edge has been found can be many relevant parameters, for example the location, area, the integrated optical density and various Moments can be calculated without further ado. These derived parameters can be used by means of the usual decision theory the probability of membership in previously defined subgroups can be determined. Definitions for the classification of blood cell morphology, are determined by trained observers. These definitions are then used as the basis of the selected algorithms. The accuracy of the method is based on a comparison of the machine results with those of trained observers examining the same samples. The edition the results can be programmed to come in a wide variety of formats, histograms, graphs and table-style summaries are available for special needs.
Es seigt sich also, daß bei der Strömungszelle 10 der Teilchenstrom im Abbildungsbereich 18 zwei Dimensionen hat. Es kann also mehr als ein Teilchen in einem einzigen Feld beobachtet werden, und verschiedene Teilchen können optisch unterschieden werden» was eine Reihe wichtiger Vorteile bringt. Z.B. können zwei zusammenfließende Zellen optisch erkannt werden, während ©in Coulter-Zähler sie nur als eine einzige Zelle von doppelter Größe erkennen kann. Außerdem können die Standbilder mit digitalen Bildaufbereitungstechniken aufbereitet werden« die für Satellltenphotos entwickelt worden sind, und die einzelnen Bilder können analysiert werden, um Daten über individuelle Zellen zu erhalten. Für eine Blutprobe können Informationen über die Größe, Querschnittsfläche, Gestalt (kreisförmige Zelle, Targetselle, Sichelselle usw*) die optische Dicht©« den Häxnogl ob ingehalt aufIt thus appears that in the flow cell 10 the particle flow in the imaging area 18 has two dimensions. So more than one particle can be observed in a single field and different particles can be distinguished optically »which has a number of important advantages brings. E.g. two confluent cells can be recognized optically, while in Coulter counters they are only recognized as one can see a single double-sized cell. In addition, the still images can be processed using digital imaging techniques are processed «which are developed for satellite photos and the individual images can be analyzed to obtain data on individual cells. For one Blood sample can contain information about the size, cross-sectional area, shape (circular cell, target cell, sickle cell etc. *) the optical seal © «the Häxnogl whether content
Zellenbasis usw. erhalten werden. Es können nicht nur einzelne Zellen auf diese Weise analysiert und optisch sortiert werden, sondern es können nach dem Analysieren und Sortieren auch verschiedene Arten von Zellen individuell gezählt werden, um selbsttätig und in einem einzigen Durchlauf die Anzahl normaler roter Zellen pro Volumen der Probe, die Anzahl roter Targetzellen pro Kubikzentimeter der Probe, die Anzahl roter Sichelzellen pro Kubikzentimeter der Probe, die Anzahl weißer Zellen, die Anzahl Blutplättchen usw. pro Kubikzentimeter der Probe zu erhalten.Cell base, etc. can be obtained. Not only can individual cells be analyzed and optically sorted in this way, instead, after analyzing and sorting, different types of cells can also be counted individually in order to automatically and in a single run the number of normal red cells per volume of the sample, the number of red target cells per cubic centimeter of the sample, the number of red sickle cells per cubic centimeter of the sample, the number of whites Cells, platelet counts, etc. per cubic centimeter of sample.
Sobald eine Reihe von Standbildern in digital verarbeiteter Form vorliegt, kann je nach dem komplexen Charakter von Rechnern und Software, die zur Analyse der Bilder zur Verfügung stehen, eine große Vielfalt an sehr hochwertigen Angaben über die Teilchen in der Serie von Bildern erhalten werden.Once a series of still images is available in digitally processed form, depending on the complex nature of computers and software available to analyze the images, a wide variety of very high quality information about the particles in the series of images.
Vorzugsweise werden die von Standbildern abgeleiteten Informationen kombiniert, um zusammengesetzte Informationen zu erhalten, die den Gehalt der vielfachen Standbilder und/oder vorherbestimmter Bezugsbilder reflektieren, wobei die so erhaltenen zusammengesetzten Informationen auf verschiedenste Weise genutzt werden können. Im Fall einer einfachen Anlage kann die Information ausgedruckt werden, um z.B. dem Hamatologen Informationen über mehrfache Messungen an einer Blutprobe zu geben. Bei komplexeren Anlagen können die zusammenaesetzten MessungenPreferably the information derived from still images combined to obtain composite information representing the content of the multiple still images and / or predetermined Reflect reference images, the composite information thus obtained being used in a wide variety of ways can be. In the case of a simple system, the information can be printed out, e.g. to give information to the hematologist to give over multiple measurements on a blood sample. In the case of more complex systems, the combined measurements
zur Prozeßsteuerung genutzt werden, z.B. für den Druck in einer Homogenisiervorrichtung, die Temperatur in einer Kristallisiervorrichtung, oder die Nahrungsmittelzufuhrrate in einer Mikrobenkultur, wobei die Anlage die Teilchengröße oder Anzahl überwacht.can be used for process control, e.g. for printing in a homogenizer, the temperature in a crystallizer, or the food feed rate in a microbial culture, with the system monitoring the particle size or number.
Es ist ersichtlich, daß die Vorrichtung für die Analyse der verschiedensten optisch wahrnehmbaren Teilchen genutzt werden kann, die sich in einem Strom bewegen, und zwar biologische Teilchen, wie Zellen in Blutj oder Zellen, Bakterien,It can be seen that the device is used for the analysis of a wide variety of optically perceptible particles moving in a stream, namely biological particles such as cells in blood or cells, bacteria,
Zylinder/und Kristalle in Urin oder Teilchen in Gasanalysati ons vorrichtungen usw.. Der Ausgang dieser Messungen kann für die Prozeßsteuerung genutzt werden, beispielsweise für die Abgabe von Nahrungsmitteln in einen Strom, der Mikroorganismen enthält, wie oben erwähnt, oder die Steuerung des Wachstums von Polymerisaten und Kristallen und dgl..Cylinders / and crystals in urine or particles in gas analysis ons devices etc. The output of these measurements can be used for process control, for example for dispensing food into a stream containing microorganisms, as mentioned above, or control the growth of polymers and crystals and the like.
Fig. 5 zeigt das bekannte Verfahren zur Prüfung von Teilchen in einer Fluidprobe. Typischerweise sind die mit a, b und c bezeichneten Teilchen auf einem Objektträger 100 eines Mikroskops angeordnet. Jedes der Teilchen a, b und c hat ein Massezentrum, welches jeweils mit A, B bzw. C bezeichnet ist. Aus Fig. 5 geht hervor, daß bei insgesamt auf dem Objektträger 100 angeordneten Teilchen a, b und c die Massezentren A, B und C nicht in einer Ebene liegen. Um also die Teilchen a, b und c zu betrachten, muß zunächst das Mikroskop auf ein Teilchen a in einer Ebene parallel zum Objektträger 100, die sich durch das MasseZentrum A erstreckt, scharfeingestellt werden. Um das Teilchen b zu betrachten, muß das Mikroskop so eingestellt werden, daß es in einer Ebene parallel zum Objektträger 100 scharfeingestellt ist, die sich durch das Massezentrum B erstreckt. Ähnlich muß das Mikroskop zur Beobachtung des Teilchens c eingestellt werden.Fig. 5 shows the known method for testing particles in a fluid sample. Typically, the particles labeled a, b, and c are on a slide 100 a microscope arranged. Each of the particles a, b and c has a center of mass denoted by A, B and C, respectively is. From Fig. 5 it can be seen that with a total of arranged on the slide 100 particles a, b and c the Centers of mass A, B and C do not lie in one plane. So in order to consider the particles a, b and c, the first thing to do is Microscope on a particle a in a plane parallel to the slide 100, which extends through the center of mass A, be focused. To consider the particle b, the microscope must be adjusted so that it is focused in a plane parallel to the slide 100, which extends through the center of mass B. Similarly, the microscope must be adjusted to observe the particle c.
Im Gegensatz dazu werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Teilchen ausgerichtet, während sie sich durch die Strömungszelle 10 bewegen. Die Teilchen a, b und c in der Fluidprobe werden in der durch Pfeil 110 angedeuteten Richtung durch die Strömungszelle 10 bewegt. Außerdem wird durch die Strömungszelle 10 gleichfalls in Richtung des Pfeils UO ein Scheidenfluid geleitet, welches die Fluidprobe umhüllt. Der Durchsatz des umhüllenden Fluids oder der Fluidprobe oder beide können so gesteuert werden, daß die Strömung beider Fluide im laminaren Bereich liegt, d.h. mit nur geringen oder gar keinen Turbulenzen. Ferner ist der Durchsatz jedes FluidsIn contrast, in the method according to the invention, the particles are aligned as they move through the flow cell 10 move. Particles a, b, and c in the fluid sample are moved in the direction indicated by arrow 110 moved through the flow cell 10. In addition, a through the flow cell 10 is also in the direction of the arrow UO Passed vaginal fluid, which envelops the fluid sample. The flow rate of the enveloping fluid or the fluid sample or both can be controlled in such a way that the flow of both fluids is in the laminar range, i.e. with little or no flow no turbulence. Further is the flow rate of each fluid
oder "beider so gesteuert, daß die Teilchen a, b und c sich im wesentlichen so ausrichten, daß die minimale Querschnittsfläche sich in Querrichtung zur Richtung 110 und die maximale Querschnittsfläche sich im wesentlichen parallel zur Breite der Strömungszelle 10 erstreckt, wobei die Massezentren A, B und C der Teilchen a, b bzw. c alle im wesentlichen in einer Ebene 12 0 im Prüfbereich 18 liegen. Wenn die Teilchen a, b und c so im Prüfbereich 18 ausgerichtet sind, kann das Mikroskop 30 so eingestellt werden, daß es in der einen Ebene 120 scharfeingestellt ist. Dann sind alle Teilchen a, b und c in Scharfeinstellung, wenn sie durch das Mikroskop 30 betrachtet werden. Gemäß einer Alternative kann der Durchsatz des umhüllenden Fluids so geändert werden, daß die Teilchen bewegt werden, um die Brennebene zu verlagern, damit die Teilchen im Brennpunkt sind.or "both controlled so that the particles a, b and c are align essentially so that the minimum cross-sectional area is transverse to direction 110 and the maximum Cross-sectional area extends substantially parallel to the width of the flow cell 10, with the centers of mass A, B and C of the particles a, b and c all lie essentially in a plane 120 in the test area 18. When the particles a, b and c are aligned in the test area 18, the microscope 30 can be adjusted so that it is in one plane 120 is in focus. Then all particles a, b and c are in focus when viewed through microscope 30 to be viewed as. According to an alternative, the flow rate of the enveloping fluid can be changed so that the particles be moved to shift the focal plane so that the particles are in focus.
Ferner kann bei im wesentlichen in einer Ebene 120 liegenden Massezentren A, B und C der Teilchen a, b bzw. c ein Verfahren zur optischen Trennung der Teilchen angewandt werden. Wie Fig. 6 zeigt, kann das Mikroskop 30 so eingestellt werden, daß es auf eine Ebene 122 scharfeingestellt ist, die sich von der genannten Ebene 120 unterscheidet. Die Ebene 122 verläuft überhaupt nicht durch das Teilchen a. Durch das Mikroskop30 betrachtet ist also Teilchen a nicht scharfeingestellt. Da jedoch die Teilchen b und c beträchtlich größer sind als das Teilchen a würde die Ebene 122, auf die das Mikroskop30 scharfeingestellt ist, die Teilchen b und c im wesentlichen scharfeingestellt präsentieren. Da das Teilchen a nicht scharfeingestellt ist, reicht sein Grauskalen-Niveau unter Umständen nicht aus, um das Randbestimmungsprogramm des elektronischen Prozessors 3& auszulösen. Eine Verlagerung der Brennebene, die kleinere Teilchen unscharf eingestellt erscheinen läßt, führt also zu einer optischen Trennung der Teilchen. Ferner werden vermutlich kleinere Teilchen, wie Bakterien weniger von der Hydrodynamik der Strömungszelle 10 beeinflußt. Mit anderen Worten, sie werden weniger durch dieFurthermore, in the case of centers of mass A, B and C lying essentially in one plane 120, the particles a, b and c can be a Methods for the optical separation of the particles can be used. As FIG. 6 shows, the microscope 30 can be adjusted so that that it is focused on a plane 122 which differs from said level 120. The plane 122 does not run through the particle a at all. By the Considered microscope30, particle a is not focused. However, since the particles b and c are considerably larger as the particle a, the plane 122 on which the microscope 30 is focused would be the particles b and c essentially Present in focus. Since the particle a is not in focus, its gray scale level is sufficient may not work to trigger the electronic processor 3 & edge determination program. A shift in the The focal plane, which makes smaller particles appear out of focus, leads to an optical separation of the Particle. Furthermore, smaller particles, such as bacteria, are likely to be less affected by the hydrodynamics of the flow cell 10 influenced. In other words, they get less from that
Gestalt der Strömungszelle 10 beeinflußt, um sich mit ihren Querschnittsflächen in Strömungsrichtung auszurichten. Teilchen wie Bakterien werden vermutlich von der Brown'sehen Bewegung beeinflußt. Da die durch die Hydrodynamik der Strömungszelle 10 "beeinflußten Teilchen der Fluidprobe im wesentlichen in einer Ebene 120 liegen, kann die Ebene, auf die das Mikroskop 30 scharfeingestellt ist, verlagert werden, um die Teilchen in der einen Ebene 12 0 unscharf erscheinen zu lassen und stattdessen auf die Bakterien in einer anderen Ebene fokussiert werden. Auch auf diese Weise wird eine optische Trennung der Teilchen erreicht.Affected shape of the flow cell 10 to align with their cross-sectional areas in the flow direction. Particles like bacteria are believed to be from the Brown's motion influenced. Since the particles of the fluid sample influenced by the hydrodynamics of the flow cell 10 "are essentially lie in a plane 120, the plane on which the microscope 30 is focused can be shifted, to make the particles in one plane appear blurred and instead focus on the bacteria in another Level to be focused. In this way, too, becomes a optical separation of the particles is achieved.
Es gibt eine Reihe von Anwendungsfällen für das erfindungsgemäße Verfahren, z.B. die Analyse von Blut oder Urin als Fluidproben. Wenn Blut als Fluidprobe dient, sind die roten Blutkörperchen kleiner als die weißen Blutkörperchen. So kann gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren ein rotes Blutkörperchen optisch vom weißen Blutkörperchen getrennt werden, indem das rote Blutkörperchen unscharf und das weiße Blutkörperchen im wesentlichen scharfeingestellt wird. Wenn Urin als Fluidprobe dient, können Zellenpartikel, z.B. Blutzellen oder Epithelzellen von Zylindern /ge^brennt werden, da diese viel größer sind als die zuerst genannten.There are a number of applications for the method according to the invention, for example the analysis of blood or urine as Fluid samples. When blood is used as the fluid sample, the red blood cells are smaller than the white blood cells. So can optically separate a red blood cell from the white blood cell according to the method described above by making the red blood cell out of focus and the white blood cell essentially in focus. if Urine serves as a fluid sample, cell particles, e.g. blood cells or epithelial cells of cylinders / ge ^ burned, because these are much larger than the first mentioned.
Eine Abwandlung der erfindungsgemäßen Verfahren sieht vor, ein zweites Hüllfluid durch die Strömungszelle 10 zu leiten. Der Durchsatz der beiden umhüllenden Fluide und des Probenfluids wird dabei so eingestellt, daß die Massezentren der Teilchen im wesentlichen in einer Ebene liegen. Jedes der umhüllenden Fluide fließt in einer Ebene im wesentlichen parallel zur Breite der Strömungszelle 10, wobei die Breite ein Vielfaches der Dicke ausmacht.A modification of the method according to the invention provides for a second envelope fluid to be passed through the flow cell 10. The throughput of the two enveloping fluids and the sample fluid is adjusted so that the centers of mass Particles lie essentially in one plane. Each of the enveloping fluids essentially flow in a plane parallel to the width of the flow cell 10, the width being a multiple of the thickness.
Die erfindungsgemäßen Verfahren haben viele Vorteile. Der wichtigste besteht darin, daß bei scharfeingestellten Teilchen der maximale Kontrast erreicht wird. Die maximale Rand-The methods of the invention have many advantages. The most important is that in the case of focused particles the maximum contrast is achieved. The maximum edge
intensität jedes Teilchens liegt in der Abbildungsebene. Ferner braucht bei in einer Ebene liegenden Massezentren der Teilchen das Mikroskop 30 nicht zur Beobachtung jedes Teilchens neu eingestellt zu werden. Schließlich ist bei im wesentlichen in einer Ebene liegenden Massezentren der Teilchen auch eine optische Trennung der Teilchen möglich. Die Verlagerung der Brennebene kann absichtlich so beeinflußt werden, daß die Randintensität der kleineren Teilchen diffus wird, während die größeren Teilchen scharfeingestellt bleiben. Ferner kann die Verlagerung der Brennebene eine Diffusion selbst all derjenigen Teilchen hervorrufen, die in der einen Ebene 12 0 liegen, und das Mikroskop kann auf die kleineren Teilchen fokussiert werden, die nicht durch die Hydrodynamik der Strömungszelle 10 beeinflußt werden und in einer anderen Ebene liegen.intensity of each particle lies in the plane of the image. It also needs centers of mass in one plane the microscope 30 does not allow the observation of each of the particles Particle to be readjusted. Finally, the particles have centers of mass lying essentially in one plane optical separation of the particles is also possible. The shift in the focal plane can be intentionally influenced in this way The edge intensity of the smaller particles becomes diffuse, while the larger particles are focused stay. Furthermore, the shift in the focal plane can cause diffusion even of those particles that are in of the one plane 12 0, and the microscope can be focused on the smaller particles that do not pass through the Hydrodynamics of the flow cell 10 are influenced and lie in a different plane.
Claims (17)
dadurch gekennzeichnet,Method for aligning particles in a fluid sample which is moved in one direction through a flow cell which has a width and a thickness at right angles to this direction, each particle of which has a center of mass,
characterized,
dadurch gekennz ei chne t,sample moving in a direction through a flow cell each having a width and a thickness perpendicular to the direction in an imaging area, wherein a microscope device is aligned for observing the particles in the imaging area and each of the particles has a center of mass,
characterized,
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