DE3026185A1 - Zusammensetzung geeignet zur untersuchung biologischer gewebe und/oder fluessigkeiten und verfahren zu deren anwendung - Google Patents

Zusammensetzung geeignet zur untersuchung biologischer gewebe und/oder fluessigkeiten und verfahren zu deren anwendung

Info

Publication number
DE3026185A1
DE3026185A1 DE3026185A DE3026185A DE3026185A1 DE 3026185 A1 DE3026185 A1 DE 3026185A1 DE 3026185 A DE3026185 A DE 3026185A DE 3026185 A DE3026185 A DE 3026185A DE 3026185 A1 DE3026185 A1 DE 3026185A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
dye
cells
sample
dyes
series
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE3026185A
Other languages
English (en)
Other versions
DE3026185C2 (de
Inventor
Vittorio Roma Baroncelli
Ivo Giannini
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eni SpA
Original Assignee
Eni SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eni SpA filed Critical Eni SpA
Publication of DE3026185A1 publication Critical patent/DE3026185A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3026185C2 publication Critical patent/DE3026185C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/10—DNA staining
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts
    • G01N2333/395—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts from Saccharomyces

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Description

Case 1244-
E.Έ.I. Ente Nazionale r.drocarburi, Rom, Italien
Zusammensetzung, geeignet zur Untersuchung biologischer Gewebe und/oder Flüssigkeiten und Verfahren zu deren Anwendung
Die Erfindung betrifft eine spezielle Zusammensetzung, die dazu geeignet ist, biologische Gewebe und/oder Flüssigkeiten zu untersuchen, das heißt, auf die Anwesenheit von darin enthaltenen, speziellen Bestandteilen. Sie betrifft auch das Untersuchungsverfahren unter Anwendung dieser Zusammensetzung. Zum völligen Verständnis der Gegenstände der Erfindung seien im folgenden einige allgemeine Ausführungen zur theoretischen Grundlage des Gegenstands der Erfindung gemacht.
Wenn eine Substanz sichtbares Licht oder Ultraviolettl:.cht absorbiert, so ist es bekannt, daß ein darin enthaltenes Elektron von seinem Grundzustand in einen angeregten "Slagulett"-Zustand übergeht.
Ein "Iatersystem-Crossing" kann stattfinden, wobei metastabile "'Triplett"-Zustände entstehen, in denen das Elektron gefangen bleibt, bis eine Energieabfuhr erfolgt, durch eine Löschungsreaktion (durch Zusammenstoß mit einem anderen Kolekül) oder durch Lichtemission (Phosphoreszenz) und/oder andere Vorgänge, von denen alle relativ langsam verlaufen.
Die Phänomene werden leicht in verschiedenen Kategorien natürlicher und synthetischer Farbstoffe bestimmt.
130012/0622
Eine weitverbreitete Methode zur Untersuchung und quantitativen Bestimmung dieser Phänomene ist die sogenannte Flashfotolysemethode, bei der die Probe, die die zu untersuchende Suostanz enthält, der Bestrahlung einer pulsierenden Lichtquelle (Flash bzw. Blitz) unterzogen wird, die eine diskrete Anzahl gefärbter Moleküle in den angeregten Elektronenzastand bringt. Die Entwicklung der vorstehenden Yorgänge beobachtet man durch Feststellen der Absorption eines kontinuierlichen monochromatischen Lichtstrahls durch die Probe, der durch eine geeignete 3lektronische Vorrichtung (Oscilloskop, usw.) gegen die Zeit aufgezeichnet wird.
Diese Verfahrensmethode hat sich während der letzten Jahre qualitativ beträchtlich weiter entwickelt im Hinblick auf eine höhere Empfindlichkeit, die unter Verwendung von pulsierenden Lasern als Ströungsquelle erzielbar ist. Es ist nicht bekannt, Methoden des vorstehenden Typs zur Untersuchung und Charakterisierung biologischer Gewebe und/oder Flüssigkeiten zu verwenden mit der Ausnahme des Falls, daß das zu untersuchende Gewebe eine große Menge einer fotoempfindlichen, natürlichen Substanz enthält, wie im Falle der Pigmente der Chlorophyllfotosynthese, von Ehodopsin und Carboxyhämoglobin.
Im Falle eines Gewebes, das jedoch nur leicht gefärbt ist, erfolgt mit dem Blitzlicht bevorzugt eine Diffusion im Gegensatz zu einer Absorption. Jedoch kann das Gewebe mit synthetischen Farbstoffen gefärbt werden, wie dies bei den optischen Untersuchungsmethoden mit dem Mikroskop üblich ist. Da in diesem Falle der Farbstoff zu einer erfolgreichen Färbung des Gewebes führt, bedeutet dies, daß er in einer gewissen Weise daran gebunden wird.
Jedoch bestehen zumindest zwei grundlegende Schwierigkeiten bei der Verwendung der Flash- bzw» Plitzfotolysetechniken in diesem Zusammenhang in Proben mit starken Diffusionseffekten.
Da erstens die Konzentrationen an gebundenem Farbstoff ziemlich gering sind, war es zweifelhaft, ob bedeutsame Signale unter Verwendung dieser Methode erhältlich s:ad. Zweitens war es nicht
130012/0°22
vorher sehbar, daß Signale, die durch Absorptionscharakteristika der metastabilen Zustände des Tarbstoffs hervorgerufen werden, im !"alle eines Farbstoffs, der an ein spezielles Gewebe gebunden ist, unterschiedlich sind von denen die von Molekülen in Lösung oder unterschiedlich gebunden stammen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß es laöglich ist, diese beiden Schwierigkeiten auszuschalten, wenn man Addukte des Bestandteils des betreffenden biologischen Geweben und/oder der betreffenden biologischen Flüssigkeit mit einem Farbstoff bildet, der synthetisch ist oder zumindest in physiologischen Fluiden bzw. Flüssigkeiten oder Lösungen nicht vorhanden ist, durch Inkontaktbringen einer zu untersuchenden Probe, mit einer Zusammensetzung, die den ersten Gegenstand der Erfindung bildet und die aus einem Farbstoff, einem Medium, das mit dem biologischen Gewebe und/oder der biologischen Flüssigkeit verträglich ist und einer Substanz besteht, die dazu geeignet ist, Energie aus den Farbstoffmolekülen abzuführen, wenn sie damit zusammenstößt (Löschung).
Wie erwähnt, wird die Zusammensetzung, die das Addukt mit dem physiologischen Bestandteil bildet, gebildet durch a) einen Farbstoff, ausgewählt aus den Azin-, Oxazin-, Acrid:n- oder Xanthenreihen, oder aus gewissen wasserlöslichen FarDstoffen der "Diazo"-Reihen oder Tripheny!methan bzw. Triphenylmethanfarbstoffen;b) ein Medium, das mit dem physiologischen Bestandteil verträglich ist und gebildet wird aus einer wäßrigen Lösung, die verschiedene Salze enthält, wie UaCl, CaCl- und dergleichen, in einer derartigen Konzentration, daß sie etwa isotonisch mit dem physiologischen Bestandteil ist (0,1-1 Gew.-%) sowie anderen Komponenten in geringerem Anteil, wie Glucose, Puffergemische usw., zugesetzt derart, daß die Vitalität der vorhandenen Zellen konditioniert wird, der pH-Wert des Mediums geeignet ist, um in einem gewissen Grad um die Neutralität zu variieren (von pH 4,5 bis zum pH 955) und geringer Mengen organischer Lösungsmittel, die zugesetzt werden können, um die Löslichkeit des Farbstoffs zu erhöhen; und c) ein Löschungsmittel bzw. "Quencher" (d. h., welches eine rasche Ent-Energetisierung der Farbstoffmoleküle.
130012/0622
bewirkt, wenn die zwei Moleküle miteinander zusammenstoßen), bei dem es sich um Kalium- (oder Natrium-) jodid (10"" "bis 0,2 m) oder das Salz eines ρ ar cunagne tischen Übergangsmetalls (10 bis 0,2 m Co, Fe, Ni, gewählt in der Form von beispielsweise CoCIo oder dergleichen) handeln kann, möglicherweise in Anwesenheit einer chelatbildenden Substanz, wie Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA); oder kann die verwendete Löschsubstanz ("Quencher") eine definierte Menge von molekularem Sauerstoff (Op)» gelöst in Wasser sein (beispielsweise durch Sättigung der Lösung der Probe mit O- bei einer bestimmten Temperatur).
Die vorstehend genannte Zusammensetzung wird verwendet zur Durchführung eines UntersuchungsVerfahrens für biologische Gewebe und/oder Flüssigkeiten, welches seinerseits einen zweiten Gegenstand der Erfindung bildet.
Dieses Verfahren besteht darin, daß man zunächst die zu untersuchende Substanzprobe mit der Zusammensetzung behandelt, die resultierende SuDstanz mittels einer ersten Strahlungsquelle von pulsierendem Licht bestrahlt, die so behandelte Probe mit einem zweiten Lichtstrahl von monochromatischem Licht durchstrahlt und ' die austretende optische Intensität des letzteren als Funktion der Zeit analysiert.
Es hat sich gezeigt, daß auf diese Weise die von der Absorption der metastabilen Zustände der Farbstoffmoleküle, die in die zu untersuchenden Zellen gebunden sind, stammenden Signale, deutlich unterschiedlich sind in der Amplituden- und/oder Zeitänderung von solchen^ die von den Molekülen in Lösung oder von anderen Zellen stammen.
Die Methode führt somit erfolgreich zur Charakterisierung der einzelnen, in dem Gewebe vorhandenen Zellen.
Diese Methode hat sich als besonders geeignet zur Untersuchung von fermentierenden Zellkulturen, zur Unterscheidung der toten Zellen von lebenden Zellen und der Hefe~ellen von Bakterienzellen,
130012/0622
erwiesen, sowie auch zur quantitativen Analyse von Blutleucozyten.
Die Methode kann andererseits automatische Messungen ergeben (die nur einige Sekunden erfordern), als Ersatz für lange und mühsame Routineverfahren, die im Falle des optischen Mikroskops notwendig sind. Sie kann auch erfolgreich angewendet werden zur Darstellung von Charakteristika, die für das Auge nicht unters ehe id'oar sind und in Beziehung stehe.i zur spezifischen Molekülwechselwirkung zwischen dem farbstoff mit einigen der Zellbestandteile.
Sie kann daher verwendet werden für Untersuchungen, die gegenwärtig nicht durchführbar sind oder nur unter Verwendung wesentlich komplizierterer Methoden möglich sind. Insbesondere ist es möglich die Methode leicht zur Tumordiagnose zu verwenden, da es möglich ist, die DNS-(bzw. DNA-) Farbstoff Wechselwirkung quantitativ zu bestimmen.
Die beigefügte Figur 1 stellt ein Diagramm dar, welches ein Beispiel für die bei diesen Untersuchungen verwendbare Torrichtung darstellt.
S^ stellt eine Quecksilber lampe dar und S2 ist der Laserstrahl. L^, Lp, L^, L^ sind Quarzlinsen. M^, M2 stellen Spiegel dar und Dy., D2 sind Detektoren im festen Zustand (solid state detectors), die den Laserimpuls feststellen. MC ist der Monochromator mit großer Leuchtkraft. S zeigt die Lage der Probe an und PM ist der. Fotovervielfacher. Filter und Blenden werden aus Übersichtlichkeit sgründen nicht dargestellt.
Der pulsierende Lichtstrahl wurde aus einem Nd-Laser erhalten, nämlich einem handelsüblichen TAG (Chromatix mod. 1000), der Lichtimpulse von 0,1-0,5 ^aJ von etwa 150 ns Länge emittiert mit einer Wiederholungsfrequenz von etwa 50 Hz.
Die Laserfarbe ist variabel von blau (^1= 4-7:5 um) bis zum nahen Infrarot. Der Beobachtungsstrahl wurde erzeugt durch eine in geeigneter Weise filtrierte Hochdruck-Quecksilberlampe. Beide
130012/0622
Strahlen wurden in eine Zone der Probe von etwa 0,2 mm Durchmesser fokusiert, derart, daß ein Winkel von etwa 15° zwischen ihnen gebildet wurde. Die Probenzelle war 2 mm dick. Das Licht von der Lampe durchlief einen Monochromator mit großer Öffnung und wurde in einen Fotovervielfältiger (Philips XP1113) eingespeist. Der elektrische Ausstoß des lOtovervielfältigers vurde kontinuierlich als durchschnittlicher Wert aufgezeichnet und wurde ebenfalls in einen Vorverstärker mit einem Durchlaßbereich von 0,5 EHz his 30 MHz beschickt und anschließend verstärkt, ir- .Oigitalspeichern gespeichert und in einem kleinen Computer (LABEN 70) gespeichert.
Das aus einem einzigen Impuls erhaltene Signal wurde aufgezeichnet und zu dem von Hunderten analoger Impulse addiert bzw. gefügt. So erhielt man einen Signaldurchschnitt in dem Störungen auf einen Faktor von mehr als 10, bezogen auf das aus einem einzigen Impuls stammende Signal,verringert wurde. Da die Wiederholungsfrequenz der Impulse relativ hoch war, erhielt man das Ergebnis der Messungen bereits innerhalb weniger Sekunden. Die Speicherung in dem Computer machte die Reproduktion und die Verarbeitung des Signals möglich unter Verwendung von Magnetbändern, Zeicheneinrichtungen , usw..
Das gespeicherte Signal snthält eine beträchtliche Datsnmenge, wie dia Absorptiünsamplxtude und verschiedene beobachtete Wellenlängen sowie deren Änderung mit der Zeit.
Wenn die Amplitude V (71, t) ist, so ist es im allgemeinen möglich, Tt und t derart einzustellen, daß:
worin η die Anzahl der für den erfindungsgemäßen Zweck relevanten Zellen darstellt und k^, und kg Konstanten sind, die durch ein Eichverfahren erhältlich sinds d. h. durch Einbringen einer Probe bekannter Zusammensetzung in dit Vorrichtung.
130012/062?
Beispiel 1
Untersuchung von Zellkulturen. Yitalitätstest. Untersucht wurden Hefekulturen vom Typ Saccharomyces, wie Saccharomyces Lactis, Saccharomyces fragilis oder dergleichen.
Die Untersuchung ergibt ein quantitatives Maß cer Anzahl von toten Zellen, die in der Permencation vorhanden sind.
Experimentelle Methode: Die zu untersuchende Zellprobe wird mit
einem Gemisch, das 10 g Trypanblau zusammen mit fur Jeden Liter 0,1 g ITaU3, 6,8 g KH2PO^, eingestellt mit EOH auf pH-Wert 7,2
und 8,76 g FaCl enthält. CoGIo wird in einer Endkonzentration von
10 m in der Anwesenheit einer gleichen Konzentration von EDTA zugesetzt. Das Gemisch wird einige Minuten gerührt und anschließend mit der vorstehend "beschriebenen Vorrichtung gemessen.
Die Probe wird in einer 2-mm-Zelle bestrahlt unter Verwendung eines pulsierenden Lasers bei λ. = 659 nm, und die Absorptionsänderungen bei λ = 4-05 und 435 nm werden nach 1 us Verzögerung vom Laserimpuls gemesser. Eine Eichung ist notwendig, um die festgestellte Amplitude gegen die Amplitude des Laserimpulses, die optische Fluchtung und so weiter zu justieren. 51Ur diesen Zweck wird eine Suspension verwendet ^ in der die Hefezellen gezählt sind und anschließend alle durch Sieden während einiger Minuten getötet wurden.
Ergebnisse^,
In der !Figur 2 stellt die Ordinate die Übergangsabsorption (transient absorption) (in mV), festgestellt bei λ= 435 nm dar, wenn eine Suspension, die teilweise abgetötete Saccharomyces-lactis-Zellen und Trypanblau enthält, einer ImpulsStrahlung bei λ 659 n^ wie vorstehend beschrieben unterzogen wird. Die Abszisse stellt die Zeit in MikrοSekunden (us) dar.
In der ffi^ur 3 stellt die Ordinate die Übergangsamplitude (in mV), festgestellt nach einer/US, vom Beginn des Laserimpulses dar.
130012/0622
Die Abszisse stellt den Prozentsatz toter Zellen in der Suspension, abgelesen durch übliche Einrichtungen, d. h. durch optische Mikroskopzählung, dar.
Die Korrelation ist sehr gut und ermöglicht die automatische Me.<3-sung der Anzahl der toten Zellen in einigen wenigen Sekunden. Die erzielbare Empfindlichkoit kann um 100 - 1000 Zellen/mnr variieren, d. h. weniger als 1 % der in der Brühe vorhandenen Gesamtpopulation.
Beispiel 2
Untersuchung von Zellkulturen. Verunreinigung durch verschiedene Stämme.
Die gleiche Zusammensetzung wie im Eeaktionsgemisch des Beispiels 1, enthaltend Trypanblau, ermöglicht die Unterscheidung verschiedener Typen von Zellen in einer !fermentation. Für zwei verschiedene Hefen des Saccharomyces-Typs weist der Übergang, festgesTellt bei%= 4-35 um, eine unterschiedliche Variation mit der Zeit auf, beispielsweise ist die Halbwertszeit (d. h. die Zeit, während der die Übergangsamplitude um einen Faktor von 2 verringert wird) 2,3 Jis für Saccharomyces lactis und 1,7 Ais für £accharomyces fragilis.
Bei toten Bakterienzellen des Typs Arthrobacter wird kein Übergang festgestellt. Die Methode ist daher geeignet zur Untersuchung der Hefeverunreinigung in Bakterienkult^iren oder zur Unterscheidung . •verschiedener Hefen. Für diesen Zweck wird die zu untersuchende Probe entnommen, alle vorhandenen Zellen werden durch Sieden während einiger Minuten getötet, die Probe wird anschließend mit dem Gemisch, das deu Farbstoff enthält, behandelt und es werden dann Messungen der Amplitude und der Verfallszeit des Übergangs, aufgezeichnet bei A = 4-35 nm, wenn die Probe mit Impulsen von X= 650 nm bestrahlt wird, durchgeführt.
130012/0'2 2
-10-Beispiel 3
Messungen der DNS-Menge ("bzw. MA-Menge), die'in Geweben vorhanden ist.
Diese Methode ist geeignet zur quantitativen Messung von Nukleinsäuren, die in menschlichen Zellen vorhanden sind. Für diese Untersuchung werden weiße Blutkörperchen "bzw. weiße Blutzellen in verschiedenen Zusammensetzungen verwendet.
Proben, die verschiedene Zellen miI leicht meßbaren Mengen an DNS enthalten, werden ausheparinisiertem Menschenblut nach üblichen Methoden, einschließlich dem Zentrifugieren in einem Ficoll-Gradienten, erhalten. Es wird ein linearer Picoll-Gradient von 18 % bis 15 °/° vorwendet, die Zellen, die über den Gradienten geschichtet sind, werden 5 Minuten bei 50 χ g und 7 Minuten bei 250 χ g zentrifugiert. Man erhält verschiedene Banden, die bei der Reinigung Lymphocyten, Monocyten und Granulocyten mit geringen Mengen roter Blutkörperchen enthalten. Die so erhaltenen weißen ZeIl^1I werden gezählt und auf Streifen mittels eines Mikroskops unter Verwendung üblicher Methoden analysiert. Dies ermöglicht eine quantitative Bewertung der in der Probe enthaltenen BNS, da der Durchschnittsgehalt an Chromatin in jedem Zelltyp bekannt ist.
Die erhaltenen, verschiedenen Fraktionen werden beide getrennt gefärbt und in bekannten Anteilen miteinander vermischt.
Um sie zu färben v/erden die Zellen zentrifugiert und in einer Lösung, die 5 x ΛΟ~·? m Acridinorange in einer physiologischen Lösung enthalten, die 0,05 m eines Phosphatpuffers vom pH 7,2
-2 -2
und auch 10 m CoCIo und 10 m EDTA enthält, suspendiert.
Die erhaltene Suspension wird einer Impulsbestrahlung unter Anxtfendung der vorstehend beschriebenen Vorrichtung mit einer Wellenlänge zwischen H = 4-73 und λ= 532 nm unterzogen. Sie wird mit kontinuierlichem Licht vonTt= 435 ron beobachtet.
130012/0622
Die gleiche Arbeitsweise verfolgt man an einer Probe, die die gleichen Reagentien jedoch ohne den Farbstoff enthält. Dieser letzten.e Arbeitsgang ist notwendig, da geringe Mengen an vorhandenem Carboxyhämoglobin zu der Übergangsabsorption beitragen könnten.
Der -unter Verwendung der Probe ohne den Farbstoff erhaltene Übergang wird von dem mit den vollständigen Gemischen erhaltenen abgezogen unter Bildung des in der Figur 4 dargestellten Ergebnisses.
Die Ordinate stellt die Amplitude des Übergangs (in mV) dar, und die Abszisse stellt die Zeit in us dar.
Die Änderung der Übergangsabsorption wird bei ^t= 4-35 nm festgestellt, wenn eine Suspension bestrahlt wird, die menschliche Granulocyten und Acridinorange bei \ = 532 nm enthält, wie vorstehend beschrieben.
Die Amplitude des Impulses 1 us nach der Bestrahlung mit dem Laser ist proportional zum DNS-Gehalt der Probe, wie in der Figur ^ dargestellt. In dieser Figur ist die Übergangsamplitude (in mV) dargestellt als Funktion des DNS-Gehalts (dargestellt als mg/l) für verschiedene Typen von Zellen, nämlich Lymphocyten und Monocyten in verschiedenen Anteilen oder Monocyten allein, Granulocyten allein oder alles Leucocyten. Die Proben enthalten verschiedene Mengen an Erythrocyten und stammen von verschiedenen Spendern,
Die Tatsache, daß diese Proportionalität für verschiedene Gehalte verschiedener Zellen aus verschiedenen Individuen erhalten wird, macht es glaubhaft, daß die Methode auch zuverlässig auf biologische Gewebe anderen Ursprungs angewendet werden kann, wie Epithelgewebe usw..
Die Messung des DNS-Gehalts, zusammen mit der Messung der Anzahl der in dem Gewebe vorhandenen Zellen, könnte wichtig sein für die Frühdiagnose von Krebserkrankungen.
130012/0622
Beispiel 4-
Charakterisierung von Leucocyten in menschlichem Blut. Man arbeitet mit Blutproben, die niclit-koagulierend gemacht wur den.
Die Probe ergibt eine quantitative Bewertung der Gesamtanzahl an Leucocyten und der Anzahl an Granulocyten, Monocyten und Lympho cyt en.
Zu einer Probe von venösem menschlichem Blut, die durch Heparin in einer Konzentration von 0,1 bis 0,2 mg/ ml Blut oder mit Hatrium-EDTA in einer Konzentration von 1 mg/ml, nicht-koagulierend gemacht wurde, fügt man oine 3 »5 %ige Lösung von Dextran (Molekulargewicht 250 000) bis zu einer Endkonzentration von 1,5 % in dem Gemisch, das dann in einem Thermostat während 20 Minuten bei 37 0C gehalten wird. Die überstehende Flüssigkeit, die Zellen der weißen Gruppen und etwa 1 % der roten Zellen enthält, wird entfernt und destilliertes Wasser wird zugesetzt, um die Salzkonzentration auf 0,25 %o (pro Tausend) zu verringern. Nach genau 30 Sekunden wird der isotonische Charakter durch Zusatz von 3?5 %o wäßrigem ITaGl wieder hergestellt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 400 g (Gravitationskraft) während 5 Minuten geironnen und werden anschließend in ca 0,9$ wässr. ITaCl oder Phosphatpuffer, pH 7,1> 0,1 m, in einem derartigen Volumen wieder aufgeschlämmt, daß die Anzahl der Lymphocyten etwa 8000 pro mm-5 beträgt. Die Gewinnung der Leucocyten beträgt etwa 95 % mit einer prozentualen Zusammensetzung, die von der des Blutes nicht unterschieden werden kann: Die roten Boutkörperchen, die verbleiben, liegen in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 mit den weißen Blutkörperchen vor. Die Messungen werden an 200 ul (Mikroliter) einer Zellsuspension in einer Zelle mit einem optischen Weg von 2 mm zu der Farbstoff und ein Löschungsmittel gefügt wurden, durchgeführt; die Zellen können vorher fixiert werden.
Insbesondere wurden folgende IPärbetechniken verwendet. Zu der Zellsuspension fügt man das CoCI2-EDTA-Loschmittel und
130012/0622
—2 —4-Brilliantgrün in einer Endkonaentration von 10 bzw. 9-10 m.
Eine weitere Färbetechnik besteht in der Fixierung der Zellen mit Äthanol bei einer Endkonzentration von 12 %o (pro Tausend).
Nach einer Minute fügt man CoCl0-EDTA und Brilliant-Cresylblau
2 —5 in der Endkonzentration 10 bzw. 5.10 y m zu. Eine dritte Fäz'bemethode, die sich als nützlich erwies, ist wie die vorstehend beschriebene zweite Färbemethode, jedoch wird als Farbstoff Kilblau in einer Konzentration von 8.10"'' m verwendet.
Die so erhaltenen Proben werden anschließend mit dem Laserimpulssystem, das eingangs beschrieben wurde, bestrahlt bei/I= 659 um und werden mit monochromatischem Licht bei \~ 435 ma und /I = 54-7 nm nacheinander beobachtet.
Mit zwei verschiedenen Färbetechniken können so vier verschiedene Übergänge erhalten werden, deren Charakteristika derart sind, daß sie mit den zu messenden Größen in Korrelation stehen.
Eine Beobachtung der so behandelten Blutproben wird in Korrelation gesetzt zu der nach üblichen Methoden erzielten, d. h. mittels mikroskopischer Beobachtung von Abstrichen von Gesamtblut. Die Figuren 6 und 7 zeigen Beispiele für einige derartige Übergänge. Insbesondere zeigt die Figur 6 die Amplitude in mV, festgestellt bei %= 5^7 nm in der mit Brilliant-Cresylblau gefärbten und mit Äthanol fixierten Probe, wobei die Ibszisse die Zeit in us (Mikrosokunden) angibt. Die Amplitude &V, gemessen in der Figur zwischen dem Peak bzw. Maximalwert und dem Wert nach längerer Zelt ist proportional zu der Gesamtanzahl der Monocyten. Es sei bemerkt, daß in diecem Beispiel die Anwesenheit von Co-EDTA wichtig ist zur Bestimmung des Verschwindens der Signale, die von anderen Zellen kommen oder von H.en freien Farbstoffen stammen. Die Figur 7 zeigt der. Übergang, festgestellt bei % = 4-35 am in der Probe, gefärbt mit Brilliantgrün (die Ordinate stellt mV dar und die Abszisse us bzw. MikrcSekunden, wie im vorstehenden Falle). Das ,Ergebnis (width) dieser St1Ife, entsprechend der Erregung des Triplett-Zustandes des Farbstoffs, der voraussichtlich
130012/C'22
an den Zellkern gebunden ist, wie unter dem Mikroskop festgestellt, kann gut in Beziehung: mit der Gesamtanzahl der Leucocyten gebracht werden. '
Der Trend der Abnahme ist zusätzlich biphasisch, wie in der Zeichnung dargestellt. Die rasche Stufe, die zweckmäßig sowohl bei/L= 435 um als auch bei Jt= 5>47 E*a gemessen wird, ist schließlich proportional zur Anzahl der Lymphocyten. So wurden alle drei unabhängigen Parameter (Anzahl der Lymphocyten (1), Anzahl der Monocyten (m) und Anzahl der Crranulocycen (g) ) bestimmt, wobei die Gesamtanzahl an Leucocyten (n) gleich der Summe der drei ist, d. h. η = 1 + m + g. Es sei bemerkt, daß nur ein geringer Anteil der Informationen, die in der Aufzeichnung der f estgestel '.ten Übergänge enthalten ist, für diese Bestimmungen verwertet wurde und daß.die unabhängige Feststellung der Verfallszeiten der Triplett-Zustände und der Verhältnisse zwischen den Amplituden bei verschiedenen Werten von % verfügbar ist, um Untersuchungen anderer Natur durchzuführen, wie beispielsweise die Feststellung des Vorhandenseins pathologischer Zellen.
Die oben erwähnten Farbstoffe haben die folgenden Nummern im Colour Index:
Trypanblau = 23850
Acridinorange = 46005
Brilliantgr'in = 42040
Nilblau =51180
Brilliant-Cresyl-blau = 51010
130012/0622

Claims (2)

  1. Dr. F- Zumstein sen. - Dr. E. Assmann - E>r.:K. Koenigsberger Dip!.-Phys. R. Holzbauer - Dipl.'-Ing. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun.
    PATENTANWÄLTE
    8000 München 2 · Bräuhausstraße 4 ■ Telefon Sammel-Nr. 225341 · Telegramme Zumpat ■ TeI=X 523S7?
    • üase 1244-
    Patentansprüche
    Zusammensetzung, geeignet zur Unterbachung der Bestandteile von "biologischen Geweben und/oder Flüssigkeiten, bestehend aus
    a) einem Farbstoff, ausgewählt aus den Xanthen-, Azin-, Oxazin- oder Acridin-Reihen oder aus wasserlöslichen Farbstoffen der "Diazo"-Eeihen, oder Triphenylmethan bzv. Sriphenylmethanfarbstoffen,
    b) einem Medium, das mit dem biologischen Gewebe und/oder der Flüssigkeit verträglich ist,
    c) einer Substanz, die eine rasche Ent-Energetisierung der Farbstoffmoleküle bei ihrem Zusammenstoß mit diesen ermöglicht, (d. h. ein Löschmittel).
  2. 2. Zusammensetzung nach dem vorhergehenden Anspruch in der der Farbstoff in einer Konzentration von 10 -^ bis 10 m vorliegt.
    3>. Verfahren zur Untersuchung biologischer Gewebe und/oder Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man die betreffende Probe mit einer Zusammensetzung behandelt, bestehend aus
    a) einem Farbstoff, ausgewählt aus deij Xanthen-, Azin-, Oxazin- oder Acridin-Eeihen, oder aus wasserlöslichen Farbstoffen der "Diazo"-Seihen, oder 'Triphenylmethan bzw. TriphenylmetharJ? arbstoff en,
    b) einem Medium, das mit dem biologischen Gewebe und/oder der Flüssigkeit verträglich ist,
    c) einer Substanz, die zu einer raschen Ent-Energetisierung der Farbstoffmoleküle bei ihrem Zusammenstoß mit diesen geeignet ist (d. h. ein Löschmittel)v
    worauf man das resultierende Gemisch einer Bestrahlung mit einem ersten Strahl von pulsierendem Licht unterzieht, einen zweiten Strahl vcn monochromatischem Licht durch die so behandelte Probe führt und am Austrit" die optische Intensität dieses zweiten Strahls als Funktion der Zeit analysiert.
    130012/0e :2
DE3026185A 1979-09-10 1980-07-10 Zusammensetzung, geeignet zur Untersuchung biologischer Gewebe oder Flüssigkeiten und Verfahren zu deren Anwendung Expired DE3026185C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT25568/79A IT1123573B (it) 1979-09-10 1979-09-10 Composizione adatta al controllo di tessuti e/o liquidi biiologici e metodo impiegante la stessa

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3026185A1 true DE3026185A1 (de) 1981-03-19
DE3026185C2 DE3026185C2 (de) 1983-11-24

Family

ID=11217121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3026185A Expired DE3026185C2 (de) 1979-09-10 1980-07-10 Zusammensetzung, geeignet zur Untersuchung biologischer Gewebe oder Flüssigkeiten und Verfahren zu deren Anwendung

Country Status (20)

Country Link
US (2) US4331759A (de)
JP (1) JPS5640740A (de)
AT (1) AT371837B (de)
AU (1) AU536677B2 (de)
BE (1) BE884217A (de)
BR (1) BR8004357A (de)
CA (1) CA1150603A (de)
CH (1) CH648125A5 (de)
DE (1) DE3026185C2 (de)
DK (1) DK157264C (de)
ES (1) ES8106057A1 (de)
FI (1) FI72611C (de)
FR (1) FR2466019A1 (de)
GB (1) GB2059582B (de)
IE (1) IE50002B1 (de)
IT (1) IT1123573B (de)
LU (1) LU82587A1 (de)
NL (1) NL8003987A (de)
NO (1) NO153869C (de)
SE (1) SE442347B (de)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4707454A (en) * 1981-08-10 1987-11-17 Bio-Diagnostics, Inc. Fluorescent chlorophyll labeled assay reagents
US4906561A (en) * 1981-09-14 1990-03-06 Thornthwaite Jerry T Nuclear isolation medium and procedure for separating cell nuclei
US4622291A (en) * 1984-06-11 1986-11-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method and device for quantitative end point determination in immunofluorescence using microfluorophotometry
US4707451A (en) * 1985-09-18 1987-11-17 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes
EP0226272B1 (de) * 1985-11-01 1991-03-06 Becton, Dickinson and Company Nachweis von Retikulozyten
US5319079A (en) * 1986-05-15 1994-06-07 Beckman Instruments, Inc. Process for terminal substituting of a polynucleotide
US5141855A (en) * 1986-07-28 1992-08-25 Eastman Kodak Company Signal amplifying cobalt (III) redox reagents and methods for the determination of analytes in aqueous fluids
US5171669A (en) * 1987-05-04 1992-12-15 Eastman Kodak Company Cobalt(III) reagents in combination with water soluble polymers
US4963478A (en) * 1988-07-05 1990-10-16 Immucor, Inc. Article for preforming immunological assays utilizing organic dyes and method for producing and utilizing same
US5413915A (en) * 1988-07-12 1995-05-09 Resource Technologies Group, Inc. Method and sensor for detecting toxic chemical exposure effects and metabolic activation of carcinogenic chemical agents
FR2636646B1 (fr) * 1988-09-19 1990-12-21 Tepral Sa Procede de detection specifique et de denombrement des micro-organismes dans des produits filtrables
JP2595423B2 (ja) * 1992-08-05 1997-04-02 大和ハウス工業株式会社 無溶接トラス
US5407794A (en) * 1992-09-08 1995-04-18 Cytocolor Inc. Oxazine stained lymphocytes and method
WO1995030767A1 (en) * 1992-10-22 1995-11-16 The Center For The Improvement Of Human Functioning International, Inc. METHOD FOR DETECTING INTESTINAL PATHOGEN $i(DIENTAMOEBA FRAGILIS)
US5610027A (en) * 1992-10-30 1997-03-11 Micro-Med, Inc. Microphoto lysis-anlaysis process to measure cell characteristics
EP0708334B1 (de) * 1994-10-20 2001-05-23 Sysmex Corporation Reagenz und Verfahren zur Analyse fester Bestandteile im Harn
JP4509607B2 (ja) * 2004-03-17 2010-07-21 シスメックス株式会社 細胞分析装置および方法
CN101678356B (zh) 2007-04-06 2014-04-16 加利福尼亚技术学院 微流体装置
EP3462172B1 (de) 2012-12-17 2023-09-06 Accellix Ltd Systeme und verfahren zum erkennen eines biologischen zustands
US10610861B2 (en) 2012-12-17 2020-04-07 Accellix Ltd. Systems, compositions and methods for detecting a biological condition
US20140170678A1 (en) 2012-12-17 2014-06-19 Leukodx Ltd. Kits, compositions and methods for detecting a biological condition
CN116990101B (zh) * 2023-09-27 2023-12-15 四川大学华西医院 一种易掉片组织的预处理方法及其多重免疫荧光染色方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT630626A (de) * 1959-05-15
US3298789A (en) * 1964-12-14 1967-01-17 Miles Lab Test article for the detection of glucose
US3682783A (en) * 1971-03-15 1972-08-08 Photovolt Corp Method for coulometric karl fischer titration
US4146604A (en) * 1973-05-31 1979-03-27 Block Engineering, Inc. Differential counting of leukocytes and other cells
US4094745A (en) * 1973-06-22 1978-06-13 John Scholefield Method of staining microscopic organisms
US3899297A (en) * 1973-12-19 1975-08-12 Block Engineering Biological staining technique and mixture thereof
US4174384A (en) * 1975-06-30 1979-11-13 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4207469A (en) * 1975-08-02 1980-06-10 Sir Howard Grubb Parsons and Company Ltd. Analysis of emulsions and suspensions
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4219337A (en) * 1978-04-27 1980-08-26 The Medical College Of Wisconsin Assay for proteins and polypeptides
US4225783A (en) * 1978-07-24 1980-09-30 Abbott Laboratories Determination of microbial cells in aqueous samples
US4225669A (en) * 1979-04-27 1980-09-30 Melnick Joseph L Staining and analysis of bacteria
JPS55116259A (en) * 1979-03-01 1980-09-06 Fuji Photo Film Co Ltd Microimmunoassay method
US4252783A (en) * 1979-06-18 1981-02-24 Syva Company Reducing fluorescent background in fluorescent immunoassays
US4336029A (en) * 1980-08-15 1982-06-22 Ortho Diagnostic Systems Inc. Method and reagents for quantitative determination of reticulocytes and platelets in whole blood

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B. Romeis, Mikroskopische Technik, 16. Aufl., 1968, S. 185-193 *
Technique of Chemistry, Vol. VI, Investigation of rates and mechanism of reactions, part II, P. 367-372, published by G.Hammes, Interscience New York, 1974 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPS5640740A (en) 1981-04-17
AU536677B2 (en) 1984-05-17
BE884217A (fr) 1981-01-08
US4376820A (en) 1983-03-15
NO153869B (no) 1986-02-24
SE442347B (sv) 1985-12-16
SE8005060L (sv) 1981-03-11
CA1150603A (en) 1983-07-26
ES493614A0 (es) 1981-07-01
LU82587A1 (fr) 1981-02-02
NO802050L (no) 1981-03-11
JPH0131139B2 (de) 1989-06-23
CH648125A5 (it) 1985-02-28
GB2059582A (en) 1981-04-23
FI72611B (fi) 1987-02-27
IT7925568A0 (it) 1979-09-10
DK157264B (da) 1989-11-27
ES8106057A1 (es) 1981-07-01
NO153869C (no) 1986-06-04
IT1123573B (it) 1986-04-30
AU5961580A (en) 1981-03-19
ATA357580A (de) 1982-12-15
AT371837B (de) 1983-08-10
FR2466019B1 (de) 1983-12-23
FI802211A (fi) 1981-03-11
US4331759A (en) 1982-05-25
IE50002B1 (en) 1986-01-22
DK157264C (da) 1990-05-07
DE3026185C2 (de) 1983-11-24
BR8004357A (pt) 1981-04-28
NL8003987A (nl) 1981-03-12
FR2466019A1 (fr) 1981-03-27
IE801417L (en) 1981-03-10
GB2059582B (en) 1983-08-17
DK282480A (da) 1981-03-11
FI72611C (fi) 1987-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3026185C2 (de) Zusammensetzung, geeignet zur Untersuchung biologischer Gewebe oder Flüssigkeiten und Verfahren zu deren Anwendung
DE2451409C2 (de) Verfahren zur Bestimmung spezieller weißer Blutkörperchen
DE2422016A1 (de) Diagnose von krankheitszustaenden durch fluoreszenzmessungen unter verwendung von abtastlaserstrahlen
DE3304795C2 (de)
DE2455870A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur klassifizierung biologischer zellen durch fluoreszente strahlung
DE3109252A1 (de) Verfahren und zusammensetzung zur bestimmung einzelner leukozyten durch metachromatische farbstoffdifferentialabsorption
DE3214939C2 (de)
DE2031447A1 (de) Verfahren zur Prüfung von Zellproben
EP0979402B1 (de) Verfahren zur optischen detektion von analytmolekülen in einem natürlichen biologischen medium
EP0563080B1 (de) Messverfahren zur bestimmung von harzteilchen in papierstoffen
DE2602068A1 (de) Immunologisches reagens
DE2645959A1 (de) Verfahren zur identifizierung von fluoreszenzstoffen
EP1999457A1 (de) Verfahren zur bestimmung von molekülen oder molekülteilen in biologischen proben
CH675485A5 (de)
DE3038255A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur pruefung von biologischen wirkungen physikalischer und/oder chemischer agenzien
EP0435226B1 (de) Phagozytose-Test
DE60110755T2 (de) Testverfahren zum nachweiss von lipoproteinen
DE2424955A1 (de) Verfahren zum vorbereiten von objekttraegern fuer die blutuntersuchung
DE2321050A1 (de) Verfahren und einrichtung zur ermittlung boesartiger zellen
DE4104014A1 (de) Verfahren zur bestimmung von calciumionenkonzentration in zellen
EP0037905A1 (de) Verfahren zur Bestimmung leukämischer Zellen
DE2551231A1 (de) Verfahren und anordnung zur klassifizierung biologischer zellen aufgrund von fluoreszenzstrahlung
Condrau Time-resolved fluorescence measurement in flow cytometry
DE3523642A1 (de) Mikrophotolyse-verfahren
EP1366362A2 (de) Verfahren zum nachweis apoptotischer und nekrotischer zellen

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee