DE2929278A1

DE2929278A1 - Deep freezing of cell suspensions - to give preparations suitable for back-transfusion in tumour therapy

Info

Publication number: DE2929278A1
Application number: DE19792929278
Authority: DE
Inventors: Guenter Prof Rau; Max Werner Dipl Ing Scheiwe
Original assignee: Forschungsgesellschaft fur Biomedizinische Technik Ev-Helmholtz-Institut; Forschungsgesellschaft fuer Biomedizinische Technik eV
Current assignee: Forschungsgesellschaft fur Biomedizinische Technik Ev-Helmholtz-Institut; Forschungsgesellschaft fuer Biomedizinische Technik eV
Priority date: 1979-07-19
Filing date: 1979-07-19
Publication date: 1981-01-29
Also published as: DE2929278C2

Abstract

Process comprises cooling the specimen to the freezing temp. T(F) by lowering the chamber temp. at a cooling rate B(I); cooling the chamber to a predetermined temp. T(U); holding the chamber at this temp. until the specimen temp. is on the plateous end temp. T(P), leaves the temp. plateau, and falls further; heating the chamber to an intermediate temp. T(O) which is below the specimen temp. T(H); maintaining the chamber at T(O) until a temp. is reached in the specimen at which 85% of the specimen mass is frozen; and lowering the chamber temp. at a cooling rate B(II) until the end temp. required for the specimen is reached. T(U), T(P), T(O), T(F) and B are specified for lymphocytes, stem cells, granulocytes, bone marrow cells, thrombocytes and erythrocytes.

Description

beschreibunR description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Eingefrieren von Zellsuspensionen, die bei dem Verfahren erhaltenen tiefgefrorenen Zellsuspensionen und ihre Verwendung zur Bekämpfung von Tumoren.The invention relates to a method for freezing cell suspensions, the frozen cell suspensions obtained in the process and their use to fight tumors.

In den letzten Jahren wurde ein Verfahren zur Tumortherapie entwickelt, bei dem eine Rücktransfusion von körpereigenen weißen Blutkörperchen, die vor dem Beginn der konventionellen Therapie abgenommen und nach erfolgter Therapie rücktrans fundiert werden, durchgeführt wird.In the last few years a procedure for tumor therapy has been developed, in which a reverse transfusion of the body's own white blood cells, which were present before the Start of conventional therapy removed and transplanted back after therapy well-founded, is carried out.

Dazu ist es erforderlich, die Zellen längere Zeit, oft über mehrere Monate hinweg, zu lagern, da es wegen der Gefahr tödlicher Immunabwehrreaktion nicht möglich ist, Zellen anderer Spender zu verwenden, und da der Therapiezeitraum oft im Bereich mehrerer Monate liegt. Zur Konservierung der Zellen hat man die Gefrierkonservierung bei tiefen Temperaturen angewandt und bis heute steht noch kein anderes Verfahren zur Verfügung.For this it is necessary to keep the cells for a longer period of time, often for several Months, as there is no risk of fatal immune response it is possible to use cells from other donors, and since the therapy period often is in the range of several months. Freeze preservation is used to preserve the cells used at low temperatures and no other method is available to date to disposal.

Mit keinem der bekannten Gefrierverfahren ist es jedoch möglich, die großen erforderlichen Zellmengen in einer Probe einzufrieren. Für die Therapie bestimmte Zellsuspensionen müssen möglichst große Mengen an Zellen enthalten und die Zahl der lebenden Zellen soll nach dem Gefriervorgang möglichst hoch liegen.However, it is not possible with any of the known freezing processes to freeze large quantities of cells required in a sample. Intended for therapy Cell suspensions must contain the largest possible amount of cells and the number of the living cells should be as high as possible after the freezing process.

Die Bedeutung einer Verbesserung der Krebstherapie läßt den durch die Gefrierkonservierung verursachten Aufwand gerechtfertigt erscheinen. Da die benötigte große Menge von autologen lymphoiden Blutkörperchen oder Knochenmarkszellen schwierig zu gewinnen ist, muß den einzelnen Schritten des Frierkonservierungsprozesses besondere Sorgfalt gewidmet werden.The importance of improving cancer therapy lets that through the effort caused by freeze preservation appear justified. Since the required large amount of autologous lymphoid blood cells or bone marrow cells difficult To win must follow the steps of the freeze preservation process special care should be given.

Die wesentlichsten Schritte dieses Verfahrens sind: Abnahme des Blutes und daraus Anreicherung der benötigten Zellart, Transfer in den Einfrierbeutel, Versetzen mit dem Gefrierschutzmittel, Kontrolliertes Einfrieren nach vorgesehenem Zeitprogramn, Lagerung bei unterhalb -1300C (1430K), Auftauen mit der erforderlichen zeitlichen Temperaturänaerung, Revitalisierung der Zellen, d.h. allmähliches Verdünnen und Auswaschen der Suspension.The main steps in this procedure are: Drawing a blood sample and from it enrichment of the required cell type, transfer to the freezer bag, Adding the anti-freeze, controlled freezing according to the intended Time programs, storage below -1300C (1430K), thawing with the required Temporal change in temperature, revitalization of the cells, i.e. gradual thinning and washing out the suspension.

Die Vitalität der Zellen hängt in ausschlaggebender Weise vom programmierten Einfrieren ab. So wird schon durch geringfügigste Abweichungen von einer als günstig ermittelten Frierkurve die Zahl lebender Zellen drastisch reduziert.The vitality of the cells depends in a decisive way on the programmed Freeze off. Even the slightest deviation from one is considered cheap determined freezing curve drastically reduces the number of living cells.

Alle bisher käuflichen Friergeräte für biologische Zellen wurden primär für das Einfrieren von Laborproben (mit ca.All previously available freezers for biological cells became primary for freezing laboratory samples (with approx.

2 ml Inhalt) entwickelt und können deshalb den erhöhten Anforderungen für Therapiezwecke in vielen Punkten nicht gerecht werden. FLur Therapiezwecke müssen die Therapiezelien in großen Mengen gesammelt werden, beispielsweise müssen bei Knochenmarkzellen z.B. 1 x i010 Zellen je Einzelprobe (Bereich 1 x 109 bis 1011) Lymphozyten z.B. 1 x 101° Zellen je Einzelprobe (Bereich 1 x 109 bis 1 x 1011> Granulozyten z.B. 1 x io10 Zellen je Einzelprobe (Bereich 1 x 109 bis 1 x 1011) Stammzellen, z.B. 1 x 107 Zellen je Einzelprobe (Bereich 1 x 106 bis 1 x 108).2 ml content) and can therefore meet the increased requirements for therapeutic purposes do not do justice in many respects. Must for therapeutic purposes the therapy cells have to be collected in large quantities, for example at Bone marrow cells e.g. 1 x 1010 cells per individual sample (range 1 x 109 to 1011) Lymphocytes e.g. 1 x 101 ° cells per individual sample (range 1 x 109 to 1 x 1011> Granulocytes e.g. 1 x 1010 cells per individual sample (range 1 x 109 to 1 x 1011) Stem cells, e.g. 1 x 107 cells per individual sample (range 1 x 106 to 1 x 108).

Thrombozyten (Plättchen) z.B. 1 x 1011 Plättchen je Einzelprobe (Bereich 1 x 1010 bis 1 x 1012) vorhanden sein.Thrombocytes (platelets) e.g. 1 x 1011 platelets per individual sample (range 1 x 1010 to 1 x 1012).

Diese erhöhten Anforderungen für Therapiezellen bedeuten: a) daß Therapiezellen in Volumina von 100 bis 200 ml prc Einheit gefroren werden müssen, da sonst der Zeitverlust bei Einfüllen in kleineren Proben zu groß ist, eine Sterilität nur gewährleistet ist, wenn Techniken der Transfusionsmedizin verwendet werden, und die LE-gerung solcher Proben sehr teuer ist. Beispielsweise betragen die Kältemittelkosten für einen LagerbenSlter mit 320 1 Volumen im Jahr DM 10.400,--.These increased requirements for therapy cells mean: a) that therapy cells must be frozen in volumes of 100 to 200 ml prc unit, otherwise the Loss of time when filling smaller samples is too great, sterility is only guaranteed is when transfusion medicine techniques are used and the LE gel such samples is very expensive. For example, the refrigerant costs are for a storage tank with a volume of 320 1 per year DM 10,400.00.

b) Therapiezellen müssen mindestens 8056 lebende Zellen nach dem Auftauen enthalten, da sonst die restlichen lebenden Zellen durch die Inhaltsstoffe toter Zellen in ihren Vitalfunktionen unwirksam werden. Bei Testzellen genügen demgegenüber oft z.B. 50% lebende Zellen. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gefrorenen Zellen weisen Vitalitäten bis zu 95% auf.b) Therapy cells must have at least 8056 living cells after thawing otherwise the remaining living cells will be dead due to the ingredients Cells become ineffective in their vital functions. In contrast, it is sufficient for test cells often e.g. 50% living cells. The frozen by the method according to the invention Cells have vitalities of up to 95%.

c) Käufliche Friergeräte weisen Temperaturschwankungen in der Kammer um den Sollwert von 3 0C auf. Dieser Effekt reduziert die Lebensfähigkeit der Zellen in den Randzonen der Behälter und deshalb sind mit solchen Geräten gefrorene menschliche Lymphozyten nur zu etwa 70% lebensfähig.c) Commercial freezers show temperature fluctuations in the chamber around the setpoint of 3 0C. This effect reduces the viability of the cells in the edge zones of the container and therefore are frozen human with such devices Lymphocytes only about 70% viable.

d) Käufliche Friergeräte weisen eine Steuerung der eperatur-Zeitfunktion auf, die nicht durch das Verhalren der Probe beeinflußt wird. Deshalb funktioniert bei diesen Geräten das Einfrieren nur dann in gew Unschter Weise, wenn das Probevolumen gegenüber der gefundenen Einstellung nicht geändert wird. Außerdett muß, wenn eine andere Probengeometrie verwendet wird, ein neuer Programmgeber benutzt werden. Die erfindungsgemäße Regelung macht diesen Schritt nicht erforderlich.d) Commercial freezers have a control of the temperature-time function which is not affected by the behavior of the sample. That's why it works with these devices the freezing only in some cases Impudently if the sample volume is not changed compared to the setting found. In addition, if a different sample geometry is used, a new programmer must be used to be used. The regulation according to the invention does not make this step necessary.

Es wurde bereits vorgeschlagen, zur Vermeidung dieser Schwierigkeiten die gemessene Probentemperatur zur Steuerung der verschiedenen Phasen des Abkühlvorgangs zu benutzen und die Proben- und Kammertemperatur parallel zu ermitteln (vgl.It has been suggested to avoid these difficulties the measured sample temperature to control the different phases of the cooling process and to determine the sample and chamber temperature in parallel (cf.

N.W. Scheiwe und P. Schwindke, Biomedizinische Technik, 3ana 23, Seite 144, und dort insbesondere Seite 148 unter Punkt 3 "Flexible Regelung"; vgl. auch die Berichtigung in Biomedizinische Technik, Band 23, Seite 181, wo ausgeführt wurde, daß die Bilder 2 (Seite 146) und 4 (Seite 148) verwechselt wurden und daß die Darstellung mit der Unterschrift Bild 2 über die Legende zum Bild 4 und umgekehrt gehören).N.W. Scheiwe and P. Schwindke, Biomedical Engineering, 3ana 23, p 144, and there in particular page 148 under point 3 "Flexible regulation"; see also the correction in Biomedical Engineering, Volume 23, page 181, where stated, that pictures 2 (page 146) and 4 (page 148) were mixed up and that the representation with the signature Fig. 2 above the legend to Fig. 4 and vice versa).

Gemäß diesem bekannten Verfahren wird die Probenkammer auf einen Temperaturwert T1 abgekühlt. Die Kammertemperatur verbleibt so lange auf diesem Endwert, bis die Probentemperatur das Temperaturplateau verläßt und weiter absinkt. In diesem Augenblick erfolgt die Aufheizung der Kammer bis auf eine Zwischentemperatur T3 unterhalb der Probentemperatur T2, damit die weitere Abfuhr der latenten Phasenunwandlungswarme erfolgen kann. Die Kammertemperatur verharrt auf diesem Wert T2, bis in der Probe die Temperatur erreicht ist, bei der 85% der Probenmasse gefroren vorliegen. Dann wird die Kammertemperatur mit einer bestimmten Kühlrate abgesenkt, bis die für die Probe erforderliche Endtemperatur erreicht ist.According to this known method, the sample chamber is brought to a temperature value T1 cooled down. The chamber temperature remains at this end value until the Sample temperature leaves the temperature plateau and continues to drop. At this moment the chamber is heated up to an intermediate temperature T3 below Sample temperature T2, so that further dissipation of the latent heat of phase change can be done. The chamber temperature remains at this value T2 until the sample the temperature has been reached at which 85% of the sample mass is frozen. then the chamber temperature is lowered with a certain cooling rate until the for the Sample required final temperature is reached.

Als Beispiel wird die Abkühlung von Zellsuspension in zylinrischen Röhrchen mit 2 ml Inhalt angegeben. Es finden sich jedoch keinerlei Hinweise über die Vitalität der erhaltenen Probe. Als zweites Beispiel wird das Gefrieren einer platterförmigen Makroprobe von 100 ml beschrieben. Auch hier finden sich keine genauen Angaben.As an example, the cooling of cell suspension in cylindrical Tubes with 2 ml content indicated. However, there is no evidence of any kind the vitality of the sample received. As a second example, freezing a flat-shaped macro sample of 100 ml. Here, too, there are no exact ones Declarations.

In der genannten Arbeit wird unter Punkt 4 "Ausblick" ausgeführt, daß Gegenstand der Forschung die Suche geeigneter Abkiihlprofile für einzufrierende Zellen sei. Es wird schlieBlich angegeben, daß mit dem entwickelten System die Überlebensrate von Makroproben von menschlichen Lymphozyten bereits auf merm als 90% gesteigert werden konnte.In the work mentioned under point 4 "Outlook" is carried out, that the subject of research is the search for suitable cooling profiles for those to be frozen Cells are. It is finally stated that with the system developed the survival rate of macro samples of human lymphocytes already increased to more than 90% could be.

Weitere Einzelheiten, wie man vorgehen muß, um dieses Frierverfahren für die Tumortherapie zu verwenden, finden sich nicht. Es wird nur allgemein am Ende der Arbeit Kühltemperatur : "Die Anwendung des Frierverfahrens in der Tumortherapie wird zur Zeit ausgeweitet." Arbeitet man nach diesem Verfahren, so ist es nicht möglich, reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Versuche haben gezeigt, daß man mit der einen Sorte von Zellen, beispielsweise mit Lymphozyten, bei dem einen Ansatz Uberlebensraten von mehr als 90%, bei einem anderen Ansatz jedoch wesentlich niedrigere Uberlebensraten erhält. Es hat sich weiterhin gezeigt, daß dieses bekannte Verfahren nicht auf Granulozyten oder Thrombozyten auszudehnen ist und daß es nicht möglich ist, nach diesem Verfahren Zellsuspensionen mit hohem i3ärnatokrit einzufrieren. Unter Hämatokrit versteht man den Volumenanteil der Zellen in der Suspensionsflüssigkeit, der moglichst hoch sein soll und im Bereich von 20 bis 50%, vorzugsweise 35%, liegen sollte.More details on how to go about this freezing procedure to be used for tumor therapy are not found. It is only generally on End of work cooling temperature: "The application of the freezing method in tumor therapy is currently being expanded. "If you work according to this procedure, it is not possible to get reproducible results. Experiments have shown that you can with one kind of cell, for example with lymphocytes, with one approach Survival rates greater than 90%, but much lower with a different approach Maintains survival rates. It has also been shown that this known method not to extend to granulocytes or platelets and that it is not possible is to freeze cell suspensions with a high i3natocrit according to this procedure. Hematocrit is the volume fraction of cells in the suspension liquid, which should be as high as possible and be in the range from 20 to 50%, preferably 35% should.

Der Anmelder hat nun überraschenderweise gefunden, daß für das Einfrieren größerer Mengen von Zellsuspensionen ein Zusammenhang zwischen der Kühlrate BI, mit der die immer abgekühlt wird, der Kühltemperatur Tu, auf die die Kammer abgekühlt wird, und der Plateauendtemperatur TP der Probe, mit der die Probe das Temperaturplateau verläßt, der Zwischentemperatur TO, auf die die Kammer aufgeheizt wird, und der Kühlrate BII, mit der die Temperatur der Kammer abgesenkt wird, besteht. Zur wenn diese Werte genau aufeinander abgestimmt sind, ist es möglich, reproduzierbar größere Mengen von Zellsuspensionen mit hohem H>matokrit einzufrieren und nach de Auftauen eine hohe Uberlebensrate für die Makroproben zu erhalten. Unter Uberlebensrate oder auch totaler Recovery versteht man den Anteil lebender Zellen (Vitalität), muLtipliziert mit dem Anteil insgesamt zurückerhaltener Zellen nach Auftauen und Wiederaufbereitung zur Transfusion. Dieser Wert kann z.B., wenn nicht nach dem vorgegebenen Verfahren eingefroren wird, bei 10% liegen, obwohl die Vitalität Werte über 90% erreichen kann. Mit dem beschriebenen Verfahren wird die totale Recovery auf über 80% durchschnittlich angehoben.The applicant has now surprisingly found that for freezing larger amounts of cell suspensions show a relationship between the cooling rate BI, with which it is always cooled, the cooling temperature Tu to which the chamber is cooled is, and the plateau end temperature TP of the sample with which the sample reaches the temperature plateau leaves, the intermediate temperature TO to which the chamber is heated, and the Cooling rate BII, with which the temperature of the chamber is lowered, exists. To if these values are precisely matched to one another, it is possible to reproducibly larger ones Freeze quantities of cell suspensions with a high H> matocrit and thaw after de-icing obtain a high survival rate for the macro samples. Below survival rate or Total recovery is also understood to mean the proportion of living cells (vitality), multiplied with the percentage of cells recovered in total after thawing and reprocessing for transfusion. This value can, for example, if not according to the specified procedure frozen, lie at 10%, although the vitality values reach over 90% can. With the method described, the total recovery is on average over 80% raised.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Eingefrieren von Zellsuspensionen durch Abkühlen der Probe bis zur Friertemperatur TF durch Erniedrigung der Kammertemperatur mit einer Kühlrate EI, Abkühlen der Kammer auf einen vorgegebenen Temperaturwert Tu, Halten der Kammertemperatur bei diesem Wert, bis die Probentemperatur bei der Plateauendtemperatur Tp das Temperaturplateau verläßt und weiter absinkt, Aufheizung der Kammer bis auf eine Zwischentemperatur T0 unterhalb der Probentemperatur TH, Halten der Kammertemperatur auf diesem Wert bis bis in der Probe die Temperatur erreicht ist, bei der 85% der Probenmasse gefroren vorliegen, und Senken der Kammertemperatur mit der Kühlrate BII, bis die für die Probe erforderliche Endtemperatur erreicht ist.The invention therefore relates to a method for freezing of cell suspensions by cooling the sample to the freezing temperature TF by lowering it the chamber temperature with a cooling rate EI, cooling the chamber to a predetermined one Temperature value Tu, holding the chamber temperature at this value until the sample temperature leaves the temperature plateau at the end of the plateau temperature Tp and continues to decrease, The chamber is heated to an intermediate temperature T0 below the sample temperature TH, hold the chamber temperature at this value until the temperature in the sample is reached, at which 85% of the sample mass is frozen, and lowering the chamber temperature with the cooling rate BII until the final temperature required for the sample is reached.

Das erfindungsgemäße Verfahren is+ dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit einem Zellseparator oder durch übliche Trennmethoden, wie Dichtegradienten-Sedimentation, durch Schwerkraft oder Zentrifugation nach Venenpunktion chne speziellen Zellseparator sammelt, zu zwei Teilen Zellsuspension 0,5 bis 1,5 Teile des Gefrierschutzmittels zugibt, die Gefrierschutzmittel enthaltende Zellsuspensior.The inventive method is + characterized in that the cells with a cell separator or by conventional separation methods such as density gradient sedimentation, by gravity or centrifugation after venipuncture using a special cell separator collects, to two parts of cell suspension, 0.5 to 1.5 parts of the antifreeze admits the cell suspensions containing antifreeze.

in Behälter gibt, und für Lymphozyten mit einer Kühlrate BI von 4 bis 6°C/min auf die Friertemperatur TF und eine Kammertemperatur TU von -55°C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe die Plateauendtemperatur TP erreicht hat, die Kammer auf eine Zwischentemperatur TO von -14°C aufheizt und die Kammer mit der Kühl rate BII von 2 bis 6°C/Min abkühlt oder für Stammzellen mit einer Kühlrate BI von 2 bis 60C/min auf die Friertemperatur TF und eine Kammertemperatur TO 0 von -55 C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe die Plateauendtemperatur TP erreicht hat, die Kammer auf eine Zwischentemperatur T0 von -13°C aufheizt und die Kammer mit der Kühlrate BII von 1 bis 3°C/min abkühlt oder für Granulozyten mit einer Kühlrate BI von 2 bis 60C/min auf die Friertemperatur TF und eine Kammertemperatur TU von -55 0C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe die Piateauendtemperatur Tp erreicht hat, die Kammer auf eine Zwischentemperatur T0 von -13°C aufheizt und die Kammertemperatur mit einer Kühlrate BIT von 2 bis 30C/min abkühlt oder für Knochenmarkzellen mit einer Kühlrate EI von 20C/min auf die Friertemperatur Tr und eine Kammertemperatur Tu von -55°C abkühlt. in container, and for lymphocytes with a cooling rate BI of 4 cools down to 6 ° C / min to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU of -55 ° C, the chamber temperature is kept at this value until the sample reaches the plateau end temperature TP has reached, the chamber heats up to an intermediate temperature TO of -14 ° C and the chamber cools down at the cooling rate BII of 2 to 6 ° C / min or for stem cells with a cooling rate BI of 2 to 60C / min to the freezing temperature TF and a chamber temperature TO 0 cools down from -55 C, the chamber temperature is kept at this value until the sample the plateau end temperature TP has been reached, the chamber to an intermediate temperature T0 heats up from -13 ° C and the chamber cools down at the cooling rate BII from 1 to 3 ° C / min or for granulocytes with a cooling rate BI of 2 to 60C / min to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU of -55 0C cools down, the chamber temperature at this one The value holds the chamber until the sample has reached the plateau end temperature Tp an intermediate temperature T0 of -13 ° C heats up and the chamber temperature with a cooling rate BIT of 2 to 30C / min or for bone marrow cells with a cooling rate EI of 20C / min to the freezing temperature Tr and a chamber temperature Tu cools from -55 ° C.

die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe die Pleteauendtemperatur TP erreicht hat, die Kammer auf die Zwischentemperatur T0 von -130C aufheizt und dann die Kammertemperatur mit der Kühl rate BII von 1°C/min senkt oder für Thrombozyten (Verfahren A) mit einer Kühirate BI von 300C/min auf die Friertemperatur TF und eine Kammertemperatur TU von -650C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe die Plateauendtemperatur Tp erreicht hat, die Kammer auf eine Zwischentemperatur T0 von -25 0C aufheizt und die Kammertemperatur mit einer Kühlrate BIT von -300C/min abkühlt oder für Thrombozyten (Verfahren B) mit einer Kühlrate BI von -60C/min auf die Friertemperatur TF und eine Kammertemperatur TU von -50°C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe die Plateauendtemperatur Tp erreicht hat, die Kammer auf eine Zwischentemperatur T0 von -11 0C aufheizt und die Kammertemperatur mit einer Kühlrate BII von -2# 30C/min abkühlt oder für Erythrozyten mit einer Kühlrate BI von 7000C/min auf die Friertemperatur TF und eine Kammertemperatur TU von -1302C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe die Plateauendtemperatur TP erreicht hat und die Kammer auf eine Zwischentemperatur T0 von -900C aufheizt. und schließlich die Kammertemperatur mit einer Kühl rate von 7000C/min abkühlt.the chamber temperature is kept at this value until the sample reaches the plateau end temperature TP has reached, the chamber heats up to the intermediate temperature T0 of -130C and then lower the chamber temperature with the cooling rate BII of 1 ° C / min or for platelets (Method A) with a cooling rate BI of 300C / min to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU of -650C cools down, the chamber temperature at this value holds the chamber on one until the sample has reached the plateau end temperature Tp Intermediate temperature T0 of -25 0C heats up and the chamber temperature with a cooling rate BIT of -300C / min cools or for platelets (method B) with a cooling rate BI from -60C / min to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU of -50 ° C cools down, keeping the chamber temperature at this value until the sample reaches the plateau end temperature Tp has reached, the chamber heats up to an intermediate temperature T0 of -11 0C and the chamber temperature cools with a cooling rate BII of -2 # 30C / min or for erythrocytes with a cooling rate BI of 7000C / min to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU cools down from -1302C, keeping the chamber temperature at this value until the sample the plateau end temperature TP has been reached and the chamber at an intermediate temperature T0 heats up from -900C. and finally the chamber temperature with a cooling rate of 7000C / min.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren hängt die Friertemperatu TF von der Zusammensetzung der Probe ab und kann aus TabellE entnommen werden oder experimentell ermittelt werden.In the method according to the invention, the freezing temperature depends on TF the composition of the sample and can be taken from Table E or experimentally be determined.

Die Plateauendtemperatur Tp liegt um 0,5 0C unterhalb der Friertemperatur Tr.The plateau end temperature Tp is 0.5 0C below the freezing temperature Tr.

Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit einem Zellseparator, oder durch übliche Trennmethoden, wie Dichtegradienten-Sedimentation, durch Schwerkraft oder Zentrifugation nach Venenpunktion ohne speziellen Zellseparator sammelt, zu zwei Teilen Zellsuspension 0,5 bis 1,5 Teile des Gefrierschutzmittels zugibt, die Gefrierschutzmittel enthaltende Zellsuspension in Behälter gibt und für Lymphozyten mit einer Kühlrate BI von 60C/min auf eine Friertemperatur Tp von -40C und eine Kammertemperatur TU von -55°C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe eine Plateauendtemperatur TP von -4,50C erreicht hat, die Kammer auf eine Zwischentemperatur TO von -13 0C aufheizt und die Kammer mit der Kühlrate BII von 2 bis 3°C/min abkühlt oder für Stammzellen mit einer Kühlrate BI von 6°C/min auf eine Friertemperatur TF von -40C und eine Kammertemperatur TU von -550C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe eine Plateauendtemperatur Tp von -4,50C erreicht hat, die Kammer auf eine Zwischentemperatur TO von -13°C aufheizt und die Kammer mit--der--Kühirate EII von 2 bis 3°C/min abkühlt oder für Granulozyten mit einer Kühlarte EI von 20C/min uaf eine Friertemperatur TF von -4°C und eine Kammertemeratur TU von -55 0C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe eine Plateauendtemperatur Tp von -4,50C erreicht hat, die Kammer auf eine Zwischentemperatur TO von -13°C aufheizt und die Kammertemperatur mit einer Kühlrate von BII von 2 bis 30C/min abkühlt oder für Knockenmarzellen mit einer Kühlrate BI von 2°C/Min auf eine Friertemperatur TF von -4°C und eine Kammertemperatur TU von -55 0C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe eine Plateauendtemperatur Tp von -4,5°C erreicht hat, die Kammer auf die Zwischentemperatur TO von -13°C aufheizt und dann de Kammertemperatur mit der Kühlrate BII von 1°C/min senkt oder für Thrombozyten (Verfahren A) mit einer Kühlarte BI von 30°C/min auf eine Friertemperatur TF von -2°C und eine Kammertemperatur TU von -65°C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe eine Plateauendtemperatur Tp von -2,50C erreicht hat, die Kammer auf eine Zwischentemperatur TO von -25°C aufheizt und die Kammertemperatur mit einer Kühlrate BII von -300C/min abkühlt oder für Thrombozyten (Verfahren B) mit einer Kühlrate von B I von -60C/min auf eine Friertemperatur T von -1,5°C und eine Kammertemperatur Tu von -50°C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe eine Plateauendtemperatur Tp von -2,CCC erreicr.A preferred embodiment according to the invention is characterized in that that the cells with a cell separator, or by conventional separation methods, such as Density gradient sedimentation, by gravity or centrifugation after venipuncture without a special cell separator collects two parts of cell suspension 0.5 to 1.5 Adding parts of the antifreeze, the antifreeze-containing cell suspension in container and for lymphocytes with a cooling rate BI of 60C / min on one Freezing temperature Tp of -40C and a chamber temperature TU of -55 ° C that cools Chamber temperature is kept at this value until the sample reaches a plateau end temperature TP of -4.50C, the chamber heats up to an intermediate temperature TO of -13 0C and the chamber cools at the cooling rate BII of 2 to 3 ° C / min or for stem cells with a cooling rate BI of 6 ° C / min to a freezing temperature TF of -40C and a Chamber temperature TU cools down from -550C, the chamber temperature keeps at this value, until the sample has reached a plateau end temperature Tp of -4.50C, the Chamber is heated to an intermediate temperature TO of -13 ° C and the chamber with - the - cooling rate EII cools from 2 to 3 ° C / min or for granulocytes with a cooling rate EI of 20 ° C / min uaf a freezing temperature TF of -4 ° C and a chamber temperature TU of -55 0C cools, the chamber temperature is kept at this value until the sample reaches a plateau end temperature Tp of -4.50C has reached the chamber to an intermediate temperature TO of -13 ° C heats up and the chamber temperature cools with a cooling rate of BII from 2 to 30C / min or for Knockenmar cells with a cooling rate BI of 2 ° C / min to a freezing temperature TF of -4 ° C and a chamber temperature TU of -55 0C cools down, the chamber temperature holds at this value until the sample reaches a plateau end temperature Tp of -4.5 ° C heats the chamber to the intermediate temperature TO of -13 ° C and then de chamber temperature with the cooling rate BII of 1 ° C / min or for platelets (method A) with a Cooling type BI from 30 ° C / min to a freezing temperature TF of -2 ° C and a chamber temperature TU cools down from -65 ° C, the chamber temperature is kept at this value until the sample has a Plateau end temperature Tp of -2.50C has reached, the chamber to an intermediate temperature TO of -25 ° C and the chamber temperature with a cooling rate BII of -300C / min cools or for platelets (method B) with a cooling rate of B I of -60C / min cools to a freezing temperature T of -1.5 ° C and a chamber temperature Tu of -50 ° C, the chamber temperature is kept at this value until the Sample a plateau end temperature Tp of -2, CCC reachable.

hat, die Kammer auf eine Zwischentemperatur " von 1100 aufheizt und die Kammertemperatur mit einer Kühl rate PII von -2 # 3°C/min abkühlt, für Erythrozyten mit einer Kühlrate BI von 700°C/min auf eine Friertemperatur TF von -20C und eine Kammertemperatur TU von -65°C abkühlt, die Kammertemperatur bei diesem Wert hält, bis die Probe eine Plateauendtemperatur Tp von -2,5°C erreicht hat und die Kammer auf eine Zwischentemperatur T0 von -25°C aufheizt und schließlich die Kammertemperatur mit einer Kühlrate von 700°C/min abkühlt. has, the chamber is heated to an intermediate temperature "of 1100 and the chamber temperature cools with a cooling rate PII of -2 # 3 ° C / min, for erythrocytes with a cooling rate BI of 700 ° C / min to a freezing temperature TF of -20C and a Chamber temperature TU cools down from -65 ° C, the chamber temperature keeps at this value, until the sample has reached a plateau end temperature Tp of -2.5 ° C and the chamber heated to an intermediate temperature T0 of -25 ° C and finally the chamber temperature cooled at a cooling rate of 700 ° C / min.

Das Verfahren A für Thrombozyten ist das Glycerin-Glucose-Verfahren, d.h. ein Verfahren, bei dem als Gefrierschutzmittel eine Lösung aus 4 bis 6% Glycerin, 3 bis 5% Glucose, 20 bis 40% Plasma in Aminosäurenlösung verwendet wird.Method A for platelets is the glycerol-glucose method, i.e. a process in which a solution of 4 to 6% glycerine, 3 to 5% glucose, 20 to 40% plasma in amino acid solution is used.

Das Verfahren B für Thrombozyten ist das DMSO-Verfahren, d.h. ein Verfahren, bei dem als Gefrierschutzmittel eine Lösung aus 20 bis 40% Dimethylsulfoxid und 60 bis 80% Aminosäuren-Glucoselösung verwendet wird.Method B for platelets is the DMSO method, i.e. a Process in which a solution of 20 to 40% dimethyl sulfoxide is used as an anti-freeze agent and 60 to 80% amino acid glucose solution is used.

In der folgenden Tabelle sind die verschiedenen Temperaturen für die Kühlraten, die Gefrierpunkte, die Plateau endtemperaturen etc. für verschiedene Zellarten zusammengefaßt. Zellart Kühl- Kühl- Gefrier- Plateau- Start TU TO rate rate punkt ende BII: Beispiel BI BII TF TP TII 2) Granulozyt)a) -6°C/min -2-3°C/min -4°C -4.5°C -12°C -55°C -13°C 3) Knochenmark)a) -6°C/min -1°C/min -4°C -4.5°C -12°C -55°C -13°C 4) Thrombozyt)b) -30°C/min -30°C/min -2°C -2.5°C -20°C -65°C -25°C 5) Erythrozyt) -700°C/min -700°C/min -2°C -2.5°C -20°C -130°C -90°C 6) Stammzelle)a) -2°C/min -1°C/M -4°C -4.5°C -12°C -55°C -13°C 7) Thrombozyt)c) -6°C/min -2-3°C/min -1.5°C -2.0°C -10°C -50°C -11°C 8) Lymphozyt)d) -4°C/min -4-6°C/min -2.5°C -3.0°C -13°C -55°C -14°C 9) Granulozyt)e) -6C/min -2-3°C/min -2.5°C -3.0°C -12°C -55°C -13°C a) DMSO-Prozeß (10 % in der Freierlösung) b) Gylzerin-Glucose-Prozeß c) DMSO-Prozeß (4% in der Freiersuspendion) d) Polyäthylen-Prozeß (10 % in der Friersuspension) e) Gylzerin-Glucose-Dextran-Prozeß (5% Glyzerin, 4% Glukose, 7% Dextran T10 in der Friersuspension) Die Erfindung betrifft weiterhin die bei dem Verfahren erhaltene Zellsuspension und ihre Verwendung zur Bekämpfung von Tumoren.The following table shows the different temperatures for the Cooling rates, the freezing points, the final plateau temperatures etc. for different Cell types summarized. Cell type Cool Cool Freezer Plateau Start TU TO rate rate point end BII: Example BI BII TF TP TII 2) Granulocyte) a) -6 ° C / min -2-3 ° C / min -4 ° C -4.5 ° C -12 ° C -55 ° C -13 ° C 3) Bone marrow) a) -6 ° C / min -1 ° C / min -4 ° C -4.5 ° C -12 ° C -55 ° C -13 ° C 4) Platelet) b) -30 ° C / min -30 ° C / min -2 ° C -2.5 ° C -20 ° C -65 ° C -25 ° C 5) Erythrocyte) -700 ° C / min -700 ° C / min -2 ° C -2.5 ° C -20 ° C -130 ° C -90 ° C 6) stem cell) a) -2 ° C / min -1 ° C / M -4 ° C -4.5 ° C -12 ° C -55 ° C -13 ° C 7) thrombocyte) c) -6 ° C / min -2-3 ° C / min -1.5 ° C -2.0 ° C -10 ° C -50 ° C -11 ° C 8) Lymphocyte) d) -4 ° C / min -4 -6 ° C / min -2.5 ° C -3.0 ° C -13 ° C -55 ° C -14 ° C 9) Granulocyte) e) -6C / min -2-3 ° C / min -2.5 ° C -3.0 ° C -12 ° C -55 ° C -13 ° C a) DMSO process (10% in the release solution) b) Glycerine-glucose process c) DMSO process (4% in the freezing suspension) d) Polyethylene process (10% in the freezing suspension) e) Glycerine-glucose-dextran process (5% glycerine, 4% glucose, 7% dextran T10 in the Freezing suspension) The invention also relates to the method cell suspension obtained and its use for combating tumors.

Anhand der beigefügten Figur wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.The method according to the invention is explained in more detail with the aid of the attached figure explained.

In der Figur ist auf der Abszisse die Zeit t in min und auf der Ordinate die Temperatur T in 0C aufgetragen. Es sind die Abkühlkurven der Kammer und der Proben dargestellt.In the figure, the time t is on the abscissa in minutes and on the ordinate the temperature T is plotted in 0C. There are the cooling curves of the chamber and the Samples shown.

In der Zeichnung bedeuten: BI und BII die Kühlraten für die Kammer TF der Frierpunkt der Probe Tp die Temperatur der Probe am Plateauende T11 die Temperatur der Probe bei Beginn der Abkühlung der Kammer mit der Kühlrate BII TU die Temperatur, auf die die Kammer abgekühlt wird, und Tg die Temperatur, auf die die Kammer wieder erwärmt wird.In the drawing: BI and BII mean the cooling rates for the chamber TF the freezing point of the sample Tp the temperature of the sample at the end of the plateau T11 the temperature the temperature of the sample at the beginning of the cooling of the chamber at the cooling rate BII TU, to which the chamber is cooled, and Tg is the temperature to which the chamber will return is heated.

Für die jeweiligen Zellsorten stehen all diese Werte miteinander in Beziehung. Nur wenn diese Werte innerhalb der sehr engen oben aufgeführten Grenzen eingehalten werden, gelingt es, auf reproduzierbare Weise größere Mengen an Therapiezellen zu gefrieren und nach dem Auftauen hohe Überlebensraten zu erhalten. Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren naher erläutert.For the respective cell types, all of these values are related to one another Relationship. Only if these values are within the very narrow limits listed above are adhered to, it is possible to reproducibly large amounts of therapy cells to freeze and maintain high survival rates after thawing. Hereinafter the method according to the invention is explained in more detail.

Vorbereitung zum Frieren Die Therapiezellen werden über Zeiträume von 2 bis 6 h, vorzugsweise über Zeiträume von 3 h, mit einem Zellseparator gesammelt. Bis zum Vorliegen der Zellen für das Einfrieren vergehen im Mittel 3 bis 4 h. Untersuchungen haben gezeigt, daß iele lebende Zellen, z.B. Lymphozyten, in vitrc kurzlebing sind und daß die bereits einsetzende Schädigung vor de Frieren zeitabhängig ist. Der Zeitverlust durch Umfüllprozedurer zu:. Auffüllen auf bestimmte Volumina ist erheblic und dauert oft bis etwa 1 h. Solche Umfüllvorgänge werden beim erfindungsgemäßen Verfahren vermieden. Da sich eine Vorschädigung der Zellen vor dem Frieren multiplikativ auf die Schädigung nach dem Auftauen auswirkt, bringt Zeitersprnis bei dem. erfindungsgemäßen Verfahren eine erhöhte Zellvitalität. Außerdem wird durch die Reduzierung von Umfüllvorgängen die Sterilitätssicherheit erhöht.Preparing to Freeze The therapy cells are over periods of time from 2 to 6 hours, preferably over periods of 3 hours, collected with a cell separator. It takes an average of 3 to 4 hours for the cells to be available for freezing. Investigations have shown, that all living cells, e.g. lymphocytes, are in vitrc are short-lived and that the onset of damage before the freezing is time-dependent is. The loss of time due to the transfer procedure to :. Filling up to certain volumes is significant and often takes up to about 1 hour. Such transfer processes are in accordance with the invention Procedure avoided. Since there is a pre-existing damage to the cells before freezing, multiplicative affects the damage after thawing, saves time for the. according to the invention Procedure for increased cell vitality. In addition, by reducing the number of decanting processes increases the sterility security.

Für das erfindungsgemäße Verfahren werden die Therapiezellen in großen Mengen gesammelt, und zwar für Knochenmark 1x109 bis i011 Zellen je Einzelprobe, für Lymphozyten 1 2 109 bis 1 x loll Zellen pro Einzelprobe, für Stammzellen 1 x 106 bis 1 x 108 Zellen pro Einzelprobe, für Granulozyten 1 x 109 bis 1 x 1011 Zellen pro Einzelprobe und für Thrombozyten (Plättchen) 1 x 1010 bis 1 x 1012 Zellen pro Einzelprobe.For the method according to the invention, the therapy cells are in large Quantities collected, namely for bone marrow 1x109 to 1011 cells per individual sample, for lymphocytes 1 2 109 to 1 x loll cells per individual sample, for stem cells 1 x 106 to 1 x 108 cells per individual sample, for granulocytes 1 x 109 to 1 x 1011 cells per individual sample and for thrombocytes (platelets) 1 x 1010 to 1 x 1012 cells per Individual sample.

Diese Korpuskeln werden dann in einem Volumen von 50 bis 500 ml, vorzugsweise 100 bis 200 ml, suspendiert. Das Zellmaterial ist, bedingt durch die Gewinnung, großen Schwankungen unterworfen und es ist vor der Zellseparation nicht bekannt, welche Zahl der benötigten Zellen erhalten wird.These corpuscles are then in a volume of 50 to 500 ml, preferably 100 to 200 ml, suspended. The cell material is, due to the extraction, subject to large fluctuations and it is not known before the cell separation what number of cells needed will be obtained.

Die für die Therapie benötigte Zellmenge wird mit einem Gefrierschutzmittel versetzt. Im allgemeinen verwendet man auf 2 Teile Zellsuspension 0,5 bis 1,5 Teile Gefrierschutzmittel.The amount of cells required for therapy is treated with an anti-freeze agent offset. In general, 0.5 to 1.5 parts are used per 2 parts of cell suspension Antifreeze.

Bevorzugt wird ein Gefrierschutzmittel verwendet, das 30% DMSO und 70% Aminosäuren-Glucoselösung enthält. Die Verwendung des Dimethylsulfoxides ist allgemein bekannt, jedoch ist die erforderliche Konzentration an das Frierverfahren gebunden. Polyäthylenglycol kann alternativ verwendet werden.Preference is given to using an anti-freeze that contains 30% DMSO and Contains 70% amino acid glucose solution. The use of dimethyl sulfoxide is well known, however, the required concentration is on the freezing process bound. Polyethylene glycol can alternatively be used.

Dieses Gefrierschutzmittel erreicht eine weitergehende Verminderung der osmotischen Belastung der Zellen während de Prozesses, und erspart deshalb die durch die Konservierw:s-und Aufbereitungsphase bedingten Verluste. Hydroxyäthylstärke (HES) findet Verwendung für Erythrozyten und gestattet bei Einfrierung in der angegebenen Weise die Rucklrarfusion der aufgetauten Konservie ohne weitere Kachbehandlung, wie z.B. Waschen.This antifreeze achieves a further reduction the osmotic load on the cells during the process, and therefore saves the losses caused by the conservation and processing phase. Hydroxyethyl starch (HES) is used for erythrocytes and is permitted when frozen in the specified range Way the reverse fusion of the thawed preserve without further caching treatment, such as washing.

Durch die Verwendung des Gefrierschutzmittels wird die osmotische Belastung der Zellen minimiert. Die das Gefrierschutzmittel enthaltende Zellsuspension wird in ein Temperieibad gegeben. Die für Therapiezwecke einzufrierenden Zellen werner in Plattenform eingefroren, da hierbei das Temperaturfeld in der Probe besonders günstig für die einheitliche Qualität der Zellen ist. Die Schichtdicke der Suspension beträgt beispielsweise 5 mm für 120 ml je Platte bzw. 10 mm für 240 ml.By using the antifreeze, the osmotic Cell stress is minimized. The cell suspension containing the antifreeze is placed in a temperature bath. The cells to be frozen for therapeutic purposes Werner frozen in plate form, because this is where the temperature field in the sample is special is favorable for the uniform quality of the cells. The layer thickness of the suspension is, for example, 5 mm for 120 ml per plate or 10 mm for 240 ml.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können als Behälter für die Proben die üblichen Behälter, wie Blechflascnen, Blechplatten, Container usw., verwendet werden. Bevorzugt werde.In the method according to the invention can be used as a container for the samples the usual containers, such as sheet metal bottles, sheet metal plates, containers, etc., are used will. I will be preferred.

jedoch Beutel mit einem Volumen von 50 bis 500 ml, vorzugsweise von 110 bis 300 ml, die 4 bis 10 mm dick sind, verwendet. Die Verwendung solcher Beutel ergibt eine hohe Sterilitätssicherheit, da ein Wegwerfsystem eingesetzt wird, und man erhält keine Ausfälle durch eindringenden Flüssigstickstoff während der Lagerungsphase, die oft mehrere Jahre umfaßt, da der Beutel verschweißt ist. Metallbehälter werden lediglich zugestöpselt und es kommt immer zu Undichtigkeiten.however, bags with a volume of 50 to 500 ml, preferably of 110 to 300 ml, which are 4 to 10 mm thick, is used. The use of such bags results in a high level of sterility security, since a disposable system is used, and there are no failures due to penetrating liquid nitrogen during the storage phase, which often takes several years because the bag is sealed. Be metal containers just plugged in and there are always leaks.

Die Zellsuspension wird zu gleichen Teilen in Frierbeutel gefüllt. Das tatsächlich vorhandene Volumen wird durch Wiegen bestimmt. Da die Suspension jetzt eine für das erfolgreiche Einfrieren besonders günstige Zusammensetzung aufweist (10h DMSO, 23 Aminosäuren-Glucoselösung, Zellvolumen-Ante il 35SU, 29% Plasma und 3% Antigerinnungs- und Stabilisatorzusatz), wird dieses Volumen nicht mehr verändert. Die Referenzprobe - bestehend aus eben dieser Lösung mit isotoner Salzlösung statt des Zellvolumenanteils versetzt, einem Frierbeutel, einem Blechplattenbehälter zur Formgebung und zweier Kupferkonstantan-Thermoelemente (Spitzendurchmesser 0,5 mm), die mit einem Distanzhalter in der räumlichen Mitte dieser Probe fixiert sind - wird mit der sich auf gleicher Temperatur befindlichen Flüssigkeit im gleichen Gewicht, wie das Zellsuspensionsvolumen je Beutel gefüllt, und in einen Kupfercontainer gestellt. Dieser wird zugeklappt, geklammert und in die Halterung im Frierschacht gestellt.The cell suspension is filled into freezer bags in equal parts. The actual volume is determined by weighing. Because the suspension now one for the successful Freezing particularly favorable composition (10h DMSO, 23 amino acid glucose solution, cell volume proportion 35SU, 29% Plasma and 3% anticoagulant and stabilizer additive), this volume will not more changed. The reference sample - consisting of this same solution with isotonic Saline solution instead of the cell volume, a freezer bag, a sheet metal container for shaping and two copper constantan thermocouples (tip diameter 0.5 mm), which are fixed with a spacer in the spatial center of this sample - becomes in the same with the liquid which is at the same temperature Weight, like the cell suspension volume, filled per bag, and in a copper container posed. This is closed, clamped and in the holder in the freeze shaft posed.

Die Verwendung einer entsprechenden Referenzprobe ist wesenlicher Bestandteil des Frierverfahrens. Durch die Referenzprobe wird das jeweilige Verhalten der Probe unter den gegebenen Bedingungen erfaßt und automatisch im Frierprozeß berücksichtigt. Da die Referenzprobe den Prozeßablauf bestimmt, handelt es sich hierbei um eine Regelung und nicht wie üblicherweise um eine Steuerung.The use of an appropriate reference sample is more essential Part of the freezing process. The respective behavior is determined by the reference sample of the sample is recorded under the given conditions and automatically in the freezing process considered. Since the reference sample determines the process sequence, it is in this case a regulation and not, as is usually the case, a control.

Die Frierbeutel mit der Zellsuspension werden ebenfalls in Kupfercontainer gefüllt, nachdem beide abgetrocknet wurden.The freezer bags with the cell suspension are also placed in copper containers filled after both were dried off.

Dadurch wird ein unerwlinschter Phasenwechsel des anhaftenden Wassers vermieden. Die Kupfercontainer bestehen aus 2 mm dickem Kupferblech, sind aufklappbar und verleihen dem Beutel eine Schichtdicke von 5,0 t 0,1 mm. Die Kupfercontainer sind Bestandteil des Verfahrens. Die Verwendung der Kupfercontainer hat ein besonders homogenes Temperaturfeld innerhalb der frierenden Proben zur Folge. Untersuchungen hierüber sind in der Literaturstelle M.W. Scheiwe, G. Jansen: "Ice Formation in Bags ...n+ näher beschrieben.This results in an undesired phase change in the adhering water avoided. The copper containers are made of 2 mm thick copper sheet and can be opened and give the bag a layer thickness of 5.0 to 0.1 mm. The copper container are part of the procedure. The use of the copper container has a special one result in a homogeneous temperature field within the freezing samples. Investigations about this are in the reference M.W. Scheiwe, G. Jansen: "Ice Formation in Bags ... n + described in more detail.

+aus dem Helmholtz-Institut für Biomedizin, YII International Conference on Medical & Biological Engineering Jerusalem, Israel, August 19-24, 1979 Durchführung des Friervorgangs Vor Beginn des Prozeßablaufes des Frierens werden am Progammgeber die gewünschten und charakteristischen Einstelldaten eingegeben. Durch Verwendung eines Mikroprozessors-Systems werden alle erforderlichen Daten schnell und über Schalter eingestellt. Diese Daten lassen sich, falls gewünscht, auch, während des Frierens ändern, um z.B. Variationen in der Abkühlkurve in der Auswirkung auf die Zellvitalität studieren zu können. Zusätzlich können verschiedene Festprogramme eingegeben werden, die z.B. für Routinezzecke eine Überprüfung der vorhandenen Einstelldaten unnötig machen.+ from the Helmholtz Institute for Biomedicine, YII International Conference on Medical & Biological Engineering Jerusalem, Israel, August 19-24, 1979 execution of the freezing process Before the freezing process begins, the program generator enter the desired and characteristic setting data. By using a microprocessor system gets all the necessary data quickly and over Switch set. If desired, this data can also be saved during the Change in freezing to e.g. variations in the cooling curve in the effect on the To be able to study cell vitality. In addition, various fixed programs can be entered, e.g. for routine purposes a check of the existing setting data make unnecessary.

Die in der Zeichnung dargestellten Kühlkurven für die Probe und die Kammer sind für die einzelnen Zellarten wie folgt: Zellart Kühl- Kühl- Frier- Plateau- Start Tu T rate rate punkt ende BII: BI BII TF Tp TII Lymphozyt 6°/min 2-3°/min-4°C -4,5°C -12°C -55°C -13° Granulozyt 2°/min 2-3°/min-4°C -4,5°C -12°C -55°C -13° Knochenmark 2°/min 1 / min-4°C -4,5°C -12°C -55°C -13° Thrombozyt 30°/min 30° /min-2°C -2,5°C -20°C -65°C -25° Erythtozyt 25°/min 700°/min-2°C -2,5°C -20°C -65°C -25° Abkühlverfahren Am Beispiel des Lymphozyten soll der Ablauf des Frierprozesses geschildert werden. Die Kammertemperatur wird BI = 60/min abgesenkt. Die Probentemperatur folgt dieser Abkühlung bis der Frierpunkt der Lösung erreicht wird. Der Frierpunkt ist in Tabellenwerten nachzulesen oder zu messen (osmometrisch) und beträgt z.B. für die 10% DMSO-Lösung des Beispiels 4,000.The cooling curves shown in the drawing for the sample and the Chamber are as follows for the individual cell types: Cell type Cooling Cooling Freezing Plateau Start Tu T rate rate point end BII: BI BII TF Tp TII lymphocyte 6 ° / min 2-3 ° / min-4 ° C -4.5 ° C -12 ° C -55 ° C -13 ° Granulocyte 2 ° / min 2-3 ° / min-4 ° C -4.5 ° C -12 ° C -55 ° C -13 ° Bone marrow 2 ° / min 1 / min-4 ° C -4.5 ° C -12 ° C -55 ° C -13 ° Platelet 30 ° / min 30 ° / min-2 ° C -2.5 ° C -20 ° C -65 ° C -25 ° Erythtocyte 25 ° / min 700 ° / min-2 ° C -2.5 ° C -20 ° C -65 ° C -25 ° cooling method The course of the freezing process will be described using the example of the lymphocyte. The chamber temperature is lowered BI = 60 / min. The sample temperature follows this Cooling until the freezing point of the solution is reached. The freezing point is in tabular values can be read or measured (osmometric) and is e.g. for the 10% DMSO solution of the example 4,000.

In dieser Phase befindet sich die Probe im ungetrorenen Zustand. Die Äbkühlgeschwindigkeit BI ist in zahlreichen Versuchsreihen als besonders günstig für die Vitalität der Zellen ermittelt worden. Bei anderen Abkuhlgeschwindigke iten tritt vermutlich durch Umlagerungen innerhalb der Zellmembran-Bausteine und Beeinträchtigung der Mechanismen des aktiven Stofftransports (K+, Na+-Pumpe) eine nachweisbare Schädigung auf ("thermaler Schock"). Mit Erreichen des Frierpunktes TF wird die Kammer auf TU =-55°C mit etwa 150°C/min abgekühlt.In this phase the sample is in an unfrozen state. the Cooling speed BI is particularly favorable in numerous test series for the vitality of the cells has been determined. At other cooling speeds presumably occurs through rearrangements within the cell membrane building blocks and impairment the mechanisms of active substance transport (K +, Na + pump) cause detectable damage on ("thermal shock"). When the freezing point TF is reached, the chamber opens TU = -55 ° C cooled at about 150 ° C / min.

Durch die Größe von TU wird die Wärmeabgabe während des Phasenwechsels der Probe, bei der latente Wärme frei wird, beeinflußt. Es hat sich gezeigt, daß eine mittlere Wanderungsgeschwindigkeit der Eisfronten von etwa 1,50 mm/min (Bereich 1,25 bis 2,5 mm/min) entsprechend einem Temperaturplateau von 1,6 min Dauer für die 5 mm dicke Platte aich besonders vorteilhaft auswirkt. Obwohl die Wirkung dieses Effektes auf die Zellen Gegenstand der Forschung ist, kann gesagt werden, daß die Eisfront die Zellen bei geringeren Werten vermutlich zu sehr zusammenschiebt;bei großeren Werten werden die Zellen durch Wachstum spitzer Eiskristalle evtl. mechanisch geschädigt.The heat output during the phase change is due to the size of TU of the sample that releases latent heat. It has been shown that an average migration speed of the ice fronts of about 1.50 mm / min (area 1.25 to 2.5 mm / min) corresponding to a temperature plateau of 1.6 min duration for the 5 mm thick plate is particularly beneficial. Although the effect of this The effect on the cells is the subject of research, it can be said that the Ice front probably pushes the cells too much together at lower values; at At higher values, the cells may become mechanically through the growth of pointed ice crystals damaged.

Weiterhin wird der Stoffaustausch Zelle - Umgebung, insbesondere der extrem starke Wassertransport, durch diese Phänomene beeinflußt.Furthermore, the exchange of substances between the cell and the environment, in particular the extremely strong water transport, influenced by these phenomena.

Eine auftretende Unterkühlung wird durch die Regelung automatisch berücksichtigt. Dieser Umstand macht die Abkühlung wesentlich reproduzierbarer als bisher möglich, da die Größe der Unterkühlung unabhängig vom Probevolumen stark schwanken kann. Da dieser Umstand die Dauer des Phasenuswandels bei konstanter Temperatur beeinflußt, wird bei einer Steuerung keine reproduzierbare Abkühlung erreicht. Außerdem ist die Linearität der Abkühlkurve nach dem Phasenwechsel nicht gewährleistet, was eine Zellschädigung zur Folge hat.Any undercooling that occurs is automatically controlled by the control considered. This fact makes the cooling much more reproducible than previously possible because the size of the hypothermia is strong regardless of the sample volume can fluctuate. Because this circumstance the duration of the phase change at constant temperature influenced, no reproducible cooling is achieved with a control. aside from that the linearity of the cooling curve after the phase change is not guaranteed, what causes cell damage.

Das Ende des Phasenwechsels bei konstanter Temperatur wird bei Erreichen der Temperatur Tp, die vorher eingestellt wird, registriert.The end of the phase change at constant temperature is reached upon reaching the temperature Tp which is set in advance.

Tp = TF -0,50C. Tp = TF -0.50C.

Die Kammer wird nun durch Zuschalten der elektrischen Heizung mit 50°/min erwärmt und erreicht Tow -130C, und hält diese Temperatur konstant. Da die Probe aufgrund des binären bz.The chamber is now activated by switching on the electrical heating Heats up to 50 ° / min and reaches Tow -130C, and keeps this temperature constant. Since the Sample due to the binary or

ternären Charakters der wäßrigen Lösung noch weiter Eis bildet, bei gleichzeitiger Gefrierpunktabsenkung der sich aufkonzentrierenden Restlösung, wird bis zum Erreichen von dem jeweiligen Eutektikum (Salzwasser -21,20C) weitere latente Wärme frei.The ternary character of the aqueous solution continues to form ice simultaneous lowering of the freezing point of the concentrating residual solution until reaching the respective eutectic (salt water -21.20C) further latent ones Heat free.

Bis die Probe -12°C erreicht hat (T11), spielt dieser Vorgang auch wärmetechnisch eine große Rolle. Da erst ab dieser Temperatur die Probe hinsichtlich des Frierens als gefrorener Körper ohne Wärmequellen angesehen werden kann, wird die bis dahin ablaufende Abkühldung durch Konstanthalten der Kammer auf TO =-13°C erreicht.This process also plays until the sample has reached -12 ° C (T11) a major role in terms of heat technology. Since only from this temperature the sample with regard to of freezing can be viewed as a frozen body with no heat sources the cooling down until then by keeping the chamber constant at TO = -13 ° C achieved.

Hat die Probe TII durchlaufen, wird die Kammer weiter mit EII, 20/min abgekühlt. Dies muß bis -350C durchgeführt werden. Bei wird die Heizung abgeschaltet. Dieses erfolgt automatisch durch Ermittlung der benötigten Heizleistung. Bei 350C wird die Abkühlung mit 10°/min auf -1300C fortgesetzt. Hiermit ist die geregelte Abkühlung beendet.If the sample has passed through TII, the chamber continues to run at EII, 20 / min cooled down. This must be done up to -350C. The heating is switched off at. This is done automatically by determining the required heating power. At 350C the cooling is continued at 10 ° / min to -1300C. This is the regulated Cooling down finished.

Auswirkung auf Zellen In der Abkühlphase bis -35°C finden weitere erhebliche Veränderungen des Zustandes der Zellen und in der ursprünglich homop neun Suspensionsflüssigkeit statt, die für die Vitalität Ton äußerster Wichtigkeit sind. Ab Erreichen der frstarrungstemperatur TF bildet sich die neue Phase Eis; dadurch wird der Restlösung Wasser entzogen, und es findet eine Aufkonzentrierung der Flüssigkeit statt. Die Zelle reagiert mit Wasserabgabe, was jedoch nicht beliebig schnell erfolgt, sondern vielmehr durch die Nembranpermeabilität der Zellen limitiert ist.Effect on cells In the cooling phase down to -35 ° C there are more considerable changes in the state of the cells and in the originally homop nine suspension liquid held for vitality Sound utmost Are important. When the solidification temperature TF is reached, the new one is formed Phase ice; this removes water from the residual solution and concentrates it the liquid instead. The cell reacts by releasing water, but this is not arbitrary occurs quickly, but rather limited by the membrane permeability of the cells is.

Wird langsamer als angegeben gefroren, so bleibt die Zelle zu lange den konzentrierten Lösungen ausgesetzt; die Zelle wird zerstört, da die Schrumpfung zu stark ist und auch Proteine denaturiert werden. Wird schneller als angegeben gekühlt, verbleibt Wasser in der Zelle, nachdem T11 erreicht ist. Dieses bildet intrazelluläres Eis und zerstört dadurch die Zelle von innen her.If freezing is slower than indicated, the cell will stay too long exposed to the concentrated solutions; the cell is destroyed because of the shrinkage is too strong and proteins are also denatured. Will be faster than stated cooled, water will remain in the cell after T11 is reached. This makes intracellular ice and thereby destroys the cell from the inside.

Untersuchungen zeigten, daß diese Effekte bereits bei geringfügigen Abweichungen von der angegebenen Kuhirate auftreten.Investigations showed that these effects were already minor Deviations from the specified cow rate occur.

Überraschenderweise kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, wenn die Probentemperatur gleich dem Frierpunkt der eingefüllten Lösung ist, mit maximal bis 15min abkühlen, bei Erythrozyten jedoch bis maximal 7000/min. Dadurch kann die Wanderungsgeschwindigkeit der Eisfront für die Zellen (über die Beeinflussung der Länge des Temperaturplateaus) auf den günstigen Wert von 1,5 mm/min, bei Erythrozyten 21 mm/min, gebracht werden. Zellen, die mit anderen Abkühlungsraten gefroren werden, können ebenfalls geregelt eingefroren werden.Surprisingly, in the process according to the invention, if the sample temperature is equal to the freezing point of the filled solution, with Cool down for a maximum of 15 minutes, but for erythrocytes up to a maximum of 7000 / min. Through this the migration speed of the ice front for the cells (by influencing the length of the temperature plateau) to the favorable value of 1.5 mm / min, for erythrocytes 21 mm / min. Cells frozen at different cooling rates can also be frozen in a controlled manner.

Thrombozyten z.B. werden mit 300C/min gefroren (Glyzerin-Glucoseverfahren, Verfahren A); die Beeinflussung des Temperaturplateaus ist aufgrund der hohen maximalen Kühlrate auch hier immer noch möglich. Erythrozyten mit HES als Schutzadditiv werden z.B. mit 7O00/min gefroren. Auch diese hohe Einfriergeschwindigkeit ist mit dem angegebenen Verfahren zu realisieren.Platelets, for example, are frozen at 300C / min (glycerine-glucose method, Method A); the influence of the temperature plateau is due to the high maximum Cooling rate still possible here too. Erythrocytes can be used with HES as a protective additive e.g. frozen at 7000 rpm. This high freezing speed is also associated with the to realize the specified procedure.

Durch die Form der Anströmung, der speziellen Gestaltung der Container und der besonders geringen Schwankung der Kammertemperatur um den Sollwert wird ein Einhalten der Abkühlkurve in engen Grenzen, nicht nur in der Probenmitte, sondern auch in Wandnähe, erhalten.Due to the shape of the flow, the special design of the container and the particularly small fluctuation in the chamber temperature around the setpoint adherence to the cooling curve within narrow limits, not only in the middle of the sample, but also near the wall.

Die Platten werden etwa mit 40 m/s längs angeströmt. Damit sich die laminare Grenzschicht und der Umschlagpunkt zur turbulenten Grenzschicht bereits vor der eigentlichen Rupferplatte befinden, sind spezielle Abrißkanten und Strömungsprofile an der Platte angebracht. Die Kammertemperatur schwankt um den Sollwert im Mittel um 0,5°C. Diese auBerordentlich geringe Schwankung ist bereits an der Innenseite der Folie, aus der der Frierbeutel besteht, nicht mehr meßbar (Auflösung des Meßgerätes 0,1°C).The flow against the plates is about 40 m / s. So that the laminar boundary layer and the transition point to the turbulent boundary layer already are in front of the actual plucking plate, there are special tear-off edges and flow profiles attached to the plate. The chamber temperature fluctuates around the setpoint on average around 0.5 ° C. This extraordinarily small fluctuation is already on the inside the film from which the freezer bag is made can no longer be measured (resolution of the measuring device 0.1 ° C).

Die frierkammer ist so gestaltet, daß das Kältemittel im Kreislauf umgewälzt wird; die Konstruktion des Frierkanals erlaubt das parallele Einfrieren von 6 Proben, die alle in gleicher Weise mit der Strömung beaufschlagt werden. Die Homogenität der Strömung wird durch zusätzliche Leitbleche erhalten, die hinter dem Lüfter angebracht sind. Die Zufuhrleitung des Kältemittels und die Positionierung der Einlaßdüse unterhalb des Lüfters sind weitere Gründe für die geringe Soll-Ist-Differenz-Schwankung der Kammertemperatur.The freezer is designed in such a way that the refrigerant circulates is circulated; the construction of the freezing channel allows parallel freezing of 6 samples, all of which are exposed to the flow in the same way. the Homogeneity of the flow is obtained by additional baffles behind attached to the fan. The refrigerant supply line and the positioning the inlet nozzle below the fan are further reasons for the low target / actual difference fluctuation the chamber temperature.

Der FrierprozeB hat sich ebenfalls bewährt zum Einfrieren von zylindrischen Proben. Die Zellen für Testzwecke werden in Röhrchen mit 2 ml Fassungsvolumen suspendiert. Die Frierlösung ist die gleiche, wie unter Abschnitt 3 beschrieben, die Anzahl der Zellen liegt bei 1 x 107 je Probe. Als Referenzprobe wird ebenfalls ein solches Röhrchen mit der Frierlösung gefüllt, die Temperaturmessung erfolgt mit einem entsprechend fixierten Thermoelernent in der Probenmitte.The freezing process has also proven itself for freezing cylindrical Rehearse. The cells for test purposes are suspended in tubes with a capacity of 2 ml. The freezing solution is the same as described in Section 3, the number of Cells is 1 x 107 per sample. Such a reference sample is also used as a reference sample The tube is filled with the freezing solution, the temperature is measured with a corresponding fixed thermal element in the middle of the sample.

Die Einstelldaten des Frierprozesses können beibehalten werden, de die etwas längere optimale Plateauphase (Dauer 3,3 min) automatisch ausgeregelt wird.The setting data for the freezing process can be retained, de the slightly longer optimal plateau phase (duration 3.3 min) is automatically adjusted will.

Ausgedehntere zylindrische Proben sind zwar ebenfalls nach diesem Verfahren in gewünschter Weise abkühlbar, aber eine 10 mm übersteigende Probenschichtdicke in der hauptwärmeabgebenden Richtung ergibt für die ellvitalität verschlechterte Werte. Deshalb kann z.B. das System des Holländischen Roten Kreuzes, welches auf die Verwendung von Blechflaschen mit 600 ml Inhalt für die Kryokonservierung von roten Blutkörperchen zurückgreift, nicht für die wesentlich komplizierteren anderen Blutzellkomponenten herangezogen werden.More extensive cylindrical samples are also after this Process can be cooled in the desired manner, but a sample layer thickness exceeding 10 mm in the main heat-emitting direction results in decreased vitality Values. Therefore, e.g. the system of the Dutch Red Cross, which is based on the use of metal bottles with a capacity of 600 ml for the cryopreservation of uses red blood cells, not for the much more complicated others Blood cell components are used.

Ende der Beschreibung.End of description.

Claims

Method for freezing cell suspensions Patent claims 1. Method for freezing cell suspensions by cooling the sample to Freezing temperature TF by lowering the chamber temperature with a cooling rate BI, The chamber is cooled to a predetermined temperature value Tu, the chamber temperature is maintained at this value until the sample temperature is at the plateau end temperature Tp, leaves the temperature plateau and continues to fall, the chamber is heated up to an intermediate temperature Tg below the sample temperature TH, maintaining the chamber temperature at this value Tg until the temperature in the sample is reached at which 85% of the Sample mass is frozen, and the chamber temperature is lowered with the cooling rate BII, until the final temperature required for the sample is reached, thereby g e it is not indicated that the cells can be separated with or through a cell separator common separation methods, such as density gradient sedimentation, by gravity or Centrifugation after venipuncture without a special cell separator collects, to two Share cell suspension with 0.5 to 1.5 parts of the cryoprotectant admits the cell suspension containing the anti-freeze is placed in containers and for lymphocytes with a cooling rate BI of 4 to 60C / min to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU cools down from -550C, the chamber temperature is kept at this value until the sample dies The end of the plateau temperature Tp has been reached, the chamber to an intermediate temperature T0 heats up from -140C and cools the chamber with the cooling rate BII from 2 to 60C / min or for stem cells with a cooling rate BI of 2 to 6 ° C / min to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU of -55 ° C cools down, the chamber temperature at this one Holds the value until the sample reaches the final plateau temperature Tp, keep the chamber open an intermediate temperature TO of -13 ° C and the chamber with the cooling rate BII from 1 to 3 ° C / min or for granulocytes with a cooling rate BI of 2 to 60C / min cools down to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU of -550C, the chamber temperature is kept at this value until the sample reaches the plateau end temperature Tp reaches halt, the chamber heats up to an intermediate temperature TO of -13 ° C and the chamber temperature cools with a cooling rate BII of 2 to 30C / min or for bone marrow cells with a cooling rate BI of 20C / min to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU cools down from -550C, the chamber temperature is kept at this value until the sample dies Has reached the plateau end temperature Tp, the chamber to the intermediate temperature TO of -130C and then lower the chamber temperature with the cooling rate BII of 1 ° C / min or for platelets (method A) with a cooling rate BI of 30 ° C./min cools down to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU of -650C, the chamber temperature holds at this value until the sample has reached the plateau end temperature TP, the Chamber heated to an intermediate temperature TO of -25 ° C and the chamber temperature with a cooling method BII of -300C / min or for platelets (method B) with a cooling rate BI of -6 ° C / min to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU cools down from -5O0C, the chamber temperature is kept at this value until the sample dies Has reached the plateau end temperature Tp, the chamber to an intermediate temperature TO of -110C and the chamber temperature with a cooling rate BII of -2 to -30C / min cools or for erythrocytes with a cooling rate BI of 700 ° C / min to the freezing temperature TF and a chamber temperature TU of -1300C cools down the chamber temperature at this one Holds the value until the sample has reached the plateau end temperature TP and the chamber heated to an intermediate temperature T0 of -90 ° C and finally the chamber temperature with a Kmilrate of 7000C / min cools.

2. The method according to claim 1, characterized in that g e k e n n -z e i c h n e t that one for lymphocytes, stem cells, granulocytes, bone marrow cells and platelets (Method B) as an anti-freeze agent, a solution of 20 to 40% dimethyl sulfoxide and 60 to 80% amino acid glucose solution used.

3. The method according to claim 1, characterized in that g e k e n n -z e i c h n e t that one can use for lymphocytes, stem cells, KSG-chenmark cells and granulocytes as Antifreeze 4 to 6% glycerine, 3 to 5% D-glucose, 6 to 10% dextran T 10, 20 to 30% plasma and 0.1% EDTh in amino acid solution vervence.

4. The method according to claim 1, characterized in that g e k e n nz e i c h n e t, that one for lymphocytes, stem cells, G nulocytes and bone marrow cells as cryoprotectants 15 to 25% polyethylene glycol, molecular weight a 20,000, in amino acid solution and 3 to 7% ACD-B used.

5. The method according to claim 1, characterized in that g e k e n n -z e i c h n e t that a solution for platelets (method A) is used as an anti-freeze agent 4 to 6% glycerol, 3 to 5% glucose, 20 to 40% plasma in amino acid solution used.

6. The method according to claim 1, characterized in that g e k e n n -z e i c h n e t that one uses hydroxyethyl starch as an anti-freeze agent for erythrocytes.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that g e k e n n z e i c h n e t that the cells for a period of 2 to 6 h with a Cell separator collects and samples from 50 to 500 ml, preferably from 110 to 300 ml, cell suspension freezes.

8. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized g e k e n n notices that the cells can be separated by conventional separation methods, such as density gradient sedimentation, by gravity or centrifugation after venipuncture without a special cell separator collects and samples from 50 to 500 ml, preferably 110 0 to 300 ml, cell suspension freezes.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized g e it is not noted that the hematocort is in the range of 20 to 50%.

10. The method according to at least one of the preceding k: claims, as a result, it is not indicated that the container is a bag with one volume from 50 to 500 ml, preferably from 110 to 300 ml, is used.

11. The method according to claim 1G, characterized in that g e k e n n -z e i c h n e t that the bags are 4 to 10 mm, preferably 5 to 8 mm, thick.

12. The method according to any one of claims 10 or 11, characterized g e k e It is noted that the bags are placed in copper containers made of 2 mm thick copper sheet there and both the copper containers and the freezer bags are good before freezing dries off.

13. The method according to any one of claims 1 to 5 and 8 ,, thereby g e it is not indicated that it is used as a container with a small tube with a capacity from 1 to 25 ml, preferably 2 to 5 ml, used.

14. The method according to any one of claims 1 to 5 and 7 to 13, characterized it is not noted that the migration speed of the ice front is at a value of 1.0 to 2.0 mm / min.

15. The method according to any one of claims 1 and 6 to 13, characterized g e it is not stated that the migration speed of the ice front at 15 up to 25 mm / min.

16. Frozen cell suspension, thus g e k e n n -z e i c h n e t that they have lymphocytes, stem cells, granulocytes, bone marrow cells, platelets or contains erythrocytes and obtained by one of the methods of claims 1 to 15 has been.

17. Use of the frozen cell suspensions nac; Claim 16 to combat tumors after thawing the cell suspensions in a manner known per se Way.