DE2910737C2 - Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei enzymatischen Analysenverfahren - Google Patents

Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei enzymatischen Analysenverfahren

Info

Publication number
DE2910737C2
DE2910737C2 DE19792910737 DE2910737A DE2910737C2 DE 2910737 C2 DE2910737 C2 DE 2910737C2 DE 19792910737 DE19792910737 DE 19792910737 DE 2910737 A DE2910737 A DE 2910737A DE 2910737 C2 DE2910737 C2 DE 2910737C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
reactions
determination
substrate
nad
substances
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE19792910737
Other languages
English (en)
Other versions
DE2910737A1 (de
Inventor
Ewald 6701 Dannstadt-Schauernheim Blees
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SCHMIDT VOLKER DR 8918 LACHEN DE
Original Assignee
SCHMIDT VOLKER DR 8918 LACHEN DE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SCHMIDT VOLKER DR 8918 LACHEN DE filed Critical SCHMIDT VOLKER DR 8918 LACHEN DE
Priority to DE19792910737 priority Critical patent/DE2910737C2/de
Publication of DE2910737A1 publication Critical patent/DE2910737A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2910737C2 publication Critical patent/DE2910737C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/62—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving uric acid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

20 den ist.
;; Zur Beschleunigung der Redoxreaktionen.verwendet
■ man neben Redöxkatalysatoren wie z. B. mehrwertigen .Metallionen, Jodid, Phenazinmethqsulfat u. a. in "der biochemischen Analytik insbesondere spezielle Redoxenzyme (Dehydrogenasen, Oxidasen); die die selektive und in der Regel spezifische Umsetzung eines Substrates ermöglichen.
Na<:h den Redoxenzymen, die man ihrer Vorteile wegen bevojzugt einsetzt, lassen sich die Indikätorreaktionen in folgende drei Gruppen einteilen:
Reversible Indikatörreaktionen, an denen NAD(P)-abhängige Dehydrogenasen unter Umsetzung von Pyridinnucleotiden als In'likatorcoenzymen beteiligtsind:
Beispiel:
Pyruvat
NADH + H+ NAD
LDH
Lactat.
2. Reversible Indikatorreaktionen, an denen Flavin-Dehydrogenasen und chromogene bzw. fluorogene Redoxsubstanzen beteiligt sind:
Reaktionsprinzip:
Indikator (red.) Indikator (ox.) Substrat (ox.)
Produkt (red.)
Indikator (ox.) Indikator (red.) Substrat (red.) > Produkt (ox.)
PMS0x. PMSred.
Succinat
Fumarat
PMS = Phenazinmethosulfat.
' *><ix$k*
3. Irreversible Dehydrierungereaktioncn von Substraten durch Flavin-Dehydrogenasen (Oxidascn) unter Pttmtzung von Hydroperoxid mit nachfolgender OwMkm eines (reversiblen) Indikatorsystems durch Peroxides«, Kstalase oder einen Katalysator (z. B. Vanadat/Jodid):
Reaktionsprinzip:
O2 H2O2
Substrat (red.)
-> Produkt (ox.)
H2O2 H2O
Indikator (red.) > Indikator (ox.).
Beispiel:
Glucose
H2O+O2 H2O2
GOD
Gluconsäure
H2O2 H2O
Phenol+Aminophenazon > 4-(p-Behzochinonmonoimino)-phenazon
POD
ι Entsprechend der fundamentalen Bedeutung von Dehydrierungen beim katabolen sowie andererseits von Hydrierungen beim anabolen Stoffwechsel stehen für eine Vielzahl natürlicher Substrate solche direkte Nachweisreaktionen zur Verfügung.
In biologischen Flüssigkeiten wie z. B. im Serum Hegen viele dieser Redox-Substrate in höheren Konzentrationen vor, so daß zumeist Probenvolumina von nur wenigen Mikrolitern erforderlich sind. Ihr Nachweis erfolgt typischerweise so, daß die Probe einer Reaktionslösung zugesetzt wird, in der — neben Puffersubstanzen zur Einstellung eines optimalen pH-Werts — die Indikatorsubstanz sowie die spezifi- 2Ί sehe Dehydrogenase (Oxidase) gelöst enthalten sind. Nach Ablauf der Reaktionszeit wird die der umgesetzten Substratmenge entsprechende Änderung der Lichtabsorption bzw, der Fluoreszenz gemessen.
Ein Beispiel für eine solche direkte Bestimmung ist die Analyse von Cholesterin im Serum nach folgendem Reaktionsprinzip (Test-Combination Cholesterin, CHOD-PAP-Methode; Boehringer Mannheim GmbH):
O2 H2O2
Cholesterin
CHOD
Cholestenon
H2O2 H2O
Phenol + Aminophenazon
POD
-* 4-(p-Benzochinonmonoimino)-phenazon
Das Probenvolumen beträgt bei 2 ml Reaktionslösung 20 μΐ.
In dieser einfachen Weise läßt sich eine Substratbestimmung jedoch nur dann realisieren, wenn Enzyme hoher Spezifität zur Verfügung stehen und die JSubstratkonzentration hoch ist, da dann die Geschwindigkeit der zur Bestimmung herangezogenen Hauptreaktion gegenüber störenden Nebenreaktionen von Begleitsubstanzen besonders groß ist. Die quantitative Bestimmung von Substraten geringerer Konzentration erfordert hingegen in der Regel zusätzliche Schritte zur Beseitigung von Störungen.
Störungen treten allgemein dadurch auf, daß in der Probe weitere Enzyme enthalten sind oder als Verunreinigungen der zugesetzten Nachweisenzyme eingebracht werden, die die Indikatorsubstanz oder das Indikatorcoenzym in Nebenreaktionen mit Substanzen der Probe umsetzen. Ähnlich störend wirken in der Probe enthaltene Substanzen, die direkt ohne enzymatische Katalyse mit den Nachweissubstanzen reagieren können.
Durch derartige Störreaktionen werden im Einzelfall je nach Probe und Nachweisreaktion höhere oder niedrigere Substratkonzentrationen vorgetäuscht und damit die Analysenergebnisse oft in erheblichem Maße verfälscht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein 'Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei der quantitativen Bestimmung von Substraten niederer Konzentration in flüssigen Medien, insbesondere biologischen Flüssigkeiten und Abwässern, bei denen photometrisch oder fluorimetriscb gemessene enzymatische Bestimmungsraktionen herangezogen und störende Carbonylverbindungen zuvor mit Carbonylreagentien beseitigt werden, anzugeben, das einfach ist und keine besonderen Anforderungen an die Af beitstechnik und den Zeitaufwand stellt, auf üblichen manuell betriebenen v/ie auch automatischen Analysengeräten routinemäßig durchführbar ist, keine schwer zugänglichen oder teueren zusätzlichen Reagentien erfordert und zu erhöhter Analysengenauigkeit führt.
Das Verfahren soll zugleich möglichsi breit auf photometrische oder fluorimetrische enzymatische Bestimmungsverfahren anwendbar sein.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst
'Das erfindungsgemäße Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei der quantitativen Bestimmung von Substraten niederer Konzentration in flüssigen Medien durch photometrisch oder fluorimetrjsch gemessene enzymatische Bestimmungsreaktio-
nen durch Beseitigung störender Carbonylverbindungen vor der Durchführung der enzymatischen Bestimmungsreaktionen in der zu untersuchenden Probe durch Carbonylreagentien ist dadurch gekennzeichnet, daß als Carbonylreagens Thiosemicarbazid verwendet wird.
Erfindungsgemäß werden also vor der Durchführung der eigentlichen Bestimmungsreaktionen störende Begleitsubstrate mit Carbonylgruppen durch gezielte Kondensation mit dem Carbonylreagens Thiosemicarbazid von einer Teilnahme an den Bestimmungsreaktionen oder ihrer Beeinflussung ausgeschlossen, so daß sie von den zur Bestimmung herangezogenen Enzymen nicht mehr als Substrate umgesetzt werden können.
Proteine mit enzymatischer oder inhibierender Wirkung brauchen dabei nicht vom System abgetrennt zu v/erden, sondern werden in ihm durch Denaturierung unwirksam gemacht, was beispielsweise mit üblichen Denaturierungsmitteln oder durch Erhitzen erfolgen kann.
Während die Entstörung direkter Nachweisreaktionen darauf gerichtet ist, lediglich die störenden Substanzen zu oxidieren, das Redoxsubstrat selbst hingegen vor unbeabsichtigter Oxidation zu schützen, besteht bei indirekten Nachweisreaktionen, bei denen das Substrat oder ein Reaktionspartner erst in eine Redoxsubstanz umgewandelt werden muß oder deren Bildung auslöst, das Prinzip der erfindungsgemäßen Störungsbeseitigung gerade darin, in der Probe vorliegende und von den Indikatorenzymen umsetzbare Redoxsubstanzen einer chemischen Umsetzung zuzuführen.
Ein prinzipieller Weg zur Entfernung solcher Substanzen besteht in der Oxidation. Dies gilt insbesondere auch für die von NAD(P)-abhängigen Dehydrogenasen umgesetzten Redoxsubstanzen, die sich allgemein folgenden Gruppen zuordnen lassen:
Alkohol — Aldehyd/Keton
Hydroxysäure -- Λ-Ketosäure
Aldehyd -« Carbonsäure
Die NAD(P)H-verbrauchenden Umsetzungen Ketosäure — Hydroxysäure und Aldehyd — Alkohol sowie die NAD(P)H-Iiete nde umsetzung Aidehyd — Carbonsäure laufen meist quantitativ ab. während die Gegenreaktion durch Carbonylreagentien erzwungen werden muß. Zur Entstörung liegen somit vorwiegend Aldehyde und «-Ketocarbonsäuren vor, die durch stärkere Oxidationsmittel wie z. B. Cer(IV), Hypochlorit, alkalisches H>O.^ u.dgl. meist glatt zu Carbonsäuren («-Ketosäuren unter Decarboxylierung) oxidiert werden können. Diese Oxidation hat zwar den VorU', daß zugleich beide Partner des störenden Redoxysystems entfernt werden können; nachteilig ist jedoch, daß das Substrat eine hinreichende Oxidationsbeständigkeit besitzen und ferner der Überschuß'des Oxidationsmittels durch Zugabe eines Reduktionsmittels aus dem Ansatz entfernt werden muß. Dieser Nachteil wird durch die erfindungsgemäße Beseitigung von störenden Carbonylverbindungen mit Thiosemicarbazid vermieden.
Zur Beseitigung von Aldehyden, Ketonen und Ketonsäuren, deren alleinige Entfernung in der Regel
ίο zur Entstörung der Bestimmungsreaktion ausreicht, wurden bisher als Carbonylreagentien beispielsweise Hydroxylamin, Hydrazin und Semicarbazid bzw. Derivate davon verv/endet, die mit den zu beseitigenden, d.h. in nicht störende Produkte umzuwandelnden Substanzen im neutralen bis schwach alkalischen pH-Bereich stabile Verbindungen eingehen.
Wie bei den Oxidationsmitteln war jedoch bisher auch hier im allgemeinen die Entfernung des überschüssigen Reagens aus dem Ansatz erforderlich, um die bei der Bestimmungsreaktion entstehenden Carbonylverbindungen nicht der Indikatorreaktion zu entziehen.
Demgegenüber besitzt Thiosemicarbazid gegenüber Carbonylverbindungen wie z. B. Pyruvat oder Acetaldehyd in saurem Medium ein sehr hohes, in neutralem oder schwach alkalischem Medium hingegen ein nur sehr geringes Reaktionsvermögen, so daß es auch bei großem Überschuß die Nachweisreaktion nicht beeinträchtigt, also auch nicht entfernt werden muß. Ein weiterer mit der erfindungsgemäßen Verfahrensweise verbundener Vorteil ist die besonders hohe Stabilität der Reaktionsprodukte mit Thiosemicarbazid.
Durch die Zugabe des Thiosemicarbazide zusammen mit einer beispielsweise zur Eiweißdenaturierung eingesetzten Säure läßt sie! ferner bei indirekten Nachweisreaktionen mit NAD(P)-abhängigen Dehydrogenasen als Indikatorenzymen in einfachster Weise eine kombinierte und umfassende Entstörung realisieren, wobei gegenüber der herkömmlichen, gestörten Verfahrensweise lediglich ein zusätzlicher Pipettierschritt, jedoch keine Abtrennung von überschüssigem Thiosemicarbazid erforderlich ist.
Beispiel 1
Bestimmung von Creatinin
Das Beispiel bezieht sich auf die Bestimmung von Creatinin, beispielsweise im Serum. Als Störsubstanzen liegen hierbei Ketoverbindungen, hauptsächlich a-Ketosäuren bzw. Pyruvat, vor.
Die erfindungsgemäße Creatinin-Bestimmung dient zugleich als Modellbeispiel für die Bestimmung sämtlicher Substrate, die einer Phosphorylierung mit ATP zugänglich sind.
Verwendete Lösungen
1. Entstörungsreagens
0,1 N-HCI
0,5 mmol/l Thiosemicarbazid
0,5% Detergens (z.B. Hydroxylpolyethoxydodecan u.dgl.)
2. Neutralisations/Reaktions-Pufferlösung
400 mmol/I N-2'-HydroxyethyIpiperazin-propansulfonsäure (HEPPS) 455 mmol/l NaOH
5 mmol/1
.300 μηηοΐ/l
i 1600μη1ο1/1
800 μπιοΐ/l
' 16kU/l 8kU/l 16 kU/1
Mg-acetat NADH ATP
Phpsphoenplpyruvat Creatinkinase Pyruvatkinase LDH
vorzugsweise durch Auflösen einer entsprechenden Reagentientablette eingebracht
3. Creatininase 350 U/ml
Zur Durchführung der Best:mmungsreaktion werden 400 μΐ Serum mit 1000 μΐ Hei obigen Entstörungsreagens versetzt.
Nach 3 min oder später werden 1000μΙ der Neutralisations/Reaktions-Pufferlösung zugesetzt und gut vermischt.
Zur Bestimmung des Hauptwerts werden dem Ansatz 1000 μ! entnommen und mit 10 μΐ Creatininase versetzt.
Nach 30 min wird der Hauptwert gegen den Leerwert (Restansatz) gemessen (366 nm (Hg), 10 mm-Küvette,
Reaktionsprinzip
Creatinin).
Gegenüber der bisherigen Verfahrensweise zur Creatininbestimmung tritt keine (beispielsweise hämolysebedingte) Störung durch NADH-Verbraucher mehr auf, so daß eine entsprechend höhere Genaugigkeit resultiert.
In Fig. 1 sind Extinktions-Zeit-Kurven für die herkömmliche, bisher übliche nicht entstörte Creatininbestimmung (Kurve A) sowie die erfindungsgemäße Creatininbestimmung gemäß Beispiel 1 schematisch dargestellt:
Die gestrichelte, zur Abszisse parallele Kurve entspricht der Ausgangs-Extinktion der Probe.
Bei der bisherigen Verfahrensweise (A) fällt die Extinktion zunächst aufgrund der Umsetzung des vorhandenen Pyruvats mit NADH zu Lactat + NAD rasch ab, der sich die langsamere Umsetzung von Creatin überlagert (Kurvenabschnitt Aa): der weitere Extinktionsabfall im Kurvenabschnitt A\ ist durch die in der Probe enthaltenen störenden Enzyme bedingt (Proben-Leerwert).
Der nach Zusatz von Creatininase als Startenzym (Zeit ii) gemessene Extinktionsverlauf (Kurvenabschnitt A2, Proben-Hauptwert) ist zusätzlich durch die Umsetzung des Creatinins zu Creatin und dessen Weiterreaktion hervorgerufen.
Bei der erfindungsgemäßen Bestimmungsweise (B) fehlt aufgrund der Entstörung der durch Pyruvat bedingte anfängliche starke Extinktionsabfall (Kurvenabschnitt 5b); die gegenüber der Ausgangs-Extinktion zur Zeit ti vorliegende Extinktionsdifferenz entspricht dem in der Probe enthaltenen Creatin (Leerwert).
Der nach Zusatz der Creatininase (zur Zeit ii) resultierende Extinktionsabfall (Kurvenabschnitt B1
Verwendete Lösungen
1. Entstörungsreagens
0,1 N-HCl
0,5 ramol/1 Thiosemicarbazid
Deteigens (z.B. Hydroxylpolyethq.xydodecan u.dgl.)
(Hauptwert) gegenüber Kurvenabschnitt B\ (Leerwert)) entspricht dem in der Probe enthaltenen Creatinin.
Aus Fi g. 1 ist ferner unmittelbar ersichtlich, daß bei der herkömmlichen Verfahrensweise wegen des permanenten Extinktionsabfalls aufgrund der Aktivität der störenden Enzyme Haupt- und Leerwert unter standardisierten Zeit- und Temperaturbedingungen gemessen werden müssen, während dies erfindungsgemäß aufgrund der praktisch gleichbleibenden Extinktion des Leerwerts bei weitern nicht in diesem Maße erforderlich ist, da sich eine Temperaturdifferenz zwischen Hauptwert B2 und Leerwert B\ lediglich in einer Verschiebung des Zeitpunkts der quantitativen Umsetzung des Creatinins äußert, nicht aber in einer Verfälschung des Meßwerts.
Beispiel 2
Bestimmung von Creatin
Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, wobei die Creatinkinase (CK) in der Neutralisations/Reaktions-Pufferlösung weggelassen und anstelle der Creatininase als Startenzym eingesetzt wird.
Beispiel 3
Bestimmung von Harnsäure unter Beseitigung störender Carbonylverbindungen sowie reduzierender Begleitsubstanzen.
Das Beispiel dient zur Erläuterung enzyrnatischer Bestimmungsreaktionen, bei denen ein Aldehyd oder H2O2 entsteht.
Harnsäure
Ethanol
Acetaldehyd
H7O+O, H2O2
Uncase H2O2 H2O
Katalase NAD® NADH+Η®
Allantoin
* Acetaldehyd
Aldehyddehydrogenase
-» Acetat
2. Neutraüsations/Reaktions-Pufferlösung
400 mmol/1
400 mmol/1
3 mmol/1
1850 kU/1
650 U/l
HEPPS
NaOH
Ethanol
Katalase
Aldehyddehydrogenase
1,4 mmol/1 NAD
3. Unease
vorzugsweise durch Auflösen
einer Lyophilisat-Reagenstablette eingebracht
Zum Nachweis werden 100 μΙ Serum mit 1000 μΐ des obigen Entstörungsreagens versetzt. Nach 3 min oder später werden 1000 μΐ der Neutralisations/Reaktions-'Pufferlösung zugesetzt und gut vermischt.
Dem Ansatz werden 1000 μ! zur Bestimmung des Hauptwerts entnommen und mit 10 μΐ Uricase versetzt.
Nach 15 min wird der Hauptwert gegenüber dem Leerwert (Restansatz) bestimmt (366 nm (Hg), 10 mm-Küvette;
ΔΕχ 102 = mg/100 ml).
Bei der obigen Verfahrensweise werden die störenden reduzierenden Begleitsubstanzen nicht selektiv durch Oxidation entfernt; die Störungsbeseitigung erfolgt hier durch Anwendung eines hohen Alkoholüberschusses, so daß anstelle von reduzierenden Substanzen nunmehr Aldehyde (Überwerte) sowie NADH-verbrauchende Reaktionen, z. B. Pyruvat-LDH (Unterwerte), stören.
Bei der vorliegenden Verfahrensweise wird demgemäß auf der Ebene der zweiten Reaktion (H2O2 + Alkohol) »entstört«.
Die zugrunde liegende Bestimmungsweise ist an sich bekannt; herkömmlicherweise wird der entstehende Aldehyd (Formaldehyd aus Methanol) einer Kondensationsreaktion mit Acetylaceton unterworfen (60 min bei 37°C, Extinktionsmessung des Kondensationsprodukts bei 405 nm); im Fall von Acetaldehyd aus Ethanol wird der Aldehyd entweder mit NAD unter NADH-Bildung und Katalyse mit Aldehyddehydrogenase (ALDH) zu Essigsäure auioxidiert (iö—15 min bei Raumtemperatur. Extinktionsmessung bei 366 nm), oder mit NADH und Alkoholdehydrogenase (ADH) zum Alkohol hydriert.
Die herkömmlichen Verfahrensweisen mit ADH bzw. ALDH sind irn Gegensatz zur oben erläuterten erfindungsgemäßen Verfahrensweise durch mitreagierende Störsubstanzen in ihrer Genauigkeit beeinträchtigt. Da diese Bestimmung insbesondere durch NADH-verbrauchende Enzymreaktionen gestört wird, so daß die Konzentration des in äquimolarer Menge zu Harnsäure gebildeten NADH ein Maximum durchläuft, liefert z. B. die Dehydrierung des Aldehyds zur Säure
dementsprechend lediglich bei sog. substratkinetischer Auswertung, also bei Auswertung der Anfangssteigung der Extinktions-Zeit-Kurven bzw. der zugehörigen Anfangsgeschwindigkeiten, einigermaßen gute Ergebnisse, während normale Konzentrationsmessungen (AE) je nach Meßzeitpunkt und Aktivität der Nachweisenzyme mehr oder weniger stark ausgeprägte Unterwerte ergeben.
Die Verhältnisse bei niedriger Harnsäurekonzentration und hoher Pyruvatkonzentration sind schematisch in Fig.2 dargestellt, wobei Kurve A dem Extinktionsverlauf bei der bisher üblichen Verfahrensweise und Kurve B dem Extinktionsverlauf nach dem erfindungsgemäßen Verfahren entsprechen.
Während es bei der herkömmlichen Verfahrensweise (A) erforderlich ist. zur Erzielung eines hinreichend genzjen Analysenwertes über die Anfangsgeschwindigkeit der Extinktionsänderung (gestrichelte Linie) auszuwerten, was die zeitliche Verfolgung der Extinktion sowie den Einsatz einer hohen Konzentration an Aldehyddehydrogenase relati/ zur störenden LDH erfordert und praktisch nur auf Analysenautomaten durchführbar ist, genügt im erfindungsgemäßen Fall (B) eine Einzelmessung der Extinktion, da sie unter entstörten Verhältnissen einen stabilen Endwert erreicht.
Die erfindungsgemäße Entstörung führt entsprechend zu einer bei geringem Einsatz an (teuren) Nachweisenzymen erheblich vereinfachten Bestimmung und zugleich einer wesentlich höheren analytischen Bestirnrriungsgenauigkeii.
Durch die erfindungsgemäße Verfahrensweise werden zahlreiche neue enzymatische Analysenverfahren zugänglich, die bisher aufgrund der vorliegenden Störungen überhaupt nicht praktisch ausgenutzt werden konnten. Ferner können an die Spezifität wie auch die Reinheit der für die Bestimmungsreaktionen eingesetzten Indikatorenzyme erheblich geringere Anforderungen gestellt werden, was insbesondere bei neuen, bisher aufgrund vorliegender Störungen noch nicht entsprechenden Bestimmungsreaktionen analytisch herangezogenen Enzymsystemen von besonderem Vorteil ist.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei der quantitativen Bestimmung von Substraten niederer Konzentration in flüssigen Medien mit photometrisch oder fluorimetrisch gemessenen enzymatischen Bestimmungsreaktionen durch Beseitigung störender Carbonylverbindungen vor der Durchführung der enzymatischen Bestim-
IU mungsreaktionen in der zu untersuchenden Probe durch Carbonylreagentien, dadurch gekennzeichnet, daßalsCarbonylreagensThiosemicarbazid verwendet wird.
2. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch i auf die Creatinin- und Creatinbestimmung.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei der quantitativen Bestimmung von Substraten niederer Konzentration in flüssigen Medien, insbesondere biologischen Flüssigkeiten oder etwa Abwässern, bei denen photometrisch oder fluorimetrisch gemessene Bestimmungsreaktionen herangezogen und störende ■Earbonylverbindungen vor der Durchführung der ■enzymatischen Bestimmungsreaktionen in der zu untersuchenden Probe durch Carbonylreagentien beseitigt werden.
Nur für sehr wenige zu bestimmende Substanzen, die ;hier kurz als Substrate bezeichnet sind, stehen direkte [spezifische Nachweisreaktionen zur Verfügung, in denen durch wenige Reaktionsschritte ein farbiges oder fluoreszierendes Substrat in ein farbloses bzw. nichtfluoreszierendes Produkt umgewandelt oder umgekehrt ein farbloses oder nichtfluoreszierendes Substrat in ein farbiges bzw. fluoreszierendes Produkt übergeführt wird. In den meisten Fällen müssen demgemäß an sich unspezifische Redoxreaktionen als Indikatorreaktionen herangezogen werden, wobei eine der Menge an Vi
η Reaktionsprinzip:
NAD(P)H NAD(P) Substrat (ox.) * Produkt (red,)
NAD(P) NAD(P) Substrat (red.) > Produkt (ox.).
Substrat äquivalente Menge an einer Indikatorsubstanz
ι 'S hydriert oder dehydriert wird.
Als Indikatorsubstanzen werden Stoffe verwendet, deren Hydrierung bzw. Dehydrierung allgemein mit dem Auftreten oder Verschwinden oder einer Änderung der Lichtabsorption (Farbe) oder Fluoreszenz verbun-
DE19792910737 1979-03-19 1979-03-19 Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei enzymatischen Analysenverfahren Expired DE2910737C2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19792910737 DE2910737C2 (de) 1979-03-19 1979-03-19 Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei enzymatischen Analysenverfahren

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19792910737 DE2910737C2 (de) 1979-03-19 1979-03-19 Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei enzymatischen Analysenverfahren

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2910737A1 DE2910737A1 (de) 1980-10-30
DE2910737C2 true DE2910737C2 (de) 1984-01-19

Family

ID=6065801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19792910737 Expired DE2910737C2 (de) 1979-03-19 1979-03-19 Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei enzymatischen Analysenverfahren

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE2910737C2 (de)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4333734A (en) * 1980-01-18 1982-06-08 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Diagnostic device for fecal occult blood and method of use
US4493892A (en) * 1982-12-20 1985-01-15 Memorial Hospital For Cancer & Allied Diseases Solvent system for peroxidase inhibitor reagent for fecal occult blood determinations
DE3620817A1 (de) * 1986-06-21 1987-12-23 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen bestimmung des serumfructosamingehalts sowie hierfuer geeignetes reagenzgemisch
DE3743405A1 (de) * 1987-05-14 1988-11-24 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung von fructosamin
DE3732688A1 (de) * 1987-09-29 1989-04-13 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen bestimmung des serumfructosamingehalts sowie hierfuer geeignetes reagenzgemisch

Also Published As

Publication number Publication date
DE2910737A1 (de) 1980-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3012368C2 (de) Verfahren und diagnostische Mittel zum Nachweis von Redox-Reaktionen
DE60210904T2 (de) Nitrit-stabilisierte Zusammensetzungen von Tetrazolium-Reagenz und Methoden derer Nutzung
EP0354441B1 (de) Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels enzymatischer Oxidation
DE2265122C2 (de) Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin
DE2833612C3 (de) Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd
EP0068356B1 (de) Mittel und Verfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid oder Peroxidasen
DE2913553B1 (de) Verfahren und Reagenz zur enzymatischen Bestimmung von Enzymsubstraten
DE1598133A1 (de) Verfahren und diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen
DE2910737C2 (de) Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei enzymatischen Analysenverfahren
DE3125667C2 (de) Verfahren und Mittel zum Nachweis von Wasserstoffperoxid
DE2526558A1 (de) Verfahren zur enzymatischen analyse
EP0048347B1 (de) Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin
DE2224132B1 (de) Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin
DE2906732C2 (de) Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Peroxidase
CH646792A5 (de) Testvorrichtung fuer die bestimmung von harnsaeure.
DE2855433C2 (de) Testmittel zum Nachweis von Harnsäure
EP0121944A2 (de) Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Sulfit
DE69817449T2 (de) Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von direktem Bilirubin
DE2737290A1 (de) Analytisches verfahren zur bestimmung einer substanz in einer fluessigkeit
DE4343082A1 (de) Mittel und Verfahren zur Bilirubin-Entstörung enzymatischer H¶2¶O¶2¶-Farbtests
EP0089606B1 (de) Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Glycerin
EP1445603A1 (de) Fluorimetrische Bestimmung von Analyten durch Amin-N-Oxide als Redoxindikatoren
Haugen The determination of thiamine by the thiochrome method
DE3342977A1 (de) Verfahren zur diagnostischen bestimmung von wasserstoffperoxid und wasserstoffperoxid bildenden substrat/enzymmischungen
DE3625852A1 (de) Verbesserte testmittel und verfahren zu deren herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
OAP Request for examination filed
OD Request for examination
8172 Supplementary division/partition in:

Ref country code: DE

Ref document number: 2954297

Format of ref document f/p: P

Q171 Divided out to:

Ref country code: DE

Ref document number: 2954297

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee