DE2737290A1 - ANALYTICAL PROCEDURE FOR DETERMINING A SUBSTANCE IN A LIQUID - Google Patents
ANALYTICAL PROCEDURE FOR DETERMINING A SUBSTANCE IN A LIQUIDInfo
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Description
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- 0 " Dipl.-Chem. Dr. Brandes- 0 "Dipl.-Chem. Dr. Brandes
Dr.-Ing.HekJ Dipl.-Phys.WotffDr.-Ing.HekJ Dipl.-Phys.Wotff
8 München 22. ThierschstraBe 88 Munich 22. Thierschstrasse 8
Tel.(089)293297Tel. (089) 293297
wolffpatent, münchenwolffpatent, munich
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außer samstagsexcept saturdays
20. Juli 1977 25/93 Reg.Nr. 125 349July 20, 1977 25/93 Reg.No. 125 349
Eastman Kodak Company, 343 State Street, Rochester, Staat New York, Vereinigte Staaten von AmerikaEastman Kodak Company, 343 State Street, Rochester, New York State, United States of America
Analytisches Verfahren zur Bestimmung einer Substanz in einer FlüssigkeitAnalytical method for the determination of a substance in a liquid
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Analytisches Verfahren zur Bestimmung einer Substanz in einer Flüssigkeit.Analytical method for the determination of a substance in a liquid.
Die Erfindung betrifft ein analytisches Verfahren zur Bestimmung einer Substanz in einer Flüssigkeit, die als die Bestimmung störende Verbindung Ascorbinsäure enthalten kann und bei demThe invention relates to an analytical method for the determination of a substance in a liquid which is considered to interfere with the determination Compound may contain ascorbic acid and in which
(A) eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit mit einem Bestimmungs-Reagens in Kontakt gebracht wird, das Verbindungen oder Reagensien enthält, die bei Vorhandensein der zu analysierenden Substanz über mindestens eine Oxidations -Reduktions reaktion eine feststellbare Veränderung herbeiführen und(A) contacting a sample of the liquid to be analyzed with a determination reagent, which compounds or contains reagents which, in the presence of the substance to be analyzed, have at least one oxidation -Reduction reaction bring about a noticeable change and
(B) die erfolgte Veränderung bestimmt wird.(B) the change that has occurred is determined.
Des weiteren betrifft die Erfindung Bestimmungs-Reagensien sowie ein analytisches Element zur Durchführung des analytischen Verfahrens. The invention also relates to determination reagents as well an analytical element for performing the analytical process.
Bei der enzymatischen Bestimmung von bestimmten Verbindungen in wäßrigen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blutserum, bei der die zu analysierende Substanz zu Peroxid oxidiert wirdunldas Peroxid mit einem Indikator oder einem Indikatorsystem unter Erzeugung einer bestimmbaren Verbindung oder eines bestimmbaren Produktes umgesetzt wird, treten oftmals Störungen durch reduzierend wirkende Verbindungen, wie Ascorbinsäure auf, die das Analysenergebnis verfälschen. Ahnliche Störungen werden bei analytischen Verfahren beobachtet, die auf anderen gut bekannten fcedox-Indika-In the enzymatic determination of certain compounds in aqueous liquids, such as blood serum, in which the substance to be analyzed is oxidized to peroxide and the peroxide is generated with an indicator or an indicator system a determinable compound or a determinable product is implemented, disturbances often occur due to reducing effects Compounds, such as ascorbic acid, which falsify the analysis result. Similar disorders are found in analytical Procedures observed based on other well-known fcedox indica-
tor-Reaktionen beruhen, beispielsweise NAD+ < ^ NADH-Indikator-tor reactions are based, for example NAD + <^ NADH indicator-
Systemen.Systems.
Das Problem ist von besonderer Bedeutung bei der Bestimmung von Glucose, Harnsäure und Cholesterin im Blutserum, wobei die zu analysierende Substanz zunächst enzymatisch durch Glucose-Oxidase, Urat-Oxidase bzw. Cholesterin-Oxidase oxidiert wird, und zwar unter Erzeugung eines oxidierten Derivates und einem Peroxid. DasThe problem is of particular concern in the determination of glucose, uric acid and cholesterol in blood serum, which too the substance to be analyzed is first enzymatically oxidized by glucose oxidase, urate oxidase or cholesterol oxidase, namely under Generation of an oxidized derivative and a peroxide. That
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Peroxid oxidiert dann einen Indikator oder ein Indikatorsystem mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität, beispielsweise Peroxidase, und einem Stoff, der bei Oxidation in Gegenwart der Peroxidase und der Substanz mit peroxidativer Aktivität einer bestimmbaren Veränderung unterliegt. Die bestimmbare Veränderung besteht dabei normalerweise aus einer Farbveränderung, die mit oder ohne gleichzeitige Kupplungsreaktion auftreten kann. Hs hat sich gezeigt, daß das Vorhandensein von reduzierend wirkender Ascorbinsäure sowohl die Oxidation der zu analysierenden Substanz als auch die peroxidative Oxidation des Indikators oder des Indikatorsystems stört.Peroxide then oxidizes an indicator or an indicator system with a substance with peroxidative activity, for example Peroxidase, and a substance which, when oxidized in the presence of peroxidase and the substance with peroxidative activity, can be determined Subject to change. The determinable change usually consists of a color change that is accompanied by or can occur without a simultaneous coupling reaction. Hs has been shown to have a reducing effect Ascorbic acid both the oxidation of the substance to be analyzed and the peroxidative oxidation of the indicator or the indicator system disturbs.
Störende Mengen von Ascorbinsäure treten häufig in den Körperflüssigkeiten von Personen auf, die vergleichsweise große Mengen an Ascorbinsäure (Vitamin C) zu sich genommen haben oder die mit Antikörpern behandelt wurden, die Ascorbinsäure als Antioxidationsmittel enthalten.Disturbing amounts of ascorbic acid often occur in the body fluids by people who have consumed comparatively large amounts of ascorbic acid (vitamin C) or who have Antibodies that contain ascorbic acid as an antioxidant have been treated.
Es besteht demzufolge ein Bedürfnis nach einem analytischen Verfahren, bei dem durch Ascorbinsäure hervorgerufene Störungen bei der Analyse von Köxperflüssigkeiten ausgeschaltet werden.There is therefore a need for an analytical method in which disturbances caused by ascorbic acid in the analysis of body fluids are eliminated.
Das am häufigsten angewandte Verfahren zur Kontrolle derartiger Störungen beruht in der Verdünnung des zu analysierenden Materials, um den beschriebenen Effekt zu vermindern. Andere Verfahren beruhen auf der physikalischen oder chemischen Eliminierung derartiger störender Komponenten vor Durchführung des Analyseverfahrens.The most commonly used method to control such disturbances is to dilute the material to be analyzed, to reduce the described effect. Other methods rely on the physical or chemical elimination of such interfering components before carrying out the analysis process.
Aus der US-PS 3 411 887 ist ein Verfahren bekannt, bei dem störend wirkenden, reduzierenden Substanzen, wie beispielsweise Ascorbinsäure, dadurch Rechnung getragen wird, daß das Bestimmungs-Reagens eine Art Fallen-System aufweist. Das Fallen-System besteht dabei aus einer ionisierbaren Schwermetallverbindung, die im ionisierten Zustand ein Oxidations-Reduktionspotential (E° ,) aufweist, das über dem entsprechenden Potential der Ascorbinsäure oder einer anderen reduzierend wirkenden Substanz liegt, jedochFrom US-PS 3,411,887 a method is known in which troublesome acting, reducing substances, such as ascorbic acid, is taken into account in that the determination reagent has a kind of trap system. The trap system consists of an ionizable heavy metal compound that is ionized in the State has an oxidation-reduction potential (E °,), which is above the corresponding potential of ascorbic acid or another reducing substance, however
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unter dem Potential des Stoffes, der der bestimmbaren Veränderung unterliegt.under the potential of the substance, that of the determinable change subject.
Yamazaki, Isao und Yokota, Ken-nosuke berichten in einer Arbeit mit der Oberschrift "Oxidation States of Peroxidase" in "Molecular and Cellular Biochemistry", Band 2, Nr. 1, (1973), Seiten 39 bis 52, daß Ascorbat den Oxidationszustand von Meerrettich-Peroxidase reduziert. In der Literaturstelle findet sich jedoch kein Hinweis darauf, daß diese Reduktion des Oxidationszustandes der Peroxidase der Grund für den Effekt ist, der sich zu erkennen gibt, als Verminderung der Wirksamkeit von Wasserstoffperoxid-Indikatorsystemen auf Peroxidase-Basis.Yamazaki, Isao and Yokota, Ken-nosuke report in a paper entitled "Oxidation States of Peroxidase" in "Molecular and Cellular Biochemistry ", Vol. 2, No. 1, (1973), pp 39 to 52 that ascorbate is the oxidation state of horseradish peroxidase reduced. In the literature, however, there is no indication that this reduction in the oxidation state Peroxidase is the reason for the effect, which can be seen as a reduction in the effectiveness of hydrogen peroxide indicator systems based on peroxidase.
Die Eigenschaften von Ascorbinsäure-Oxidase werden von Thomas E. Barman in dem "Enzyme Handbook", Band 1, Seite 29 beschrieben (L-Ascorbinsäure: Sauerstoff-Oxidoreductase 1.10.3.3).The properties of ascorbic acid oxidase are described by Thomas E. Barman in the "Enzyme Handbook", Volume 1, page 29 (L-ascorbic acid: oxygen oxidoreductase 1.10.3.3).
Der Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß sich das Enzym Ascorbat-Oxidase ausgezeichnet dazu eignet, bei analytischem Verfahren zur Bestimmung bestimmter Substanzen in einer Flüssigkeit Störungen auszuschalten, die durch Ascorbinsäure hervorgerufen werden.The invention was based on the finding that the enzyme ascorbate oxidase is excellently suited for analytical processes for the determination of certain substances in a liquid to switch off interferences caused by ascorbic acid will.
Unter "Ascorbinsäure" ist hier dabei Ascorbinsäure in ihrer freien Form als Carbonsäure zu verstehen, wie auch in gebundener Form als Ascorbatester mit verschiedenen Hydroxylgruppen-haltigen Verbindungen, die in den zu analysierenden Flüssigkeiten vorliegen können.The term "ascorbic acid" here means ascorbic acid in its free form Form to be understood as carboxylic acid, as well as in bound form as ascorbate ester with various hydroxyl group-containing compounds, which may be present in the liquids to be analyzed.
Fig. 1 zeigt den Einfluß von drei verschiedenen Ascorbinsäurekonzentrationen auf den Beginn und die Endpunkte der Farbbildung bei 5 mg/dl und 15 mg/dl Harnsäure in einem analytischen Element, wie es später näher beschrieben wird.Fig. 1 shows the influence of three different ascorbic acid concentrations on the beginning and end points of color formation at 5 mg / dl and 15 mg / dl uric acid in an analytical element such as it will be described in more detail later.
Fig. 2 zeigt den Einfluß verschiedener Ascorbinsäurekonzentrationen auf Harnsäure"Eichkurven.Fig. 2 shows the influence of different ascorbic acid concentrations on uric acid "calibration curves.
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Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein analytisches Verfahren zur Bestimmung einer Substanz in einer Flüssigkeit, die als die Bestimmung störende Verbindung Ascorbinsäure enthalten kann und bei demThe invention therefore relates to an analytical method for the determination of a substance in a liquid which contains ascorbic acid as a compound which interferes with the determination can and with that
(A) eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit mit einem Bestimmungs-Reagens in Kontakt gebracht wird, das Verbindungen oder Reagensien enthält, die bei Vorhandensein der zu analysierenden Substanz über mindestens eine Oxidations-Reduktionsreaktion eine feststellbare Veränderung herbeiführen und(A) contacting a sample of the liquid to be analyzed with a determination reagent, which compounds or contains reagents which, in the presence of the substance to be analyzed, via at least one oxidation-reduction reaction bring about a noticeable change and
(B) die erfolgte Veränderung bestimmt wird,(B) the change made is determined,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Bestimmung in Gegenwart von Ascorbinsäure-Oxidase durchführt. Die Ascorbinsäureüxidase wird dabei in Konzentrationen verwendet, die ausreichen, um die störenden Effekte der Ascorbinsäure zu eliminieren.which is characterized by the fact that the determination is in the presence by ascorbic acid oxidase. The ascorbic acid oxidase is used in concentrations that are sufficient to eliminate the disturbing effects of ascorbic acid.
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren ein Bestimmungs-Reagens für die Durchführung des Verfahrens mit Verbindungen (oder Reagensien), die bei Vorhandensein der zu analysierenden Substanz über mindestens eine Oxidations-Reduktionsreaktion eine feststellbare oder ermittelbare Veränderung herbeiführen, das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an Ascorbinsäure-Oxidase, wobei der Gehalt an Ascorbinsäure-Oxidase wiederum derart bemessen ist, daß Störungen infolge von Ascorbinsäure ausgeschaltet werden.The invention also relates to a determination reagent for carrying out the method with compounds (or reagents), which, in the presence of the substance to be analyzed, can be determined via at least one oxidation-reduction reaction or bring about a detectable change, which is characterized by a content of ascorbic acid oxidase, the content of ascorbic acid oxidase is in turn dimensioned in such a way that disturbances due to ascorbic acid are eliminated.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein mehrschichtiges analytisches Element für die Durchführung des Verfahrens mit mindestens einer Ausbreitschicht und mindestens einer Reagensschicht mit einem Gehalt an Ascorbinsäure-Oxidase in einer Konzentration, die ausreicht, um durch Ascorbinsäure hervorgerufene Störungen zu vermeiden.Finally, the subject matter of the invention is a multilayer analytical one Element for performing the method with at least one spreading layer and at least one reagent layer containing ascorbic acid oxidase in a concentration sufficient to prevent disorders caused by ascorbic acid to avoid.
Das erfindungsgemäße Bestimmungs-Reagens weist in vorteilhafter Weise auf:The determination reagent according to the invention advantageously has:
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(a) ein Enzym, das in Gegenwart von Sauerstoff die Oxidation der zu analysierenden Verbindung zu eines oxidierten Derivat hiervon und einem Peroxid zu katalysieren vermag und(a) an enzyme that in the presence of oxygen does oxidation the compound to be analyzed is able to catalyze an oxidized derivative thereof and a peroxide and
(b) einen Indikator oder ein Indikatorsystem mit einer Substanz oder einer Verbindung mit peroxidativer Aktivität und einem Stoff, der durch das Peroxid in Gegenwart der Substanz oder der Verbindung mit peroxidativer Aktivität oxidierbar ist, und zwar unter Erzeugung eines feststellbaren Reaktionsproduktes, wobei das Bestimmungs-Reagens gekennzeichnet ist durch(b) an indicator or an indicator system with a substance or a compound with peroxidative activity and a substance produced by the peroxide in the presence of the substance or compound having peroxidative activity is oxidizable to produce a detectable reaction product, the determining reagent is characterized by
(c) einen Gehalt an Ascorbinsäure-Oxidase in einer zur Ausschaltung von durch Ascorbinsäure herbeigeführten Störungen ausreichenden Konzentration.(c) a content of ascorbic acid oxidase in an elimination sufficient concentration of disturbances caused by ascorbic acid.
Die im erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagens enthaltenen Verbindungen oder "Reagensien" sind Verbindungen oder Stoffe, die mit der zu analysierenden Substanz, d.h. dem sogenannten "Analyten", einer Vorläuferverbindung hiervon oder einer Verbindung, die während der Bestimmungsmethode erzeugt wird, zu reagieren vermögen. Die Reaktionsfähigkeit der "Reagensien" oder Verbindungen kann dabei sehr verschieden sein, d.h. sie kann auf einer chemischen Reaktionsfähigkeit beruhen, einer katalytischen Aktivität, wie im Falle der Erzeugung eines Enzym-Substratkomplexes oder einer anderen Form einer chemischen oder physikalischen Reaktion, die letztlich eine meßbare oder feststellbare Veränderung herbeiführt, die nach irgendeiner Methode ermittelt oder festgestellt werden kann, beispielsweise durch eine Strahlungsenergie verwendende Meßmethode, normalerweise eine Meßmethode unter Verwendung von Lichtenergie. The compounds contained in the determination reagent according to the invention or "reagents" are compounds or substances that interact with the substance to be analyzed, i.e. the so-called "analyte", a precursor compound thereof or a compound which is generated during the determination method are able to react. The reactivity of the "reagents" or compounds can be very different, i.e. it can be based on a chemical Reactivity based on a catalytic activity, as in the case of the generation of an enzyme-substrate complex or another Form of a chemical or physical reaction that ultimately leads to a measurable or detectable change, which can be determined or ascertained by any method, for example by a measuring method using radiant energy, usually a measurement method using light energy.
Als ein besonders vorteilhaftes Bestimmungs-Reagens hat sich ein Reagens erwiesen, das mindestens ein Enzym enthält, welches die Oxidation der zu analysierenden Substanz katalysiert und des weiteren mindestens einen Indikator oder ein Indikatorsystem enthält, das auf das erzeugte Peroxid anspricht, das in der Oxidations-Re-A reagent which contains at least one enzyme which the Oxidation of the substance to be analyzed catalyzes and furthermore contains at least one indicator or an indicator system, which responds to the generated peroxide, which in the oxidation re-
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duktionsreaktion erzeugt wurde. Jedoch können auch die verschiedensten anderen Reagensien und Kombinationen von Reagensien verwendet werden, welche eine feststellbare Veränderung im System herbeiführen.induction reaction was generated. However, the most varied of them can also be used other reagents and combinations of reagents can be used which produce a detectable change in the system bring about.
In vorteilhafter Weise besteht somit ein erster Bestandteil eines erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagens aus einem Enzym, das die zu analysierende Substanz in Gegenwart von Sauerstoff zu oxidieren vermag, und zwar unter Erzeugung eines oxidierten Derivates der zu analysierenden Substanz und Peroxid.In an advantageous manner, there is thus a first component of a Determination reagent according to the invention consisting of an enzyme that converts the substance to be analyzed in the presence of oxygen capable of oxidizing, with the production of an oxidized derivative of the substance to be analyzed and peroxide.
So eignet sich beispielsweise ein aerobes Enzym, wie beispielsweise Uricase, die Harnsäure zu Allantoin zu oxidieren vermag unter gleichzeitiger Erzeugung von Peroxid zur Ermittlung und quantitativen Bestimmung von Harnsäure in Körperflüssigkeiten.For example, an aerobic enzyme such as Uricase, which is able to oxidize uric acid to allantoin with simultaneous generation of peroxide for the determination and quantitative determination of uric acid in body fluids.
Außer Harnsäure können des weiteren die verschiedensten anderen Bestandteile von Körperflüssigkeiten bestimmt werden, beispielsweise Glucose, Cholesterin, L-Aminosäure, Xanthin und dergleichen. Jede der Bestimmungsmethoden erfordert dabei die Verwendung eines spezifischen oxidierenden Enzyms, z.B. Uricase, Glucose-Oxidase, Cholesterin-Oxidase und dergleichen, um die erwünschten Oxidationen herbeizuführen. Derartige oxidierende Enzyme sind bekannt und brauchen nicht näher erläutert zu werden.In addition to uric acid, a wide variety of other components of body fluids can also be determined, for example Glucose, cholesterol, L-amino acid, xanthine and the like. Each of the determination methods requires the use of one specific oxidizing enzyme, e.g., uricase, glucose oxidase, cholesterol oxidase and the like, to carry out the desired oxidations bring about. Such oxidizing enzymes are known and do not need to be explained in more detail.
Der zweite Bestandteil eines vorteilhaften erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagens besteht aus einem Indikator oder einem Indikatorsystem, wie es üblicherweise in Kombination mit derartigen oxidierenden Enzymen verwendet wixl. Ein derartiges Indikatorsystem weist in der Regel eine Substanz mit peroxidativer Aktivität auf, im allgemeinen eine Peroxidase und eine Verbindung oder einen Stoff, die bzw. der in Gegenwart der Substanz mit peroxidativer Aktivität und Peroxid unter Erzeugung eines feststellbaren Produktes oxidierbar ist. Das feststellbare oder bestimmbare Produkt besteht dabei in der Regel aus einem Farbstoff oder einer anderen farbigen Verbindung, dessen bzw. deren Konzentration visuell meßbar ist, beispielsweise durch Vergleich mit Proben ver-The second component of an advantageous invention Determination reagent consists of an indicator or an indicator system, as is usually used in combination with such oxidizing enzymes used wixl. Such an indicator system usually has a substance with peroxidative activity, generally a peroxidase and a compound or a substance which, in the presence of the substance with peroxidative activity and peroxide, produces a detectable Product is oxidizable. The detectable or determinable product usually consists of a dye or another colored compound, the concentration of which can be measured visually, for example by comparison with samples
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schiedener Dichte oder auf spektrophotometrischem Wege, wobei die Konzentration des Reaktionsproduktes in Beziehung steht zur Konzentration des erzeugten Peroxides und infolgedessen zur Konzentration der zu analysierenden Substanz in der zu analysierenden Probe.different density or by spectrophotometric means, the concentration of the reaction product being related to Concentration of the generated peroxide and consequently the concentration of the substance to be analyzed in the one to be analyzed Sample.
Verwendbar sind die verschiedensten bekannten Substanzen mit peroxidativer Aktivität, z.B. Hämin und Peroxidase. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung des Enzymes Peroxidase erwiesen, wobei das Enzym pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs sein kann.A wide variety of known substances with peroxidative properties can be used Activity, e.g. hemin and peroxidase. The use of the enzyme peroxidase has proven to be particularly advantageous, wherein the enzyme can be of vegetable or bacterial origin.
Der Stoff oder die Verbindung, die in Gegenwart der Substanz mit peroxidativer Aktivität und Peroxid unter Erzeugung eines feststellbaren Reaktionsproduktes oxidierbar ist, kann in vorteilhafter Weise aus einem Farbbildner bestehen, z.B. einem Leucofarbstoff, d.h. einer Verbindung, die durch Oxidation in Gegenwart von Peroxid und Peroxidase in einem Farbstoff überführt wird.The substance or compound which, in the presence of the substance with peroxidative activity and peroxide, produces a detectable Reaction product is oxidizable, can advantageously consist of a color former, e.g. a leuco dye, i.e. a compound which is converted into a dye by oxidation in the presence of peroxide and peroxidase.
Andererseits kann die oxidierbare Verbindung oder der oxidierbare Stoff auch aus einer Verbindung bzw. einem Stoff bestehen, die bzw. der in Gegenwart von Peroxid und Peroxidase unter Erzeugung eines Oxidationsproduktes oxidiert wird, das wiederum mit einer anderen Verbindung, beispielsweise einem Farbkuppler, umgesetzt werden kann, unter Erzeugung eines Farbstoffes oder einer anderen feststellbaren oder meßbaren Verbindung, obgleich die zunächst durch Oxidation erzeugbare Verbindung selbst keine Farbveränderung herbeiführt. Beispiele für geeignete Leucofarbstoffe sind beispielsweise o-Toluidindihydrochlorid, meta-Toluidin, Benzidin, o-Dianisidin und dergleichen. Geeignete Kupplungs-Kombinationen können als oxidierbare Verbindung beispielsweise 4-Aminoantipyren, ein substituiertes p-Phenylendiamin, z.B. Ν,Ν-ß-Cyanoäthyl-p-phenylendiaain der folgenden Formel:On the other hand, the oxidizable compound or the oxidizable substance can also consist of a compound or a substance which or which is oxidized in the presence of peroxide and peroxidase to produce an oxidation product, which in turn with a another compound, for example a color coupler, can be reacted to produce a dye or another detectable or measurable connection, although the connection, which can initially be produced by oxidation, does not itself change color brings about. Examples of suitable leuco dyes are, for example o-toluidine dihydrochloride, meta-toluidine, benzidine, o-dianisidine and the like. Suitable coupling combinations can be used as oxidizable compound, for example 4-aminoantipyrene, a substituted p-phenylenediamine, e.g. Ν, Ν-ß-cyanoethyl-p-phenylenediaain of the following formula:
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oder ein substituiertes Fyrazolon und als Kuppler einen phenolischen, einen naphtholischen oder einen Kuppler mit aktiven Methylengruppen enthalten.or a substituted fyrazolone and as a coupler a phenolic, contain a naphtholic or a coupler with active methylene groups.
Schließlich können des weiteren selbst-kuppelnde, einen Farbstoff erzeugende Systeme verwendet werden, beispielsweise solche mit einem 4-Alkoxynaphthol, beispielsweise 4-Isopropoxy-i-naphthol, das wie folgt umgesetzt werden kann:Finally, self-coupling dye generating systems can also be used, such as those with a 4-alkoxynaphthol, for example 4-isopropoxy-i-naphthol, which can be implemented as follows:
PODPOD
2H2°2 2H 2 ° 2
♦ 4H2O♦ 4H 2 O
worin R für ein Wasserstoffatom oder einen Alkyl- oder Alkoxyrest mit 1 bis 12 C-Atomen steht. Diese Verbindungen stellen Farbstoffvorläuferverbindungen dar, die, bis sie oxidiert werden, farblos sind und die mit sich selbst unter Erzeugung eines Farbstoffes kuppeln.wherein R represents a hydrogen atom or an alkyl or alkoxy radical with 1 to 12 carbon atoms. These compounds constitute dye precursors which are colorless until oxidized and which with themselves to produce a dye couple.
üie beiden beschriebenen Komponenten des Bestimmungs-Reagens können dabei in den üblichen bekannten Konzentrationen angewandt werden. Sie sind im allgemeinen nicht kritisch, d.h. die beiden Bestandteile des Bestimmungs-Reagenses können in verschiedenenüie the two described components of the determination reagent can can be used in the usual known concentrations. They are generally not critical, i.e. the two Components of the determination reagent can be in different
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Konzentrationen angewandt werden, solange nur die Konzentration des Enzyms ausreicht, um die Oxidationsreaktion zu katalysieren, und zwar der gesamten in der zu analysierenden Probe vorhandenen zu analysierenden Substanz oder einer vorbestimmten Teilmenge hiervon und solange nur die Konzentrationen an der Substanz mit peroxidativer Aktivität und des durch das Peroxid oxidierbaren Stoffes ausreichend sind, um eine vollständige oder praktisch vollständige Reaktion des erzeugten Peroxides zu gewährleisten.Concentrations are used as long as the concentration of the enzyme is sufficient to catalyze the oxidation reaction, namely the entire substance to be analyzed or a predetermined subset present in the sample to be analyzed of this and as long as only the concentrations of the substance with peroxidative activity and that which can be oxidized by the peroxide Substance are sufficient to ensure a complete or practically complete reaction of the peroxide generated.
Die erfindungsgemäß verwendete Ascorbinsäure-Oxidase (L-Ascorbinsäure: Sauerstoff-Oxidoreductase; EC 1.10.3.3) kann verschiedenen Ursprungs sein, d.h. erfindungsgemäß können Enzyme der verschiedensten Herkunft verwendet werden, einschließlich Enzyme pflanzlicher sowie mikrobieller Herkunft.The ascorbic acid oxidase used according to the invention (L-ascorbic acid: Oxygen oxidoreductase; EC 1.10.3.3) can be of different origins, i.e. according to the invention enzymes of the most varied Origin, including enzymes of vegetable and microbial origin.
Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Ascorbinsäure-Oxidase erwiesen, die aus einem Brei (squash) von grünen Zucchini (Cucurbita pepo medullosa) stammt sowie einem gelben Brei (yellow squash) (Cucurbita pepo condensa), wobei die Ascorbinsäure-Oxidase nach einem Extraktionsverfahren gewonnen werden kann, wie es beispielsweise in den folgenden Tabellen I und II näher beschrieben wird. Bei diesem Verfahren wird ein Extrakt erzeugt, der eine spezifische Aktivität von etwa 3,0 bis 5,5 Einheiten pro mg Protein aufweist. Eine Einheit der Enzymaktivität ist dabei definiert als die Menge von Enzym-Protein, die 1 η Mol Ascorbinsäure pro Minute in einer 0,05 molaren Natriumphosphatpufferlösung bei 37°C und einem pH-Wert von 6,80 - 0,05 oxidiert.The use of ascorbic acid oxidase has proven to be particularly advantageous, which comes from a pulp (squash) of green zucchini (Cucurbita pepo medullosa) and a yellow pulp (yellow squash) (Cucurbita pepo condensa), the ascorbic acid oxidase after a Extraction process can be obtained, as described in more detail, for example, in Tables I and II below. In this process, an extract is produced which has a specific activity of about 3.0 to 5.5 units per mg of protein. One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme protein that oxidizes 1 η mol of ascorbic acid per minute in a 0.05 molar sodium phosphate buffer solution at 37 ° C. and a pH of 6.80-0.05.
809809/0798809809/0798
Reinigung von Ascorbinsäure-Oxidase aus grünen Zucchini (Cucurbita pepo medullosa)Purification of ascorbic acid oxidase from green zucchini (Cucurbita pepo medullosa)
Die zerstoßene grüne Masse (squash) (2,72 bis 3,62 kg) wird kurz mit destilliertem Wasser gespült;The crushed green mass (squash) (2.72 to 3.62 kg) is briefly rinsed with distilled water;
Die pfwjsc^wird in dem 2- bis 3-fachen Volumen einer Pufferlösung (0,05 molare Natriumphosphatlösung bei einem pH-Wert von 6,8) homogenisiert (die Pulpe wird verworfen);The pfwjsc ^ is in 2 to 3 times the volume of a buffer solution (0.05 molar sodium phosphate solution at pH 6.8) homogenized (the pulp is discarded);
4-4-
Das homogenisierte Produkt wird durch 2 bis 3 Lagen eines Käsetuches gepreßt;The homogenized product is through 2 to 3 layers of a cheesecloth pressed;
Das Filtrat wird zentrifugiert (4080 χ g, 15 Minuten), um ZeIltrünuner und unlösliches Produkt zu entfernen;The filtrate is centrifuged (4080 χ g, 15 minutes) to remove cells and remove insoluble product;
Die überstehende Lösung wird bezüglich (NH^)2SO. auf eine 65lige Sättigung gebracht, 1 Stunde lang im Kalten tO°C) gerührt und 1/2 Stunde lang im Kalten stehengelassen;The supernatant solution is with respect to (NH ^) 2 SO. brought to 65lig saturation, stirred for 1 hour in the cold (to 0 ° C.) and left to stand in the cold for 1/2 hour;
einem P.-Puffer resuspendiert keit wurde verworfenResuspended in P. buffer was discarded
Unter Rühren wurde eiskaltes Aceton (0,9 Volumenanteile, bezogen auf die Enzymlösung) zugegebenWhile stirring, ice-cold acetone (0.9 parts by volume, based on the enzyme solution) admitted
4,4,
22 450 χ g, 30 Minuten22 450 χ g, 30 minutes
Das Pellet-Material wurde in P.-Puffer resuspendiert (kleines Vo lumen)The pellet material was resuspended in P. buffer (small volume)
Das Material wurde bei einem 2- bis 3-fachen Austausch des P.Puffers dialysiert x The material was dialyzed with a 2 to 3-fold exchange of the P. buffer x
Das Material wurde zum Zwecke der Entfernung unlöslichen Materials zentrifugiert (geringe Umdrehung)The material was used for the purpose of removing insoluble material centrifuged (low rotation)
Das Präparat war zur Verwendung fertig oder konnte aufbewahrt werden und war bei -20°C für Monate haltbar.The preparation was ready for use or could be stored and was stable for months at -20 ° C.
809809/0798809809/0798
SchalenRaw rlomogenate of
Peel
tionPreparations
tion
Einhei-
tenTotal-
Unit
th
Grad + Activity
Degree +
FaktorCleaning
factor
fällungAiiimoniujiisul fat- Aus
precipitation
BA.
B.
Protein
mgSent
protein
mg
113921876
11392
100100
100
11
1
BA.
B.
128002800
12800
103311760
10331
9194
91
1,921.22
1.92
BA.
B.
60422150
6042
, Aktivit.1t
(Einheiten/
ng)Specific
, Activity 1t
(Units/
ng)
82591137
8259
7261
72
1 ,811.33
1, 81
BA.
B.
51301278
5130
0,890.67
0.89
3074826
3074
2744
27
6,35.1
6.3
549243
549
1,710.82
1.71
1 ,610.89
1, 61
5,63.4
5.6
Bemerkung: Die beiden Präparationen wurden ausgehend von 3,2 kg Zucchinibrei (squash) hergestellt. Das tatsächliche Trockengewicht einer jeden Präparation nach Lyonhilisierung des Dialysates betrug ungefähr das 2- bis 3-fache des Gramngswichtes, bestii.m.t nach dem Verfahren von Lowry. Dies bedeutet, daß die Präparationen (A) ein Trockengewicht von -0,69 g aufwies, während die Präparation (B) ein Trockengewicht von 1,7g hatte.(Nach der Methode vor Lowry wird lediglich das Proteingewicht (Grammgewicht) gemessen. Das Trockengewicht setzt sich aus de:n Proteingewicht und dem Gewicht anderer vorhandener Substanzen zusammen. Besteht die Probe zu 1001 aus Protein, dann entspricht das Trockengewicht dem Gramingev.-icht. Es ist das Trockengewicht von dem hier Jie Rede ist. INote: The two preparations were made from 3.2 kg of zucchini pulp (squash). The actual dry weight of each preparation after lyophilization of the dialysate was approximately 2 to 3 times the gramng weight, determined according to the Lowry method. This means that the preparations (A) have a dry weight of -0.69 g, while preparation (B) had a dry weight of 1.7 g (According to the method before Lowry, only the protein weight (gram weight) is measured. The dry weight is made up of the protein weight and the weight of others existing substances together. If the sample consists of 1001 protein, then corresponds to the dry weight does not match the gramineae. It's the dry weight of this Jie Speech is. I.
In -o bezogen auf dia Aktivität des rohen "laterials (bei der nimr.t die Aktivität ab).In -o based on the activity of the raw material (in the stops the activity).
Jes rohen "'.iterialsJes raw "'.iterials
Die im Einzelfalle optimale Konzentration an Ascorbinsäure-Oxidase in einem erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagens oder einem erfindungsgemäßen mehrschichtigen analytischen Material kann sehr verschieden sein und kann von verschiedenen Faktoren abhängen, beispielsweise der Konzentration der zu analysierenden Substanz (wobei vergleichsweise geringe Konzentrationen normalerweise störanfälliger sind), der Empfindlichkeit des im Einzelfalle verwendeten Bestimmungs-Reagenses gegenüber Ascorbinsäure und dergleichen. Die im Einzelfalle optimale Konzentration an Ascorbinsäure-Oxidase läßt sich jedoch leicht feststellen. Es wurde gefunden, daß vorteilhafte Ergebnisse sich ganz allgemein bei Anwendung von Konzentrationen von etwa 0,01 bis etwa 1,0 U/ml Bestimmungslösung erzielen lassen, beispielsweise bei der Bestimmung von Glucose, Harnsäure oder Cholesterin.The optimal concentration of ascorbic acid oxidase in each individual case in a determination reagent according to the invention or a multilayer analytical material according to the invention can be very different and can depend on various factors, for example the concentration of the substance to be analyzed (whereby comparatively low concentrations are normally more susceptible to interference are), the sensitivity of the determination reagent used in the individual case to ascorbic acid and the like. However, the optimal concentration of ascorbic acid oxidase in the individual case can easily be determined. It was found, that advantageous results are generally achieved when using concentrations of about 0.01 to about 1.0 U / ml of the determination solution can be achieved, for example in the determination of glucose, uric acid or cholesterol.
Das erfindungsgemäße Bestimmungs-Reagens kann in vorteilhafter Weise in einem analytischen Element untergebracht werden, beispielsweise einem Element des aus der US-PS 3 992 158 bekannten Typs oder eines Elementes des aus der BE-PS 801 74 2 bekannten Typs oder eines Elementes des aus der DT-OS 25 32 918 bekannten Typs. Derartige analytische Elemente weisen in vorteilhafter Weise eine Ausbreitschicht auf, welche die zu analysierende Flüssigkeit ausbreitet und eine gleichförmige Konzentration der zu analysierenden Substanz einer unter der Ausbreitschicht angeordneten hydrophilen Reagensschicht zuführt, die mindestens einen Teil der Reagensien enthält, die erforderlich sind, um ein feststellbares oder erkennbares Produkt in einer Konzentration zu erzeugen, die in Beziehung steht zur Konzentration der zu analysierenden Substanz in einer auf die Ausbreitschicht aufgebrachten Flüssigkeitsprobe. Gegebenenfalls können derartige Elemente einen Schichtträger aufweisen, auf den die Reagensschicht und die Ausbreitschicht aufgetragen sind, wobei die Reagensschicht zwischen Schichtträger und Ausbreitschicht angeordnet ist. In den später folgenden Beispielen wird der Aufbau derartiger Elemente und ihre Herstellung näher beschrieben.The determination reagent according to the invention can be used in an advantageous manner Manner can be accommodated in an analytical element, for example an element of that known from US Pat. No. 3,992,158 Type or an element of the type known from BE-PS 801 74 2 or an element of the type known from DT-OS 25 32 918. Such analytical elements advantageously have a spreading layer which spreads the liquid to be analyzed and a uniform concentration of the substance to be analyzed of a hydrophilic disposed under the spreading layer Feeds reagent layer which contains at least a portion of the reagents that are necessary for a detectable or recognizable To produce product in a concentration which is related to the concentration of the substance to be analyzed in a liquid sample applied to the spreading layer. Such elements can optionally have a layer support to which the reagent layer and the spreading layer are applied, the reagent layer between the support and the spreading layer is arranged. In the examples below, the structure of such elements and their manufacture are described in more detail.
Im Falle derartiger analytischer Elemente befinden sich die Schichten in einem sogenannten Flüssigkeits- oder Strömungskontakt, wasIn the case of such analytical elements, the layers are located in a so-called liquid or flow contact, what
809809/07 98809809/07 98
besagt, daß ein strömendes Medium, sei es nun eine Flüssigkeit oder ein Gas, in einem solchen Element die Ausbreitschicht und die Reagensschicht passieren kann. Mit anderen Worten: ein Flüssigkeits- oder Strömungskontakt besagt, daß die Komponenten einer Flüssigkeit zwischen den miteinander in Kontakt stehenden Flüssigkeiten transportiert werden können. Obgleich die in Flüssigkeitsoder Strömungskontakt miteinander stehenden Schichten einander benachbart sein können, können sie doch auch durch Zwischenschichten voneinander getrennt sein, wobei gilt, daß derartige Zwischenschichten den Durchtritt der Flüssigkeit nicht stören sollen.states that a flowing medium, be it a liquid or a gas, in such an element the spreading layer and the reagent layer can pass. In other words: a liquid or flow contact means that the components of a liquid are between the liquids in contact with one another can be transported. Although the layers in fluid or flow contact with one another are adjacent to one another can be, they can also be separated from one another by intermediate layers, it being understood that such intermediate layers should not interfere with the passage of the liquid.
Die Ascorbinsäure-Oxidase kann in derartigen Elementen in der Reagensschicht, der Ausbreitschicht oder in einer Zwischenschicht zwischen Ausbreitschicht und Reagensschicht untergebracht werden oder wo auch immer Störungen auf Grund von Ascorbinsäure ausgeschaltet oder vermindert werden können. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, die Ascorbinsäure-Oxidase in einer Zwischenschicht unterzubringen. Bei Verwendung einer derartigen Zwischenschicht weist diese in vorteilhafter Weise eine chemische Zusammensetzung und physikalische Eigenschaften auf, d.h. beispielsweise Permeabilitätseigenschaften, die denen einer Reagensschicht entsprechen, wobei die Konzentration der Zwischenschicht an Ascorbinsäure-Oxidase so groß sein soll, daß Störungen auf Grund des Vorhandenseins von Ascorbinsäure in der Probe, die auf die Ausbreitschicht aufgebracht wurde, ausgeschaltet oder mindestens reduziert werden.The ascorbic acid oxidase can be present in such elements in the reagent layer, the spreading layer or in an intermediate layer be accommodated between the spreading layer and the reagent layer or wherever disturbances due to ascorbic acid are eliminated or can be reduced. It has proven to be particularly advantageous to place the ascorbic acid oxidase in an intermediate layer accommodate. When such an intermediate layer is used, it advantageously has a chemical composition and physical properties, i.e., for example, permeability properties similar to those of a reagent layer correspond, the concentration of the intermediate layer of ascorbic acid oxidase should be so great that disturbances due to the presence of ascorbic acid in the sample affect the spreading layer applied, switched off or at least reduced.
Die Erfindung ermöglicht des weiteren die Ausschaltung oder Verminderung von Störungen, die durch das Vorhandensein von Ascorbinsäure in Matrixmaterialien des Typs hervorgerufen werden, die herstellbar sind durch Imprägnierung mit Reagensien zum Zwecke der Herstellung von Elementen, die sich für die Bestimmung bestimmter Substanzen in einer zu analysierenden Probe eignen. Typische Matrixmaterialien und Elemente dieses Typs, die erfindungsgemäß verwendbar sind, sind beispielsweise bekannt aus den folgenden US-PS: 3 092 465, 3 418 099, 3 418 083, 2 893 843, 2 893 844, 2 912 309, 3 008 879, 3 802 842, 3 798 064, 3 298 739, 3 915 647, 3 917 453,The invention also enables elimination or reduction of disorders caused by the presence of ascorbic acid in matrix materials of the type that can be manufactured are made by impregnation with reagents for the purpose of preparing elements that are suitable for the determination of certain Substances in a sample to be analyzed. Typical matrix materials and elements of this type that can be used in accordance with the invention are known, for example, from the following US patents: 3,092,465, 3,418,099, 3,418,083, 2,893,843, 2,893,844, 2,912,309, 3 008 879, 3 802 842, 3 798 064, 3 298 739, 3 915 647, 3 917 453,
809809/0798809809/0798
3 933 594 und 3 93b 357.3 933 594 and 3 93b 357.
Die erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagensien können des weiteren in Form trockener Mischungen oder Pulver vorliegen oder in Form lyophi1isierter Reagensien, die unmittelbar vor ihrer Verwendung mit Wasser unter Bildung von verwendbaren Reagens-Lösungen versetzt werden können. Obgleich sich das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagensien in vorteilhafter Weise zur Bestimmung einer zu analysierenden Substanz eignen, die unter Bildung eines oxidierten Derivates und Wasserstoffperoxid oxidiert wird, ist doch selbstverständlich, daß auf Grund der reduzierenden Natur der Ascorbinsäure diese auch eine Wasserstoffperoxid-Bestimmungsreaktion stört, bei der eine Substanz mit peroxidativer Aktivität verwendet wird sowie ein Stoff oder eine Verbindung, der bzw. die durch das Peroxid oxidierbar ist, und zwar wahrscheinlich durch Reduktion des Oxidationszustandes der Substanz oder des Stoffes mit peroxidativer Aktivität. Diese Störung wird in den später folgenden Beispielen veranschaulicht. Die Erfindung ermöglicht infolgedessen auch die Verbesserung eines Verfahrens sowie die Verbesserung eines Bestimmungs-Reagenses für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid durch Verwendung von Ascorbinsäure-Üxidase, wobei Störungen bei der Wasserstoffperoxidbestimmung ausgeschaltet werden.The determination reagents according to the invention can furthermore in the form of dry mixtures or powders or in the form of lyophilized reagents which are immediately prior to their use mixed with water to form usable reagent solutions can be. Although the inventive method and the determination reagents according to the invention are more advantageous Way to determine a substance to be analyzed, the formation of an oxidized derivative and hydrogen peroxide is oxidized, it goes without saying that, due to the reducing nature of ascorbic acid, this also has a hydrogen peroxide determination reaction bothers, in which a substance with peroxidative activity is used as well as a substance or a Compound that can be oxidized by the peroxide, probably by reducing the oxidation state of the substance or the substance with peroxidative activity. This malfunction is illustrated in the examples below. The invention consequently enables a method to be improved as well as a determination reagent for the Determination of hydrogen peroxide by using ascorbic acid oxidase, with interferences in the hydrogen peroxide determination turned off.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich des weiteren im Rahmen von analytischen Bestimmungssystemen anwenden, bei denen Oxidations-Reduktions-Reaktionen durchgeführt werden und die nicht auf der Erzeugung und der Ermittlung von H2O2 beruhen, bei denen jedoch Ascorbinsäure auf Grund der Reduktionseigenschaften störend wirkt. Dies bedeutet, daß Störungen auf Grund des Vorhandenseins von Ascorbinsäure auch in solchen Verfahren ausgeschaltet werden können, die beispielsweise auf der Umwandlung von NAD zu NADH beruhen, unter gleichzeitiger Fluoreszenzveränderung. Das später folgende Beispiel 10 veranschaulicht ein anderes Bestimmungsverfahren, das nicht auf einem H2O2-Bestimmungssystem beruht, nämlich die Bestimmung von Harnsäure unter Verwendung von Phosphotungstat.The method according to the invention can also be used in analytical determination systems in which oxidation-reduction reactions are carried out and which are not based on the generation and determination of H 2 O 2 , but in which ascorbic acid has a disruptive effect due to its reducing properties. This means that disturbances due to the presence of ascorbic acid can also be eliminated in processes which are based, for example, on the conversion of NAD to NADH, with a simultaneous change in fluorescence. Example 10, which follows later, illustrates another method of determination which is not based on an H 2 O 2 determination system, namely the determination of uric acid using phosphotungate.
809809/0798809809/0798
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen. The following examples are intended to illustrate the invention in more detail.
Um zu zeigen, daß Störungen durch Ascorbinsäure bei der Analyse von Lösungen auftreten, bei denen Wasserstoffperoxid mittels eines Bestimmungs-Reagenses analysiert wird, das Peroxidase und einen Stoff enthält, der einer bestimmbaren Veränderung unterliegt, sei es nun auf colorometrischera Wege oder in anderer Weise, in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid, wurden Lösungen aus dem Leucofarbstoff o-Dianisidin und Peroxidase hergestellt, wobei steigende Mengen an Ascorbinsäure und Ascorbinsäure-Oxidase (im folgenden kurz mit ASO bezeichnet) zugesetzt wurden. Die End-Komponente, die diesen Lösungen zugesetzt wurde, war Wasserstoffperoxid, um die Reaktion einzuleiten. Die End-Absorption bei 37°C und 430 au wurde aufgezeichnet. Es wurden jeweils zwei Bestimmungen durchgeführt. Festgehalten wurde in jedem Fall der Mittelwert. Die erhaltenen Mittelwerte sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt. In order to show that interference from ascorbic acid occurs in the analysis of solutions in which hydrogen peroxide is by means of a Determination reagent is analyzed that contains peroxidase and a substance that is subject to a determinable change it now in a colorometric way or in some other way, in the present of peroxidase and hydrogen peroxide, solutions of the leuco dye o-dianisidine and peroxidase were prepared, with increasing amounts of ascorbic acid and ascorbic acid oxidase (hereinafter referred to as ASO for short) were added. The end component, added to these solutions was hydrogen peroxide to initiate the reaction. The final absorption at 37 ° C and 430 au was recorded. Two determinations were carried out in each case. The mean value was recorded in each case. the The mean values obtained are summarized in Table III below.
809809/0798809809/0798
O (D OO OO (D OO O
corbinsäureAdded ace
corbic acid
gleichs-
antwort*i Ver
equal
answer*
gleichs-
antworti Ver
equal
answer
gleichs-
antworti Ver
equal
answer
gleichs-
antworti Ver
equal
answer
+Der Vergleich bezieht sich auf die End-Absorption, erhalten bei einer Null-Konzentration «ο an Ascorbinsäure bei jeder ASO-Konzentration. + The comparison refers to the final absorption obtained with a zero concentration «ο of ascorbic acid with every ASO concentration.
N) CO ON) CO O
- 2i -- 2i -
Aus Tabelle III ergibt sich, daß bei einer Konzentration an Ascorbinsäure von 0,33 mgl Störungen praktisch vollständig ausgeschaltet werden, wenn die Oxidase in einer konzentration von 0,1 mg zugesetzt wird. Des weiteren ergibt sich aus der Tabelle, daß bei einer Konzentration an Ascorbinsäure von 1,33 mgl Störungen von etwa 58t, wenn Oxidase nicht verwendet wird, auf etwa 15 % vermindert werden können, wenn 1,0 mg Oxidase zugesetzt wird.Table III shows that at a concentration of ascorbic acid of 0.33 mg, disturbances are practically completely eliminated if the oxidase is added in a concentration of 0.1 mg. The table also shows that at a concentration of ascorbic acid of 1.33 mg, disturbances of about 58 t, if oxidase is not used, can be reduced to about 15% if 1.0 mg of oxidase is added.
Es wurde eine Reihe mehrschichtiger analytischer Elemente für die Bestimmung von Harnsäure folgenden Aufbaues hergestellt:A number of multilayer analytical elements for the determination of uric acid were produced as follows:
"Blushed" Celluloseacetat mit"Blushed" cellulose acetate with
Oxidase-Oxidase
Schicht:Layer:
Gelatine, deionisierter Puffer, pH=9,0 Ascorbinsäure-Oxidase (ASO)Gelatin, deionized buffer, pH 9.0 ascorbic acid oxidase (ASO)
:5,4 g/m': 5.4 g / m '
:von O bis 2376 U/m' (Details siehe in Tabelle IV): from 0 to 2376 rpm '(for details see in Table IV)
Reagens-Schicht: Reagent Layer:
Gelatine H Dimethoxyverb. Peroxidase
Uricase
Puffer, pH«9,0Gelatin H Dimethoxyverb. Peroxidase uricase
Buffer, pH «9.0
10,8 g/m;10.8 g / m;
270 mg/nr 6500 Einheiten/m'270 mg / nr 6500 units / m '
215 Einheiten/m2 215 units / m 2
Polyesterschichtträger Polyester backing
:0,017 cm: 0.017 cm
2(3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyphenyl)-4,5-bis(4-dimethylamino· phenyl)imidazol.2 (3 ', 5'-Dimethoxy-4'-hydroxyphenyl) -4,5-bis (4-dimethylamino phenyl) imidazole.
809809/0798809809/0798
Beispiel Nr. Ascorbinsäure-Oxidase in ASO- __^_ Schicht (Einheiten/m2) Example no. Ascorbic acid oxidase in ASO- __ ^ _ layer (units / m 2 )
2 O (Vergleich)2 O (comparison)
3 11763 1176
4 15804 1580
5 18375 1837
6 23766 2376
Aus der folgenden Tabelle V ergibt sich, daß, wird die Ascorbin säure-Oxidase fortgelassen, eine beträchtliche Ascorbinsäurestö rung in dem angegebenen Harnsäurebereich auftritt. Die Ascorbin säure-Störung wurde nach folgender Gleichung berechnet:From the following Table V it can be seen that if the ascorbic acid oxidase is omitted, a considerable ascorbic acid disturbance is produced tion occurs in the specified uric acid range. The ascorbic acid disorder was calculated using the following equation:
K K X KK X
und wird in * (Durchschnittswert aus mindestens drei Versuchen) angegeben. Sämtliche Topfel-Lösungen enthielten 7 g \ Bovin-Serumalbumin. Jene Lösungen, die Ascorbinsäure enthielten, wurden alle 1 bis 2 Stunden neu hergestellt. Die DR-Werte im Falle beider Elemente mit Harnsäure allein waren praktisch nicht unterscheidbar und unterschieden sich in weniger als 1 bis 1,5 \. and is given in * (average value from at least three tests). All Topfel solutions contained 7 g \ bovine serum albumin. Those solutions containing ascorbic acid were made up every 1 to 2 hours. The D R values in the case of both elements with uric acid alone were practically indistinguishable and differed by less than 1 to 1.5 \.
Im Falle der Prüflinge der Beispiele 2 bis 6 jedoch, in denen ASO in der ASO-Schicht vorhanden war, ergab sich eine klare Verminderung der Ascorbinsäure-Störung innerhalb des interessierenden Harnsäure-Bereiches und bei den beiden untersuchten Ascorbinsäurekonzentrationen. Des weiteren ergibt sich ein Trend der Verminderung der Ascorbinsäure-Störung, wenn die ASO-Konzentration von 1176 auf 2376 Einheiten/m2 erhöht wird. Bei 2376 Einheiten/m2 ASO ergibt sich eindeutig, daß die Ascorbinsäure-Störung, die im Falle des Vergleichsversuches bei 2,5 und 5,0 mg/dl Harnsäure sehr stark war, auf weniger als 5 % vermindert wurde, gleichgültig, ob 2 oder 3,5 mg/dl Ascorbinsäure vorlagen. Bei den höheren Harnsäurekonzentrationen (10 - 15 mg/dl) wurde die Störung wirksam beseitigt (0In the case of the test specimens of Examples 2 to 6, however, in which ASO was present in the ASO layer, there was a clear reduction in the ascorbic acid interference within the uric acid range of interest and at the two ascorbic acid concentrations investigated. Furthermore, there is a trend of reducing the ascorbic acid disturbance when the ASO concentration is increased from 1176 to 2376 units / m 2 . At 2376 units / m 2 ASO it clearly emerges that the ascorbic acid disturbance, which in the case of the comparative experiment was very strong at 2.5 and 5.0 mg / dl uric acid, was reduced to less than 5 % , regardless of whether 2 or 3.5 mg / dl ascorbic acid were present. At the higher uric acid concentrations (10-15 mg / dl) the disorder was effectively eliminated (0
bis 3 *)· 809809/0798 to 3 *) 809809/0798
analytischen Elementen mit
KonzentrationenDisorder from ascorbic acid
analytical elements with
Concentrations
(Vergleich
ohne ASO)Example 2
(Comparison
without ASO)
ASO ,
(1580 E./m*)Example 4
ASO,
(1580 U./m*)
ASO _
(1837 E./mZ)Example 5
ASO _
(1837 E./m Z )
ASO
(2376 E./mz)Example 6
ASO
(2376 E./m z )
rs)I.
rs)
(mg/dl)Ascorbic acid
(mg / dl)
68,928
68.9
18,611.7
18.6
11.75.8
11.7
5,30.5
5.3
Konzentr.
(mg/dl)Uric acid-
Concentr.
(mg / dl)
3,52
3.5
37,818.7
37.8
12,74.5
12.7
8,35.0
8.3
4,12.1
4.1
3,52
3.5
23,510.2
23.5
8,32.9
8.3
5,82.8
5.8
3,11.2
3.1
O
CO°° 5.0
O
CO
3,52
3.5
15,39.7
15.3
Ascorbinsäure-Oxidase (ASO) bei verschiedenen(at 2.0 or 3.5 mg / dl) when using
Ascorbic acid oxidase (ASO) in various
3,42.0
3.4
4,64.0
4.6
1,4O
1.4
O
COoo 10.0
O
CO
3,52
3.5
ASO ,
(1176 E./mz)Example 3
ASO,
(1176 E./m z )
O
^j^ 15.0
O
^ j
17,14.8
17.1
OOCD
OO
10,14.1
10.1
8,02.9
8.0
5.42.6
5.4
INJ COINJ CO
Es wurde eine Reihe von analytischen Elementen hergestellt, um die Reduktion der Ascorbinsäure-Störung zu veranschaulichen, die erreicht wird durch Zusatz von ASO zur Reagensschicht mit Uricase, Peroxidase und einem Chromogen anstatt einer Unterbringung in einer separaten Gelatineschicht (Tabelle VI).A series of analytical elements were prepared to illustrate the reduction in ascorbic acid disorder that is achieved by adding ASO to the reagent layer with uricase, peroxidase and a chromogen instead of placing it in a separate gelatin layer (Table VI).
809809/07 9 8809809/07 9 8
Ascorbinsäure-Störung bei Verwendung von Harnsäure-Elementen mit und ohne Ascorbinsäure-Oxidase in der Reagensschicht Ascorbic acid disorder when using uric acid elements with and without Ascorbic acid oxidase in the reagent layer
♦3,5 mg/dl Ascorbinsäure♦ 3.5 mg / dl ascorbic acid
σο ο co oo ο coσο ο co oo ο co
Vergleich, d.h. ohne zugesetzte ASOComparison, i.e. without added ASO
1176 E./m2 ASO in der oberen Gelatineschicht oberhalb der Reagensschicht, wie im Falle der Beispiele 2-61176 U./m 2 ASO in the upper gelatin layer above the reagent layer, as in the case of Examples 2-6
1176 E./m2 ASO in der unteren Gelatineschicht, d.h. ASO in der Reagensschicht1176 U./m 2 ASO in the lower gelatin layer, i.e. ASO in the reagent layer
Harnsäuremg / dl
uric acid
säurewithout ascorbine
acid
0,4364
0,9944
1,36020.1099
0.4364
0.9944
1.3602
5
10
152.5
5
10
15th
0,7269
1,1579
1,59790.4882
0.7269
1.1579
1.5979
0,6671
1,1168
1 ,46780.3969
0.6671
1.1168
1, 4678
66,9
63,0
85,122.5
66.9
63.0
85.1
5
10
152.5
5
10
15th
0,7356
1 ,1941
1,61780.4722
0.7356
1, 1941
1.6178
0,6409
1,1317
1,45180.3439
0.6409
1.1317
1.4518
90,7
93,5
90,784.1
90.7
93.5
90.7
5
10
152.5
5
10
15th
0,7511
1,1945
1,61810.4970
0.7511
1.1945
1.6181
85,3
94,7
89,769.2
85.3
94.7
89.7
ro -j co -ο roro -j co -ο ro
Beispiel 10Example 10
Um die Verwendbarkeit von Ascorbinsäure-Oxidase zur Verminderung der Störung eines analytischen Ergebnisses auf Grund des Vorhandenseins von Ascorbinsäure in einer Nicht-Peroxid-Bestimmungsmethode zu veranschaulichen, wurden die im folgenden beschriebenen Versuche zur Bestimmung von Harnsäure nach der Phosphotungstat-Methode durchgeführt. Diese Methode zur Bestimmung von Harnsäure wird von N.W. Tietz in dem Buch "Fundamentals of Clinical Chemistry," Verlag W.B. Saunders Company (1970) auf Seite 727 beschrieben.To reduce the usefulness of ascorbic acid oxidase the interference with an analytical result due to the presence of ascorbic acid in a non-peroxide determination method To illustrate, the experiments described below for the determination of uric acid by the phosphotungstat method were made carried out. This method of determining uric acid is proposed by N.W. Tietz in the book "Fundamentals of Clinical Chemistry," Publishing house W.B. Saunders Company (1970) on page 727.
Es wurden zwei Harnsäureansätze in 7 g % Bovin-Serumalbumin hergestellt, durch Vermischen von abgewogenen Mengen von Harnsäure mit Albuminlösungen. Die nominalen Harnsäurekonzentrationen betrugen S und 10 mg/dl. Von jedem Ansatz wurden drei identische 1 ml Anteile hergestellt. Ein Anteil diente als Vergleichsanteil, während dem zweiten Anteil 2 mg/dl Ascorbinsäure und dem dritten Anteil 2 mg/dl Ascorbinsäure und 0,2 Internationale Einheiten ASO zugesetzt wurden. Alle 6 Anteile wurden dann nach der Phosphotungstat-Methode nach Tietz auf ihren Harnsäuregehalt untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VII zusammengestellt.Two uric acid mixtures were prepared in 7 g% bovine serum albumin by mixing weighed amounts of uric acid with albumin solutions. The nominal uric acid concentrations were 1/2 and 10 mg / dl. Three identical 1 ml portions were made from each batch. One portion served as a comparison portion, while 2 mg / dl ascorbic acid and the third portion 2 mg / dl ascorbic acid and 0.2 international units of ASO were added to the second portion. All 6 portions were then examined for their uric acid content using the Tietz phosphorothungate method. The results obtained are shown in Table VII below.
809809/0799809809/0799
Der Einfluß von Ascorbinsäure auf die Phosphotungstat-Bestimmung von Serum-Harnsäure mit und ohne Ascorbinsäure-OxidaseThe influence of ascorbic acid on the phosphphotungate determination of serum uric acid with and without ascorbic acid oxidase
Nominale Urat-Konzentration durch Einwiegen Nominal urate concentration by weighing
5 mg/dl5 mg / dl
10 mg/dl10 mg / dl
Lösungsolution
1. Urat allein (Vergleich)1. Urate alone (comparison)
2. Urat + 2 mg/dl Ascorbinsäure2. Urate + 2 mg / dl ascorbic acid
3. wie bei 2.+ 0,2 Internationale Einheiten ASO (0,1 mg)3rd as for 2nd + 0.2 international units ASO (0.1 mg)
1. Urat allein (Vergleich)1. Urate alone (comparison)
2. Urat + 2 mg/dl Ascorbinsäure2. Urate + 2 mg / dl ascorbic acid
3. wie bei 2. ♦ 0,2 Internationale Einheiten ASO (0,1 mg)3. As with 2. ♦ 0.2 international units ASO (0.1 mg)
Bestimmungswert für Urat (mg/dl) Determination value for urate (mg / dl)
5,1 6,3 5,25.1 6.3 5.2
9,89.8
10,810.8
9,79.7
Aus Tabelle VII ergibt sich, daß das Vorhandensein von ASO die Störung, die durch Ascorbinsäure bei der Phosphotungstat-Bestimmung von Harnsäure hervorgerufen wird, ausgeschaltet wird.From Table VII it can be seen that the presence of ASO is the interference caused by ascorbic acid in the phosphotungate determination caused by uric acid is turned off.
809809/0798809809/0798
Claims (24)
Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 5 mit einer Ausbreitschicht und einer Reagensschicht, die bei ihrer Verwendung in Kontakt miteinander stehen, dadurch gekennzeichnet, daß es Ascorbinsäure-Oxidase enthält.21. Multi-layer analytical element for performing the
Process according to Claims 1 to 5, having a spreading layer and a reagent layer which are in contact with one another when they are used, characterized in that it contains ascorbic acid oxidase.
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Also Published As
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