DE2322533C2 - Verfahren zum Binden von Immunoglobulin und Hilfsmittel zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zum Binden von Immunoglobulin und Hilfsmittel zur Durchführung des VerfahrensInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Binden von mindestens einem Immunoglobulin oder dessen freiem
Fc-Fragment, wobei das Immunoglobulin in freier Form oder mit seinem Fab-Teil gebunden an ein Antigen, an
das wahlweise eine oder mehrere Gruppen oder Substanzen gebunden sind, vorliegt, in Gegenwart einer
Flüssigkeit an ein in der Flüssigkeit unlösliches Polymer mit Hilfe einer an das Polymer gebundenen Substanz
sowie ein Hilfsmittel zur Durchführung des Verfahrens.
Es ist bekannt Polypeptidantigene an unlösliche Polymere zu binden. Derartige gebundene Antigene können
solche Immunoglobuline immunochemisch binden, die gegen das Antigen gerichtete Antikörper sind. (Hierbei
binden sich die Fab-Teile der Antikörper an das Antigen.) Es ist auch bekannt, Antikörper an unlösliche Polymere
zu binden. Derartige gebundene Antikörper können solche Antigene binden, gegen die die Antikörper
gerichtet sind. Hierbei kann das Antigen beispielsweise
ίο ein Immunoglobulin (oder ein Fragment von einem Immunoglobulin,
das ein glattes Äquivalent zum Immunoglobulin selbst darstellt) sein, wobei das Immunoghbulin
(bzw. das Fragment davon) an die polymergebundenen Antikörper gebunden werden können. Beispiele
von der Verwendung an fester Phase gebundenen Antigene oder Antikörper zur Bildung der entsprechenden
Antikörper oder Antigene sind in einem Übersichtsartikel von I. Silman und E. Katchalski in Annual Review of
Biochemistry Vol.35, 1966, Teil II, S.873-804, insbesondere Seite 896—904 beschrieben. Viele Methoden
zur Bildung von Polypeptiden an unlösliche Polymere sind ebenfalls beschrieben, wie beispielsweise in der
US-PS 36 45 852.
In Angew.Chem. 84, S. 319 (1972) und Annu. Rev. Biochem. 40, 259—278 (1971) wird ausgeführt,
daß die Affinitätschromatographie eine neue Methode sei.
Zu Beginn der 70er Jahre war.die Technik der »Affinitätschromatographie«
nicht mehr neu, sondern seit wenigstens 15 Jahren schon allgemein bekannt. Die allerersten
Versuche, biologisch aktive Substanz an einen Träger unter Beibehaltung der Aktivität zu binden, wurden
in den 20er und 30er Jahren durchgeführt; s. z. B. Annu. Rev. Biochem. 32 (1966) 873—874 und Literaturangäbe
auf Seite 905.
Seit 1958 ist es bekannt, daß Protein A humanes y-Globulin
präzipitiert (Acta Pathol. Microbiol. Scandinav. 44 (1958) 421 —428). Viel früher bereits hatte man
verschiedene Methoden zur Reinigung von Immunoglobulinen der IgG-Klasse entwickelt, und zwischen den
Jahren 1958 und 1972 wurden weitere Methoden entwickelt.
Die bisher bekannten Reinigungsmethoden für IgG waren alle sehr zeitraubend und enthielten mehrere verschiedene
Reinigungsstufen mit einer schlechten Gesamtausbeute. Sie stellten im Prinzip ein »Auffischen«
von Verunreinigungen dar, was prinzipiell zu einer schlechten Kontrolle über die verbleibenden Verunreinigungen
führte.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine einfache Reinigungsmethode für Immunoglobuline bereitzustellen,
mit deren Hilfe ein sehr reines Produkt in sehr hoher Ausbeute erhalten wird.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem gattungsgemäßen Verfahren dadurch gelöst, daß das Immunoglobulin
ein Immunoglobulin der Klasse IgG ist und daß die verwendete an das Polymer gebundene
Substanz Protein A ist.
Im vorliegenden werden der Ausdruck »Immunoglobulin G« und »IgG« identisch benutzt.
Im vorliegenden werden der Ausdruck »Immunoglobulin G« und »IgG« identisch benutzt.
Die Erfindung ermöglicht ein besonders einfaches, bequemes, spezifisches und reversibles Verfahren zum
Binden von Immunoglobulin G in freier Form oder mit seinen Fab-Teilen gebunden an ein Antigen, an ein PoIymeres,
das in der Flüssigkeit unlöslich ist. Da gemäß der Erfindung das Immunoglobulin über seinen Fc-Teil an
die polymere feste Phase gebunden wird, wird der antigenspezifische Fab-Teil intakt gelassen. Der Fab-Teil
kann so an ein Antigen gebunden werden, oder der Fab-Teil kann veranlaßt werden, sich selbst an ein Antigen
zu binden.
Das Funktionieren dieses Verfahrens war besonders überraschend, weil der Fachmann erwarten mußte, daß
die Fähigkeit von Protein A, IgG biospezifisch zu binden, durch die kovalente Bindung von Protein A an
einen unlöslichen Träger beeinträchtigt würde, und zwar insbesondere deshalb, weil Protein A ein kleines
Protein ist und die Kupplung von Proteinen an den Träger mit Hilfe von Amino- und Carboxylgruppen erfolgt,
die sich über die ganze Oberfläche des kleinen Proteins verbreiten, wodurch zu erwarten war, daß die Affinitätsstellen blockiert wurden.
Außerdem ist aus J. Imunol. 104 (2), S. 273-278 (1970) bekannt, daß die Affinität zwischen Protein A und IgG
schwach ist, so daß der Fachmann erwarten mußte, daß
eine effektive Absorption nicht zustande käme.
Das Immunoglobulin G oder sein an das Antigen zu bindendes Fc-Fragment kann von verschiedenen Tier-'
arten, in erster Linie von Wirbeltieren, vorzugsweise von Säugetieren, stammen. Der Fc-Teil der Immunoglobuline
G kann nach bekannten enzymatischen Methoden zu dem entsprechenden Fc-Fragment abgespalten
werden.
Gemäß der Erfindung kann das Immunoglobulin G oder sein freies Fc-Fragment nicht markiert oder markiert
sein. Unter »markiert« wird hier verstanden, daß das Immunoglobulin oder sein freies Fc-Fragment für
analytische Zwecke mit charakteristischen Gruppen oder Atomen, wie z. B. radioaktive Atome oder diese
enthaltende Gruppen oder auch fluoreszierende Gruppen oder ein oder mehrere Substituenten mit enzymatischer
Wirksamkeit, versehen ist. In gleicher Weise können das Antigen oder die daran gebundenen Gruppen
im vorstehenden Sinne nicht markiert oder markiert sein, wenn das Antigen an den Fab-Teil des Immunoglobulins
gebunden ist.
Nach der Erfindung kann das Protein A z. B. Protein A von Staphylococcus aureus oder Fragmente dieses
Proteins sein, wobei diese Fragmente von Polypeptid-Natur sind. Diese Polypeptide (Protein A und Fragmente
davon), die von S. aureus abgeleitet sind, besitzen die Fähigkeit, zur IgG-Klasse gehörende Immunoglobuline
an ihren Fc-Teilen zu binden.
Wie vorstehend erwähnt, wird das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart einer Flüssigkeit durchgeführt.
Die Flüssigkeit ist in erster Linie eine wäßrige Flüssigkeit, wie z. B. eine gepufferte Kochsalzlösung von geeignetem
pH-Wert, z. B. einem etwa neutralen pH-Wert.
Erfindungsgemäß kann das Protein A oder Fragmente davon, mit Hilfe von kovalenten Bindungen an das
Polymer gebunden werden. Auf diese Weise wird sichergestellt, daß das Protein A während der Waschvorgänge
nicht aus der festen Phase herausgelöst oder entfernt wird. Das Protein A kann nach Methoden, die
üblicherweise zum Binden von Polypeptiden, z. B. Proteinen, an polymere Substanzen verwendet werden, z. B.
mit Hilfe von Cyanhalogeniden, Isocyanaten usw., an das Polymer gebunden werden. Die verwendeten polymeren
Substanzen können Polymere sein, die üblicherweise für ähnliche Zwecke eingesetzt werden, z. B. Cellulose,
Agarose und vernetzte Polysacchyride, wie Dextran, das mit Epichlorhydrin vernetzt ist (Sephadex®).
Die aus dem Polymer bestehende feste Phase kann in verschiedener Form vorliegen. In vielen Fällen kann das
Polymer in Teilchenform eingesetzt werden. Andere Beispiele schließen die Möglichkeit ein, daß das Polymer
an der Wand eines Teströhrchens abgelagert ist
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Hilfsmittel verwendet, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß es ein in der Flüssigkeit unlösliches Polymer enthält oder daraus besteht, an welches Protein
A oder Fragmente davon gebunden ist bzw. sind.
Was vorstehend hinsichtlich des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeführt wurde, ist auch auf das Hilfsmittel
anwendbar.
Die Erfindung kann auf verschiedenen Gebieten angewendet werden, wenn es erforderlich ist, spezifisch
und — gegebenenfalls — reversibel Immunoglobuline G oder ihre Fc-Fragmente an eine polymere feste Phase
zu binden. Beispiel für derartige Anwendungen sind die Reinigung eines Immunoglobulins G oder seines Fc-Fragmentes.
Aufgrund der Tatsache, daß das Immunoglobulin G oder das Fc-Fragment unter milden Bedingungen,
z. B. durch Veränderung des pH-Wertes oder der Ionenstärke, abgetrennt werden kann, können das
immunogiobulin G oder sein Fc-Fragment in einer sehr reinen Form erhalten werden. Die Erfindung kann auch
zur Trennung von einem oder mehreren Immunoglobulinen G von anderen Immunoglobulinklassen in einem
Gemisch verschiedener Immunoglobuline angewendet werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht auch, ein Fc-Fragment aus einem Gemisch von Fc-
und Fab-Fragmenten derart spezifisch zu binden, daß das Fab-Fragment leicht in reinem Zustand abgetrennt
werden kann. Der gebundene Fc-Fragment kann dann von dem löslichen Polymeren nach einer üblichen Methode
abgetrennt und in reinem Zustand erhalten werden.
Das Verfahren kann auch in Verbindung mit einer Anzahl von immunologischen Methoden zur Bestimmung
von Immunoglobulinen oder Antigenen angewendet werden.
Bei solchen Methoden können Verfahren und das Hilfsmittel der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden,
um ein Immunoglobulin G in freier Form oder in an ein Antigen gebundener Form oder auch dessen Fc-Fragmente
unlöslich zu machen. Sie können im Zusammenhang hiermit auch markiert werden.
Wenn die Immunoglobuline G in freier Form gebunden werden, können ihre Fab-Teile verwendet werden, um Antigene, gegen die diese Fab-Teile gerichtet sind, zu binden. Das Antigen kann in einer markierten Form vorliegen. Das Antigen seinerseits kann an verschiedene Gruppen oder Substanzen, die im Sinne der vorstehenden Bedeutung markiert sein können, gebunden sein.
Wenn die Immunoglobuline G in freier Form gebunden werden, können ihre Fab-Teile verwendet werden, um Antigene, gegen die diese Fab-Teile gerichtet sind, zu binden. Das Antigen kann in einer markierten Form vorliegen. Das Antigen seinerseits kann an verschiedene Gruppen oder Substanzen, die im Sinne der vorstehenden Bedeutung markiert sein können, gebunden sein.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
B e i s ρ i e 1 1
I. Polypeptid-Herstellung
A. Herstellung eines rohen Extraktes von
Polypeptid-Fragment von Protein A aus
Polypeptid-Fragment von Protein A aus
Staphylococcus aureus
Nach der von Sjöquist u. a. in European J. Biochem. Bd. 29 (1972) Seite 572 beschriebenen Methode wurde
S. aureus, Stamm Cowan I (ATCC 12 598 = NCTC 8530), gezüchtet.
Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren entfernt und mit 0,9%iger NaCl-Lösung in Wasser gewaschen.
100 g Bakterien (Feuchtgewicht) wurden in 150 ml einer
physiologischen Kochsalzlösung aufgeschlämmt 10 mg Trypsin (frei von Chymotrypsin) wurden zugesetzt Der
pH-Wert betrug 7,2. Ein Enzym-Behandb.ngsverfahren wurde 30 Minuten bei 30° C und einem pH-Wert von 7,2
durchgeführt wonach 20 mg Trypsin-lnhibitor aus Sojabohnen zugesetzt wurden. Die Suspension wurde
dann zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen und durch Milliporen-Filter steril filtriert.
Die steril filtrierte Flüssigkeit enthielt Fragmente von Protein A mit Polypeptid-Charakter im Gemisch mit
verunreinigenden Substanzen. Zur Reinigung der Fragmente, die fähig sind, sich an den Fc-Teil von IgG-MoIekülen
zu binden, wurden diese mit Hilfe von Agarose, an die IgG gebunden war, isoliert.
B. Herstellung von Agarose, woran
IgG gebunden ist
IgG gebunden ist
Agarose in Form eines im Handel erhältlichen Präparates, Sepharose®4B (Pharmacia Fine Chemicals AB,
Üppsala, Schweden), wurde für diesen Versuch eingesetzt.
Die Agarose wurde in Form kleiner Teilchen (40—190 μ) eingesetzt, die zur Quellung in Wasser fähig
sind. Die Teilchenmasse enthielt 4 Gew.-% Agarose. Die Teilchenmasse wurde zuerst mit Wasser gewaschen.
100 ml der gepackten Teilchenmasse im Gemisch mit 50 ml Wasser wurde mit 10 g Cyanbromid in 50 ml
Wasser unter Rühren bei 20°C versetzt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 5 η NaOH bei 10—11 gehalten
wurde. Nach 10 Minuten wurden die Teilchenmasse sorgfältig mit eiskaltem Wasser und dann mit 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Puffer
in Wasser bei pH 9,0 und 4° C gewaschen.
Die mit Cyanbromid aktivierte Teilchenmasse wurde unter Rühren bei 4° C in 120 ml der vorstehenden Pufferlösung
von pH 9,0 mit einem Gehalt von 3,0 g menschlichem IgG (erhalten von Kabi AB, Stockholm,
Schweden) aufgeschlämmt.
Nach 4 Stunden wurde die Teilchenmasse durch Filtration abgetrennt und mit der vorstehenden Pufferlösung
von pH 9,0 gewaschen,· wonach die Teilchenmasse in 1,51 einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von
0,05 m 2-Aminoäthanol und 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat von pH 9,0 aufgeschlämmt und
18 Stunden bei 4°C gerührt wurde. Die Teilchenmasse wurde dann mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung
in Wasser mit einem Gehalt von 4 m Harnstoff von pH 6,0 und anschließend mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung
in Wasser von pH 7,0 gewaschen, bis die OD 280 m der Waschflüssigkeit weniger als 0,01 betrug. Die Gelmasse wurde dann mit einer
0,1 m Glyein-HCl-Pufferlösung in Wasser von pH 3,0
und anschließend erneut mit der vorstehenden 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung von pH 7,0 gewaschen.
Das erhaltene Produkt enthielt etwa 30 mg gebundenes IgG pro ml der gepackten Teilchenmasse.
C. Trennung der Polypeptid-Fragmente
von Protein A aus S. aureus
von Protein A aus S. aureus
Eine chromatographische Säule wurde mit 100 ml der in der vorstehenden Stufe B erhaltenen gepackten Teilchenmasse,
an die IgG bei pH 7,0 gebunden war, gefüllt. 100 ml des in der vorstehenden Stufe A erhaltenen rohen
Extraktes von pH 7,0, der die Polypeptidfragmente von Protein A enthielt, wurden langsam bei 2O0C mit
einer Durchflußgeschwindigkeit von 50 ml pro Stunde durch die Säule mit der Teilchenmasse geleitet. Die Teilchenmasse
wurde dann in der Säule mit 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser bei pH 7,0 sorgfältig
gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,02 betrug. Das erhaltene Produkt enthielt
etwa 1 mg gebundene Polypeptide pro ml der gepackten Teilchenmasse.
ίο D. Trennung der Polypeptid-Fragmente
von Protein A von der Teilchenmasse
Die in der vorstehenden Stufe C erhaltenen, an die Teilchenmasse gebundenen Polypeptide wurden durch
Eluieren der Säule mit 100 ml einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung
in Wasser mit einem pH-Wert von 3,0 aus der Teilchenmasse freigesetzt. Die gesammelte Glycin-HCl-Pufferlösung,
die die zum Binden des Fc-Teils von IgG-Molekülen fähigen Polypeptide enthielt wurde
durch Gelfiltration mit Hilfe von Sephadex® G 25 (Teilchen von mit Epichlorhydrin vernetzten! Dextran) entsalzen.
Durch Gefriertrocknen wurden etwa 100 mg Polypeptide
mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 isoliert Durch Chromatographie konnte gezeigt werden,
daß die Polypeptid-Fraktion mehrere eng verwandte Polypeptide enthielt, die alle die Fähigkeit zum Binden
der Fc-Teile von IgG-Molekülen hatten. Durch u. a. immunologische Versuche konrue gezeigt werden, daß
die Polypeptid-Fraktion rein von verunreinigenden Substanzen war.
In entsprechender Weise können die Polypeptid-Fragmente, die zum Binden des Fc-Teils von IgG-Molekülen
fähig sind, isoliert werden, indem man zuerst Protein A isoliert und dann Protein A in Lösung bei z. B. pH
8,2 mit Trypsin in einer der vorstehenden analogen Weise behandelt wonach die Polypeptid-Fragmente mit
den entsprechenden Eigenschaften in einer der vorstehenden analogen Weise abgetrennt werden, indem man
sie an eine Agarose, an die IgG gebunden war, bindet und die Polypeptid-Fragmente anschließend abtrennt.
II. Herstellung von Agarose, an die
Polypeptid von Protein A aus S. aureus
gebunden ist
E. Herstellung von Agarose, an die
Polypeptid gebunden ist
Polypeptid gebunden ist
Für diesen Versuch wurde eine Agarose in Form des im Handel erhältlichen Präparates Sepharose® 4 B
(Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) verwendet
Die Agarose wurde in Form kleiner Teilchen (40—190 μ) verwendet, die in Wasser gequollen waren.
Die Teilchenmasse enthielt 4 Gew.-% Agarose. Die Teilchenmasse wurde zuerst mit Wasser gewaschen.
10 ml der gepackten Teilchenmasse wurden mit 5 ml Wasser versetzt und dann unter Rühren bei 20° C mit
1 g Cyanbromid in 5 ml Wasser vermischt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 1 η NaOH bei 10 bis 11
gehalten wurde. Nach 10 Minuten wurde die Teilchenmasse sorgfältig mit eiskaltem Wasser und dann mit
einer 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung
in Wasser bei pH 9,0 und 40C gewaschen.
Die mit Cyanbromid aktivierte Teilchenmasse wurde in 12 ml der vorstehenden Pufferlösung bei pH 9,0 mit
einem Gehalt von 25 mg reinem Polypeptid unter Rühren bei 4° C aufgeschlämmt.
Nach 4 Stunden wurde die Teilchenmasse durch Filtration gewonnen und mit der vorstehenden Pufferlösung
bei pH 9,0 gewaschen, wonach die Teilchenmasse in 500 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von
0,05 m 2-Aminoäthanol und 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat mit einem pH-Wert von 9,0 suspendiert
und 18 Stunden bei 4° C gerührt wurde. Die Teilchenmasse wurde dann mit 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung
in Wasser mit einem Gehalt von 4 m Harnstoff und einem pH-Wert von 6,0 und anschließend mit
einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen, bis die OD
280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,01 betrug. Die Gelmasse wurde dann mit einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung
in Wasser bei pH 3,0 und anschließend erneut mit der vorstehenden 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung
bei pH 7,0 gewaschen. Das erhaltene Produkt enthielt gebundenes Polypeptid, das zum Binden
des Fc-Teils von IgG- Molekülen fähig war.
III. Binden von Immunoglobulin aus
menschlichem Serum
menschlichem Serum
F. Binden an Agarose, an die
Polypeptid gebunden ist
Polypeptid gebunden ist
10 ml der nach der vorstehenden Stufe E erhaltenen gepackten Teilchenmasse, an die ein Polypeptid durch
covalente Bindungen gebunden war und die einen pH-Wert von 7,0 hatte, wurden in eine chromatische Säule
eingeführt Dann wurden 10 ml menschliches Serum, die mit 10 ml der vorstehenden 0,1m Natriumphosphat-Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 7,0 verdünnt waren, durch die Säule geleitet, wobei die Teilchenmasse
bei 200C und die Durchflußgeschwindigkeit bei 30 Minuten
gehalten wurde. Die Teilchenmasse wurde dann in der Säule sorgfältig mit 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung
in Wasser bei pH 7,0 gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,02 betrug.
Das erhaltene Produkt enthielt Immunoglobuline der IgG-Kiasse, die an die Teilchenmasse gebunden waren.
Die gebundenen Immunoglobuline können aus den Polymerteilchen durch einfache Verfahren, z. B. durch
Veränderung des pH-Wertes oder der ionenstärke, freigesetzt werden. So wurden die gemäß dem vorstehenden
Versuch gebundenen Immunoglobuline durch EIuieren mit einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung in Wasser
bei pH 3,0 wieder von der Teilchenmasse getrennt Durch immunologische Versuche usw. wurde gezeigt,
daß die wieder freigesetzten Immunoglobuline frei von zurückgebliebenen Serumproteinen waren und zur Immunoglobulin-Klasse
IgG gehörten.
Binden von Immunoglobulin
aus Schweineserum
aus Schweineserum
Der Versuch wurde in gleicher Weise wie der von Beispiel 1 durchgeführt In diesem Fall wurde jedoch die
Teilcheninasse mit dem daran gebundenen Polypeptid nicht in eine Säule eingeführt, sondern das Immunoglobulin
wurde in folgender Weise gebunden: 10 ml der gepackten Teilchenmasse mit dem covalent daran gebundenen
Polypeptid (wobei das Polypeptid analog Stufe E von Beispiel 1 erhalten wurde) wurden in 50 ml
einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 suspendiert Zu dieser Suspension
wurden im Verlauf von 10 Minungen tropfenweise bei einer Temperatur von 200C 10 ml Schweineserum
gegeben. Nach 30 Minuten wurde die Teilchenmasse durch Filtration abgetrennt und sorgfältig mit
0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 gewaschen. Wie in Beispiel 1 waren
auf diese Weise die zur Klasse IgG gehörenden Immunoglobuline an die Teilchenmasse gebunden worden.
Dies konnte durch anschließende Abtrennung der gebundenen Immunoglobuline und nachfolgenden Analysen
in einer Weise, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, gezeigt werden.
I. Herstellung von reinem Protein A
aus S. aureus
aus S. aureus
A. Herstellung des rohen Extraktes
von Protein A aus Staphylococcus aureus
von Protein A aus Staphylococcus aureus
Nach der von Sjöquist u. a. in European J. Biochem. Bd. 29 (1972), S. 572 beschriebenen Methode wurde der
Stamm Cowan I (ATCC 12 598 = NCTC 8530) von
S. aureus gezüchtet.
Aus den Bakterien wurde Protein A mit Hilfe des Enzympräparates Lysostaphin freigesetzt. Unlösliches
Material wurde durch Zentrifugieren entfernt, und die flüssige Phase wurde gewonnen. Der pH-Wert wurde
mit HCl auf 3,5 eingestellt, und das unlösliche Material wurde durch Zentrifugieren entfernt, und die Flüssigkeit
wurde gewonnen. Der pH-Wert wurde dann gemäß der vorstehenden Literatur mit Hilfe von NaOH auf 0,7 eingestellt.
Die enthaltene Flüssigkeit stellte einen rohen Extrakt dar, der Protein A im Gemisch mit verunreinigenden
Substanzen enthielt
B. Herstellung von Agarose, an
die IgG gebunden ist
die IgG gebunden ist
Für diesen Versuch wurde Agarose in Form eines im Handel erhältlichen Präparates, nämlich Sepharose®
4 B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) eingesetzt
Die Agarose wurde in Form kleiner Teilchen (40 bis 190 μ) eingesetzt, die in Wasser gequollen waren. Die
Teilchenmasse enthielt 4Gew.-°/o Agarose. Die Teilchenmasse
wurde zuerst mit Wasser gewaschen. 100 ml
so der gepackten Teilchenmasse wurden mit 50 ml Wasser versetzt und dann unter Rühren bei 200C mit 10 g Cyanbromid
in 50 ml Wasser gemischt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 5 η NaOH bei 10 bis 11 gehalten wurde.
Nach 10 Minuten wurde die Teilchenmasse sorgfältig mit eiskaltem Wasser und dann mit einer 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung
in Wasser bei pH 9,0 und 4" C gewaschen.
Die Cyanbromid aktivierte Teilchenmasse wurde in 120 ml der vorstehenden Pufferlösung von pH 9,0 mit
einem Gehalt von 3,0 g menschlichem IgG (erhalten von KaM AB, Stockholm, Schweden) bei 4° C unter Rühren
aufgeschlämmt
Nach 4 Stunden wurde die Teilchenmasse durch Filtration gewonnen und mit der vorstehenden Pufferlösung
von pH 9,0 gewaschen. Die Teilchenmasse wurde dann in 1,51 einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt
von 0,05 m 2-Aminoäthanol und 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat
bei pH 9,0 suspendiert und
18 Stunden lang bei 4°C gerührt. Anschließend wurde die Teilchenmasse mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung
in Wasser mit einem Gehalt von 4 m Harnstoff und einem pH-Wert von 6,0 und dann mit einer
0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen, bis die OD 280 nm der
Waschflüssigkeit weniger als 0,01 betrug. Die Gelmasse wurde dann mit einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung in
Wasser bei pH 3,0 und anschließend erneut mit der vorstehenden 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem
pH-Wert von 7,0 gewaschen. Das erhaltene Produkt enthielt etwa 30 mg gebundenes IgG pro ml der
gepackten Teilchenmasse.
C. Trennung von Protein A aus
dem rohen Extrakt von S. aureus
dem rohen Extrakt von S. aureus
Eine chromatographische Säule wurde mit 100 ml der in Stufe B erhaltenen gepackten Teilchenmasse mit daran
gebundenem IgG und mit einem pH-Wert von 7,0 gefüllt. 500 ml des in Stufe A erhaltenen rohen Extraktes
mit einem Gehalt von Protein A und einem ρ H-Wert von 7,0 wurden langsam bei 20° C durch die Säule geleitet,
wobei die Durchflußgeschwindigkeit auf 50 ml pro Stunde eingestellt wurde. Die Teilchenmasse wurde
dann in der Säule sorgfältig mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert
von 7,0 gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,02 betrug. Das erhaltene Produkt enthielt
etwa 3 mg gebundenes Protein A pro 1 ml der gepackten Teilchenmasse.
ü. Abtrennung von Protein A
aus der Teilchenmasse
aus der Teilchenmasse
Das gemäß der vorstehenden Stufe C an die Teilchenmasse
gebundene Protein A wurde durch Eluieren der Säule mit 100 ml einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung in
Wasser bei pH 3,0 daraus freigesetzt Die das Protein A enthaltende gesammelte Glycin-HCl-Pufferlösung wurde
gegen destilliertes Wasser dialysiert, wonach das Protein A in fester Form durch Gefriertrocknen erhalten
wurde. Auf diese Weise wurden etwa 250 mg Protein A in reiner Form erhalten. (Anstelle der Dialyse kann
auch eine Entsalzung mit Hilfe einer Gelfiltration durchgeführt werden.) Durch immunologische Versuche
konnte gezeigt werden, daß das Protein A frei von verunreinigenden Substanzen war.
II. Herstellung von Agarose, an die
Protein A aus S. aureus gebunden ist
Protein A aus S. aureus gebunden ist
E. Herstellung von Agarose, an die
Protein A gebunden ist
Protein A gebunden ist
Für diesen Versuch wurde Agarose in Form des im Handel erhältlichen präparates Sepharose® 4 B (Pharmacia
Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) eingesetzt
Die Agarose wurde in Form kleiner Teilchen (40—190 μ) eingesetzt die in Wasser gequollen waren.
Die Teilchenmasse enthielt 4 Gew.-% Agarose. Die Teilchenmasse wurde zuerst mit Wasser gewaschen.
10 ml der gepackten Teilchenmasse wurde mit 5 ml Wasser versetzt und unter Rühren bei 200C mit 1 g
Cyanbromid in 5 ml Wasser gemischt wobei der pH-Wert durch Zugabe von 1 π NaOH bei 10 bis 11 gehalten
wurde. Nach 10 Minuten wurde die Teilchenmasse sorgfältig mit eiskaltem Wasser und dann mit einer
0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung in Wasser von pH 9,0 und 4°C gewaschen.
Die mit Cyanbromid aktivierte Teilchenmasse wurde bei 4° C unter Rühren in 12 ml der vorstehenden Pufferlösung von pH 9,0 mit einem Gehalt von 50 mg reinem Protein A aufgeschlämmt.
Die mit Cyanbromid aktivierte Teilchenmasse wurde bei 4° C unter Rühren in 12 ml der vorstehenden Pufferlösung von pH 9,0 mit einem Gehalt von 50 mg reinem Protein A aufgeschlämmt.
Nach 4 Stunden wurde die Teilchenmasse durch Filtration gewonnen und mit der vorstehenden Pufferlösung
von pH 9,0 gewaschen, wonach die Teilchenmasse in 500 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von
0,05 m 2-AminoäthanoI und 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat und einem pH-Wert von 9,0 suspendiert
und 18 Stunden bei 40C gerührt wurde. Die Teilchenmasse
wurde dann mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem Gehalt von
4 m Harnstoff und einem pH-Wert von 6,0 und anschließend mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in
Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,01 betrug.
Die Gelmasse wurde dann mit einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 3,0
und anschließend erneut mit der vorstehenden 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von
7,0 gewaschen. Das erhaltene Produkt enthielt etwa
5 mg gebundenes Protein A pro ml der gepackten Teilchenmasse.
III. Binden von Immunoglobulin aus
menschlichem Serum
menschlichem Serum
F. Binden an Agarose, an die
Protein A gebunden ist
Protein A gebunden ist
10 ml der in Stufe E erhaltenen gepackten Teilchenmasse, an die Protein A covalent gebunden war und die
einen pH-Wert von 7,0 aufwies, wurden in eine chromatographische Säule gefüllt Durch die Säule mit der Teilchenmasse
wurden bei 200C in einer Durchflußzeit von
30 Minuten 10 ml menschliches Serum geleitet die mit
10 ml der vorstehenden 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 verdünnt waren. Die
Teilchenmasse wurde dann in der Säule sorgfältig mit 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser von pH
7,0 gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,02 betrug. Das erhaltene Produkt enthielt
Immunoglobuline der Klasse IgG gebunden an die Teilchenmasse.
Die gebundenen Immunoglobuline können durch einfache Verfahren, z. B. durch Veränderung des pH-Wertes oder der Ionenstärke, aus dem Polymerteilchen freigesetzt werden. So wurden die im vorstehenden Versuch gebundenen Immunoglobuline durch Eluieren mit 0,1 m Glycerin-HCl-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 3,0 wieder von der Teilchenmasse getrennt Durch immunologische Tests usw. wurde festgestellt daß die wieder freigesetzten Immunoglobuline rein von Serumproteinen waren und zur Klasse IgG der Immunoglobuline gehörten.
Die gebundenen Immunoglobuline können durch einfache Verfahren, z. B. durch Veränderung des pH-Wertes oder der Ionenstärke, aus dem Polymerteilchen freigesetzt werden. So wurden die im vorstehenden Versuch gebundenen Immunoglobuline durch Eluieren mit 0,1 m Glycerin-HCl-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 3,0 wieder von der Teilchenmasse getrennt Durch immunologische Tests usw. wurde festgestellt daß die wieder freigesetzten Immunoglobuline rein von Serumproteinen waren und zur Klasse IgG der Immunoglobuline gehörten.
Binden von Immonuglobulin
aus Schweineserum
aus Schweineserum
Dieser Versuch wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 3 durchgeführt wobei jedoch in diesem Fall die
Teilchenmasse mit dem daran gebundenen Protein A
nicht in eine Säule eingeführt wurde, sondern das Immunoglobulin
in folgender Weise gebunden wurde: 10 ml der gepackten Teilchenmasse mit dem covalent
daran gebundenen Protein A (wobei das Protein A analog Stufe E von Beispiel 3 erhalten worden war) wurden
in 50 ml einer 0,1 m Natriumphosphat-pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 suspendiert. Diese
Suspension wurde im Verlauf von 10 Minuten bei einer Temperatur von 200C tropfenweise mit 10 ml Schweineserum
versetzt. Nach 30 Minuten wurde die Teilchenmasse durch Filtration abgetrennt und sorgfältig mit
einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen.
Wie in Beispiel 3 waren die Immunoglobuline der Klasse IgG an die Teilchenmasse gebunden worden.
Dies konnte gezeigt werden, indem man die gebundenen Immunoglobuline wieder abgetrennte und anschließend
die in Beispiel 3 beschriebenen Analysen durchge,-führte.
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Claims (12)
1. Verfahren zum Binden von mindestens einem Immunoglobulin oder dessen freiem Fc-Fragment,
wobei das Immunoglobulin in freier Form oder mit seinem Fab-Teil gebunden an ein Antigen, an das
wahlweise eine oder mehrere Gruppen oder Substanzen gebunden sind, vorliegt, in Gegenwart einer
Flüssigkeit an ein in der Flüssigkeit unlösliches Polymer mit Hilfe einer an das Polymer gebundenen
Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunoglobulin ein Immunoglobulin der Klasse
IgG ist und daß die verwendete an das Polymer gebundene Substanz Protein A oder Fragmente davon
ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein markiertes Immunoglobulin G oder ein markiertes freies Fc-Fragment des immunoglobulins
G verwendet
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Verwendung eines Immunoglobulins
G, an dessen Fab-Teil ein Antigen gebunden ist, das Antigen markiert.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man es zur
Reinigung von einem Immunoglobulin G anwendet.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man es zu einer
immunologischen Bestimmung anwendet
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Flüssigkeit
eine wäßrige Flüssigkeit verwendet
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Protein A
oder Fragmente davon über kovalente Bindungen an das Polymer gebunden wird.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polymer
in Form von Teilchen einsetzt.
9. Hilfsmittel zur Durchführung der Verfahren nach den Ansprüchen 1—8, dadurch gekennzeichnet,
daß es ein in der Flüssigkeit unlösliches Polymer enthält oder daraus besteht, an welches Protein A
oder Fragmente davon gebunden ist bzw. sind.
10. Hilfsmittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein A von Staphylococcusaureus
erhalten worden ist.
11. Hilfsmittel nach Anspruch 9 und 10, dadurch
gekennzeichnet, daß Protein A bzw. die Fragmente davon über kovalente Bindungen an das Polymer
gebunden ist bzw. sind.
12. Hilfsmittel nach Anspruch 9 oder 11, dadurch
gekennzeichnet, daii das Polymer in Teilchenform vorliegt.
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