DE2224132B1 - METHOD AND REAGENT FOR DETERMINATION OF CHOLESTEROL - Google Patents

METHOD AND REAGENT FOR DETERMINATION OF CHOLESTEROL

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DE2224132B1 DE19722224132 DE2224132A DE2224132B1 DE 2224132 B1 DE2224132 B1 DE 2224132B1 DE 19722224132 DE19722224132 DE 19722224132 DE 2224132 A DE2224132 A DE 2224132A DE 2224132 B1 DE2224132 B1 DE 2224132B1
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Description

Obige Reaktion verläuft quantitativ und ermöglicht dadurch eine absolut spezifische und genaue quantitative Bestimmung des Cholesterins.The above reaction is quantitative and thus enables an absolutely specific and precise one quantitative determination of cholesterol.

Cholesterinoxydase, das Ausgangsmaterial zu ihrer Gewinnung, ihre Reinigung und die Eigenschaften sind in den gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldungen P 22 24 133.4 und P 22 24 131.2 beschrieben.Cholesterol oxidase, the starting material for its production, its purification and its properties are in the simultaneously filed German patent applications P 22 24 133.4 and P 22 24 131.2.

Das Verfahren der Erfindung eignet sich zur Bestimmung von Cholesterin in wäßrigen Medien aller Art, wie Lebensmittelextrakten, KörperflüssigkeitenThe method of the invention is suitable for the determination of cholesterol in aqueous media of all Kind of like food extracts, body fluids

und insbesondere Serum. Auf Grund der großen Spezifität des Verfahrens wird nur freies Cholesterin bestimmt. Gebundenes Cholesterin, welches bekanntlich in veresterter Form vorliegt, läßt sich jedoch ebenfalls bestimmen durch vorherige chemische oder enzymatische Verseifung. Chemische Verseifung erfolgt beispielsweise mit alkoholischer Kalilauge, enzymatische Verseifung mit Esterase, vorzugsweise mit Cholesterinesterase aus Leber oder Pankreas.and especially serum. Due to the great specificity of the process, only free cholesterol is produced certainly. Bound cholesterol, which is known to be in esterified form, can, however also determined by prior chemical or enzymatic saponification. Chemical saponification takes place for example with alcoholic potassium hydroxide solution, enzymatic saponification with esterase, preferably with cholesterol esterase from liver or pancreas.

Die Messung des Sauerstoffverbrauchs, der H2O2-Bildung oder der Cholestenonbildung gemäß obiger allgemeiner Gleichung kann nach den hierfür bekannten und üblichen Methoden erfolgen.The measurement of the oxygen consumption, the H 2 O 2 formation or the cholestenone formation according to the above general equation can be carried out according to the methods known and customary for this purpose.

Geeignete Methoden zur Bestimmung des Sauerstoffverbrauches sind beispielsweise Gaschromatographie und Depolarisationsverfahren. Bevorzugt wird die polarometrische Bestimmung mittels Sauerstoffelektrode, da sich dieses Verfahren besonders zur automatisierten Durchführung der Cholesterinbestimmung eignet. Derartige Bestimmungsmethoden sind bekannt. Besonders geeignet erwiesen sich die in den deutschen Offenlegungsschriften 2 130 340 und 2 130 308 beschriebenen Methoden zur polarometrischen Messung des Sauerstoffverbrauchs in wäßrigen Medien.Suitable methods for determining the oxygen consumption are, for example, gas chromatography and depolarization processes. Polarometric determination using an oxygen electrode is preferred, as this method is particularly suitable for the automated implementation of the cholesterol determination suitable. Such methods of determination are known. The proved to be particularly suitable in the German Offenlegungsschriften 2 130 340 and 2 130 308 described methods for polarometric Measurement of oxygen consumption in aqueous media.

Gebildetes Wasserstoffperoxyd kann sowohl titrimetrisch als auch potentiometrisch, polarographisch und colorimetrisch sowie enzymatisch bestimmt werden. Bevorzugt werden die enzymatischen Methoden unter Verwendung von Katalase oder Peroxydase, da diese nicht nur äußerst spezifisch und zuverlässig sind, sondern auch mit der Hauptreaktion unter Bildung von Wasserstoffperoxyd auf einfachste Weise kombiniert werden können. Als besonders geeignet erwies sich insbesondere die Bestimmung mittels Katalase in Gegenwart von /?-Diketonen, z. B. Acetylaceton und Methanol bzw. Äthanol oder Methylenglycol, sowie die Bestimmung mittels Peroxydase in Gegenwart eines Chromogens. Bei der Bestimmung mittels Katalase, Acetylaceton und Methanol wird letzteres zu Formaldehyd oxydiert, der mit Acetylaceton eine Farbreaktion eingeht, die gemessen werden kann. Bei der Bestimmung mittels Peroxydase werden als Chromophor Verbindungen zugesetzt, die nach der Reaktion photometrisch bestimmt werden können. Ein Beispiel für ein geeignetes Chromophor ist 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure. Hydrogen peroxide formed can be titrimetrically as well as potentiometrically, polarographically and can be determined colorimetrically and enzymatically. The enzymatic methods are preferred using catalase or peroxidase, as these are not only extremely specific and are reliable, but also with the main reaction with the formation of hydrogen peroxide in the simplest way Way can be combined. The determination in particular proved to be particularly suitable by means of catalase in the presence of /? - diketones, e.g. B. acetylacetone and methanol or ethanol or Methylene glycol, as well as the determination by means of peroxidase in the presence of a chromogen. In the Determination by means of catalase, acetylacetone and methanol, the latter is oxidized to formaldehyde, which enters into a color reaction with acetylacetone that can be measured. When determining by means of Peroxidase are added as chromophore compounds, which are determined photometrically after the reaction can be. An example of a suitable chromophore is 2,2'-aminobenzothiazoline sulfonic acid.

Die Bestimmung des Cholestenons erfolgt mit Hilfe von Ketoreagenzien, vorzugsweise einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung umsetzenden Hydrazinderivat, wie z. B. 2,4-Dinitrophenylhydrazin.The determination of the cholestenone takes place with the help of keto reagents, preferably one with Keto groups with hydrazone reacting hydrazine derivative such. B. 2,4-Dinitrophenylhydrazine.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin, welches aus Cholesterinoxydase und einem System zur Bestimmung von H2Oo oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon besteht. In einer ersten bevorzugten Ausführungsform besteht dieses Reagenz aus Cholesterinoxydase, Katalase, Acetylaceton, Methanol und Puffer, einzeln oder gemischt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Reagenz aus Cholesterinoxydase, Peroxydase, Chromogen und Puffer, einzeln oder gemischt. Als Chromogen wird 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure bevorzugt.The invention also relates to a reagent for the determination of cholesterol, which consists of cholesterol oxidase and a system for the determination of H 2 Oo or a system for the determination of cholestenone. In a first preferred embodiment, this reagent consists of cholesterol oxidase, catalase, acetylacetone, methanol and buffer, individually or mixed. In a further preferred embodiment, the reagent consists of cholesterol oxidase, peroxidase, chromogen and buffer, individually or mixed. The preferred chromogen is 2,2'-aminobenzothiazoline sulfonic acid.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Reagenz aus Cholesterinoxydase und einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierenden Hydrazinderivat sowie gegebenenfalls einem Puffer. Als Hydrazinderivat wird 2,4-Dinitrophenylhydrazin bevorzugt. According to a further preferred embodiment, the reagent according to the invention consists of Cholesterol oxidase and a hydrazine derivative which reacts with keto groups to form hydrazone and, if necessary, a buffer. 2,4-Dinitrophenylhydrazine is preferred as the hydrazine derivative.

Die obenerwähnten bevorzugten Reagenzkombi-S nationen können außer den aufgeführten obligaten Bestandteilen zusätzlich übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren oder/und oberflächenaktive Substanzen enthalten. Alle diese Zusatzstoffe sind dem Fachmann bekannt und in Nachweissystemen für Wasserstoffperoxyd bzw. Cholestenon üblich.The above-mentioned preferred reagent combinations can besides the obligatory ones listed Components additionally common solvents, stabilizers and / or surface-active substances contain. All of these additives are known to the person skilled in the art and are used in detection systems for hydrogen peroxide or cholestenone common.

Vorzugsweise enthalten die obenerwähnten Reagenzkombinationen die essentiellen Bestandteile in folgenden Mengenverhältnissen:The above-mentioned reagent combinations preferably contain the essential components in the following proportions:

1. 2 bis 1OU Cholesterinoxydase, 0,05 bis 11 mg handelsübliche Katalase, 0,05 bis 0,2 ml Acetylaceton und 2 bis 10 ml Methanol in Puffer pH 5 bis 7.1. 2 to 10U cholesterol oxidase, 0.05 to 11 mg commercial catalase, 0.05 to 0.2 ml acetylacetone and 2 to 10 ml methanol in buffer pH 5 to 7.

2. 0,1 bis 1 U Cholesterinoxydase, 0,005 bis 0,1ml käufliche Peroxydase, 50 bis 200 mg% 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure sowie gegebenenfalls 0,005 bis 0,1 ml oberflächenaktives Mittel (vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan) in Puffer pH 6 bis 8.2. 0.1 to 1 U of cholesterol oxidase, 0.005 to 0.1 ml of commercial peroxidase, 50 to 200 mg% 2,2'-aminobenzothiazoline sulfonic acid and optionally 0.005 to 0.1 ml surface-active Medium (preferably hydroxypolyethoxydodecane) in buffer pH 6 to 8.

3. 0,1 bis 1 U Cholesterinoxydase, 1 bis 5 ml einer 1-mM-Lösung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin und gegebenenfalls 0,005 bis 0,1 ml oberflächenaktives Mittel.3. 0.1 to 1 U of cholesterol oxidase, 1 to 5 ml of a 1 mM solution of 2,4-dinitrophenylhydrazine and optionally 0.005 to 0.1 ml of surfactant.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.The following examples further illustrate the invention.

Beispiel 1example 1

Polarometrische Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs Polarometric determination of oxygen consumption

Es wird die in Fig. 1 der Zeichnung dargestellte Vorrichtung verwendet. Die Vorrichtung besteht aus einem Reaktionsgefäß 1 in Form einer zylindrischen Kammer aus transparentem Kunststoff mit einem Innendurchmesser von 143 mm und einer Innenhöhe von 220 mm. Die Kammer enthält 1,8 ml einer Lösung von 18 mM Kaliumiodid, 7,5 mM Ammoniumheptamolybdat, 800 mM Natriumchlorid und 2 U Cholesterinoxydase in 0,2 m Kaliumphosphatpuffer pH 6,0. In das Reaktionsgefäß ragt der Detektor 3, der aus einer sauerstoffsensitiven Elektrode besteht (WTW: OXI-ElektrodeE016). Der Detektor ist mit dem Analysator 4 verbunden (WTW: Digitalmeter DIGI610 mit Einschub OXI 610D). Am Boden des Reaktionsgefäßes 1 befindet sich ein Magnetrührer 5. Durch die Einfüllöffnung 6 werden 20 μΐ einer wäßrigen cholesterinhaltigen Lösung als Probe zugegeben. Während kräftigem Rühren mit dem Magnetrührer wird die Abnahme der Sauerstoffkonzentration der Lösung gemessen. Der nach 2,5 Minuten Reaktion beobachtete Sauerstoffverbrauch wird gegen die Cholesterinkonzentration aufgetragen. Das Meßergebnis für unterschiedliche Konzentrationen der cholesterinhaltigen Lösung ist in F i g. 2 der Zeichnung dargestellt. Es zeigt die lineare Abhängigkeit zwischen Meßsignal und Cholesterinkonzentration. The device shown in FIG. 1 of the drawing is used. The device consists of a reaction vessel 1 in the form of a cylindrical chamber made of transparent plastic with a Inside diameter of 143 mm and an inside height of 220 mm. The chamber contains 1.8 ml of a solution of 18 mM potassium iodide, 7.5 mM ammonium heptamolybdate, 800 mM sodium chloride and 2 U cholesterol oxidase in 0.2 M potassium phosphate buffer pH 6.0. The detector 3 protrudes into the reaction vessel, which consists of an oxygen-sensitive electrode (WTW: OXI electrodeE016). The detector is with connected to analyzer 4 (WTW: DIGI610 digital meter with OXI 610D insert). At the bottom of the Reaction vessel 1 is a magnetic stirrer 5. Through the filling opening 6 are 20 μΐ one aqueous cholesterol-containing solution added as a sample. While stirring vigorously with the magnetic stirrer the decrease in the oxygen concentration of the solution is measured. The one after 2.5 minutes Oxygen consumption observed in the reaction is plotted against the cholesterol concentration. The measurement result for different concentrations of the cholesterol-containing solution is shown in FIG. 2 shown in the drawing. It shows the linear relationship between the measurement signal and the cholesterol concentration.

Das Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung einer mittels alkoholischer KOH verseiften Serumprobe. Die Bestimmung ergab eine Konzentration von 193 mg Cholesterin pro 100 ml. Ein Vergleichswert nach Liebermann und Burchard ergab 182 mg pro 100 ml.The procedure was repeated using an alcoholic KOH saponified Serum sample. The determination gave a concentration of 193 mg cholesterol per 100 ml. A comparison value according to Liebermann and Burchard gave 182 mg per 100 ml.

5 65 6

Beispiel 2 teren 10Minuten wird die Extinktionsdifferenz ab-Example 2 for more than 10 minutes, the extinction difference is

r> *· τι η. gelesen.r> * τι η. had read.

Bestimmung von H2U2 In gleicher Weis6j jedocll ^161- Verwendung einerDetermination of H 2 U 2 In the same way6j j edocll ^ 161 - using a

10 g Ammoniumhydrogenphosphat werden in Cholesterinstandardlösung mit einem Gehalt von10 g of ammonium hydrogen phosphate are in cholesterol standard solution with a content of

100 ml Wasser gelöst und mit 85%iger Phosphor- 5 200 mg% wurde die in F i g. 4 dargestellte EichkurveDissolved 100 ml of water and with 85% phosphorus 5 200 mg% was the in F i g. 4 calibration curve shown

säure auf pH 7,0 eingestellt. Dann werden 11mg aufgestellt. Mit Hilfe dieser Eichkurve wird deracid adjusted to pH 7.0. Then 11mg are set up. With the help of this calibration curve, the

Katalase zugesetzt. Mit der so erhaltenen Lösung Cholesteringehalt der Serumprobe bestimmt. DieCatalase added. The cholesterol content of the serum sample is determined with the solution obtained in this way. the

wird eine Mischung von 0,2 ml Acetylaceton und Messung ergab einen Gehalt von 180 mg0/» Chole-a mixture of 0.2 ml of acetylacetone and measurement showed a content of 180 mg of 0 / »Chol-

10ml Methanol auf 100ml aufgefüllt. sterin. Eine Kontrollmessung nach Liebermann10ml methanol made up to 100ml. sterol. A control measurement according to Liebermann

7,5 ml der so erhaltenen Lösung werden mit io und Burchard ergab 185mg°/o.
0,5 ml Serum bzw. 0,5 ml einer Cholesterinstandardlösung mit einem Gehalt von 200mg% Cholesterin Beispiel 4
gemischt. Aliquots der serumhaltigen Probe sowie Bestimmung von Cholestenon
der cholestermstandardhaltigen Probe werden mit je7.5 ml of the solution thus obtained are with io and Burchard gave 185 mg%.
0.5 ml of serum or 0.5 ml of a cholesterol standard solution with a content of 200 mg% cholesterol Example 4
mixed. Aliquots of the serum-containing sample and determination of cholestenone
of the sample containing cholestermstandard are with each

5 U Cholesterinoxydase versetzt und 70 Minuten bei 15 0,2 ml Serum (1:10 mit Wasser verdünnt) werden5 U of cholesterol oxidase are added and 0.2 ml of serum (diluted 1:10 with water) are added for 70 minutes

37° C inkubiert. Dann wird der gebildete Farbstoff mit 0,05 ml 20%iger Hydroxypolyäthoxydodecan-Incubated at 37 ° C. Then the dye formed is treated with 0.05 ml of 20% hydroxypolyäthoxydodecan-

bei 405 nm photometrisch gemessen unter Berück- lösung und 0,15 U Cholesterinoxydase versetzt. NachMeasured photometrically at 405 nm with re-solution and 0.15 U of cholesterol oxidase added. To

sichtigung des Reagenzienleerwertes. Mit den Chole- 15 Minuten werden 2,0 ml einer Lösung, enthaltendViewing the reagent blank value. With the Chole 15 minutes, 2.0 ml of a solution containing

sterinstandardlösungen wird eine Eichkurve ange- 1 mM 2,4-Dinitrophenylhydrazin in 1 n-Salzsäuresterol standard solutions, a calibration curve is drawn - 1 mM 2,4-dinitrophenylhydrazine in 1N hydrochloric acid

fertigt, die in Fig. 3 der Zeichnung dargestellt ist. 20 zugesetzt. Nach weiteren 30Minuten werden 4,0 mlmanufactures, which is shown in Fig. 3 of the drawing. 20 added. After a further 30 minutes, 4.0 ml

In der Eichkurve ist die Cholesterinkonzentration Wasser zugegeben und das gebildete Hydrazon beiIn the calibration curve, the cholesterol concentration is added to water and the hydrazone formed is added

gegen die Extinktion bei 405 nm aufgetragen. 405 nm im Photometer gemessen. Die Auswertungplotted against the absorbance at 405 nm. 405 nm measured in the photometer. The evaluation

Der Cholesteringehalt der serumhaltigen Probe erfolgt an Hand einer Standardkurve unter Berückwird unter Benutzung eines Standards als Bezugs- sichtigung des Reagenzienleerwertes. Die Messung größe bestimmt. Kontrollbestimmungen nach Lie- 25 kann auch bei 546 nm nach Zusatz von Alkali erbermann—Burchard ergaben eine Abweichung folgen.The cholesterol content of the serum-containing sample is determined using a standard curve using a standard as a reference for the reagent blank. The measurement size determined. Control determinations according to Lie-25 can also be carried out at 546 nm after the addition of alkali erbermann-Burchard resulted in a deviation.

von etwa 5%. Die Messung in einer typischen Probe ergabof about 5%. The measurement in a typical sample showed

. · , ο 60mg% freies Cholesterin und 154mg°/o Gesamt-. ·, Ο 60mg% free cholesterol and 154mg% total

Beispiel 5 cholesterin (Verseifung mit alkoholischer KOH).Example 5 cholesterol (saponification with alcoholic KOH).

Bestimmung des H2O0 3° Die Vergleichsbestimmung nach Lieb er mann—Determination of the H 2 O 0 3 ° The comparison determination according to Liebemann—

" Burchard ergab 17Omg°/o Gesamtcholestenn."Burchard gave 170 mg% total cholesterol.

Zu 3 ml Kah'umphosphatpuffer pH 7 (O2 gesättigt), Zur Verseifung von verestertem Cholesterin (Mesder 100 mg°/o 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure sung von Gesamtcholesterin im Serum) werden 1 ml enthält, werden 0,05 ml einer 2O°/oigen Lösung von Serum, 1 ml 20%ige Hydroxypolyäthoxydodecan-Hydroxypolyäthoxydodecan und 0,02 ml käuflicher 35 lösung und 5 ml 0,5n-KOH in 9O°/oigem Äthanol Peroxydaselösung sowie 0,02 ml H2O2 (0,02 ml gemischt und 30 Minuten auf 70° C erhitzt. Dann 36%iges v:v H2O2 auf 100 ml Wasser) zur Ent- wird die Lösung abkühlen gelassen, mit 10 ml fernung reduzierender Substanzen gegeben. Die 0,1-M-Magnesiumsulfatlösung gemischt und abMischung wurde im Photometer bei 405 bzw. 436nm zentrifugiert. Der Überstand (13 ml) enthält das geverfolgt. Sobald die Reaktion zum Stillstand ge- 4° samte Cholesterin in freier Form,
kommen ist, wird mit 0,01 ml Serum (1:15 mit Die Verseifung von verestertem Cholesterin mit Wasser verdünnt) gestartet. Nach 10 Minuten wer- Leberesterase erfolgt durch 30minutige Inkubation den 0,15 U Cholesterinoxydase zugesetzt. Nach wei- des Serums bei 37° C und pH 6 bis 8.To 3 ml of potassium phosphate buffer pH 7 (O 2 saturated), 1 ml are added for saponification of esterified cholesterol (Mesder 100 mg% 2,2'-aminobenzothiazolinesulfonic acid solution of total cholesterol in the serum), 0.05 ml of a 2O % Solution of serum, 1 ml of 20% hydroxypolyäthoxydodecan-Hydroxypolyäthoxydodecan and 0.02 ml of commercial 35 solution and 5 ml of 0.5N-KOH in 90% ethanol peroxidase solution and 0.02 ml of H 2 O 2 (0, 02 ml mixed and heated for 30 minutes to 70 ° C. Then 36% v: v H 2 O 2 to 100 ml water) for removal, the solution is allowed to cool down and 10 ml of distance-reducing substances are added. The 0.1 M magnesium sulfate solution was mixed and the mixture was centrifuged in the photometer at 405 and 436 nm, respectively. The supernatant (13 ml) contains the tracked. As soon as the reaction comes to a standstill, all cholesterol is in free form,
is started with 0.01 ml of serum (1:15 with The saponification of esterified cholesterol diluted with water). After 10 minutes, liver esterase is added to the 0.15 U cholesterol oxidase by incubation for 30 minutes. After white serum at 37 ° C and pH 6 to 8.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings

Claims (14)

Patentansprüche:Patent claims: 1. Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin, dadurch gekennzeichnet, daß Cholesterin in wäßrigem Medium mit Cholesterinoxydase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes H2O2 bzw. Cholestenon bestimmt wird.1. A method for the determination of cholesterol, characterized in that cholesterol is incubated in an aqueous medium with cholesterol oxidase and either the oxygen consumption or the H 2 O 2 or cholestenone formed is determined. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Sauerstoffverbrauch polarometrisch gemessen wird,2. The method according to claim 1, characterized in that the oxygen consumption is polarometric is measured 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß gebildetes H2O2 enzymatisch mit Katalase oder Peroxydase bestimmt wird.3. The method according to claim 1, characterized in that H 2 O 2 formed is determined enzymatically with catalase or peroxidase. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß gebildetes Cholestenon mit einem Ketoreagenz, wie 2,4-Dinitrophenylhydrazin, gemessen wird.4. The method according to claim 1, characterized in that formed cholestenone with a keto reagent such as 2,4-dinitrophenylhydrazine. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man in getrennten Ansätzen aus je einer Probe ohne und mit Verseifung mittels äthanolischer Kalilauge freies und gesamtes Cholesterin getrennt bestimmt.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that one in separate Batches from one sample each with and without saponification using ethanolic potassium hydroxide solution and total cholesterol determined separately. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Ansatz zunächst freies Cholesterin bestimmt, dann Cholesterinesterase zusetzt und anschließend das gebundene Cholesterin bestimmt.6. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that one in one Approach first determined free cholesterol, then added cholesterol esterase and then determines the bound cholesterol. 7. Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Cholesterinoxydase und einem System zur Bestimmung von H2O2 oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon besteht.7. reagent for the determination of cholesterol, characterized in that it consists of cholesterol oxidase and a system for the determination of H 2 O 2 or a system for the determination of cholestenone. 8. Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin enthält.8. Reagent according to claim 7, characterized in that there is also an agent for Contains saponification of esterified cholesterol. 9. Reagenz nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Bestimmung von H2O2 aus Katalase, Acetylaceton, Methanol und Puffer besteht.9. Reagent according to claim 7 or 8, characterized in that the system for the determination of H 2 O 2 consists of catalase, acetylacetone, methanol and buffer. 10. Reagenz nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Bestimmung von H0O., aus Peroxydase, Chromogen und Puffer besteht.10. Reagent according to claim 7 or 8, characterized in that the system for the determination of H 0 O., consists of peroxidase, chromogen and buffer. 11. Reagenz nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Bestimmung von Cholestenon aus einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierenden Derivat, insbesondere 2,4-Dinitrophenylhydrazin, besteht.11. Reagent according to claim 7 or 8, characterized characterized in that the system for the determination of cholestenone from one with keto groups derivative which reacts to form hydrazone, in particular 2,4-dinitrophenylhydrazine. 12. Reagenz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es 2 bis 10 U Cholesterinoxydase, 0,05 bis 11 mg Katalase, 0,05 bis 0,2 ml Acetylaceton, 2 bis 10 ml Methanol oder ein Vielfaches davon und Puffer pH 5 bis 7 enthält.12. Reagent according to claim 9, characterized in that it contains 2 to 10 U of cholesterol oxidase, 0.05 to 11 mg of catalase, 0.05 to 0.2 ml of acetylacetone, 2 to 10 ml of methanol or a Contains multiples thereof and buffer pH 5 to 7. 13. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,1 bis 1 U Cholesterinoxydase, 0,005 bis 0,1 ml Peroxydase, 50 bis 200 mg'/o 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure und gegebenenfalls 0,005 bis 0,1 ml eines oberflächenaktiven Mittels oder ein Vielfaches davon und Puffer pH 6 bis 8 enthält.13. Reagent according to claim 10, characterized in that that there is 0.1 to 1 U of cholesterol oxidase, 0.005 to 0.1 ml of peroxidase, 50 to 200 mg / o 2,2'-aminobenzothiazoline sulfonic acid and optionally 0.005 to 0.1 ml or a multiple thereof of a surfactant and pH 6-8 buffer. 14. Reagenz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,1 bis 1 U Cholesterinoxydase, 1 bis 5 ml einer 1-mM-Lösung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin und gegebenenfalls 0,005 bis 0,1 ml eines oberflächenaktiven Mittels enthält.14. Reagent according to claim 11, characterized in that it contains 0.1 to 1 U of cholesterol oxidase, 1 to 5 ml of a 1 mM solution of 2,4-dinitrophenylhydrazine and optionally Contains 0.005 to 0.1 ml of a surfactant. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von freiem und verestertem Cholesterin und ein Reagenz zur Durchführung dieses Verfahrens.The invention relates to a method for enzymatic Determination of free and esterified cholesterol and a reagent for carrying out this Procedure. Die Bestimmung von Cholesterin hat für die medizinische Diagnostik eine erhebliche Bedeutung. Ein erhöhter Cholesterinspiegel im Blut ist ein wesentlicher Risikofaktor der Arteriosklerose. Bei hohen Cholesterinwerten, also Hypercholesterinämie, kommen Koronarinsuffizienz und Herzinfarkt häufiger vor als bei niedrigen Cholesterinwerten. Hypercholesterinämie begünstigt das Auftreten von Arteriosklerose und Koronarerkrankungen und muß daher frühzeitig erkannt werden, damit die Behandlung rechtzeitig beginnen kann. Erhöhte Cholesterinwerte finden sich häufig auch bei Diabetes mellitus, nephrotischem Syndrom, Hypothyreose und Leberkrankheiten, wie der biliären Cirrhose. Eine rasche und zuverlässig durchführbare Methode zur Be-Stimmung von Cholesterin hat daher große Bedeutung.The determination of cholesterol is of considerable importance for medical diagnostics. A High blood cholesterol is a major risk factor for arteriosclerosis. At high Cholesterol levels, i.e. hypercholesterolemia, coronary insufficiency and heart attacks are more common before than with low cholesterol. Hypercholesterolemia promotes the occurrence of arteriosclerosis and coronary disease and must therefore be detected early to allow treatment can start on time. Increased cholesterol levels are also often found in diabetes mellitus, nephrotic syndrome, hypothyroidism and liver diseases such as biliary cirrhosis. A quick one and reliably feasible method for determining cholesterol is therefore of great importance. Die bekannten und brauchbaren Methoden zurThe known and useful methods for Cholesterinbestimmung basieren auf der Reaktion nach Liebermann und Burchard. Freies und verestertes Cholesterin bilden danach mit Essigsäureanhydrid und konzentrierter Schwefelsäure blaugrüngefärbte Verbindungen, deren Farbintensität der Cholesterinkonzentration proportional ist und spektrometrisch gemessen wird.Cholesterol determinations are based on the Liebermann and Burchard reaction. Free and Esterified cholesterol then forms blue-green colored with acetic anhydride and concentrated sulfuric acid Compounds whose color intensity is proportional to the concentration of cholesterol and spectrometrically is measured. Dieses bekannte Verfahren weist jedoch wesentliehe Nachteile auf. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens liegt in seiner Unspezifität. Die Liebermann-Burchard-Reaktion stellt eine relativ unspezifische Steroidreaktion dar, die außer von Cholesterin auch von anderen Steroiden eingegangen wird. Da beispielsweise im Plasma noch 1 bis 3 °/o Dihydrocholesterol und 0,5 bis 1,4% ^7-Cholestenol neben anderen Steroiden vorhanden sind, ergibt sich ein unerwünscht großer Fehler. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß mit aggressiven und ätzenden Reagenzien gearbeitet werden muß.However, this known method has significant disadvantages. The main disadvantage of this method is its non-specificity. The Liebermann-Burchard reaction is a relatively unspecific steroid reaction that is entered into by other steroids in addition to cholesterol. Since, for example, 1 to 3% dihydrocholesterol and 0.5 to 1.4% ^ 7- cholesterol are still present in the plasma, along with other steroids, there is an undesirably large error. Another disadvantage is that aggressive and caustic reagents have to be used. Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Verfahrens und eines Reagenzes zur Bestimmung von Cholesterin, welches die obenerwähnten Nachteile nicht aufweist und insbesondere absolut spezifisch für Cholesterin ist und keine aggressiven Reagenzien erfordert.The object of the invention is therefore to create a new method and a reagent for Determination of cholesterol which does not have the disadvantages mentioned above and in particular is absolutely specific for cholesterol and does not require harsh reagents. Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin, welches darin besteht, daß Cholesterin in wäßrigem Medium mit Cholesterinoxydase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes H2O2 bzw. Cholestenon bestimmt wird.This object is achieved according to the invention by a method for determining cholesterol, which consists in incubating cholesterol in an aqueous medium with cholesterol oxidase and determining either the oxygen consumption or the H 2 O 2 or cholestenone formed. Cholesterinoxydase ist ein neues Enzym, welches nachstehende Reaktion katalysiert:Cholesterol oxidase is a new enzyme that catalyzes the following reaction: CholesterinoxydaseCholesterol oxidase Cholesterin + O2 > Cholestenon + H2O2 Cholesterol + O 2 > cholestenone + H 2 O 2
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