DE19951154A1 - Finely time resolved sample luminescence measurement apparatus modulates both excitation wave and photonic mixing device used as detector - Google Patents
Finely time resolved sample luminescence measurement apparatus modulates both excitation wave and photonic mixing device used as detectorInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung bezeichnet ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Probeneigenschaften über zeitaufgelöste Lumineszenz (Phosphoreszenz, Fluoreszenz), insbesondere im Bereich der biologi schen und physiko-chemischen Fluoreszenzanalytik und Fluoreszenzkor relationsspektroskopie (FCS).The invention relates to a method and an apparatus for Determination of sample properties via time-resolved luminescence (Phosphorescence, fluorescence), especially in the field of biological and physico-chemical fluorescence analysis and fluorescence correction relation spectroscopy (FCS).
Ein Großteil chemischer, biochemischer und biologischen Verbindungen aber auch lebende Systeme emittieren Licht infolge von Bestrahlung. Lumineszenzemission dieser Art beinhaltet Phosphoreszenz und Fluoreszenz. Die Photonenemission fällt exponential nach einer Anregung mit einer charakteristischen Zeit ab. Der Abfall auf 1/e bezogen auf das Maximum nennt man Fluoreszenzlebensdauer und im Falle der Phosphoreszenz heißt sie Phosphoreszenzlebensdauer. Im nachhinein soll anhand der Fluoreszenz der Hintergrund der Erfindung und der Stand dargestellt werden. Diese bezieht sich dabei analog auf die Phosphoreszenz.The majority of chemical, biochemical and biological compounds but living systems also emit light as a result of radiation. Luminescence emission of this type includes phosphorescence and Fluorescence. The photon emission drops exponentially after one Excitation with a characteristic time. The drop to 1 / e referred to the maximum is called fluorescence lifetime and im In the case of phosphorescence, it is called the phosphorescence lifetime. in the the background of the invention is said to be based on the fluorescence and the status are shown. This applies analogously on the phosphorescence.
Die Fluoreszenz hängt stark von der unmittelbaren Umgebung des Fluorophores (dem fluoreszierenden Farbstoff) ab. Änderungen dieser, z. B. infolge einer Reaktion, bewirkt nicht nur eine Intensitätsände rung des Fluoreszenz sondern auch eine Veränderung der Fluoreszenz lebensdauer. Des weiteren ist bei vielen Experimenten die genaue Konzentration der Fluorophore im Beobachtungsvolumen nicht bekannt. So daß aus der bloßen Intensitätsänderung nicht zwischen einer qualitativen oder einer quantitativen Veränderung unterschieden werden kann, ob z. B. die Reaktion stattgefunden hat oder der Fluoreszenzfarbstoff sich zersetzt hat. In der Fluoreszenzanalytik verzichtet man zweckmäßigerweise auf ratiometrische Verfahren und mißt die Fluoreszenzlebensdauer.The fluorescence strongly depends on the immediate environment of the Fluorophores (the fluorescent dye). Changes this, e.g. B. due to a reaction, not only causes an intensity change fluorescence but also a change in fluorescence lifespan. Furthermore, many experiments are accurate Concentration of fluorophores in the observation volume not known. So that from the mere change in intensity not between one distinguished qualitative or quantitative change can be whether z. B. the reaction has taken place or the Fluorescent dye has decomposed. In fluorescence analysis expediently dispense with ratiometric methods and measures the fluorescence lifetime.
Derartige Verfahren und Vorrichtungen sind aus der IPC (Internatio nale Patentklassifikation) unter G01N und C09K vorbekannt. Eine fluoreszierende Probe wird von einer modulierten Lichtquelle (gepulst oder sinusförmig) oder im Falle der FCS mit gleichmäßiger Intensität geeigneter Frequenz angeregt und die erzeugte Lumineszenzemission registriert. Vorher kann die Emission spektral aufgetrennt oder in einem Intensifier, Multichannelplate (MCP)ect. verstärkt oder moduliert worden sein.Such methods and devices are from the IPC (Internatio nale patent classification) under G01N and C09K. A fluorescent sample is from a modulated light source (pulsed or sinusoidal) or, in the case of FCS, with more uniform Intensity of suitable frequency and the generated Luminescence emission registered. Before that, the emission can be spectral separated or in an intensifier, multichannel plate (MCP) ect. amplified or modulated.
Die Verfahren unterteilen sich grob in time-domain oder frequency domain Methoden. Bei den time-domain Methoden wie der zeitkorrelier ten Einzelphotonzählung (TCSPC) finden ultrakurze Lichtimpulse Verwendung. Durch die endliche Länge des Anregungsimpulses und die Trägheit der Detektion tritt die Fluoreszenzemission gefaltet in Erscheinung und bedarf der computerunterstützen Entfaltung, um die Fluoreszenzlebensdauer exakt zu bestimmen. Bei den frequencydomain Methoden wird die Probe mit intensitätsmodulierten Licht angeregt. Das Fluoreszenzlicht hat dieselbe Frequenz, ist aber demoduliert. Die Modulationstiefe verringert sich und die Phase verschiebt sich aufgrund der endlichen Lebensdauer der Fluoreszenz. Man kann das Anregungslicht auch multifrequent modulieren. Zur Analyse und die Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer aus diesen Phasen- bzw. Modul ationstiefenshift wird auf LAKOWICZ: "Prinziples of Fluorescence Spectroskopy", Plenum Press, New York, verwiesen. Vorteil dieser Phasenfluorometrie ist, daß keine ultrakurzen Lichtimpulse gebraucht werden und keine aufwendige Entfaltung berechnet werden muß. Aller dings muß man in der Lage sein, daß Anregungslicht zwischen 10 und 1000 MHz und mehr zu modulieren. Die meisten kommerziellen Geräte arbeiten auf dem Prinzip der Kreuzkorrelation wozu auf SPENCER, WEBER: äMeasurement of Sub-nanosecond Fluorescence Lifetime with Cross-Correlation Phase Fluorometer" Ann. New York Acad. Sci. (1969), p. 361 verwiesen wird. Nachteilig sind die dazu erforderli chen aufwendigen und kostenintensiven Detektoren, bestehend aus ultraschnellen Schaltungen und Photodioden. Die Fluorescence Corre lations Spectroscopy (FCS)als Methode und in Anwendungen wird verwiesen auf RIEGLER R. "Fluorescence correlations, single molecule detection and large number screening. Applications in biotechnology." J Biotechnol. 1995 Jul 31; 41(2-3): 177-86.The procedures are roughly divided into time-domain or frequency domain methods. With time-domain methods such as time correlation Single photon counting (TCSPC) finds ultrashort light pulses Use. By the finite length of the excitation pulse and the Inertia of detection occurs when the fluorescence emission folds in Appearance and requires computer-assisted unfolding in order to To determine fluorescence lifetime exactly. With the frequency domain Methods, the sample is excited with intensity-modulated light. The fluorescent light has the same frequency but is demodulated. The depth of modulation decreases and the phase shifts due to the finite lifetime of fluorescence. You can do that Also modulate excitation light multifrequently. For analysis and the Determination of the fluorescence lifetime from this phase or module ationstiefenshift on LAKOWICZ: "Principles of Fluorescence Spectoskopy ", Plenum Press, New York. Advantage of this Phase fluorometry is that no ultrashort light pulses are needed be and no complex development has to be calculated. Everything However, one must be able to have excitation light between 10 and Modulate 1000 MHz and more. Most commercial devices work on the principle of cross correlation, why on SPENCER, WEBER: ÄMeasurement of Sub-nanosecond Fluorescence Lifetime with Cross-Correlation Phase Fluorometer "Ann. New York Acad. Sci. (1969), p. 361 is referred. The disadvantage is that they are necessary Chen complex and costly detectors, consisting of ultra-fast circuits and photodiodes. The Fluorescence Corre lations Spectroscopy (FCS) as a method and in applications refer to RIEGLER R. "Fluorescence correlations, single molecule detection and large number screening. Applications in biotechnology. "J Biotechnol. 1995 Jul 31; 41 (2-3): 177-86.
Die Technik vereinfacht sich, wenn man die Phosphoreszenz nutzt, da hier das Anregungslicht mitunter nur noch im kHz-Bereich moduliert werden muß. In letzter Zeit gibt es Arbeiten, die Phosphoreszenz und Fluoreszenzemission miteinander mischen, um die empfindlichere Fluoreszenzlebensdaueränderung über die Phosphoreszenz mit einer weniger aufwendigen und damit kostengünstigeren Technologie zu bestimmen. Eine derartige Methode unter Anwendung der Phasenmodula tionstechnik mit Frequenzen im kHz-Bereich wird in der Druckschrift WO 9906821 beschrieben, wodurch die sonst aufwendige Messung von Abklingzeiten im unteren Nanosekundenbereich, welche instrumentell sehr aufwendig und damit kostenintensiv ist, entfällt. Nachteilig ist, daß mit Hilfe von Phasenmodulationstechniken bei Frequenzen im kHz-Bereich bei dieser Art von Sensoren immer nur eine mittlere Phasenverschiebung ermittelt werden kann. Ein Aufsplitten in beide Abklingzeitkomponenten ist zwar prinzipiell möglich, durch die benötigten hohen Frequenzen aber messtechnisch aufwendig.The technique is simplified if you use phosphorescence, because here the excitation light is sometimes only modulated in the kHz range must become. Recently there have been works that do phosphorescence and Mix fluorescent emission together to make the more sensitive Fluorescence lifetime change over the phosphorescence with a less expensive and therefore less expensive technology determine. Such a method using the phase modules tion technology with frequencies in the kHz range is described in the publication WO 9906821 described, whereby the otherwise complex measurement of Cooldowns in the lower nanosecond range, which are instrumental is very complex and therefore costly. Disadvantageous is that with the help of phase modulation techniques at frequencies in kHz range with this type of sensors always only a medium one Phase shift can be determined. A split into both Cooldown components are possible in principle through which high frequencies required but technically complex.
um zweidimensionale Fluoreszenzlebensdauerverteilungen (fluorescence lifetime imageing) zu messen, werden bisher Lösungen auf CCD-Kamera Basis beschrieben. (T. French et al "Fluorescence lifetime imaging techniques for microscopy" Methods in Cell Biology Vol 56 1998, 277-309) Die Auslesezeit einer CCD ist langsam (zeilenweises Ausle sen der am Pixel generierten Ladungen zu einem Verstärker) und daher gibt es FLI-Lösungen vor allem z. B. für die sehr langlebige Phosphoreszenz. Das CCD-Pixel kann keine Phase direkt messen, sondern nur die Amplitude und damit die Veränderung der Modulations tiefe. Dazu wird der Auslesetakt einer ganzen Zeile mit der Modula tion der Anregung gekoppelt. Man erhält sozusagen, zwei Bilder eines vom Maximum und eines vom Minimum. Aus der Veränderung des Kontras tes kann man im Nachhinein die Lumineszenzlebensdauer berechnen. Die Phasenverschiebung kann nur bestimmt werden, wenn die Fluoreszenzmo dulation über abschnittseises Messen der Intensität (Amplitude) verfolgt wird. Das kann mit einer zusätzlichen Frequenzmodulation - in der Regel moduliert man den Bildverstärker - erreicht werden. Damit ist die CCD sehr langsam und keine Echtzeitmessung der Korre lation. Nachteilig ist auch, daß die Intensitätsmessung immer nur sehr kurz erfolgt, was ein schlechtes Signal/Rauschverhältnis bewirkt und eine aufwendige und teure Bildverstärkung benötigt oder entsprechend intensive Lumineszenzereignisse nur detektierbar sind.around two-dimensional fluorescence lifetime distributions (fluorescence lifetime imageing), solutions have so far been used on CCD cameras Basis described. (T. French et al "Fluorescence lifetime imaging techniques for microscopy "Methods in Cell Biology Vol 56 1998, 277-309) The readout time of a CCD is slow (line by line readout the charges generated at the pixel to an amplifier) and therefore there are FLI solutions especially for B. for the very durable Phosphorescence. The CCD pixel cannot measure a phase directly, but only the amplitude and thus the change in modulation depth. This is done by reading out an entire line with the modula tion of the suggestion coupled. You get, so to speak, two pictures of one of the maximum and one of the minimum. From the change in the contrast The luminescence lifetime can be calculated afterwards. The Phase shift can only be determined if the fluorescence mo dulation over section ice measuring the intensity (amplitude) is being followed. This can be done with additional frequency modulation - usually one modulates the image intensifier - can be achieved. The CCD is therefore very slow and no real-time measurement of the corrections lation. Another disadvantage is that the intensity measurement only ever is very short, which is a poor signal / noise ratio causes and requires a complex and expensive image intensification or correspondingly intense luminescence events can only be detected.
Die fehlende Eignung der CCD-Arrays zur Bestimmung einer Korrelationsfunktion mit einem Modulationssignal in Echtzeit ist durch die prinzipiell damit verbundene wesentliche Frequenzbeschrän kung bei der Verwendung von CCD-Arrays für die FLI nachteilig. Die technisch mögliche Frequenzbandbreite des CCD-Arrays, welche ansons ten nutzbar ist, kann daher zur zeitaufgelösten Lumineszenz nicht ausgeschöpft werden.The unsuitability of the CCD arrays for determining a Correlation function with a modulation signal in real time due to the fundamental frequency limits associated with it disadvantage when using CCD arrays for the FLI. The technically possible frequency bandwidth of the CCD array, which otherwise ten can therefore be used for time-resolved luminescence be exhausted.
Weiterhin ist aus der Druckschrift WO 9810255 ein komplexes photoni sches Mischelement (PMD) vorbekannt, welches durch eine von Außen modulierte Ladungsschaukel in der Lage ist, Amplitude und Phase einer elektromagnetischen Welle zu ermitteln, um damit in einfacher und kostengünstiger Weise einen 3d-Scann durchführen zu können. Das Photoelement am PMD ist zweigeteilt, beide Teile werden über die Ladungsschaukel direkt korreliert mit der elektrisch am PMD angeleg ten Modulation der elektromagnetischen Welle.Furthermore, the document WO 9810255 is a complex photoni previously known mixing element (PMD), which by an external modulated charge swing is capable of amplitude and phase to determine an electromagnetic wave to make it easier and to be able to carry out a 3d scan in a cost-effective manner. The Photo element on the PMD is divided into two, both parts are over the Charge swing correlates directly with that electrically applied to the PMD modulation of the electromagnetic wave.
Beim PMD handelt sich um ein elektrooptisches Mischelement. Der PMD ist ein in Standard CMOS Technologie hochintegrierbare OE-ASIC, welcher zusätzlich zur Detektion auch die Mischung eines einfallen den Lichtsignals mit einer elektronischen Referenz on-chip ermög licht und ist damit physikalisch und technologisch nicht mit der CCD-Technik verwandt. Das Pixel stellt zugleich einen breidbandigen Schalter, einen Multiplizierer und OE-Mikromischer dar. Die Applika tionen der PMD reichen von ein- und mehrdimensionalen Phasen- und Laufzeitmessung übertragener oder reflektierter elektromagnetischer Wellen zum optischen 3d-Scann bis hin zur Anwendung in optischen Kommunikationssystemen.The PMD is an electro-optical mixing element. The PMD is an OE-ASIC that is highly integrable in standard CMOS technology, which, in addition to detection, also comes up with a mixture of one enables the light signal with an electronic reference on-chip light and is therefore physically and technologically not with the CCD technology used. The pixel also represents a wide band Switch, a multiplier and OE micromixer. The applications PMD functions range from one- and multi-dimensional phase and Transit time measurement of transmitted or reflected electromagnetic Waves for optical 3D scanning up to the application in optical Communication systems.
Beim PMD liegen über einer Siliziumschicht zwei Modulationsgates, welche elektrisch leitend und für das einfallende Licht transparent sind. Die beiden Gates werden im Gegentakt angesteuert. Durch diese Gatespannungsmodulation ändert sich der Potentialverlauf synchron. Neben den Gates ist jeweils eine Photodiode plaziert (auch Avelange Dioden). Diese Dioden saugen abhängig von der Lichtintensität die Ladungsträger, welche auf der Potentialschaukel nach links oder rechts laufen, ab. Somit hängt deren Bewegungsrichtung von der Polung der modulierenden Spannung an den Gates ab. Die Ladungsträger werden beidseitig in Speicherelementen aufsummiert und stehen als Meßsignale zur Verfügung. Das Differenzausgangsignal an einem PMD-Pixel, stellt die Korrelationsfunktion des modulierten Lichtes mit dem angelegten Gegentakt Gatespannung dar. D. h., nur im Falle eines zeitlichen Zusammenhangs zwischen der Pixel- und der Lichtmo dulation fließen im Mittel unterschiedliche Ströme aus den beiden Pixelausgängen. Das Summensignal ist proportional zur Amplitude der in das Pixel eingestrahlten Lichtleistung. Somit ist aus den Meßwer ten des PMD der Meßwert einer herkömmlichen CMOS Kamera nachbildbar.The PMD has two modulation gates over a silicon layer, which are electrically conductive and transparent to the incident light are. The two gates are driven in push-pull. Through this Gate voltage modulation changes the potential curve synchronously. A photodiode is placed next to the gates (also Avelange Diodes). These diodes suck depending on the light intensity Charge carriers which are on the potential swing to the left or run to the right. So their direction of movement depends on the Polarity of the modulating voltage on the gates. The load carriers are added up on both sides in storage elements and stand as Measurement signals available. The differential output signal on one PMD pixel, represents the correlation function of the modulated light with the applied push-pull represents gate voltage. That is, only in the case a temporal relationship between the pixel and the light mo On average, different currents flow from the two Pixel outputs. The sum signal is proportional to the amplitude of the light output radiated into the pixel. Thus from the measurement The measured value of a conventional CMOS camera can be simulated on the PMD.
Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Ermittlung beider Parameter der Lumineszenz (Intensität und Lebensdauer) in Echtzeit, vorteil haft bis hinein in den unteren Nanosekundenbereich der Fluoreszenz, auf einfache und kostengünstige Weise.The object of the invention is to determine both parameters the luminescence (intensity and lifespan) in real time, advantage adheres to the lower nanosecond range of fluorescence, in a simple and inexpensive way.
Die Aufgabe wird durch die unabhängigen Patentansprüche gelöst.The task is solved by the independent claims.
Das Wesen der Erfindung besteht im Einsatz eines PMD anstelle der auf dem Gebiet der Lumineszenzspektroskopie üblicherweise verwende ten Photodioden, insbesondere bei den Anwendungen der Phasenfluoro metrie bzw. Phosphorometrie, der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC) bzw. Fluoreszenzkorrelationsspektro skopie (FCS). Dadurch wird die Applikation von PMD auf die Messung von emittierten elektromagnetischen Wellen erweitert und erlaubt damit, ganz neue Meßprinzipien zu verwirklichen, wie die zweidimen sionale FCS in Verbindung mit PMD-Arrays.The essence of the invention is to use a PMD instead of commonly used in the field of luminescence spectroscopy th photodiodes, especially in the applications of phase fluoro metry or phosphorometry, the time-correlated Single photon counting (TCSPC) or fluorescence correlation spectro scopie (FCS). This will apply PMD to the measurement of emitted electromagnetic waves expanded and allowed with the realization of completely new measuring principles like the two dimes sional FCS in connection with PMD arrays.
Die Vorteile des PMD liegen in der inhärenten Mischeigenschaft des Bauelementes, was die ansonsten diskret aufgebaute Empfangskette verkürzt und damit Fehlereinflüsse, Drift- und Temperatureffekte deutlich verringert. Außerdem stellt der PMD das Meßsignal direkt zur Verfügung wodurch ein einfacher und kostengünstiger Detektor für Lumineszenzspektroskopie bis in den unteren Nanosekundenbereich realisiert werden kann. Die über das PMD erfolgende Amplituden- und Phasenmessung elektromagnetischer Wellen in Echtzeit ermöglicht dadurch eine Messung der Fluoreszenzlebensdaueränderung.The advantages of the PMD are the inherent mixing properties of the Component what the otherwise discretely constructed reception chain shortens and thus influences of errors, drift and temperature effects significantly reduced. The PMD also provides the measurement signal directly available making a simple and inexpensive detector for Luminescence spectroscopy down to the lower nanosecond range can be realized. The amplitude and Phase measurement of electromagnetic waves in real time thereby measuring the change in fluorescence lifetime.
Die Modulation der anregenden elektromagnetischen Welle, welche vorteilhaft mit der Modulation der anregenden Strahlenquelle (z. B. Laser, Laserdiode) identisch ist, wird elektrisch am PMD angelegt. Der PMD wird ausgelesen und das Verhältnis der beiden pro PMD-Pixel anfallenden Ladungen (Q1 und Q2) rechnerisch ausgewertet wodurch sich eine Korrelation (Q2 zu Q1) zwischen elektrischer und optischer Modulation ergibt. Die Gesamtladungszahl (Q1 + Q2 ∼ Is) entspricht der einfallenden Photonenzahl und wird als Intensitätssignal Is ausgewer tet. Das Signal (Q2 zu Q1) entspricht einer Phasenû bzw. Zeitverzö gerung des Fluoreszenzlichtes. Bewegt sich ein Fluorophor durch ein Beobachtungsvolumen (Diffusion) oder umgedreht wird das Beobach tungsvolumen über ein vermutliches Fluorphor bewegt, kann auch die dafür benötigte Zeit bzw. die effektive Beobachtungszeit (Diffusi onszeit) über eine zweckmäßige Zeittaktung am PMD bestimmt werden. Somit wird angezeigt, ob einzelne Fluoreszenzereignisse miteinander korreliert sind und ermöglicht somit eine FCS. Die Auslesefrequenz der Signale (Q1 und Q2) am PMD ûPixel wird vorteilhaft als eigenständiger Parameter an das Meßproblem angepaßt.The modulation of the exciting electromagnetic wave, which is advantageously identical to the modulation of the exciting radiation source (e.g. laser, laser diode), is applied electrically to the PMD. The PMD is read out and the ratio of the two charges (Q1 and Q2) accruing per PMD pixel is evaluated mathematically, resulting in a correlation (Q2 to Q1) between electrical and optical modulation. The total charge number (Q1 + Q2 ∼ I s ) corresponds to the incident number of photons and is evaluated as an intensity signal I s . The signal (Q2 to Q1) corresponds to a phase or time delay of the fluorescent light. If a fluorophore moves through an observation volume (diffusion) or is reversed, the observation volume is moved over a presumed fluorophore, the time required for this or the effective observation time (diffusion time) can also be determined using an appropriate timing on the PMD. This indicates whether individual fluorescence events are correlated with one another and thus enables FCS. The readout frequency of the signals (Q1 and Q2) on the PMD ûPixel is advantageously adapted to the measurement problem as an independent parameter.
Diese PMD-Lumineszenzspektroskopie ist in Weiterbildungen sehr gut geeignet, zweidimensionale Fluoreszenzlebensdauerverteilungen (fluorescence lifetime imageing) zu messen, wofür es bisher nur einige Lösungen auf CCD-Kamera Basis gibt. Sie arbeiten phasenflu orimetrisch. Preiswerte Lösungen gibt es vor allem für die langle bige Phosphoreszenz.This PMD luminescence spectroscopy is very good in further training suitable, two-dimensional fluorescence lifetime distributions (fluorescence lifetime imageing) to measure what it was only used for some solutions based on CCD cameras. You work in phase flow orimetric. There are inexpensive solutions especially for the langle beige phosphorescence.
Die Gerätelösungen sollen Anwendung finden in der molekularen Analy tik von Biomolekülwechselwirkung, (z. B. Fluoreszenz Immuno-Assays), Biochipauswertung, aber auch für Sensoren wie Optoden, Sensoren mit umgebungsabhängige Farbstoffe oder Sensoren die mit Farbstoffen und mit Quenchern arbeiten.The device solutions are to be used in molecular analysis tics of biomolecule interaction, (e.g. fluorescence immunoassays), Biochip evaluation, but also for sensors such as optodes, sensors with environment-dependent dyes or sensors with dyes and work with quenchers.
Vorteilhafte Ausführungsformen für Geräte und Sensoren die den PMD zur zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung oder zur Phasenfluoreme trie (Veränderung im Kontrast und in der Phase einer modulierten Fluoreszenz/Phosphoreszenz) benutzen bestehen aus einer Anregungs lichtquelle und -optik (wie Laser, LED oder Lampen), die frequenzmo duliert (KHz-10 GHz) oder gepulsed (Pulsbreite Millisekunde bis Femtosekunde) arbeitet oder bei der die Modulation oder Pulsierung nach der Emittierung erzeugt wird.Advantageous embodiments for devices and sensors that the PMD for time-correlated single photon counting or for phase fluoremes trie (change in contrast and in the phase of a modulated Fluorescence / phosphorescence) use consist of an excitation light source and optics (such as lasers, LEDs or lamps), the frequency mo dulated (KHz-10 GHz) or pulsed (pulse width milliseconds to Femtosecond) or modulation or pulsation is generated after the emission.
Vorteilhaft ist weiterhin eine Optik zur Anregung der Probe, sowie Probenhalterung beliebiger Bauform und Funktionalität je nach Aggre gatzustand der Probe (Optoden, Küvetten, Mikrotitterplatten, Biochips, optisch Detektierbare Flußsysteme (Mikrokanäle), Kapillaren).An optical system for excitation of the sample is also advantageous Specimen holder of any design and functionality depending on the aggre state of the sample (optodes, cuvettes, Microtitre plates, biochips, optically detectable flow systems (Microchannels), capillaries).
Es kann zur optischen Abbildung auf den PMD, je nach Zweck mit einer optischen Trennung von Anregungs- und Lumineszenzlicht, einer spektralen Aufspaltung des Lumineszenzlichtes und einer Vorverstär kung desselben gearbeitet werden. Es ist wahlfrei welche Steuer elektronik eingesetzt oder welches Format der PMD besitzt (einzelne PMD, PMD-Zeile oder PMD-Array) oder welche Spezifikation der Modula tion oder der Pulsfolge als elektrisches Signal dem PMD zur Verfü gung steht (einheitliches elektrisches Signal bei allen PMD (Zeile oder Array) oder zusätzliche Signale für die spezielle Korrelation von einzelnen PMD in der Zeile oder im Array).It can be used for optical imaging on the PMD, depending on the purpose optical separation of excitation and luminescent light, one spectral splitting of the luminescent light and a preamplifier of the same. Which tax is optional electronics used or what format the PMD has (individual PMD, PMD line or PMD array) or what specification of the modules tion or the pulse train as an electrical signal to the PMD (uniform electrical signal for all PMD (line or array) or additional signals for the special correlation of individual PMD in the row or in the array).
Die Auswerteeinheit besteht aus Rechnerhardware und Software (Verrechnungs- oder Rückkopplungs- oder Anzeige-, Auswertungssoftwa re, Bildverarbeitung). Der Gesamtaufbau ist bedingt durch Verwen dungszweck (Mikroskopaufbau (Fluorescence lifetime imageing), offene oder geschlossene, kompakte, miniaturisiert Spekrometeraufbau, paralleler Scanner oder Reader von Mikrotitterplatten oder Chips, Optoden, Meßsonden, Küvetten, MikrokanäleThe evaluation unit consists of computer hardware and software (Billing or feedback or display, evaluation software re, image processing). The overall structure is due to use Purpose (microscope structure (fluorescence lifetime imageing), open or closed, compact, miniaturized spectrometer construction, parallel scanner or reader of microplate or chips, Optodes, measuring probes, cuvettes, microchannels
Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie mit PMD besteht vorteilhaft aus einer Anregungslichtquelle und -optik (z. B. konfokale Optik) im cw oder quasi cw. Die Steuerelektronik erzeugt vorteilhaft eine Modulation, die mit zeitlich verschiedenen Fluoreszenzereignissen korreliert (Diffusion eines fluoreszierenden Moleküles) und als elektrisches Signal dem PMD zur Verfügung steht oder eine Multifre quenzmodulation um eine Autokorrelation der Photonenstatistik zu erhalten.Fluorescence correlation spectroscopy with PMD is advantageous from an excitation light source and optics (e.g. confocal optics) in the cw or quasi cw. The control electronics advantageously generate one Modulation with different fluorescence events correlated (diffusion of a fluorescent molecule) and as electrical signal the PMD is available or a multifre frequency modulation to an autocorrelation of the photon statistics receive.
Claims (10)
einer Strahlenquelle zur Erzeugung einer anregenden elektromagneti schen Welle, welche geeignet fokussiert auf eine Probe trifft,
einen Detektor, welcher die von der geeignet gehaltenen Probe emittierte Strahlung geeignet fokussiert empfängt
und dem Detektor zugeordneten Steuer- und Auswerteeinheiten, dadurch gekennzeichnet,
daß die anregende elektromagnetische Welle moduliert ist,
daß der Detektor als photonisches Mischelement (PMD) ausgeführt ist und
daß der PMD durch die Steuereinheit elektrisch mit der Modulation der anregenden elektromagnetischen Welle moduliert ist.1. Device for determining sample properties via time-resolved luminescence, consisting of
a radiation source for generating an exciting electromagnetic wave which suitably focuses on a sample,
a detector which receives the radiation emitted by the suitably held sample in a suitably focused manner
and control and evaluation units assigned to the detector, characterized in that
that the exciting electromagnetic wave is modulated
that the detector is designed as a photonic mixing element (PMD) and
that the PMD is electrically modulated by the control unit with the modulation of the exciting electromagnetic wave.
daß über die Steuereinheit eine elektrische Modulation des PMD frequenzmoduliert im Bereich von 1 kHz bis 60 GHz oder gepulst im Bereich 1 ms bis 100 fs erfolgt,
daß die Vorrichtung optional Teil eines optischen Spektrometers ist,
daß optional über einen optischen Strahlteiler die Trennung von Anregungslicht und Lumineszenzlicht erfolgt,
daß optional über einen spektralen Strahlteiler eine spektrale Aufspaltung des Lumineszenzlichts erfolgt und
daß optional über einen Lichtverstärker eine Vorverstärkung des Lumineszenzlichts erfolgt.2. Device according to claim 1, characterized in that
that the control unit electrically modulates the PMD frequency-modulated in the range from 1 kHz to 60 GHz or pulsed in the range from 1 ms to 100 fs,
that the device is optionally part of an optical spectrometer,
that the excitation light and luminescent light are separated optionally via an optical beam splitter,
that a spectral splitting of the luminescent light optionally takes place via a spectral beam splitter and
that the luminescent light is optionally preamplified via a light amplifier.
daß der PMD als ein- oder mehrdimensionales Array ausgeführt ist,
daß optional alle PMD mit einer einheitlichen elektrischen Modula tion betrieben werden und
daß optional einzelne PMD zusätzliche Modulationssignale für spezi elle Korrelationen erhalten. 3. Device according to one of claims 1 to 2, characterized in that
that the PMD is designed as a one- or multi-dimensional array,
that optionally all PMD are operated with a uniform electrical modulation and
that optional individual PMD receive additional modulation signals for special correlations.
daß mit geeigneten Abbildungsmitteln ein optisches Bild der Probe erzeugt wird und
daß eine ein- oder zweidimensionale Verteilung der Probeneigenschaf ten über der Probe bestimmt wird.4. The device according to claim 3, characterized in
that an optical image of the sample is generated with suitable imaging means and
that a one- or two-dimensional distribution of the sample properties over the sample is determined.
in einem ersten Schritt eine geeignet modulierte elektromagnetische Welle geeignet fokussiert eine geeignet gehaltene Probe anregt,
in einem weiteren Schritt die Modulation der anregenden elektromag netische Welle durch eine Steuereinheit in eine elektrische Modula tion transformiert ein photonisches Mischelement (PMD) ansteuert,
in einem weiteren Schritt die angeregte Probe elektromagnetische Strahlung emittiert,
in einem weiteren Schritt die emittierte elektromagnetische Strah lung geeignet fokussiert auf den PMD trifft,
in einem weiteren Schritt die beiden Meßsignale des PMD in Echtzeit ausgelesen werden und
in einem letzten Schritt über die Auswerteeinheit daraus die Inten sität und die Lebensdauer der emittierten Strahlung berechnet wird.8. Method for determining sample properties via time-resolved luminescence, in which
in a first step, a suitably modulated electromagnetic wave, suitably focused, excites a suitably held sample,
in a further step, the modulation of the exciting electromagnetic wave is transformed by a control unit into an electrical modulation and controls a photonic mixing element (PMD),
in a further step the excited sample emits electromagnetic radiation,
in a further step the emitted electromagnetic radiation hits the PMD in a suitably focused manner,
in a further step, the two measurement signals of the PMD are read out in real time and
in a final step, the intensity and the lifetime of the emitted radiation are calculated from the evaluation unit.
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