DE19857792A1

DE19857792A1 - Fluorescent properties of microscopically sample plants determined by synchronized light pulses and charge coupled device

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Publication number: DE19857792A1
Application number: DE1998157792
Authority: DE
Inventors: Ulrich Schreiber; Rolf Gademann
Original assignee: Ulrich Schreiber
Current assignee: SCHREIBER, ULRICH, DR., 97082 WUERZBURG, DE GADEMA
Priority date: 1998-12-15
Filing date: 1998-12-15
Publication date: 2000-07-20

Abstract

A measuring system to determine the relative chlorophyllic fluorescence yield of a specimen plant, uses measured light pulses to stimulate periodic fluorescent emissions. The system has a photo-detector to register the fluorescent signal, and a fluorescent signal amplifier synchronized with the measured light pulses. The system especially has a switch-synchronized higher-intensity light source, which when connected increases the frequency of the measured light pulses and reduces the frequency on disconnection. The high-intensity light source is identical with the light source triggering periodic fluorescent (1) stimulation. The measured light pulses are of uniform intensity and the total light energy directed at the sample (2) is varied by a change in pulse frequency.

Description

Die Erfindung betrifft ein Meßsystem nach dem Oberbegriff der nebengeordneten Ansprüche 1 bzw. 2.The invention relates to a measuring system according to the preamble of the subordinate Claims 1 and 2, respectively.

Ein derartiges Meßsystem ist aus der DE-35 18 527 A1 bekannt. Bei diesem, den derzeitigen Stand der Meßtechnik charakterisierenden System treten bei der Belichtung mit Starklicht zum Treiben der Photosynthese in pflanzlichen Proben, sowie bei der Anwendung von sättigenden Lichtpulsen, die im Zusammenhang mit der sogenannten "Chlorophyllfluoreszenz-Quenchanalyse" zur kurzfristigen Unterdrückung der Ausbeute der photosynthetischen Energieumwandlung appliziert werden, sehr unterschiedliche Signalamplituden auf. Diese Eigenschaft wirkt sich solange nicht nachteilig aus, wie als Photodetektor eine Photodiode verwendet wird, bei welcher die Signalamplitude über mehrere Zehnerpotenzen proportional zur Lichtintensität ist, ohne dass die Rauschamplitude bei hohen Intensitäten wesentlich zunimmt. Weiterhin kann durch Standardtechniken (wie z. B. AC-Kopplung) das Pulssignal am Ausgang einer einzelnen Photodiode leicht von einem potentiell um mehrere Zehnerpotenzen höheren nichtmodulierten Hintergrundsignal getrennt werden. In der Praxis treten jedoch Probleme auf, wenn statt einer Photodiode ein Photomultiplier oder eine CCD-Kamera als Photodetektor eingesetzt wird. Die Anwendung eines Photomultipliers ist erstrebenswert zur Untersuchung von Proben mit sehr geringem Chlorophyllgehalt (z. B. Wasserproben aus Seen, Flüssen und Meeren) und zur Untersuchung sehr kleiner Probenflächen (z. B. bei der Fluoreszenzmikroskopie oder bei Mikrofiber- Untersuchungen).Such a measuring system is known from DE-35 18 527 A1. With this, the current state of the art characterizing system occur at the Exposure to strong light to drive photosynthesis in plant samples, as well as in the application of satiating light pulses that are associated with the so-called "chlorophyll fluorescence quench analysis" for short-term Suppression of the yield of photosynthetic energy conversion be applied, very different signal amplitudes. This attribute has no adverse effect as long as a photodiode as a photodetector is used, in which the signal amplitude over several powers of ten is proportional to the light intensity, without the noise amplitude at high Intensities increase significantly. Furthermore, standard techniques (such as e.g. B. AC coupling) the pulse signal at the output of a single photodiode easily from a non-modulated one that is potentially several orders of magnitude higher Background signal to be separated. In practice, however, problems arise when instead of a photodiode a photomultiplier or a CCD camera as Photodetector is used. The application of a photomultiplier is Desirable to examine samples with very low chlorophyll content (e.g. water samples from lakes, rivers and seas) and for investigation very much small sample areas (e.g. fluorescence microscopy or microfiber Investigations).

Mit einer CCD-Kamera oder einer CCD-Zeilenkamera lassen sich über Fluoreszenzbildanalyse örtliche Heterogenitäten der Photosyntheseleistung (z. B. in einem Blatt) erfassen, was vor allem in der Phytopathologie von großer praktischer Bedeutung ist. Bei Verwendung eines Photomultipliers ergeben sich grundsätzliche Probleme aus der Tatsache, dass, anders als bei einer Photodiode, die Rauschamplitude mit der Signalamplitude ansteigt. So wird vor allem die Bestimmung der maximalen Fluoreszenzausbeute mit Hilfe eines sättigenden Lichtpulses, deren Wert für die Chlorophyllfluoreszenz-Quenchanalyse von zentraler Bedeutung ist, durch starkes Rauschen erheblich erschwert. Bei Verwendung eines CCD-Detektors ergibt sich ein Problem bezüglich der digitalen Auflösung, wenn das Meßsignal um Zehnerpotenzen variiert. Dieses Problem läßt sich selbst durch sehr kostspielige A/D-Wandler nicht beheben. Es kann somit festgestellt werden, dass die den derzeitigen Stand der Technik charakterisierenden Meßeinrichtungen in zwei sehr wichtigen praktischen Anwendungen grundlegend limitiert sind.With a CCD camera or a CCD line scan camera you can Fluorescence image analysis of local heterogeneities in photosynthesis performance (e.g. in one sheet) capture what is particularly practical in phytopathology Meaning is. When using a photomultiplier, there are fundamental Problems from the fact that, unlike a photodiode, the Noise amplitude increases with the signal amplitude. That is how it will be Determination of the maximum fluorescence yield with the help of a saturating one Light pulse, whose value for the chlorophyll fluorescence quench analysis of is of central importance, made much more difficult by strong noise. At Using a CCD detector poses a problem with digital Resolution if the measurement signal varies by powers of ten. This problem leaves not fix themselves by very expensive A / D converters. So it can are found to characterize the current state of the art Basic measuring equipment in two very important practical applications are limited.

Der vorliegenden Erfindung hegt daher die Aufgabe zugrunde, Meßsysteme zu schaffen, welche eine selektive Erfassung der Chlorophyllfluoreszenz-Ausbeute im pulsmodulierten Meßlicht sowie eine zuverlässige "Chlorophyllfluoreszenz- Quenchanalyse" mit Hilfe sättigender Lichtpulse auch dann ermöglichen, wenn zur Erhöhung der Meßempfindlichkeit ein Photomultiplier oder zur Fluoreszenzbildanalyse ein CCD-Element eingesetzt wird.The present invention is therefore based on the object of measuring systems create a selective detection of the chlorophyll fluorescence yield in pulse-modulated measuring light and a reliable "chlorophyll fluorescence Enabling quench analysis "with the help of saturating light pulses even when Increase the sensitivity of a photomultiplier or Fluorescence image analysis a CCD element is used.

Diese Aufgabe wird bei einem Meßsystem nach den Merkmalen im Oberbegriff der nebengeordneten Ansprüche 1 bzw. 2 gelöst mit deren Merkmalen im kennzeichnenden Teil.This task is in a measuring system according to the features in the preamble of independent claims 1 and 2 solved with their features in characteristic part.

Bei Verwendung derselben Lichtquelle zur Erzeugung sowohl der Meßlichtpulse, als auch des photosynthetisch wirksamen Starklichts und der sättigenden Lichtpulse, bei ausschließlicher Variation der Frequenz der Meßlichtpulse (d. h. konstanter Intensität der einzelnen Meßlichtpulse) gemäß Anspruch 1 sind die potentiellen Änderungen der Fluoreszenzintensität relativ klein und ausschließlich auf die lichtinduzierten Änderungen der Fluoreszenzausbeute der pflanzlichen Probe zurückzuführen, deren Messung angestrebt wird. Im Extremfall tritt beim Übergang vom schwachen Meßlicht (Quasi-Dunkelzustand) zum sättigenden Licht eine Erhöhung der Fluoreszenzausbeute um einen Faktor 5 auf, wobei das Signal/Rauschverhältnis des Photomultipliers nur geringfügig erniedrigt wird und bei Verwendung eines CCD-Detektors eine gute digitale Auflösung gewährleistet ist. Das Prinzip der Meßanordnung nach Anspruch 1 ist in Abb. 1a dargestellt. Als lichtemittierendes Mittel (1) fungiert vorzugsweise eine lichtemittierende Diode (LED), welche auf die pflanzliche Probe (2) gerichtet ist, deren Fluoreszenzemission mit Hilfe des Photodetektors (3) gemessen wird. Dem Stand der Technik entsprechend dient eine Steuer- und Auswerteelektronik zur synchronen Ansteuerung des LED-Treibers und des selektiven Vorverstärkers des Signals des Photodetektors (3).When using the same light source for generating both the measuring light pulses, as well as the photosynthetically active strong light and the saturating light pulses, with only the variation of the frequency of the measuring light pulses (ie constant intensity of the individual measuring light pulses) according to claim 1, the potential changes in the fluorescence intensity are relatively small and exclusively on attributed to the light-induced changes in the fluorescence yield of the plant sample, the measurement of which is sought. In extreme cases, the transition from weak measuring light (quasi-dark state) to saturating light leads to an increase in the fluorescence yield by a factor of 5, the signal / noise ratio of the photomultiplier being only slightly reduced and good digital resolution is ensured when using a CCD detector . The principle of the measuring arrangement according to claim 1 is shown in Fig. 1a. A light-emitting diode (LED), which is aimed at the plant sample ( 2 ) and whose fluorescence emission is measured with the aid of the photodetector ( 3 ), preferably functions as the light-emitting means ( 1 ). According to the state of the art, control and evaluation electronics are used to synchronously control the LED driver and the selective preamplifier of the signal from the photodetector ( 3 ).

Alternativ kann das gleiche Ziel gemäß Anspruch 2 auch dadurch erreicht werden, dass das Starklicht oder die sättigenden Lichtpulse durch eine zweite Puls- Lichtquelle erzeugt werden, die so angesteuert wird, dass eine Überlappung mit den Meßlichtpulsen vermieden wird. Das zwischen den Meßlichtpulsen eingestrahlte Licht kann den Zustand der pflanzlichen Probe und damit die Fluoreszenzausbeute verändern, ohne zum Zeitpunkt der mit den Meßlichtpulsen synchronisierten, selektiven Signalverstärkung bzw. Signalerfassung wirksam zu sein. Die Pulsdauer dieses zusätzlich eingestrahlten Lichts muß um einige µsec kürzer als das Zeitintervall zwischen zwei aufeinander folgenden Meßlichtpulsen sein, um die Messung eines Referenzsignals im Aus-Zustand der LED-Lichtquelle vor jedem Meßlichtpuls zu ermöglichen. Bei Verwendung eines CCD-Detektors müssen die Ladungsintegrations-Perioden mit den Meßlichtpuls-Perioden synchronisiert sein. Das Prinzip der Meßanordnung nach Anspruch 2 ist in Abb. 1b dargestellt. Als lichtemittierendes Mittel (1) für Meßlichtpulse fungiert wie beim Anspruch 1 vorzugsweise eine lichtemittierende Diode (LED), welche auf die pflanzliche Probe (2) gerichtet ist, deren Fluoreszenzemission mit Hilfe des Photodetektors (3) gemessen wird. Zusätzlich ist ein zweites lichtemittierendes Mittel (4) zur Erzeugung von Starklicht und Sättigungspulsen auf die pflanzliche Probe gerichtet, wozu wiederum vorzugsweise eine LED dient. Dem Stand der Technik entsprechend dient eine Steuer- und Auswerteelektronik zur Ansteuerung der beiden LED-Treiber, wobei der selektive Vorverstärkers des vom Photodetektor (3) gemessenen Fluoreszenzsignals mit dem LED-Treiber der Meßlichtpulse synchronisiert ist.Alternatively, the same goal can also be achieved in that the strong light or the saturating light pulses are generated by a second pulse light source, which is controlled in such a way that an overlap with the measurement light pulses is avoided. The light radiated in between the measuring light pulses can change the state of the plant sample and thus the fluorescence yield without being effective at the time of the selective signal amplification or signal detection synchronized with the measuring light pulses. The pulse duration of this additionally radiated light must be a few µsec shorter than the time interval between two successive measurement light pulses in order to enable the measurement of a reference signal in the off state of the LED light source before each measurement light pulse. When using a CCD detector, the charge integration periods must be synchronized with the measuring light pulse periods. The principle of the measuring arrangement according to claim 2 is shown in Fig. 1b. A light-emitting diode (LED), which is aimed at the plant sample ( 2 ), the fluorescence emission of which is measured with the aid of the photodetector ( 3 ), preferably acts as the light-emitting means ( 1 ) for measuring light pulses. In addition, a second light-emitting means ( 4 ) for generating strong light and saturation pulses is directed at the plant sample, which in turn is preferably used by an LED. In accordance with the prior art, control and evaluation electronics are used to control the two LED drivers, the selective preamplifier of the fluorescence signal measured by the photodetector ( 3 ) being synchronized with the LED driver of the measurement light pulses.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen 3-19 angeführt. Further advantageous refinements are set out in subclaims 3-19.

Gemäß den Ansprüchen 3 bis 6 bieten sich LEDs oder Laserdioden als geeignete Lichtquellen mit schnellen Ein-Ausschaltflanken und einer breiten Auswahl verfügbarer Meßlichtwellenlängen sowohl für das Meßlicht als auch für das Stark- und Sättigungspulslicht an. Die LEDs können entweder einzeln oder als Arrays eingesetzt werden. Einzelne LEDs geben selbst zur Sättigung der Photosynthese ausreichende Intensitäten, wenn sie über geeignete Linsensysteme auf die zu untersuchenden pflanzliche Proben fokussiert sind. LED-Arrays sind dann erforderlich, wenn größere Probenvolumina oder Probenflächen untersucht werden. Diese Meßanordnung ist z. B. erforderlich zur Chlorophyllfluoreszenz- Quenchanalyse bei Proben natürlicher Oberflächengewässer, in denen das mikroskopisch kleine, photosynthetisch aktive Phytoplankton über relativ große Wasservolumina verteilt ist, so dass durch eine einzelne LED die zur Lichtsättigung der photosynthetischen Energieumwandlung notwendige Intensität nicht aufgebracht werden kann. Aus dem gleichen Grunde ist die Verwendung eines LED-Arrays erforderlich zur Messung von zweidimensionalen Bildern der Chlorophyllfluoreszenz-Emission von größerflächigen pflanzlichen Objekten, wie z. B. Blättern, mit Hilfe einer Kamera mit CCD-Detektor.According to claims 3 to 6, LEDs or laser diodes are suitable Light sources with fast switch-on and switch-off edges and a wide selection available measuring light wavelengths both for the measuring light and for the strong and saturation pulse light on. The LEDs can either be used individually or as arrays be used. Individual LEDs give themselves to the saturation of photosynthesis sufficient intensities if they have suitable lens systems towards the investigating plant samples are focused. LED arrays are then required when examining larger sample volumes or sample areas become. This measuring arrangement is e.g. B. required for chlorophyll fluorescence Quench analysis for samples of natural surface water, in which the microscopic, photosynthetically active phytoplankton over relatively large ones Water volume is distributed, so that by a single LED Light saturation necessary for photosynthetic energy conversion cannot be applied. The use is for the same reason of an LED array required to measure two-dimensional images of the Chlorophyll fluorescence emission from large-scale plant objects, such as e.g. B. Scroll, using a camera with a CCD detector.

Die Verwendung eines Photomultipliers als Photodetektor gemäß Anspruch 7 bringt den Vorteil einer sehr effektiven und rauscharmen Fluoreszenzdetektion und Signalverstärkung.The use of a photomultiplier as a photodetector according to claim 7 brings the advantage of a very effective and low-noise fluorescence detection and Signal amplification.

Die Verwendung eines CCD-Detektors als Photodetektor gemäß den Ansprüchen 8 und 9 ist vor allem dann vorteilhaft, wenn die zweidimensionale Verteilung der Fluoreszenzausbeute in der pflanzlichen Probe von Interesse ist. So können Video- Kameras, in denen CCD-Detektoren integriert sind, zur Registrierung von Fluoreszenzbildern eingesetzt werden, aus denen sich Bilder der photosynthetischen Aktivität ableiten lassen.The use of a CCD detector as a photodetector according to the claims 8 and 9 is particularly advantageous if the two-dimensional distribution of the Fluorescence yield in the plant sample is of interest. So video Cameras in which CCD detectors are integrated for the registration of Fluorescence images are used, from which images of the Derive photosynthetic activity.

Bei Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit Auflicht-Fluoreszenzanregung gemäß den Ansprüchen 11-15 (Abb. 2a) wird das Licht einer einzelnen LED (1) durch das Objektiv des Mikroskops mit hoher Effizienz auf das Untersuchungsobjekt (2) fokussiert, so dass lokal am Objekt eine sehr hohe Meßlichtintensität vorliegt, was sowohl für die Amplitude des Meßsignals als auch für die Stärke des Sättigungspulses vorteilhaft ist. Durch die Anordnung des Photomultipliers (3) am Kamera-Adaptertubus des Fluoreszenzmikroskops gemäß Anspruch 12 ist eine optimale Erfassung des Fluoreszenzsignals gewährleistet. Bei Verwendung eines CCD-Detektors am Kamera-Adaptertubus des Fluoreszenzmikroskops gemäß Anspruch 13 wird das vergrößerte Bild des fluoreszierenden pflanzlichen Objektes mit zellulärer und subzellulärer räumlicher Auflösung erfaßt.When using a fluorescence microscope with incident light fluorescence excitation according to claims 11-15 ( Fig. 2a), the light of a single LED ( 1 ) is focused through the lens of the microscope with high efficiency on the examination object ( 2 ), so that a locally on the object there is very high measurement light intensity, which is advantageous both for the amplitude of the measurement signal and for the strength of the saturation pulse. The arrangement of the photomultiplier ( 3 ) on the camera adapter tube of the fluorescence microscope in accordance with claim 12 ensures optimal detection of the fluorescence signal. When using a CCD detector on the camera adapter tube of the fluorescence microscope according to claim 13, the enlarged image of the fluorescent plant object is captured with cellular and subcellular spatial resolution.

Durch die Anordung der zweiten Lichtquelle (4) unterhalb der zu untersuchenden Probe (2) gemäß Anspruch 14 und Fokussierung des Lichtstrahls mit Hilfe eines Linsensystems ergibt sich eine hohe lokale Lichtintensität in der Objektebene, welche bei transparenten Objekten, wie z. B. einzelnen Algenzellen, bei der Erzeugung von Sättigungspulsen von Vorteil ist. (Abb. 2a)The arrangement of the second light source ( 4 ) below the sample to be examined ( 2 ) according to claim 14 and focusing of the light beam with the aid of a lens system results in a high local light intensity in the object plane, which in transparent objects, such as. B. individual algae cells, is advantageous in the generation of saturation pulses. (Fig. 2a)

Dadurch, dass gemäß Anspruch 15 das fokussierte Licht einer zweiten Lichtquelle (4) über eine Lichtleitfaser auf die Probe gerichtet wird, können im mikroskopisch kleinen Bildfeld hohe lokale Lichtintensitäten erreicht werden. Dabei kann der Winkel zwischen dem Ausgangsstrahl der Lichtleitfaser und dem Objektiveingang so gewählt werden, dass kein direktes Licht durch das Objektiv zum Photodetektor (3) gelangt. Diese Anordnung ist besonders bei Einstrahlung von fernrotem Licht vorteilhaft, da dieses ebenso wie die Chlorophyllfluoreszenz ungehindert zum Photodetektor vordringen kann.Because the focused light of a second light source ( 4 ) is directed onto the sample via an optical fiber, high local light intensities can be achieved in the microscopic image field. The angle between the output beam of the optical fiber and the lens input can be selected so that no direct light reaches the photodetector ( 3 ) through the lens. This arrangement is particularly advantageous when irradiating far red light, since this, like the chlorophyll fluorescence, can penetrate unhindered to the photodetector.

Eine einfache Meßeinrichtung gemäß Anspruch 16 läßt sich dadurch realisieren, dass das Anregungslicht einer LED in das eine Ende eines Lichtleiters eingekoppelt wird, an dessen anderem Ende sich die Probe befindet, und dass das Fluoreszenzlicht am gleichen Ende über ein dichroitisches Filter, welches das LED-Licht ungehindert passieren läßt, im Winkel von 45° auf den Detektor umgelenkt wird. (Abb. 2b) A simple measuring device according to claim 16 can be realized in that the excitation light of an LED is coupled into one end of a light guide, at the other end of which the sample is located, and that the fluorescent light at the same end via a dichroic filter which Allows light to pass freely, is deflected at an angle of 45 ° to the detector. (Fig. 2b)

Wird gemäß Anspruch 17 das Licht einer einzelnen LED über ein geeignetes Linsensystem in den einen Arm einer Y-förmigen, dünnen Lichtleiteranordnung eingekoppelt und der andere Arm mit einem Photomultiplier verbunden, so lassen sich die oben beschriebenen Messungen auch an Blättern oder Sedimenten durchführen (Abb. 3a). Auf diese Weise läßt sich die Verteilung der Photosyntheseaktivität in Abhängigkeit vom Abstand zur Oberfläche bestimmen, wenn das freie Ende des Lichtleiters in das Substrat eingeführt wird. Die Fasern können dazu auf wenige Mikrometer Durchmesser ausgezogen werden.If, according to claim 17, the light of a single LED is coupled into a arm of a Y-shaped, thin light guide arrangement via a suitable lens system and the other arm is connected to a photomultiplier, the measurements described above can also be carried out on leaves or sediments ( Fig. 3a). In this way, the distribution of photosynthetic activity as a function of the distance to the surface can be determined when the free end of the light guide is inserted into the substrate. For this purpose, the fibers can be drawn out to a diameter of a few micrometers.

Zur Untersuchung von Wasserproben können gemäß Anspruch 18 eine oder mehrere LEDs auch direkt auf eine Küvette ausgerichtet werden (Abb. 3b). Ein Photomultiplier erlaubt dann die Messung der Fluoreszenzausbeute und der Photosyntheseaktivität bei extrem niedrigen Chlorophyllgehalten. Nach Kalibrierung lassen sich so die absoluten Chlorophyllgehalte von Wasserproben bestimmen. Eine besondere Anwendung sind Toxizitätstest, bei denen die Wirkung von potentiell toxischen Wasserproben auf Standardsuspensionen mit niedrigem Chlorophyllgehalt und bekannter Aktivität untersucht wird.To examine water samples, one or more LEDs can also be aligned directly with a cuvette ( Fig. 3b). A photomultiplier then allows the measurement of the fluorescence yield and the photosynthetic activity at extremely low chlorophyll contents. After calibration, the absolute chlorophyll content of water samples can be determined. A special application are toxicity tests, in which the effect of potentially toxic water samples on standard suspensions with low chlorophyll content and known activity is examined.

Meßsysteme nach den beschriebenen Ansprüchen können sowohl für den ortsgebundenen Laborbetrieb, als auch portabel für den Feldeinsatz unter rauhen Betriebsbedingungen, z. B. unter Wasser, ausgeführt sein. Auch automatisch arbeitende Meßstationen sind möglich.Measuring systems according to the claims described can be used for both location-based laboratory operation, as well as portable for field use under rough conditions Operating conditions, e.g. B. under water. Also automatically working measuring stations are possible.

Claims

1. Measuring system for determining the relative chlorophyll fluorescence yield of a plant sample to be examined using measuring light pulses of a light-emitting agent for periodic fluorescence excitation with

a) a photodetector for detecting the fluorescence signal,
b) a selective fluorescence signal amplifier synchronized with the clock of the measuring light pulses, and
c) a light source of high radiation intensity with means for operating it and switching it on and off, with synchronization devices ensuring that the frequency of the measurement light pulses is increased when switched on and decreased again when switched off,

characterized in that

a) the light source of high radiation intensity is identical to the light emitting means for periodic fluorescence excitation ( 1 ), and
b) the light intensity acting on the plant sample ( 2 ) over time is varied by the frequency of the individual measurement light pulses while the intensity remains constant.

2. Measuring system for determining the relative chlorophyll fluorescence yield of a plant sample to be examined using measuring light pulses of a light-emitting agent for periodic fluorescence excitation with

a) a photodetector for detecting the fluorescence signal,
b) a selective fluorescence signal amplifier synchronized with the clock of the measuring light pulses, and
c) a light source of high radiation intensity with means for its operation and

Switching on and off, with synchronization devices ensuring that the frequency of the measuring light pulses is increased when switched on and decreased again when switched off, characterized in that

a) a second light-emitting means for periodic fluorescence excitation ( 4 ) is used as the light source of high radiation intensity, and
b) the first light-emitting means ( 1 ) is always switched off when the second light-emitting means ( 4 ) is switched on, and
c) the turn-on times of the second light-emitting means ( 4 ) are shorter than the turn-off times of the first light-emitting means ( 1 ).

3. Measuring system according to claim 1, characterized, that an LED as a light-emitting means for periodic fluorescence excitation or a laser diode is used.

4. Measuring system according to claim 1, characterized in that a group of synchronously controlled LEDs (LED array) is used as light-emitting means for periodic fluorescence excitation, which are all aligned to the sample ( 2 ).

5. Measuring system according to claim 2, characterized in that LEDs or laser diodes are used for both light-emitting means, which are controlled asynchronously and are aligned with the sample ( 2 ).

6. Measuring system according to claim 2, characterized in that groups of LEDs (LED arrays) are used for both light-emitting means, which are controlled asynchronously and both are aligned with the sample ( 2 ).

7. Measuring system according to one of claims 1 to 6, characterized in that a photomultiplier is used as the photodetector ( 3 ).

8. Measuring system according to one of claims 1 to 6, characterized in that a linear CCD element is used as the photodetector ( 3 ).

9. Measuring system according to one of claims 1 to 6, characterized in that an imaging CCD element is used as the photodetector ( 3 ).

10. Measuring system according to claim 9, characterized in that the CCD element in conjunction with a video camera provides a two-dimensional image of the distribution of the fluorescence yield of the plant sample ( 2 ).

11. Measuring system according to one of claims 1 to 9, characterized in that the light-emitting means for periodic fluorescence excitation ( 1 ) serves as an excitation light source in a fluorescence microscope with incident-light fluorescence excitation ( Fig. 2a).

12. Measuring system according to claim 11, characterized in that the photodetector ( 3 ) is attached to the camera adapter tube of a fluorescence microscope with incident light fluorescence excitation ( Fig. 2a).

13. Measuring system according to claim 12, characterized in that the CCD element in connection with a video camera is attached to the camera adapter tube of a fluorescence microscope with incident light fluorescence excitation and a two-dimensional, microscopically enlarged image of the distribution of the fluorescence yield of the plant sample ( 2 ) provides (Fig. 2a).

14. Measuring system according to one of claims 12 or 13, characterized in that the second light-emitting means ( 4 ) is attached in the extended optical axis of the fluorescence microscope below the plant sample ( 2 ) located on a slide and its light via a lens system on the is focused sample (Fig. 2a).

15. Measuring system according to one of claims 12 or 13, characterized in that the light of the second light-emitting means ( 4 ) is focused via a lens system on a light guide, the other end of which is directed towards the sample ( 2 ).

16. Measuring system according to one of claims 1 to 9, characterized in that the light-emitting means ( 1 ) and a photodetector ( 3 ) via a beam splitter optics ( 5 ) are directed to the same end of a light guide ( 6 ), the other end of which sample (2) shows (Fig. 2b).

17. Measuring system according to one of claims 1 to 9, characterized in that the light-emitting means ( 1 ) and a photodetector ( 3 ) are directed to different ends of a multi-arm light guide system ( 6 ), the free end of which points to the sample ( 2 ) or in these penetrate (Fig. 3a).

18. Measuring system according to one of claims 1 to 9, characterized in that the light-emitting means for periodic fluorescence excitation ( 1 ), the light-emitting means ( 4 ) and a photodetector ( 3 ) directed directly onto a sample tube (z. B. test tube or cuvette) are in which the sample ( 2 ) is in solution or suspended form ( Fig. 3b).