DE19834145C1 - Verfahren zum Verbessern der Auflösung in zweidimensionalen heteronuklearen Korrelationsspektren der Festkörper-NMR - Google Patents

Abstract

Ein neues zweidimensionales Korrelationsexperiment für Kohlenstoff und Protonen, das MAS-J-HMQC Experiment, wird für rotierende Festkörper vorgeschlagen. Der Magnetisierungstransfer, der für die Korrelation verwendet wird, basiert auf skalarer heteronuklearer J-Kopplung. Die zweidimensionalen Spektren bieten Verschiebungskorrelationen durch die chemische Bindung zwischen direkt gebundenen Protonen-Kohlenstoff Paaren in einer ähnlichen Weise zu entsprechenden Hochauflösungsexperimenten in Lösung. Es wird gezeigt, daß der Transfer über die J-Kopplung effizient und wesentlich selektiver ist als im Fall der Korrelation über heteronukleare Dipolkopplungen. Das Experiment, das bei hohen MAS-Rotationsraten durchgeführt wird, erlaubt die eindeutige Zuordnung der Protonenresonanzen. Das Experiment wird an verschiedenen organischen Verbindungen demonstriert.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren der zweidimensionalen, heteronuklearen Korrela­ tionsspektroskopie zur Untersuchung von Festkörperproben, die eine erste Kernart (¹H) und eine zweite Kernart (¹³C) enthalten, in einem Kernresonanzspektrometer mittels einer Pulssequenz der kernmagnetischen Resonanz, welche Pulssequenz ein Präparationsintervall, ein Evolutionsintervall, ein Mischintervall und ein Detektionsin­ tervall umfaßt, wobei während des Präparationsintervalls die erste Kernart durch mindestens einen Präparations-Hochfrequenzpuls in einem ersten Frequenzband angeregt wird und während des Evolutionsintervalls Evolutions-Hochfrequenzpulsen im ersten Frequenzband ausgesetzt ist, und wobei während des Detektionsintervalls die erste Kernart mindestens einem Entkopplungs-Hochfrequenzpuls im ersten Fre­ quenzband ausgesetzt ist, während der freie Induktionszerfall der zweiten Kernart im zweiten Frequenzband detektiert wird und wobei die Pulssequenz (1 ≦ p ≦ n) mit identischem Präparationsintervall, Mischintervall und Detektionsintervall aber geän­ dertem Evolutionsintervall n-mal hintereinander durchgeführt wird, und wobei die Pro­ be mit einer Rotationsfrequenz größer als 1 kHz um eine Achse rotiert, die um etwa 54° gegen die Achse eines homogenen Magnetfelds geneigt ist, und wobei der min­ destens eine Präparations-Hochfrequenzpuls breitbandig ist mit einer Zentralfre­ quenz in der Mitte des Kernresonanzspektrums der ersten Kernart der Probe und eine Rotation der Kernmagnetisierung der ersten Kernart um eine Achse senkrecht zur Magnetfeldrichtung (X) mit einem Winkel vorzugsweise von 90° bewirkt, und daß die Evolutions-Hochfrequenzpulse eine sog. FSLG-Sequenz bilden mit zwei aufein­ anderfolgenden, um 180° gegeneinander phasenverschobenen (Y, -Y), breitbandi­ gen Evolutions-Hochfrequenzpulsen, deren Zentralfrequenzen der des Präparations- Hochfrequenzpulses gegenüber in entgegengesetzte Richtungen verschoben sind und die jeweils eine Drehung der Kernmagnetisierung der ersten Kernart um etwa 294° bewirken.

Solch ein Verfahren ist bekannt aus EP 0 481 256 A1 oder aus DE 196 48 391 C1.

Kernresonanz (NMR) ist ein Phänomen, das in Verbindung mit einer ausgewählten Gruppe von Atomkernen auftritt und das auf der Existenz von magnetischen Kern­ momenten in diesen Atomkernen basiert. Wenn ein Atomkern mit einem Kernspin in ein starkes, gleichförmiges und statisches Magnetfeld gebracht wird (ein sog. "Zee­ man-Feld") und mit Hilfe eines schwachen Hochfrequenz (HF)-Magnetfelds angeregt wird, präzediert der Kernspin mit einer natürlichen Resonanzfrequenz, der Larmor- Frequenz, die für jede Kernart mit Kernspin charakteristisch ist und von der am Ort des Kerns wirksamen Magnetfeldstärke abhängt. Typische Atomkerne mit magneti­ schem Moment sind z. B. Protonen ¹H, ¹³C, ¹⁹F und ³¹P. Die Resonanzfrequenzen der Kerne können beobachtet werden, indem man die transversale Magnetisierung be­ obachtet, die nach einem starken HF-Puls auftritt. Es ist üblich, mit Hilfe der Fourier­ transformation das gemessene Signal in ein Frequenzspektrum überzuführen.

Obwohl identische Kerne dieselbe Frequenzabhängigkeit vom Magnetfeld haben, können Unterschiede in der unmittelbaren chemischen Umgebung jedes Kerns das Magnetfeld modifizieren, so daß Kerne derselben Probe nicht das gleiche effektive Magnetfeld sehen. Die Unterschiede im fokalen Magnetfeld bewirken spektrale Ver­ schiebungen der Larmorfrequenz zwischen zwei solchen chemisch nicht äquivalen­ ten Kernen, die "chemische Verschiebungen" genannt werden. Diese chemischen Verschiebungen sind interessant, da sie Informationen liefern über die Anzahl und die Positionen der Atome in einem Molekül und über die relative Anordnung angren­ zender Moleküle innerhalb einer Verbindung.

Unglücklicherweise ist es nicht immer möglich, die durch die chemischen Verschie­ bungen verursachten Frequenzspektren zu interpretieren, da auch noch andere und möglicherweise dominierende Wechselwirkungen vorliegen.

Dies trifft ganz besonders auf die NMR-Spektroskopie von Festkörpern zu. Bei der NMR-Spektroskopie von Flüssigkeiten hat die schnelle Bewegung der Moleküle die Tendenz, die Kerne zu isolieren und die Kernwechselwirkungen zu trennen, so daß es wesentlich einfacher ist, unterschiedliche Kerne im Spektrum zu erkennen. Bei der Festkörper-NMR gibt es sehr viele Wechselwirkungen zwischen den Molekülen, die das Ergebnis verschleiern. Z. B. stören sich die magnetischen Momente benach­ barter Kerne gegenseitig, was zu Wechselwirkungen führt, die "Dipol-Dipol- Kopplungen" genannt werden. Diese Kopplungen verbreitern die charakteristischen Resonanzlinien und überdecken die "feine" Resonanzstruktur, die durch die chemi­ sche Verschiebung verursacht wird. Ein weiteres Problem, das in Verbindung mit Festkörpern auftritt und das in Flüssigkeiten nicht vorliegt, ist, daß die Orientierung der Moleküle in Festkörpern bezogen auf das angelegte Zeeman-Feld verhältnismä­ ßig fest ist und daß daher die chemischen Verschiebungen anisotrop sind, so daß ein Beitrag zur Resonanzfrequenz von der räumlichen Orientierung der Moleküle re­ lativ zum angelegten Magnetfeld abhängt. Daher ist es wesentlich, einige dieser Wechselwirkungen zu unterdrücken, um für die anderen ein aussagekräftiges Ergeb­ nis zu erhalten. Dies wird üblicherweise dadurch erreicht, daß man bei ausgewählten Frequenzen das System anregt, damit sich unerwünschte Wechselwirkungen her­ ausheben oder zumindest zu einer reduzierten Amplitude mitteln. Zum Beispiel wird in Festkörpern die o. g. Anisotropie der chemischen Verschiebung üblicherweise weitgehend reduziert dadurch, daß man die Festkörperprobe bezüglich des ange­ legten Magnetfelds unter dem sog. "Magischen Winkel" (54° 44') orientiert und unter diesem Winkel mit einer verhältnismäßig schnellen Frequenz rotieren läßt, was die anisotropen Feldkomponenten zu Null mittelt.

In ähnlicher Weise ist es mit bekannten Techniken möglich, die unerwünschten Spin- Spin-Wechselwirkungen zu reduzieren, indem man die Kerne mit zusätzlichen HF- Pulsen bei oder nahe den Larmorfrequenzen bestrahlt. Indem man sorgfältig ver­ schiedene Polarisationen und Phasen der HF-Pulse auswählt, kann die Magnetisie­ rung der störenden Kernspinsysteme in Nachbargruppen verändert werden, wodurch die Spinwechselwirkungen effektiv weggemittelt werden, so daß ihr Beitrag zum endgültigen Meßwert sehr stark vermindert ist. Da für jede Kernsorte die Larmorfre­ quenz unterschiedlich ist, wird ein angelegtes HF-Feld einen sehr viel größeren Ef­ fekt auf diejenigen Spins haben, die eine Larmorfrequenz aufweisen, die nahe bei der angelegten Frequenz liegt als auf jene Spins, deren Larmorfrequenz deutlich verschieden ist. Auf diese Weise können angelegte HF-Felder verwendet werden, um eine Kernart zu beeinflussen, während andere unverändert bleiben.

Wegen der speziellen Probleme der Festkörperspektroskopie verwendet man übli­ cherweise eine zweidimensionale Spektroskopietechnik in der Zeitdomäne, um die Auflösung zu verbessern. Mit dieser Technik wird es möglich, die Wechselwirkung oder "Korrelation" zwischen zwei unterschiedlichen Kernarten in einem Festkörper zu untersuchen - die Wechselwirkung zwischen Protonen und ¹³C-Kernen ist üblicher­ weise in vielen organischen Festkörpern von großem Interesse. Die grundlegende Technik der zweidimensionalen heteronuklearen Korrelation im Zusammenhang mit Festkörpern ist wohlbekannt und in vielen Artikeln beschrieben, wie z. B. in "Hetero­ nuclear Correlation Spectroscopy" von P. Caravatti, G. Bodenhausen und R. R. Ernst, Chemical Physics Letters Vol 89, No. 5, pp. 363-367 (Juli 1982) und in "Heteronucle­ ar Correlation Spectroscopy in Rotating Solids" von P. Caravatti, L. Braunschweiler und R. R. Ernst, Chem. Phys. Letters, Vol. 100, No. 4, pp. 305-310 (September 1983). Auf den Inhalt dieser Artikel wird ausdrücklich Bezug genommen.

Wie in den o. g. Artikeln beschrieben, umfaßt die zweidimensionale heteronukleare Korrelationstechnik ein "Experiment" in der Zeitdomäne, das i. a. aus vier unter­ schiedlichen aufeinanderfolgenden Zeitintervallen besteht. Das erste Intervall heißt "Präparationsintervall". Während dieser Zeit wird eine der beiden untersuchten Kern­ sorten in einen angeregten, kohärenten Nicht-Gleichgewichtszustand gebracht, der sich während der folgenden Zeitintervalle ändert bzw. "entwickelt". Das Präparati­ onsintervall kann aus dem Einstrahlen eines einzigen HF-Pulses bestehen oder auch aus einer Sequenz von HF-Pulsen. Üblicherweise hat das Präparationsintervall eine feste zeitliche Länge.

Ein zweites Zeitintervall heißt "Evolutionsintervall", währenddessen sich die ange­ regten Kernspins unter dem Einfluß des angelegten Magnetfelds, der Nachbarkern­ spins, möglicherweise eingestrahlter periodischer HF-Pulssequenzen und der Pro­ benrotation "entwickeln". Die Evolution der angeregten Kerne während dieses Inter­ valls erlaubt es, diese Frequenzen zu bestimmen. Eine Serie von "Experimenten" oder "Scans" wird durchgeführt, wobei die Evolutionszeit des Evolutionsintervalls sy­ stematisch inkrementiert wird.

Auf das Evolutionsintervall folgt i. a. ein "Mischintervall". Während des Mischintervalls können ein oder mehrere HF-Pulse eingestrahlt werden, was den Transfer der Kohä­ renz oder Polarisation vom angeregten Kern zur anderen untersuchten Kernsorte bewirkt. Der durch den Mischprozeß ausgelöste Kohärenz- oder Polarisationstransfer ist charakteristisch für das untersuchte Kernsystem.

Auf das Mischintervall folgt schließlich ein "Detektionsintervall", in dem die Reso­ nanzfrequenzen der zweiten Kernsorte gemessen werden. Es ist üblich, während dieser Zeit weitere Pulse oder kontinuierliche HF-Energie einzustrahlen, um eine weitere Wechselwirkung zwischen den beiden Kernsorten zu unterbinden (Entkopp­ lung).

Nach der Fouriertransformation ist das Ergebnis des Mehrfachexperiments ein zwei­ dimensionales Spektralprofil, das heteronukleares Korrelationsspektrum genannt wird (auch: 2D HETCOR). Auf einer Achse des Plots sind die detektierten Frequen­ zen der zweiten Kernsorte aufgetragen. Die andere Achse repräsentiert die Frequen­ zen der ersten Kernsorte, die über die wiederholten Scans mit inkrementierten Evo­ lutionszeiten ermittelt werden. Da die gemessenen Frequenzen der zweiten Kern­ sorte vom Energietransfer von der ursprünglich angeregten ersten Kernsorte abhän­ gen und der Zustand der ersten Kernsorte wiederum von der Evolutionszeit abhängt, repräsentiert die zweite Plot-Achse effektiv die chemischen Verschiebungen auf­ grund der verschiedenen ersten Kernsorten in einem bestimmten Molekül und ihre räumliche Anordnung bezüglich der zweiten Kernsorte. Die gemessenen Peaks des Plots entsprechen Korrelationen zwischen ausgewählten Kernen der ersten und zweiten Kernsorte innerhalb eines gegebenen Moleküls. Ein Vorteil der heteronu­ klearen Korrelation ist, daß sie die Protonenresonanzen über den weit größeren Be­ reich der chemischen Verschiebung des ¹³C aufspreizt. Aus diesem Grund kann die­ se Technik gut aufgelöste Information über die chemische Verschiebung der Proto­ nen einer Probe liefern, obwohl es nicht möglich ist, diese chemischen Verschiebun­ gen der Protonen mit anderen eindimensionalen Spektroskopietechniken aufzulösen.

Es ist z. B. üblich, in einem typischen zweidimensionalen heteronuklearen Korrelati­ onsexperiment, das auf ein organisches Material angewendet wird, die Korrelation zwischen Wasserstoffkernen (Protonen) ¹H und ¹³C-Kernen innerhalb der Probe zu untersuchen. Um dies zu tun, wird während des Präparationsintervalls ein HF-Puls angelegt, der die Wasserstoffprotonen anregt. Theoretisch würden dann die Proto­ nenspins während des Evolutionsintervalls eine freie Präzessionsbewegung ausfüh­ ren. Während des Mischintervalls wechselwirken die Protonen mit den ¹³C-Kernen über direkte heteronukleare Dipol-Dipol-Kopplung. Schließlich werden während des Detektionsintervalls die ¹³C-Frequenzen gemessen. Einer der Vorteile eines solchen Experiments ist, daß die heteronukleare Kopplung zwischen den Protonen und den ¹³C-Kernen ausschließlich vom Abstand zwischen den Kernen abhängt unabhängig von der chemischen Bindung. Daher bietet die Korrelation eine Möglichkeit, die Ste­ reochemie individueller Moleküle zu untersuchen sowie die relative Anordnung an­ grenzender Moleküle.

Das Problem dieser Technik ist, daß andere Kopplungen, wie z. B. eine "homonuklea­ re" Dipol-Dipol-Kopplung zwischen Protonen und die "heteronukleare" Dipol-Dipol- Kopplung zwischen Protonen und Kohlenstoffkernen das gewünschte Meßergebnis überdecken können, wenn man diese Wechselwirkungen während des Evolutions­ intervalls zuläßt, da sie die Messung der chemischen Verschiebungen im Protonen­ spektrum beeinflussen. Diese letzten beiden Wechselwirkungen bewirken ein Auf­ weiten der Peaks der chemischen Verschiebung bei Protonen, was zu einer Über­ lappung verschiedener Protonenplätze führt und damit seinerseits zu einer Verwi­ schung der Zuordnung zu den unterschiedlichen Plätzen. Daher ist es notwendig, diese beiden sehr starken Wechselwirkungen während des Evolutionsintervalls zu unterdrücken. Unter bestimmten Bedingungen, wenn man ein häufigeres Element als ¹³C untersucht, z. B. Phosphor oder Aluminium, kann es auch nötig sein, die homo­ nukleare Wechselwirkung zwischen diesen Kernen zu unterdrücken.

Im allgemeinen müssen sorgfältig erstellte HF-Pulssequenzen angewendet werden, um während des Evolutionsintervalls die Unterdrückung der homonuklearen und he­ teronuklearen Kopplungen zu gewährleisten, wobei die Pulse entweder auf die Pro­ tonen, die ¹³C-Kerne oder auf beide gleichzeitig eingestrahlt werden. Die Aufgabe dieser Pulssequenzen ist, die Ergebnisse der unerwünschten Wechselwirkungen zu unterdrücken oder wegzumitteln. Im Stand der Technik sind viele derartige Pulsse­ quenzen bekannt geworden.

Zum Beispiel sind im Stand der Technik Pulssequenzen bekannt, die verhältnismä­ ßig effektiv die homonukleare Wechselwirkungen zwischen den Protonen unterdrüc­ ken. Weiterhin sind andere Pulssequenzen bekannt für die Unterdrückung von hete­ ronuklearen Wechselwirkungen zwischen Protonen und ¹³C-Kernen. Bei Versuchen, simultan sowohl die homonuklearen als auch die heteronuklearen Wechselwirkungen zu unterdrücken, hat man einfach die bekannten HF-Pulssequenzen kombiniert. Da allerdings die bekannten Pulssequenzen nicht im Hinblick auf eine Kombination er­ stellt wurden, ergaben sich sehr lange Folgen von HF-Pulsen, die nötig waren, beide Wechselwirkungstypen zu unterdrücken und die Verfahren führten zu keinen befrie­ digenden Ergebnissen. Daher war die Anzahl der nicht äquivalenten Protonenplätze, die aufgelöst werden konnte, erheblich eingeschränkt. Das wiederum begrenzte die Anzahl von Verbindungen, die erfolgreich untersucht werden konnte.

Die eingangs genannte Druckschrift EP 0 481 256 A1 beschreibt ein verbessertes Verfahren, das die heteronuklearen Wechselwirkungen effektiver unterdrückt. Die dort vorgeschlagene Pulssequenz ist so konstruiert, daß sie in Verbindung mit einer der vorher bekannten Pulssequenzen verwendet werden kann, so daß sowohl homo- als auch heteronukleare Wechselwirkungen unterdrückt werden. Darüber hinaus unterdrückt die vorgeschlagene Pulssequenz effektiv homonukleare Wechselwirkun­ gen, wodurch sie im Zusammenhang mit einer Vielzahl von Kernsorten verwendet werden kann. Im einzelnen wird während des Präparationsintervalls die erste Kernart mit einem Präparationspuls angeregt und während des Evolutionsintervalls zur ho­ monuklearen Entkopplung zwischen den Kernen der ersten Sorte (i. a. Protonen) mit einer sog. BLEW-12-Sequenz (Phasen X Y -X -X -Y -X X Y X X -Y -X) bestrahlt, wäh­ rend zur Entkopplung zwischen den beiden Kernsorten (i. a. ¹H-¹³C) und der Kerne der zweiten Kernsorte (i. a. ¹³C-¹³C) die zweite Kernart mit einer Pulssequenz aus 12 90°-HF-Pulsen einer vorgegebenen Phasenabfolge bestrahlt wird, der sog. BB-12- Sequenz (-X Y -X X Y -X -X Y X -X Y -X). Weil dadurch sowohl die homo- als auch die heteronuklearen Wechselwirkungen entkoppelt sind, können sich die Protonen frei nur unter dem Einfluß ihrer chemischen Verschiebung entwickeln, was zu einer verbesserten Auflösung führt. Nach dem Evolutionsintervall werden zwei getrennte Pulse (θ und ϕ Pulse) auf die Protonen eingestrahlt um zum Zweck der späteren Be­ obachtung die während des Evolutionsintervalls gebildete Magnetisierung in die Ebene senkrecht zum Magnetfeld zu kippen. Der θ-Puls ist ein 90°-Puls und der ϕ- Puls hat einen Winkel von 63° (mit -Y-Phase). Auf diese beiden Pulse folgt die sog. WIM-24 ("Windowless Isotropic Mixing) Sequenz, die über die direkte heteronukleare Dipolwechselwirkung Kernpolarisation selektiv von den Protonen auf direkt­ gekoppelte Kohlenstoffkerne überträgt. Die WIM-24 Sequenz unterdrückt zudem die chemischen Verschiebungen der Protonen und ¹³C-Kerne sowie die Proton-Proton- und ¹³C-¹³C homonuklearen Kopplungen, beläßt jedoch die Protonen-¹³C heteronu­ kleare Kopplung. Die WIM-24 Sequenz besteht aus einer auf die Protonen einge­ strahlten 24-Puls-Sequenz und einer entsprechenden simultan auf die ¹³C-Kerne eingestrahlten 24-Puls-Sequenz. Die Sequenz ist Stand der Technik und detailliert im Artikel "Heteronuclear Correlation Spectroscopy in Rotating Solids" von P. Caravatti, L. Braunschweiler und R. R. Ernst in Chem. Phys. Letters 100, No. 4, pp 305-310 (1983) beschrieben.

Letztlich wird während des Detektionsintervalls ein Dauerstrichsignal (CW) mit relativ hoher Intensität auf der Protonenfrequenz eingestrahlt, um auf bekannte Weise die Protonen von den ¹³C-Kernen zu entkoppeln und der ¹³C-FID wird gemessen.

Während des gesamten Experiments wird standardmäßig die Festkörperprobe um den "Magischen Winkel" rotiert um Verbreiterungen durch die Anisotropie der chemi­ schen Verschiebung zu verringern.

In der eingangs erwähnten EP 0 481 256 A1 (US 5,117,186) wird auch darauf hinge­ wiesen, daß anstelle der WIM-24-Sequenz auch andere Pulssequenzen aus dem bekannten Stand der Technik verwendet werden können, um während des Mischin­ tervalls die selektive Kreuzpolarisation zu bewirken und gleichzeitig die homonuklea­ re Dipolwechselwirkung nach wie vor zu unterdrücken. Die WIM-24 Sequenz sei zwar bevorzugt, aber eine phasen- und frequenzgeschaltete Lee-Goldburg-Sequenz (FSLG) in Verbindung mit einer phasengeschalteten ¹³C-Sequenz könne eine ähnlich wirksame selektive Kreuzpolarisation während des Mischintervalls bewirken. Diese Mischmethode ist detailliert beschrieben im Artikel "Frequency-Switched Pulse Se­ quences: Homonuclear Decoupling and Dilute Spin NMR in Solids" von A. Bielecki, A. C. Kolbert und M. H. Levitt in Chem. Phys. Letters 155, Nos. 4, 5, pp. 341 (1989).

Das aus EP 0 481 256 A1 (US 5,117,186) bekannte Verfahren hat allerdings den Nachteil, daß die während des Evolutionsintervalls eingesetzte BLEW-12-Sequenz verhältnismäßig lang sein muß. I. a. ist sie wegen der sonst gefährdeten Durch­ schlagfestigkeit des NMR-Probenkopfs auf über 36 Mikrosekunden beschränkt. Dies beschränkt wiederum die möglichen Spinraten der Probenrotation um den magi­ schen Winkel, da die Umlaufzeit groß gegen die Zeitdauer der BLEW-12-Sequenz sein muß. In der Praxis sind dadurch die Spinraten auf unter 5 kHz beschränkt, wäh­ rend gängige Probenköpfe derzeit bereits Spinraten um 15 kHz erlauben.

Der Artikel J. Magn. Res. A 120, S. 274-277 (1996) beschreibt ein Verfahren, bei dem auch ohne zusätzliche Verschmälerung des Protonenspektrums durch eine Pulssequenz bei hohen Feldern bereits Anzeichen einer Auflösung der chemischen Verschiebung erhalten werden können.

Der Artikel J. Magn. Res. A 121, S. 114-120 (1996) beschreibt ein Verfahren der bildgebenden NMR, in dem die linienverschmälernde Wirkung der FSLG-Sequenz ausgenutzt wird, um eine Scheibenselektion zu erzielen.

In der deutschen Patentschrift DE 196 48 391 C1 werden in einem dipolaren HETCOR-Experiment im Evolutionsintervall die Kernspins bezüglich der Dipolkopp­ lung durch eine im Protonenfrequenzband eingestrahlte FSLG-HF-Pulssequenz ent­ koppelt. Da diese Sequenz im Vergleich mit den bisher gebräuchlichen sehr kurz sein kann und keine Hochfrequenz gleichzeitig im Bereich der S-Kerne eingestrahlt werden muß, eignet sich das Verfahren insbesondere für hohe Rotationsgeschwin­ digkeiten der Probe und hohe Magnetfelder, wo es eine entscheidende Verbesse­ rung der Auflösung bewirkt.

Alle Kohlenstoff-Protonen Korrelationsexperimente, über die bisher berichtet wurde, basieren auf einem Magnetisierungstransfer durch dipolare Kopplungen. Verschie­ dene Schemata zum Polarisationstransfer sind vorgeschlagen und im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit und Abstandsselektivität untersucht worden, z. B. Experimente von Hartmann-Hahn- Kreuzpolarisation bis WIM (windowless isotropic mixing) Multi­ puls-Sequenzen. Da all diese Experimente Wechselwirkungen durch den Raum aus­ nutzen, bleibt eines der Hauptprobleme, die genügende Selektivität des Magnetisie­ rungstransfers sicherzustellen, damit das Spektrum nutzbringend interpretiert werden kann. D. h., es soll nur Magnetisierung von Protonen zu direkt gebundenen Kohlen­ stoffen übertragen werden, und eben nicht zu Kohlenstoffkernen, die weiter entfernt sind. Während Korrelationssignale zwischen nicht gebundenen Paaren wertvolle In­ formationen über die Konformation eines Moleküls liefern, komplizieren sie doch die Analyse eines zweidimensionalen Spektrums erheblich.

Es besteht daher der Bedarf nach einem Verfahren der eingangs genannten Art, das einen verbessert selektiven Magnetisierungstransfer gestattet.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß während des Präparationsintervalls die erste Kernart mit CP-Hochfrequenzpulsen im ersten Frequenzband zur Übertragung der Kernmagnetisierung auf die zweite Kernart bestrahlt wird, und die zweite Kernart in einem zweiten Frequenzband mit mindestens einem Anregungs-Hochfrequenzpuls bestrahlt wird, daß das Mischintervall in zwei Teilintervalle aufgespalten ist, von de­ nen das erste zwischen Präparations- und Evolutionsintervall liegt und das zweite zwischen Evolutionsintervall und Detektionsintervall, und daß in beiden Mischteilin­ tervallen die Misch-Hochfrequenzpulse eine sog. FSLG-Sequenz bilden mit zwei aufeinanderfolgenden, um 180° gegeneinander phasenverschobenen (X, -X), breit­ bandigen Evolutions-Hochfrequenzpulsen, deren Zentralfrequenzen der des Präpa­ rations-Hochfrequenzpulses gegenüber in entgegengesetzte Richtungen verschoben sind und die jeweils eine Drehung der Kernmagnetisierung der ersten Kernart um etwa 294° bewirken, daß im Zentrum des Evolutionsintervalls die zweite Kernart einem breitbandigen 180°-Refokussierungspuls mit einer Zentralfrequenz in der Mitte des Kernresonanzspektrums der zweiten Kernart der Probe ausgesetzt wird, wo­ durch ein Korrelationsspektrum der beiden Kernarten erzeugt wird, das die chemi­ schen Verschiebungen der beiden Kernarten für direkt gebundene Paare über skala­ re Kopplung miteinander korreliert.

Hierdurch wird eine zweidimensionale Protonen-Kohlenstoff Korrelationstechnik vor­ gestellt, die auf einem Polarisationstransfer durch heteronukleare J-Kopplung basiert und im folgenden MAS-J-HMQC genannt werden soll. In Analogie zum bekannten HMQC-Experiment in der Lösungs-NMR nutzt die Sequenz heteronukleare Multi­ quantenkohärenzen, um eine Korrelation zwischen isotropen chemischen Verschie­ bungen direkt gebundener Paare von Kernen herzustellen.

Die Aufgabe wird dadurch vollständig gelöst.

Es hat sich gezeigt, daß diese Technik empfindlich ist, und daß skalare Kopplungen eine sehr viel selektivere Methode zur Korrelation darstellen als dipolare Kopplun­ gen. Das Experiment kann bei hohen Rotationsfrequenzen durchgeführt werden. Unter der Voraussetzung, daß das Kohlenstoffspektrum zugeordnet ist, liefert das Experiment eine eindeutige Identifikation der Protonen chemischen Verschiebungen in Festkörpern.

Die Verwendung der an sich in anderem Zusammenhang bekannten phasen- und frequenzverschobenen Lee-Goldburg-Sequenz (FSLG) im Evolutionsintervall ver­ kürzt die entsprechende Zykluszeit entscheidend. Ein typischer Wert ist etwa 10 Mi­ krosekunden für die Basis-FSLG-Sequenz, wobei noch kürzere Zeiten durchaus vor­ stellbar sind. Dadurch kann aber die maximale Spinrate heutiger Probenköpfe voll ausgenutzt werden. 15 kHz stellen keinerlei Problem dar.

Als Folge davon kann das Verfahren problemlos in Magneten höherer Feldstärke angewendet werden, ohne daß Rotationsseitenbänder störend in Erscheinung treten.

Dadurch wird auch eine höhere spektrale Dispersion erreicht, was die Auflösung ins­ besondere in der F1-Dimension (erste Kernart) erhöht.

Höhere Spinraten entkoppeln die ersten und zweiten Kernsorten (i. a. I- und S-Spins genannt, meistens, aber nicht ausschließlich Protonen und ¹³C) sowohl voneinander als auch untereinander bereits recht effizient, so daß an die Effizienz der Entkopp­ lungssequenz im Evolutionsintervall (in diesem Fall FSLG) geringere Ansprüche ge­ stellt werden. Dadurch wird das Experiment unempfindlicher gegen Fehljustierungen.

Im eingangs erwähnten Verfahren mußten im Evolutionsintervall gleichzeitig eine BLEW-12 und eine BB-12-Sequenz ausgeführt werden, um die beiden Spinsorten zu entkoppeln. Dies ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht mehr nötig, da dies bereits durch die hohe Spinrate erreicht wird.

Da die gleichzeitige Entkopplung nicht mehr nötig ist, ergibt sich als weiterer Vorteil, daß mit geringerer Gefahr für den Probenkopf höhere Entkopplungsfelder einge­ strahlt werden können, da jetzt nur noch ein HF-Feld anliegt und da Spannungs­ durchschläge bei gleichzeitiger Anwendung mehrere HF-Felder aufgrund sich addie­ render Spannungen wahrscheinlicher werden).

Es hat sich auch experimentell gezeigt, daß die Effizienz der erfindungsgemäß im Evolutionsintervall verwendeten FSLG-Sequenz bei der Entkopplung der Spins der ersten Kernart ("häufige Spins, meist Protonen oder ¹⁹F) jeder anderen Sequenz (BLEW-12 oder BR-24) überlegen ist, so daß die Auflösung der chemischen Ver­ schiebung dieser Spins wesentlich besser ist. In der Praxis ergibt sich eine Auflö­ sung, die auch in einem gut justierten BR-24-Experiment zur Beobachtung der "häu­ figen" Spins nicht zu erreichen ist (für diesen Zweck gilt die BR-24 bisher als beste Sequenz).

Die Abwandlung des Verfahrens zum sog. "Spectral Editing" (selektive Messung von seltenen Spins mit verschiedenem "Protonierungsgrad" ähnlich der DEPT-Sequenz in Lösungen) werden damit möglich.

Das Verfahren läßt sich leicht in ein 3D-Verfahren integrieren.

Vorzugsweise wird während des Evolutionsintervalls nur der 180°- Refokussierungspuls im Frequenzband der zweiten Kernart eingestrahlt. Er kann be­ züglich Amplitude und Dauer in unkritischer Weise so eingestellt werden, daß Span­ nungsdurchschläge im Probenkopf sicher vermieden werden.

Vorzugsweise ist die erste Kernart ¹H und die zweite Kernart ¹³C. Dies sind für viele Materialien, insbesondere im organischen Bereich, die interessantesten "häufigen" und "seltenen" Kerne.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden bei der n-maligen, vorzugsweise 512- maligen, Durchführung der Pulssequenz im p-ten Evolutionsintervall (1 ≦ p ≦ n) die beiden Evolutions-Hochfrequenzpulse (p-1)-mal nacheinander eingestrahlt. Dadurch wird sukzessive inkrementiert.

Vorzugsweise wird zwischen dem ersten Mischteilintervall und dem Evolutionsinter­ vall im Frequenzband der ersten Kernart drei Hochfrequenzpulse eingestrahlt wer­ den, von denen der erste die Kernmagnetisierung der ersten Kernart um etwa 54° (Θ_m) um eine Achse senkrecht zum Magnetfeld (-Y) dreht, gefolgt von einem dage­ gen phasenverschobenen (ϕ₂) 90°-Puls, gefolgt von einem Hochfrequenzpuls, der die Kernmagnetisierung der ersten Kernart um etwa 54° (Θ_m) um eine Achse senk­ recht zum Magnetfeld (+X) dreht und daß zwischen dem Evolutionsintervall und dem zweiten Mischteilintervall im Frequenzband der ersten Kernart drei Hochfrequenzpul­ se eingestrahlt werden, von denen der erste die Kernmagnetisierung der ersten Ker­ nart um etwa 54° (Θ_m) um eine Achse senkrecht zum Magnetfeld (-X) dreht, gefolgt von einem dagegen phasenverschobenen (ϕ₃) 90°-Puls, gefolgt von einem Hochfre­ quenzpuls, der die Kernmagnetisierung der ersten Kernart um etwa 54° (Θ_m) um eine Achse senkrecht zum Magnetfeld (+Y) dreht. Dies ist ein besonders vorteilhaftes, aber nicht das einzig mögliche, Mischverfahren.

Ein bevorzugtes Verfahren verwendet eine TPPM-Sequenz (Two Pulse Phase Mo­ dulated) während des Detektionsintervalls, durch die die Kernspins der ersten Ker­ nart entkoppelt werden. Diese Entkopplung ist beschrieben im Artikel von A. E. Ben­ nett, C. M. Rienstra, M. Auger, K. V. Lakshmi und R. G. Griffin in der Zeitschrift J. Chem. Phys. 103 (1995) 6951 ff, sowie im Artikel J. Magn. Res. A 120, S. 274-277 (1996).

Es ist weiterhin bevorzugt, daß zwischen dem p-ten Detektionsintervall und dem (p + 1)-ten Präparationsintervall ein Warteintervall eingefügt wird, das länger ist als die Relaxationszeiten T₁ der beiden Kernarten. Dadurch sind vor der folgenden Sequenz ansonsten störende Restmagnetisierungen weitgehend abgeklungen.

Zur weiteren Eliminierung von Phasenfehlern ist es vorteilhaft, daß die Phasen der Anregungs-Hochfrequenzpulse in den Intervallen entsprechend einer CYCLOPS- Folge variiert werden. Die Cyclops-Folge ist beispielsweise im Buch "A Handbook of Nuclear Magnetic Resonance" von Ray Freeman, Longman Scientific & Technical (1990), S. 151-156 beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft bei Rotationsfrequenzen der Probe um den magischen Winkel, die größer sind als 10 kHz.

Die obengenannten Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens treten besonders hervor, wenn die Dauer der beiden Evolutions-Hochfrequenzpulse kürzer ist als je­ weils 15 Mikrosekunden.

Es ist weiter bevorzugt, daß die Frequenzverschiebung der Zentralfrequenzen der beiden Evolutions-Hochfrequenzimpulse gegen die des Präparationspulses symme­ trisch zwischen ± 40 kHz und ± 100 kHz liegt. Damit wurden experimentell die besten Resultate erzielt, insbesondere wenn die Frequenzverschiebung der Zentralfrequen­ zen der beiden Evolutions-Hochfrequenzimpulse phasenkontinuierlich erfolgt.

Durch die Unkompliziertheit der Sequenzen, ihre Unempfindlichkeit gegen Fehljustie­ rungen und durch das verbesserte Auflösungsvermögen bietet es sich an, daß das Verfahren als Teil eines dreidimensionalen Spektroskopieverfahrens verwendet wird.

Das Verfahren läßt sich vorteilhaft zum Editieren von Kernresonanzspektren (Spec­ tral Editing) verwenden. Die Spektrenedition ist ausführlich im Buch "A Handbook of Nuclear Magnetic Resonance" von Ray Freeman, Longman Scientific & Technical (1990), S. 137-141 sowie in dem Artikel von D. Burum and A. Bielecki, J. Magn. Res. 95, S. 184 ff. (1991) beschrieben.

Weitere Details der Erfindung sind durch die folgenden Abbildungen offenbart und können diesen entnommen werden. Offensichtlich können diese Abbildungen einzeln oder in Kombination Verwendung finden ohne den Rahmen der Erfindung zu verlas­ sen.

Es zeigen:

Fig. 1a auf einer horizontalen Zeitachse die aufeinanderfolgenden Zeitintervalle (auch "Perioden" genannt) einer Sequenz einer bevorzugten Ausfüh­ rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 1b berechneten Kurven der Entwicklung der beobachtbaren Magnetisierung entsprechend der Kohlenstoff-Multiplizität als Funktion der Wartezeit τ im "idealen" Fall von Flüssigkeiten;

Fig. 1c berechneten Kurven der Entwicklung der beobachtbaren Magnetisierung entsprechend der Kohlenstoff-Multiplizität als Funktion der Wartezeit τ in festen Proben mit einer Linienbreite von einigen Hertz (15 bis 50 Hz);

Fig. 2 MAS-J-HMQC Spektrum von Campher;

Fig. 3 Entwicklung der Signalintensität als Funktion der Wartezeit τ für drei ver­ schiedene Gruppen;

Fig. 4 Vergleich der Effektivitäten des Einbindungs- und geminalen Transfers im MAS-J-HMQC Experiment (a) und im dipolaren CP-HETCOR Experiment (b), (c) und (d) zeigen das Verhältnis der Mechanismen in den beiden Ex­ perimenten;

Fig. 5 zwei heteronukleare Korrelations-Spektren von L-Tyrosin in natürlicher Häufigkeit, (a) MAS-J-HMQC-Experiment, (b) dipolares HETCOR-Experi­ ment;

Fig. 6 MAS-J-HMQC-Spektrum des Tripeptides Boc-Ala-Ala-Pro-O-Bzl;

Fig. 7: Zwei-dimensionales MAS-J-HMQC-Spektrum von Cholesterylacetat in natürlicher Häufigkeit.

Fig. 1a zeigt mit einer horizontalen Zeitachse die aufeinanderfolgenden Zeitintervalle (auch "Perioden" genannt) einer Sequenz einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die gezeigte Sequenz wird im Verfahren n-mal (im Beispiel 256) wiederholt, wobei das Präparationsintervall, die Mischteilintervalle und das Detektionsintervall jeweils ungeändert bleiben, der Inhalt des Evolutionsintervalls jedoch inkrementiert wird, d. h. in der ersten Sequenz ist das Intervall nicht vorhan­ den, dann hat es den in Fig. 1a gezeigten Inhalt und bei den darauffolgenden Se­ quenzen wird der Inhalt jeweils noch einmal hinzugefügt, so daß in der 256. Sequenz die beiden Evolutionspulse 255-mal unmittelbar nacheinander eingestrahlt werden.

Die bevorzugte Pulssequenz für das MAS-J-HMQC-Experiment ist in Fig. 1a abge­ bildet. Nach der Kreuzpolarisation von Protonen (den I-Spins) auf Kohlenstoff (den S- Spins) entwickelt sich Kohlenstoffmagnetisierung während der Wartezeit τ unter dem isotropen Hamilton-Operator der skalierten heteronuklearen J_C,H Kopplung. In der Tat werden in dieser Zeit die Protonen-Protonen Dipolkopplungen durch eine frequenz­ geschobene Lee-Goldburg-Entkopplung (FSLG) beseitigt, wohingegen die verblei­ benden inhomogenen (anisotropen) Wechselwirkungen, d. h. die chemische Ver­ schiebung und heteronukleare Kopplungen durch schnelle Rotation um den magi­ schen Winkel in ihre isotrope Komponenten gemittelt werden. Dadurch bleiben nur die isotrope chemische Verschiebung und die skalare J-Kopplung übrig. Für ein ko­ valent gebundenes Paar von ¹H-¹³C-Spins führt die Kohlenstoffmagnetisierung zu einer Inphase- (S_x) und einer Antiphase(2I_zS_y)-Kohärenz in bezug auf die gebunde­ nen Protonen. Ein 90°-Puls, der auf die Protonen angewandt wird, transformiert die Antiphase-Kohlenstoff-Kohärenz in eine heteronukleare Doppelquanten-Kohärenz, die sich während t₁ nur unter dem Effekt der chemischen Verschiebung der Protonen entwickelt. Genauer gesagt, sind die heteronuklearen Multiquanten-Kohärenzen (MQ) unempfindlich gegenüber heteronuklearen Kopplungen und die Proton-Proton- Dipolkopplungen werden durch FSLG-Entkopplung beseitigt. Die Entwicklung von chemischen Verschiebungen des Kohlenstoffs während τ und t₁ wird durch einen 180°-Puls in der Mitte der Pulssequenz refokussiert. Am Ende der Evolutionsperiode t₁ wird die MQ-Kohärenz durch einen zweiten 90°-Puls wieder zurück in Antiphase- Kohärenz verwandelt und nach einer zweiten Periode τ in beobachtbare Inphase- Kohärenz. Der erste 54.7°-("magische") Puls am Ende der ersten Wartezeit τ und der dritte 54.7°-("magische") Puls am Ende der Evolutionsperiode t₁, die jeweils auf Protonen angewandt werden, sollen die gekippte Präzession um das effektive Feld (parallel zum magischen Winkel) unter der FSLG-Entkopplung kompensieren und die Protonenmagnetisierung in die z-Achse des Laborkoordinatensystems rotieren. In der gleichen Weise soll der zweite "magische" Puls, der vor der t₁ Evolutionsperiode angewandt wird, die Protonenmagnetisierung senkrecht zum effektiven Feld bringen, wohingegen der vierte "magische" Puls diese von der z-Achse in die Richtung des effektiven Feldes rotiert. Während der Aufnahmezeit wird heteronuklear unter Ver­ wendung von TPPM entkoppelt. Aufgrund der FSLG-Sequenz werden die heteronu­ klearen Kopplungen sowie die chemischen Verschiebungen der Protonen in ω₁, mit einem Faktor 1/√3 skaliert. Für CH₂- oder CH₃-Fragmente werden Kohärenzen höhe­ rer Ordnung am Ende der Wartezeit τ generiert, d. h. heteronukleare Drei- oder Vier­ quanten-Kohärenzen. Dennoch selektiert der Phasenzyklus der Pulssequenz, die in Fig. 1a skizziert ist, heteronukleare Doppelquantenkohärenz. Man beachte, daß das MAS-J-HMQC Experiment analog dem bekannten HMQC-Experiment in der Lö­ sungs-NMR wirkt.

Entsprechend der Kohlenstoff-Multiplizität, entwickelt sich die beobachtbare Magne­ tisierung unterschiedlich als Funktion der Wartezeit τ. Die berechneten Kurven sind in den Fig. 1b und 1c gezeigt.

Im "idealen" Fall von Flüssigkeiten (Fig. 1b), geschieht die maximale Anregung von heteronuklearer Doppelquantenkohärenz (DQ) für τ = 1/√(J_CH) für eine CH- oder CH₃- Gruppe, und für τ = 1/√(2J_CH) für eine CH₂-Gruppe. In festen Proben, bei denen eine Linienbreite von einigen Hertz (15 bis 50 Hz) in Betracht gezogen werden muß, wird die Signalintensität durch transversale Relaxation stark abgeschwächt (Fig. 1c). Wenn die Anwendung einer FSLG-Sequenz während der Periode 2 τ effizient genug ist, um Linienbreiten zu erhalten, die vergleichbar mit der skalierten heteronuklearen skalaren Kopplung sind (Δ = 30 Hz), dann sollte ein nennenswertes Signal beobachtbar sein (eine J_CH-Kopplung von 125 Hz, die für einen sp³ Kohlenstoff in Kohlenwasser­ stoffen typisch ist, gibt eine effektive skalierte Kopplung von 72 Hz unter FSLG- Entkopplung). Die optimale Wartezeit, die eine Anregung von heteronuklearen DQ Kohärenzen für alle CH-Gruppen erlaubt, liegt bei ungefähr 2 ms.

Die Proben (in natürlicher Häufigkeit) von Campher, Tyrosin und Cholesterylacetat wurden alle von der Firma Sigma gekauft und ohne weiteres Umkristallisieren ver­ wendet. Das Tripeptid Boc-Ala-Ala-Pro-O-Bzl (Boc steht für tert-Butoxycarbonyl und Bzl für Benzyl) wurde im Labor synthetisiert und aus Di-Isopropyloxid umkristallisiert. Ungefähr 20 mg wurden für jede Probe verwendet. Die Experimente wurden auf ei­ nem Bruker DSX 500 Spektrometer (mit 500 MHz Protonen-Frequenz) mit einem 4 mm Tripelresonanz-MAS-Probenkopf durchgeführt. Das Probenvolumen wurde auf ca. 25 µl in der Mitte des Rotors beschränkt, um die Homogenität des Radiofre­ quenzfeldes zu erhöhen. Die Amplitude des Radiofrequenzfeldes wurde auf 100 kHz während beider Wartezeiten τ (FSLG-Entkopplung) und während der Datenaufnah­ me (TPPM-Entkopplung) eingestellt. Die Frequenzverschiebungen der FSLG- Entkopplung gegenüber der Mitte des Protonenspektrums wurden sorgfältig über die Spektren von Campher und L-Alanin in natürlicher Häufigkeit bestimmt, für die die Multiplettfeinstrukturen aufgrund der skalaren J_CH Kopplungen aufgelöst sein müs­ sen. Für die Kreuzpolarisation wurde die Amplitude des Radiofrequenzfeldes für Kohlenstoff auf 80 kHz eingestellt, während für Protonen ein Radiofrequenzfeld ge­ wählt wurde, das in seiner Amplitude linear von 70 bis 140 kHz verändert wurde. Hiermit wurde maximales Signal erhalten. Ein Phasenzyklus mit 32 Schritten wurde verwendet. Die Warteperiode τ wurde mit der Rotorperiode synchronisiert. Quadra­ turdetektion in ω₁ wurde durch die States-TPPI Methode erreicht.

Fig. 2 zeigt das MAS-J-HMQC Spektrum von Campher. Die Zuordnung des 1D Spektrums wurde bereits veröffentlicht (Benn R., Grondey H., Brevard C., Pagelot A., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1988, 102-103).

Fig. 3 zeigt die Entwicklung der Signalintensität als Funktion der Wartezeit τ für drei verschiedene Gruppen. Signale von quaternären Kohlenstoffen sollten im Prinzip unterdrückt werden, da sie nicht direkt zu Protonen gebunden sind. Dennoch beob­ achten wir ein nennenswertes Signal, dessen Entwicklung als Funktion der Wartezeit τeiner kleinen J_CH Kopplung von 0.9 Hz entspricht. Der Wert dieser Kopplung ent­ spricht der Größenordnung einer geminalen ²J_CH Kopplung, die in der Literatur be­ schrieben ist. Für lange Wartezeiten sind diese ²J_CH Kopplungen verantwortlich für die Generierung von heteronuklearen MQ-Kohärenzen, auch wenn sie sehr klein sind. Für die CH₃-Gruppe (b in Fig. 3) und die CH Gruppe (c in Fig. 3) sind die expe­ rimentellen Daten in guter Übereinstimmung mit den theoretischen Vorhersagen. Die CH₃-Gruppe ist isoliert von anderen Protonen, so daß Weitbereichs-J_CH-Kopplungen die Entwicklung der Signalintensität nicht beeinflussen. Um die Daten für die CH₂- Gruppe richtig anpassen zu können, müssen eine Einbindungs-¹J_CH-Kopplung und gleichzeitig zwei verschiedene geminale ²J_CH-Kopplungen berücksichtigt werden. Solch ein Modell paßt die Daten besser an als ein Modell, das nur eine ¹J_CH- Kopplung in Betracht zieht. Die Werte für die angepaßten Parameter sind: ¹J_CH2 = 146 Hz, ²J₁ = 8.2 Hz, ²J₂ = 5.5 Hz und T₂ ^CH2 = 105 ms, J_CH3 = 144.5 Hz und T₂ ^CH3 = 146 ms. Die Werte der Einbindungskopplung J_CH sind in guter Übereinstimmung mit den experimentellen Kopplungen, die im Kohlenstoffspektrum unter FSLG Entkopp­ lung gemessen werden können (78 Hz und 74 Hz für die Signale 4 bzw. 10).

Fig. 4 zeigt einen Vergleich der Effektivitäten des Einbindungs- und geminalen Transfers im MAS-J-HMQC-Experiment (a) und im dipolaren CP-HETCOR- Experiment (b). Im MAS-J-HMQC-Experiment ist der Beitrag zur Signalintensität durch geminale (Zweibindungs-)-²J_CH-Kopplungen nicht so bedeutend wie im dipola­ ren HETCOR-Experiment. (c) und (d) in Fig. 4 zeigen das Verhältnis der Mechanis­ men in den beiden Experimenten. Man beachte, daß im MAS-J-HMQC-Experiment die Transferamplitude oszilliert, da die J_CH-Kopplung orientierungsunabhängig ist, wodurch sich alle Kristallite identisch verhalten. Im dipolaren HETCOR-Experiment hingegen findet der Transfer von Protonen zum Kohlenstoff durch orientierungsab­ hängige dipolare Kopplungen statt und wird durch MAS moduliert (die einzelnen Kri­ stallite ändern ihre Orientierung zum Magnetfeld was eine Veränderung der hetero­ nuklearen Dipolwechselwirkung hervorruft). Daher stammt das Signal von einer Mit­ telung über alle möglichen Orientierungen. Für ein Zwei-Spin-System (b in Fig. 4) kann der dipolare Transfer mit einem gedämpften Oszillator verglichen werden. Als Ausweg wurden auf Dipolwechselwirkungen basierende Kohärenztransfer-Schemata wie z. B. WIM-24 vorgeschlagen. Um aber selektiv zu sein, müssen diese Transfer­ schemata mit der Rotorperiode synchronisiert werden, was bei hohen Rotationsraten Probleme bereitet. Keines der Spektren, die wir erhalten haben, zeigen Korrelationen von Protonen zu quaternären Kohlenstoffen oder von Kohlenstoffen zu nicht direkt gebundenen Protonen, was die Selektivität des Experimentes unterstreicht.

Weiterhin ist die Empfindlichkeit des dipolaren HETCOR abhängig von der Größe der heteronuklearen Dipolkopplungen, die üblicherweise unterschiedlich für die einzelnen Gruppen des Moleküls sind. Insbesondere wenn einige Gruppen in flexibleren Berei­ chen des Moleküls sind als andere, d. h. kleinere Dipolkopplungen haben, bedeutet eine kurze CP-Kontaktzeit um Selektivität zu erzielen, daß ein effizienter Polarisati­ onstransfer verhindert wird und einige Kreuzsignale im 2D-Spektrum fehlen. Im Ge­ gensatz dazu sind die J-Kopplungen erheblich homogener für die gesamte Probe, und die Empfindlichkeit des MAS-J-HMQC-Experimentes ist unabhängig von Beweg­ lichkeiten oder der Konformation des Moleküls. Vielmehr ist die Empfindlichkeit des Experimentes bestimmt durch die Linienbreite im Kohlenstoff-Spektrum unter Proto­ nen-FSLG-Entkopplung.

Der Unterschied in der Selektivität der beiden Experimente wird besonders offen­ sichtlich in Fig. 5, die zwei heteronukleare Korrelations-Spektren von L-Tyrosin in natürlicher Häufigkeit zeigt. Einmal (a) wurde das MAS-J-HMQC-Experiment ver­ wendet, einmal (b) das dipolare HETCOR-Experiment. Die Zuordnung des 1D- CP/MAS-Spektrums, die in Fig. 5 oben eingetragen ist, wurde an einer voll ange­ reichterten Probe von L-Tyrosin mit Hilfe des INADEQUATE-Experimentes getroffen. Das dipolare HETCOR-Experiment der voll angereicherten Probe von L-Tyrosin ist bereits publiziert. Im MAS-J-HMQC-Experiment zeigen die CH-Gruppen (Signale 2, 5, 6, 7 und 8) wie erwartet nur eine einzige Korrelation zu ihren direkt gebundenen Protonen, die Signale der quaternären Kohlenstoffe zeigen keine Korrelationen. Kohlenstoff 3 (eine CH₂ Gruppe) korreliert mit Protonen bei zwei verschiedenen chemischen Verschiebungen, die somit den beiden diastereotopen Protonen zuge­ ordnet werden können. Im dipolaren HETCOR werden viele zusätzliche Signale sichtbar, die eindeutig aufgrund Weitbereichstransfers zwischen nicht direkt gebun­ denen Paaren von Heterokernen entstanden sind. Damit geht die Auflösung des Protonenspektrums verloren. Selbst wenn diese Signale für strukturelle Studien sehr nützlich sein können, da sie die räumliche Nähe zwischen Heterokernen widerspie­ geln, komplizieren sie das Korrelationsspektrum erheblich und erschweren die Zu­ ordnung der Signale der an Kohlenstoff gebundenen Protonen. Im MAS-J-HMQC- Experiment hingegen ist diese Zuordnung sofort und eindeutig durchzuführen, da die Auflösung im Protonenspektrum deutlich verbessert ist.

Natürlich kann die Selektivität des dipolaren HETCOR Experimentes verbessert wer­ den, indem kürzere Kontaktzeiten verwendet werden. Dies ginge jedoch zu Lasten eines signifikanten Verlustes an Signalintensität, die selbstverständlich ein wirkliches Problem für Proben mit natürlicher Häufigkeit darstellt. Unter unseren experimentel­ len Bedingungen (Kontaktzeit für die Kreuzpolarisation von 300 µs beim dipolaren HETCOR, und eine Wartezeit τ von 1.3 ms beim MAS-J-HMQC-Experiment) fanden wir, daß die Empfindlichkeit der beiden Experimente vergleichbar war. Für längere Mischzeiten (τ-Werte größer als 2 ms) erscheinen Kreuzsignale der quaternären Kohlenstoffe (Signale 1 und 9) im MAS-J-HMQC-Spektrum (Daten sind hier nicht gezeigt). Die Entwicklung der Intensitäten dieser Signale als Funktion von τ war in Übereinstimmung mit einem ²J_CH-Kopplungstransfer über zwei Bindungen.

Fig. 6 zeigt das MAS-J-HMQC-Spektrum des Tripeptides Boc-Ala-Ala-Pro-O-Bzl. Wie bereits erwähnt erlaubt dieses Experiment eine eindeutige Zuordnung des Protonen­ spektrums und die Bestimmung der chemischen Verschiebungen der Protonen, vor­ ausgesetzt das Kohlenstoffspektrum ist zugeordnet. Im Falle dieses Tripeptides ist die Zuordnung des Kohlenstoffspektrums unbekannt. Selbst wenn eine Vielzahl an Methoden zur Charakterisierung hochaufgelöster MAS-Spektren von verdünnten Kernen in markierten Verbindungen vorgeschlagen wurden, bleibt die Zuordnung des Kohlenstoffspektrums bei Proben in natürlicher Häufigkeit eine schwierige Aufgabe. In solchen Fällen bietet die Korrelation mit der Protonendimension eine zusätzliche Informationsquelle und hilft, das Kohlenstoffspektrum zuzuordnen. Für das Beispiel des Tripeptides können wir bereits zweifelsfrei sagen, daß die vier Kohlenstoffreso­ nanzen, die nicht zu chemischen Verschiebungen von Protonen korreliert sind (77, 135, 165 und 171 ppm), quaternäre Kohlenstoffe sind. In der gleichen Weise lassen sich die drei Kohlenstoffresonanzen bei 18, 19 und 28 ppm, die jeweils mit einer chemischen Verschiebung der Protonen um ca. 1 ppm korreliert sind, den drei Me­ thylgruppen zuordnen.

Abschließend haben wir das MAS-J-HMQC-Experiment auf Cholesterylacetat ange­ wendet. Diese große Verbindung mit 30 Kohlenstoffen kristallisiert mit zwei Molekü­ len je Einheitszelle. Einmal mehr ist die Auflösung des Protonenspektrums exzellent. Dies demonstriert, daß das Experiment gut geeignet ist, chemische Verschiebungen von Protonen im Festkörper zu bestimmen. Man beachte, daß die Dispersion der chemischen Verschiebung in der Protonendimension sehr klein ist, ein dipolares HETCOR Spektrum von dieser Probe wäre sicherlich zu komplex, um nützlich zu sein.

Es wurde gezeigt, daß skalare J_CH-Kopplungen verwendet werden können, um hete­ ronukleare Multiquanten Kohärenzen in herkömmlichen, organischen Festkörpern zu erzeugen. Ein neues zweidimensionales Kohlenstoff-Protonen-Korrelations- Experiment wurde vorgeschlagen, das Kreuzsignale zwischen Paaren von gebunde­ nen Heterokernen liefert. (Man beachte, daß diese Technik nicht in Anwesenheit homonuklearer C-C-skalarer-Kopplungen funktioniert, d. h., in mehrfach markierten Systemen). Im Gegensatz zu kürzlich vorgestellten heteronuklearen Korrelationsex­ perimenten, die auf dipolaren Kopplungen basierten, ist diese Technik hoch selektiv und erlaubt die zweifelsfreie Identifizierung von Protonen chemischen Verschiebun­ gen. Das Experiment wurde auf Modellverbindungen wie einem Tripeptid und Chole­ sterylacetat, einem starren Molekül mit 29 Kohlenstoffatomen angewendet. Diese Methode sollte breite Anwendung zur Charakterisierung von Protonenspektren im Festkörper finden.

Es folgt noch eine etwas ausführlichere Beschreibung der Figuren.

Fig. 1a: Bevorzugte Pulssequenz des MAS-J-HMQC-Experimentes. Die Kohärenz­ transferwege von Protonen und Kohlenstoff, die durch den Phasenzyklus selektiert werden, sind ebenfalls gezeigt.

Fig. 1b: Theoretische Entwicklung der Kohlenstoffsignalintensitäten als Funktion der Wartezeit τ. Die Berechnungen wurden für 0 Hz Linienbreite und 130 Hz Kopplung durchgeführt. Das entspricht dem "idealen" Lösungsfall und einer typischen ¹J_CH- Kopplung für einen aliphatischen Kohlenstoff. Diese Kopp­ lungen sind typischerweise viel größer als Zwei- oder Drei-Bindungs- Kopplungen, die in erster Näherung vernachlässigt werden. Um ein maxi­ males Signal für alle Typen von CH_n Gruppen zu erhalten, muß die Warte­ zeit τ auf 2 ms gesetzt werden. Für jede CH_n Gruppe (n = 1, 2, 3) wurden die Kurven entsprechend der folgenden Ausdrücke erhalten:

Hierin ist I⁰ die Signalintensität nach Kreuzpolarisation und T₂ die transver­ sale Relaxationszeit (in der die Magnetisierung dephasiert) in der Wartezeit 2τ (gleich 1/πΔ) . c_i = cos(2πτJ_i) und s_i = sin(2πτJ_i). Die Ausdrücke wurden unter Verwendung von Produkt-Operator-Algebra und einem Hamilton- Operator der J-Kopplung ähnlich in Lösung berechnet. Man beachte, daß die Signalintensitäten der CH₃-Gruppen zwei konkrete Beiträge enthalten:
einen Beitrag von der reinen Einquantenkohärenz zwischen Kohlenstoff und einem Proton und einen Beitrag von Dreiquantenkohärenz (Terme S_xI_1xI_2xI_3x im Dichte-Operator) mit unterschiedlichen funktionalen Abhängigkeiten.

Fig. 1c: Theoretische Entwicklung der Kohlenstoffsignalintensitäten als Funktion der Wartezeit τ. Die Berechnungen wurden für 50 Hz Linienbreite und 70 Hz Kopplung durchgeführt. Das entspricht einer typischen Linienbreite im Fest­ körper und einer unter FSLG Entkopplung mit dem Faktor 1/√3 skalierten ¹J_CH-Kopplung für einen aliphatischen Kohlenstoff. Weitere Erklärungen wie in Fig. 1b.

Fig. 2: Zwei-dimensionales MAS-J-HMQC-Spektrum von Campher. Insgesamt 256 t₁-Inkremente mit 8 Akkumulationen wurden aufgenommen. Die Spin­ rate betrug 2.5 kHz, und die Wartezeit τ wurde auf 2 ms gesetzt. Das 1D- CP/MAS-Spektrum ist über dem 2D-Spektrum gezeigt.

Fig. 3: Entwicklung der Signalintensitäten in eindimensionalen MAS-J-HMQC- Experimenten als Funktion der Wartezeit τ für Signale 6 (Graph a), 4 (Graph b) und 10 (Graph c) im Campher. Die Punkte sind Meßpunkte, die durchgezogenen Kurven entsprechen den angepaßten analytischen Aus­ drücken (berechnet unter Verwendung von Produkt-Operator-Algebra und einem flüssigkeitsähnlichen Hamilton-Operator der J-Kopplung). Als Para­ meter wurden die Gesamtintensität, die J_CH Kopplung und die transversale Relaxationszeit angepaßt. Die Simulationen wurden unter Berücksichtigung einer J_CH-Kopplung für die Signale 7 und 4 und für zwei verschiedene J- Kopplungen für Signal 10 durchgeführt.

Fig. 4: Effizienzen des Kohärenztransfers als Funktion der Mischzeit τ im MAS-J- HMQC- Experiment (Graph a) und im dipolaren HETCOR-Experiment (Graph b). In Graph a sind die Kurven entsprechend der Gleichungen in der Legende zu Fig. 1 für eine CH-Gruppe gezeigt. Die durchgezogene Linie entspricht dem Transfer durch eine Ein-Bindungs-Kopplung ¹J_CH (70 Hz), während die gepunktete Linie dem Transfer durch eine Zwei-Bindungs- Kopplung ²J_CH (6 Hz) entspricht. Für das dipolare HETCOR-Experiment in Graph b wurde ein Kreuzpolarisationsschema für den Polarisationstransfer berücksichtigt. Die folgenden Ausdrücke wurden für die Berechnungen ver­ wendet:

und b(θ) ist die orientierungsabhängige Dipolkopplung.

Die Berechnungen wurden im Fall eines direkt gebundenen Kohlenstoff- Proton- Paares unter Verwendung eines Kernabstandes von 110 µm ent­ sprechend einer Dipolkopplung von 23 kHz (durchgezogene Linie) durch­ geführt, im Falle zweier geminaler Kerne mit einem Abstand von 208 µm und einer Dipolkopplung von 3.3 kHz (gestrichelte Linie). Relaxation wurde in diesen Berechnungen nicht berücksichtigt. In Graph c und d sind die Verhältnisse der Transfereffizienzen zwischen direkt gebundenen und ge­ minalen Kernen für die beiden Typen von heteronuklearen Korrelationsex­ perimenten widergegeben. Das MAS-J-HMQC-Experiment hat eine bessere Selektivität als das dipolare HETCOR in bezug auf den Transfer zum näch­ sten Nachbarn. Für τ-Werte von 1.3 ms und 300 µs für das MAS-J-HMQC bzw. das dipolare HETCOR ist die Selektivität des Transfers 16 mal größer im MAS-J-HMQC als im dipolaren HETCOR.

Fig. 5: Zwei-dimensionales MAS-J-HMQC-Spektrum (Graph a) und dipolares HETCOR-Spektrum (Graph b) einer L-Tyrosin-Hydrochlorid-Probe in natür­ licher Häufigkeit. Die Spinrate betrug 15 kHz. Die Wartezeit τ wurde auf 1.3 ms im MAS-J-HMQC- Experiment eingestellt, die Kontaktzeit im dipolaren HETCOR betrug 300 µs. Insgesamt wurden je 256 t₁-Inkremente mit jeweils 96 Akkumulationen aufgenommen.

Fig. 6: Zwei-dimensionales MAS-J-HMQC-Spektrum des Tripeptides Boc-Ala-Ala- Pro-O-Bzl in natürlicher Häufigkeit. Die Spinrate betrug 15 kHz, und die Wartezeit τ 1.3 ms. Insgesamt wurden je 256 t₁-Inkremente mit jeweils 96 Akkumulationen aufgenommen.

Fig. 7: Zwei-dimensionales MAS-J-HMQC-Spektrum von Cholesterylacetat in na­ türlicher Häufigkeit. Die Spinrate betrug 15 kHz, und die Wartezeit τ 1.3 ms. Insgesamt wurden je 256 t₁-Inkremente mit jeweils 96 Akkumulationen auf­ genommen.

Claims (13)

1. Verfahren der zweidimensionalen, heteronuklearen Korrelationsspektroskopie zur Untersuchung von Festkörperproben, die eine erste Kernart (¹H) und eine zweite Kernart (¹³C) enthalten, in einem Kernresonanzspektrometer mittels ei­ ner Pulssequenz der kernmagnetischen Resonanz, welche Pulssequenz ein Präparationsintervall, ein Evolutionsintervall, ein Mischintervall und ein Detekti­ onsintervall umfaßt, wobei während des Präparationsintervalls die erste Kernart durch mindestens einen Präparations-Hochfrequenzpuls in einem ersten Fre­ quenzband angeregt wird und während des Evolutionsintervalls Evolutions- Hochfrequenzpulsen im ersten Frequenzband ausgesetzt ist, und wobei wäh­ rend des Detektionsintervalls die erste Kernart mindestens einem Entkopp­ lungs-Hochfrequenzpuls im ersten Frequenzband ausgesetzt ist, während der freie Induktionszerfall der zweiten Kernart im zweiten Frequenzband detektiert wird, und wobei die Pulssequenz (1 ≦ p ≦ n) mit identischem Präparations­ intervall, Mischintervall und Detektionsintervall aber geändertem Evolutionsin­ tervall n-mal hintereinander durchgeführt wird, und wobei die Probe mit einer Rotationsfrequenz größer als 1 kHz um eine Achse rotiert, die um etwa 54° ge­ gen die Achse eines homogenen Magnetfelds geneigt ist, und wobei der minde­ stens eine Präparations-Hochfrequenzpuls breitbandig ist mit einer Zentralfre­ quenz in der Mitte des Kernresonanzspektrums der ersten Kernart der Probe und eine Rotation der Kernmagnetisierung der ersten Kernart um eine Achse senkrecht zur Magnetfeldrichtung (X) mit einem Winkel vorzugsweise von 90° bewirkt, und daß die Evolutions-Hochfrequenzpulse eine sog. FSLG-Sequenz bilden mit zwei aufeinanderfolgenden, um 180° gegeneinander phasenverscho­ benen (Y, -Y), breitbandigen Evolutions-Hochfrequenzpulsen, deren Zentralfre­ quenzen der des Präparations-Hochfrequenzpulses gegenüber in entgegenge­ setzte Richtungen verschoben sind und die jeweils eine Drehung der Kernma­ gnetisierung der ersten Kernart um etwa 294° bewirken, dadurch gekennzeichnet, daß während des Präparationsintervalls die erste Kernart mit CP- Hochfrequenzpulsen im ersten Frequenzband zur Übertragung der Kernma­ gnetisierung auf die zweite Kernart bestrahlt wird, und die zweite Kernart in ei­ nem zweiten Frequenzband mit mindestens einem Anregungs-Hochfrequenz­ puls bestrahlt wird, daß das Mischintervall in zwei Teilintervalle aufgespalten ist, von denen das erste zwischen Präparations- und Evolutionsintervall liegt und das zweite zwischen Evolutionsintervall und Detektionsintervall, und daß in bei­ den Mischteilintervallen die Misch-Hochfrequenzpulse eine sog. FSLG-Sequenz bilden mit zwei aufeinanderfolgenden, um 180° gegeneinander phasenverscho­ benen (X, -X), breitbandigen Evolutions-Hochfrequenzpulsen, deren Zentralfre­ quenzen der des Präparations-Hochfrequenzpulses gegenüber in entgegenge­ setzte Richtungen verschoben sind und die jeweils eine Drehung der Kernma­ gnetisierung der ersten Kernart um etwa 294° bewirken, und daß im Zentrum des Evolutionsintervalls die zweite Kernart einem breitbandigen 180°- Refokussierungspuls mit einer Zentralfrequenz in der Mitte des Kernresonanz­ spektrums der zweiten Kernart der Probe ausgesetzt wird, wodurch ein Korrela­ tionsspektrum der beiden Kernarten erzeugt wird, das die chemischen Ver­ schiebungen der beiden Kernarten für direkt gebundene Paare über skalare Kopplung miteinander korreliert.

2. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die erste Kernart ¹H und die zweite Kernart ¹³C sind.

3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß bei der n-maligen, vorzugsweise 512-maligen, Durchführung der Puls­ sequenz im p-ten Evolutionsintervall (1 ≦ p ≦ n) die beiden Evolutions- Hochfrequenzpulse (p-1)-mal nacheinander eingestrahlt werden.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß zwischen dem ersten Mischteilintervall und dem Evolutionsintervall im Frequenzband der ersten Kernart drei Hochfrequenzpulse eingestrahlt werden, von denen der erste die Kernmagnetisierung der ersten Kernart um etwa 54° (Θ_m) um eine Achse senkrecht zum Magnetfeld (-Y) dreht, gefolgt von einem dagegen phasenverschobenen (ϕ₂) 90°-Puls, gefolgt von einem Hochfrequenz­ puls, der die Kernmagnetisierung der ersten Kernart um etwa 54° (Θ_m) um eine Achse senkrecht zum Magnetfeld (+X) dreht, und daß zwischen dem Evoluti­ onsintervall und dem zweiten Mischteilintervall im Frequenzband der ersten Kernart drei Hochfrequenzpulse eingestrahlt werden, von denen der erste die Kernmagnetisierung der ersten Kernart um etwa 54° (Θ_m) um eine Achse senk­ recht zum Magnetfeld (-X) dreht, gefolgt von einem dagegen phasenverscho­ benen (ϕ₃) 90°-Puls, gefolgt von einem Hochfrequenzpuls, der die Kernmagne­ tisierung der ersten Kernart um etwa 54° (Θ_m) um eine Achse senkrecht zum Magnetfeld (+Y) dreht.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß während des Detektionsintervalls die Kernspins der ersten Kernart durch eine TPPM-Sequenz entkoppelt werden.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß zwischen dem p-ten Detektionsintervall und dem (p + 1)-ten Präparati­ onsintervall ein Warteintervall eingefügt wird, das länger ist als die Relaxations­ zeiten T₁ der beiden Kernarten.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die Rotationsfrequenz der Probe größer ist als 10 kHz.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die Dauer der beiden Evolutions-Hochfrequenzpulse kürzer ist als je­ weils 15 Mikrosekunden.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die Frequenzverschiebung der Zentralfrequenzen der beiden Evoluti­ ons-Hochfrequenzimpulse gegen die des Präparationspulses symmetrisch zwi­ schen ± 40 kHz und ± 100 kHz liegt.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die Frequenzverschiebung der Zentralfrequenzen der beiden Evoluti­ ons-Hochfrequenzimpulse phasenkontinuierlich erfolgt.

11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß es als Teil eines dreidimensionalen Spektroskopieverfahrens verwen­ det wird.

12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß es zum Bestimmen skalarer Kopplungen verwendet wird.

13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß es zum Editieren von Kernresonanzspektren ver­ wendet wird.