DE19749216C1 - Assay device containing electrolyte and sensor - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft eine Meßvorrichtung mit Probenzelle zum Nachweis von kleinen Probenmengen mittels eines potentiometri schen Chemo- und Biosensors gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a measuring device with a sample cell Detection of small sample amounts using a potentiometri chemical and biosensors according to the preamble of the claim 1.
Als Stand der Technik sind potentiometrische Chemo- und Biosen soren bekannt, die für den Nachweis bzw. die Konzentrationsbe stimmung von Ionen oder Molekülen in wäßrigen Lösungen (Elektro lyten) eingesetzt werden. Ausführungen als ionenselektive Elek trode (ISE), chemisch oder biologisch sensitiver Feldeffekttran sistor und als Enzym-Feldeffekttransistor (ChemFET, BioFET, En- FET) sowie als kapazitiver Sensor in Form von sogenannten Elek trolyt-Isolator-Silizium(EIS)-Strukturen sind beispielsweise aus G. Weiglein, Feldeffekttransistoren als Sensoren, Physik in unserer Zeit, 21, 3 (1990) 113-116 oder K. Camman, U. Lemke, A. Rohen, J. Sander, H. Wilken, B. Winter, Chemo- und Biosensoren - Grundlagen und Anwendungen, Angewandte Chemie 103 (1991) 519-541 bekannt.Potentiometric chemo- and biosen are state of the art sensors known for the detection or the concentration tuning of ions or molecules in aqueous solutions (electro lytes) can be used. Versions as ion-selective elec trode (ISE), chemically or biologically sensitive field effect oil sistor and as an enzyme field effect transistor (ChemFET, BioFET, En- FET) and as a capacitive sensor in the form of so-called elec Trolyt-insulator silicon (EIS) structures are for example from G. Weiglein, field effect transistors as sensors, physics in our time, 21, 3 (1990) 113-116 or K. Camman, U. Lemke, A. Rohen, J. Sander, H. Wilken, B. Winter, Chemo- and Biosensors - Fundamentals and Applications, Angewandte Chemie 103 (1991) 519-541 known.
Das Nachweisprinzip beruht in allen Fällen auf der Änderung des Potentials an der Grenzfläche sensoraktive Fläche/Elektrolyt, das stromlos gemessen wird. Bei Chemosensoren hängt die Poten tialänderung nach dem Nernstschen Gesetz von der Aktivität, d. h. der Konzentration der freien (ungebundenen) interessierenden Io nen - den sog. potentialbestimmenden Ionen - in der Lösung ab. Im Falle von Biosensoren, bei denen bioaktive Moleküle auf der sensoraktiven Fläche von Chemosensoren immobilisiert werden, hängt das Sensorsignal zusätzlich von der Art des eingesetzten Biomoleküls, z. B. von der Aktivität des jeweiligen Enzyms ab. Potentialbestimmend sind hier bestimmte ionische Produkte, z. B. der Enzymreaktion, die sich in unmittelbarar Nähe der sensorak tiven Oberfläche befinden und deren Konzentration direkt mit der Konzentration des Analyten korreliert ist.The principle of verification is based in all cases on the change of the Potential at the interface of sensor-active area / electrolyte, that is measured without current. The potential hangs with chemosensors tial change according to Nernst's law of activity, d. H. the concentration of the free (unbound) interested Io in the solution - the so-called potential-determining ions. In the case of biosensors in which bioactive molecules on the sensor-active area is immobilized by chemosensors, the sensor signal also depends on the type of used Biomolecule, e.g. B. on the activity of the respective enzyme. Certain ionic products, e.g. B. the enzyme reaction, which is in the immediate vicinity of the sensorak surface and their concentration directly with the Concentration of the analyte is correlated.
Die niedrigste mit einem bestimmten Sensor noch detektierbare Analytkonzentration bezeichnet man als dessen untere Nachweis grenze. Bezogen auf das zur Messung erforderliche Probenvolumen ist damit auch die minimal nachweisbare Analytmenge festgelegt. Liegt die Konzentration des zu detektierenden Analyten unterhalb der Nachweisgrenze, muß die Probe durch geeignete Verfahren auf konzentriert werden. Ist das danach verbleibende Probenvolumen kleiner als das zur Messung erforderliche Volumen oder steht grundsätzlich nur eine sehr geringe Probenmenge zur Verfügung, kann die Messung nicht mehr mit einem einfachen Sensor durchge führt werden.The lowest still detectable with a particular sensor Analyte concentration is referred to as its lower level border. Based on the sample volume required for the measurement the minimum detectable amount of analyte is also determined. The concentration of the analyte to be detected is below the detection limit, the sample must be opened using suitable methods be concentrated. Is the remaining sample volume afterwards smaller than the volume required for the measurement or stands basically only a very small amount of sample is available, the measurement can no longer be carried out with a simple sensor leads.
In diesem Fall bedient man sich der Fließinjektionsanalyse, ei ner Methode, die beispielsweise in J. Ruzicka, E. H. Hansen, Flow Injection Analysis, Second Edition, 1988, John Wiley & Sons, Inc., New York, beschrieben ist. Der potentiometrische Chemo- oder Biosensor, der zu diesem Zweck gegebenenfalls miniaturi siert werden muß, ist dabei mit einem Mikrodosier- und -pumpen system verbunden, in das ein spezielles Referenzelement inte griert ist. Die zu untersuchende Probe wird dabei in einen per manent über den Sensor fließenden Elektrolytstrom injiziert und führt zu einem Peak mit konzentrationsabhängiger Höhe im Sensor signal, wie zum Beispiel in M. J. McGrath, E. I. Iwuoha, D. Dia mond, M. R. Smyth, The use of differential measurements with a glucose biosensor for interference compensation during glucose determination by flow injection analysis, Biosensors & Bioelec tronics 10 (1995) 937-943 beschrieben.In this case, one uses the flow injection analysis, ei ner method, for example in J. Ruzicka, E. H. Hansen, Flow Injection Analysis, Second Edition, 1988, John Wiley & Sons, Inc., New York. The potentiometric chemo- or biosensor, which may be miniaturi for this purpose Siert must be with a microdosing and pumping system connected, in which a special reference element inte is free. The sample to be examined is in a per manently injected electrolyte current flowing through the sensor and leads to a peak with concentration-dependent height in the sensor signal, as described, for example, in M. J. McGrath, E. I. Iwuoha, D. Dia moon, M.R. Smyth, The use of differential measurements with a glucose biosensor for interference compensation during glucose determination by flow injection analysis, biosensors & bioelec tronics 10 (1995) 937-943.
Aus DE 44 36 001 C2 ist als Stand der Technik eine Meßvorrichtung mit einer Probenzelle und einem in dieser Probenzelle enthalte nen Elektrolyten bekannt, wobei die aktive Seite des Sensors in direktem Kontakt mit der Probemenge steht. Aus "Trends in analy tical chemistry", vol. 15, no. 2, 1996, Seiten 56-61 ist zudem eine Meßvorrichtung mit einem EIS-Chip oder einem FET als Sensor bekannt.DE 44 36 001 C2 is a measuring device as prior art with one sample cell and one contained in this sample cell NEN electrolytes known, the active side of the sensor in there is direct contact with the sample amount. From "Trends in analy tical chemistry ", vol. 15, no. 2, 1996, pages 56-61 is also a measuring device with an EIS chip or an FET as a sensor known.
Aus DE 39 21 526 ist eine Meßvorrichtung bekannt, die eine Diffu sionsbarriere aufweist. Außerdem ist aus DE 41 28 494 eine Meßvor richtung bekannt, die eine Konvektionsbarriere aufweist, die aus einer porösen Folie besteht. Diese bekannten Barrieren trennen jedoch nicht die Probe von einem Elektrolyten.From DE 39 21 526 a measuring device is known which a diffu sions barrier. In addition, DE 41 28 494 is a measuring device direction known, which has a convection barrier, the a porous film. Separate these known barriers but not the sample from an electrolyte.
Nachteilig bei dem bekannten Verfahren und der Meßvorrichtung zum Nachweis kleiner Probenmengen mit potentiometrischen Chemo- und Biosensoren ist die Verwendung von aufwendigen und kostenin tensiven Fließinjektionsvorrichtungen. Eine Miniaturisierung dieses Meßaufbaus in Form eines portablen Meßgeräts ist nur mit erheblichem Aufwand möglich.A disadvantage of the known method and the measuring device for the detection of small sample amounts with potentiometric chemo- and biosensors is the use of complex and costly intensive flow injection devices. A miniaturization this measurement setup in the form of a portable measuring device is only with considerable effort possible.
Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, eine Meßvorrichtung mit Probenzelle zu schaffen, die es erlaubt, mit einem herkömmli chen, einfach herzustellenden Sensor unter Verwendung einer her kömmlichen Referenzelektrode den kostengünstigen Nachweis klei ner Analytmengen durchzuführen.It is therefore an object of the invention to provide a measuring device To create a sample cell that allows to use a conventional Chen, easy to manufacture sensor using a conventional reference electrode the low-cost detection perform analyte amounts.
Die Aufgabe wird gelöst durch eine Meßvorrichtung gemäß der Ge samtheit der Merkmale nach Anspruch 1. Weitere zweckmäßige oder vorteilhafte Ausführungsformen finden sich in den auf diesen An spruch rückbezogenen Unteransprüchen.The object is achieved by a measuring device according to Ge togetherness of the features according to claim 1. Further expedient or advantageous embodiments can be found in the on this claim related subclaims.
Es wurde im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit erkannt, eine Diffusionsbarriere einzusetzen, welche sich bezüglich der zu analysierenden Substanz in der Probe neutral verhält und gleich zeitig einen elektrischen Kontakt zwischen dem Sensor und der Referenzelektrode ermöglicht. Zur Messung eines kleinen Proben volumens wird die zu untersuchende Probe zwischen die aktive Oberfläche eines potentiometrischen Chemo- oder Biosensors und die Diffusionsbarriere gebracht und der Kontakt zwischen Sensor und Referenzelektrode über einen Elektrolyten hergestellt.The possibility of a was recognized in the context of the invention Diffusion barrier to use, which with respect to the analyzing substance in the sample behaves neutrally and the same electrical contact between the sensor and the Allows reference electrode. For measuring a small sample volumens the sample to be examined between the active Surface of a potentiometric chemo or biosensor and brought the diffusion barrier and the contact between sensor and the reference electrode are produced via an electrolyte.
Durch die Diffusionsbarriere wird verhindert, daß der Analyt in den zur Kontaktierung der Referenzelektrode notwendigen Elektro lyten diffundiert und somit die lokale Konzentration an der ak tiven Sensoroberfläche absinkt. Gleichzeitig wird im Falle eines Enzym-Biosensors auch verhindert, daß die Produkte der enzymati schen Reaktion von der Sensoroberfläche wegdiffundieren. Die da durch erhöhte Konzentration der Reaktionsprodukte, die vom Sen sor detektiert werden, führt zu einer Verstärkung des Meßsi gnals.The diffusion barrier prevents the analyte in the electrical necessary for contacting the reference electrode lyte diffuses and thus the local concentration at the ak active sensor surface sinks. At the same time, in the case of a Enzyme biosensors also prevent the products of the enzymati diffuse away from the sensor surface. The one there by increasing the concentration of the reaction products, which Sen sor detected leads to an increase in Meßsi gnals.
Die Erfindung ist im weiteren an Hand von Figuren und einem Aus führungsbeispiel näher erläutert.The invention is further based on figures and an Aus management example explained in more detail.
Fig. 1: erfindungsgemäße Meßvorrichtung; Fig. 1: Measuring device according to the invention;
Fig. 2: Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Meßvorrich tung; Fig. 2: embodiment of the Meßvorrich device according to the invention;
Fig. 3: Vergleich der Meßbereiche eines Penicillin-Biosensors bei Verwendung eines herkömmlichen Meßaufbaus (geschlos sene Quadrate) und bei Verwendung des erfindungsgemäßen Meßaufbaus (offene Kreise). Fig. 3: Comparison of the measuring ranges of a penicillin biosensor when using a conventional measurement setup (closed squares) and when using the measurement setup according to the invention (open circles).
Fig. 1 zeigt den erfindungsgemäßen Meßaufbau schematisch. Die aktive Seite des Sensors 6 ist in direktem Kontakt mit der zu untersuchenden Probe 5, die durch eine Diffusionsbarriere 4 vom Elektrolyten 3 getrennt ist. Die elektrische Kontaktierung zur Messung der Kleinsignalkapazität des Sensors mit einer Impedanz meßbrücke 1 erfolgt auf der Rückseite durch einen metallischen Kontakt 7 und auf der Vorderseite durch eine Referenzelektrode 2, die in den Elektrolyten eintaucht. Fig. 1 shows the measurement setup according to the invention schematically. The active side of the sensor 6 is in direct contact with the sample 5 to be examined, which is separated from the electrolyte 3 by a diffusion barrier 4 . The electrical contacting for measuring the small signal capacitance of the sensor with an impedance measuring bridge 1 is carried out on the back by a metallic contact 7 and on the front by a reference electrode 2 which is immersed in the electrolyte.
In Fig. 2 ist ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Meßaufbau dargestellt. Der potentiometrische Biosensor 7, beste hend aus einer pH-sensitiven EIS-Struktur mit immobilisierter Penicillinase, befindet sich in einer mittels O-Ring gedichteten Meßzelle 6. Die elektrische Kontaktierung erfolgt auf der Vor derseite des Sensors über eine Referenzelektrode 2, die in eine Elektrolytlösung 3 eintaucht. Die Kontaktierung der Rückseite geschieht über einen Goldstift 8. Mit einer handelsüblichen Im pedanzmeßbrücke 1 wird die Kleinsignalkapazität der Sensorstruk tur, bzw. über einen Regelkreis die konzentrationsabhängige Spannungsänderung zum Einregeln eines konstanten Kapazitätswer tes gemessen.In FIG. 2, an embodiment of the measuring arrangement according to the invention. The potentiometric biosensor 7 , consisting of a pH-sensitive EIS structure with immobilized penicillinase, is located in a measuring cell 6 sealed by an O-ring. The electrical contact is made on the front of the sensor via a reference electrode 2 , which is immersed in an electrolyte solution 3 . The back is contacted via a gold pin 8 . The small signal capacitance of the sensor structure, or, via a control loop, the concentration-dependent change in voltage for adjusting a constant capacitance value is measured with a commercially available pedometer measuring bridge 1 .
Aus einer Folie, bestehend aus Polymeren wie z. B. PVC, Polyuret han, Polyethylen, Polyamid, PTFE oder Polystrol, vorzugsweise einer handelsüblichen, kopierfähigen Overheadfolie, werden Stüc ke geeigneter Größe, vorzugsweise etwas kleiner als die sensor aktive Fläche des verwendeten Sensors, ausgestanzt. Auf ein sol ches Folienstück, das während der Messung erfindungsgemäß als Diffusionsbarriere 4 eingesetzt wird, wird die zu analysierende Probe aufpipettiert und beispielsweise bei Raumtemperatur einge trocknet.From a film consisting of polymers such. As PVC, polyurethane, polyethylene, polyamide, PTFE or polystyrene, preferably a commercially available, copyable overhead film, pieces of suitable size, preferably somewhat smaller than the sensor-active area of the sensor used, are punched out. The sample to be analyzed is pipetted onto such a piece of film, which is used according to the invention as a diffusion barrier 4 during the measurement, and dried, for example, at room temperature.
Zur Bestimmung der auf dem Folienstück aufgebrachten Penicillin menge, wird die Meßzelle gemäß Fig. 2 zunächst mit einer defi nierten Menge geeigneter Pufferlösung, z. B. 1 ml 0,1 mM POLYMIX [D. D. Perrin, B. Dempsey, Buffers for pH and Metal Ion Control, Chapman and Hall Ltd. London (1974)], pH 8, gefüllt. Dann wird das präparierte Folienstück mit der beschichteten Seite auf die aktive Sensoroberfläche gelegt. Die Probe 5 löst sich wieder und ist zwischen Sensoroberfläche und Folie eingeschlossen. Die bei der sofort einsetzenden enzymatischen Umsetzung des Penicillins frei werdenden Protonen werden sodann vom Sensor detektiert, was als Spannungsänderung abgelesen werden kann.To determine the amount of penicillin applied to the piece of film, the measuring cell according to FIG. 2 is first with a defined amount of suitable buffer solution, eg B. 1 ml 0.1 mM POLYMIX [DD Perrin, B. Dempsey, Buffers for pH and Metal Ion Control, Chapman and Hall Ltd. London (1974)], pH 8. Then the prepared piece of film with the coated side is placed on the active sensor surface. The sample 5 dissolves again and is enclosed between the sensor surface and the film. The protons released during the enzymatic conversion of the penicillin which begins immediately are then detected by the sensor, which can be read as a change in voltage.
In der Fig. 3 sind zum Vergleich zwei Kalibrierkurven gezeigt, die mit demselben Penicillinsensor, aber unterschiedlichen Ver fahren aufgenommen wurden. Die rechte Kurve wurde auf die her kömmliche Weise gemessen, bei der die übliche Menge Analytlösung in die Probenzelle eingebracht wurde. Die linke Kalibrierkurve wurde mit dem erfindungsgemäßen Meßaufbau unter Verwendung eines Folienstücks als Diffusionsbarriere aufgenommen. Dabei konnte mit einer um zwei Größenordnungen geringeren Penicillinmenge ein etwa ebenso großes Meßsignal wie bei der herkömmlichen Methode erreicht werden.In Fig. 3, two calibration curves are shown for comparison, which were recorded with the same penicillin sensor, but different processes. The right curve was measured in the conventional manner in which the usual amount of analyte solution was introduced into the sample cell. The left calibration curve was recorded with the measurement setup according to the invention using a piece of film as a diffusion barrier. It was possible to achieve an approximately as large measurement signal as with the conventional method with an amount of penicillin smaller by two orders of magnitude.
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Legal Events
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---|---|---|---|
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D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |