DE19638870B4 - Tubulysins, methods for their production and agents containing them - Google Patents

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Abstract

Tubulysine der folgenden Formeln:

Figure 00000002
Tubulysin A
Figure 00000003
Tubulysin B
Figure 00000004
Tubulysin C Tubulysins of the following formulas:
Figure 00000002
Tubulysin A
Figure 00000003
Tubulysin B
Figure 00000004
Tubulysin C

Figure 00000001
Figure 00000001

Description

Verbindungen mit antibiotischer und cytostatischer Wirkung, die aus Archangium gephyra isoliert wurden sind in WO 93/13094 sowie in F. Sasse, H. Steinmetz, G. Höfle und H. Reichenbach, J. Antibiotics 48 (1995) S. 21–25 beschrieben.Antibiotic and cytostatic compounds isolated from Archangium gephyra are disclosed in US Pat WO 93/13094 and F. Sasse, H. Steinmetz, G. Höfle and H. Reichenbach, J. Antibiotics 48 (1995) pp. 21-25.

Die vorliegende Erfindung betrifft Tubulysine, die aus folgenden Formeln ausgewählt sind:

Figure 00010001
Tubulysin A The present invention relates to tubulysins selected from the following formulas:
Figure 00010001
Tubulysin A

Figure 00010002
Tubulysin B
Figure 00010002
Tubulysin B

Figure 00020001
Tubulysin C
Figure 00020001
Tubulysin C

Somit betrifft die Erfindung eine chemische Verbindung der Summenformel C43H65N5O10S und mit den folgenden Parametern:
1H-NMR-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin A);
13C-NMR-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin A);
UV-Spektrum (Methanol) lambdamax (log epsilon): 225 (4,20), 250 (3,86) und 280 (3,20);
IR-Spektrum (KBr) ny: 3390, 2959, 2934, 2876, 1747, 1667, 1553, 1515 und 1233 cm–1.Thus, the invention relates to a chemical compound of the empirical formula C 43 H 65 N 5 O 10 S and having the following parameters:
1 H-NMR spectrum according to Table 1 (Tubulysin A);
13 C-NMR spectrum according to Table 1 (Tubulysin A);
UV spectrum (methanol) lambda max (log epsilon): 225 (4.20), 250 (3.86) and 280 (3.20);
IR spectrum (KBr) ny: 3390, 2959, 2934, 2876, 1747, 1667, 1553, 1515 and 1233 cm -1 .

Ferner betrifft die Erfindung somit eine chemische Verbindung der Summenformel C42H63N5O10S und mit den folgenden Parametern:
1H-NMR-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin B);
13C-NMR-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin B);
UV-Spektrum (Methanol) lambdamax (log epsilon): 225 (4,23), 250 (3,91) und 280 (3,26);
IR-Spektrum (KBr) ny: 3421, 2964, 2935, 2878, 1742, 1667, 1550, 1517 und 1235 cm–1.Furthermore, the invention thus relates to a chemical compound of the empirical formula C 42 H 63 N 5 O 10 S and having the following parameters:
1 H-NMR spectrum according to Table 1 (Tubulysin B);
13 C-NMR spectrum according to Table 1 (Tubulysin B);
UV spectrum (methanol) lambda max (log epsilon): 225 (4.23), 250 (3.91) and 280 (3.26);
IR spectrum (KBr) ny: 3421, 2964, 2935, 2878, 1742, 1667, 1550, 1517 and 1235 cm -1 .

Weiterhin betrifft die Erfindung somit eine chemische Verbindung der Summenformel C41H61N5O10S und mit einem Rt-Wert (HPLC) unter folgenden Bedingungen:
Säule: Nucleosil 100 C-18, 7 μm, 125 × 4 mm;
Laufmittel: Methanol/Wasser = 70/30 + 2 mM Ammoniumacetat (pH 5,0) + 10 mM Natriumdodecylsulfat;
Fluß: 1 ml/min;
Detektion: Diodenarray.Furthermore, the invention thus relates to a chemical compound of the empirical formula C 41 H 61 N 5 O 10 S and having an R t value (HPLC) under the following conditions:
Column: Nucleosil 100 C-18, 7 μm, 125 × 4 mm;
Eluant: methanol / water = 70/30 + 2mM ammonium acetate (pH 5.0) + 10mM sodium dodecyl sulfate;
Flow: 1 ml / min;
Detection: diode array.

Weiterhin betrifft die Erfindung somit Tubulysine mit antimykotischer und cytotoxischer Wirkung, dadurch gewinnbar, daß man

  • (a) Archangium gephyra DSM 11 092 in einem wässrigen Kulturmedium mit einem Gehalt an Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, Schwefel-Quellen, Cyanocobalamin und Mineralsalzen aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert und
  • (b) das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Methanol eluiert und vom Eluat das Methanol abzieht und
  • (c) die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, den Extrakt einengt und einen Rohextrakt gewinnt und
  • (d) den Rohextrakt einer Gelchromatographie mit Methanol als Laufmittel unterwirft und ein oder mehrere Fraktionen mit einem Gehalt an Verbindungen mit antimykotischer und cytostatischer Wirkung im UV bei 226 nm detektiert, abtrennt und einengt,
  • (e) das gewonnene Konzentrat an einer Umkehrphase mit Methanol/Ammoniumacetat-Puffer chromatographiert und durch Detektion im UV bei 226 nm (e1) eine Fraktion mit einer rascher laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt, (e2) eine Fraktion mit einer langsamer laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt, (e3) eine Fraktion mit einer noch langsamer laufenden Verbindung abtrennt,
  • (f) von der gemäß (e1) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt,
  • (g) von der gemäß (e2) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt und
  • (h) von der gemäß (e3) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt.
Furthermore, the invention thus relates to tubulysins with antimycotic and cytotoxic effect, thereby obtainable that one
  • (a) Archangium gephyra DSM 11 092 cultured in an aqueous culture medium containing carbon sources, nitrogen sources, sulfur sources, cyanocobalamin and mineral salts aerobically in the presence of an adsorbent resin and
  • (B) the adsorbent resin is separated from the culture medium and eluted with methanol and the methanol eluted from the eluate and
  • (c) extracting the residual water phase with ethyl acetate, concentrating the extract and recovering a crude extract, and
  • (d) subjecting the crude extract to gel chromatography with methanol as eluent and detecting, separating and constricting one or more fractions containing compounds with antimycotic and cytostatic activity in the UV at 226 nm;
  • (e) the recovered concentrate is chromatographed on a reversed phase with methanol / ammonium acetate buffer and, by detection in UV at 226 nm (e1), a fraction having a faster-moving compound and, separated by time, (e2) a fraction having a slower-moving compound and , separated in time, (e3) separates a fraction with an even slower running compound,
  • (f) removing the methanol from the fraction obtained according to (e1), extracting the remaining water phase with ethyl acetate, evaporating and drying, and obtaining the compound,
  • (g) removing the methanol from the fraction obtained according to (e2), extracting the residual water phase with ethyl acetate, evaporating and drying, and the compound is recovered and
  • (h) stripping the methanol fraction from (e3), extracting the remaining water phase with ethyl acetate, evaporating and drying, and the compound is recovered.

Diese Verbindungen können dadurch gewinnbar sein, daß man bei Stufe (e) an einer C18-Umkehrphase chromatographiert.These Connections can be obtainable by that one at step (e), chromatographed on a C18 reverse phase.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von Tubulysinen, dadurch gekennzeichnet, daß man

  • (a) Archangium gephyra DSM 11 092 in einem wässrigen Kulturmedium mit einem Gehalt an Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, Schwefel-Quellen, Cyanocobalamin und Mineralsalzen aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert und
  • (b) das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Methanol eluiert und vom Eluat das Methanol abzieht und
  • (c) die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, den Extrakt einengt und einen Rohextrakt gewinnt und
  • (d) den Rohextrakt einer Gelchromatographie mit Methanol als Laufmittel unterwirft und ein oder mehrere Fraktionen mit einem Gehalt an Verbindungen mit antimykotischer und cytostatischer Wirkung im UV bei 226 nm detektiert, abtrennt und einengt,
  • (e) das gewonnene Konzentrat an einer Umkehrphase mit Methanol Ammoniumacetat-Puffer chromatographiert und durch Detektion im UV bei 226 nm (e1) eine Fraktion mit einer rascher laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt, (e2) eine Fraktion mit einer langsamer laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt, (e3) eine Fraktion mit einer noch langsamer laufenden Verbindung abtrennt,
  • (f) von der gemäß (e1) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt,
  • (g) von der gemäß (e2) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt und
  • (h) von der gemäß (e3) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt.
According to a further embodiment, the invention relates to a method for obtaining tubulysins, characterized in that
  • (a) Archangium gephyra DSM 11 092 cultured in an aqueous culture medium containing carbon sources, nitrogen sources, sulfur sources, cyanocobalamin and mineral salts aerobically in the presence of an adsorbent resin and
  • (B) the adsorbent resin is separated from the culture medium and eluted with methanol and the methanol eluted from the eluate and
  • (c) extracting the residual water phase with ethyl acetate, concentrating the extract and recovering a crude extract, and
  • (d) subjecting the crude extract to gel chromatography with methanol as eluent and detecting, separating and constricting one or more fractions containing compounds with antimycotic and cytostatic activity in the UV at 226 nm;
  • (e) the recovered concentrate is chromatographed on a reverse phase with methanol ammonium acetate buffer and by detection in UV at 226 nm (e1) a fraction having a faster-moving compound and, separated by time, (e2) a fraction having a slower-moving compound and, separated by time, (e3) separating a fraction with an even slower-going compound,
  • (f) removing the methanol from the fraction obtained according to (e1), extracting the residual water phase with ethyl acetate, evaporating and drying, and the compound is recovered,
  • (g) removing the methanol from the fraction obtained according to (e2), extracting the remaining water phase with ethyl acetate, evaporating and drying, and the compound is recovered and
  • (h) stripping the methanol fraction from (e3), extracting the remaining water phase with ethyl acetate, evaporating and drying, and the compound is recovered.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein antimykotisches Mittel mit einem Gehalt an einer erfindungsgemäßen Verbindung.According to one another embodiment The invention relates to an antifungal agent with a content on a compound of the invention.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein cytostatisches Mittel mit einem Gehalt an einer erfindungsgemäßen Verbindung.According to one another embodiment The invention relates to a cytostatic agent with a content on a compound of the invention.

Nachstehend wird die Erfindung durch experimentelle Angaben und 3 Figuren (Strukturformeln) näher erläutert.below the invention is described by experimental data and 3 figures (structural formulas) explained in more detail.

A. ProduktionsbedingungenA. Production conditions

A.1. ProduktionsstammA.1. production strain

Das Bakterium Archangium gephyra gehört zur Ordnung der Myxococcales (Myxobakterien), Unterordnung Cystobacterineae, Familie Archangiaceae. Der Produktionsstamm Archangium gephyra Ar 315 wurde im Februar 1973 von Dr. Reichenbach aus einer Probe von einem Komposthaufen im Botanischen Garten in Freiburg, Deutsch land, isoliert. Er wurde 1996 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) unter der Nr. DSM 11 092 hinterlegt.The Bacterium Archangium gephyra belongs to the order of myxococcales (myxobacteria), suborder cystobacterineae, Family Archangiaceae. The production strain Archangium gephyra Ar 315 was founded in February 1973 by Dr. med. Reichenbach from a sample of a compost heap in the botanical garden in Freiburg, Germany, isolated. He was in 1996 at the German Collection of Microorganisms (DSM) under the number DSM 11 092 deposited.

A.2. StammkulturA.2. stock culture

Die Stammhaltung erfolgt auf Agarplatten, bevorzugt auf Hefe-Agar (VY/2-Agar). Dieses Medium enthält 0,5% Bäckerhefe, 0,1% CaCl2 × 2H2O, 0,1 μg/l Cyanocobalamin und 1,2% Agar. Der pH-Wert wird auf 7,4 eingestellt. Das Medium wird durch Autoklavieren sterilisiert. Die Plattenkulturen werden bei 30°C bebrütet.The stock is carried on agar plates, preferably on yeast agar (VY / 2 agar). This medium contains 0.5% baker's yeast, 0.1% CaCl 2 x 2H 2 O, 0.1 g / l cyanocobalamin and 1.2% agar. The pH is adjusted to 7.4. The medium is sterilized by autoclaving. The plate cultures are incubated at 30 ° C.

A.3. Morphologische BeschreibungA.3. Morphological description

Die vegetativen Zellen sind lange, schlanke Stäbchen, etwa 6 bis 9 μm lang und 0,8 μm dick. Bedingt durch die Gleitbewegung der Bakterien, breiten sich die Kolonien rasch über die Kulturplatte aus. Die Schwarmkolonie auf Hefeagar ist dünn, filmartig, rötlich braun. Wie an dem um die Kolonien entstehenden Klärhof zu erkennen, werden die Hefezellen im Medium abgebaut. Auf diesem Medium bildet der Stamm oft blaßbräunliche Fruchtkörper, die aus mäandrierenden Wülsten aufgebaut sind und stark lichtbrechende Myxosporen enthalten. Letztere sind kurze, dicke, etwas unregelmäßige Stäbchen, etwa 2,5 bis 4 mm lang und 1,2 bis 1,8 mm dick.The Vegetative cells are long, slender rods, about 6 to 9 μm long and 0.8 μm thick. Due to the sliding movement of the bacteria, the spread Colonies quickly over the culture plate. The swarm colony on Hefeagar is thin, film-like, reddish brown. As with the Klärhof around the colonies recognize, the yeast cells are degraded in the medium. On this medium the trunk is often pale brownish Fruiting bodies, the meandering beads are constructed and contain highly refractive Myxosporen. Latter are short, thick, somewhat irregular rods, about 2.5 to 4 mm long and 1.2 to 1.8 mm thick.

A.4. LeistungenA.4. Services

Der Stamm Ar 315 produziert Substanzen, nämlich Tubulysine, die das Wachstum von Pilzen, humanen Krebszellen und anderen tierischen Zellkulturen hemmen. Die Hemmstoffe können sowohl aus den Zellen wie auch aus dem Kulturüberstand isoliert werden.Of the Tribe Ar 315 produces substances, namely tubulysins, which cause growth of fungi, human cancer cells and other animal cell cultures inhibit. The inhibitors can be isolated both from the cells as well as from the culture supernatant.

A.5. Produktion der TubulysineA.5. Production of tubulysins

Die Substanzen werden während der logarithmischen bis hin zur stationären Wachstumsphase produziert. Eine typische Fermen tation verläuft wie folgt: Ein Fermentor mit 350 l Arbeitsvolumen wird mit 300 l Kulturmedium gefüllt (Zusammensetzung: 0,5% Probion (Einzellerprotein der Fa. Hoechst); 1,0% Stärke (Cerestar Krefeld); 0,2% Glucose; 0,1% Hefeextrakt; 0,1% MgSO4 × 7H2O; 0,1% CaCl2 × 2H2O; 0,1 μg/l Cyanocobalamin; Alternativen zu Probion sind Sojamehl oder Maiskleber). Der pH-Wert wird mit KOH auf 7,4 eingestellt. Zur Bindung der ins Medium freigesetzten Hemmstoffe wird dem Medium 1% (V/V) eines Adsorberharzes (Amberlite XAD-16, Rohm & Haas) zugesetzt. Beimpft wird mit 10 l einer 3 Tage alten Vorkultur, die im gleichen Medium in einem entsprechend kleineren Fermentor erzeugt wurde. Fermentiert wird bei 30°C mit einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min und einer Belüftungsrate von 10 Vol.-% pro min. Anfängliche Schaumbildung wird durch Zugabe von 50 ml Silikon-Antischaum (z. B. Tegosipon, Goldschmidt AG, Essen) verhindert. Der pH-Wert steigt im Laufe der Fermentation an. Der Anstieg wird durch Zugabe von 5-proz. Schwefelsäure auf 7,8 begrenzt. Die Fermentation wird nach 5 Tagen beendet.The substances are produced during the logarithmic to the stationary growth phase. A typical fermentation proceeds as follows: A fermenter with a working volume of 350 l is filled with 300 l of culture medium (composition: 0.5% of probion (single-cell protein from Hoechst), 1.0% of starch (Cerestar Krefeld), 0.2% Glucose; 0.1% yeast extract; 0.1% MgSO 4 .7H 2 O; 0.1% CaCl 2 .2H 2 O; 0.1 μg / l cyanocobalamin; alternatives to probion are soybean meal or corn gluten). The pH is adjusted to 7.4 with KOH. To bind the inhibitors released into the medium, 1% (v / v) of an adsorber resin (Amberlite XAD-16, Rohm & Haas) is added to the medium. Inoculated with 10 l of a 3 day old preculture, which in same medium was produced in a correspondingly smaller fermentor. Fermentation at 30 ° C with a stirring speed of 150 U / min and a ventilation rate of 10 vol .-% per min. Initial foaming is prevented by adding 50 ml of silicone antifoam (eg Tegosipon, Goldschmidt AG, Essen). The pH increases during the fermentation. The increase is by adding 5 percent. Sulfuric acid limited to 7.8. The fermentation is stopped after 5 days.

B. Isolierung von Tubulysin A, B und CB. Isolation of Tubulysin A, B and C

Das Adsorberharz wird in einem Prozeßfilter (0,7 m2, 100 Maschen (mesh)) von der Kultur abgetrennt, und mit 15 1 Methanol im Verlauf von 3 h eluiert. Die Konzentration des Eluates erfolgt unter Vakuum bis zum Auftreten der Wasserphase, die anschließend dreimal mit Ethylacetat extrahiert wird. Nach Einengen der organischen Phase im Vakuum bei 30°C Badtemperatur erhält man 36 g Rohextrakt.The adsorber resin is in a process filter (0.7 m 2, 100 mesh (mesh)) separated from the culture, and with 15 1 of methanol in the course of 3 h eluted. The concentration of the eluate is carried out under vacuum until the appearance of the water phase, which is then extracted three times with ethyl acetate. After concentration of the organic phase in vacuo at 30 ° C bath temperature, 36 g of crude extract.

Dieser Rohextrakt wird durch LH-20-Gelchromatographie (Säule: d = 20 cm, l = 100 cm, Fluß 45 ml/min, Detektion 226 nm) mit dem Laufmittel Methanol nach UV-Banden in 6 Fraktionen aufgetrennt, wobei Tubulysin A, B und C in der 2. Fraktion von 110 bis 130 min enthalten sind. Nach Einengen der betreffenden Fraktion trennt man in 3 Portionen auf einer Eurosil-Bioselect (100-20-C-18)-Säule (d = 4 cm, l = 48 cm) mit dem Laufmittel Methanol/0,05 M Ammoniumacetat-Puffer (pH 7,0) = 60/40 und einem Fluß von 8 ml/min. Die Detektion erfolgt bei 226 nm. Rt Tubulysin C 245 bis 260, Tubulysin B 260 bis 285 min, Tubulysin A 300 bis 320 min.This crude extract is separated by LH-20 gel chromatography (column: d = 20 cm, l = 100 cm, flow 45 ml / min, detection 226 nm) with the eluent methanol by UV bands in 6 fractions, where tubulysin A, B and C are contained in the 2nd fraction from 110 to 130 minutes. After concentration of the fraction in question is separated in 3 portions on a Eurosil Bioselect (100-20-C-18) column (d = 4 cm, l = 48 cm) with the eluent methanol / 0.05 M ammonium acetate buffer ( pH 7.0) = 60/40 and a flow of 8 ml / min. The detection is performed at 226 nm. R t Tubulysin C 245-260, tubulysin B 260-285 min, Tubulysin A 300-320 min.

Nach Eindampfen der vereinigten Tubulysin A, Tubulysin B und Tubulysin C enthaltenen Fraktionen bis zur Wasserphase extrahiert man mit Ethylacetat und erhält nach dem Eindampfen im Vakuum und Trocknen 420 mg Tubulysin A, 240 mg Tubulysin B und 20 mg Tubulysin C.To Evaporation of pooled tubulysin A, tubulysin B and tubulysin C contained fractions up to the water phase extracted with Ethyl acetate and obtained after evaporation in vacuo and drying 420 mg Tubulysin A, 240 mg tubulysin B and 20 mg tubulysin C.

Tubulysin ATubulysin A

  • C43H65N5O10S [843]C 43 H 65 N 5 O 10 S [843]
  • DCI-MS (positiv-Ionen): 844.4543 für [M+H]+ DCI-MS (positive ions): 844.4543 for [M + H] +
  • 1H- und 13C-NMR siehe Tabellen 1 und 2 1 H and 13 C NMR see Tables 1 and 2
  • UV (Methanol) lambdamax (log epsilon) = 225 (4.20) ; 250 (3.86) ; 280 (3.30)UV (methanol) lambda max (log epsilon) = 225 (4.20); 250 (3.86); 280 (3.30)
  • IR KBr: ny = 3390; 2959; 2934; 2876; 1747; 1667; 1553; 1515; 1233 cm–1 IR KBr: ny = 3390; 2959; 2934; 2876; 1747; 1667; 1553; 1515; 1233 cm -1
  • DC: Rf = 0.27DC: R f = 0.27
  • DC-Alufolie 60 F254 Merck. Laufmittel: Dichlormethan/Methanol = 9:1DC aluminum foil 60 F 254 Merck. Eluent: dichloromethane / methanol = 9: 1
  • Detektion: UV-Löschung bei 254 nmDetection: UV extinction at 254 nm
  • HPLC: Rt = 9.7 minHPLC: R t = 9.7 min
  • Säule: Nucleosil 100 C-18 7 μm, 125 × 4 mmPillar: Nucleosil 100 C-18 7 μm, 125 × 4 mm
  • Laufmittel: Methanol/Wasser = 70/30 + 2 mM Ammoniumacetat (pH 5.0) + 10 mM Natrium-dodecylsulfatEluent: methanol / water = 70/30 + 2 mM ammonium acetate (pH 5.0) + 10 mM sodium dodecyl sulfate
  • Fluß: 1 ml/minRiver: 1 ml / min
  • Detektion: Diodenarray Detection: diode array

Tubulysin BTubulysin B

  • C42H63N5O10S [829]C 42 H 63 N 5 O 10 S [829]
  • DCI-MS (positiv-Ionen): 830.4361 für [M+H]+ DCI-MS (positive ions): 830.4361 for [M + H] +
  • 1H- und 13C-NMR siehe Tabellen 1 und 2 1 H and 13 C NMR see Tables 1 and 2
  • UV (Methanol) lambdamax (log epsilon) = 225 (4.23); 250 (3.91); 280 (3.26)UV (methanol) lambda max (log epsilon) = 225 (4.23); 250 (3.91); 280 (3.26)
  • IR KBr: ny = 3421; 2964; 2935; 2878; 1742; 1667; 1550; 1517; 1235 cm–1 IR KBr: ny = 3421; 2964; 2935; 2878; 1742; 1667; 1550; 1517; 1235 cm -1
  • DC: Rf = 0.25DC: R f = 0.25
  • DC-Alufolie 60 F254 Merck. Laufmittel: Dichlormethan/Methanol = 9:1DC aluminum foil 60 F 254 Merck. Eluent: dichloromethane / methanol = 9: 1
  • Detektion: UV-Löschung bei 254 nmDetection: UV extinction at 254 nm
  • HPLC: Rt = 7.3 minHPLC: R t = 7.3 min
  • Säule: Nucleosil 100 C-18 7 μm, 125 × 4 mmPillar: Nucleosil 100 C-18 7 μm, 125 × 4 mm
  • Laufmittel: Methanol/Wasser = 70/30 + 2 mM Ammoniumacetat (pH 5.0) + 10 mM Natrium-dodecylsulfatEluent: methanol / water = 70/30 + 2 mM ammonium acetate (pH 5.0) + 10 mM sodium dodecyl sulfate
  • Fluß: 1 ml/minRiver: 1 ml / min
  • Detektion: DiodenarrayDetection: diode array

Tubulysin CTubulysin C

  • C41H61N5O10S [815]C 41 H 61 N 5 O 10 S [815]
  • ESI-MS (positiv-Ionen): 816.6 für [M+H]ESI-MS (positive ions): 816.6 for [M + H]
  • HPLC: Rt = 6.8 minHPLC: R t = 6.8 min
  • Säule: Nucleosil 100 C-18 7 μm, 125 × 4 mm.Pillar: Nucleosil 100 C-18 7 μm, 125 × 4 mm.
  • Laufmittel: Methanol/Wasser = 70/30 + 2 mM Ammoniumacetat (pH 5,0) + 10 mM Natrium-dodecylsulfatEluent: methanol / water = 70/30 + 2 mM ammonium acetate (pH 5.0) + 10 mM sodium dodecyl sulfate
  • Fluß: 1 ml/minRiver: 1 ml / min
  • Detektion: DiodenarrayDetection: diode array

Tabelle 1 1H-NMR Daten von Tubulysinen in [D6] DMSO (600 MHz) H Tubulysin A Tubulysin B δH m J[Hz] δH m J[Hz] 2-H 2.37 m 2.39 m 3-Ha 1.57 m 1.55 m 3-Hb 1.83 m 1.82 m 4-H 4.10 m 4.11 m 5-H 7.88 d 7.5 7.76 d 9.0 8-H 8.18 s 8.17 s 11-H 5.74 dd 11.3, 1.4 5.75 dd 11.2, 1.6 12-Ha 2.09 m 2.08 m 12-Hb 2.36 m 2.36 m 13-H 4.35 m 4.35 m 16-H 4.40 dd 9.0, 8.8 4.42 dd 9.0, 8.8 17-H 7.92 d 8.8 7.88 d 8.6 19-H 2.46 dd 7.6 2.47 m 20-Ha 1.42 m 1.42 m 20-Hb 1.51 m 1.52 m 21-Ha 1.15 dd 12.5 1.16 m 21-Hb 1.62 m 12.6 1.62 m 22-Ha 1.36 m 1.38 m 22-Hb 1.53 m 1.53 m 23-Ha 1.94 m 1.93 m 23-Hb 2.82 dd 11.4 2.83 dd 11.3 25-H3 2.04 s 2.05 s 26-H3 1.04 d 7.0 1.05 d 7.0 27-Ha 2.66 m 2.68 m 27-Hb 2.73 m 2.71 m 29-H 6.96 d 8.4 6.96 d 8.4 30-H 6.61 d 8.4 6.62 d 8.3 32-H 6.61 d 8.4 6.62 d 8.3 33-H 6.96 d 8.4 6.96 d 8.4 35-H3 2.10 s 2.11 s 36-H 1.82 m 1.84 m 37-H3 0.67 d 6.5 0.68 d 6.6 38-H3 0.97 d 6.5 0.97 d 6.4 39-Ha 5.26 d 12.0 5.27 d 12.0 39-Hb 6.19 d 12.0 6.20 d 12.0 40-H 1.93 m 1.95 m 41-Ha 1.08 m 1.10 m 41-Hb 1.49 m 1.49 m 42-H3 0.81 t 7.5 0.80 t 7.4 43-H3 0.81 d 7.1 0.80 d 7.0 2'-Ha 2.13 m 2.15 m 2'-Hb 2.15 m 2.18 m 3'-Ha 1.92 m 1.48 m 3'-Hb - 1.50 m 4'-H3 0.82 d 6.9 0.82 t 7.0 5'-H3 0.81 d 6.8 Tabelle 2 13C-NMR Daten von Tubulysinen in [D6] DMSO (600 MHz) C Tubulysin A Tubulysi B δc m δc m 1 177.1 s 177.0 s 2 36.2 d 36.0 d 3 37.6 t 37.6 t 4 49.0 d 48.9 d 6 159.7 s 159.7 s 7 149.8 s 149.7 s 8 124.2 d 124.1 s 10 168.5 s 168.7 s 11 68.8 d 69.0 d 12 34.3 t 34.4 t 13 55.8* d 55.6* d 15 174.2 s 174.2 s 16 52.6 d 52.6 d 18 172.8 s 172.8 s 19 68.1 d 68.0 d 20 24.8 t 24.8 t 21 22.8 t 22.7 t 22 29.6 t 29.5 t 23 54.7 t 54.6 t 25 43.8 q 43.7 q 26 18.0 q 17.9 q 27 39.5 t 39.4 t 28 128.5 s 128.4 s 29 129.9 d 129.9 d 30 114.9 d 114.9 d 31 155.5 s 155.5 s 32 114.9 d 114.9 d 33 129.9 d 129.9 d 34 169.8 s 169.7 s 35 20.5 q 20.4 q 36 30.0 d 30.0 d 37 19.3 q 19.3 q 38 20.2 q 20.2 q 39 68.9* t 68.9* t 40 35.1 d 35.1 d 41 24.1 t 24.0 t 42 10.0 q 10.0 q 43 15.3 q 15.3 q 1' 171.3 s 171.8 s 2' 42.7 t 35.5 t 3' 25.0 d 17.6 t 4' 22.0 q 10.7 q 5' 22.0 q *δc gemessen bei 80°C Table 1 1 H-NMR data of tubulysins in [D 6 ] DMSO (600 MHz) H Tubulysin A Tubulysin B δ H m J [Hz] δ H m J [Hz] 2-H 2:37 m 2:39 m 3-H a 1:57 m 1:55 m 3-H b 1.83 m 1.82 m 4-H 4.10 m 4.11 m 5-H 7.88 d 7.5 7.76 d 9.0 8-H 8.18 s 8.17 s 11-H 5.74 dd 11.3, 1.4 5.75 dd 11.2, 1.6 12-H a 2:09 m 2:08 m 12-H b 2:36 m 2:36 m 13-H 4:35 m 4:35 m 16-H 4:40 dd 9.0, 8.8 4:42 dd 9.0, 8.8 17-H 7.92 d 8.8 7.88 d 8.6 19-H 2:46 dd 7.6 2:47 m 20-H a 1:42 m 1:42 m 20-H b 1:51 m 1:52 m 21-H a 1.15 dd 12.5 1.16 m 21-H b 1.62 m 12.6 1.62 m 22-H a 1:36 m 1:38 m 22-H b 1:53 m 1:53 m 23-H a 1.94 m 1.93 m 23-H b 2.82 dd 11.4 2.83 dd 11.3 25-H 3 2:04 s 2:05 s 26-H 3 1:04 d 7.0 1:05 d 7.0 27-H a 2.66 m 2.68 m 27-H b 2.73 m 2.71 m 29-H 6.96 d 8.4 6.96 d 8.4 30-H 6.61 d 8.4 6.62 d 8.3 32-H 6.61 d 8.4 6.62 d 8.3 33-H 6.96 d 8.4 6.96 d 8.4 35-H 3 2.10 s 2.11 s 36-H 1.82 m 1.84 m 37-H 3 0.67 d 6.5 0.68 d 6.6 38-H 3 0.97 d 6.5 0.97 d 6.4 39-H a 5.26 d 12.0 5.27 d 12.0 39-H b 6.19 d 12.0 6.20 d 12.0 40-H 1.93 m 1.95 m 41-H a 1:08 m 1.10 m 41-H b 1:49 m 1:49 m 42-H 3 0.81 t 7.5 0.80 t 7.4 43-H 3 0.81 d 7.1 0.80 d 7.0 2'-H a 2.13 m 2.15 m 2'-H b 2.15 m 2.18 m 3'-H a 1.92 m 1:48 m 3'-H b - 1:50 m 4'-H 3 0.82 d 6.9 0.82 t 7.0 5'-H 3 0.81 d 6.8 TABLE 2 13 C-NMR data of tubulysins in [D 6 ] DMSO (600 MHz) C Tubulysin A Tubulysi B δ c m δ c m 1 177.1 s 177.0 s 2 36.2 d 36.0 d 3 37.6 t 37.6 t 4 49.0 d 48.9 d 6 159.7 s 159.7 s 7 149.8 s 149.7 s 8th 124.2 d 124.1 s 10 168.5 s 168.7 s 11 68.8 d 69.0 d 12 34.3 t 34.4 t 13 55.8 * d 55.6 * d 15 174.2 s 174.2 s 16 52.6 d 52.6 d 18 172.8 s 172.8 s 19 68.1 d 68.0 d 20 24.8 t 24.8 t 21 22.8 t 22.7 t 22 29.6 t 29.5 t 23 54.7 t 54.6 t 25 43.8 q 43.7 q 26 18.0 q 17.9 q 27 39.5 t 39.4 t 28 128.5 s 128.4 s 29 129.9 d 129.9 d 30 114.9 d 114.9 d 31 155.5 s 155.5 s 32 114.9 d 114.9 d 33 129.9 d 129.9 d 34 169.8 s 169.7 s 35 20.5 q 20.4 q 36 30.0 d 30.0 d 37 19.3 q 19.3 q 38 20.2 q 20.2 q 39 68.9 * t 68.9 * t 40 35.1 d 35.1 d 41 24.1 t 24.0 t 42 10.0 q 10.0 q 43 15.3 q 15.3 q 1' 171.3 s 171.8 s 2 ' 42.7 t 35.5 t 3 ' 25.0 d 17.6 t 4 ' 22.0 q 10.7 q 5 ' 22.0 q * δ c measured at 80 ° C

C. WirkungC. Effect

Die Tubulysine haben eine cytostatische Wirkung auf Pilze, humane Krebszellinien und andere tierische Zellkulturen (vgl. Tabelle). Sie führen in den Zellen zu einem raschen Abbau des Mikrotubuli-Gerüsts. Das Aktinskelett bleibt erhalten. Adhärent wachsende L929-Maus-Zellen vergrößern unter dem Einfluß der Tubulysine ihr Zellvolumen, ohne sich zu teilen, und entwickeln große Zellkerne, die dann in einem apoptotischen Vorgang zerfallen. Wirkungsspektrum Pilze Hemmhof [mm] Tubulysin A Tubulysin B Aspergillus niger 20 18 Botrytis cinerea 23 18 Coprinus cinereus 20 Pythium debaryanum 20 The tubulysins have a cytostatic effect on fungi, human cancer cell lines and other animal cell cultures (see table). They lead to a rapid degradation of the microtubule framework in the cells. The actin skeleton is preserved. Adherently growing L929 mouse cells, under the influence of tubulysins, increase their cell volume without dividing and develop large cell nuclei, which then disintegrate in an apoptotic process. spectrum mushrooms Hemmhof [mm] Tubulysin A Tubulysin B Aspergillus niger 20 18 Botrytis cinerea 23 18 Coprinus cinereus 20 Pythium debaryanum 20

Agardiffusionstest: 20 μg pro Testblättchen von 6 mm Durchmesser Humane Krebszellinien IC50 [ng/ml] Tubulysin A Tubulysin B Tubulysin C KB-3-1 (DSM ACC 158) 0,01 0,02 0,1 K-562 (ATCC CCL 243) 0,1 0,2 1,5 HL-60 (ATCC CCL 240) 0,04 0,08 0,4 Tierische Zellinien L929, Maus (ATCC CCL 1) 0,2 0,4 2 Pt K2, Potorous tridactylis (ATCC CCL 56) 0,2 0,2 2 Agar diffusion test: 20 μg per test leaflet 6 mm in diameter Human cancer cell lines IC 50 [ng / ml] Tubulysin A Tubulysin B Tubulysin C KB-3-1 (DSM ACC 158) 0.01 0.02 0.1 K-562 (ATCC CCL 243) 0.1 0.2 1.5 HL-60 (ATCC CCL 240) 0.04 0.08 0.4 Animal cell lines L929, Mouse (ATCC CCL 1) 0.2 0.4 2 Pt K2, Potorous tridactylis (ATCC CCL 56) 0.2 0.2 2

Claims (4)

Tubulysine der folgenden Formeln:
Figure 00180001
Tubulysin A
Figure 00180002
Tubulysin B
Figure 00180003
Tubulysin C Tubulysins of the following formulas:
Figure 00180001
Tubulysin A
Figure 00180002
Tubulysin B
Figure 00180003
Tubulysin C Verfahren zur Gewinnung von Tubulysinen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) Archangium gephyra DSM 11 092 in einem wässrigen Kulturmedium mit einem Gehalt an Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, Schwefel-Quellen, Cyanocobalamin und Mineralsalzen aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert und (b) das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Methanol eluiert und vom Eluat das Methanol abzieht und (c) die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, den Extrakt einengt und einen Rohextrakt gewinnt und (d) den Rohextrakt einer Gelchromatographie mit Methanol als Laufmittel unterwirft und ein oder mehrere Fraktionen mit einem Gehalt an Tubulysinen im UV bei 226 nm detektiert, abtrennt und einengt, (e) das gewonnene Konzentrat an einer Umkehrphase mit Methanol Ammoniumacetat-Puffer chromatographiert und durch Detektion im UV bei 226 nm (e1) eine Fraktion mit einer rascher laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt, (e2) eine Fraktion mit einer langsamer laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt, (e3) eine Fraktion mit einer noch langsamer laufenden Verbindung abtrennt, (f) von der gemäß (e1) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt, (g) von der gemäß (e2) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt und (h) von der gemäß (e3) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt.A process for obtaining tubulysins according to claim 1, characterized in that (A) Archangium gephyra DSM 11 092 in an aqueous culture medium with a Content of carbon sources, nitrogen sources, sulfur sources, Cyanocobalamin and mineral salts aerobic in the presence of an adsorber resin cultivated and (b) separating the adsorber resin from the culture medium and eluted with methanol and the methanol eluted from the eluate and (C) the remaining one Extracted water phase with ethyl acetate, the extract and concentrated wins a crude extract and (d) the crude extract of gel chromatography subjected to eluent with methanol and one or more fractions detected with a content of tubulysins in the UV at 226 nm, separated and constricts, (e) the recovered concentrate at a reversal phase chromatographed with methanol ammonium acetate buffer and by detection in the UV at 226 nm (e1) a fraction with a fast-moving one Connection as well as, separated by time, (e2) a fraction with a slower running connection and, separated by time, (E3) separating a fraction with an even slower running compound, (F) from that obtained according to (e1) Stripping the methanol, the remaining water phase with ethyl acetate extracted, evaporated and dried and the compound wins, (G) from that obtained according to (e2) Stripping the methanol, the remaining water phase with ethyl acetate extracted, evaporated and dried and the compound wins and (H) from that obtained according to (e3) Stripping the methanol, the remaining water phase with ethyl acetate extracted, evaporated and dried and the compound wins. Antimykotisches Mittel mit einem Gehalt an Tubulysin gemäß Anspruch 1.Antimycotic agent containing tubulysin according to claim 1. Cytostatisches Mittel mit einem Gehalt an Tubulysin gemäß Anspruch 1.Cytostatic agent containing tubulysin according to claim 1.
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