DE19513659A1

DE19513659A1 - Polypeptid-enthaltende pharmazeutische Darreichungsformen in Form von Mikropartikeln und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE19513659A1
Application number: DE19513659A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Dr Winter; Hans Dipl Biol Dr Koll; Thomas Prof Dr Kissel; Michael Morlock
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1995-03-10
Filing date: 1995-04-11
Publication date: 1996-09-12

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind parenterale pharmazeutische Darreichungsformen in Form von Mikropartikeln (MP) zur kontrollierten Freisetzung von Polypeptiden und Verfahren zur Herstellung dieser Mikropartikel.

Durch das schnelle Fortschreiten der Entwicklung in der Biotechnologie stehen eine Vielzahl von bioaktiven Makromolekülen in ausreichender Menge zur klinischen Anwendung zur Verfügung. Bedingt durch ihre Struktur werden sie im Magen-Darm- Trakt hydrolytisch gespalten und können daher nur parenteral verabreicht werden. Wegen ihrer kurzen Halbwertszeit ist die Entwicklung von parenteralen Depotsystemen sinnvoll, um die Injektionshäufigkeit zu reduzieren und konstante Blutspiegel zu erreichen.

Es werden in der Fach- und Patentliteratur eine Reihe von Depotsystemen beschrieben, um physiologisch aktive Substanzen nach parenteraler Applikation über einen längeren Zeitraum hinweg möglichst konstant freizusetzen. Eines der wichtigsten Herstellungs verfahren für Mikrokapseln auf Polymerbasis, das sogenannte "Tripelemulsions verfahren", wird in der Patentanmeldung EP 0 145 240 (Takeda Chemical Industries) beschrieben. Grundsätzlich wird bei dieser auch als W/O/W-Technik bezeichneten Methode der Wirkstoff in einer wäßrigen Lösung gelöst bzw. suspendiert, und diese wäßrige Lösung mit einer das Polymer enthaltenden "öligen Lösung" aus einem organischen, nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel zu einer W/O-Emulsion homogenisiert. Diese W/O-Emulsion wird in eine äußere wäßrige Phase dispergiert, so daß eine Emulsion mit drei Phasen entsteht. Mittels verschiedener Techniken wird dann die Verdunstung des Lösungsmittels erreicht. Das Polymer wird wieder fest und um schließt nun den wäßrig gelösten Wirkstoff. Als Polymere werden in der Regel Poly mere aus Milchsäure (LA = lactid acid) und Glykolsäure (GA = glycolic acid) oder deren Copolymere (PLGA) mit Molekulargewichten zwischen 2000 und 100000 und einem Verhältnis von Milchsäure:Glykolsäure zwischen 100 : 0 bis 50 : 50 eingesetzt.

Die europäische Patentanmeldung EP 0 145 240 offenbart die Herstellung von Mikro kapseln mit Hilfe eines solchen Tripelemulsionsverfahrens, wobei die innere wäßrige Phase eine Viskosität von mindestens 5 000 mPas besitzt bzw. völlig verfestigt ist. Die Erhöhung der Viskosität erfolgt durch Hilfsstoffe wie Gelatine, humanes Serum albumin, Globulin, Casein, Collagen und Polyaminosäuren. In Anwendungsbeispielen wird die Mikroverkapselung von γ-Interferon bzw. Heparin beschrieben.

In der Patentschrift EP 0 190 833 (Takeda) wird das gleiche Herstellungsverfahren beschrieben, nur ist hier die Viskosität der W/O-Emulsion auf einen Wert zwischen 150-10 000 mPas einzustellen. Dies geschieht durch Variation der Polymer-Konzentration (PLGA 100/0-05/50) und dem Zusatz von natürlichen oder synthetischen hoch molekularen Verbindungen, wie z. B. Proteinen, Kohlenhydraten (Cellulose, Dextrin, Pektin, Stärke, Agar), Polyvipylverbindungen, Polycarbonsäuren oder Polyethylen verbindungen in die wäßrige Phase. Dadurch soll eine stark verminderte Aggregations- und Kohäsionsneigung der Mikropartikel während der Herstellung erreicht werden. In einem Anwendungsbeispiel wird Interferon alpha verkapselt.

In EP 0 442 671 (Takeda) werden bezüglich Aggregationsverhalten, sphärischer Gestalt der Mikropartikel und möglicher Zusätze ahnliche Angaben wie in EP 0 190 833 gemacht. "Arzneistoff-zurückhaltende Substanzen" sind gemäß Patentschrift nicht unbedingt erforderlich. Die in der Beschreibung näher erläuterten und konkret offen barten Beispiele betreffen das kurzkettige und relativ stabile Peptid TAP144, das ein LHRH-Analogon darstellt.

Auch in der Fachliteratur sind Beispiele für die Mikroverkapselung von Peptiden bzw. Proteinen mit Hilfe der W/O/W-Technik publiziert.

So beschreiben Ogawa et al., Chem. Pharm. Bull. 1988, Vol. 36, Nr. 3, S. 1095-1103 die Mikroverkapselung von Leuprorelinacetat, einem Peptid, unter der Verwendung von PLA (Polymer aus Milchsäure) und PLGA und gehen auch auf das Freisetzungs verhalten des Peptids ein.

Cohen et al., Pharmaceutical Reseach 1991, Vol. 8, Nr. 6, S. 713 verkapselten FITC- Merrettich-Peroxidase und FITC-BSA in PLGA-Mikropartikeln mit einem Molekular gewicht von 14 000 oder weniger und einem Anteil Milchsäure/Glykolsäure von 75/25 und fanden sowohl eine Unversehrtheit des Proteins BSA als auch einen Erhalt der Enzym-Aktivität. Jeffery H. et al. Pharmaceutical Research 1993, Vol. 10, Nr. 3, S. 362 benutzten Ovalbumin als Kernmaterial und konnten ebenfalls die Unversehrtheit des verkapselten Proteins zeigen. M. S. Hora et al., Biotechnology 1990, Vol. 8, S. 755 verwendeten Interleukin-2 und modifizierte Formen davon als Kernmaterial und unter suchten das Freisetzungsverhalten von PLGA-Mikropartikeln, die humanes Serum albumin als Exzipiens enthielten.

Ferner beschreiben Youxin L. et al. im Joumal of Controlled Release 32, (1994) 121- 128 Depotformen aus ABA-Triblock-Copolymeren (MW: 15 000-40 000), deren A- Block ein Copolymer aus Milch- und Glycolsäure ist und deren B-Block ein Poly ethylenglycol (PEG) darstellt. Sie stellten fest, daß diese Mikropartikel bovines Serum albumin, das als Modellprotein eingesetzt wurde, schnell und kontinuierlich über 2-3 Wochen freisetzen (molare Polymerzusammensetzung LA : GA : PEG = 48 : 14 : 38).

Die im Stand der Technik zur Herstellung von Mikrokapseln bisher häufig verwendeten PLOA-Polymere weisen aufgrund ihres hydrophoben Charakters als entscheidenden Nachteil eine geringe Quellfähigkeit auf, wodurch der Wassereintrift in das Innere der Depotform nur langsam erfolgen kann. Dadurch ist eine Diffusion der Proteinmoleküle durch die Polymerschichten nicht möglich, was eine unbefriedigende Freisetzungsrate zur Folge hat. Dies ist insbesondere beim Einschluß sehr geringer Polypeptidmengen, d. h. bei niedrigem Beladungsgrad, in die Mikropartikel der Fall. Außerdem bewirkt die langsame Wasseraufnahme eine hohe lokale Proteinkonzentration, bezogen auf die ver fügbare Wassermenge, wodurch eine Bildung von hochniolekularen Proteinaggregaten gefördert wird. Diese können wiederum wegen ihres hohen Molekulargewichtes nicht mehr freigesetzt werden. Eine therapeutisch zuverlässige Dosierung des Wirkstoffes ist dann nicht mehr gewährleistet. Ferner kann es bedingt durch den hohen Anteil der Proteinaggregate zu unerwünschten immunologischen Reaktionen kommen. Nur sehr stabile Proteine mit relativ hohen Beladungsgraden von beispielsweise mehr als 5% können mit akzeptabler Rate und ohne Bildung von Aggregaten über einen längeren Zeitraum hinweg freigesetzt werden.

Es zeigte sich ferner, daß auch im Falle der hydrophilen ABA-Polymere eine kontinu ierliche Freisetzung von Proteinen über einen Zeitraum von zwei Wochen dann nicht gewährleisten können, wenn der Polypeptidgehalt in den Mikropartikeln sehr gering ist oder wenn es sich um aggregationsempfindliche Polypeptide handelt. In diesen Fällen werden auch mit dem hydrophilen ABA-Blockpolymer Aggregatbildung und inakzeptable Freisetzungszeiträume von weniger als zwei Wochen beobachtet. Bei niedrigem Beladungsgrad, d. h. bei Einschluß von geringen Polypeptidmengen im Poly mer ist offensichtlich die Diffusion des Wirkstoffes aus den inneren Schichten des Polymers aufgrund der beschränkten Quellfähigkeit des Polymers nicht optimal. Dies führt dann zu unbefriedigenden Freigaberaten des Wirkstoffes aus dem Polymer.

Aufgabe der Erfindung war es, Polypeptid-enthaltende Mikropartikel herzustellen, in denen die Aggregation des Wirkstoffes auch für aggregationsempfindliche Polypeptide möglichst gering gehalten bzw. weitgehend vermieden werden soll. Damit wird die Stabilität der Polypeptide in den Mikropartikeln erhöht. Die Mikropartikel sollen eine kontinuierliche Freisetzung der Polypeptide über einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen bei Erhalt ihrer biologischen Aktivität gewährleisten. Dies sollte vor allem bei solchen Mikropartikeln erzielt werden, die einen niedrigen Beladungsgrad an Wirkstoff aufweisen. Insbesondere sollten diese Freisetzungszeiträume auch für geringe Poly peptidmengen von 0,1-5% (bezogen auf die Gesamtmikropartikelmenge) gelten.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch Mikropartikel bestehend aus einer bio abbaubaren Polymermatrix, in die das Polypeptid eingebettet ist, wobei als Polymer ein ABA-Blockpolymer verwendet wird, dessen A-Block ein Copolymer aus Milch- und Glykolsäure ist und dessen B-Block ein Polyethylenglykol darstellt, und Zuschlags stoffe enthalten sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe Cyclodextrine; Cyclodextrin derivate; Saccharide, wie z. B. Di- und Polysaccharide; Aminozucker; Aminosäuren; Polyaminosäuren; Serumproteine; sowie Gemische dieser Zuschlagsstoffe.

Als Saccharide kommen beispielsweise die Disaccharide Trehalose, Saccharose, Maltose, in Frage. Polysaccharide sind beispielsweise Raffinose, Stärke, Maltodextrine, Alginate oder Dextran. Ein geeigneter Aminozucker ist beispielsweise das Chitosan. Ein bevorzugtes Cyclodextrinderivat im Sinne der Erfindung ist beispielsweise das Beta- Hydroxypropyl-Cyclodextrin (HPCD).

Vorteilhaft im Sinne der Erfindung sind auch Gemische der zuvor genannten Zuschlags stoffe. Beispielhaft seien erwähnt Gemische aus Dextranen und Polyaminosäuren, wie z. B. Gemische aus Dextranen und Polyarginin oder Dextranen und Polyhistidin; Gemische aus Cyclodextrinen oder Cyclodextrinderivaten mit Aminosäuren oder Polyaminosäuren.

Als Polyaminosäurenkommen sowohl die entsprechenden (D) oder (L) bzw. Poly- (D,L)-aminosäuren in Frage. Besonders bevorzugt ist Polyarginin mit einem Molekular gewicht von 5000-150.900, insbesondere 5000 bis 50.000, sowie Polyhistidin mit einem Molekulargewicht von 5000-50.000, insbesondere 15.000-50.000.

Als Polypeptide kommen im Sinne der Erfindung physiologisch aktive Polypeptide mit einem Molekulargewicht zwischen 2000 bis 200 000 in Frage. Solche Polypeptide sind z. B. Erythropoietin (EPO), Parathormon (PTH), G-CSF, TNF oder EGF, sowie deren durch Deletionen oder Substitutionen in der Aminosäurekette ableitbaren Derivate. Besonders geeignet ist die Erfindung für aggregationsempfindliche Polypeptide, die zur Aggregationsbildung in den Mikropartikeln neigen, insbesondere im Fall von EPO.

Der Polypeptidgehalt in den Mikropartikeln beträgt zwischen 0,01 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmikropartikelmenge. Bevorzugt beträgt der Beladungsgrad 0,1 -3 Gew.-%, insbesondere 0,1-2 Gew.-%, und bevorzugt 0,1-1 Gew.-%. Für EPO beträgt der bevorzugte Beladungsgrad 0,1-1%, insbesondere 0,2-0,6%.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Verwendung von ABA-Tri-Block- Copolymeren in Kombination mit Zuschlagstoffen eine kontinuierliche Freigabe der Polypeptide über einen längeren Zeitraum hinweg ohne Aktivitätsverluste ermöglicht und durch die Zuschlagsstoffe ein aggregationsmindernder Effekt erreicht wird. Erfindungsgemäß kommen ABA-Blockpolymere in Frage, deren A-Block ein Molekulargewicht zwischen 2.000 und 150.000 besitzt, und deren B-Block ein Molekulargewicht zwischen 1.000 und 15.000 besitzt. Insbesondere weist der B-Block ein Molekulargewicht zwischen 3.000 bis 10.000 auf. Besonders bevorzugt sind ABA-Blockpolymere mit einem Molekulargewicht von 5.000-50.000 Dalton, vor zugsweise 10.000-30.000, und einer Polydispersität von 1,1-7 oder 1,1-5, vorzugsweise 1,5-4,5 und insbesondere bevorzugt von 2-4.

Erfindungsgemäß beträgt der Polyethylenglykolanteil im Blockpolymer 20 bis 50 Gew.- %, bezogen auf die Gesamtpolymermenge, vorzugsweise 25 bis 45 Gew.-%. Das Verhältnis von Milchsäure zu Glykolsäure im Blockpolymer liegt zwischen 1 : 1 bis 5 : 1, insbesondere beträgt es zwischen 1,5 : 1 bis 4,2 : 1. Besonders bevorzugt ist ein Verhältnis zwischen 1 ,5 : 1 bis 3,5 : 1. Ein bevorzugtes ABA-Polymer ist ein Polymer mit einem Verhältnisanteil von LA : GA : PEG wie 50 : 12 : 38.

Die Herstellung der ABA-Tri-Block-Copolymere ist bekannt und kann, wie im "Journal of Controlled Release 27, 1993, 247-257" beschrieben, durchgeführt werden.

Überraschend wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Zuschlagsstoffe neben ihrem aggregationsmindernden Effekt eine signifikante Erhöhung der Freisetzungsdauer bewirken können, verglichen mit ABA-Mikropartikeln ohne Zuschlagsstoffe. Dies gilt insbesondere für die erfindungsgemäßen Serumproteine, die eine Erhöhung der Frei setzungsdauer des Polypeptids auf beispielsweise bis zu 29 Tagen hervorrufen (vgl. Beispiel 4). Als Serumproteine werden bevorzugt bovines oder humanes Serumalbumin eingesetzt. Werden die erfindungsgemäßen Zuschlagsstoffe PLGA-Mikropartikeln zu gesetzt, so tritt auch ein aggregationsmindernder Effekt und somit eine Stabilisierung der aggregationsempfindlichen Polypeptide ein.

Derartig lange Freisetzungszeiträume von bis zu 29 Tagen sind von Polypeptiden aus Mikropartikeln auf Basis von PLGA oder ABA-Polymeren bislang nur bei hohem Beladungsgrad bekannt, jedoch nicht für solche Fälle, in denen die Wirkstoffmenge in den Mikropartikeln sehr gering ist, wie beispielsweise im Fall von EPO.

Die erfindungsgemäßen Mikropartikel können als Zuschlagsstoffe auch Aminosäuren wie z. B. Arginin, Glycin, Lysin oder Phenylalanin, Cyclodextrine oder Cyclodextrin derivate wie z. B. Beta-Hydroxypropyl-Cyclodextrin (HPCD) enthalten. Ebenso können erfindungsgemäß als Zuschlagsstoffe Polyaminosäuren wie z. B. Polyarginin oder Polyhistidin eingesetzt werden oder auch Gemische aus Cyclodextrinen oder Cyclodextrinderivaten mit Aminosäuren oder Polyaminosäuren wie z. B. HPCD mit Polyarginin. Auch Gemische aus Dextranen mit Cyclodextrinderivaten, z. B. mit HPCD, oder mit Cyclodextrinen finden Verwendung. Die verwendeten Dextrane besitzen ein Molekulargewicht zwischen 20 000 und 60 000.

Bevorzugt werden als Zuschlagsstoffe auch Gemische aus Dextranen und Polyarginin oder Gemische aus Dextranen und Polyhistidin eingesetzt. Auch Detergenzien, wie beispielsweise Tween 20®, Tween 80®, Pluronic® oder Miglyol® sind als Zuschlagsstoffe im Sinne der Erfindung geeignet.

Die erfindungsgemäßen Mikropartikel enthalten die Zuschlagsstoffe in einer Menge von 0,5-40 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmikropartikelmenge, vorzugsweise von 1-30%. Insbesondere bevorzugt sind 1-20 Gew.-%. Im Fall der Saccharide werden vorzugsweise Mengen von 5-15 Gew.-% eingesetzt. Im Fall der Polyaminosäure beträgt die Menge der Zuschlagsstoffe insbesondere 1-5 Gew.-%. Cyclodextrin und Cyclodextrinderivate werden vorzugsweise in einer Menge von 2-20 Gew.-% zugesetzt. Die Menge an BSA oder HSA beträgt bevorzugt 2-20 Gew.-% bezogen auf das Gesamtpartikelgewicht.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptid enthaltenden Mikropartikeln mit Hilfe des Tripelemulsionsverfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das bei der Herstellung der "öligen" Phase durch Lösen eines Polymers in einem organischen, nicht wassermischbaren Lösungsmittel als Polymer ein ABA- Blockpolymer eingesetzt wird, dessen A-Block ein Copolymer aus Milch- und Glykolsäure ist und dessen B-Block ein Polyethylenglykol darstellt und dem wäßrig gelösten Polypeptid, das in der "öligen" Phase emulgiert wird, Zuschlagsstoffe zugesetzt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe Cyclodextrine; Cyclodextrinderivate; Saccharide, wie z. B. Di- und Polysaccharide; Aminozucker; Aminosäuren; Polyaminosäuren; Serumproteine; sowie deren Gemische. Es hat sich gezeigt, daß es besonders vorteilhaft ist, wenn bei der Herstellung der Polymerphase dem organischen Lösungsmittel eine schwache Säure, wie beispielsweise Benzoesäure, zugesetzt wird. Dies führt dazu, daß ein beschleunigter Abbau des Polymeren bewirkt wird und es somit zu einer verbesserten Freisetzung des Wirkstoffes aus der Polymermatrix kommt. Dies ist besonders von Vorteil zur Erzielung von höheren Freisetzungsraten im Endstadium des Freisetzungsverhaltens, beispielsweise nach zehn Tagen.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung eines ABA-Blockpolymers, dessen A-Block ein Copolymer aus Milch- und Glykolsäure ist und dessen B-Block ein Polyethylenglykol darstellt, zusammen mit Zuschlagsstoffen, die ausgewählt sind aus der Gruppe Cyclodextrine; Cyclodextrinderivate; Saccharide, wie z. B. Di- und Polysaccharide; Aminozucker; Aminosäuren; Polyaminosäuren; Serumproteine; sowie Gemische dieser Zuschlagsstoffe und Detergentien zur Herstellung von Polypeptid entaltenden Mikropartikeln.

In den folgenden Ausführungsbeispielen wird die Erfindung näher erläutert, ohne sie darauf zu beschränken.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln enthaltend EPO (W/O/W-Methode)

Es wurde ein PLGA-oder ABA-Block-Polymer, wie in "Journal of Controlled Release 22, 1993, 247-257" beschrieben, hergestellt.

Es wurde eine Lösung aus dem PLGA- oder ABA-Block-Polymer und Dichlormethan hergestellt, indem 709 mg des Polymers in 2,33 ml Dichlormethan gelöst wurden. 3,5 mg EPO (in 0,2 ml Natrium-Phosphar-Puffer, pH 7,4) werden je nach Bedarf mit Zuschlagsstoffen (1%, 5% oder 10% w/w bezogen auf die Gesamtmikro partikelmenge) versetzt und mit Wasser auf 0,8 ml Endvolumen aufgefüllt.

Die wäßrige EPO-Lösung wird zur Polymerlösung gegeben und mit Hilfe eines Ultraturrax (30 Sekunden, 20°C, 20000 U/min) eine W/O-Emulsion hergestellt. Anschließend wird die W/O-Emulsion durch Einspritzen in 300 ml wäßrige 0,1% PVA-Lösung mit Hilfe eines Ultraturrax bei 8000 U/min für 30 Sekunden dispergiert (Herstellung einer W/O/W-Tripelemulsion).

Die W/O/W-Emulsion wird zur Verdunstung der organischen Dichlormethanphase für 2 bis 2,5 Stunden bei Raumtemperatur mit Hilfe eines Flügelrührers gerührt (solvent evaporation). Die gebildeten und gehärteten MP werden durch Abnutschen isoliert, zweimal mit je 200 ml Wasser gewaschen und lyophilisiert. Die Mikropartikel werden in einem Exsikkator über Blaugel bei 4°C gelagert.

Beispiel 2 Stabilisierung von EPO-haltigen Mikropartikeln

Es wurden nach herkömmlichen Methoden, wie in Beispiel 1 beschrieben, Mikroparti kel hergestellt, wobei unterschiedliche Zuschlagsstoffe in unterschiedlichen Mengen, bezogen auf die Gesamtmikropartikelmenge, eingesetzt wurden.

Die Aggregatbildung des Wirkstoffes EPO wurde anschließend mittels SDS-Page nach der Extraktion von EPO aus den Mikropartikeln (a) oder der Solvatation der Mikropartikel in DMSO oder DMSO/DMF-Gemisch (30 : 70) (b) folgendermaßen bestimmt:

a) 10 mg MP wurden in 300 ml CH₂Cl₂ gelöst und EPO durch Zugabe von 700 ml Aceton ausgefällt. Das EPO-Präzipitat wurde abzentrifugiert, 2× mit 1 ml CH₂Cl₂/Aceton-Gemisch (1 : 3) gewaschen und anschließend in der speed vac getrocknet. Der Niederschlag wurde in Probenpuffer für SDS-PAGE gelöst, auf ein 12,5 oder 15%-iges SDS-Gel geladen und einer Elekrophorese unterzogen.
b) 10 mg MP wurden in 200 µl DMSO/DMF (30 : 70) gelöst. 25 µl (entspricht ca. 5 µg EPO) wurden direkt auf ein 15%-iges SDS-Gel geladen und einer Elektrophorese unterzogen.
Nach Abschluß der Elektrophorese wurden die Öle entweder:
- a) mit Coomassie angefärbt und mittels eines Laserscanners densitometrisch vermessen, oder
- b) auf Nitrocellulose geblottet, mittels eines EPO-spezifischen Antikörpers die EPO-haltigen Banden angefärbt und mittels eines Laserscanners densitometrisch vermessen.

Es zeigte sich, daß bei der Verwendung von ABA-Polymer (LA : GA : PEG = 50 : 12 : 38) als Polymermaterial durch den Einschluß von BSA oder Dextran 40 000, letzteres insbesondere in Kombination mit Polyhistidin bzw. Polyarginin, oder durch den Einschluß von Arginin oder Cyclodextrinen in die Mikropartikel eine deutliche EPO-Aggregat-Reduzierung erzielt werden konnte. Diese Zuschlagsstoffe wurden in einer Menge von 1 bis 10 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmikro partikelmenge, eingesetzt.

Tabelle 1

Anteil von Aggregaten am Gesamt-EPO in ABA-Mikropartikeln in Gegenwart von verschiedenen Zuschlagsstoffen

Beispiel 3 Freisetzung von EPO aus Mikropartikeln auf Basis von PLGA-Polymeren

Es wurden Mikropartikel auf Basis von PLGA-Polymeren (MG 40000; LA : GA = 50 : 50) mit einem Wirkstoffgehalt von EPO von 0,5% (bezogen auf die Gesamtmikropartikelmenge) gemäß Beispiel 1 hergestellt, wobei bei der Herstellung unterschiedliche Zuschlagsstoffe (% w/w bezogen auf die Gesamtmikropartikelmenge) eingesetzt wurden.

Die Bestimmung der Freisetzungsrate (in % der verkapselten Wirkstoffmenge/pro Tag) erfolgte folgendermaßen:
Jeweils 15 mg Mikropartikel-wurden in 2 ml Eppendorfgefäßen eingewogen und mit 1,5 ml PBS-Puffer und 0,01% Tween 20, pH 7,4 versetzt. Diese Röhrchen wurden in einem auf 37°C thermostatierten, rotierenden Metallblock (Rotatherm, Fa. Liebisch, 30 U/Min.) gestellt. Nach den vorgegebenen Probenahmezeiten wurden die Proben gezogen und das verbleibende Freigabemedium jeweils vollständig durch neues Medium ausgetauscht. Es wurden die Freisetzungsraten für folgende Mikropartikel bestimmt:

Tabelle 2

In vitro Freisetzung von EPO aus PLGA (50 : 50) - Mikropartikeln (Einfluß von Zuschlagsstoffen)

Freisetzung in %/Tag (bezogen auf die in den MP vorhandene EPO-Gesamtmenge)

Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, daß bei Verwendung von PLGA unabhängig von den Zusatzstoffen die EPO-Freisetzung nur maximal 36 Stunden andauert und dann keine weitere kontinuierliche Freisetzung erfolgt.

Beispiel 4 Freisetzung von EPO aus Mikropartikeln auf Basis von ABA-Polymeren

Es wurden Mikropartikel auf Basis von ABA-Polymeren (LA : GA : PEG = 50 : 12 : 38; mittleres Molekulargewicht= 19000; mittlere Polydispersität=3,2) mit einem Wirkstoff gehalt von EPO von 0,5% (bezogen auf die Gesamtmikropartikelmenge) gemäß Beispiel 1 hergestellt, wobei unterschiedliche Zuschlagsstoffe (% w/w bezogen auf die Gesamtmikropartikelmenge) eingesetzt wurden. Die Bestimmung der Freisetzungsraten wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt.

Tabelle 3

In vitro Freisetzung von EPO aus ABA (50 : 12 : 38)-Mikropartikeln (Einfluß von Zuschlagsstoffen)

Freisetzung in %/Tag (bezogen auf die in den MP vorhandene EPO-Gesamtmenge)

Aus Tabelle 3 wird deutlich, daß im Gegensatz zu den PLGA-Mikropartikeln bei den ABA-Mikropartikeln eine kontinuierliche Freisetzung von EPO bis beispielsweise zum 29. Tag erzielt werden kann, insbesondere bei der Verwendung von BSA als Zuschlagsstoff.

Vergleicht man die in vitro Freisetzung von EPO aus PLGA (50 : 50)-Mikropartikeln und ABA-Mikropartikeln (50 : 12 : 38) mit einem Wirkstoffgehalt von 0,5% - jeweils ohne Zusatzstoffe - so wird die Überlegenheit der ABA-Mikropartikel deutlich:

Freisetzung in %/Tag (bezogen auf die in den MP vorhandene EPO-Gesamtmenge)

Jedoch zeigt sich auch, daß bei geringem Beladungsgrad (0,5%) die Freisetzung aus ABA-Mikropartikeln auf 11 Tage begrenzt ist, wenn keine Zuschlagsstoffe zugesetzt werden.

Abkürzungsverzeichnis

MP: Mikropartikel
PLGA: Copolymer aus Milchsäure und Glykolsäure
LA: Milchsäure
GA: Glykolsäure
ABA: Tripel-Blockcopolymere aus A- und B-Block
A-Block: Copolymer aus Milch- und Glykolsäure
B-Block: Polyethylenglykol (PEG)
BSA: bovines Serumalbumin
HSA: humanes Serumalbumin
PVA: Polyvinylalkohol.

Claims

1. Pharmazeutische Darreichungsformen in Form von Mikropartikeln bestehend aus einer Polymermatrix, in die der Wirkstoff eingebettet ist, wobei das Polymer ein ABA-Blockpolymer ist, dessen A-Block ein Copolymer aus Milch- und Glykolsäure und dessen B-Block ein Polyethylenglykol darstellt, gekennzeichnet dadurch, daß der Wirkstoff ein aggregationsempfindliches Polypeptid ist und die Mikropartikel Zuschlagsstoffe enthalten, die ausgewählt sind aus der Gruppe Cyclodextrine; Cyclodextrinderivate; Saccharide; Aminozucker; Aminosäuren; Polyaminosäuren; Serumproteine; sowie Gemische dieser Zuschlagsstoffe.

2. Pharmazeutische Darreichungsformen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuschlagsstoffe ausgewählt sind aus der Gruppe Cyclodextrinderivate; Saccharide; Serumalbumin; Aminosäuren und Polyaminosäuren.

3. Pharmazeutische Darreichungsformen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuschlagsstoffe ausgewählt sind aus Gemischen von Dextranen und Polyaminosäuren; Gemischen aus Cyclodextrinen oder Cyclodextrinderivaten mit Aminosäuren; Gemischen von Cyclodextrin oder Cyclodextrinderivaten mit Polyaminosäuren; Gemischen von Cyclodextrinen oder Cyclodextrinderivaten mit Dextranen; oder aus Gemischen von Dextranen mit Aminosäuren.

4. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der A-Block des ABA-Blockpolymers ein Molekulargewicht zwischen 2 000 und 150 000 aufweist und der B-Block des ABA-Blockpolymers ein Molekulargewicht zwischen 1 000 und 15 000, vorzugsweise zwischen 3 000 und 10 000, besitzt.

5. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das ABA-Blockpolymer ein Molekulargewicht zwischen 5 000 bis 50 000 Dalton, vorzugsweise zwischen 10 000 bis 30 000, aufweist und eine Polydispersität von 1,1 bis 7, vorzugsweise von 1,5 bis 4,5 besitzt.

6. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyethylenglykolanteil im ABA-Blockpolymer zwischen 20 bis 50 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Polymermenge, vorzugsweise zwischen 25 bis 45 Gew.-% liegt.

7. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Milchsäure zu Glykolsäure im Polymer zwischen 1 : 1 bis 5 : 1 liegt, vorzugsweise zwischen 1 ,5 : 1 bis 4,2 : 1.

8. Darreichungsformen gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Milchsäure zu Glykolsäure zwischen 1,5 : 1 bis 3,5 : 1 beträgt.

9. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuschlagsstoffe in einer Menge von 0,5 bis 40 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmikropartikelmenge, vorzugsweise von 1-30 Gew.-%, enthalten sind.

10. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Serumproteine bovines oder humanes Serumalbumin enthalten.

11. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Cyclodextrinderivat β-Hydroxypropyl cyclodextrin enthalten.

12. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Polyaminosäuren Polyarginin oder Polyhistidin enthalten, als Aminosäuren Arginin, Glycin, Phenylalanin, Glutaminsäure oder Lysin enthalten, als Saccharide, Trehalose, Saccharose, Maltose, Stärke, Maltodextrine, Raffinose, Alginat oder Chitosan enthalten.

13. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Dextrane solche mit einem Molekulargewicht zwischen 20 000 und 60 000 enthalten.

14. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie Gemische aus Dextranen mit Polyarginin oder Polyhistidin enthalten.

15. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Detergenzien Tween 20®, Tween 80®, Pluronic® oder Miglyol® enthalten.

16. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Polypeptidgehalt in den Mikropartikeln zwischen 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmikropartikelmenge, vorzugsweise zwischen 0,1 bis 2,9 Gew.-% beträgt.

17. Darreichungsformen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie EPO als Polypeptid enthalten.

18. Verfahren zur Herstellung von Polypeptid-enthaltenden Mikropartikeln mit Hilfe des Tripelemulsionsverfahrens, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Herstellung der "öligen" Phase durch Lösen eines Polymers in einem organischen, nicht wassermischbaren Lösungsmittel als Polymer ein ABA-Blockpolymer eingesetzt wird, dessen A-Block ein Copolymer aus Milch- und Glykolsäure ist und dessen B-Block ein Polyethylenglykol darstellt und dem wäßrig gelösten Polypeptid, das in der "öligen" Phase emulgiert wird, Zuschlagsstoffe zugesetzt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe Cyclodextrine; Cyclodextrinderivate; Saccharide; Aminozucker; Aminosäuren; Polyaminosäuren; Serumproteine; sowie Gemische dieser Zuschlagsstoffe.

19. Verwendung von pharmazeutischen Zuschlagsstoffen ausgewählt aus der Gruppe Cyclodextrine; Cyclodextrinderivate; Saccharide; Aminozucker; Aminosäuren; Polyaminosäuren; Serumproteine; sowie Gemische dieser Zuschlagsstoffe zur Vermeidung der Aggregationsbildung von aggregationsempfindlichen Polypeptiden bei der Herstellung von polypeptid enthaltenden Mikropartikeln.