DE112008001837T5

DE112008001837T5 - Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE112008001837T5
Application number: DE112008001837T
Authority: DE
Inventors: Yves Hatzfeld
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2008-07-31
Publication date: 2012-01-05
Also published as: AU2008281764B2; CN101778942A; CA2694105A1; US20100205689A1; WO2009016212A3; US8507753B2; WO2009016212A2; AR067748A1; BRPI0814378A2; EP2188378A2; AU2008281764A1; US20130305414A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung von verschiedenen wirtschaftlich wichtigen Ertragsmerkmalen in Pflanzen. Genauer ausgedrückt befasst sich die Erfindung mit einem Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid (Nitritreduktase) oder ein ASNS-Polypeptid (Asparaginsynthase) kodiert, in Pflanzen. Die vorliegende Erfindung befasst sich auch mit Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid oder ein ASNS-Polypeptid kodiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte, die Nukleinsäuren, die entweder für eine NITR oder ein ASNS kodieren, umfassen, bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung von verschiedenen Pflanzenwachstumseigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für eine NITR (Nitritreduktase) kodiert, in Pflanzen. Die vorliegende Erfindung befasst sich auch mit Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die für eine NITR kodiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Wildtyppflanzen oder anderen Kontrollpflanzen verbesserte Wachstumseigenschaften aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Verbessern von verschiedenen Pflanzenwachstumseigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für eine ASNS (Asparaginsynthase) kodiert, in Pflanzen. Die vorlegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die für eine ASNS kodiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Wildtyppflanzen oder anderen Kontrollpflanzen verbesserte Wachstumseigenschaften aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind.
Dadurch, dass die Weltbevölkerung ständig zunimmt und immer weniger Kulturfläche für die Landwirtschaft vorhanden ist, wird die Wissenschaft gezwungen, sich mit der Verbesserung der Schlagkräftigkeit der Landwirtschaft zu befassen. Bei traditionellen Mitteln für die pflanzen- und gartenbauliche Züchtung verwendet man Selektionszüchtungstechniken, um Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften zu identifizieren. Diese Selektionszüchtungstechniken weisen jedoch mehrere Nachteile auf, nämlich, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, die häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen, dass das wünschenswerte Merkmal von den Elternpflanzen weiter vererbt wird. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es der Menschheit nun möglich, das Erbmaterial von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die pflanzliche Gentechnik beinhaltet die Isolation und Manipulation von genetischem Material (typischerweise in Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einführung von diesem genetischen Material in eine Pflanze. Mit dieser Technologie kann man Pflanzen, auch Kulturpflanzen, mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, agronomischen oder gartenbaulichen Merkmalen zu produzieren.
Ein Merkmal von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist erhöhter Ertrag. Ertrag wird normalerweise als messbares Kulturpflanzenprodukt mit wirtschaftlichem Wert definiert. Dies kann bezüglich Quantität und/oder Qualität definiert werden. Der Ertrag hängt direkt von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel Anzahl und Große der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel die Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blattalterung und anderen. Weitere wichtige Faktoren, die den Ertrag bestimmen, sind Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität. Eine Optimierung der oben genannten Faktoren kann daher zur Erhöhung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
Der Samenertrag ist deshalb ein besonders wichtiges Merkmal, weil die Samen von vielen Pflanzen wichtig für die menschliche und tierische Ernährung sind. Kulturpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Canola-Raps und Sojabohne machen mehr als die Hälfte der Gesamtkalorienaufnahme des Menschen aus, und zwar entweder durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch den Verzehr von Fleischprodukten, die mit verarbeiteten Samen erzeugt wurden. Sie bilden weiterhin eine Quelle von Zuckern, Ölen und vielen Arten von Stoffwechselprodukten, die in industriellen Verfahren eingesetzt werden. Samen enthalten einen Embryo (den Ursprung für neue Sprosse und Wurzeln) und ein Endosperm (die Nährstoffquelle für das Embryowachstum während der Keimung und des frühen Wachstums der Keimpflanzen). An der Entwicklung eines Samens sind viele Gene beteiligt; er erfordert den Transfer von Stoffwechselprodukten von den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Insbesondere das Endosperm assimiliert die Stoffwechselvorstufen von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert daraus Speichermakromoleküle, die das Korn ausfüllen.
Ein weiteres wichtiges Merkmal für viele Kulturpflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Eine Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist ein wichtiges Ziel von modernen Reiszüchtungsprogrammen für Sorten von tropischem Reis, aber auch Reis für gemäßigte Zonen. Lange Wurzeln sind wichtig für Reis, der in Wasser gesät wird, für eine ordentliche Verankerung im Boden. Dort, wo Reis direkt in angestaute Felder gesät wird und wo die Pflanzen rasch durch das Wasser auflaufen müssen, sind längere Triebe mit Vitalität assoziiert. Wird das Saatgut gedrillt, so sind längere Mesokotyle und Koleoptilen wichtig für eine gutes Auflaufen der Keimpflanzen. Die Fähigkeit, Jungpflanzenvitalität in Pflanzen mittels Gentechnik einzubringen, wäre in der Landwirtschaft von großer Wichtigkeit. So bildete zum Beispiel eine schlechte Jungpflanzenvitalität eine Einschränkung für die Einführung von Maishybriden (Zea mays L.), die auf Erbmaterial des „Corn Belt” beruhten, in die europäische Atlantikregion.
Ein weiteres wichtiges Merkmal ist das der verbesserten Toleranz für abiotischen Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweite Erntesverluste und reduziert die durchschnittlichen Erträge bei den meisten Hauptkulturpflanzenarten um mehr als 50% (Wang et al, Planta (2003), 218: 1–14). Abiotischer Stress kann durch Trockenheit, Versalzung, Temperaturextreme, chemische Toxizität und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die pflanzliche Toleranz, fürüber abiotischem Stress zu verbessern, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für die Landwirte und würde den Anbau von Kulturpflanzen unter ungünstigen Bedingungen und in Gebieten, wo ein Anbau von Kulturpflanzen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
Der Kulturpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben genannten Faktoren erhöht werden.
Je nach dem Endzweck kann man die Modifikation von bestimmten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu anderen bevorzugen. Für Anwendungen wie zum Beispiel Feldfutter- oder Holzproduktion oder als Quelle für Biokraftstoff kann zum Beispiel eine Zunahme der vegetativen Pflanzenteile wünschenswert sein, und für Anwendungen wie die Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann eine Zunahme bei den Samenparametern besonders wünschenswert sein. Auch unter den Samenparametern selbst können je nach Anwendungszweck manche im Vergleich zu anderen bevorzugt werden. Zur Erhöhung des Samenertrags können verschiedene Mechanismen beitragen, egal, ob in Form von erhöhter Samengröße oder erhöhter Anzahl an Samen.
Ein Ansatz für die Erhöhung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) bei Pflanzen kann durch Modifizieren der pflanzeneigenen Wachstumsmechanismen, wie des Zellzyklus oder von verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind, erfolgen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass ein Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid oder ein ASNS-Polypeptid kodiert, zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, das das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassten einen oder mehrere der Faktoren erhöhte Biomasse, erhöhte Jungpflanzenvitalität und erhöhter Samenertrag.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, das das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassten einen oder mehrere der Faktoren erhöhte Biomasse, erhöhte Jungpflanzenvitalität und erhöhter Samenertrag.
Definitionen
Polypeptid(e)/Protein(e)
Die Begriffe „Polypeptid” und „Protein” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Aminosäuren in polymerer Form mit beliebiger Länge, die miteinander über Peptidbindungen verbunden sind.
Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe „Polynukleotid(e)”, „Nukleinsäuresequenz(en)”, „Nukleotidsequenz(en)”, „Nukleinsäure(n)”, „Nukleinsäuremolekül” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Nukleotide, und zwar entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination davon, in polymerer, unverzweigter Form mit einer beliebigen Länge.
Kontrollpflanze(n)
Die Wahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein Routinebestandteil eines Versuchsaufbaus und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen beinhalten. Typischerweise gehört die Kontrollpflanze zur selben Pflanzenart oder sogar derselben Sorte wie die zu beurteilende Pflanze. Bei der Kontrollpflanze kann es sich auch um eine Nullizygote der zu beurteilenden Pflanze handeln. Nullizygoten sind Einzelorganismen, denen des Transgen aufgrund von Aufspaltung fehlt. Eine „Kontrollpflanze” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang nicht nur ganze Pflanzen, sondern auch Pflanzenteile, darunter Semen und Samenteile.
Homolog(e)
„Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu dem jeweiligen nichtmodifizierten Protein, sie weisen eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie des nichtmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste, die in eine vorbestimmte Stelle in ein Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminate Fusionen sowie Insertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäuren in eine Sequenz hinein umfassen. Im Allgemeinen sind Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in einer Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Resten. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie er im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet wird, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®Epitop, lacZ, CMP (calmodulin-binding peptide), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.

Eine Substitution bezieht sich auf den Ersatz von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie ähnlicher Hydrophobie, Hydrophilie, Antigenität, Neigung zur Bildung oder zum Bruch von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, sie können jedoch in Abhängigkeit von funktionellen Zwängen, die dem Polypeptid auferlegt werden, in Form von Cluster vorliegen. Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten. Bei den Aminosäuresubstitutionen handelt es sich vorzugsweise um konservative Aminosäuresubstitutionen. Konservative Substitutionstabellen sind in der Fachwelt gut bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) and Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	konservative Substitutionen	Rest	konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Set	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen lassen sich leicht mit Hilfe von fachbekannten Techniken der Peptidsynthese, wie Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation herstellen. Verfahren für die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertion- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind in der Fachwelt gut bekannt. So sind dem Fachmann zum Beispiel Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA gut bekannt; dazu zählen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange Site Directed Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese.
Derivate
„Derivates” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die im Vergleich zu der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie des interessierenden Proteins, Substitutionen von Aminosäuren durch nichtnatürlich vorkommende Aminosäurereste oder Additionen von nichtnatürlich vorkommenden Aminosäureresten umfassen. „Derivate” eines Proteins umfassen auch Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die natürlich vorkommende veränderte (glykosylierte, acetylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte usw.) oder nichtnatürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann auch eine(n) oder mehrere nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der es abstammt, umfassen, zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, das/der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie ein Reportermolekül, das gebunden ist, um seinen Nachweis zu gestatten, und nichtnatürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins. „Derivate” beinhalten weiterhin auch Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (ein Übersichtsartikel über Tagging-Peptide finden sich bei Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
Ortholg(e)/Paralog(e)
Orthologe und Paraloge umfassen Evolutionskonzepte, mit denen die Vorfahrenbeziehungen von Genen beschrieben werden. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Art, die durch Duplikation eines Vorfahrengens entstanden sind; Orthologe sind Gene von unterschiedlichen Organismen, die durch Artbildung entstanden sind und die auch von einem gemeinsamen Vorfahrengen abstammen.
Domäne
Der Begriff „Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, die an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen von evolutionsmäßig verwandten Proteinen konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen schwanken können, zeigen Aminosäuren, die an spezifischen Positionen stark konserviert sind, Aminosäuren an, die wahrscheinlich für die Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins essentiell sind. Sie wenden durch ihren hohen Konservierungsgrad in als Alignment dargestellten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen identifiziert und können als identifikationsmittel verwendet werden, um zu bestimmen, ob irgendein Polypeptid zu einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie gehört.
Motiv/Konsensussequenz/Signatur
Der Begriff „Motiv” oder „Konsensussequenz” oder „Signatur” bezieht sich auf eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionsmäßig verwandten Proteinen. Bei Motiven handelt es sich häufig um hochkonservierte Teile von Domänen, sie können jedoch auch nur einen Teil der Domäne beinhalten oder außerhalb einer konservierten Domäne lokalisiert sein (wenn alle Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Hybridisierung
Der Begriff „Hybridisierung” ist wie hier definiert ein Vorgang, bei dem sich im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen aneinander anlagern. Der Hybridisierungsvorgang kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Der Hybridisierungsvorgang kann auch stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren auf einer Matrix wie magnetischen Perlen, Sepharose-Perlen oder einem sonstigen Harz immobilisiert ist. Der Hybridisierungsvorgang kann weiterhin stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einen festen Träger wie eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran immobilisiert ist oder mittels z. B. Photolithographie auf z. B. einen kieselsäurehaltigen Glasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder „micorarrays” oder Nukleinsäure-Chips bekannt ist). Die Nukleinsäuremoleküle werden im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen aufzuschmelzen und/oder um „hairpins” oder sonstige Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen, so dass die Hybridisierung stattfinden kann.
Der Begriff „Stringenz” bezieht sich auf diejenigen Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz der Hybridisierung wird von Bedingungen wie Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers beeinflusst. Im Allgemeinen werden niedrige Stringenzbedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 30°C niedriger sind als die Schmelzpunkttemperatur (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittlere Stringenzbedingungen liegen dann vor, wenn die Temperatur 20°C unter T_m liegt, und hohe Stringenzbedingungen dann, wenn die Temperatur 10°C unter T_m liegt. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden typischerweise für die Isolation von hybridisierenden Sequenzen, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit der Zielnukleinsäuresequenz aufweisen, eingesetzt. Nukleinsäuren können jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes sequenzmäßig abweichen und trotzdem noch für ein im Wesentlichen identisches Polypeptid kodieren. Zum Identifizieren von solchen Nukleinsäuremolekülen können daher manchmal Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz erforderlich sein.
Bei dem T_m-Wert handelt es sich um diejenige Temperatur bei definierter Zonenstärke und definiertem pH-Wert, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt zusammenpassenden Sonde hybridisiert. Der T_m-Wert hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung und Länge der Sonde ab. Längere Sequenzen zum Beispiel hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Hybridisierungsrate wird bei 16°C bis 32°C unter dem T_m-Wert erzielt. Das Vorliegen von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung reduziert die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen und fördert so die Hybridbildung; dieser Effekt wird für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M beobachtet (bei höheren Konzentrationen kann dieser Effekt außer Acht gelassen werden). Formamid verringert die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen mit 0,6 bis 0,7°C pro Prozent Formamid, und bei zusätzlich 50% Formamid ermöglicht es, bei 30 bis 45°C hybridisieren zu können, obwohl die Hybridisierungsrate erniedrigt wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die Hitzestabilität der Doppelstränge. Durchschnittlich, und für längere Sonden, sinkt der T_m-Wert um ungefähr 1°C pro Prozent Basen-Fehlpaarung. Der T_m-Wert kann je nach der Art der Hybride mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6xlog₁₀[Na⁺]^a + 0,41x%[G/C^b] – 500x[L^c]^–1 – 0,61x% Formamid
2) DNA-RNA oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5 (log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58(%G/C^b) + 11,8(%G/C^b)² – 820/L^c
3) oligo-DNA oder oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2(I_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46(I_n) ^aoder für ein anderes einwertiges Kation, jedoch nur im Bereich von 0,01–0,4 M genau. ^bnur für %GC im 30%- bis 75%-Bereich genau. ^cL = Länge des Doppelstrangs in Basenpaaren. ^doligo, Oligonukleotid; I_n, = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. G/C) + (Anz. A/T).

Eine unspezifische Bindung kann dadurch bekämpft werden, dass man eine von mehreren bekannten Techniken einsetzt, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusätze von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nichthomologe Sonden können eine Reihe von Hybridisierungen durchgeführt werden, und zwar dadurch, dass man entweder (i) die Anlagerungstemperatur nach und nach erniedrigt (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) dass man die Formamidkonzentration nach und nach erniedrigt (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während der Hybridisierung verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern werden.
Abgesehen von den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung typischerweise auch von der Funktion der Waschvorgänge nach der Hybridisierung ab. Um einen Hintergrund, der das Ergebnis von unspezifischer Hybridisierung ist, zu entfernen, werden die Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu kritischen Faktoren von solchen Waschvorgängen zählen die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung: Je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur ist, desto höher ist die Stringenz des Waschvorgangs. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, das mindestens zweimal so stark wie das Hintergrundsignal ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäurehybridisierungs-Assays oder Genamplifizierungsnachweisevorgänge wie oben dargestellt. Es können auch Bedingungen mit höherer oder niedrigerer Stringenz ausgewählt werden. Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während des Waschens verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern werden.
So umfassen zum Beispiel typische hochstringente Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, wonach Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC erfolgt. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, und anschließendes Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die erwartete Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Werden Nukleinsäuren mit einer bekannten Sequenz hybridisiert, so kann die Hybridlänge dadurch bestimmt werden, dass man mit den Sequenzen ein Alignment durchführt und die darin beschriebenen konservierten Regionen identifiziert. 1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und die Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA und 0,5% Natriumpyrophosphat beinhalten.
Um das Ausmaß der Stringenz zu bestimmen, kann Sambrook et al, (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Neufassungen) herangezogen werden.
Spleißvariante
Der Begriff „Spleißvariante” umfasst im vorliegenden Zusammenhang Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in denen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verdrängt oder hinzugefügt wurden oder in denen Introns verkürzt oder verlängert wurden. Bei solchen Varianten wird die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleiben; dies kann dadurch erzielt werden, dass man funktionelle Abschnitte des Proteins selektiv beibehält. Solche Spleißvarianten können in der Natur vorkommen oder vom Menschen hergestellt werden. Verfahren für die Prognostizierung und für das Isolieren von solchen Spleißvarianten sind in der Fachwelt gut bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005), BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelvariante
Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines bestimmten Gens, die an derselben chromosomalen Lage lokalisiert sind. Allelvarianten umfassen Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), aber auch Small Insertion/Deletion Polymorphisms (INDELs). Die Größe der INDELs beträgt üblicherweise weniger als 100 Bp. SNPs und INDELs bilden den größten Satz von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
„Gen-Shuffling”/gerichtete Evolution
„Gen-Shuffling” oder „gerichtete Evolution” besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem entsprechendem Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Teilen davon zu erzeugen, die für Proteine mit modifizierter biologischer Aktivität kodieren (Castle et al, (2004), Science 304(5674): 1151–4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
Regulationselement/Kontrollsequenz/Promoter
Die Begriffe „Regulationselement”, „Kontrollsequenz” und „Promoter werden im vorliegenden Text alle austauschbar verwendet und sollen dahingehend breit interpretiert werden, dass sie regulatorische Nukleinsäuresequenzen bedeuten, die fähig sind, eine Expression derjenigen Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, zu bewirkten. Der Begriff „Promoter” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäurekontrollsequenz, die sich stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines Gens befindet und die am Erkennen und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer operativ verknüpften Nukleinsäure gesteuert wird. Die oben genannten Begriffe umfassen auch Transkriptionsregulationssequenzen, die sich von einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen ableiten (darunter auch die TATA-Box, die für eine präzise Initiation der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz) sowie zusätzliche Regulationselemente (d. h. stromaufwärts aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression als Reaktion auf Umweltreize und/oder von außen wirkende Reize oder auf gewebespezifische Art und Weise verändern. Der Begriff beinhaltet auch eine Transkriptionsregulationssequenz eines klassischen prokaryontischen Gens, und hier können eine -35-Box-Sequenz und/oder -10-Box-Transkriptionregulationssequenzen beinhaltet sein. Der Begriff „Regulationselement” umfasst auch ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ vermittelt, aktiviert oder verbessert.
Ein „pflanzlicher Promoter” umfasst Regulationselemente, die die Expression eines Kodiersequenzabschnitts in pflanzlichen Zellen vermitteln. Ein pflanzlicher Promoter muss daher nicht pflanzlichen Ursprungs sein, sondern kann von Viren oder Mikroorganismen, zum Beispiel von Viren, die Pflanzenzellen angreifen, abstammen. Der „pflanzliche Promoter” kann auch von einer Pflanzenzelle abstammen, z. B. von der Pflanze, die mit der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierenden und hier beschriebenen Nukleinsäuresequenz transformiert wird. Dies trifft auch auf andere „pflanzliche” Regulationssignale, wie „pflanzliche^„ Termintoren zu. Die stromaufwärts der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Nukleotidsequenzen gelegenen Promoter können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert werden, ohne die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Promoter, des offenen Leserasters (ORF) oder der 3'-Regulationsregion wie Termintoren oder anderen 3'-Regulationsregionen, die vom ORF beabstandet liegen, zu stören. Weiterhin kann man auch die Aktivität der Promoter durch Modifizieren ihrer Sequenz modifizieren oder sie vollständig durch aktivere Promoter ersetzen, sogar durch Promoter von heterologen Organismen. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben operativ mit einem geeigneten Promoter verbunden sein oder einen geeigneten Promoter umfassen, der das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Für ein Identifizieren von funktionell äquivalenten Promotern kann die Promoterstärke und/oder das Expressionsmuster eines potentiellen Promoters zum Beispiel dadurch analysiert werden, dass man den Promoter operativ mit einem Reportergen verbindet und das Expressionsausmaß und -muster des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze testet. Zu geeigneten gut bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel die beta-Glukoronidase oder die beta-Galaktosidase. Die Promoteraktivität wird dadurch getestet, dass man die enzymatische Aktivität der beta-Glukoronidase oder der beta-Galaktosidase misst. Die Promoterstärke und/oder des Expressionsmuster können dann mit derjenigen/demjenigen eines Referenzpromoters (wie demjenigen, der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird) verglichen werden. Die Promoterstärke kann jedoch auch dadurch getestet werden, dass man die mRNA-Mengen quantitativ bestimmt oder dadurch, dass man die mRNA-Mengen der in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Nukleinsäure mit den mRNA-Mengen von „housekeeping^„-Genen wie 18S rRNA unter Verwendung von fachbekannten Verfahren wie Northern-Blotting unter densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitativer Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Held et al, 1996, Genome Methods 6: 986–994) vergleicht. Im Allgemeinen versteht man unter „schwachem Promoter” einen Promoter, der die Expression einer Kodiersequenz auf niedrigem Niveau vorantreibt. Unter „niedrigem Niveau” versteht man Mengen von ungefähr 1/10 000 Transkripte bis 1/100 000 Transkripte bis ungefähr 1/500 0000 Transkripte pro Zelle. Im Gegensatz dazu treibt ein „starker Promoter” die Expression einer Kodiersequenz auf hohem Niveau bzw. mit ungefähr 1/10 Transkripten bis 1/100 Transkripte bis ungefähr 1/1 Transkripte pro Zelle voran. Im Allgemeinen versteht man unter ”mittelstarkem Promoter” einen Promoter, der die Expression einer Kodiersequenz auf einem niedrigerem Niveau als ein starker Promoter vorantreibt, insbesondere auf einem Niveau, das in allen Fällen unter demjenigen Niveau Liegt, das erzielt wird, wenn die Expression unter der Kontrolle eines 35S-CaMV-Promoters steht.
Operativ verknüpft
Der Begriff „operativ verknüpft” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verknüpfung zwischen der Promotersequenz und dem interessierenden Gen, so dass die Promotersequenz fähig ist, die Transkription des interessierenden Gens zu initiieren.
Konstitutiver Promoter

Ein „konstitutiver Promoter” bedeutet einen Promoter, der während den meisten, jedoch nicht unbedingt allen, Wachstums- und Entwicklungsphasen und unter den meisten Umweltbedingungen in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionmäßig aktiv ist. Beispiele für konstitutive Promoter finden sich in Tabelle 2a unten. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Promoter

Herkunftsgen	Literaturangabe
Actin	McElroy et al, Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGP	WO 2004/070039
CAMV 35S	Odell et al, Nature, 313: 810–812, 1985
CaMV 19S	Nilsson et al, Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
GOS2	de Pater et al, Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al, Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
Mais-H3-Histon	Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Luzerne-H3-Histon	Wu et al, Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Actin 2	An et al, Plant J. 10(1); 107–121, 1996
34S FMV	Sanger et al, Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
Kleine Rubisco-Untereinheit	US 4,962,028
OCS	Leisner (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
SAD1	Jain et al, Crop Science, 39(6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al, Crop Science, 39(6), 1999: 1696
nos	Shaw et al, (1984), Nucleic Adds Res. 12(20): 7831–7846
V-ATPase	WO 01/14572
Superpromoter	WO 95/14098
G-Box-Proteine	WO 94/12015

Ubiquitärer Promoter
Ein ubiquitärer Promoter ist in im Wesentlichen allem Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungsregulierter Promoter
Ein entwicklungsregulierter Promoter ist während gewissen Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, bei denen entwicklungsmäßige Veränderungen auftreten, aktiv.
Induzierbarer Promoter
Ein induzierbarer Promoter weist eine induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation als Reaktion auf einen chemischen Reiz (siehe Übersichtsartikel von Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mal. Biol., 48: 89–108), einen Umweltreiz oder einen physikalischen Reiz auf, oder kann „stressinduzierbar” sein, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt ist, oder „pathogen induzierbar^„, d. h. wird dann aktiviert, wenn eine Pflanze verschiedenen Pathogenen ausgesetzt ist.
Organspezifische/gewebespezifische Promoter
Ein organspezfischer oder gewebespezifischer Promoter ist ein Promoter, der fähig ist, die Transkription bevorzugt in gewissen Organen oder Geweben, wie den Blättern, Wurzeln, dem Samengewebe usw. zu initiieren. So ist zum Beispiel ein „wurzelspezifischer Promoter” ein Promoter, der in erster Linie in Pflanzenwurzeln transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Promoter, die fähig sind, die Transkription nur in gewissen Zeilen zu initiieren, werden im vorliegenden Text als „zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele für wurzelspezifische Promoter sind in Tabelle 2b unten angegeben: Tabelle 2b: Beispiele für wurzelspezifische Promoter

Herkunftsgen	Literaturangabe
RCc3	Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48
Arabidopsis-PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
Phosphattransporter aus Medicago	Xiao et al., 2006
Arabidopsis-Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
in Wurzeln exprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
Auxininduzierbares Gen aus Tabak	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
β-Tubulin	Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988.
tabakwurzelspezifische Gene	Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
G1-3b-Gen aus B. napus	United States Patent Nr. 5,401,836
SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993
LRX1	Baumberger et al., 2001, Genes & Dev. 15: 1128
BTG-26 aus Brassica napus	US 20050044585
LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Das LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Klasse-I-Patatingen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991
KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
TobRB7-Gen	W. Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
OsRAB5a (Reis)	Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
NRT2; 1Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

Ein samenspezifischer Promoter ist in erster Linie in Samengewebe, jedoch nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe (bei „leaky^„-Expression) transkriptionsmäßig aktiv. Der samenspezifische Promoter kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Beispiele für samenspezifische Promoter sind in Tabelle 2c bis 2f unten angegeben. Weitere Beispiele für samenspezfische Promoter sind bei Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, und diese Beschreibung wird hiermit durch Bezugnahme als ob hier vollständig beschrieben aufgenommen. Tabelle 2c: Beispiele für samenspezifische Promoter

Herkunftsgen	Literaturangabe
Samenspezifische Gene	Simon et al, Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al, J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;
	Baszczynski et al, Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990
Paranuss-Albumin	Pearson et al, Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992
Legumin	Ellis et al, Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al, Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al, FEBS Letts. 221: 43–47, 1987
Zein	Matzke et al, Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32, 1990
napA	Stalberg et al, Planta 199: 515–519, 1996
LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461-2, 1989
Weizen-SPA	Albani et al, Plant Cell, 9: 171–184, 1997
α-, β-, γ–Gliadine aus Weizen	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
Itr1-Promoter aus der Gerste	Diaz et al, (1995), Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
B1, C, D, Hordein aus der Gerste	Theor. Appl. Gen. 98: 1253-62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet 250: 750–60, 1996
Gerste-DOF	Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
blz2	EP99106056.7
synthetischer Promoter	Vicente-Carbajosa et al, Plant J. 13: 629–640, 1998
Reis-Prolamin NRP33	Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
a-Globulin Glb-1 aus Reis	Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis-OSH1	Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
α-Globulin REB/OHP-1 aus Reis	Nakase et al, Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
Mais-ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
α-Kafirtn aus Sorghumhirse	DeRose et al, Plant Mol. Biol. 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
Reis-Oleosin	Wu et al, J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblumen-Oleosin	Cummins et al, Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
PRO0117, mutmaßliches 40S-Ribosomenprotein aus Reis	WO 2004/070039
PRO0136, Reis-Alaninaminotransferase	unveröffentlicht
PRO0147, Trypsinhemmer ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
PRO0151, Reis-WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis-RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al, Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin-β-artiges Gen	Cejudo et al, Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al, Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al, Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B – Peru	Selinger et al, Genetics 149; 1125–38, 1998

Tabelle 2d: Beispiele für endospermspezifische Promoter

Herkunftsgen	Literaturangabe
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al, (1986), Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al, (1987), FEBS Letts. 221: 43–47
Zein	Matzke et al, (1990), Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen	Colot et al, (1989), Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al, (1989), NAR 17: 461–2
Weizen-SPA	Albani et al, (1997), Plant Cell 9: 171–184
Weizen-Gliadine	Rafalski et al, (1984), EMBO 3: 1409–15
Itr1-Promoter aus der Gerste	Diaz et al, (1995), Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
B1, C, D, Hordein aus der Gerste	Cho et al, (1999), Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62;
	Mullen et al, (1993), Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al, (1996), Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
Gersten-DOF	Mena et al, (1998), Plant J. 116(1): 53–62
blz2	Onate et al, (1999), J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
Synthetischer Promoter	Vicente-Carbajosa et al, (1998), Plant J. 13: 629–640
Reis-Prolamin NRP33	Wu et al, (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis-Globulin Glb-1	Wu et al, (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis-Globulin REB/OHP-1	Nakase et al, (1997), Plant Molec. Biol. 33: 513–522
Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase	Russell et al, (1997), Trans. Res. 6: 157–68
Mais-ESR-Genfamilie	Opsahl-Ferstad et al, (1997), Plant J. 12: 235–46
Sorghumhirse-Kafirin	DeRose et al, (1996), Plant Mol. Biol. 32: 1029–35

Tabelle 2e: Beispiele für embryospezifische Promoter:

Herkunftsgen	Literaturangabe
Reis-OSH1	Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

Tabelle 2f: Beispiele für aleuronspezifische Promoter:

Herkunftsgen	Literaturangabe
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al, Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin-β-artiges Gen	Cejudo et al, Plant. Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gersten-Ltp2	Kalla et al, Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al, Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al, Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezfischer Promoter wie im vorliegenden Text definiert ist ein Promoter, der in erster Linie in grünem Gewebe transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.

Beispiele für für grünes Gewebe spezifische Promoter, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind in Tabelle 2g unten dargestellt. Tabelle 2g: Beispiele für für grünes Gewebe spezifische Promoter

Gen	Expression	Literaturangabe
Orthophosphatdikinase aus dem Mais	blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus dem Mais	blattspezifisch	Keusch et al., 2001
Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus dem Reis	blattspezifisch	Liu et al., 2003
Kleine Rubisco-Untereinheit aus dem Reis	blattspezifisch	Nomura et al., 2000
Beta-Expansin EXBP9 aus dem Reis	sprossspezifisch	WO 2004/070039
Kleine Rubisco-Untereinheit aus der Straucherbse	blattspezfisch	Panguluri et al., 2005
Erbsen-RBCS3A	blattspezfisch

Ein weiteres Beispiel für einen gewebespezifischen Promoter ist ein meristemspezifischer Promoter, der in erster Linie in Meristemgewebe transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Beispiele für Promoter mit Spezifität für das grüne Meristem, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind in Tabelle 2h unten dargestellt. Tabelle 2h: Beispiele für meristemspezifische Promoter

Herkunftsgen	Expressionsmuster	Literaturangabe
Reis-OSH1	Sprossapikalmeristem, vom globulärem Embryonenstadium bis zum Keimlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
Metallothionein aus dem Reis	meristemspezifisch	BAD87835.1
WAK1 & WAK2	Spross- und Wurzelapikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Sepalen	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318

Terminator
Der Begriff „Terminator” umfasst eine Kontrollsequenz, bei der es sich um eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit handelt, die die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines primären Transkripts und die Transkriptionstermination signalisiert. Der Termintor kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA abstammen. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel vom Nopalinsynthasegen oder vom Octopinsynthasegen oder auch von einem anderen pflanzlichen Gen oder, was weniger bevorzugt ist, von einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abstammen.
Modulation
Der Begriff „Modulation” bedeutet in Bezug auf die Expression oder Genexpression einen Vorgang, bei dem das Expressionsniveau durch diese Genexpression im Vergleich zu der Kontrollpflanze verändert wird; das Expressionsniveau kann erhöht oder erniedrigt werden. Bei der ursprünglichen, nichtmodulierten Expression kann es sich um eine beliebige Art von Expression einer Struktur-RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation handeln. Unter dem Begriff „Modulieren der Aktivität” versteht man jegliche Veränderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der kodierten Proteine, die zu erhöhtem Ertrag und/oder erhöhtem Wachstum der Pflanzen führt.
Expression
Der Begriff „Expression” oder „Genexpression” bedeutet die Transkription eines bestimmten Gens bzw. von bestimmten Genen oder eines spezfischen Genkonstrukts. Insbesondere bedeutet der Begriff „Expression” oder „Genexpression die Transkription eines Gen bzw. von Genen oder eines Genkonstrukts in Struktur-RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA, mit oder ohne anschließende(r) Translation von letzterer in ein Protein. Der Vorgang beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des entstandenen mRNA-Produkts.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff „erhöhte Expression” oder „Überexpression” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang jegliche Form von Expression, die zusätzlich zu dem ursprünglichen Expressionsniveau des Wildtyps ist
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt; dazu zählen zum Beispiel die von entsprechenden Promoter vorangetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, die als Promoter- oder Enhancerelemente dienen, können in einer geeigneten Lage (typischerweise stromaufwärts) einer nichtheterologen Form eines Polynukleotids eingeführt werden, um die Expression einer Nukleinsäure, die für das interessierende Polypeptid kodiert, hinaufzuregulieren. So können zum Beispiel endogene Promoter in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution (siehe Kmiec, US 5,565,350 ; Zarling et al, WO9322443 ) verändert werden, oder es können isolierte Promoter in eine Pflanzenzelle in der korrekten Orientierung und in korrektem Abstand von einem Gen der vorliegenden Erfindung eingeführt werden, um die Expression des Gens zu kontrollieren.
Wünscht man, ein Polypeptid zu exprimieren, so ist es im Allgemeinen wünschenswert, am 3'-Ende einer Polynukleotid-Kodierregion eine Polyadenylierungsregion mitzuverwenden. Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA stammen. Die hinzuzufügende 3'-terminale Sequenz kann zum Beispiel von dem Nopalinsynthasegen oder dem Octopinsynthasegen oder alternativ von einem anderen pflanzlichen Gen, oder, was weniger bevorzugt wird, von jeglichem sonstigen eukaryontischen Gen abstammen.
Um die Menge der reifen Information, die im Cytosol akkumuliert zu erhöhen, kann der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz der Partialkodiersequenz auch eine Intronsequenz hinzugefügt werden. Es wurde gezeigt, dass die Mitverwendung eines spleißbaren Introns in der Transkriptionsunit sowohl bei pflanzlichen als auch bei tierischen Expressionskonstrukten die Genexpression sowohl auf dem mRNA-Niveau als auch dem Proteinniveau bis um das 1000fache erhöht (Buchman und Berg (1988), Mol. Cell biol. 8: 4395–4405; Callis et al, (1987), Genes Dev. 1: 1183–1200). Solch eine Intronverstärkung der Genexpression ist typischerweise dann am größten, wenn sie in der Nähe des 5'-Endes der Transkriptionsunit platziert wird. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2, und 6, das Bronze-1-Intron, sind in der Fachwelt gut bekannt. Allgemeine Informationen finden sich in: The Maize Handbock, Kapitel 116, Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, N. Y. (1994).
Endogenes Gen
Wird im vorliegenden Text ein „endogenes” Gen erwähnt, so bezieht sich dies nicht nur auf das jeweilige Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form vorkommt (d. h. ohne menschlichen Eingriff), sondern auch auf dasselbe Gen (oder eine im Wesentlichen homologe Nukleinsäure/ein im Wesentlichen homologes Gen) in isolierter Form, das anschließend in eine Pflanze (erneut) eingeführt wird (ein Transgen). So kann zum Beispiel bei einer transgenen Pflanze, die solch ein Transgen enthält, eine wesentliche Reduktion der Transgenexpression und/oder eine wesentliche Reduktion der Expression des endogenen Gens stattfinden. Das isolierte Gen kann von einem Organismus isoliert sein oder kann künstlich, zum Beispiel mittels chemischer Synthese, hergestellt sein.
Verringerte Expression
Wird im vorliegenden Text von „verringerter Expression” oder „Verringerung oder im Wesentlichen stattfindender Elimination” der Expression gesprochen, so bedeutet dies eine Verringerung der Expression des endogenen Gens und/oder der Polypeptidmengen und/oder Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination ist mit ansteigender Bevorzugung im Vergleich zu derjenigen der Kontrollpflanzen um mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr reduziert.
Für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine ausreichende Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Um ein „gene silencing” durchzuführen, muss diese nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide lang sein; sie kann jedoch sogar die Länge des ganzen Gens (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder ganz oder teilweise) betragen. Der Abschnitt von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden kann von der Nukleinsäure, die für das interessierende Protein kodiert (Zielgen) oder von jeglicher Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren, abstammen. Vorzugsweise ist der Abschnitt der im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotide fähig, mit dem Zielgen (entweder dem sense- oder antisense-Strang) Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden; stärker bevorzugt weist der Abschnitt der im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotide eine Sequenzidentität mit dem Zielgen (entweder dem sense- oder antisense-Strang) von mit ansteigender Bevorzugung 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität auf. Für die verschiedenen Verfahren, die im vorliegenden Text für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens diskutiert werden, ist eine Nukleinsäuresequenz, die für ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, nicht Voraussetzung.
Diese Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression kann unter Verwendung von Routinemaßnahmen und -techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen Genexpression besteht darin, dass man ein Genkonstrukt, in das die Nukleinsäure (in diesem Fall ein Abschnitt von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einem der interessierenden Proteine zu kodieren, abstammen) als invertierte Wiederholung (teilweise oder ganz), die durch einen Spacer (nichtkodierende DNA) getrennt ist, kloniert wird, in eine(r) Pflanze einzuführen und zu exprimieren.
Bei solch einem bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens durch RNA-vermitteltes Silencing reduziert oder im Wesentlichen eliminiert, und zwar unter Verwendung einer invertierten Wiederholung einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einem Abschnitt von im Wesentlichen aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren, abstammen), die bzw. der vorzugsweise fähig ist, eine „hairpin^„-Struktur auszubilden. Die invertierte Wiederholung wird in einen Expressionsvektor, der Kontrollsequenzen umfasst, kloniert. Zwischen den beiden invertierten Nukleinsäure, die die invertierte Wiederholung bilden, befindet sich eine nichtkodierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Spacer, zum Beispiel ein „matrix attachment region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker usw.). Nach der Transkription der invertierten Wiederholung entsteht eine chimäre RNA mit selbstkomplementärer Struktur (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als „hairpin”-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, die in einen RNA-induzierten „silencing^„-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet weiter die mRNA-Transkripte und reduziert dadurch die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in Polypeptide zu translatieren sind, wesentlich. Weitere allgemeine Einzelheiten finden sich zum Beispiel bei Grierson et al, (1998), WO 98/53083 ; Waterhouse et al, (1999), WO 99/53050 ).
Für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ist es nicht unbedingt erforderlich, dass man ein Genkonstrukt, in das die Nukleinsäure als invertierte Wiederholung kloniert ist, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, sondern es können eine oder mehrere von verschiedenen gut bekannten „gene silencing”-Verfahren eingesetzt werden, um zu derselben Wirkung zu gelangen.
Ein solches Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing der Genexpression (Herunterregulation). In diesem Fall wird das Silencing in einer Pflanze durch eine doppelsträngige RNA-Sequenz (dsRNA), die im Wesentlichen eine Ähnlichkeit mit der endogenen Zielsequenz aufweist, ausgelöst. Diese dsRNA wird von der Pflanze weiter zu ungefähr 20 bis ungefähr 26 Nukleotiden prozessiert. die als „short interfering” RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC), der das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens weiter spaltet und so die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid zu translatieren sind, wesentlich reduziert, eingebaut. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
Bei einem weiteren Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren führt man Nukleinsäuresequenzen oder Teile davon (in diesem Fall einen Abschnitt von mit im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden, abgeleitet von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren) in sense-Orientierung in eine Pflanze ein. „Sense-Orientierung” bedeutet eine DNA-Sequenz, die zu einem mRNA-Transkript davon homolog ist. Es würde daher mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze eingeführt werden. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens reduzieren und so zu einem Phänomen, das als Cosuppression bekannt ist, führen. Die Reduktion der Genexpression ist dann stärker ausgeprägt, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingeführt werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptniveaus und dem Auslösen der Cosuppression besteht.
Bei einem weiteren Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren verwendet man antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine „antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, die zu einer „sense”-Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein kodiert, komplementär ist, d. h. komplementär zu dem Kodierstrang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise zu dem endogenen Gen, bei dem das Silencing erfolgen soll, komplementär. Die Komplementarität kann sich in der „Kodierregion” und/oder in der „Nichtkodierregion” eines Gens befinden. Der Begriff „Kodierregion” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, die Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff „Nichtkodierregion” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, die die Kodierregion flankieren und die transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (auch 5'- und 3'-nichttranslatierte Regionen genannt).
Antisense-Nukleinsäuresequenzen können nach den Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung entwickelt werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zu der gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall einem Abschnitt von mit im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden, abgeleitet von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren) komplementär sein, kann jedoch auch ein Oligonukleotid sein, das nur gegenüber einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der mRNA-5'- und 3'-UTR) in antisense orientiert ist. So kann zum Beispiel die antisense-Oligonukleotidsequenz zu derjenigen Region, die den Translationsstartpunkt eines mRNA-Transkripts, das für ein Polypeptid kodiert, umgibt, komplementär sein. Die Länge einer geeigneten antisense-Oligonukleotidsequenz ist in der Fachwelt bekannt und kann ab ungefähr 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotide lang oder weniger sein. Eine erfindungsgemäße antisense-Nukleinsäuresequenz kann unter Verwendung von chemischen Synthesereaktionen und enzymatischen Ligationsreaktionen unter Verwendung von fachbekannten Verfahren konstruiert werden. So kann zum Beispiel eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, und zwar unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder verschiedenartig modifizierten Nukleotiden, so dass die biologische Stabilität der Moleküle vergrößert wird oder die physikalische Stabilität des Doppelstrangs, der zwischen der Antisense-Nukleinsäuresequenz und der sense-Nukleinsäuresequenz gebildet wird, erhöht wird; es können zum Beispiel Phosphorthioatderivate und acridinsubstituierte Nukleotide eingesetzt werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die eingesetzt werden können, um die Antisense-Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen, sind in der Fachwelt gut bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Ringschluss und „Caps” sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide durch ein Analog wie Inosin. Weitere Modifikationen von Nukleotiden sind in der Fachwelt gut bekannt.
Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors, in den eine Nukleinsäuresequenz in Antisense-Orientierung subkloniert wurde (d. h. RNA, die von der insertierten Nukleinsäure transkribiert wird, wird in Antisense-Orientierung in Bezug auf eine interessierende Zielnukleinsäure vorliegen), erzeugt werden. Vorzugsweise erfolgt die Herstellung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts umfassend einen Promoter, ein operativ verknüpftes antisense-Oligonukleotid und einen Terminator.
Die für das Silencing in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle (egal, ob in eine Pflanze insertiert oder in situ erzeugt) hybridisieren mit bzw. binden an mRNA Transkripte und/oder genomische DNA, die für ein Polypeptid kodieren, um so die Expression des Proteins zu hemmen, z. B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch traditionelle Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Doppelstrangs oder zum Beispiel bei einer antisense-Nukleinsäuresequenz, die an DNA-Doppelstränge bindet, durch spezifische Interaktionen in der Hauptfurche der Doppelhelix erfolgen. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können in eine Pflanze durch Transformation oder direkte Injektion in eine spezifische Gewebestelle eingeführt werden. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können jedoch auch so modifiziert werden, dass sie bestimmte Zellen ansteuern, und dann systemisch verabreicht werden. So können zum Beispiel für die systemische Verabreichung antisense-Nukleinsäuresequenzen so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die an einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. dadurch, dass man die antisense-Nukleinsäuresequenz mit Peptiden oder Antikörpern verknüpft, welche an Zelloberflächenrezeptoren oder -antigene binden. Die antisense-Nukleinsäuresequenzen können an die Zellen auch unter Verwendung der im vorliegenden Text beschriebenen Vektoren abgegeben werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt handelt es sich bei der antisense-Nukleinsäuresequenz um eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in denen im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al, (1987), Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die antisense-Nukleinsäuresequenz kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al, (1987), Nud. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al, (1987), FEBS Lett. 215, 327–330) umfassen.
Die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen erfolgen. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die fähig sind, eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, wie eine mRNA, für die sie eine komplementäre Region aufweisen, zu spalten. Ribozyme (z. B. „hammerhead”-Ribozyme (beschrieben bei Haselhoff und Gerlach (1988), Nature 334, 585–591)) können also dazu verwendet werden, um mRNA Transkripte, die für ein Polypeptid kodieren, katalytisch zu spalten, wodurch sie die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid zu translatieren sind, wesentlich reduzieren. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entwickelt werden (siehe zum Beispiel: Cech et al, U.S. Patent No. 4,987,071 ; und Cech et al, U.S. Patent No. 5,116,742 ). mRNA-Transkripte, die einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, können jedoch auch dazu verwendet werden, um eine katalytische RNA mit spezifischer Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen (Bartel und Szostak (1993), Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist in der Fachwelt bekannt (z. B. Atkins et al, (1994), WO 94/00012 ; Lenne et al, (1995), WO 95/03404 ; Lutziger et al, (2000), WO 00/00619 ; Prinsen et al, (1997), WO 97/13865 und Scott et al, (1997), WO 97/38116 ).
Ein Gen-Silencing kann auch mittels Insertionsmutagenese (zum Beispiel T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien, wie sie unter anderen bei Angell und Baulcombe ((1999), Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben sind, erreicht werden.
Gen-Silencing kann auch stattfinden, wenn eine Mutation an einem endogenen Gen und/oder eine Mutation an einem isolierten Gen bzw. einer isolierten Nukleinsäure, das/die anschließend in eine Pflanze eingeführt wird, vorliegt. Die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination kann von einem nichtfunktionellen Polypeptid verursacht werden. So kann das Polypeptid zum Beispiel an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid bereitstellen, das noch fähig ist, interagierende Proteine (wie Rezeptorproteine) zu binden, das jedoch nicht seine normale Funktion (wie Signalligand) ausüben kann.
Ein weiterer Ansatz beim Gen-Silencing besteht darin, dass man Nukleinsäuresequenzen, die zu der Regulationsregion des Gens (z. B. dem Promoter und/oder den Enhancern) komplementär ist, ansteuert, um dreifache Helixstrukturen zu bilden, die die Transkription des Gens in den Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al, Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36, 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
Der Fachmann wird mit anderen Methoden, wie der Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, um dessen Funktion in planta zu hemmen, oder dem Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, gut vertraut sein. Insbesondere ist es vorstellbar, dass künstlich hergestellte Moleküle für die Hemmung der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder für das Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
Es kann jedoch auch ein Screening-Programm angelegt werden, um innerhalb einer Pflanzenpopulation natürliche Varianten eines Gens, die für Polypeptide mit verringerter Aktivität kodieren, zu identifizieren. Solche natürliche Varianten können zum Beispiel auch verwendet werden, um eine homologe Rekombination durchzuführen.
Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (miRNAs) können dazu verwendet werden, um ein Knock-Out der Genexpression und/oder mRNA Translation durchzuführen. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs, die typischerweise 19–24 Nukleotide lang sind. Ihre Funktion besteht in erster Linie in der Regulation der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen mikroRNAs (miRNAs) weisen eine komplette oder beinahe komplette Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Es gibt jedoch natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Diese werden ausgehend von längeren nichtkodierenden RNAs mit charakteristischen „Fold-Back”-Strukturen durch doppelsträngige spezifische RNasen der Dicer-Familie prozessiert. Bei der Prozessierung werden sie in den „RNA-induced silencing”-Komplex (RISC) eingebaut, und zwar durch Bindung an dessen Hauptkomponente, ein Argonautenprotein. miRNAs dienen als Spezifitätskomponenten des RISCs, da sie eine Basenpaarung mit Zielnukleinsäuren, in erster Linie mRNAs, im Cytoplasma eingehen. Anschließende Regulationsereignisse beinhalten die Spaltung der Ziel-mRNA und die Zerstörung und/oder translationelle Hemmung. Auswirkungen der miRNA-Überexpression spiegeln sich daher häufig in verringerten mRNA-Mengen der Zielgene wider.
Künstliche microRNAs (amiRNAs), die typischerweise 21 Nukleotide lang sind, können dahingehend einem Genetic Engineering unterworfen werden, dass sie spezifisch die Genexpression von einzelnen oder mehreren interessierenden Genen negativ regulieren. Determinanten der pflanzlichen microRNA-Zielauswahl sind in der Fachwelt gut bekannt Es wurden empirische Parameter für die Zielerkennung definiert, und diese können als Hilfe beim Entwickeln von spezfischen amiRNAs verwendet werden (Schwab et al, Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Praktische Werkzeuge für die Entwicklung und Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorstufen sind ebenfalls für die Allgemeinheit verfügbar (Schwab et al, Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
Für eine optimale Leistung ist bei den Gen-Silencing-Techniken, die für die Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze verwendet werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen von monokotylen Pflanzen für die Transformation von monokotylen Pflanzen und von Nukleinsäuresequenzen von dikotylen Pflanzen für die Transformation von dikotylen Pflanzen erforderlich. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz von einer beliebigen Pflanzenart in dieselbe Art eingeführt. So wird zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz aus dem Reis in einer Reispflanze hineintransformiert. Es ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz von derselben Pflanzenart wie diejenige Pflanze, in die sie eingeführt werden wird, stammt. Es reicht aus, dass eine Art wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
Im obigen Text sind Beispiele für verschiedene Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze beschrieben. Ein Fachmann wäre leicht fähig, die oben genannten Silencing Verfahren dahingehend zu adaptieren, dass eine Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer ganzen Pflanze oder in Teilen davon durch die Verwendung von z. B. einem entsprechenden Promoter erzielt wird.
Selektionsmarker(gen)Reportergen
„Selektionsmarker”, „Selektionsmarkergen” oder „Reportergen” beinhaltet jegliches Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, um die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transfiziert sind oder transformiert sind, zu erleichtern, einen Phänotyp verleiht. Mit diesen Markergenen kann ein erfolgreicher Transfer der Nukleinsäuremoleküle mittels einer Reihe von unterschiedlichen Prinzipien identifiziert werden. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, die ein neues Stoffwechselmerkmal einführen oder die eine visuelle Selektion gestatten. Zu Selektionsmarkergenen zählen zum Beispiel Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die Resistenz gegen zum Beispiel Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosate vermitteln, oder die Gene, die Resistenz gegen z. B. Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff verleihen), oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, oder Xyloseisomerase für die Verwertung von Xylose, oder Antinährstoffmarker, wie Resistenz gegen 2-Desoxyglucose), vermitteln. Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, zum Beispiel X-Gal), Lumineszenz (wie das Luziferin/Luziferase-System) oder Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP, und seine Derivate). Diese Aufzählung stellt nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern dar. Der Fachmann ist mit solchen Marker vertraut. Je nach dem Organismus und dem Selektionsverfahren werden unterschiedliche Marker bevorzugt.
Es ist bekannt, dass bei der stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur ein kleiner Teil der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und gewünschtenfalls in ihr Genom integriert, was von dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik abhängt. Um diese Integranten zu identifizieren und auszuselektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen) kodiert, gemeinsam mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel bei Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene nichtfunktionell sind, und zwar zum Beispiel durch Deletion mit traditionellen Verfahren. Weiterhin können Nukleinsäuremoleküle, die für einen Selektionsmarker kodieren, in einer Wirtszellen auf demselben Vektor, der die Sequenz, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide kodiert, umfasst, oder auch in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel überleben Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, während die anderen Zellen absterben).
Da, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingeführt worden sind, die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht mehr erforderlich sind oder unerwünscht sind, werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Einführung der Nukleinsäuren vorteilhaft Techniken verwendet, die die Entfernung oder das Herausschneiden dieser Markergene gestatten. Eines dieser Verfahren ist die so genannten Cotransformation. Bei dem Cotransformationsverfahren werden zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation verwendet, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter Vektor das Markergen bzw. die Markergene trägt. Ein Großteil der Transformanten erhält oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beider Vektoren. Bei der Transformation mit Agrobakterien erhalten die Transformanten üblicherweise nur einen Teil des Vektors, d. h. diejenige Sequenz, die von der T-DNA flankiert ist, die üblicherweise die Expressionskassette darstellt. Die Markergene können anschließend von der transformierten Pflanze mittels Kreuzen entfernt werden. Bei einem anderen Verfahren werden für die Transformation Markergene, die in ein Transposon integriert sind, gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure eingesetzt (dies ist unter der Bezeichnung Ac/Ds-Technologie bekannt). Die Transformanten können mit einer Transposasequelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, das transient oder stabil die Expression einer Transposase vermittelt, transformiert. In manchen Fällen (ungefähr 10%) springt das Transposon, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, aus dem Genom der Wirtszelle heraus und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an einen anderen Locus. In diesen Fällen muss das Markergen durch Kreuzen entfernt werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die den Nachweis solcher Ereignisse möglich machen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf den so genannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil darin besteht, dass ein Entfernen durch Kreuzen nicht erforderlich ist. Das bekannteste System dieses Typs ist unter der Bezeichnung Cre/lox-System bekannt. Cre1 ist eine Rekombinase, die die Sequenzen, die sich zwischen den loxP-Sequenzen befinden, entfernt. Ist das Markergen zwischen den loxP-Sequenzen integriert, so wird es, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, durch Expression der Rekombinase entfernt. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al, J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al, J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Natürlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen wie Hefe, Pilze oder Bakterien angewandt werden.
Trensgen/transgen/rekombinant
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „transgen”, „Transgen” oder „rekombinant” eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor umfassend die Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus, der mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren transformiert ist, wobei alle diese Konstrukte mittels rekombinanter Verfahren entstehen, in denen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen für Proteine kodieren, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, oder
(b) genetische Kontrollsequenz(en) in operativer Verknüpfung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel einem Promoter, oder
(c) a) und b)

US 5,565,350

WO 00/15815

Unter einen transgenen Pflanze versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wie oben, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Locus im Genom dieser Pflanze vorliegen, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Wie erwähnt bedeutet transgen auch, dass die Sequenz in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind, obwohl die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die Nukleinsäuren, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, in ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen. Transgen bedeutet vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an einem unnatürlichen Locus” in dem Genom, d. h. dass eine homologe, oder vorzugsweise, heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanze werden im vorliegenden Text erwähnt.
Transformation
Der Begriff „Einführung” oder „Transformation” umfasst im vorliegenden Zusammenhang den Transfer eines Fremdpolynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für den Transfer eingesetzten Verfahren. Pflanzengewebe, das anschließend durch Klonieren vermehrt werden kann, egal ob durch Organgenese oder Embryogenese, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert werden und eine ganze Pflanze daraus regeneriert werden. Das jeweilige ausgewählte Gewebe hängt von den jeweiligen Klonierungsvermehrungssytemen ab, die für die jeweilige zu transformierende Art Verfügbar und am besten geeignet sind. Zu Zielgeweben zählen zum Beispiel Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achelknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in eine Wirtszelle transient oder stabil eingeführt werden und kann in nichtintegrierter Form, zum Beispiel als Plasmid, aufrechterhalten werden. Es kann jedoch auch in das Wirtsgenom integriert werden. Mit den erhaltenen transformierten Pflanzenzellen kann man dann eine transformierte Pflanze auf fachbekannte Art und Weise regenerieren.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird Transformation genannt. Die Transformation von Pflanzenarten ist heutzutage eine ziemliche Routineangelegenheit. Um das interessierende Gen in eine geeignete Vorfahrenzelle einzuführen, kann vorteilhafterweise irgendeine von verschiedenen Transformationsmethoden eingesetzt werden. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Methoden können für die transiente oder für die stabile Transformation eingesetzt werden. Zu Transformationsmethoden zählen die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, die die freie DNA-Aufnahme verstärken, die Injektion der DNA direkt in die Pflanze, der Beschuss mit der Genkanone, die Transformation mit Viren oder Pollen und die Mikroprojektion. Die Methoden können aus den folgenden ausgewählt werden: Calcium/Polyethylenglycol-Methode für Protoplasten (Krens, F. A. et al, (1982), Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al, (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al, (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al, (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); Beschuss mit mit DNA oder RNA beschichteten Partikeln (Klein TM et al, (1987), Nature 327: 70), Infektion mit (nichtintegrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, darunter auch transgene Kulturpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erzeugt. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken lassen oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien inokulieren. Erfindungsgemäß hat sich besonders günstig erwiesen, eine Suspension von transformierten Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest die Blütenprimordien einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter herangezogen, bis man die Samen der behandelten Pflanze erhält (Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743). Zu den Methoden für die Agrobacteriumvermittelte Transformation des Reises zählen gut bekannte Methoden für die Reistransformation, wie diejenigen, die in einer der folgenden Schriften beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al, (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al, (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), die hiermit durch Bezugnahme als ob vollständig beschrieben in den vorliegenden Text aufgenommen werden. Bei der Transformation des Maises ist die bevorzugte Methode entweder wie bei Ishida et al, (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder bei Frame et al, (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme als ob vollständig beschrieben in den vorliegenden Text aufgenommen werden. Diese Methoden sind weiterhin zum Beispiel bei B. Jenes et al, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al, Nud. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die mit solch einem Vektor transformiert wurden, können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana zählt im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, und zwar zum Beispiel dadurch, dass man verletzte Blätter oder zerkleinerte Blätter in einer Agrobakterienlösung badet und sie dann in geeigneten Medien kultiviert. Die Transformation von Pflanzen mittel Agrobacterium tumefaciens wird zum Beispiel bei Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
Zusätzlich zu der Transformation von somatischen Zellen, die dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, kann man auch Zellen von pflanzlichen Meristemen transformieren, insbesondere solche Zellen, die sich zu Gameten entwickeln. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung und ergeben transgene Pflanze. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und man erhält von den sich entwickelnden Pflanzen, von denen ein gewisser Teil transformiert und daher transgen ist, Samen [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Andere Methoden beruhen auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch ebenfalls später transformierte Samen erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Eine besonders wirksame Methode ist jedoch die Vakuuminfiltrationsmethode mit ihren Modifikationen, wie der „floral dip”-Methode. Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], während bei der „floral dip”-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer mit Tensid behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743]. Ein gewisser Anteil transgener Samen wird in beiden Fällen geerntet, und diese Samen lassen sich von nichttransgenen Samen dadurch unterscheiden, dass man sie unter den oben beschriebenen Selektionsbedingungen heranzieht. Außerdem ist die stabile Transformation von Plastiden vorteilhaft, da Plastide bei den meisten Kulturpflanzen mütterlich vererbt werden, wodurch die Gefahr des Transgenflusses durch Pollen reduziert oder eliminiert wird. Die Transformation des Chloroplastengenoms erfolgt im Allgemeinen durch ein Verfahren, das schematisch bei Klaus et al, 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] gezeigt wunde. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen gemeinsam mit einem Selektionsmarkergen zwischen flankierende Sequenzen, die zu dem Chloroplastengenom homolog sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen dirigieren die ortsgerichtete Integration in das Plastom. Die Plastidentransformation ist für viele unterschiedliche Pflanzenarten beschrieben worden, und eine Übersicht findet sich bei Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3): 425–38 oder Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Über einen weiteren Fortschritt in der Biotechnologie ist in jüngster Zeit in Form von markerfreien Plastidentransformanten, die durch ein transientes cointegriertes Markergen erzeugt werden können, berichtet worden (Klaus et al, 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
T-DNA-Aktivierungs-Tagging
T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al, Science (1992), 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, die üblicherweise einen Promoter (kann auch ein Translationsenhancer oder ein Intron sein) enthält, in die Genomregion des interessierenden Gens oder 10 kB stromaufwärts oder stromabwärts von der Kodierregion eines Gens in solch einer Anordnung, dass der Promoter die Expression des Zielgens dirigiert. Typischerweise wird die Regulation der Expression des Zielgens unterbrochen, und das Gen gelangt unter die Kontrolle des neu eingeführten Promoters. Typischerweise ist der Promoter in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird in das pflanzliche Genom zufallsmäßig insertiert, zum Beispiel mittel Agrobacterium-Infektion, und führt zu einer modifizierten Expression von Genen in der Nähe der inserierten T-DNA. Die entstehenden transgenen Pflanzen weisen aufgrund der modifizierten Expression von Genen in der Nähe des eingeführten Promoters dominante Phänotypen auf.
TILLING
Der Begriff „TILLING” ist eine Abkürzung von „Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die sich dazu eignet, Nukleinsäuren, die für Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren, zu erzeugen und/oder zu identifizieren. TILLING ermöglicht auch die Selektion von Pflanzen, die solche Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufweisen, und zwar entweder bezüglich der Stärke oder der Lokalisierung oder des Zeitpunkts (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promoter betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufweisen als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. Beim TILLING wird Mutagenese in hoher Dichte mit Screening-Methoden mit hohem Durchsatz kombiniert. Die Schritte, die beim TILLING typischerweise durchlaufen werden, lauten: (a) EMS-Mutagenese (Redet GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al, (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods on Molecular Biology, Band 82. Humane Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Herstellung und Poolen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer interessierenden Region; (d) Denaturieren und Annealing, um die Bildung von Heteroduplexen zu ermöglichen; (e) DHPLC, wo das Vorhandensein eines Heteroduplex in einem Pool als zusätzlicher Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifizieren der einzelnen Mutante; und (g) Sequenzieren des PCR-Produkts der Mutante. TILLING-Methoden sind in der Fachwelt gut bekannt (McCallum et al, (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50) erwähnt.
Homologe Rekombination
Die homologe Rekombination gestattet die Einführung einer ausgewählten Nukleinsäure in ein Genom in einer definierten ausgewählten Position. Die homologe Rekombination ist eine Standardtechnik, die routinemäßig in den Biowissenschaften für niedere Organismen wie Hefe oder das Moos Physcomitrella eingesetzt wird. Methoden für die Durchführung der homologen Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen (Offringa et al, (1990), EMBO J. 9(10): 3077–84), sondern auch für Kulturpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et. al, (2002), Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004), Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8) beschrieben worden, und es gibt Ansätze, die unabhängig von dem Zielorganismus allgemein anwendbar sind (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
Ertrag
Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen ein messbares Produkt von wirtschaftlichem Wert, das typischerweise mit einer bezeichneten Kulturpflanze, einem Ort und einem Zeitraum in Relation steht. Die einzelnen Pflanzenteile tragen direkt aufgrund ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts zum Ertrag bei, bzw. ist der tatsächliche Ertrag der Ertrag pro Quadratmeter für eine Kultur und ein Jahr, der dadurch bestimmt wird, dass man die Gesamtproduktion (was sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion beinhaltet) durch die bepflanzten Quadratmeter dividiert. Der Begriff „Ertrag” einer Pflanze kann sich auf die vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die Reproduktionsorgane und/oder auf Vermehrungsmaterial (wie Samen) derjenigen Pflanze beziehen.
Jungpflanzenvitalität
”Jungpflanzenvitalität” bezieht sich auf aktives gesundes balanciertes Wachstum, insbesondere während der Frühstadien des Pflanzenwachstums, und kann das Ergebnis einer erhöhten pflanzlichen Anpassungsfähigkeit aufgrund von z. B. einer besseren Adaption der Pflanzen an ihre Umwelt (d. h. Optimieren der Nutzung von Energieressourcen und Aufteilung zwischen Spross und Wurzel) sein. Pflanzen mit Jungpflanzenvitalität weisen auch ein erhöhtes Überleben der Keimpflanzen und eine besseres Etablieren der Kultur auf, was häufig zu stark einheitlichen Feldern (wobei die Kultur einheitlich heranwächst, d. h. wobei der Großteil der Pflanzen die verschiedenen Entwicklungsstadien im Wesentlichen gleichzeitig erreicht) und häufig zu einem besseren und höheren Ertrag führt. Jungpflanzenvitalität lässt sich daher dadurch bestimmen, dass man verschiedene Faktoren misst, wie Tausendkorngewicht, Keimungsprozentsatz, Prozentsatz des Auflaufens, Keimpflanzenwachstum, Keimpflanzenhöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und viele andere mehr.
Erhöhen/Verbessern/Fördern
Die Begriffe „erhöhen”, „Verbessern” oder „fördern” sind untereinander austauschbar und sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, starker bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen wie im vorliegenden Text definiert bedeuten.
Samenertrag
Ein erhöhter Samenertrag kann sich als eine oder mehrere der folgenden Erscheinungen äußern: a) Erhöhung der Samenbiomasse (Samengesamtgewicht), entweder auf Grundlage der einzelnen Samen und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter; b) erhöhte Anzahl Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl (gefüllte) Samen; d) erhöhte Samenfüllungsrate (die als Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als Verhältnis des Ertrags von Erntegut wie Samen dividiert durch die Gesamtbiomasse ausgedrückt wird; sowie f) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), das aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKG kann das Ergebnis einer erhöhten Samengröße und/oder eines erhöhten Samengewichts sein und kann auch das Ergebnis einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße sein.
Eine Erhöhung der Samenausbeute kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern. Eine Erhöhung der Samenausbeute kann sich auch als Erhöhung der Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Ertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur vorliegen.
„Greenness”-Index
Der „Greenness-Index” wird im vorliegenden Zusammenhang aufgrund von digitalen Bildern von Pflanzen berechnet. Für jedes Pixel, das zu dem pflanzlichen Subjekt des Bilds gehört, wird das Verhältnis zwischen dem Grünwert und dem Rotwert (im RGB-Modell für die Farbkodierung) berechnet. Der „Greenness-Index” wird als Prozentsatz Pixel, bei denen das Grün/Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt, ausgedrückt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Nährstoffmangel-Wachstumsbedingungen wird der „Greenness-Index” von Pflanzen beim letzten Imaging vor der Blüte gemessen. Im Gegensatz dazu wird der „Greenness-Index” von Pflanzen unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen beim ersten Imaging nach der Trockenheit gemessen.
Pflanze
Der Begriff „Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachfahren der Pflanzen und Pflanzenteile, darunter Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst. Der Begriff „Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst.
Zu Pflanzen, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders eignen, zählen all diejenigen Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futterleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelpflanzen, Bäume oder Sträucher aus der Liste, die folgende umfasst: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp., Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola-Raps, normaler Raps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B.. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Omithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp.; Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum mache, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. und viele andere mehr.
Genaue Beschreibung der Erfindung
I NITR
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen führt, die im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, moduliert, bereit.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert.
Wird im folgenden Text ein Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist,” erwähnt, so versteht man darunter ein NITR-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert. Wird im folgenden Text eine „Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist,” erwähnt, so bedeutet dies eine Nukleinsäure, die fähig ist, für solch ein NITR-Polypeptid zu kodieren. Die in eine Pflanze einzuführende Nukleinsäure (und die daher beim Durchführen der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist) ist jede beliebige Nukleinsäure, die für die Art von Protein, die nun beschrieben werden wird, kodiert, und wird im Folgenden auch ”NITR-Nukleinsäure” oder ”NITR-Gen” genannt.
Ein wie im vorliegenden Text definiertes ”NITR-Polypeptid” bezieht sich auf das Nitritreduktaseprotein gemäß SEQ ID NO: 2 und auf dessen Homologe (Orthologe und Paraloge). Die Nitritreduktasen gehören zu der Enzymklasse EC 1.7.7.1 und katalysieren die Reduktion von Nitrid zu Ammonium. Vorzugsweise verfügen die Homologe von SEQ ID NO: 2 über eine NIR_SIR-Domäne. NIR_SIR-Domänen (Pfam-Eingang PF01077, Nitrit- und Sulfitreduktase, 4Fe-4S-Region) sind in der Fachwelt gut bekannt und können vom Fachmann leicht identifiziert werden. Vorzugsweise umfassen die NITR-Polypeptide auch eine oder mehrere der folgenden Domänen:

• InterPro: IPR005117 (Nitrit-/Sulfitreduktase, Hämoprotein-bete-Komponente, ferrodoxinartig)
• PFAM: PF03460 (NIR_SIR_ferr)
• InterPro: IPR006066 (Nitrit- und Sulfitreduktase, Eisen-Schwefel/Sirohäm-Bindungsstelle)
• PRINTS: PR00397 (SIROHAEM)
• PROSITE: PS00365 (NIR_SIR)
• InterPro: IPR006067 (Nitrit- und Sulfitreduktase, 4Fe-4S-Region)
• GENE3D: G3DSA:3.30.413.10 (G3DSA:3.30.413.10)

Alternativ weist das Homolog eines NITR-Proteins mit ansteigender Bevorzugung mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure gemäß SEQ ID NO: 2 auf, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein die wie oben umrissenen konservierten Domänen umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Verwendung eines Gesamt-Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus in dem GAP-Programm (GCG Wisconsin Package, Accelrys) bestimmt, und zwar vorzugsweise mit Default-Parameter und vorzugsweise mit Sequenzen von reifen Proteinen (d. h. ohne dass Sekretionssignale oder Transitpeptide in Betracht gezogen werden). Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn nur konservierte Domänen oder Motive in Betracht gezogen werden.
Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz die, wenn sie bei der Konstruktion eines phylogenetischen Stamm Baums wie dem in dargestellten eingesetzt wird, Cluster mit der Gruppe der NITR-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, und nicht mit Sulfitreduktasen oder einer beliebigen anderen Gruppe.
Die Begriffe „Domäne” und „Motiv” werden im vorliegenden Text in dem Abschnitt „Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al, (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al, (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al, Nud. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al, Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Ein Satz Werkzeuge für die in-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al, ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788(2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der „matches” maximiert und die Anzahl der „gaps” minimiert. Beim BLAST Algorithmus (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologe können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden ((Campanella et al, BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie dem Fachmann klar wird, kleine händische Veränderungen vorgenommen werden. So können außerdem statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt. Weiterhin weisen NITR-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form), insofern als SEQ ID NO: 2 und seine Homologe betroffen sind, typischerweise eine Oxidoreduktaseaktivität auf. Werkzeuge und Techniken für die Bestimmung der Oxidoreduktaseaktivität sind in der Fachwelt gut bekannt, siehe zum Beispiel Ferrari und Varner, Plant Physiol., 47(6), 790–794 (1971).
Die Nitritreduktasen bilden zusammen mit den Sulfitreduktasen (EC 1.8.1.2, Hilz et al., Biochem. Z. 332, 151–166, 1959), die die Reaktion Schwefelwasserstoff + 3 NADP + + 3 H2O = Sulfit + 3 NADPH + 3 H + eine Gruppe. Es ist jedoch anzumerken, dass die Gruppe der Sulfitreduktasen nicht von dem Ausdruck NITR, wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst werden.
Die vorliegende Erfindung wird dadurch, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, die für die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert, transformiert, dargestellt. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft mit jeder Nukleinsäure, die für NITR-Polypeptide kodiert, oder mit NITR-Polypeptiden, wie sie im vorliegenden Text definiert sind, durchgeführt werden (die Sulfitreduktasen sind dadurch ausgeschlossen).
Beispiele für Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren (wie diejenigen, die in 2 oder im Sequenzprotokoll bereitgestellt sind), finden sich in im Stand der Technik bekannten Datenbanken. Solche Nukleinsäuren sind bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich. Orthologe und Paraloge, wobei die Begriffe „Orthologe^„ und „Paraloge” wie im vorliegenden Text definiert sind, können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein „BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von SEQ ID NO: 2). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gewünschtenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis thaliana). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der „Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das „Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mittels dem Prozentsatz der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure- (oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten nützlich sein, die für Homologe und Derivate von SEQ ID NO: 2 kodieren, wobei die Begriffe „Homolog„ und „Derivat” wie im vorliegenden Text definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren nützlich, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von SEQ ID NO: 2 kodieren. Homologe und Derivate, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren, die mittels „gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, Allelvariante und „gene shuffling” sind wie im vorliegenden Text definiert.
Nukleinsäuren die für NITR-Polypeptide kodieren, müssen nicht unbedingt Volllängennukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von SEQ ID NO: 1 oder einen Abschnitt von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 2 kodiert, einführt und exprimiert.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere Kodiersequenzen (oder Nichtkodiersequenzen) fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion an andere Kodiersequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
Abschnitte, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein NITR-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der Nukleinsäuren in SEQ ID NO: 1 oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Aminosäuresequenzen in SEQ ID NO: 1 kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750 aufeinanderfolgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um SEQ ID NO: 1 handelt oder um eine Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 2 kodiert, handelt. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1
Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Nukleinsäure, die fähig ist, unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, oder mit einem Abschnitt wie im vorliegenden Text zu hybridisieren vermag.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit SEQ ID NO: 1 zu hybridisieren vermag, einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 1 kodiert, zu hybridisieren vermag, einführt und exprimiert.
Hybridisierende Sequenzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein NITR-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert, wobei sie im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 aufweisen. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit SEQ ID NO: 1 oder einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen zu hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz fähig ist, mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 2 kodiert, zu hybridisieren.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Spleißvariante, die für ein NITR-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Spleißvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von SEQ ID NO: 1 oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 2 kodiert, einführt und exprimiert.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Allelvariante, die für ein NITR-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Allelvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Allelvariante von SEQ ID NO: 1 oder eine Allelvariante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert, einführt und exprimiert.
Die Allelvarianten, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das NITR-Polypeptid von SEQ ID NO: 2 auf. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und die Verwendung dieser natürlichen Allele ist von den erfindungsgemäßen Verfahren umfasst. „Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, um Varianten von Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide wie oben definiert kodieren, zu erzeugen; wobei der Begriff „gene shuffling” wie oben definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von SEQ ID NO: 1 oder eine Variante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 2 kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels „gene shuffling” erhalten wird.
Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Methoden auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Verlegt bei Wiley).
Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abstammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezieltes menschliches Eingreifen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die für das NITR-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze. Im Falle von SEQ ID NO: 1 stammt die Nukleinsäure, die für das NITR-Polypeptid kodiert, vorzugsweise von einer monokotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure von Arabidopsis thaliana.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verstärkten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe „Ertrag” und „Samenertrag” werden im vorliegenden Text im Abschnitt Definitionen” genauer beschrieben.
Werden im vorliegenden Text verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Jungpflanzenvitalität und/oder der Biomasse bzw. des Biomassegewichts von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile die Biomasse und/oder Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität, erhöhter Biomasse und/oder erhöhter Samenausbeute in Bezug auf die Jungpflanzenvitalität, die Biomasse oder den Samenertrag von Kontrollpflanzen.
Wählt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Erhöhte Anzahl Pflanzen, die pro Quadratmeter etabliert sind, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, Ährenlänge/-durchmessers, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert) und viele andere mehr. Wählt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich einem oder mehreren der folgenden Merkmale ausdrücken: Anzahl Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausenkorngewicht und viele andere mehr.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Erhöhung des Ertrags, insbesondere der Biomasse und/oder des Samenertrags von Pflanzen, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindestens während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate aufweisen.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, „Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenabreifung beeinflusst werden. Die erhöhte Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, so kann dies ein weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wachstumsperiode). Auf ähnliche Weise kann, wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, dies ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließendes z. B. Aussäen und gewünschtenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann es auch möglich sein, dass man zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten kann. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh In der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parameter von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter folgendes sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und viele mehr.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht. In einer besonderen Ausführungsform führt die Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität.
Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate findet statt, egal, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressfaktoren unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, starker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Milder Stress ist der alltägliche biotische und/oder abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Minustemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise Stressfaktoren, die von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen und Insekten verursacht werden.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder milden Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag erhält. Wie von Wang et al, (Plante (2003), 218: 1–14) beschrieben führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al, (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. So äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Das Ergebnis ist, dass diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen aktivieren, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff „Nichtstress”-Bedingungen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen gestatten. Die Fachwelt ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu geeigneten Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, erhöhten Ertrag und/oder erhöhte Jungpflanzenvitalität aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags und/oder der Jungpflanzenvitalität von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, erhöht.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren vermittelt Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, heranwachsen, einen im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen wachsenden Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nahrstoffmangelbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst. Nährstoffmangel kann das Ergebnis einer Unterversorgung mit Nährstoffen wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Kadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor und anderen mehr sein.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Salzstress einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, erhöhten Ertrag aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Salzstressbedingungen wachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein POI-Polypeptid kodiert, moduliert. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern es kann sich dabei um eine oder mehrere der folgenden Substanzen handeln: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂ sowie andere.
Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (darunter Samen), die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das für ein NITR-Polypeptid wie oben definiert, kodiert.
Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in dem erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt umfassend

(a) eine Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
(b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die für NITR-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Der Begriff ”Kontrollsequenz” und „Terminationssequenz” sind wie im vorliegenden Text definiert.
Die Pflanzen werden mit einem Vektor umfassend eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuren transformiert. Der Fachmann ist mit den genetischen Elementen, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren, vertraut. Die interessierende Sequenz ist operativ mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) verbunden.
Für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz kann vorteilhaft jede Art von Promoter, egal, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden. Ein konstitutiver Promoter ist bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promoter auch um einen ubiquitären Promoter. Für Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe den Abschnitt ”Definitionen” im vorliegenden Text.
Es ist klar, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1, die für das NITR-Polypeptid kodiert, beschränkt ist bzw. dass die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, wenn sie von einem konstitutiven spezifischen Promoter vorangetrieben wird, beschränkt ist.
Bei dem konstitutiven Promoter handelt es sich vorzugsweise um einen mittelstarken Promoter pflanzlichen Ursprungs, vorzugsweise um einen GOS2-Promoter, stärker bevorzugt um einen Reis-GOS2-Promoter. Weiterhin wird bevorzugt, dass der konstitutive Promoter durch eine Nukleinsäuresequenz dargestellt wird, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 3 ähnlich ist, am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promoter wie durch SEQ ID NO: 3 dargestellt. Für weitere Beispiele für konstitutive Promoter siehe Tabelle 2 in Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text.
Bei dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, kann/können gewünschtenfalls eine oder mehrere Terminatorsequenzen verwendet werden. Zu zusätzlichen Regulationselementen können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer zählen. Die Fachwelt ist mit Terminator- und Enhancer-Sequenzeng wie sie für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können, vertraut. Um die Menge der reifen Botschaft, die im Cytosol akkumuliert wird, kann eine Introsequenz auch zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz hinzugefügt werden, wie im Abschnitt „Definitionen” beschrieben. Andere Kontrollsequenzen (neben Promoter-, Enhancer-, Silencer-, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt bzw. können von diesem leicht erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Zu bevorzugten Replikationsursprüngen zählen der f1-ori und colE1, sind jedoch hierauf nicht beschränkt.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanze, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (bzw. Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann daher gewünschtenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen.
Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben. Die Markergene können, wenn sie nicht mehr gebraucht werden, aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden. Techniken für die Entfernung von Markern sind in der Fachwelt bekannt, und nützliche Techniken sind oben im Abschnitt „Definitionen” beschrieben.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen bereit, welches das Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid wie oben definiert kodiert, in eine(r) Pflanze umfasst.
Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Jungpflanzenvitalität und/oder erhöhtem Ertrag bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzeile unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.

Bei der Nukleinsäure von (i) kann es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die fähig ist, für ein wie im vorliegenden Text definiertes NITR-Polypeptid zu kodieren, handeln.
Die Nukleinsäure kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen sonstigen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure in eine Pflanze vorzugsweise mittels Transformation eingeführt. Der Begriff ”Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt „Definitionen” genauer beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Arbeiten von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, selektiert, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wunden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, sodass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden; beide Techniken sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1 = Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. So kann es sich um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen handeln; um klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); um Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf einen untransformierten Edelreis gepfropft wurde).
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jegliche Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf alle Pflanzenteile und alles Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes NITR-Polypeptid kodiert, enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuren oder Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die fähig sind, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide zu synthetisieren.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen zählen zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen zählt zum Beispiel das Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden zählen zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mohrenhirse, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze wie zum Beispiel, jedoch nicht einschränkend, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei diese erntbaren Teile eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, enthalten. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntbaren Teil von solch einer Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um eine erhöhte Expression. Verfahren zum Erhöhen der Expression von Nukleinsäuren oder Genen, oder Genprodukten, sind in der Fachwelt gut beschrieben, und Beispiele finden sich im Abschnitt „Definitionen”.
Wie oben erwähnt besteht ein bevorzugtes Verfahren für die Modulation (vorzugsweise das Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert; die Auswirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. des Verbesserns der Ertragsmerkmale, können auch unter Verwendung von anderen gut bekannten Techniken erzielt werden, darunter, jedoch nicht einschränkend, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnit ”Definitionen”.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die für wie im vorliegenden Text beschriebene NITR-Polypeptide kodieren, und die Verwendung dieser NITR-Polypeptide bei der Verbesserung von einem der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
Nukleinsäuren, die für ein wie im vorliegenden Text beschriebenes NITR-Polypeptid kodieren, bzw. die NITR-Polypeptide selbst, können in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, in denen ein DNA-Marker, der genetisch mit einem für ein NITR-Polypeptid kodierenden Gen verbunden sein kann, identifiziert wird. Die Nukleinsäuren/Gene bzw. die NITR-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, um Pflanzen zu selektieren, die wie oben in den erfindungsgemäßen Verfahren definierte, verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen.
Allelvarianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das für ein NITR-Polypeptid kodiert, können ebenfalls in Marker gestützten Zuchtprogrammen Verwendung finden. Für solche Zuchtprogramme ist es manchmal erforderlich, dass mittels mutagener Behandlung von Pflanzen, zum Beispiel mittels EMS-Mutagenese, eine Allelvariation eingeführt wird; alternativ dazu kann dem Programm eine Kollektion von Allelvarianten so genannten „natürlichen” Ursprungs, die unabsichtlich erzeugt wurden, als Ausgangsmaterial dienen. Anschließend findet die Identifikation von Allelvarianten statt, zum Beispiel mittels PCR. Danach schließt sich ein Schritt für die Selektion von überlegenen Allelvarianten der jeweiligen Sequenz, die einen erhöhten Ertrag geben, an. Typischerweise wird die Selektion dadurch durchgeführt, dass man die Wachstumsleistung von Pflanzen, die unterschiedliche Allelvarianten der jeweiligen Sequenz enthalten, verfolgt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Zu weiteren optionalen Schritten zählt das Kreuzen von Pflanzen, in denen die überlegene Allelvariante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Damit könnte man zum Beispiel eine Kombination von interessanten phänotypischen Merkmalen erzeugen.
Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verbunden sind, eingesetzt werden. Solche Informationen können in der Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit erwünschten Phänotypen zu entwickeln. Für solch eine Verwendung von Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren, ist nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden erforderlich. Die Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren, können als Marker für den Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989), Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von pflanzlicher genomischer DNA, mit der ein Restriktionsverdau durchgeführt wurde, können mit den Nukleinsäuren, die für NITR-Polypeptide kodieren, als Sonde behandelt werden. Mit den erhaltenen Bandierungsmustern kann man anschließend mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al, (1987), Genomics 1: 174–181) genetische Analysen durchführen, um eine Genkarte zu konstruieren. Weiterhin kann man mit den Nukleinsäuren als Sonde Southern-Blots behandeln, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs eines Satzes von Einzelorganismen, die Elter und Nachkommenschaft einer definierten genetischen Kreuzung darstellen, enthalten. Die Aufspaltung der DNA-Polymorphismen wird notiert und für die Berechnung der Position der Nukleinsäure, die für das NITR-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al, (1980), Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und die Verwendung von Sonden, die von pflanzlichen Genen abstammen, für die Verwendung in der genetischen Kartierung ist bei Bematzky und Tanksley (1986), Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Die genkartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik bzw. Variationen davon ist in zahlreichen Publikationen beschrieben. So können für die Kartierung zum Beispiel F2-Heterozygotenkreuzungspopulationen, Rückkreuzungspopulationen, Populationen mit zufälliger Paarung, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Einzelorganismen verwendet werden. Diese Methodiken sind dem Fachmann gut bekannt.
Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. die Platzierung von Sequenzen auf physikalische Karten; siehe Hoheisel et al, In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, S. 319–346, und darin genannte Literaturhinweise).
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden für ein direktes „fluorescence in situ hybridisation mapping” (FISH) verwendet werden (Trask (1991), Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl man bei den derzeitigen FISH-Kartierungsmethoden lieber größere Klone verwendet (mehrere kB bis mehrere Hundert kB; siehe Laan et al, (1995), Genome Res. 5: 13–20), können es Verbesserungen bezüglich der Empfindlichkeit ermöglichen, ein FISH-Mapping mit kürzeren Sonden durchzuführen.
Mit den Nukleinsäuren können verschiedene Verfahren für die genetische und physikalische Kartierung, die auf der Amplifikation von Nukleinsäuren beruhen, durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezfische Amplifikation (Kazazian (1989), J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), der Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al, (1993), Genomis 16: 325–332), die allelspezifische Ligation (Landegren et al, (1988), Science 241: 1077–1080), Nukleotidextensionsreaktionen (Sokolov (1990), Nucleic Acid Res. 18: 3671), „Radiation Hybrid Mapping" (Walter et al, (1997), Nat. Genet 7: 22–28) und „Happy Mapping" (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren verwendet man die Sequenz einer Nukleinsäure, um Primer-Paare für die Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primer-Extensionsreaktionen zu entwickeln und herzustellen. Die Entwicklung von solchen Primern ist dem Fachmann gut bekannt Bei Verfahren, bei denen eine Genkartierung auf PCR-Basis verwendet wird, kann es erforderlich sein, Unterschiede bezüglich der DNA-Sequenz zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht, zu identifizieren. Dies ist jedoch allgemein für Kartierungsmethoden nicht erforderlich.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie oben beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren ertragsverbessernden Merkmalen, Toleranz für andere abiotische und biotische Stressfaktoren, Merkmalen, die verschiedene Architekturaspekte und/oder biochemische und/oder physiologische Aspekte modifizieren, kombiniert werden.
II ASNS
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen führt, die im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen in Bezug auf Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert.
Ein bevorzugtes Verfahren für die Modulation (vorzugsweise die Erhöhung) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Wird im vorliegenden Text ein „Protein, das in den erfindungsgemäßen Methoden nützlich ist” erwähnt, so bedeutet dies ein ASNS-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert. Wird im vorliegenden Text eine „Nukleinsäure, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist” erwähnt, so bedeutet dies eine Nukleinsäure, die fähig ist, für solch ein ASNS-Polypeptid zu kodieren. Die in eine Pflanze einzuführende Nukleinsäure (und die daher bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist) ist jede Nukleinsäure, die für die Art von Protein, die nun beschrieben werden soll und die im Folgenden auch „ASNS-Nukleinsäure” oder ”ASNS-Gen” genannt wird, kodiert.
Ein wie im vorliegenden Text definiertes ”ASNS-Polypeptid” bezieht sich auf die Asparaginsynthase gemäß SEQ ID NO: 63 und auf ihre Homologe (Orthologe und Paraloge). Im Vergleich zu der Wildtypsequenz (Os06g0265000, SEQ ID NO: 67) umfasst die SEQ ID NO: 63 zwei Punktmutationen, nämlich R382G und S165G (6). Das Arginin in Position 382 in SEQ ID NO: 67 ist bei den Asparaginsynthasen hoch konserviert und kann Bestandteil einer großen α-Helix sein, die den molekularen Tunnel zwischen den zwei aktiven Stellen begrenzt. Es befindet sich auch in der Nähe der AMP-Bindungsstelle. Das Serin in Position 165 kann gemäß der von E. coli abgeleiteten Struktur in einer verzerrten a-Helix-Region an der Außenseite der Glutaminbindungsseite liegen. Es wird postuliert, dass die S165G-Mutation vermutlich wenige Auswirkungen auf die Struktur dieser Region haben wird.
ASNS-Polypeptide, die in den erfindungsgemäßen Methoden nützlich sind, weisen daher vorzugsweise eine Substitution des Argininrests, der R382 in SEQ ID NO: 67 entspricht, in eine Aminosäure, die die Alpha-Helix verzerrt, vorzugsweise in ein Glycin, auf. Optional weisen ASNS-Polypeptide, die in den erfindungsgemäßen Methoden nützlich sind, zusätzlich eine Substitution des Serinrests, der S165 in SEQ; ID NO: 67 entspricht, in eine andere Aminosäure, vorzugsweise in ein Glycin, auf. Arg-Reste, die R382 in SEQ ID NO: 67 entsprechen, oder Ser-Reste, die S165 entsprechen, können dadurch identifiziert werden, dass man mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 67 ein Alignment durchführt, siehe zum Beispiel das multiple Alignment in 4. Solche Alignment-Verfahren sind in der Fachwelt gut bekannt.
Vorzugsweise weisen die Homologe von SEQ ID NO: 63 eine Asn_synthase-Domäne auf. Asn_synthase-Domänen (Pfam-Eingang PF00733) sind in der Fachwelt gut bekannt und können vom Fachmann leicht identifiziert werden. Außer der Asn_synthase-Domäne weisen ASNS-Polypeptide vorzugsweise auch eine Glutaminamidotransferase, Klasse-II-Domäne (InterPro IPR000583; GATase_2 (HMMPfam-Eingang PF00310), GATase_Typ-II (PROSITE-Eingang PS00443)) und/oder eine Asparaginsynthase, glutaminhydrolisierende Domäne (asn_synth_AEB: Asparaginsynthase (glutami (TIGRFAMs-Eingang TIGR01536)) auf.
Alternativ dazu weist das Homolog eines ASNS-Proteins mit ansteigender Bevorzugung mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%,42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure gemäß SEQ ID NO: 63 auf, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein die konservierten Motive wie oben umrissen und die Substitution des Arg-Rests, der R382 in SEQ ID NO: 67 entspricht, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Verwendung eines globalen Alignment-Algorithmus wie des Needleman-Wunsch-Algorithmus, in dem Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys) bestimmt, vorzugsweise mit Default-Parametern. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn nur konservierte Domänen oder Motive in Betracht gezogen werden.
Der Begriff „Domäne” und „Motiv” wird im vorliegenden Text in dem Abschnitt „Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al, (2002), Nucleic Acids Res 30, 242–244, InterPro (Mulder et al, (2003), Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al, Nucl. Acids. Res. 32: D134– D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al, Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Ein Satz Werkzeuge für die in-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al, ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge und analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788(2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der „matches” maximiert und die Anzahl der „gaps^„ minimiert, zu finden. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologe können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parameter für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden (Campanella et al, BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie dem Fachmann klar wäre, kleine händische Veränderungen vorgenommen werden. So können zum Beispiel statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt. Für lokale Alignments eignet sich besonders der Algorithmus nach Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS (1981), J. Mol. Biol. 147(1); 195–7).
Weiterhin weisen ASNS-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form), soweit SEQ ID NO: 2 und ihre Homologe betroffen sind, typischerweise Asparaginsynthetaseaktivität auf (Patterson und Orr, J. Biol. Chem. 243, 376–380, 1968; Enzyme Catalogue 6.3.5.4, Reaktionsschema: ATP + L-Aspartat + L-Glutamin + H2O = AMP + Diphosphat + L-Asparagin + L-Glutamat). Werkzeuge und Techniken für die Bestimmung der Asparaginsynthetaseaktivität sind in der Fachwelt gut bekannt.
Die vorliegende Erfindung wird dadurch erläutert, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 62, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 63 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft mit einer beliebigen ASNS-kodierenden Nukleinsäure oder ASNS-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert durchgeführt wenden.
Beispiele für Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, finden sich in im Stand der Technik bekannten Datenbanken, und einige davon sind in 5 aufgezählt. Solche Nukleinsäuren eignen sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Orthologe und Paraloge, wobei die Begriffe „Orthologe” und „Paraloge” wie im vorliegenden Text definiert sind, können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein „BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von SEQ ID NO: 63). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gewünschtenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 62 oder SEQ ID NO: 63, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Oryza sativa). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing wenden dann verglichen. Ein Paralog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist. Beispiele von Orthologen und Paralogen von SEQ ID NO: 63 oder SEQ ID NO: 67 sind in 5 aufgezählt.
Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der „Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das „Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mittels des Prozentsatzes der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure- (oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Nukleinsäurevarianten, die für Homologe und Derivate von SEQ ID NO: 63 kodieren, können ebenfalls bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein, wobei die Begriffe „Homolog und „Derivat” wie im vorliegenden Text definiert sind. Nützlich in den erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von SEQ ID NO: 63 kodieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen.
Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, die mittels „gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe „hybridisierende Sequenz”, „Spleißvariante”, „Allelvariante” und „gene shuffling^„ sind wie im vorliegenden Text beschrieben.
Bei den Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, muss es sich nicht um Volllängen-Nukleinsäuren handeln, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht von der Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen abhängig ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze einen Teil von SEQ ID NO: 62 oder einen Teil einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 63 kodiert, einführt und exprimiert.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere Kodiersequenzen (oder Nichtkodiersequenzen) fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion an andere Kodiersequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wunde.
Abschnitte, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind und die für ein ASNS-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodieren, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 63 auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 62 oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 62 kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um SEQ ID NO: 62 oder um eine Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 63 kodiert, handelt. Am stärksten bevorzugt handelt es sich beim dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 62.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Nukleinsäure, die fähig ist, unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, oder mit einem Abschnitt wie im vorliegenden Text definiert zu hybridisieren vermag. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, das man eine Nukleinsäure, die fähig ist, mit SEQ ID NO: 62 zu hybridisieren, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Nukleinsäure, die fähig ist, an eine Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 62 zu hybridisieren, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Hybridisierende Sequenzen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein ASNS-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 63 aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit SEQ ID NO: 62 oder einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen zu hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz fähig ist, mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 63 zu hybridisieren.
Eine weitere Nukleinsäurevariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Spleißvariante, die für ein ASNS-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Spleißvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Spleißvariante von SEQ ID NO: 62, oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 63 kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Eine weitere Nukleinsäurevariante, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Allelvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Allelvariante von SEQ ID NO: 62 in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 63 kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Die Allelvarianten, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das ASNS-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 63 auf. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und die Verwendung von diesen natürlichen Allelen ist von den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst. „Gene shuffling” oder gerichtete Evolution können ebenfalls eingesetzt werden, um Varianten von Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide wie oben definiert kodieren, zu erzeugen; wobei der Begriff „gene shuffling” wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Variante von SEQ ID NO: 62 in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von SEQ ID NO: 63 kodiert, wobei diese Nukleinsäure durch „gene shuffling” erhalten wurde, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Methoden auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Verlegt bei Wiley).
Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abstammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezieltes menschliches Eingreifen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die für das ASNS-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze. Im Falle von SEQ ID NO: 62 stammt die Nukleinsäure, die für das ASNS-Polypeptid kodiert, vorzugsweise von einer monokotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure von Oryza sativa.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, speziell erhöhter Biomasse und erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe „Ertrag” und „Samenertrag” sind im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text genauer beschrieben.
Werden im vorliegenden Text verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Jungpflanzenvitalität und/oder der Biomasse bzw. des Biomassegewichts von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile die Biomasse oder Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität, erhöhter Biomasse und/oder erhöhter Samenausbeute in Bezug auf die Jungpflanzenvitalität, die Biomasse oder die Samenausbeute von Kontrollpflanzen.
Wählt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: erhöhte Anzahl Pflanzen, die pro Quadratmeter etabliert sind, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, Korngewicht, Tausendkorngewicht, Ährenlänge/-durchmesser, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert) und viele andere mehr. Wählt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich einem oder mehreren der folgenden Merkmale äußern: Anzahl Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausendkorngewicht und viele andere mehr.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Erhöhung des Ertrags, speziell der Biomasse und/oder des Samenertrags, von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate aufweisen.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, „Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenabreifung beeinflusst werden. Die erhöhte Wachstumsrate kann in einem oder mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, so kann dies ein weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wachstumsperiode). Auf ähnliche Weise kann, wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, dies ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließendes z. B. Aussäen und gewünschtenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann es auch möglich sein, dass man zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten kann. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parameter von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter folgendes sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und viele mehr.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht. Bei einer bestimmten Ausführungsform führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität.
Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate findet dann statt, wenn die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressfaktoren unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichter Stress ist der alltägliche biotische und/oder abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Minustemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise Stressfaktoren, die von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen und Insekten verursacht werden.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder milden Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag erhält. Wie von Wang et al, (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al, (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. So äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Verbindungen führen. Des Ergebnis ist, dass diese verschiedenen Umweltsstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen aktivieren, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff „Nichtstress”-Bedingungen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen gestatten. Die Fachwelt ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, erhöhten Ertrag und/oder erhöhter Jungpflanzenvitalität aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags und/oder der Jungpflanzenvitalität von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, erhöht.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren vermittelt Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, heranwachsen, einen im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen wachsenden Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst. Nährstoffmangel kann das Ergebnis einer Unterversorgung mit Nährstoffen wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Kadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor und anderen mehr sein.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Salzstressbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, erhöhten Ertrag aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Salzstressbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, moduliert. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern es kann sich dabei um eine oder mehrere der folgenden Substanzen handeln: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂, sowie andere.
Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (darunter Samen), die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das für ein ASNS-Polypeptid wie oben definiert, kodiert.
Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression der Nukleinsäuren, die für ein ASNS-Polypeptid kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation in eine Pflanze und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt umfassend

(a) eine Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
(b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Der Begriff „Kontrollsequenz” und „Terminationssequenz” sind wie im vorliegenden Text definiert.
Die Pflanzen werden mit einem Vektor umfassend eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren transformiert. Der Fachmann ist mit den genetischen Elementen, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren, vertraut. Die interessierende Sequenz ist operativ mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) verbunden.
Vorteilhafterweise kann jede Art von Promoter, egal, ob natürlich oder synthetisch eingesetzt werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz voranzutreiben, der Promoter ist jedoch vorzugsweise pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promoter ist bei den erfindungsgemäßen Methoden besonders nützlich. Vorzugsweise ist der konstitutive Promoter auch ein ubiquitärer mittelstarker Promoter. Für Definitionen der verschiedenen Promotertypen, siehe Abschnitt ”Definitionen” im vorliegenden Text.
Es muss klargestellt werden, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 62, die für das ASNS-Polypeptid kodiert, beschränkt ist und dass die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer Nukleinsäure, die für das ASNS-Polypeptid kodiert, wenn diese von einem konstitutiven spezifischen Promoter vorangetrieben wird, beschränkt ist.
Bei dem konstitutiven Promoter handelt es sich vorzugsweise um einen GOS2-Promoter, vorzugsweise um einen Reis-GOS2-Promoter. Weiterhin wird bevorzugt, dass der konstitutive Promoter durch eine Nukleinsäuresequenz dargestellt wird, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 64 ähnlich ist, am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promoter, wie durch SEQ ID NO: 64 dargestellt. Für weitere Beispiele für konstitutive Promoter siehe Tabelle 2 in Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text.
Optional können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt verwendet werden. Zusätzliche Regulationselemente können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer beinhalten. Die Fachwelt ist mit Terminator- und Enhancer-Sequenzen, wie sie für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können, vertraut. Zu den 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz kann auch eine Intronsequenz hinzugefügt werden, um die Informationsmenge, die im Zytosol akkumuliert, zu erhöhen; Beschreibung im Abschnitt „Definitionen Andere Kontrollsequenzen (neben Promoter-, Enhancer-, Silencer-, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt bzw. können von diesem leicht erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Zu bevorzugten Replikationsursprüngen zählen der f1-ori und colE1, sind jedoch hierauf nicht beschränkt.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanze, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (bzw. Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann daher gewünschtenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben. Die Markergene können, wenn sie nicht mehr gebraucht werden, aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden. Techniken für die Entfernung von Markern sind in der Fachwelt bekannt, und nützliche Techniken sind oben im Abschnitt „Definitionen” beschrieben.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid wie oben definiert kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Die Erfindung stellt spezifischer ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Jungpflanzenvitalität und/oder erhöhtem Ertrag bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.

Bei der Nukleinsäure von (i) kann es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die fähig ist, für ein wie im vorliegenden Text definiertes ASNS-Polypeptid zu kodieren, handeln.
Die Nukleinsäure kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen sonstigen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure in eine Pflanze vorzugsweise mittels Transformation eingeführt. Der Begriff „Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt „Definitionen” genauer beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Arbeiten von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, selektiert, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Norther- und/oder Western-Analyse verfolgt werden; beide Techniken sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. So kann es sich um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zeilen handeln; um klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); um Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jegliche Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf alle Pflanzenteile und alles Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes ASNS-Polypeptid kodiert, enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder den Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die fähig sind, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide zu synthetisieren.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen zähen zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen zählt zum Beispiel das Zuckerrohr. Werter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden zählen zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mohrenhirse, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze wie zum Beispiel, jedoch nicht einschränkend, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntbaren Teil von solch einer Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen, oder Genprodukten, sind in der Fachwelt gut beschrieben, und Beispiele finden sich in dem Abschnitt „Definitionen”.
Wie oben erwähnt besteht ein bevorzugtes Verfahren für die Modulation (vorzugsweise das Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert; die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Verbesserung der Ertragsmerkmale, lässt sich auch mit anderen, gut bekannten Techniken erzielen, darunter, jedoch nicht einschränkend, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung von diesen Techniken findet sich in dem Abschnitt „Definitionen Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die für wie im vorliegenden Text beschriebene ASNS-Polypeptide kodieren, und die Verwendung dieses ASNS-Polypeptids bei der Verbesserung von einem der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
Nukleinsäuren, die für ein wie im vorliegenden Text beschriebenes ASNS-Polypeptid kodieren, bzw. die ASNS-Polypeptide selbst, können in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, in denen ein DNA-Marker, der genetisch mit einem für ein ASNS-Polypeptid kodierenden Gen verbunden sein kann, identifiziert wird. Die Nukleinsäuren/Gene bzw. die ASNS-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, um Pflanzen zu selektieren, die wie oben in den erfindungsgemäßen Verfahren definierte, verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen.
Allelvarianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das für ein ASNS-Polypeptid kodiert, können ebenfalls in Marker gestützten Zuchtprogrammen Verwendung finden. Für solche Zuchtprogramme ist es manchmal erforderlich, dass mittels mutagener Behandlung von Pflanzen, zum Beispiel mittels EMS-Mutagenese, eine Allelvariation eingeführt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Kollektion von Allelvarianten so genannten „natürlichen” Ursprungs, die unabsichtlich erzeugt wurden, als Ausgangsmaterial beginnen. Anschließend findet die Identifikation von Allelvarianten statt, zum Beispiel mittels PCR. Danach schließt sich ein Schritt für die Selektion von überlegenen Allelvarianten der jeweiligen Sequenz, die einen erhöhten Ertrag geben, an. Typischerweise wird die Selektion dadurch durchgeführt, dass man die Wachstumsleistung von Pflanzen, die unterschiedliche Allelvarianten der jeweiligen Sequenz enthalten, vertilgt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Zu werteren optionalen Schritten zählt das Kreuzen von Pflanzen, in denen die überlegene Allelvariante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Damit könnte man zum Beispiel eine Kombination von interessanten phänotypischen Merkmalen erzeugen.
Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verbunden sind, eingesetzt werden. Solche Informationen können in der Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit erwünschten Phänotypen zu entwickeln. Für solch eine Verwendung von Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, ist nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden erforderlich. Die Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, können als Marker für den Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989), Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von pflanzlicher genomischer DNA, mit der ein Restriktionsverdau durchgeführt wurde, können mit den Nukleinsäuren, die für ASNS-Polypeptide kodieren, als Sonde behandelt werden. Mit den erhaltenen Bandierungsmustern kann man anschließend mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker, (Lander et al, (1987), Genomis 1: 174–181) genetische Analysen durchführen, um eine Genkarte zu konstruieren. Weiterhin kann man mit den Nukleinsäuren als Sonde Southern-Blots behandeln, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs eines Satzes von Einzelorganismen, die Elter und Nachkommenschaft einer definierten genetischen Kreuzung darstellen, enthalten. Die Aufspaltung der DNA-Polymorphismen wird notiert und für die Berechnung der Position der Nukleinsäure, die für das ASNS-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al, (1980), Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und die Verwendung von Sonden, die von pflanzlichen Genen abstammen, für die Verwendung in der genetischen Kartierung ist bei Bernatzky und Tanksley (1986), Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Die genkartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik bzw. Variationen davon ist in zahlreichen Publikationen beschrieben. So können für die Kartierung zum Beispiel F2-Heterozygotenkreuzungspopulationen, Rückkreuzungspopulationen, Populationen mit zufälliger Paarung, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Einzelorganismen verwendet werden. Diese Methodiken sind dem Fachmann gut bekannt.
Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. die Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al, In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, S. 319–346, und darin genannte Literaturhinweise).
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden für ein direktes „fluorescence in situ hybridisation mapping” (FISH) verwendet werden (Trask (1991), Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl man bei den derzeitigen FISH-Kartierungsmethoden lieber größere Klone verwendet (mehrere kB bis mehrere Hundert kB; siehe Laan et al, (1995), Genome Res. 5: 13–20), können es Verbesserungen bezüglich der Empfindlichkeit ermöglichen, ein FISH-Mapping mit kürzeren Sonden durchzuführen.
Mit den Nukleinsäuren können verschiedene Verfahren für die genetische und physikalische Kartierung, die auf der Amplifikation von Nukleinsäuren beruhen, durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989), J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), der Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al, (1993), Genomics 16: 325–332), die allelspezifische Ligation (Landegren et al, (1988), Science 241: 1077– 1080), Nukleotidextensionsreaktionen (Sokolov (1990), Nucleic. Acid Res. 18: 3671), „Radiation Hybrid Mapping” (Walter et al, (1997), Nat. Genet. 7: 22–28) und „Happy Mapping” (Dear und Cook (1989), Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren verwendet man die Sequenz einer Nukleinsäure, um Primer-Paare für die Amplifikationsreaktion oder in Primer-Extensionsreaktionen zu entwickeln und herzustellen. Die Entwicklung von solchen Primern ist dem Fachmann gut bekannt. Bei Verfahren, bei denen eine Genkartierung auf PCR-Basis verwendet wird, kann es erforderlich sein, Unterschiede bezüglich der DNA-Sequenz zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht, zu identifizieren. Dies ist jedoch allgemein für Kartierungsmethoden nicht erforderlich.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie oben beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Merkmalen, wie werteren ertragsverbessernden Merkmalen, Toleranz für andere abiotische und biotische Stressfaktoren, Merkmalen, die verschiedene Architekturaspekte und/oder biochemische und/oder physiologische Aspekte modifizieren, kombiniert werden.
Beschreibung der Abbildungen
Die vorliegende Erfindung soll nun anhand der folgenden Abbildungen beschrieben werden, in denen Folgendes dargestellt wird.
1 zeigt den binären Vektor für die erhöhte Expression einer NITR-Kodiernukleinsäure in Oryza sativa unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promoters (pGOS2::NITR).
2 beschreibt Beispiele von Sequenzen, die bei der Durchführung der Methoden gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
3 stellt einen phylogenetischen Stammbaum der in 2 aufgezählten NITR-Proteinsequenzen dar, in dem die die Outgroup durch Sulfitreduktasen repräsentiert wird, mit den Beispielen SEQ ID NO: 9 (C. reinhardtii 59303), SEQ ID NO: 11 (C. reinhardtii 192232) und SEQ ID NO: 33 (A. thaliana At5g04590).
4 zeigt den binären Vektor für die erhöhte Expression einer ASNS-Kodiernukleinsäure in Oryza sativa unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promoters (pGOS2::ASNS).
5 beschreibt Beispiele von Sequenzen, die bei der Durchführung der Methoden gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
6 gibt ein Alignment zwischen SEQ ID NO: 63 und SEQ ID NO: 67 an. Die Mutationen S165G und R382G sind eingezeichnet.
7 ist ein multiples Alignment von Beispielen für ASNS-Polypeptide. Die Sternchen bezeichnen Aminosäuren, die in allen Sequenzen identisch sind, die Strichpunkte bezeichnen hochkonservierte Reste und die Punkte zeigen konservierte Reste an. Die Arg-Reste, die R382 in SEQ ID NO: 67 entsprechen, ist fett dargestellt.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele, die lediglich der Erläuterung dienen, beschrieben. Die folgenden Beispiele sollen den Umfang der Erfindung nicht vollständig definieren oder auf andere Weise begrenzen.
DNA-Manipulation: Falls nicht anders erwähnt werden die DNA-Rekombinationstechniken nach den Standardprotokollen durchgeführt, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind: (Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York) oder in Band 1 und 2 von Ausubel et al, (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standardmaterial und verfahren für molekularbiologische Arbeiten an Pflanzen sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK).
Beispiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, verwandt sind
Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) werden unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, verwandt sind, identifiziert. Das Programm wird dazu verwendet, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen aufzufinden, und zwar dadurch, dass man Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken verglich und die statistische Signifikanz der „Matches” berechnete. Beispielsweise werden das Polypeptid, das von den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuren kodiert wird, für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wird mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) gereiht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment zufallsmäßig vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten werden die Vergleiche auch durch Prozentsatz der Identität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure (oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In manchen Fällen können die Default-Parameter verändert werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. So kann zum Beispiel der E-Wert erhöht werden, um Matches mit niedrigerer Stringenz aufzuzeigen. Auf diese Weise können kurze, beinahe exakte Matches identifiziert werden.
In manchen Fällen können verwandte Sequenzen vorläufig assembliert und von Forschungsinstituten, wie The Institute for Genomic Research (TIGR) der Öffentlichkeit bekannt gemacht werden. Um solche verwandten Sequenzen zu identifzieren, kann man sich der Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) Datenbank bedienen, und zwar entweder durch Schlagwortsuche oder unter Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz.
Beispiel 2: Alignment von NITR-Polypeptidsequenzen
Ein Alignment der Polypeptidsequenzen wird unter Verwendung des AlignX-Programms des Vector NTI Pakets (Invitrogen), das auf dem beliebten Clustal W-Algorithmus des progressiven Alignments (Thompson et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al, (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) beruht, durchgeführt. Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1, und die gewählte „weight matrix” ist Blosum 62 (wenn die Polypeptide als Alignment vorliegen). Um das Alignment weiter zu optimieren, kann im geringen Ausmaß manuell editiert werden.
Unter Verwendung eines ”Neighbour-Joining”-Clustering-Algorithmus, wie er in dem Align X-Programm von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird, wird ein phylogenetischer Baum von NITR-Polypetiden konstruiert.
Für die Konstruktion des phylogenetischen Baums von 3 wurde mit den Proteinen von 2 unter Verwendung von MUSCLE (Edgar (2004), Nucleic Acids Research 32(5): 1792–97) ein Alignment durchgeführt. Ein Neighbour-Joining-Baum wurde unter Verwendung von Quick Tree (Howe et al. (2002), Bioinformatics 18(11): 1546–7) berechnet. Der Support der Hauptverzweigung ist für 100 Bootstrap-Wiederholungen angegeben. Ein kreisförmiges Phylogramm wurde unter Verwendung von Dendroscope (Huson et al. (2007), BMC Bioinformatics 8(1): 460) erstellt.
Beispiel 3: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, werden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003, 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; die Software wird von Ledion Bitincka gehostet) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrices für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension Penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parameter handelte es sich um:
Scoring matrix: Blosum62
First Gap: 12
Extending gap: 2
Es kann auch eine MATGAT-Tabelle für das lokale Alignment einer spezfischen Domäne bzw. Daten bezüglich der %-Identität/Ähnlichkeit zwischen spezifischen Domänen erstellt werden.
Beispiel 4: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, die unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung von multiplen Sequenz-Alignments und versteckten Markov-Modellen, wobei viele häufige Proteindomänen und -familien abgedeckt werden. Pfam wird vom Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
Die Proteinsequenzen, die die NITR darstellen, werden als Abfrage für die Suche in der InterPro-Datenbank verwendet.
Beispiel 5: Topologievorhersage der Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
TargetP 1.1 sagt die Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen innerhalb der Zelle vorher. Die Lokalisierungszuordnung beruht auf dem vorhergesagten Vorliegen von einer der folgenden N-terminalen Presequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondrial Targeting Peptide (mTP) oder Signalpeptid des sekretorischen Wegs (SP). Die Wertungen, auf denen die schlussendliche Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten und fügen nicht ungedingt etwas zu einer Wahrscheinlichkeit hinzu. Die Lokalisierung mit der höchsten Wertung ist jedoch gemäß TargetP die wahrscheinlichste, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Hinweis dafür sein, wie gewiss die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (reliability Klasse RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird am Server der technischen Universität Dänemark gehalten.
Bei denjenigen Sequenzen, von denen vorhergesagt wird, dass sie eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine mögliche Spaltstelle vorhergesagt werden.
Es wunden mehrere Parameter ausgewählt, wie Organismengruppe (Nichtpflanze oder Pflanze), Cutoff-Sätze (keine, vorbestimmter Cutoff-Satz oder vom User spezifizierter Cutoff-Satz), und Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (ja oder nein).
Die von SEQ ID NO: 2 dargesellte Proteinsequenz wurde für die Abfrage von TargetP 1.1 verwendet. Es wird die Organismusgruppe „Pflanze” gewählt, es werden keine Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids erfragt. Das Protein weist eine vorhergesagte Lage im Chloroplasten auf (Wahrscheinlichkeit 0,793, RC-Wert 3).
Für die Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, darunter:

• ChloroP 1.1, gehosted am Server der Technischen Universität Dänemark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, gehostet am Server des Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, gehustet am Server der University of Alberte, Edmonton, Alberta, Kanada;
• TMHMM, gehustet am Server der Technischen Universität Dänemark.

Beispiel 6: Clonierung der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz
Clonierung der SEQ ID NO: 1:
Die NITR-Kodiernukleinsäuresqeuenz SEQ ID NO: 1, die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, wurde unter Verwendung einer maßgeschneiderten Arabidopsis-thaliana-Kernlings-cDNA-Bibliothek (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen Paisley, UK) als Matrice amplifiziert. Die PCR wunde mittels Hifi-Taq-DNA-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt, wobei 200 ng Matrice in 50 μl PCR-Mix eingesetzt wurden. Bei den verwendeten Primern handelt es sich um prm07073 (SEQ ID NO: 4; sense, Start-Codon fettgedruckt): 5'ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgacttctttctctctcactt-3' und prm07074 (SEQ ID NO: 5; reverse, komplementär): 5'ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcaatagct tttgaatcaatct-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination beinhalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde aufgereinigt, und zwar ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden. Anschließend wurde der erste Schritt der Gateway-Vorgehensweise, die Bp-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung – gemäß Gateway-Teminologie – eines „entry clone, rekombiniert. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway^® Technik erworben.
Der „entry clone” umfassend SEQ ID NO: 1 wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine visuelle Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette für die LR-in-vivo-Rekombination, wobei die interessierende Nukleinsäuresequenz bereits in den „entry clone” kloniert war. Ein Reis-GOS2-Promoter (SEQ ID NO: 3) für die samenspezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhalten Expressionsvektor pGOS2::NITR ( ) nach fachbekannten Techniken in den Agrobacterium-Stamm LBA4404 transformiert.
Beispiel 7: Pflanzentransformation
Reistransformation
Mit dem Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wunden Oryza-sativa-Pflanzen transformiert. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, wonach 6 mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt (Kallusinduktionsmedium) keimen gelassen. Nach vierwöchigem Inkubieren im Dunkeln wunden embryogene, von Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf demselben Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli vervielfacht oder vermehrt, und zwar durch Subkultur auf demselben Medium für weitere 2 Wochen. Embryogene Kallusstückchen wurden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wunde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD₆₀₀) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale gegeben und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation in Licht wunde das embryogene Potential freigesetzt, und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wunden von den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wunden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
Pro Konstrukt wunden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wunden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für die Selektionsmittel zurückbehalten, um T1-Samen zu ernten. Die Samen wunden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al, 1993, Hiei et al, 1994).
Maistransformation
Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt unter Abwandlung der von Ishida et al, (1996), Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Transformation beim Mais ist genotypabhängig, und nur bestimmte Genotypen eignen sich für die Transformation und Regeneration. Gute Herkünfte von Donormaterial für die Transformation sind die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elter, es können jedoch auch andere Gentypen erfolgreich verwendet werden. Ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP), wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt, werden die Kolben von den Maispflanzen geerntet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organgenese gewonnen. Die herauspräparierten Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Maisregenerationsmedium, des das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden), herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Maisbewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Ende umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Weizentransformation
Die Transformation von Weizen erfolgt mit der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden), herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Ende umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Sojabohnentransformation
Die Transformation von Sojabohne erfolgt unter Abwandlung der in dem Texas A&M Patent US 5,164,310 beschriebenen Methode. Für die Transformation nach dieser Methode eignen sich mehrere im Handel erhältliche Sojabohnensorten. Die Sorte Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Sojabohnensamen werden sterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Hypokotyl, Keimwurzel und ein Keimblatt werden von sieben-Tage-alten Jungkeimpflanzen herauspräpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter herangezogen, um Achselnodien zu entwickeln. Diese Achselnodien werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und in Selektionsmedium umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprosselongationsmedium gesetzt. Sprosse mit einer Länge von nicht mehr als 1 cm werden auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Raps/Canola-Transformation
Als Explantate für die Gewebekultur werden Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5–6-Tage alten Jungkeimpflanzen verwendet und nach dem Verfahren von Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für Transformationszwecke verwendete Standardsorte, es können jedoch auch andere Sorten verwendet werden. Die Canola-Samen werden oberflächensterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Die Keimblattpetiolenexplantate mit dem daran haftenden Keimblatt werden aus den in-vitro-Keimpflanzen herauspräpariert und dadurch mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden anschließend bei 23°C und 16 Stunden Licht 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Sobald die Sprosse 5–10 mm lang sind, werden sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0.5, mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zur Induktion von Wurzeln auf Bewurzelungsmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Luzernetransformation
Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird nach dem Verfahren von (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig und es ist daher eine regenerierende Pflanze erforderlich. Verfahren zur Gewinnung von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Diese können zum Beispiel wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben aus der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen sonstigen im Handel erhältlichen Luzernesorte selektiert werden. Alternativ dazu wurde die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur selektiert (Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Es werden Petiolenexplantate mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthält, cokultiviert. Die Explantate werden 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium mit 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon cokultiviert. Die Explantate werden mit halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dasselbe SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, jedoch mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden die somatischen Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium ohne Wachstumsregulatoren, ohne Antibiotika, jedoch mit 50 g/l Saccharose umgesetzt. Somatische Embryonen keimten anschließend auf halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium aus. Bewurzelte Keimlingspflanzen wurden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Beispiel 8: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
8.1 Aufbau der Auswertung
Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Fünf Events, von denen die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspaltete, wurden behalten. Für jedes dieser Events wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C in der Dunkelheit, und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
Screening unter Trockenheitsbedingungen
Pflanzen von T2-Samen werden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend werden sie in ein „trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgt. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, werden Feuchtigkeitssonden in zufallsmäßig ausgewählte Töpfe eingeführt. Sinkt der BWG unter gewisse Schwellenwerte, so werden die Pflanzen automatisch erneut gegossen, bis wiederum ein Normalgehalt erreicht wird. Dann werden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
Screening auf Stickstoffverwertungseffizienz
Reispflanzen von T2-Samen wurden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe wurden vom Umsetzen bis zur Abreife mit einer speziellen Nährlösung mit verringertem N-Stickstoff-Gehalt (N), üblicherweise zwischen 7 bis 8 mal weniger, gegossen. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragparameter wurden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
Salzstress-Screening
Die Pflanzen wurden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend wurden die Samenparameter bestimmt.
8.2 Statistische Analyse: F-Test
Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parameter, die bei allen Pflanzen von allen Events, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wunden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformation-Events und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, auch unter der Bezeichnung globaler Geneffekt bekannt. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
Da zwei Versuche mit überlappenden Events durchgeführt werden, erfolgt eine kombinierte Analyse. Hierdurch lässt sich die Übereinstimmung der Auswirkungen über die zwei Versuche hinweg überprüfen, und, wenn dies der Fall ist, können die Werte der beiden Versuche gepoolt werden, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem eingesetzten Verfahren handelt es sich um einen Mixed-Model-Ansatz, der die Multilevel-Struktur der Daten (d. h. Versuch-Event-Segreganten) berücksichtigt. Durch Vergleichen des Likelihood-Quotienten-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhält man p-Werte.
8.3 Messparameter
Biomasseparameter-Messung
Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Von diesem Wert wurde über die am selben Zeitpunkt von den unterschiedlichen Winkeln aus aufgenommenen Bilder ein Durchschnitt berechnet und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten, bestimmt wurde. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanzen (Keimpflanzen) 3 Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als maximale Wurzelbiomasse, die während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wurde) oder als Erhöhung des Wurzel/Spross-Index (gemessen als Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im Zeitraum des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
Die Jungpflanzenvitalität wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Von diesem Wert wurde über die am selben Zeitpunkt von den unterschiedlichen Winkeln aus aufgenommenen Bilder ein Durchschnitt berechnet und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die unten beschriebenen Ergebnisse beziehen sich auf Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
Samenparameter-Messungen
Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen, und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Der Harvest Index (HI) wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶, definiert.
Beispiel 9: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
Bei den transgenen Reispflanzen, die die NITR-Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 unter der Kontrolle des GOS2-Promoters exprimieren, wurde eine Erhöhung von mehr als 5% bei Biomasse (Wurzel und Spross), Jungpflanzenvitalität, Samengesamtgewicht, Anzahl gefüllter Samen, Harvest-Index, Gesamtsamenanzahl und Anzahl Blüten pro Rispe beobachtet, wenn die Pflanzen unter Stickstoffmangelstressbedingungen herangezogen wurden. Wurde über zwei Generationen (T1 und T2) bewertet, so erhielt man die folgenden Daten (Tabelle 3): Tabelle 3: Ertragserhöhung bei transgenen Pflanzen, die die NITR-Nukleinsäure exprimieren, im Vergleich zu den Kontrollpflanzen. Für jeden Parameter ist der p-Wert ≤ 0,05.

Parameter Gesamterhöhung (%)

Jungpflanzenvitalität 17,5

Wurzel/Spross-Index 9,0

Samengesamtgewicht 6,1

Anzahl gefüllte Samen 5,8

Gesamtsamenanzahl 5,0
Beispiel 10: Identifikation von Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 40 und SEQ ID NO: 41 verwandt sind
Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) werden unter Verwendung von Datenbankabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische Sequenzen), die mit der Nukleinsäuresequenz, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, verwandt sind, identifiziert. Das Programm wurde dazu verwendet, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen aufzufinden, und zwar dadurch, dass man Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken verglich und die statistische Signifikanz der „Matches” berechnete. Beispielsweise werden das Polypeptid, das von den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuren kodiert wird, für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wird mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß dem Wahrscheinlichkeits-Score (E-Wert) gereiht, wobei der Score die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment zufallsmäßig vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten werden die Vergleiche auch durch Prozentidentität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure (oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In manchen Fällen können die Default-Parameter verändert werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. So kann zum Beispiel der E-Wert erhöht werden, um Matches mit niedrigerer Stringenz aufzuzeigen. Auf diese Weise können kurze, beinahe exakte Matches identifiziert werden.
In manchen Fällen können verwandte Sequenzen vorläufig assembliert und von Forschungsinstituten, wie The Institute for Genomic Research (TIGR) der Öffentlichkeit bekannt gemacht werden. Um solche verwandten Sequenzen zu identifzieren, kann man sich der Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) Datenbank bedienen, und zwar entweder durch Schlagwortsuche oder unter Verwendung des BLAST Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz.
Beispiel 11: Alignment von ASNS-Polypeptidsequenzen
Ein Alignment der Polypeptidsequenzen wunde unter Verwendung des AlignX-Programms des Vector NTI Pakets (Invitrogen), das auf dem beliebten Clustal W-Algorithmus des progressiven Alignments (Thompson et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 4876-4882; Chenna et al, (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) basiert, durchgeführt. Die Default-Werte lauten: gap open Penalty 10, gap extension Penalty 0.1, und die ausgewählte Gewichtsmatrix ist Blosum 62 (wenn die Polypeptide als Alignment vorliegen). Um das Alignment weiter zu optimieren, kann im geringen Ausmaß manuell editiert werden. Für das Alignment von 4 wunde der ClustalW 2.0-Algorithmus mit den Default-Parameter verwendet (Matrix: Gonnet, Gap-opening penalty: 10, Gap-extension penalty: 0.1).
Unter Verwendung eines Neighbour-Joining-Clustering-Algorithmus, wie er in dem AlignX-Programm von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird, wird ein phylogenetischer Baum der ASNS-Polypeptide konstruiert.
Beispiel 12: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, werden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003, 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein oder DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; die Software wird von Ledion Bitinka gehostet) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits/Identitätsmatrices für DNA- oder Proteinsequenzen ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening Penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
Bei dem in dem Vergleich eingesetzten Parameter handelte es sich um:
Scoring matrix: Blosum62
First Gap: 12
Extending gap: 2
Es kann auch eine MATGAT-Tabelle für das lokale Alignment einer spezifzischen Domäne bzw. Daten bezüglich der %-Identität/Ähnlichkeit zwischen spezifischen Domänen ersteht werden.
Beispiel 13: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domeins und Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteins verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zahlen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung von multiplen Sequenz-Alignments und versteckten Markov-Modellen, wobei viele häufige Proteindomänen und -familien abgedeckt werden. Pfam wird vom Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
Als Abfrage für die Suche in der InterPro-Datenbank wurden die Proteinsequenzen gemäß SEQ ID Nr.: 63 verwendet.
Beispiel 14: Topologievorhersage der Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
TargetP 1.1 sagt die Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen innerhalb der Zelle vorher. Die Lokalisierungszuordnung beruht auf dem vorhergesagten Vorliegen von einer der folgenden N-terminalen Präsequezen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), „mitochondrial targeting peptide” (mTP) oder Signalpeptid des sekretorischen Wegs (SP). Die Scores, auf denen die schlussendliche Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten und fügen nicht ungedingt etwas zu einer Wahrscheinlichkeit hinzu. Die Lokalisierung mit dem höchsten Scores ist jedoch gemäß TargetP die wahrscheinlichste, und die Beziehung zwischen den Scores (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Hinweis dafür sein, wie gewiss die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (Reliability Klasse RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird am Server der technischen Universität Dänemark gehalten.
Bei denjenigen Sequenzen, von denen vorhergesagt wird, dass sie eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine mögliche Spaltstelle vorhergesagt werden.
Es wurden mehrere Parameter ausgewählt, wie Organismengruppe (Nichtpflanze oder Pflanze), Cutoff-Sätze (keine, vorbestimmter Cutoff-Satz oder vom User spezifizierter Cutoff-Satz), und Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (ja oder nein).
Für die Abfrage von TargetP 1.1 wunde die Proteinsequenz von SEQ ID Nr.: 63 verwendet. Es wird die Organismusgruppe „Pflanze” gewählt, es werden keine Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des gewünschten Transitpeptids wird erfragt. Es wunde von TargetP keine klare Lokalisierung innerhalb der Zelle vorhergesagt, eine Lokalisierung im Cytoplasma wurde jedoch von SubLoc (Hua und Son, Bioinformatics) vorhergesagt.
Für die Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, darunter:

• ChloroP 1.1, gehostet am Server der Technischen Universität Dänemark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, gehostet am Server des Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, gehostet am Server der University of Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada;
• TMHMM, gehostet am Server der Technischen Universität Dänemark.

Beispiel 15: Klonieren der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird
Klonieren von SEQ ID NO: 62
Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 64, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, wurde mittels PCR unter Verwendung einer maßgeschneiderten Oryza-sativa-Keimpflanzen-cDNA-Bibliothek (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) als Matrize amplifiziert. Die PCR wurde unter Verwendung der Hifi-Taq-DNA-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt, wobei 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix eingesetzt wurden. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm06049 (SEQ ID Nr.: 65; sense, Start-Codon fett gedruckt): 5'-ggggacaagtttgtacaa aaaagcaggcttaaacaatgtgtggcatatcgccgtgctcg-3' und prm06050 (SEQ ID NO: 66; reverse, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgcgacgatagaa agttaaacggcag-3', die die AttB-Spaltstellen für die Gateway-Rekombination beinhalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde aufgereinigt, ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden. Anschließend wurde der erste Schritt der Gateway-Vorgehensweise, die Bp-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung von – gemäß Gateway-Teminologie – eines „entry clone”, pLsm, rekombiniert. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway^® Technik erworben.
Der „entry clone pLsm” umfassend SEQ ID NO: 62 wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette, und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den „entry clone” kloniert wurde, dient Ein Reis-GOS2-Promoter (SEQ ID NO: 64) für die samenspezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor PGOS2::ASNS ( ) nach fachbekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Beispiel 16: Pflanzentransformation
Reistransformation
Mit dem Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurden Oryza-sativa-Pflanzen transformiert. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCL₂, wonach 6 mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt (Kallusinduktionsmedium) keimen gelassen. Nach vierwöchigem Inkubieren im Dunkeln wurden embryogene, von Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf demselben Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli vervielfacht oder vermehrt, und zwar durch Subkultur auf demselben Medium für weitere 2 Wochen. Embryogene Kallusstückchen wurden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD₆₀₀) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale gegeben und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wunden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wunden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation in Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden von den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
Pro Konstrukt wunden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekultur, in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für die Selektionsmittel zurückbehalten, um T1-Samen zu ernten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al, 1993, Hiei et al, 1994).
Maistransformation
Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt unter Abwandlung der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Transformation beim Mais ist genotypabhängig, und nur bestimmte Gentypen eignen sich für die Transformation und Regeneration. Gute Herkünfte von Donormaterial für die Transformation sind die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elter, es können jedoch auch andere Gentypen erfolgreich verwendet werden. Ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP), wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt, werden die Kolben von den Maispflanzen geerntet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Die herauspräparierten Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Maisregenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Maisbewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Weizentransformation
Die Transformation von Weizen erfolgt mit der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die. Sorte Bobwhite (vom CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organgenese gewonnen. Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen invitro auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Sojabohnentransformation
Die Transformation von Sojabohne erfolgt unter Abwandlung der im Texas A&M Patent US 5,164,310 beschriebenen Methode. Für die Transformation nach dieser Methode eignen sich mehrere im Handel erhältliche Sojabohnensorten. Die Sorte Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird häufig für Transformationszwecke verendet. Sojabohnensamen werden sterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Hypokotyl, Keimwurzel und ein Keimblatt werden von sieben-Tage-alten Jungkeimpflanzen herauspräpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter herangezogen, um Achselnodien zu entwickeln. Diese Achselnodien werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und in Selektionsmedium umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprosselongationsmedium gesetzt. Sprosse mit einer Länge von nicht mehr als 1 cm werden auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Ende umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthaften.
Raps/Canola-Transformation
Als Explantate für die Gewebekultur werden Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5–6-Tage alten Jungkeimpflanzen verwendet und nach dem Verfahren von Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für Transformationszwecke verwendete Standardsorte, es können jedoch auch andere Sorten verendet werden. Die Canola-Samen werden oberflächensterilisiert, um in vitro ausgesetzt zu werden. Die Keimblattpetiolenexplantate mit dem daran haftenden Keimblatt werden aus den in-vitro-Keimpflanzen herauspräpariert und dadurch mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden anschließend bei 23°C und 16 Stunden Licht 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0.7% Phytagar kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Sobald die Sprosse 5–10 mm lang sind, werden sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0.5, mit 0.5 mg/l BAR) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zur Induktion von Wurzeln auf Bewurzelungsmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Luzernetransformation
Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird nach dem Verfahren von (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig und es ist daher eine regenerierende Pflanze erforderlich. Verfahren zur Gewinnung von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Diese können zum Beispiel wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) aus der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen sonstigen im Handel erhältlichen Luzernesorte selektiert werden. Alternativ dazu wurde die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur selektiert (Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Es werden Petiolenexplantate mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthält, cokultiviert. Die Pflanzen werden 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium mit 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4.35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon cokultiviert. Die Explantate werden mit halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dasselbe SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, jedoch mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden die somatischen Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium ohne Wachstumsregulatoren, ohne Antibiotika, jedoch mit 50 g/l Saccharose umgesetzt. Somatische Embryonen keimten anschließend auf halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium aus. Bewurzelte Keimlingspflanzen wurden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Beispiel 17: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
17.1 Aufbau der Auswertung
Es wunden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Sechs Events, von denen die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspalteten, wurden behalten. Für jedes dieser Events wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wunden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C in der Dunkelheit, und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
Vier T1-Events wurden in der T2-Generation weiter ausgewertet, wobei man bei der Auswertung wie bei der T1-Generation vorging, jedoch mit mehr Einzelorganismen pro Event.
Screening unter Trockenheitsbedingungen
Pflanzen von T2-Samen werden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend werden sie in ein „trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgt. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, werden Feuchtigkeitssonden in zufallsmäßig ausgewählte Töpfe eingeführt. Sinkt der BWG unter gewisse Schwellenwerte, so werden die Pflanzen automatisch erneut gegossen, bis wiederum ein Normalgehalt erreicht wird. Dann werden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Wachsturns- und Ertragparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
Screening auf Stickstoffverwertungseffizienz
Reispflanzen von T2-Samen wurden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe wurden vom Umsetzen bis zur Abreife mit einer speziellen Nährlösung mit verringertern N-Stickstoff-Gehalt (N), üblicherweise zwischen 7 bis 8 mal weniger, gegossen. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragparameter wurden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
Salzstress-Screening
Die Pflanzen wurden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend wurden die Samenparameter bestimmt.
17.2 Statistische Analyse: F-Test
Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parameter, die bei allen Pflanzen von allen Events, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, gemessen wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Events und einen Gesamteffekt des Gens, auch unter der Bezeichnung globaler Geneffekt bekannt. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die unterschiedlichen Phänotypen verursacht.
Da zwei Versuche mit überlappenden Events durchgeführt werden, erfolgt eine kombinierte Analyse. Hierdurch lässt sich die Übereinstimmung der Auswirkungen über die zwei Versuche hinweg überprüfen, und, wenn dies der Fall ist, können die Werte der beiden Versuche gepoolt werden, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem eingesetzten Verfahren handelt es sich um einen Mixed-Model-Ansatz, der die Multilevel-Struktur der Daten (d. h. Versuch-Event-Segreganten) berücksichtigt. Durch Vergleichen des Likelihood-Quotienten-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhält man p-Werte.
17.3 Messparameter
Biomasseparameter-Messung
Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wunde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Von diesem Wert wunde über die am selben Zeitpunkt von den unterschiedlichen Winkeln aus aufgenommenen Bilder ein Durchschnitt berechnet und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten, bestimmt wunde. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanzen (Keimpflanzen) 3 Wochen nach der Keimung.
Die Jungpflanzenvitalität wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Von diesem Wert wurde über die am selben Zeitpunkt von den unterschiedlichen Winkeln aus aufgenommenen Bilder ein Durchschnitt berechnet und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die unten beschriebenen Ergebnisse beziehen sich auf Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
Samenparameter-Messungen
Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Semen wunden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wunden verworfen, und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllte Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert. Der Harvest Index (HI) wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶, definiert. Die Gesamtzahl Blüten pro Rispe wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtsamenzahl und der Anzahl der reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis (als Prozentsatz ausgedrückt) der Anzahl gefüllte Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Wurzeldicke ausgedrückt, wobei es sich um die maximale Wurzelbiomasse oberhalb einer gewissen Schwellendicke, die während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird, handelt (der Wert wird mit einem Wurzel-Imaging-System erhalten).
Beispiel 18: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
Die transgenen Reispflanzen, die die ASNS-Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr.: 62 unter der Kontrolle des GOS2-Promoters exprimieren, zeigten, egal, ob sie unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen mit reduzierter Stickstoffverfügbarkeit herangezogen wunden, eine Erhöhung von mehr als 5% für mindestens einen der folgenden Parameter: Jungpflanzenvitalität, Samengesamtgewicht, Anzahl gefüllter Semen, Füllrate, Anzahl Briten pro Rispe, Harvest-Index, Gesamtzahl Samen sowie Wurzeldicke. Für das Tausendkorngewicht betrug der beobachtete Anstieg mindestens 3%.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 5811238 [0034]
US 6395547 [0034]
WO 2004/070039 [0039, 0045, 0045, 0045, 0045, 0045, 0045, 0045, 0045, 0045, 0047]
WO 2004/065596 [0039]
US 4962028 [0039]
WO 01/14572 [0039]
WO 95/14098 [0039]
WO 94/12015 [0039]
US 5401836 [0044]
US 20050044585 [0044]
EP 99106056 [0045]
US 5565350 [0053, 0082]
WO 9322443 [0053]
WO 98/53083 [0060]
WO 99/53050 [0060]
US 4987071 [0069]
US 5116742 [0069]
WO 94/00012 [0069]
WO 95/03404 [0069]
WO 00/00619 [0069]
WO 97/13865 [0069]
WO 97/38116 [0069]
WO 98/36083 [0070]
WO 99/15682 [0070]
WO 00/15815 [0082]
EP 1198985 A1 [0085]
US 5164310 [0279, 0315]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Wang et al, Planta (2003), 218: 1–14 [0006]
Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) [0019]
Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003 [0021]
Meinkoth und Wahl, Anal Biochem., 138: 267–284, 1984 [0027]
Sambrook et al, (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York [0031]
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Neufassungen) [0031]
Foissac und Schiex (2005), BMC Bioinformatics 6: 25 [0032]
Castle et al, (2004), Science 304(5674): 1151–4 [0034]
Held et al, 1996, Genome Methods 6: 986–994 [0037]
McElroy et al, Plant Cell, 2: 163–171, 1990 [0039]
Odell et al, Nature, 313: 810–812, 1985 [0039]
Nilsson et al, Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997 [0039]
de Pater et al, Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992 [0039]
Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992 [0039]
Buchholz et al, Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994 [0039]
Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992 [0039]
Wu et al, Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988 [0039]
An et al, Plant J. 10(1); 107–121, 1996 [0039]
Sanger et al, Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443 [0039]
Leisner (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553 [0039]
Jain et al, Crop Science, 39(6), 1999: 1696 [0039]
Jain et al, Crop Science, 39(6), 1999: 1696 [0039]
Shaw et al, (1984), Nucleic Adds Res. 12(20): 7831–7846 [0039]
Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mal. Biol., 48: 89–108 [0042]
Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48 [0044]
Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341) [0044]
Xiao et al., 2006 [0044]
Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346 [0044]
Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987 [0044]
Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991 [0044]
Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988 [0044]
Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990 [0044]
Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993 [0044]
Baumberger et al., 2001, Genes & Dev. 15: 1128 [0044]
Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139) [0044]
Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139) [0044]
Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991 [0044]
Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420) [0044]
W. Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA [0044]
Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273 [0044]
Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625) [0044]
Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265) [0044]
Simon et al, Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985 [0045]
Scofield et al, J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987 [0045]
Baszczynski et al, Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990 [0045]
Pearson et al, Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992 [0045]
Ellis et al, Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988 [0045]
Takaiwa et al, Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986 [0045]
Takaiwa et al, FEBS Letts. 221: 43–47, 1987 [0045]
Matzke et al, Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32, 1990 [0045]
Stalberg et al, Planta 199: 515–519, 1996 [0045]
Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461-2, 1989 [0045]
Albani et al, Plant Cell, 9: 171–184, 1997 [0045]
EMBO J. 3: 1409–15, 1984 [0045]
Diaz et al, (1995), Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8 [0045]
Theor. Appl. Gen. 98: 1253-62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet 250: 750–60, 1996 [0045]
Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998 [0045]
Vicente-Carbajosa et al, Plant J. 13: 629–640, 1998 [0045]
Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998 [0045]
Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998 [0045]
Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996 [0045]
Nakase et al, Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997 [0045]
Trans. Res. 6: 157–68, 1997 [0045]
Plant J. 12: 235–46, 1997 [0045]
DeRose et al, Plant Mol. Biol. 32: 1029–35, 1996 [0045]
Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999 [0045]
Wu et al, J. Biochem. 123: 386, 1998 [0045]
Cummins et al, Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992 [0045]
Lanahan et al, Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7266–7270, 1991 [0045]
Cejudo et al, Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992 [0045]
Kalla et al, Plant J. 6: 849–60, 1994 [0045]
Leah et al, Plant J. 4: 579–89, 1994 [0045]
Selinger et al, Genetics 149; 1125–38, 1998 [0045]
Takaiwa et al, (1986), Mol. Gen. Genet. 208: 15–22 [0045]
Takaiwa et al, (1987), FEBS Letts. 221: 43–47 [0045]
Matzke et al, (1990), Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32 [0045]
Colot et al, (1989), Mol. Gen. Genet. 216: 81–90 [0045]
Anderson et al, (1989), NAR 17: 461–2 [0045]
Albani et al, (1997), Plant Cell 9: 171–184 [0045]
Rafalski et al, (1984), EMBO 3: 1409–15 [0045]
Diaz et al, (1995), Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8 [0045]
Cho et al, (1999), Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62 [0045]
Mullen et al, (1993), Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al, (1996), Mol. Gen. Genet. 250: 750–60 [0045]
Mena et al, (1998), Plant J. 116(1): 53–62 [0045]
Onate et al, (1999), J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82 [0045]
Vicente-Carbajosa et al, (1998), Plant J. 13: 629–640 [0045]
Wu et al, (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889 [0045]
Wu et al, (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889 [0045]
Nakase et al, (1997), Plant Molec. Biol. 33: 513–522 [0045]
Russell et al, (1997), Trans. Res. 6: 157–68 [0045]
Opsahl-Ferstad et al, (1997), Plant J. 12: 235–46 [0045]
DeRose et al, (1996), Plant Mol. Biol. 32: 1029–35 [0045]
Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996 [0045]
Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999 [0045]
Lanahan et al, Plant Cell 4: 203–211, 1992 [0045]
Skriver et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991 [0045]
Cejudo et al, Plant. Mol. Biol. 20: 849–856, 1992 [0045]
Kalla et al, Plant J. 6: 849–60, 1994 [0045]
Leah et al, Plant J. 4: 579–89, 1994 [0045]
Selinger et al, Genetics 149; 1125–38, 1998 [0045]
Fukavama et al., 2001 [0047]
Keusch et al., 2001 [0047]
Liu et al., 2003 [0047]
Nomura et al., 2000 [0047]
Panguluri et al., 2005 [0047]
Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122 [0048]
Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318 [0048]
Buchman und Berg (1988), Mol. Cell biol. 8: 4395–4405 [0055]
Callis et al, (1987), Genes Dev. 1: 1183–1200 [0055]
The Maize Handbock, Kapitel 116, Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, N. Y. (1994) [0055]
Gaultier et al, (1987), Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641 [0068]
Inoue et al, (1987), Nud. Ac. Res. 15, 6131–6148 [0068]
Inoue et al, (1987), FEBS Lett. 215, 327–330 [0068]
Haselhoff und Gerlach (1988), Nature 334, 585–591 [0069]
Bartel und Szostak (1993), Science 261, 1411–1418 [0069]
Angell und Baulcombe ((1999), Plant J. 20(3): 357–62 [0070]
Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991 [0072]
Helene et al, Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36, 1992 [0072]
Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992 [0072]
Schwab et al, Dev. Cell 8, 517–527, 2005 [0076]
Schwab et al, Plant Cell 18, 1121–1133, 2006 [0076]
Tribble et al, J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267 [0081]
Velmurugan et al, J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566 [0081]
Krens, F. A. et al, (1982), Nature 296, 72–74 [0085]
Negrutiu I et al, (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373 [0085]
Shillito R. D. et al, (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102 [0085]
Crossway A et al, (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185 [0085]
Klein TM et al, (1987), Nature 327: 70 [0085]
Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743 [0085]
Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996 [0085]
Chan et al, (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993 [0085]
Hiei et al, (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994 [0085]
Ishida et al, (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) [0085]
Frame et al, (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) [0085]
B. Jenes et al, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 [0085]
Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225 [0085]
Bevan et al, Nud. Acids Res. 12 (1984) 8711 [0085]
Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 [0085]
F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 [0085]
Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289 [0086]
Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289 [0086]
Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370 [0086]
Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199 [0086]
Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743 [0086]
Klaus et al, 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229 [0086]
Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3): 425–38 [0086]
Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28 [0086]
Klaus et al, 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229 [0086]
Hayashi et al, Science (1992), 1350–1353 [0087]
Redet GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82 [0088]
Feldmann et al, (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172 [0088]
Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods on Molecular Biology, Band 82. Humane Press, Totowa, NJ, S. 91–104) [0088]
McCallum et al, (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50) [0088]
Offringa et al, (1990), EMBO J. 9(10): 3077–84 [0089]
Terada et. al, (2002), Nat. Biotech. 20(10): 1030–4 [0089]
Iida und Terada (2004), Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8 [0089]
Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007 [0089]
Schultz et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864 [0104]
Letunic et al, (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244 [0104]
Mulder et al, (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318 [0104]
Sucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94 [0104]
Proceedings 2nd International Conference on intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park [0104]
Hulo et al, Nud. Acids Res. 32: D134–D137, (2004) [0104]
Bateman et al, Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002) [0104]
Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al, ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788(2003) [0104]
Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453 [0105]
Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10 [0105]
Campanella et al, BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4:29 [0105]
Ferrari und Varner, Plant Physiol., 47(6), 790–794 (1971) [0105]
EC 1.8.1.2, Hilz et al., Biochem. Z. 332, 151–166, 1959 [0106]
Current Protocols in Molecular Biology. Verlegt bei Wiley [0124]
Wang et al, (Plante (2003), 218: 1–14) [0134]
Rabbani et al, (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) [0134]
Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989), Molecular Cloning, A Laborstory Manual [0167]
Lander et al, (1987), Genomics 1: 174–181 [0167]
Botstein et al, (1980), Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331 [0167]
Bematzky und Tanksley (1986), Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 [0168]
Hoheisel et al, In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, S. 319–346, und darin genannte Literaturhinweise [0169]
Trask (1991), Trends Genet. 7: 149–154 [0170]
Laan et al, (1995), Genome Res. 5: 13–20 [0170]
Kazazian (1989), J. Lab. Clin. Med 11: 95–96 [0171]
CAPS; Sheffield et al, (1993), Genomis 16: 325–332 [0171]
Landegren et al, (1988), Science 241: 1077–1080 [0171]
Sokolov (1990), Nucleic Acid Res. 18: 3671 [0171]
„Radiation Hybrid Mapping” (Walter et al, (1997), Nat. Genet 7: 22–28) [0171]
„Happy Mapping” (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807 [0171]
Schultz et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864 [0180]
Letunic et al, (2002), Nucleic Acids Res 30, 242–244 [0180]
Mulder et al, (2003), Nucl. Acids. Res. 31, 315–318 [0180]
(Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94 [0180]
Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park [0180]
Hulo et al, Nucl. Acids. Res. 32: D134– D137, (2004) [0180]
Bateman et al, Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002) [0180]
Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al, ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge und analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788(2003) [0180]
Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453 [0181]
Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10 [0181]
Campanella et al, BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4:29 [0181]
Smith TF, Waterman MS (1981), J. Mol. Biol. 147(1); 195–7 [0181]
Patterson und Orr, J. Biol. Chem. 243, 376–380, 1968 [0182]
Current Protocols in Molecular Biology. Verlegt bei Wiley [0199]
Wang et al, (Planta (2003), 218: 1–14) [0209]
Rabbani et al, (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) [0209]
Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989), Molecular Cloning, A Laborstory Manual [0240]
Lander et al, (1987), Genomis 1: 174–181 [0240]
Botstein et al, (1980), Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331 [0240]
Bernatzky und Tanksley (1986), Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 [0241]
Hoheisel et al, In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, S. 319–346, und darin genannte Literaturhinweise [0242]
Trask (1991), Trends Genet. 7: 149–154 [0243]
Laan et al, (1995), Genome Res. 5: 13–20 [0243]
Kazazian (1989), J. Lab. Clin. Med 11: 95–96 [0244]
Sheffield et al, (1993), Genomics 16: 325–332 [0244]
Landegren et al, (1988), Science 241: 1077– 1080 [0244]
Sokolov (1990), Nucleic. Acid Res. 18: 3671 [0244]
Walter et al, (1997), Nat. Genet. 7: 22–28 [0244]
Dear und Cook (1989), Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807 [0244]
Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York) oder in Band 1 und 2 von Ausubel et al, (1994) [0255]
Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK) [0255]
(Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0256]
Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 [0256]
Thompson et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882 [0258]
Chenna et al, (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500 [0258]
Edgar (2004), Nucleic Acids Research 32(5): 1792–97 [0260]
Howe et al. (2002), Bioinformatics 18(11): 1546–7 [0260]
Huson et al. (2007), BMC Bioinformatics 8(1): 460 [0260]
BMC Bioinformatics. 2003, 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; die Software wird von Ledion Bitincka gehostet [0261]
Aldemita und Hodges 1996, Chan et al, 1993, Hiei et al, 1994 [0276]
Ishida et al, (1996), Nature Biotech. 14(6): 745–50 [0277]
Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 [0278]
Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188 [0280]
McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847 [0281]
Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) [0281]
Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659 [0281]
McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847 [0281]
Murashige und Skoog, 1962 [0281]
Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0293]
Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 [0293]
Thompson et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 4876-4882 [0295]
Chenna et al, (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500 [0295]
BMC Bioinformatics. 2003, 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein oder DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J [0297]
Aldemita und Hodges 1996, Chan et al, 1993, Hiei et al, 1994 [0312]
Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 [0313]
Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 [0314]
Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) [0316]
McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847 [0317]
Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112 [0317]
Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659 [0317]
McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847 [0317]
Murashige und Skoog, 1962 [0317]

Claims

Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR kodiert, moduliert, wobei die NITR gemäß SEQ ID NO: 2 oder einem Ortholog oder Paralog davon ist und wobei die Pflanze unter Stickstoffmangelbedingungen herangezogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die modulierte Expression dadurch erfolgt, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die für das NITR-Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleinsäure, die für das NITR-Polypeptid kodiert, ein Abschnitt von SEQ ID NO: 1 oder eine Nukleinsäure, die mit solch einer Nukleinsäure zu hybridisieren vermag, ist
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz für SEQ ID NO: 2 kodiert.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Jungpflanzenvitalität und/oder erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag, umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Nukleinsäure operativ mit einem konstitutiven Promoter, vorzugsweise einem GOS2-Promoter, am stärksten bevorzugt einem Reis-GOS2-Promoter, verknüpft ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer monokotylen Pflanze, starker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, noch starker bevorzugt von der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana, stammt.
Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, umfasst.
Konstrukt, umfassend: (a) Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid wie in Anspruch 1 definiert kodiert; (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Konstrukt nach Anspruch 9, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promoter, vorzugsweise ein GOS2-Promoter, am stärksten bevorzugt ein Reis-GOS2-Promoter, ist.
Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 9 oder 10 in einem Verfahren für die Erzeugung von Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere verbesserter Jungpflanzenvitalität und/oder erhöhtem Ertrag.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, transformiert mit einem Konstrukt nach Anspruch 9 oder 10.
Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserter Jungpflanzenvitalität und/oder erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, umfassend: (a) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid wie in Anspruch 1 definiert kodiert, in eine(r) Pflanze; und (b) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
Transgene Pflanze mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Jungpflanzevitalität, erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, die das Ergebnis einer erhöhten Expression einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid wie in Anspruch 1 definiert kodiert, ist, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von dieser transgenen Pflanze abstammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 8, 12 oder 14, oder eine transgene Pflanzenzelle, die davon abstammt, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine monokotyle Pflanze oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mohrenhirse, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer handelt.
Erntegut einer Pflanze nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem Erntegut vorzugsweise um Sprossbiomasse, Wurzelbiomasse und/oder Samen handelt.
Produkte, die von einer Pflanze nach Anspruch 15 und/oder von Erntegut einer Pflanze nach Anspruch 16 abstammen.
Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein NITR-Polypeptid kodiert, für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen, insbesondere für die Erhöhung von einem oder mehreren der folgenden: Jungpflanzenvitalität, Samenertrag, Wurzelbiomasse und Sprossbiomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen Im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS kodiert, moduliert, wobei das ASNS gemäß SEQ ID NO: 63 oder ein Ortholog oder Paralog davon ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die modulierte Expression dadurch erfolgt, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die für das ASNS-Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei es sich bei der Nukleinsäure, die für das ASNS-Polypeptid kodiert, um einen Abschnitt von SEQ ID NO: 62 oder um eine Nukleinsäure, die fähig ist, mit solch einer Nukleinsäure zu hybridisieren, handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Nukleinsäuresequenz für SEQ ID NO: 63 kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale erhöhte Jungpflanzenvitalität und/oder erhöhten Ertrag, vorzugsweise Wurzeldicke und/oder erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen von verringerter Nährstoffverfügbarkeit erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, wobei die Nukleinsäure operativ mit einem konstitutiven Promoter, vorzugsweise mit einem GOS2-Promoter, am stärksten bevorzugt mit einem Reis-GOS2-Promoter, verknüpft ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, wobei die Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer monokotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Poaceae, noch stärker bevorzugt von der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt von Oryza sativa, stammt
Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, umfasst.
Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid wie in Anspruch 1 definiert kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Konstrukt nach Anspruch 28, wobei es sich bei einer der Kontrollsequenzen um einen konstitutiven Promoter, vorzugsweise einen GOS2-Promoter, am stärksten bevorzugt einen Reis-GOS2-Promoter, handelt
Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 28 oder 29 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, transformiert mit einem Konstrukt nach Anspruch 28 oder 29.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, das Folgendes umfasst: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid wie in Anspruch 1 definiert kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
Transgene Pflanze mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Jungpflanzenvitalität, erhöhter Wurzeldicke und/oder erhöhtem Samenertrag, die das Ergebnis der erhöhten Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid wie in Anspruch 19 definiert kodiert, ist, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von solch einer transgenen Pflanze abstammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 27, 31 oder 33, oder eine transgene Pflanzenzelle, die davon abstammt, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine monokotyle Pflanze oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mohrenhirse und Hafer handelt
Erntegut einer Pflanze nach Anspruch 34, wobei es sich bei dem Erntegut vorzugsweise um die Wurzelbiomasse und/oder Samen handelt
Produkte, die von einer Pflanze nach Anspruch 34 und/oder von Erntegut einer Pflanze nach Anspruch 35 abstammen.
Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein ASNS-Polypeptid kodiert, für die Erhöhung der Ertragsmerkmale, insbesondere die Erhöhung von einem oder mehreren der Parameter Jungpflanzenvitalität, Samenertrag und Wurzelbiomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.