DE10312505B4

DE10312505B4 - Cultivation systems for obtaining long-term pure cultures of aquatic small organisms

Info

Publication number: DE10312505B4
Application number: DE2003112505
Authority: DE
Inventors: Wilfried Pauli
Original assignee: Pauli Wilfried Dr
Current assignee: Pauli Wilfried Dr
Priority date: 2003-03-15
Filing date: 2003-03-15
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2023-03-16
Also published as: DE10312505A1

Abstract

Kultivierungssysteme zur Gewinnung von Langzeit-Reinkulturen wasserlebender Kleinst- und Kleinorganismen aus zwei übereinander angeordneten Kammern, dadurch gekennzeichnet, dass die untere Kammer als Versorgungskammer mit festem Nährsubstrat befüllt ist und die obere Kammer eine Kulturkammer darstellt, die als Reservoir partikelfreier Organismensuspensionen dient, beide Kammern durch eine physikalische Barriere aus offenporigem Schaumstoff voneinander abgetrennt sind und die oben liegende Kammer steril, aber sauerstoffdurchlässig nach außen hin verschlossenen ist.cultivation systems for the production of long-term pure cultures of aquatic microorganisms and small organisms of two on top of each other arranged chambers, characterized in that the lower chamber as a supply chamber is filled with solid nutrient substrate and the upper chamber represents a culture chamber serving as a reservoir particle-free organism suspensions, both chambers by a physical barrier of open-cell foam from each other are separated and the upper chamber sterile, but oxygen permeable after Outside is closed off.

Description

Die Erfindung betrifft Kultivierungssysteme zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Kulturen von wasserlebenden Kleinst- und Kleinorganismen sowie Verfahren, bei denen die Organismen in einem zwei-kammerigen Kultivierungssystem steril verschlossen gehältert werden und ferner Vorrichtungen zur Implementierung der Kultivierungsverfahren.The The invention relates to cultivation systems for obtaining particle-free Long-term cultures of aquatic microorganisms and microorganisms as well as methods in which the organisms are in a two-chambered Cultivation system can be kept sterile closed and also devices to implement the cultivation procedures.

Protozoen als wasserlebende Kleinstorganismen sind einzellige eukaryotische Organismen. Im Labor stehen eine Reihe von Vertretern dieser Organismengruppe schon seit mehreren Jahrzehnten im Zentrum biochemischen und molekulargenetischen Interesses (Gall J G, 1986, The Molecular Biology of Ciliated Protozoa, Academic Press, London; Lwoff A, 1951, Biochemistry and Physiology of Protozoa, Academic Press, London; Levandowsky M, Hutner S H, 1981, Biochemistry of Protozoa, vol. I-V. Academic Press, London.). In jüngster Vergangenheit erlangten einige Protozoenspezies auch zunehmende Bedeutung im Bereich der Toxikologie, Umweltschadstoffforschung und Biotechnologie (Gilron G L, Lynn D H, 1997, Ciliated Protozoa as Test Organisms in Toxicity Assessment. In: Microscale Testing in Aquatic Toxicology, Wells P G, Lee K, Blaise C (eds), CRC Press, Boca Raton; Tiedke A, 2001, Biotechnology with Protozoa. In: Biotechnology, Brehm H-J, Wiley-VCH, Weinheim).protozoa as aquatic microorganisms are unicellular eukaryotic Organisms. There are a number of representatives of this group of organisms in the laboratory for several decades in the center biochemical and molecular genetic Interest (Gall JG, 1986, The Molecular Biology of Ciliated Protozoa, Academic Press, London; Lwoff A, 1951, Biochemistry and Physiology of Protozoa, Academic Press, London; Levandowsky M, Hutner S H, 1981, Biochemistry of Protozoa, vol. I-V. Academic Press, London.). Most recently In the past, some protozoan species also gained increasing numbers Significance in the field of toxicology, environmental pollutant research and biotechnology (Gilron G L, Lynn D H, 1997, Ciliated Protozoa the Test Organisms in Toxicity Assessment. In: Microscale Testing in Aquatic Toxicology, Wells P G, Lee K, Blaise C (eds), CRC Press, Boca Raton; Tiedke A, 2001, Biotechnology with Protozoa. In: Biotechnology, Brehm HJ, Wiley-VCH, Weinheim).

Eine wichtige Voraussetzung biochemischer, molekulargenetischer und toxikologischer Untersuchungen ist die Möglichkeit zur Kultivierung des biologischen Ausgangsmaterials in Reinkultur. Fremdorganismen würden durch ihre eigene Biologie bzw. durch das zusätzliche Vorhandensein von Stoffwechselprozessen und Biomolekülen die Probe verunreinigen und damit die Analyse des eigentlichen Untersuchungsgegenstandes stören oder gar verhindern.A important prerequisite of biochemical, molecular genetic and toxicological Investigations is the possibility for cultivation of the biological starting material in pure culture. Foreign organisms would through their own biology or through the additional presence of metabolic processes and biomolecules contaminate the sample and thus interfere with the analysis of the actual object under investigation or prevent it from happening.

In aller Regel besitzen die für Laboruntersuchungen herangezogenen Protozoen-Spezies keine cryptobiotischen Lebensstadien, vermögen also keine stoffwechselarmen Dauerformen (Cysten) wie viele ihrer Verwandten zu bilden, sondern behalten auch unter den Bedingungen der Langzeit-Kultivierung ihre aktive, vergleichsweise stoffwechselintensive Lebensform bei, die auf ständiges Vorhandensein von Nahrung bzw. Nährstoffen angewiesen ist. Die Rein-Kultivierung dieser labortypischen Arten erfolgt daher meist in Vollmedien auf der Basis von Proteose-Pepton/Hefeextrakt (PPY) kultiviert (Cell Biology, 1994, A Laboratory Handbook, Celis J (ed), Academic Press, London); seltener finden synthetische Medien mit chemisch definierter Zusammensetzung Verwendung (Szablewski et al., 1991, Tetrahymena thermophila; growth in the synthetic nutrient medium in the presence and absence of glucose, J. Protozool, 38, 62-65). Neben der Kultivierung in gelösten Nährstoffen werden auch wässrige Medien verwandt, die als Nährsubstrat feste Bestandteile pflanzlichen (meist Zerealien wie Reis oder Getreide) oder tierischen Ursprungs (Fleisch) enthalten (z.B. Vater-Dobberstein B, Hilfrich H-G, 1982, Versuche mit Einzellern, Kosmos, Stuttgart). Besonders letztere Form mit festem Nährsubstrat wird häufig zur Stammkultivierung der Organismen gewählt.In usually have the for Laboratory studies used protozoan species no cryptobiotic Life stages, assets so no metabolism-resistant permanent forms (cysts) as many of their relatives but also keep in the conditions of long-term cultivation their active, comparatively metabolic intensive life form, the on permanent Presence of food or nutrients instructed. The pure cultivation of these lab typical species is therefore usually in full media based on proteose-peptone / yeast extract (PPY) (Cell Biology, 1994, A Laboratory Handbook, Celis J (ed), Academic Press, London); rare find synthetic media with chemically defined composition Use (Szablewski et al., 1991, Tetrahymena thermophila; growth in the synthetic nutrient medium in the presence and absence of glucose, J. Protozool, 38, 62-65). In addition to the cultivation in dissolved nutrients are also aqueous media used as a nutrient substrate solid components of vegetable (usually cereals such as rice or cereals) or of animal origin (meat) (e.g., Vater-Dobberstein B, Hilfrich H-G, 1982, experiments with unicellulars, Kosmos, Stuttgart). Especially the latter form with solid nutrient substrate is often used to Root cultivation of the organisms selected.

Die Stammkultivierung bildet den Grundstock der Kultivierung des biologischen Materials. Von Stammkulturen wasserlebender Klein- und Kleinstorganismen ausgehend werden z.B. die eigentlichen Protozoen-Versuchskulturen gezogen, deren Kulturmedium der jeweiligen biologischen/biochemischen Fragestellung angepasst ist. Die Stammkultivierung dient in erster Linie dem Zweck, biologisches Ausgangsmaterial langfristig vorzuhalten und zugleich einer genetischen Verschiebung („genetic shift") vorzubeugen, weshalb die Organismen hier unter Bedingungen sehr geringen oder stationären Wachstums, d.h. unter weitgehender Vermeidung der Ausbreitungsmöglichkeit von Mutanten, gehalten werden. Die Hälterung der Organismen geschieht dabei in steril verschlossene Gefäßen, wobei Substrat und Zellen in einem Kultivierungsraum vereint vorliegen.The Stock cultivation forms the basis of the cultivation of the biological Material. From stock cultures of aquatic small and microorganisms starting from e.g. the actual protozoan experimental cultures are grown, their culture medium adapted to the respective biological / biochemical problem is. The tribe cultivation serves primarily the purpose, biological Source material in the long term and at the same time a genetic Shift ("genetic shift "), why the organisms here under conditions very low or stationary Growth, i. while largely avoiding the possibility of propagation held by mutants. The keeping of the organisms happens in sterile closed vessels, wherein Substrate and cells are present together in a cultivation room.

Mit zunehmendem Alter bildet sich in Stammkulturen durch absterbende Organismen Zell-Debris [Fragmente toter (Körper)zellen, Zellfragmente]. Ebenso zersetzt sich im Laufe der Zeit das anfangs noch konsistente, aus festen Bestandteilen pflanzlichen (Zerealien) oder tierischen (z.B. Fleisch) Ursprungs bestehende Nährsubstrat. Bei herkömmlichen Verfahren der Kultivierung in einem einzigen Kultivierungsraum kommt es – besonders bei der Entnahme von Zellen – leicht zur Vermischung dieser partikulären Abbauprodukte mit der Zellsuspension. Eine für viele Zwecke notwendige genaue Bestimmung der Zelldichten solcher gealterter Kulturen wird damit erheblich erschwert. Gebräuchliche photometrische Methoden werden durch die mit der Vermischung einhergehende Eintrübung gestört und die auch üblichen elektronischen Zellzählverfahren sind aufgrund der partikulären Verunreinigungen nicht direkt anwendbar. Um dennoch die tatsächliche Zelldichte dieser Stammkulturen zu ermitteln, muss auf zeit- und arbeitsaufwendige mikroskopische Bestimmungsmethoden zurückgegriffen werden, oder die Zellen müssen durch umständliche, weitere Arbeitsschritte erfordernde Verfahren (z.B. Zentrifugation), vom Kulturmedium getrennt werden.With increasing age forms in stock cultures by dying Organisms Cell debris [Fragments of dead (cell) cells, cell fragments]. Likewise, in the course of time, the initially consistent, solid constituents of vegetable (cereal) or animal (e.g., meat) originated nutrient substrate. In conventional Method of cultivation in a single cultivation room comes it - especially in the removal of cells - easily for mixing these particulate Degradation products with the cell suspension. An exact necessary for many purposes Determination of the cell densities of such aged cultures becomes with it considerably more difficult. common Photometric methods are characterized by those associated with the mixing downturn disturbed and the usual electronic cell counting method are due to the particulate Impurities not directly applicable. Nevertheless, the actual To determine cell density of these stock cultures must be timely and laborious microscopic methods of determination are used be, or the cells have to through cumbersome, requiring further operations (e.g., centrifugation), be separated from the culture medium.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, Systeme zur Stammkultivierung wasserlebender Klein- und Kleinstorganismen zu schaffen, mit denen die genannten Nachteile der Stammkultivierung überwunden werden und die eine Stammkultivierung von wasserlebenden Klein- und Kleinstorganismen insbesondere derart ermöglichen, dass eine Vermischung abgestorbener Zellbestandteile (Zelldebris) und partikulären Nährsubstrates bei der Entnahme lebender Zellen vermieden werden kann. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Vorrichtungen zur Implementierung der Verfahren anzugeben.The The object of the invention is systems for trunk cultivation water-living To create small and microorganisms with which those mentioned Disadvantages of root cultivation overcome and that a tribal cultivation of aquatic small and microorganisms in particular allow such a mixing Dead cell components (cell debris) and particulate Nährsubstrates can be avoided in the removal of living cells. Another The object of the invention is to provide devices for implementation specify the procedure.

Um ausgehend von bekannten Verfahren zur Stamm-Kultivierung von wasserlebenden Klein- und Kleinstorganismen, insbesondere von Protozoen (Einzellern), über längere Zeiträume detritus- und nährstoffpartikelfreie Organismensuspensionen/Zellsuspensionen zu erreichen (Detritus: breiige oder krümelige Überreste zerfallener Gewebs- u. Zellteile), wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, dass die Zellen in einem aus zwei übereinander angeordneten Kammern bestehenden, steril verschlossenen Kultivierungssystem in Flüssigkeit gehältert werden, wobei festes Nährsubstrat bzw. partikuläre Nährmediumbestandteile nur der unteren Kammer (Versorgungskammer) zugesetzt werden, und die obere Kammer als Reservoir (Organismenreservoir/Zellreservoir) partikelfreier Organismensuspension/Zellsuspension (Kulturkammer) dient. Beide Kammern stehen über eine oder mehrere Öffnungen miteinander in Verbindung. Ihre Nährstoffe erhalten die Zellen vorzugsweise aus festen, partikulären Nährsubstraten wie beispielsweise Zerealien oder Fleisch. Entsprechend ihrer im Vergleich zur Organismensuspension/Zellsuspension höheren Dichte und ihrer die Zellen um ein Vielfaches übertreffenden Größe werden sie dem unteren Teil des Kultivierungssystems zugesetzt. Die Öffnung bzw. Porenweite der trennenden Schicht zwischen beiden Kammern ist nun so bemessen, dass Partikel von der Größe der Organismen ungehindert passieren können, die Nährpartikel aber zurückgehalten werden. Zugleich muss die Öffnung bzw. Porenweite so gewählt sein, dass die in der Trennschicht wirkenden Kapillarkräfte stark genug sind, Flüssigkeit selbst nach Kippen der Kultivierungseinheit zu halten. Damit ist gewährleistet, dass sich im Laufe der Zeit bildender Zelldebris nach unten in die Versorgungskammer absinken und sich dort ansammeln kann. Umgekehrt wird das partikuläre Nährsubstrat aufgrund der geringen Porenweite der Trennschicht im unteren Teil zurückgehalten.Around starting from known methods for the trunk cultivation of aquatic living Small and microorganisms, in particular of protozoa (unicellular), over long periods of detritus and nutrient particle-free To obtain organism suspensions / cell suspensions (detritus: pulpy or crumbly remains disintegrated tissue & Cell parts) is proposed according to the invention, that cells in one of two superimposed chambers existing, sterile closed culture system in liquid held for at be, with solid nutrient substrate or particulate Nährmediumbestandteile only the lower chamber (supply chamber) can be added, and the upper chamber as a reservoir (organism reservoir / cell reservoir) particle-free organism suspension / cell suspension (culture chamber) serves. Both chambers are over one or more openings in contact with each other. Your nutrients get the cells preferably from solid, particulate nutrient substrates such as Cereals or meat. According to her in comparison to the organism suspension / cell suspension higher Density and their cells are many times superior in size added to the lower part of the cultivation system. The opening or Pore width of the separating layer between both chambers is now so dimensioned that particles of the size of the organisms unhindered can happen the nutrient particles but withheld become. At the same time, the opening needs or pore size selected so be that the capillary forces acting in the separation layer strong are enough, liquid even after tipping the cultivation unit. This is ensures that Over time cell debris down into the supply chamber sink and can accumulate there. Conversely, the particulate nutrient substrate due to the small pore size of the separating layer in the lower part retained.

Die Aufgaben der Erfindung werden durch Verfahren und durch Vorrichtungen gemäß den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.The Objects of the invention are achieved by methods and by devices according to the characteristics of Claim 1 solved. Advantageous developments are described in the subclaims.

Das erfindungsgemäße Kultivierungssystem zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von Protozoen besteht darin, dass die Organismen in einem aus zwei übereinander angeordneten Kammern bestehenden Kultivierungssystem gehältert werden, die untere Kammer mit festem Nährsubstrat befüllt ist (Versorgungskammer), und die obere Kammer als Reservoir (Organismenreservoir/Zellreservoir) partikelfreier Organismensuspension/Zellsuspension dient (Kulturkammer) und Versorgungs- und Kulturkammer durch eine offenporige physikalische Barriere voneinander abgetrennt sind, wobei gilt, dass

– die Organismen steril und als Reinkultur kuliviert werden,
– die Kultivierungseinheit steril, aber sauerstoffdurchlässig verschlossen ist,
– partikuläre, feste Nährstoffe pflanzlichen oder tierischen Ursprungs das Ausgangssubstrat der Kultur bilden und
– die physikalische Barriere zwischen den beiden Kammern eine oder mehrere Öffnungen aufweist, die groß genug sind, den aktiven Übertritt von Zellen zu gewährleisten sowie ein passives Absinken abgestorbener Zellen oder Zellbestandteile zu ermöglichen, aber klein genug sind, durch Kapillarkräfte Kulturflüssigkeit zurückzuhalten und selbst im gekippten Zustand der Kultivierungseinheit eine Vermischung der beiden Kammerinhalte verhindern bzw. deutlich reduzieren.

The cultivation system according to the invention for obtaining particle-free, long-term pure cultures of protozoa is that the organisms are kept in a culture system consisting of two superimposed chambers, the lower chamber is filled with solid nutrient substrate (supply chamber), and the upper chamber is used as a reservoir (organisms reservoir / Zellreservoir) particle-free organism suspension / cell suspension is used (culture chamber) and supply and culture chamber separated by an open-cell physical barrier, with the proviso that

- the organisms are sterile and are cultivated as a pure culture,
The culture unit is sterile but impermeable to oxygen,
- particulate, solid nutrients of plant or animal origin form the starting substrate of the culture and
The physical barrier between the two chambers has one or more openings large enough to ensure the active crossing of cells as well as allowing a passive sinking of dead cells or cell components but small enough to retain culture fluid by capillary forces and even in the tilted one Condition of the cultivation unit prevent or significantly reduce mixing of the two chamber contents.

Das Kultivierungssystem kann als einteiliges oder zweiteiliges System ausgelegt sein, bei dem die obere Kammer von der unteren abgenommen werden kann, d.h. beide Kammern vollständig voneinander trennbar sind. Im Falle einer Zweiteilung lassen sich die Organismen ohne weitere Hilfsmittel direkt mit der Kulturkammer von der Versorgungskammer entfernen.The Cultivation system can be as a one-part or two-part system be designed, in which the upper chamber removed from the lower can be, i. both chambers are completely separable from each other. In case of a dichotomy, the organisms can be without further Aid directly to the culture chamber of the supply chamber remove.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, dass ein sauerstoffdurchlässiger Verschluss aus einem durchstechbaren Septum besteht, durch das von außen mittels einer Spritze Zellen steril entnommen werden können, ohne die Kultivierungseinheit öffnen zu müssen. Ein Septumverschluss hat neben der Möglichkeit der wiederholten Entnahme noch den weiteren Vorteil, ohne Sterilraumbedingungen verbrauchte oder alte Flüssigkeit in der Kultivierungskammer zu ersetzen bzw. auszutauschen.One Another feature of the invention is that an oxygen-permeable closure consists of a pierceable septum, by the outside by means of A syringe cells can be removed sterile without opening the cultivation unit to have to. A septum closure has in addition to the possibility of repeated Removal still the further advantage, consumed without Sterilraumbedingungen or old liquid in the cultivation chamber to replace or exchange.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform besteht darin, dass die Kultivierungseinheit als Photometer-Küvette ausgelegt ist. Damit lässt sich die Dichte der Organismen nicht-invasiv direkt im Kultivierungssystem noch vor der Entnahme bestimmen und eine definierte Zahl von Organismen entnehmen.A further preferred embodiment is that the cultivation unit designed as a photometer cuvette is. Leave it The density of organisms is non-invasive directly in the cultivation system determine before the removal and a defined number of organisms remove.

In einer hevorzugten Weiterbildung werden als Kultivierungssystem Röhrchen im 96-er Standard-Mikrotiterplattenformat herangezogen. Dies erleichtert die halb- bzw. vollautomatische Befüllung des Kultivierungssystems und ermöglicht die Herstellung der Stammkulturen in großer Zahl.In A preferred continuing education will be as a cultivation system tubes in the 96 standard microtiter plate format used. This facilitates the semi-automatic or fully automatic filling of the cultivation system and allows the production of stock cultures in large numbers.

Als wasserlebende Klein- und Kleinstorganismen im Sinne dieser Erfindung werden beispielsweise Bakterien, Algen, Pilze, Protozoen und kleine Metazoen (Vielzeller) verstanden.When aquatic microorganisms in the sense of this invention For example, bacteria, algae, fungi, protozoa and small ones Metazoans understood.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Kulturen besteht darin, dass die Organismen in Kultivierungssystemen aus zwei übereinander angeordneten Kammern so gehältert werden, dass die als Versorgungskammer dienende untere Kammer mit festem Nährsubstrat befüllt wird und die obere Kammer als Kulturkammer sowie als Reservoir (Organismenreservoir/Zellreservoir) partikelfreier Organismensuspension/Zellsuspension dient und beide Kammern durch eine offenporige physikalische Barriere voneinander abgetrennt werden. Dabei werden die Organismen steril und als Reinkultur kultiviert und die Kultivierungseinheiten steril, aber sauerstoffdurchlässig verschlossen. Als Ausgangssubstrat werden in der Kultur partikuläre, feste Nährstoffe pflanzlichen oder tierischen Ursprungs eingesetzt. Vorteilhaft erfolgt die Kultivierung in Standard Glas-Gefäßen mit Schraubverschluss und einliegendem Septum und in Gefäßen im 96er Mikrotiterplatten-Format.The inventive method to obtain particle-free long-term cultures is that the organisms in cultivation systems of two superimposed chambers so salved be that serving as a supply chamber lower chamber with solid nutrient substrate filled and the upper chamber as a culture chamber and as a reservoir (organisms reservoir / cell reservoir) particle-free organism suspension / cell suspension and both Chambers through an open-pore physical barrier from each other be separated. The organisms are sterile and pure culture cultured and the cultivation units sterile, but permeable to oxygen. As a starting substrate in the culture particulate, solid nutrient of plant or animal origin. Advantageously the cultivation in standard glass vessels with Screw cap and enclosed septum and in the 96er Microtiter plate format.

Unter partikelfreien Kulturen im Sinne dieser Erfindung werden solche verstanden, die weitestgehend frei von nicht lebenden partikulären Bestandteilen wie Zelldebris oder Nährsubstratpartikeln sind.Under particle-free cultures in the sense of this invention are those understood to be largely free of non-living particulate constituents like cell debris or nutrient substrate particles are.

Es ist eine entscheidende und überraschende Eigenschaft der vorliegenden Erfindung, dass durch die Kompartimentierung der Kultivierungseinheit eine von Zelldebris und Nährsubstratpartikeln freie Organismensuspension/Zellsuspension in der oben liegenden Kulturkammer erreicht wird: Begünstigt durch die Schwerkraft sinken in dem aufrecht stehenden, zwei-kammerigen Kultivierungssystem absterbendes Zellmaterial sowie partikuläre Stoffwechselprodukte in die unten liegende Versorgungskammer. Umgekehrt wird das partikuläre Nährsubstrat aufgrund der geringen Porenweite der Trennschicht im unteren Teil zurückgehalten. Wird die Kultivierungseinheit z.B. zur Entnahme von Zellmaterial oder während eines Transports gekippt, verhindert die Trennschicht bzw. die dort aufgrund von Kapillarkräften zurückgehaltene Flüssigkeit eine Durchmischung der beiden Kammern. Durch diese Separation werden damit aufwendige physikalische Verfahren wie Zentrifugation oder Filtration zur Abtrennung von Partikeln aus der Kultur überflüssig. Durch den erfindungsgemäßen modularen Aufbau des Kultivierungssystems wird eine wesentliche Voraussetzung zur Nutzung dieser Organismen für eine Reihe biochemischer/molekulargenetischer sowie toxikologischer Fragestellungen erfüllt.It is a decisive and surprising Property of the present invention that by the compartmentalization the culture unit is one of cell debris and nutrient substrate particles free organism suspension / cell suspension in the overhead Culture Chamber is reached: Favored by gravity sink in the upright, two-chambered Cultivation system dying cell material and particulate metabolites in the lower supply chamber. Conversely, the particulate nutrient substrate due to the small pore size of the separating layer in the lower part retained. If the culturing unit is e.g. for removal of cell material or while tilted a transport prevents the separating layer or there due to capillary forces retained liquid a mixing of the two chambers. Through this separation thus consuming physical methods such as centrifugation or Filtration to remove particles from the culture superfluous. By the modular invention Building the cultivation system becomes an essential requirement to use these organisms for a series of biochemical / molecular genetic as well as toxicological Questions fulfilled.

Neben dem wesentlichen Vorteil einer von unerwünschten partikulären Verunreinigungen freien Organismensuspension/Zellsuspension in der oberen Kammer bewirkt die vertikale Anordnung der Kammern darüber hinaus, dass sich ein Großteil der in der Kulturvorrichtung vorhandenen Organismen in der oben liegenden Kulturkammer ansammelt: Erstens zeigen Protozoen eine allgemeine Tendenz zur Aerotaxis, d.h. sich entlang von Sauerstoffgradienten zu orientieren und an Orten höheren Sauerstoffgehaltes, d.h. oben, in Verschlussnähe zu akkumulieren. Und zweitens nutzt die vertikale Anordnung das häufig bei Protozoen anzutreffende negativ geotaktische Verhalten der Zellen, das zu einer Bewegung gegen die Schwerkraft und damit zu einer relativen Anreicherung der Zellen im oberen Teil der Flüssigkeitssäule führt.Next the substantial advantage of one of undesired particulate impurities free organism suspension / cell suspension in the upper chamber In addition, the vertical arrangement of the chambers causes a large part of the organisms present in the culture device in the upper one Culture chamber accumulates: First, protozoa show a general Tendency to aerotaxis, i. along oxygen gradients to orient and higher in places Oxygen content, i. above, to accumulate near the closure. And secondly the vertical arrangement makes use of what is commonly found in protozoa negative geotactic behavior of the cells leading to a movement against gravity and thus to a relative enrichment the cells in the upper part of the liquid column leads.

Das erfindungsgemäße Kultivierungssystem ermöglicht es,

• Zellen mehrfach der Kulturkammer steril zu entnehmen sowie das entnommene Volumen durch wässrige Mediumbestandteile zu ersetzten und damit eine semi-kontinuierliche Weiterkultivierung der Zellen zu erreichen;
• die Organismendichte/Zelldichte ohne vorherige Entnahme von Organismensuspension/Zellsuspension direkt in der Kulturkammer zu bestimmen;
• die Kulturkammer mit der darin enthaltenen partikelfreien Organismensuspension/Zellsuspension von der Versorgungskammer leicht abtrennen zu können.

The cultivation system according to the invention makes it possible

• to remove cells from the culture chamber several times in a sterile manner and to replace the withdrawn volume with aqueous medium components, thus achieving a semi-continuous further cultivation of the cells;
• Determine the organism density / cell density without prior removal of the organism suspension / cell suspension directly in the culture chamber;
• be able to easily separate the culture chamber with the particle-free suspension of organisms / cell suspension contained therein from the supply chamber.

Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Diese Merkmale bestehen aus an sich bekannten Elementen, die in ihrer neuen Kombination zu den erfindungsgemäßen vorteilhaften Kultivierungssystemen führen und die in ihrer Gesamtheit einen synergistischen Effekt ergeben, der darin besteht, dass erstmals Kultivierungssysteme zur Gewinnung partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von beweglichen Mikroorganismen oder kleinen Vielzellern zur Verfügung gestellt werden.The Features of the invention will become apparent from the elements of the claims and from the description, with both individual features as also represent several advantageous combinations in the form of combinations, for the with this writing protection is requested. These features exist from elements known per se, in their new combination to the advantageous inventive Lead cultivation systems and which, in their entirety, give a synergistic effect, which consists of the first time cultivation systems for the extraction Particle-free long-term pure cultures of mobile microorganisms or small multicellulars.

Die Verwendung der neuen Kultivierungssysteme besteht in der Gewinnung partikelfreier Langzeit-Reinkulturen von Organismen und weiterhin darin, dass sie

– als Küvetten zur direkten photometrischen Bestimmung der Organismendichte/Zelldichte in der Kulturkammer und als Photometer-Küvette der septumverschlossenen Kultivierungs-einheit
– als Kultivierungsgefäße im 96er Mikrotiterplatten-Format
– als Vorrichtungen zur Implementierung der erfindungsgemäßen Kultivierungs-verfahren sowie
– zur Bestimmung der Organismendichte/Zelldichte ohne vorherige Entnahme von Organismensuspension/Zellsuspension direkt in der Kulturkammer

dienen.The use of the new cultivation systems consists of obtaining particle-free, long-term pure cultures of organisms and further that they

As cuvettes for the direct photometric determination of the organism density / cell density in the culture chamber and as a photometer cuvette of the septum-sealed cultivation unit
- as culture vessels in 96-well microtiter plate format
- As devices for implementing the cultivation method according to the invention and
- To determine the density of the organism / cell density without prior removal of organism suspension / cell suspension directly in the culture chamber

serve.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.The Invention is based on embodiments be explained in more detail, without being limited to these examples to be.

Ausführungsbeispieleembodiments

Nach der Erfindung sind die Kultivierungsbehältnisse in mehreren Varianten herstellbar und einzusetzen. Ausführungsbeispiele sind in den nachfolgenden Zeichnungen dargestellt und werden im folgenden näher beschrieben.To The invention relates to the cultivation containers in several variants can be produced and used. Embodiments are in the shown in the following drawings and will be described in more detail below.

Legende zu den FigurenLegend too the figures

Es zeigenIt demonstrate

1 eine schematische Übersichtsdarstellung einer erfindungsgemäßen Kultivierungsvorrichtung mit abnehmbarem Schraubverschluss 1 a schematic overview of a cultivation device according to the invention with removable screw cap

2 einen Verschluss mit eingelegtem durchstechbaren Septum 2 a closure with inserted pierceable septum

3 eine Anordnung von Kultivierungseinheiten im 96er Mikrotiterplattenformat 3 an array of 96-well microtiter plate culture units

4 eine Kultivierungseinheit als Photometer-Küvette/schematische Übersichtsdarstellung einer als Küvette ausgelegten, septumverschlossenen Kultivierungseinheit 4 a cultivation unit as a photometer cuvette / schematic overview of a cuvette-designed, septum-capped cultivation unit

5 eine Kultivierungseinheit, bestehend aus einer von der Kulturkammer abtrennbaren Versorgungskammer/schematische Darstellung einer Kultivierungseinheit mit abtrennbarer Kulturkammer. 5 a cultivation unit, consisting of a supply chamber separable from the culture chamber / schematic representation of a culture unit with detachable culture chamber.

Bezugszeichen

reference numeral

In einer bevorzugten Ausführungsform der Kultivierungseinheit gemäß 1 werden beide Kammern 1, 2 von einem zylinderförmigen Gefäß (vorzugsweise aus Glas oder Kunststoff) umschlossen und durch einen offenporigen Schaumstoff 3 voneinander getrennt. Offenporiger Schaumstoff (z.B. Polyurethan-, Polyester- und Polyether-Schäume) ist preiswert und in beinahe jeder beliebigen Porengröße erhältlich. Er lässt sich leicht an die jeweiligen Abmessungen der Kultivierungseinheit anpassen und kann – bei entsprechender Wahl der Porengröße – von den Zellen durchdrungen werden. Wird eine Schichtdicke des Schaumstoffes von mehreren Millimetern gewählt und liegt die Porengröße bei maximal etwa zwei mm, kann zudem erreicht werden, dass selbst im gekippten Zustand der Kultivierungseinheit keine Bestandteile aus der Versorgungskammer 2 in die Kulturkammer 1 übertreten und die Organismensuspension/Zellsuspension 5 verunreinigen, da sich in den feinen Poren des Schaumstoffes 4 aufgrund von Kapillarkräften eine die beiden Kammern 1, 2 trennende, stationäre wässrige Schicht praktisch ohne Fließbewegungen bildet. Oben ist die Kultivierungseinheit steril, aber sauerstoffdurchlässig durch einen Stopfen oder eine Kappe 7 verschlossen. Nach Entfernen des Verschlusses 7 kann die Organismensuspension/Zellsuspension 5 ohne Verunreinigungen durch Zelldebris, Detritus oder Nährsubstratpartikel entnommen werden. Geschieht dies unter sterilen Bedingungen, lassen sich Zellen wiederholt entnehmen. Wird zugleich das entnommene Volumen steril durch wässrige Mediumbestandteile ersetzt, kann eine semi-kontinuierliche Weiterkultivierung der Stammkultur erreicht werden.In a preferred embodiment of the cultivation unit according to 1 become both chambers 1 . 2 enclosed by a cylindrical vessel (preferably made of glass or plastic) and by an open-cell foam 3 separated from each other. Open cell foam (eg polyurethane, polyester and polyether foams) is inexpensive and available in almost any pore size. It can be easily adapted to the respective dimensions of the cultivation unit and can - if the pore size is chosen - be penetrated by the cells. If a layer thickness of the foam of several millimeters is selected and the pore size is at most about two mm, it can also be achieved that even in the tilted state of the cultivation unit no components from the supply chamber 2 in the culture chamber 1 transgress and the organism suspension / cell suspension 5 contaminate, as reflected in the fine pores of the foam 4 due to capillary forces one the two chambers 1 . 2 separating stationary aqueous layer with virtually no flow. At the top, the culture unit is sterile, but oxygen permeable through a stopper or cap 7 locked. After removing the closure 7 may be the organism suspension / cell suspension 5 are removed without contamination by Zelldebris, detritus or Nährsubstratpartikel. If this happens under sterile conditions, cells can be repeatedly removed. If at the same time the withdrawn volume is replaced sterile by aqueous medium components, a semi-continuous further cultivation of the stock culture can be achieved.

Eine vorteilhafte Modifizierung gemäß 2 der Kultivierungseinheit sieht sauerstoffdurchlässige durchstechbare Septen 9 (z.B. aus Silikon oder Silikon/Teflon) als Verschluss 7 vor. Nach Durchstechen des Septums 9 kann – ohne Öffnen der Kultivierungseinheit – mit Hilfe einer Sterilspritze 10 mehrfach Organismensuspension/Zellsuspension 5 entnommen und transferiert werden, ohne dass es hierzu weiterer Vorkehrungen zum sterilen Arbeiten (z.B. sterile Werkbank, Arbeiten an der Flamme) bedarf. Ebenso lässt sich hier ohne Öffnen der Kultivierungseinheit das entnommene Suspensionsvolumen oder alte Kulturflüssigkeit durch frische Mediumbestandteile ersetzen. Bewährt haben sich hier Glasröhrchen, wie sie im Bereich der Chromatographie eingesetzt werden. Sie sind in unterschiedlichen Ausführungen preiswert erhältlich und zeichnen sich durch einen (abnehmbaren) Schraubverschluss 8 mit eingelegtem Silikon/Teflon-Septum 9 aus. Das Septum 9 ist sauerstoffdurchlässig und kann außerdem zur Entnahme oder Zugabe von Flüssigkeit mehrfach ohne Schädigung des Sterilverschlusses mit einer Kanüle durchstochen werden.An advantageous modification according to 2 The culture unit sees oxygen permeable pierceable septa 9 (eg silicone or silicone / Teflon) as a closure 7 in front. After piercing the septum 9 can - without opening the cultivation unit - with the help of a sterile syringe 10 several times organism suspension / cell suspension 5 can be removed and transferred, without the need for further precautions for sterile work (eg sterile workbench, work on the flame). Likewise, without opening the cultivation unit, the removed suspension volume or old culture fluid can be replaced by fresh medium components. Proven here have glass tubes, as used in the field of chromatography. They are available inexpensively in different versions and are characterized by a (removable) screw cap 8th with inlaid silicone / Teflon septum 9 out. The septum 9 is oxygen-permeable and can also be pierced multiple times for removal or addition of liquid without damaging the sterile closure with a cannula.

Um eine halb- bzw. vollautomatisierte Herstellung der Stammkulturen in großer Zahl zu erreichen, hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, Glas- oder Kunststoffröhrchen als Kultivierungssystem zu verwenden, die im 96er Mikrotiterplattenformat bereits vorgefertigt auf dem Markt erhältlich sind. 3 zeigt eine solche Anordnung von Röhrchen. Der Rückgriff auf solche Standard-Formate bietet neben der Automatisierbarkeit ein großes Angebot an sehr unterschiedlichen Kulturgefäßen und erlaubt zudem, die Anschaffungs- und Herstellungskosten sehr gering zu halten.In order to achieve a semi- or fully automated production of the stock cultures in large numbers, it has proven to be particularly advantageous to use glass or plastic tubes as a cultivation system, which are already available in the 96-well microtiter plate format on the market. 3 shows such an arrangement of tubes. The recourse to such standard formats offers in addition to the automation of a wide range of very different culture vessels and also allows to keep the acquisition and production costs very low.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform besteht gemäß 4 darin, dass die Kultivierungseinheit als Photometer-Küvette ausgelegt ist. Auf diese Weise wird eine genaue und nicht-invasive Bestimmung der Organismendichte/Zelldichte schon vorab in der Kulturkammer 1 ermöglicht. Die Kultivierungseinheit wird hierzu in ein Photometer in der Weise eingebracht, dass der Lichtstrahl durch die Kulturkammer 1 mit der darin enthaltenen, von störenden Partikeln freien Organismensuspension/Zellsuspension 5 fällt. Anhand der optischen Dichte (bzw. des Extinktionswertes) bei einer vorgegebenen Lichtwellenlänge und einer Kalibrierungskurve lässt sich die genaue Organismendichte/Zelldichte in der Kulturkammer 1 errechnen und durch Entnahme eines bestimmten Volumens eine definierte Anzahl von Organismen entnehmen. Prinzipiell kann dabei jede Lichtwellenlänge zur Bestimmung herangezogen werden, allerdings muss der Zusammenhang zwischen optischer Dichte und Organismendichte/Zelldichte (Kalibrierungskurve) jeweils bekannt sein. Wird als Verschluss 7 ein durchstechbares Septum 9 gewählt, können darüber hinaus Zellen auch unter nicht-Sterilraumbedingungen beispielsweise mittels einer Sterilspritze 10 mehrfach und steril in präziser Anzahl entnommen werden.A further preferred embodiment is according to 4 in that the cultivation unit is designed as a photometer cuvette. In this way, an accurate and non-invasive determination of the organism density / cell density in advance in the culture chamber 1 allows. For this purpose, the cultivation unit is introduced into a photometer in such a way that the light beam passes through the culture chamber 1 with the therein contained, from disturbing particles free organism suspension / cell suspension 5 falls. On the basis of the optical density (or the extinction value) at a given wavelength of light and a calibration curve, the exact organism density / cell density in the culture chamber can be determined 1 calculate and remove a certain volume by taking a defined number of organisms. In principle, each wavelength of light can be used for the determination, but the relationship between the optical density and the organism density / cell density (calibration curve) must be known in each case. Used as a closure 7 a pierceable septum 9 In addition, cells can also be used under non-sterile room conditions, for example by means of a sterile syringe 10 multiple and sterile in precise numbers are removed.

Alternativ zur Ausführungsform, bei der beide, Kultur- und Versorgungskammer von einem Behältnis fest umfasst werden, hat sich gemäß 5 eine erfindungsgemäße Ausgestaltung der Kultivierungssystems bewährt, bei dem die Kulturkammer 1 mit der darin befindlichen Organismensuspension/Zellsuspension 5 von der Versorgungskammer 2 abgenommen werden kann. Bei der in 5 illustrierten Ausführungsform werden zwei Röhrchen ineinander gesteckt, wobei der Boden der Kulturkammer 1 die Trennschicht 3 zur Versorgungskammer 2 bildet und ein Loch 11 im Boden der Kulturkammer 1 (oberes Röhrchen) die Verbindung zur Versorgungskammer 2 herstellt.As an alternative to the embodiment in which both, culture and supply chamber are firmly enclosed by a container, has become 5 an inventive embodiment of the cultivation system proven, in which the culture chamber 1 with the organism suspension / cell suspension contained therein 5 from the supply chamber 2 can be removed. At the in 5 illustrated embodiment, two tubes are inserted into each other, wherein the bottom of the culture chamber 1 the separation layer 3 to the supply chamber 2 forms and a hole 11 in the bottom of the culture chamber 1 (upper tube) the connection to the supply chamber 2 manufactures.

Die Erfindung ist nicht auf die dargestellten Ausführungsformen beschränkt. Vielmehr können die Kulturkammer, die Trennschicht, die Versorgungskammer sowie die Verschlussvorrichtungen anwendungsabhängig modifiziert werden.The The invention is not limited to the illustrated embodiments. Much more can the culture chamber, the separating layer, the supply chamber as well the closure devices are modified depending on the application.

Beispielsweise kann das Volumen der Versorgungskammer 2 um ein Vielfaches größer angelegt sein als das Volumen innerhalb der Kultivierungskammer 1. Ferner kann abweichend von der dreidimensionalen Struktur der offenporigen Trennschicht eine zweidimensionale netzartige Matrix treten. Weitere Modifizierungsmöglichkeiten beziehen sich auf die Form der Kammern und der Kultivierungseinheit sowie die Auswahl der Verschlussvorrichtung.For example, the volume of the supply chamber 2 be designed to be many times larger than the volume within the cultivation chamber 1 , Further, unlike the three-dimensional structure of the open-pore separating layer, a two-dimensional net-like matrix may occur. Further modification possibilities relate to the shape of the chambers and the cultivation unit as well as the selection of the closure device.

Claims

Cultivation systems for obtaining long-term pure cultures of aquatic microorganisms and small organisms from two superimposed chambers, characterized in that the lower chamber is filled as a supply chamber with solid nutrient substrate and the upper chamber is a culture chamber, which serves as a reservoir of particle-free organism suspensions, both chambers a physical barrier of open-cell foam are separated from each other and the upper chamber is sterile, but oxygen-permeable sealed to the outside.

Cultivation systems according to claim 1 as devices to obtain particle-free long-term pure cultures of aquatic life Microorganisms from the series bacteria, algae, fungi, Protozoa or small metazoans, characterized in that the oxygen-permeable Closure consists of a pierceable septum.

Cultivation systems according to claim 1 and 2, characterized characterized in that it is a one-part cultivation system form a single cultivation unit.

Cultivation systems according to claim 1 and 2, characterized characterized in that they are present as a two-part cultivation system, where both chambers are complete are separated from each other.

Cultivation systems according to one of claims 1 to 4, characterized in that the cultivation unit as a cuvette for direct photometric determination of organism density in the Culture chamber is designed.

Cultivation systems according to claim 1 to 5 thereby characterized in that they are made of standard glass jars with screw cap and insist on septum.

Cultivation systems according to claim 1 to 6 characterized characterized in that the physical barrier according to claim 1 consists of a two-dimensional mesh-like matrix.

Process for obtaining particle-free long-term pure cultures of aquatic microorganisms and microorganisms in cultivation systems from two on top of each other arranged chambers according to claim 1 to 7, characterized in that that the organisms so salvaged be that serving as a supply chamber lower chamber with solid nutrient substrate filled and the upper chamber as a culture chamber and as a reservoir particle free Organisms suspensions are used and both chambers by an open-pore physical barrier are separated from each other, wherein a. the organisms are sterile and cultivated as a pure culture, b. the culture unit sterile, but permeable to oxygen will and c. particulate, solid nutrients of plant or animal origin as the starting substrate of Culture are used.