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Die
Erfindung betrifft einen Bioreaktor mit modularem Aufbau, welcher
insbesondere zur ex-vivo Zellvermehrung Anwendung findet.
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Bioreaktoren
nach dem Oberbegriff der Erfindung finden auf dem Gebiet der ex-vivo
Zellvermehrung Anwendung.
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Dabei
wird das biologische Material derart konditioniert, dass dieses
unter optimalen Bedingungen wachsen kann.
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Der
biomedizinische Gerätebau
stellt für
diese Aufgabe verschiedenste Bauarten von Bioreaktoren zur Verfügung.
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Im
Stand der Technik sind Bioreaktoren bekannt, die einen zylinderförmigen Zellkulturraum
aufweisen, der von Kapillarmembranbündeln durchzogen wird. Über die
Kapillarmembran wird das System mit einer Nährlösung und einem Gasgemisch versorgt.
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Weiterhin
sind Festbettbioreaktoren bekannt, bei denen in einem zylinderförmigen Gefäß auf einem
Siebboden eine Schüttung
makroporöser, beispielsweise
collagenbeschichteter, Partikel gelagert ist. Diese Schüttung wird
von einer Nährlösung durchströmt, die
optimal temperiert ist und über
eine Gasaustauscheinheit die physiologische Konzentration von Luft,
Stickstoff, Sauerstoff und Kohlendioxid aufweist. Adherierende Zellen
siedeln sich in den Poren und Zwischenräumen der Partikelschüttung an und
wachsen schließlich
unter optimalen äußeren Bedingungen.
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Auch
ist nach der
US 5,688,687 ein
System zur ex-vivo Zellvermehrung bekannt, in welchem eine kreiszylindrische
Zellkulturkammer verwendet wird, die kontinuierlich vom Medium durchströmt wird. Über eine
Membran findet der Gasaustausch mit der Kulturkammer statt. Im Mediumstrom
befindet sich eine behandelte Kunststoffplatte, auf deren Unterseite
die Nährlösung im
Mittelpunkt des Kreiszylinders radial in die Kulturkammer eintritt
und an derem Umfang Austrittsöffnungen
vorgesehen sind. Durch die Austrittsöffnungen fließt das zellhaltige
Medium ab.
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Die
Zellkulturkammer ist eingebunden in ein System mit weiteren peripheren
Komponenten, die durch ihre Zusammenwirkung die optimalen Bedingungen
für die
Vermehrung von Zellen gewährleisten sollen.
Die Kulturkammer ist derart dimensioniert, dass die Zellen zwischen
dem Eintritt der Nährlösung in
die Kulturkammer und dem Austritt der Nährlösung aus der Kulturkammer wachsen.
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Den
im Stand der Technik bekannten Bauweisen von Bioreaktoren haften
unterschiedlichste Nachteile an.
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Die
Bioreaktoren mit Kapillarmembranbündeln haben den Nachteil, dass
der Wirkungsgrad der Stoffübertragung
von der Nährlösung in
den Zellkulturraum sehr schnell abnimmt und die Zellen immer schlechter
ernährt
werden. Zudem kann die Konzentration der Zellen im Zellkulturraum
nicht gemessen werden. Die Zellen siedeln sich verstärkt um die
Kapillarmembran herum an und können
nur schwierig und unvollständig
entnommen werden, wodurch der Wirkungsgrad des Bioreaktors sehr
ungünstig
ist.
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Festbettreaktoren
haben den Nachteil, dass zum einen nur adherente Zellen vermehrbar
sind und zum anderen die Zellen nicht in einem abgeschlossenen Raum
gehalten werden.
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Zellen,
die nicht adherieren, werden aus dem System ausgeschwämmt und
gehen somit der Zellausbeute verloren.
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Weiterhin
sind die auf den Partikeln adherent gewordenen Zellen nur schwer
und unvollständig
aus dem Bioreaktor und der Partikelschüttung entnehmbar, was zu einer
relativ geringen Zellausbeute beim Betrieb dieses Typs von Bioreaktor
führt.
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Den
angeführten
Bioreaktoren und Systemen haftet der gemeinsame Nachteil an, dass
die Zellkultur während
des Wachstums nicht beobachtbar ist und dass das Ergebnis immer
erst nach einer Betriebszeit bzw. Kulturlaufzeit erkennbar ist.
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Eine
unmittelbare Einwirkung, beispielsweise über die Wachstumsbedingungen,
durch Zusammensetzung der Nährlösung oder
des Gasgehalts im Zellkulturraum ist damit nicht möglich.
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Aus
der
DE 19817524 C1 ist
eine mikroskopierfähige
Kammer zur Kultivierung von Zellen und Geweben bekannt, wobei eine
Kammer mit Ein- und Auslasskanälen
aus einem Gehäuseunterteil
und einem Gehäuseoberteil
besteht, die jeweils einen ersten Kammerteil zwischen einem Kulturträger, Dichtungselementen
und einer Sichtscheibe im ersten Kammerteil und einen zweiten Kammerteil
zwischen Kulturträger,
Dichtungselementen und einer Sichtscheibe im zweiten Kammerteil
bilden, wobei wenigstens einer der Einlasskanäle als Blasenfangkammer vorgesehen
ist.
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Die
DE 44 43 902 C1 beschreibt
zur Kultivierung von Zellen insbesondere eine aus miteinander dichtend
verbundenen Gehäuseteilen
gebildete Mikroskopkammer mit einer nach außen abschließenden Betrachtungsscheibe,
die sich gegenüber
dem Innenraum der Kammer an einer Halteplatte mit einer die Betrachtungsscheibe
frei gebenden Öffnung
abstützt.
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Aus
der
DE 297 14 321
U1 ist eine Vorrichtung bekannt zur Fotokonversion von
floureszenzmarkierten biologischen Gewebestrukturen mit einem transparenten
Unterteil mit mittigem Probebad und einer das Probebad ringförmig umfassenden
Basis für
ein Wasserbad mit einem Kühlmittelreservoir zur Kühlung des
Probebades, und einem mit einer Öffnung
versehenen abnehmbaren Oberteil, das mit dem Unterteil gasdicht
verschließbar
ist und in Verbindung mit einer auf die Öffnung auflegbaren Glasscheibe
eine Sauerstoff ventilierbare Probenkammer bildet.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, einen Bioreaktor zu schaffen, bei welchem
die Zellkultur während der
Kulturlaufzeit beobachtbar ist und der weiterhin eine hohe Ausbeute
an Zellen gewährleistet.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe durch einen Bioreaktor mit modularem Aufbau gelöst, wobei übereinander
eine durchsichtige Temperierkammer, eine mit dieser in thermischem
Kontakt stehende Zellkulturkammer und eine mit der Zellkulturkammer über eine
Membran in stofflichem Kontakt stehende Nährlösungskammer angeordnet sind
und dass in der Zellkulturkammer eine funktionalisierte Schicht mit
biologischem Material über
ein Inversmikroskop von unten beobachtbar angeordnet ist.
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Nach
der Konzeption der Erfindung ist der Bioreaktor aus einzelnen Modulen
aufgebaut. Der Temperierboden ist dabei erfindungswesentlich aus
zwei durchsichtigen Begrenzungen aufgebaut, die einen Zwischenraum
aufweisen, durch den das Temperiermedium gepumpt wird. Die obere
Begrenzung der Temperierkammer begrenzt dabei gleichzeitig nach einer
vorteilhaften Ausführungsform
mit ihrer Oberseite den Zellkulturraum nach unten.
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Nach
einer vorteilhaften Ausführungsform der
Erfindung wird die Temperierkammer von einer Bodenplatte und einer
Deckelplatte gebildet, wobei die funktionalisierte Schicht zur Aufnahme
und Vermehrung des biologischen Materials bzw. der Zellen direkt
auf der Oberseite der Deckelplatte der Temperierkammer angeordnet
ist und somit die untere Begrenzung der Zellkulturkammer darstellt.
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Dabei
ist es erfindungsgemäß von Vorteil, wenn
die Bodenplatte und die Deckelplatte aus Glas oder aus einem ähnlich transparenten
Kunststoff ausgeführt
werden.
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Dabei
ist es weiterhin vorteilhaft, die Kammern horizontal durch parallele
Begrenzungsflächen auszubilden;
gleichfalls erfindungsgemäß möglich ist es,
die Kammer aus verschiedenen Segmenten eines Zylinders auszubilden.
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Nach
einer vorteilhaften Ausführungsform der
Erfindung wird die obere Begrenzung der Zellkulturkammer zur Nährlösungskammer
von einer lichtdurchlässigen
Flachmembran gebildet.
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Die
Flachmembran wird entweder als Diffusionsmembran oder als Perfusionsmembran
ausgebildet. Im Falle der Ausbildung der Flachmembran als Perfusionsmembran
ist die Nährlösungskammer
in einen Zuflussbereich für
die Nährlösung und
einen Abflussbereich der verbrauchten Nährlösung unterteilt.
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Als
Flachmembranen werden erfindungsgemäß kernspurgeätzte Polyestermembranen
oder hydrophile Polymermembranen, wie beispielsweise Polyethersulfon
oder Acrylpolymer, eingesetzt.
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Nach
einer weiteren Ausbildung der Erfindung wird der Zellkulturraum
mit einer dreidimensionale Textilstruktur aus Polyethylenterephthalat
(PET) ausgefüllt.
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Die
Ausbildung der funktionalisierten Schicht wird nach einer weiteren
Ausbildung der Erfindung als immobilisierte Schicht von Proteinen
der extrazellulären
Matrix, beispielsweise Collagen, erfolgen.
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Die
Ausbildung der funktionalisierten Schicht durch Textilien bzw. durch
Textilstrukturen ist insbesondere dadurch vorteilhaft, dass die
Oberflächeneigenschaften
für eine
optimale Ansiedlung und Vermehrung von Zellen durch die gezielte
Wahl der Textilien bzw. der Fasern in Verbindung mit den entsprechenden
Textilstrukturen mit einer unterschiedlichen Maschenweite und Anordnung
entsprechend der verschiedenen Oberflächenbeschichtungen gewählt werden
können.
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Weitere
Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus
der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen mit Bezugnahme
auf die zugehörigen
Zeichnungen. Es zeigen:
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1:
Bioreaktor mit Diffusionsmembran und
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2:
Bioreaktor mit Perfusionsmembran.
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Ein
erfindungsgemäßer Bioreaktor 1 ist
folgendermaßen
aufgebaut:
In 1 ist ein rechteckiger Grundrahmen 9.1 aus Edelstahl
dargestellt, der eine rechteckige, zentrisch angeordnete Aussparung
aufweist. Diese Aussparung ist etwas kleiner als ein Objektträgerglas
für die Lichtmikroskopie
ausgebildet, so dass ein solches nach unten hin in dem Grundrahmen 9.1 Aufnahme findet.
Durch die Aussparung im Grundrahmen 9.1 ist die Bodenplatte 8 der
Temperierkammer 2 von unten sichtbar.
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Nach
oben hin ist die Aussparung etwas größer als ein Objektträgerglas
ausgeführt,
so dass dieses vom Grundrahmen 9.1 aufgenommen werden kann.
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In
den Ecken des Grundrahmens 9.1 sind vier Rundstäbe 10 aus
Edelstahl in diesen eingeschraubt.
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Die
Bodenplatte 8 der Temperierkammer 2 wird von oben
in den Grundrahmen 9.1 eingelegt und besteht aus durchsichtigem
Glas oder Polymer, vorzugsweise Polykarbonat, und weist zwei Bohrungen mit
Anschlüssen
an den diagonal gegenüberliegenden
Ecken zum Ein- und Auslass des Temperiermediums auf.
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Das
Temperiermedium besteht nach einer vorteilhaften Ausführung der
Erfindung aus einem Gemisch von 50 % Ethanol und 50 % Wasser.
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Die
Bestandteile des Bioreaktors 1 sind aus sterilisierbaren
Materialien und vorzugsweise aus autoklavierbaren Materialien, wie
Edelstahl oder hitzebeständigen
Kunststoffen ausgeführt.
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Mit
einem Abstandshalter, welcher als 2 mm Rundring, der über einen
rechteckigen Rahmen gespannt ist, ausgebildet wird, ist die Deckelplatte 5 der Temperierkammer 2 über der
Bodenplatte 8 im Abstand des Abstandshalters von ca. 2
mm angeordnet.
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Nach
einer bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung besteht die Deckelplatte 5 der Temperierkammer 2 aus
einem Objektträgerglas,
welches von dem Grundrahmen 9.1 aufgenommen wird. Diese
bevorzugt als Objektträgerglas
ausgebildete Deckelplatte 5 wird nach einer Ausgestaltung
der Erfindung auf der Oberseite funktionalisiert und mit Protein,
beispielsweise Collagen oder Fibronectin, beschichtet und bildet
den Boden der Zellkulturkammer 3. Die Zellkulturkammer 3 wird
seitlich durch ein Rahmenelement der Zellkulturkammer 9.2 aus
Polyetheretherketon (PEEK) über
einen Rundring aus Ethylen-Propylen-Dien-Kautschuk (EPDM) gedichtet
aufgesetzt.
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Die
seitliche Begrenzung der Zellkulturkammer 3, das Rahmenelement 9.2,
weist dabei weiterhin eine geeigneten Zu- und Abführung für das Zellkulturmedium
auf.
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Bevorzugt
wird nach außen
ein Luer-Konus zum Aufsetzen einer Spritze vorgesehen. In die Zu- und
Abführung
ist ein Eckventil eingebaut, dessen Kolben im geschlossenen Zustand
mit der Innenwand bündig
abschließt.
Auf das Rahmenelement 9.2 der Zellkulturkammer 3 wird
die Diffusionsmembran 7 über Rundringe gedichtet aufgelegt
und begrenzt die Zellkulturkammer 3 nach oben.
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Es
schließt
sich, gedichtet wiederum über
einen Rundring, das Rahmenelement 9.3 der Nährlösungskammer 4 mit
Anschlüssen
für den
Zu- und Abfluss
der Nährlösung an.
Die Nährlösungskammer 4 wird
nach oben durch eine Glasplatte 15 abgeschlossen, welche
bevorzugt als Objektträgerglas
ausgeführt
ist.
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Die
Rundstäbe 10 führen die
Rahmenelemente 9.2 und 9.3. Um die Rahmenelemente 9.2 und 9.3 vertikal
mit dem nötigen
Dichtdruck zu beaufschlagen, befinden sich an den oberen Enden der Rundstäbe 10 Gewinde,
in welche Druckschrauben 11 eingreifen, die über eine
Druckplatte 12 die vertikalen Kräfte gleichmäßig auf die Rundringe in den verschiedenen
Ebenen des modularen Bioreaktors 1 verteilen.
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Die
Druckplatte 12 weist dabei erfindungsgemäß eine Ausnehmung
auf, so dass Licht von oben über
die Glasplatte 15 und die lichtdurchlässige Membran 7 auf
die funktionalisierte Schicht 6 gelangt. Der Bioreaktor 1 wird
auf dem Objekttisch eines Inversmikroskopes montiert, wobei er von
oben beleuchtet wird und von unten in den Zellkulturraum 3 mit
Long-Distance-Objektiven eingesehen wird. Hierdurch ist es möglich, die
Zellkultur während
der Wachstums- und Entwicklungsphase ständig zu beobachten.
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In 2 ist
ein Bioreaktor in der Ausführung mit
einer Perfusionsmembran dargestellt. Im Wesentlichen unterscheidet
sich der Aufbau dieses erfindungsgemäßen Bioreaktors 1 durch
die besondere Ausgestaltung der Nährlösungskammer 4 und
der Zellkulturkammer 3 im Vergleich zur Ausführung nach 1.
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Das
Rahmenelement der Nährlösungskammer 9.3 weist
dabei einen Mittelsteg 16 auf, welcher die Nährlösungskammer 4 in
einem Zuflussbereich 13 und einem Abflussbereich 14 für die Nährlösung trennt.
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Die
Zellkulturkammer 3 weist unter dem Mittelsteg 16 des
Rahmenelementes 9.3 der Nährlösungskammer 4 eine
Dichtleiste 17 auf.
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Die
Nährlösung durchströmt dann
beim Betrieb des Bioreaktors 1 zunächst den Zuflussbereich 13,
gelangt über
die Perfusionsmembran 7 in die Zellkulturkammer 3 und
aus der Zellkulturkammer 3 wiederum über die Perfusionsmembran 7 in
den Abflussbereich 14. Durch die entsprechenden Anschlüsse für den Zu-
und Abfluss im Rahmenelement 9.3 der Nährlösungskammer 4 strömt die Nährlösung dem System
zu und ab.
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Als
Perfusionsmembran 7 dient nach einer vorteilhaften Ausgestaltung
der Erfindung eine kernspurgeätzte
Polyestermembran mit einer Porenweite von ein bis zwei Mikrometern
oder eine hydrophile Polymermembran mit einer Porenweite von 0,8
bis 1,2 Mikrometern, beispielsweise aus Polyethersulfon.
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Von
besonderem Vorteil dieser Konstruktion ist, dass die Zellkulturkammer
mit der funktionalisierten Schicht 6 während der gesamten Zeit des
Wachstums der Zellen beobachtbar ist. Dabei wird als Beobachtungsebene
im Mikroskop die funktionalisierte Schicht 6 über ein
Inversmikroskop von unten beobachtet und durch den Bioreaktor hindurch
beleuchtet. Durch die konzeptionelle Ausgestaltung des Bioreaktors 1 auf
Lichtdurchlässigkeit
von oben und Beobachtbarkeit von unten kann das Wachstum der Zellkultur
jederzeit überwacht
werden.
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Als
funktionalisierte Schichten 6 finden insbesondere immobilisierte
Proteine, wie zum Beispiel Collagen, Anwendung.
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Weiterhin
vorteilhaft ausgebildet wird die Erfindung dadurch, dass als Träger der
funktionalisierte Schicht 6 eine textile dreidimensionale
Struktur in der Zellkulturkammer 3 angeordnet wird.
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Die
Zellkulturkammer 3 ist erfindungsgemäß durch das Rahmenelement 9.2 der
Zellkulturkammer 3 während
des Betriebes und die Membran 7 sowie die Deckelplatte 5 der
Temperierkammer 2 für
Partikel, die größer als
die Porenweite der verwendeten Membranen 7 sind, ein geschlossenes
System, so dass gewachsene Zellen oder anderes biologisches Material
nicht aus dem System gelangen können.
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- 1
- Bioreaktor
- 2
- Temperierkammer
- 3
- Zellkulturkammer
- 4
- Nährlösungskammer
- 5
- Deckelplatte
der Temperierkammer
- 6
- funktionalisierte
Schicht
- 7
- Flachmembran
- 8
- Bodenplatte
- 9.1
- Grundrahmen
- 9.2
- Rahmenelement
Zellkulturkammer
- 9.3
- Rahmenelement
Nährlösungskammer
- 10
- Rundstäbe
- 11
- Druckschrauben
- 12
- Druckplatte
- 13
- Zuflussbereich
- 14
- Abflussbereich
- 15
- Glasplatte
- 16
- Mittelsteg
- 17
- Dichtleiste