DE10230996A1 - Method for inhibiting viral replication, useful particularly for treating hepatitis C infection, by altering the 3'-untranslated region of the virus - Google Patents

Method for inhibiting viral replication, useful particularly for treating hepatitis C infection, by altering the 3'-untranslated region of the virus

Info

Publication number
DE10230996A1
DE10230996A1 DE10230996A DE10230996A DE10230996A1 DE 10230996 A1 DE10230996 A1 DE 10230996A1 DE 10230996 A DE10230996 A DE 10230996A DE 10230996 A DE10230996 A DE 10230996A DE 10230996 A1 DE10230996 A1 DE 10230996A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
strand
dsrna
use according
sequence seq
ras gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE10230996A
Other languages
German (de)
Inventor
Matthias Ocker
Christoph Herold
Anke Geick
Detlef Schuppan
Hans-Peter Vornlocher
Stefan Limmer
Roland Kreutzer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alnylam Europe AG
Original Assignee
Ribopharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10160151A external-priority patent/DE10160151A1/en
Priority claimed from PCT/EP2002/000151 external-priority patent/WO2002055692A2/en
Priority to DE10230996A priority Critical patent/DE10230996A1/en
Priority to DE10230997A priority patent/DE10230997A1/en
Application filed by Ribopharma AG filed Critical Ribopharma AG
Priority to PCT/EP2002/011970 priority patent/WO2003035870A1/en
Priority to JP2003538370A priority patent/JP2005506385A/en
Priority to PCT/EP2002/011971 priority patent/WO2003035082A1/en
Priority to CNA028261798A priority patent/CN1608131A/en
Priority to EP02785312A priority patent/EP1438406A1/en
Priority claimed from PCT/EP2002/011968 external-priority patent/WO2003035868A1/en
Priority to US10/384,434 priority patent/US20040121348A1/en
Publication of DE10230996A1 publication Critical patent/DE10230996A1/en
Priority to US10/382,634 priority patent/US20040038921A1/en
Priority to US10/666,458 priority patent/US20040126791A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Inhibiting replication of viruses (A) that have a 3'-untranslated region (UTR) comprises altering a structure within the 3'-UTR by using a short, double-stranded RNA (B) or an antisense oligonucleotide (AON) where one strand (S1) of (B) or AON is partially or completely complementary to the 3'-UTR. An Independent claim is also included for dsRNA that includes a strand (S1) partially or completely complementary to the 3'-UTR of a viral genome.

Description

Die Erfindung betrifft ein Medikament und eine Verwendung zur Behandlung eines Pankreaskarzinoms sowie eine Verwendung zur Herstellung eines solchen Medikaments. The invention relates to a medicament and a use for Treatment of pancreatic cancer and a use for Manufacture of such a drug.

Das Pankreaskarzinom bzw. Adenokarzinom des Pankreas gehört zu den Karzinomen mit den schlechtesten Prognosen. Über die Ursachen der Entstehung des Pankreaskarzinoms ist wenig bekannt. Eine ausreichend erfolgreiche Therapie existiert bisher nicht. Neben anderen genetischen Veränderungen weisen die Zellen des Pankreaskarzinoms häufig eine Mutation im K-ras- Gen auf. Mutationen wurden dabei vor allem in den Codons 12, 13 und 61 nachgewiesen. Das K-ras-Gen ist ein Proto-Onkogen, welches für das GTP-bindende Protein K-ras kodiert. K-ras ist üblicherweise auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran von Zellen lokalisiert und mit Rezeptor-Tyrosin-Kinasen assoziiert. Bindung von GTP aktiviert K-ras. Die Inaktivierung erfolgt durch hydrolytische Abspaltung eines Phosphatrests vom gebundenen GTP. Durch Freisetzen des dabei gebildeten GDPs und erneutem Binden von GTP kann K-ras wieder aktiviert werden. Die genannten Mutationen können zu einem Austausch einer Aminosäure in K-ras und dadurch zu dessen permanenter Aktivierung führen. Die Aktivierung von K-ras aktiviert unter anderem Protein-Kinase C. The pancreatic carcinoma or adenocarcinoma of the pancreas belongs carcinomas with the worst prognosis. About the The causes of the development of pancreatic cancer are few known. Sufficiently successful therapy exists not yet. In addition to other genetic changes, the Pancreatic carcinoma cells often have a mutation in the K-ras Gene on. Mutations were mainly in codons 12, 13 and 61 demonstrated. The K-ras gene is a proto-oncogene, which codes for the GTP-binding protein K-ras. K-ras is usually on the cytoplasmic side of the Plasma membrane localized by cells and with receptor tyrosine kinases associated. Binding of GTP activates K-ras. The Inactivation occurs by hydrolytic cleavage Phosphate residues from the bound GTP. By releasing the formed GDPs and again binding GTP can K-ras again to be activated. The mutations mentioned can lead to a Exchange of an amino acid in K-ras and thereby to it permanent activation. Activation of K-ras among other things activates protein kinase C.

Aus der DE 101 00 586 C1 ist ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle bekannt, bei dem ein Oligoribonukleotid mit doppelsträngiger Struktur in die Zelle eingeführt wird. Ein Strang der doppelsträngigen Struktur ist dabei komplementär zum Zielgen. DE 101 00 586 C1 describes a method for inhibiting the Expression of a target gene known in a cell in which a Oligoribonucleotide with double-stranded structure in the cell is introduced. One strand of the double-stranded structure is complementary to the target gene.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein wirksames Medikament und eine Verwendung zur Behandlung eines Pankreaskarzinoms bereitgestellt werden. Weiterhin soll eine Verwendung zur Herstellung eines solchen Medikaments bereitgestellt werden. The object of the present invention is to overcome the disadvantages to eliminate the state of the art. It is supposed to be a effective drug and a use to treat a Pancreatic cancer will be provided. Furthermore, a Use for the manufacture of such a drug to be provided.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 18 und 19 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 17 und 20 bis 36. This object is achieved by the features of claims 1, 18 and 19 solved. Advantageous configurations result from the Features of claims 2 to 17 and 20 to 36.

Erfindungsgemäß ist ein Medikament zur Behandlung eines, insbesondere humanen, Pankreaskarzinoms vorgesehen, wobei das Medikament eine zu einer Hemmung der Expression eines K-ras- Gens geeignete doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält. Die Expression kann durch die dsRNA nach dem Prinzip der RNA-Interferenz gehemmt werden. Eine dsRNA liegt vor, wenn die aus einem oder zwei Ribonukleinsäure-Strängen bestehende Ribonukleinsäure eine doppelsträngige Struktur aufweist. Nicht alle Nukleotide der dsRNA müssen kanonische Watson-Crick-Basenpaarungen aufweisen. Insbesondere einzelne nicht komplementäre Basenpaare beeinträchtigen die Wirksamkeit kaum oder gar nicht. Die maximal mögliche Zahl der Basenpaare ist die Zahl der Nukleotide in dem kürzesten in der dsRNA enthaltenen Strang. According to the invention, a medicament for the treatment of a in particular human pancreatic carcinoma provided, the Drug one to inhibit the expression of a K-ras Double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) suitable for the gene contains. Expression can be by the dsRNA according to the principle RNA interference can be inhibited. A dsRNA is available if that from one or two ribonucleic acid strands existing ribonucleic acid has a double-stranded structure having. Not all nucleotides of the dsRNA have to be canonical Watson-Crick base pairings. Especially individual non-complementary base pairs affect the Little or no effectiveness. The maximum possible number of Base pairs is the number of nucleotides in the shortest in the strand containing dsRNA.

Das Medikament kann die dsRNA in einer zu der Hemmung der Expression des K-ras-Gens in dem Pankreaskarzinom ausreichenden Menge enthalten. Das Medikament kann auch so konzipiert sein, dass mehrere Einheiten des Medikaments zusammen die ausreichende Menge in der Summe enthalten. Die ausreichende Menge hängt von der Verabreichungsform ab. Zur Ermittlung einer ausreichenden Menge kann die dsRNA in steigenden Mengen bzw. Dosierungen verabreicht werden. Danach kann an einer aus dem Pankreaskarzinom entnommenen Gewebeprobe mit bekannten Methoden ermittelt werden, ob bei dieser Menge eine Hemmung der Expression des K-ras-Gens eingetreten ist. Bei den Methoden kann es sich z. B. um molekularbiologische, biochemische oder immunologische Methoden handeln. The drug can inhibit the dsRNA in one Expression of the K-ras gene sufficient in the pancreatic carcinoma Amount included. The drug can also be designed that multiple units of the drug together make up the sufficient amount included in the total. The sufficient amount depends on the form of administration. To determine a sufficient amounts, the dsRNA can be used in increasing amounts or Dosages are administered. After that, one of the Tissue sample taken from pancreatic carcinoma with known Methods are used to determine whether an inhibition of the Expression of the K-ras gene has occurred. With the methods can it be z. B. molecular biological, biochemical or act immunological methods.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass durch die Behandlung mittels dsRNA, welche gezielt die Expression des K-ras- Gens hemmen kann, die Proliferation von Pankreaskarzinomzellen gehemmt und sogar die Zahl vitaler Tumorzellen reduziert werden kann. Erstaunlicherweise bleibt das Proliferationsverhalten nicht maligner Zellen weit gehend unbeeinflusst von einer solchen Behandlung. Das Medikament kann eine Steigerung der Apoptose-Rate in den Zellen des Pankreaskarzinoms bewirken. In vivo ist es durch ein solches Medikament möglich, das Wachstum eines Pankreastumors effektiv zu hemmen. Surprisingly, it has been shown that through the Treatment using dsRNA, which specifically targets the expression of the K-ras Gene can inhibit the proliferation of Pancreatic carcinoma cells inhibited and even reduced the number of vital tumor cells can be. Amazingly, that remains Proliferation behavior of non-malignant cells largely unaffected by of such treatment. The drug can increase the apoptosis rate in the cells of the pancreatic carcinoma cause. In vivo it is possible through such a drug that Effectively inhibit the growth of a pancreatic tumor.

Das K-ras-Gen kann derart mutiert sein, dass dadurch eine permanente Aktivierung von K-ras bewirkt wird. Die Hemmung der Expression eines solchen Gens durch das erfindungsgemäße Medikament bewirkt eine besonders effektive Hemmung des Wachstums des Pankreaskarzinoms. Das K-ras-Gen kann dabei in den Codons 12, 13 oder 61 mutiert sein. Im mutierten K-ras- Gen kann das Codon 12 für Arginin, Serin, Alanin, Valin, Cystein oder Asparaginsäure, das Codon 13 für Asparaginsäure oder das Codon 61 für Histidin oder Leucin kodieren. Im Wildtyp des K-ras-Gens kodiert das Codon 12 und das Codon 13 jeweils für Glycin und das Codon 61 für Glutaminsäure. The K-ras gene can be mutated in such a way that one permanent activation of K-ras is effected. The inhibition the expression of such a gene by the invention Drug causes a particularly effective inhibition of Pancreatic carcinoma growth. The K-ras gene can be in codons 12, 13 or 61 mutated. In the mutated K-ras Gene can be codon 12 for arginine, serine, alanine, valine, Cysteine or aspartic acid, the codon 13 for aspartic acid or encode codon 61 for histidine or leucine. in the Wild type of the K-ras gene encodes codon 12 and codon 13 each for glycine and codon 61 for glutamic acid.

Vorzugsweise weist ein Strang S1 der dsRNA einen zum K-ras- Gen zumindest abschnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinander folgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich auf. Unter dem "K-ras-Gen" wird der DNA- Strang der doppelsträngigen für K-ras kodierenden DNA in der Tumorzelle verstanden, welcher komplementär zu einem bei der Transkription als Matrize dienenden DNA-Strang einschließlich aller transkribierten Bereiche ist. Bei dem K-ras-Gen handelt es sich also im Allgemeinen um den Sinn-Strang. Der Strang S1 kann somit komplementär zu einem bei der Expression des K-ras-Gens gebildeten RNA-Transkript oder dessen Prozessierungsprodukt, wie z. B. einer mRNA, sein. A strand S1 of the dsRNA preferably has one for K-ras Gen at least partially complementary, in particular from less than 25 consecutive nucleotides existing, area on. Under the "K-ras gene" the DNA Strand of the double-stranded DNA coding for K-ras in the Understand tumor cell, which is complementary to one in the DNA strand serving as a template including of all transcribed areas. Acting on the K-ras gene so it's generally the sense strand. The strand S1 can thus be complementary to one in the expression of the K-ras gene formed RNA transcript or its Processing product, such as B. an mRNA.

Der komplementäre Bereich der dsRNA kann 19 bis 24, vorzugsweise 21 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweisen. Eine dsRNA mit dieser Struktur ist besonders effizient in der Inhibition des K-ras-Gens. Der Strang S1 der dsRNA kann weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweisen. Die Zahl dieser Nukleotide ist zugleich die Zahl der in der dsRNA maximal möglichen Basenpaare. The complementary region of the dsRNA can be 19 to 24, preferably have 21 to 23, in particular 22, nucleotides. A dsRNA with this structure is particularly efficient in the Inhibition of the K-ras gene. Strand S1 of the dsRNA can do less than 30, preferably less than 25, particularly preferably 21 to 24, nucleotides. The number of these nucleotides is also the maximum number possible in the dsRNA Base pairs.

Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist. Eine solche dsRNA weist gegenüber einer dsRNA ohne einzelsträngige Überhänge an mindestens einem Ende eine bessere Wirksamkeit bei der Hemmung der Expression des K-ras- Gens auf. Ein Ende ist dabei ein Bereich der dsRNA, in welchem ein 5'- und ein 3'-Strangende vorliegen. Eine nur aus dem Strang S1 bestehende dsRNA weist demnach eine Schleifenstruktur und nur ein Ende auf. Eine aus dem Strang S1 und einem Strang S2 gebildete dsRNA weist zwei Enden auf. Ein Ende wird dabei jeweils von einem auf dem Strang S1 und einem auf dem Strang S2 liegenden Strangende gebildet. It has proven to be particularly advantageous if at least one end of the dsRNA is one of 1 to 4, in particular 2 or 3, nucleotide-formed single-stranded overhang having. Such a dsRNA has no dsRNA single-stranded overhangs on at least one end better effectiveness in inhibiting the expression of the K-ras Gens on. One end is a region of the dsRNA, in which have a 5 'and a 3' strand end. One only dsRNA existing in strand S1 accordingly has one Loop structure and only one end on. One from strand S1 and dsRNA formed in a strand S2 has two ends. An end is based on one on strand S1 and one on the end of the strand S2 is formed.

Vorzugsweise befindet sich der einzelsträngige Überhang am 3'-Ende des Strangs S1. Diese Lokalisation des einzelsträngigen Überhangs führt zu einer weiteren Steigerung der Effizienz des Medikaments. In einem Ausführungsbeispiel weist die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3'-Ende des Strangs S1 gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang auf. Das andere Ende ist bei einer zwei Enden aufweisenden dsRNA glatt, d. h. ohne Überhänge, ausgebildet. Eine solche dsRNA hat sich sowohl in verschiedenen Zellkulturmedien als auch in Blut und Serum als besonders beständig erwiesen. The single-stranded overhang is preferably on 3 'end of strand S1. This localization of the single-stranded overhang leads to a further increase in Efficiency of the drug. In one embodiment, the dsRNA only at one, especially at the 3 'end of the strand S1, end a single-stranded overhang. The the other end is for a double ended dsRNA smooth, d. H. without overhangs, trained. Such a dsRNA has been found in various cell culture media as well as in Blood and serum proven to be particularly stable.

Vorzugsweise weist die dsRNA neben dem Strang S1 einen Strang S2 auf, d. h. sie ist aus zwei Einzelsträngen gebildet. Der Strang S1 oder der Strang S2 kann zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des K-ras-Gens komplementär sein. Vorzugsweise besteht die dsRNA aus dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 5 und dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll. Eine solche dsRNA ist in der Hemmung der Expression des K-ras-Gens besonders wirksam. The dsRNA preferably has a strand in addition to strand S1 S2 on, i.e. H. it is made up of two single strands. The Strand S1 or strand S2 can be the primary or processed RNA transcript of the K-ras gene can be complementary. The dsRNA preferably consists of strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 1 and strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 2 or strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 3 and the Strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 4 or strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 5 and the strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 6 according to the attached sequence listing. A such dsRNA is in the inhibition of the expression of the K-ras gene particularly effective.

Die dsRNA kann in dem Medikament in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer, oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, oder einem Kapsid umschlossen vorliegen. Eine micellare Struktur oder ein Kapsid kann die Aufnahme der dsRNA in die Tumorzellen erleichtern. Das Medikament kann eine Zubereitung aufweisen, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumoralen Infusion oder Injektion, geeignet ist. Eine zur Inhalation, Infusion oder Injektion geeignete Zubereitung kann im einfachsten Fall aus einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA bestehen. Es hat sich nämlich überraschenderweise herausgestellt, dass eine lediglich in einem solchen Puffer gelöste und verabreichte dsRNA von den Tumorzellen aufgenommen wird und die Expression des K-ras-Gens hemmt, ohne dass die dsRNA dazu in einem besonderen Vehikel verpackt sein muss. The dsRNA can be in the drug in a solution in particular a physiologically compatible buffer, or from one micellar structure, preferably a liposome, or a Capsid enclosed. A micellar structure or A capsid can take up the dsRNA in the tumor cells facilitate. The drug can have a preparation for inhalation, oral intake, infusion or injection, especially for intravenous, intraperitoneal or intratumoral infusion or injection. One for Inhalation, infusion or injection suitable preparation can in the simplest case from a physiologically acceptable one Buffers, especially a phosphate buffered saline solution, and the dsRNA exist. Because it has Surprisingly, it was found that only in one Buffer dissolved and administered dsRNA from the tumor cells is recorded and inhibits the expression of the K-ras gene, without the dsRNA being packaged in a special vehicle have to be.

Vorzugsweise ist die dsRNA pro vorgesehener Verabreichungseinheit in einer Menge enthalten, welche einer Dosierung von höchstens 5 mg pro kg Körpergewicht, insbesondere 200 µg pro kg Körpergewicht, entspricht. Es hat es sich nämlich gezeigt, dass die dsRNA bereits in dieser pro Tag verabreichten Dosierung eine ausgezeichnete Effektivität in der Hemmung der Expression des K-ras-Gens aufweist. The dsRNA pro is preferably provided Administration unit contained in an amount, which a dosage of at most 5 mg per kg body weight, in particular 200 µg per kg body weight. It has been shown that the dsRNA was already administered per day in this Dosage an excellent effectiveness in inhibiting the Has expression of the K-ras gene.

Erfindungsgemäß ist weiterhin die Verwendung einer zur Hemmung der Expression eines K-ras-Gens geeigneten doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Pankreaskarzinoms vorgesehen. Weiterhin ist erfindungsgemäß die Verwendung einer zur Hemmung der Expression eines K-ras-Gens geeigneten doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Behandlung eines Pankreaskarzinoms vorgesehen. According to the invention is also the use of a Inhibition of the expression of a K-ras gene suitable double stranded ribonucleic acid (dsRNA) for the production of a Drug intended to treat pancreatic cancer. Furthermore, the use of an inhibition according to the invention expression of a K-ras gene suitable double-stranded Ribonucleic acid (dsRNA) for the treatment of a Pancreatic cancer is provided.

Wegen der weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verwendungen wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen. Because of the further advantageous embodiment of the Uses according to the invention is based on the previous ones Executions referenced.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen beispielhaft erläutert. Als Abkürzung der Konzentrationsangabe "mol/l" wird dabei "M" verwendet. Es zeigen: The invention is described below with reference to the drawings exemplified. As an abbreviation for the concentration "mol / l" is used here "M". Show it:

Fig. 1 die prozentuale Apoptose-Rate von humanen Pankreaskarzinomzellen YAP C in Abhängigkeit von der Inkubationszeit nach Transfektion mit einer zu einer ersten Sequenz aus dem humanen K-ras-Gen komplementären dsRNA, Fig. 1 shows the percentage of apoptosis rate of human pancreatic cancer cells YAP C as a function of incubation after transfection with a first to a sequence from the human K-ras gene dsRNA,

Fig. 2 die Anzahl vitaler Zellen nach Transfektion mit einer dsRNA und Fig. 2 shows the number of viable cells after transfection with a dsRNA and

Fig. 3 das Volumen subkutan implantierter humaner Pankreasadenokarzinome in NMRI-Mäusen. Fig. 3, the volume subcutaneously implanted human Pankreasadenokarzinome in NMRI mice.

Die eingesetzten doppelsträngigen Oligoribonukleotide weisen folgende, im Sequenzprotokoll mit SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 8 bezeichneten, Sequenzen auf:
KRAS1, welche zu einer eine erste Punktmutation im Codon 12 aufweisenden Sequenz aus dem humanen K-ras-Gen in YAP C- Zellen komplementär ist:


KRAS1', welche zu einer eine erste Punktmutation im Codon 12 aufweisenden Sequenz aus dem humanen K-ras-Gen in einem humanen subkutan in NMRI-Mäusen implantierten Pankreasadenokarzinom komplementär ist:


KRAS2, welche zu einer Wildtyp-Sequenz aus dem humanen K-ras- Gen komplementär ist:


NEO, welche zu einer Sequenz aus dem Neomycin-Resistenz-Gen komplementär ist:


The double-stranded oligoribonucleotides used have the following sequences, designated SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 in the sequence listing:
KRAS1, which is complementary to a sequence having a first point mutation in codon 12 from the human K-ras gene in YAP C cells:


KRAS1 ', which is complementary to a sequence having a first point mutation in codon 12 from the human K-ras gene in a human pancreatic adenocarcinoma implanted subcutaneously in NMRI mice:


KRAS2, which is complementary to a wild-type sequence from the human K-ras gene:


NEO, which is complementary to a sequence from the neomycin resistance gene:


Zellen der humanen Pankreaskarzinomzellinie YAP C, welche unter der Nr. ACC 382 von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig bezogen werden können, wurden unter konstanten Bedingungen bei 37°C, 5% CO2 in RPMI 1640-Medium (Fa. Biochrom, Berlin) mit 10% fötalem Kälberserum (FKS) und 1% Penicillin/Streptomycin kultiviert. Cells of the human pancreatic carcinoma cell line YAP C, which can be obtained under the number ACC 382 from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, were under constant conditions at 37 ° C, 5% CO 2 in RPMI 1640 medium (Biochrom , Berlin) with 10% fetal calf serum (FKS) and 1% penicillin / streptomycin.

Die Transfektionen wurden in einer 6-Well-Platte mit Oligofectamine (Fa. Invitrogen, Karlsruhe) durchgeführt. Pro Well wurden 150 000 Zellen ausgesetzt. Die Transfektion der doppelsträngigen Oligoribonukleotide wurde nach dem von Invitrogen für Oligofectamine empfohlenen Protokoll durchgeführt (Angaben beziehen sich auf eine Vertiefung bzw. ein Well einer 6-Well-Platte):
10 µl des doppelsträngigen Oligoribonukleotids (0,1-10 µM) wurden mit 175 µl Zellkulturmedium ohne Zusätze verdünnt. 3 µl Oligofectamine wurden mit 12 µl Zellkulturmedium ohne Zusätze verdünnt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das so verdünnte Oligofectamine wurde zu den bereits verdünnten doppelsträngigen Oligoribonukleotiden gegeben, gemischt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit wurden die zu transfizierenden Zellen einmal mit Zellkulturmedium ohne Zusätze gewaschen und 800 µl frisches Zellkulturmedium zugegeben. Danach wurden pro Well 200 µl des beschriebenen Oligofectamine-dsRNA-Gemisches zugegeben, so dass das Endvolumen für die Transfektion 1000 µl betrug. Hierdurch ergibt sich eine Endkonzentration der doppelsträngigen Oligoribonukleotide von 1-100 nM. Der Transfektionsansatz wurde vier Stunden bei 37°C bebrütet. Danach wurden pro Well 500 µl Zellkulturmedium mit 30% FKS zugegeben, so dass die Endkonzentration an FKS 10% betrug. Dieser Ansatz wurde für 24 bis 120 Stunden bei 37°C inkubiert. The transfections were carried out in a 6-well plate with oligofectamines (Invitrogen, Karlsruhe). 150,000 cells were exposed per well. The transfection of the double-stranded oligoribonucleotides was carried out according to the protocol recommended by Invitrogen for oligofectamines (information relates to one well or one well of a 6-well plate):
10 µl of the double-stranded oligoribonucleotide (0.1-10 µM) were diluted with 175 µl cell culture medium without additives. 3 ul oligofectamines were diluted with 12 ul cell culture medium without additives and incubated for 10 minutes at room temperature. The oligofectamine thus diluted was added to the already diluted double-stranded oligoribonucleotides, mixed and incubated for 20 minutes at room temperature. During this time, the cells to be transfected were washed once with cell culture medium without additives and 800 μl of fresh cell culture medium were added. Then 200 μl of the described oligofectamine-dsRNA mixture were added per well, so that the final volume for the transfection was 1000 μl. This results in a final concentration of the double-stranded oligoribonucleotides of 1-100 nM. The transfection batch was incubated at 37 ° C for four hours. Then 500 μl of cell culture medium with 30% FCS were added per well, so that the final concentration of FCS was 10%. This approach was incubated at 37 ° C for 24 to 120 hours.

Zur Bestimmung der Apoptose-Rate wurden die Überstände nach der Inkubation gesammelt, die Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, mittels Trypsin abgelöst und 10 Minuten mit 100 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit hypotoner Propidiumjodidlösung 30 Minuten bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Die Analyse erfolgte durchflusszytometrisch im Fluoreszenz-unterstützten Zellsortierer FACSCalibur (Fa. BD GmbH, Heidelberg). The supernatants were determined to determine the apoptosis rate After incubation, the cells were buffered with phosphate Saline solution (PBS), removed using trypsin and 10 Centrifuged at 100 g for minutes. The supernatant was discarded and the pellet with hypotonic propidium iodide solution 30 Incubated for minutes at 4 ° C in the dark. The analysis was done flow cytometric in fluorescence-assisted Cell sorter FACSCalibur (BD GmbH, Heidelberg).

Fig. 1 zeigt die prozentuale Apoptose-Rate humaner Pankreaskarzinomzellen YAP C in Abhängigkeit von der Inkubationszeit nach Transfektion mit steigenden Konzentrationen der dsRNA KRAS1. Daraus ist ersichtlich, dass KRAS1 konzentrationsabhängig Apoptosen in humanen Pankreaskarzinomzellen induziert. Die Apoptose-Rate steigt in Abhängigkeit von der Inkubationszeit an. Während unbehandelte YAP C-Zellen (Kontrolle) und Zellen, mit welchen das beschriebene Verfahren zur Transfektion ohne doppelsträngiges Oligoribonukleotid durchgeführt wurde (Mocktransfektion bzw. Scheintransfektion), auch nach 120 h Inkubation nur maximal 5% Apoptose aufwiesen, konnte durch Transfektion mit 100 nM KRAS1 die Apoptose-Rate nach 120 h auf 24% gesteigert werden. Mit gleicher Effektivität induzierte die zum Wildtyp von K-ras komplementäre dsRNA KRAS2 Apoptose in YAP C-Zellen. Fig. 1 shows the percentage of apoptosis rate of human pancreatic cancer cells YAP C as a function of incubation after transfection with increasing concentrations of the dsRNA KRAS1. It can be seen from this that KRAS1 induces apoptosis in human pancreatic carcinoma cells depending on the concentration. The apoptosis rate increases depending on the incubation period. While untreated YAP C cells (control) and cells with which the described method for transfection was carried out without a double-stranded oligoribonucleotide (mock transfection or sham transfection) showed only a maximum of 5% apoptosis even after 120 h of incubation, transfection with 100 nM KRAS1 the apoptosis rate can be increased to 24% after 120 h. The dsRNA KRAS2, which is complementary to the wild type of K-ras, induced apoptosis in YAP C cells with the same effectiveness.

Zur Bestimmung des Einflusses der Transfektionen auf die Proliferation bzw. die Zahl vitaler Zellen, wurden pro Vertiefung einer 6-Well-Platte 50 000 YAP-C-Zellen ausgesetzt und wie oben beschrieben transfiziert. Die Anzahl vitaler Zellen wurde mit der Trypanblau-Ausschluss-Färbung nach 24 bis 120 h Inkubationszeit durch Auszählen in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt. Die Proliferation von YAP C-Zellen konnte durch KRAS1 konzentrationsabhängig gehemmt werden. Die Zahl vitaler Zellen konnte bereits durch 1 nM KRAS1 statistisch signifikant (p = 0.001 vs. unbehandelte Kontrolle nach 120 h) reduziert werden. To determine the influence of the transfections on the proliferation or the number of vital cells, 50,000 YAP-C cells were exposed per well in a 6-well plate and transfected as described above. The number of vital cells was determined using the trypan blue exclusion stain after 24 to 120 h of incubation by counting in a Neubauer counting chamber. The result is shown in Fig. 2. The proliferation of YAP C cells could be inhibited by KRAS1 depending on the concentration. The number of vital cells could already be reduced statistically significantly by 1 nM KRAS1 (p = 0.001 vs. untreated control after 120 h).

Eine Transfektion mit der zum K-ras-Wildtyp komplementären dsRNA KRAS2 führte bei einer Konzentration von 100 nM zu einer Reduktion der Zahl vitaler Zellen. Nicht-maligne humane Hautfibroblasten zeigten keine Änderung ihres Proliferationsverhaltens durch Transfektion mit KRAS1 oder KRAS2. A transfection with that complementary to the K-ras wild type dsRNA KRAS2 resulted in a concentration of 100 nM a reduction in the number of vital cells. Non-malignant human Skin fibroblasts showed no change in theirs Proliferation behavior through transfection with KRAS1 or KRAS2.

Für in vivo-Untersuchungen sind NMRI-Mäusen (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen) Gewebefragmente von 2-3 mm Durchmesser aus einem humanen Pankreasadenokarzinom subkutan implantiert worden. Nachdem die Tumoren eine Größe von 6-7 mm erreicht hatten, wurden täglich 200 µg KRAS1' oder NEO pro kg Körpergewicht intraperitoneal injiziert. Als Kontrolle wurde eine physiologische Kochsalzlösung injiziert. Die Tumore wurden täglich mittels einer Schiebelehre bzw. einer standardisierten Schablone vermessen. In Fig. 3 ist das in mm3 gemessene Tumorvolumen als Mittelwert +/- Standardfehler des Mittelwerts in Abhängigkeit von der Zeit ab Beginn der Behandlung durch die intraperitonealen Injektionen (Tage i. p.) dargestellt. Daraus ist ersichtlich, dass die zum K-ras-Gen komplementäre dsRNA in der Lage ist, das Wachstum der Tumore zu hemmen. Durch tägliche intraperitoneale Applikation der zum K-ras-Gen komplementären dsRNA in einer Konzentration von 200 µg/kg wurde das Wachstum des Tumors derart gehemmt, dass das Tumorvolumen nach 24 Tagen Behandlung nur 62% des Tumorvolumens der Kontrollgruppe betragen hat. SEQUENZPROTOKOLL



For in vivo studies, NMRI mice (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen) tissue fragments of 2-3 mm in diameter from a human pancreatic adenocarcinoma were implanted subcutaneously. After the tumors had reached a size of 6-7 mm, 200 µg KRAS1 'or NEO per kg body weight were injected intraperitoneally. A physiological saline solution was injected as a control. The tumors were measured daily using a caliper or a standardized template. In Fig. 3 the measured in mm 3 Tumor volume is reported as mean +/- standard error of the mean in function of the time from the start of the treatment by the intraperitoneal injections (days ip). This shows that the dsRNA, which is complementary to the K-ras gene, is able to inhibit the growth of the tumors. Daily intraperitoneal application of the dsRNA complementary to the K-ras gene in a concentration of 200 µg / kg inhibited the growth of the tumor in such a way that the tumor volume after 24 days of treatment was only 62% of the tumor volume of the control group. SEQUENCE LISTING



Claims (36)

1. Medikament zur Behandlung eines Pankreaskarzinoms, wobei das Medikament eine zu einer Hemmung der Expression eines K-ras-Gens geeignete doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält. 1. Medicament for the treatment of pancreatic cancer, wherein the drug is used to inhibit the expression of a K-ras gene suitable double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) contains. 2. Medikament nach Anspruch 1, wobei das K-ras-Gen derart mutiert ist, dass dadurch eine permanente Aktivierung von K-ras bewirkt wird. 2. Medicament according to claim 1, wherein the K-ras gene is such is mutated that this results in permanent activation of K-ras is effected. 3. Medikament nach Anspruch 1 oder 2, wobei das K-ras-Gen in den Codons 12, 13 oder 61 mutiert ist. 3. Medicament according to claim 1 or 2, wherein the K-ras gene in codons 12, 13 or 61 is mutated. 4. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im mutierten K-ras-Gen das Codon 12 für Arginin, Serin, Alanin, Valin, Cystein oder Asparaginsäure, das Codon 13 für Asparaginsäure oder das Codon 61 für Histidin oder Leucin kodiert. 4. Medicament according to one of the preceding claims, wherein in the mutated K-ras gene, codon 12 for arginine, serine, Alanine, valine, cysteine or aspartic acid, the codon 13 for aspartic acid or codon 61 for histidine or Encoded leucine. 5. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Strang S1 der dsRNA einen zum K-ras-Gen zumindest abschnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinander folgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich aufweist. 5. Medicament according to one of the preceding claims, wherein at least one strand S1 of the dsRNA belongs to the K-ras gene complementary in sections, in particular from fewer as 25 consecutive nucleotides, Area. 6. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der komplementäre Bereich 19 bis 24, bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweist. 6. Medicament according to one of the preceding claims, wherein the complementary range 19 to 24, preferably 21 to 23, in particular has 22 nucleotides. 7. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strang S1 weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweist. 7. Medicament according to one of the preceding claims, wherein strand S1 less than 30, preferably less than 25, particularly preferably 21 to 24, nucleotides having. 8. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist. 8. Medicament according to one of the preceding claims, wherein at least one end of the dsRNA one from 1 to 4, in particular 2 or 3 single-stranded nucleotides Has overhang. 9. Medikament nach Anspruch 8, wobei sich der einzelsträngige Überhang am 3'-Ende des Strangs S1 befindet. 9. Medicament according to claim 8, wherein the single-stranded overhang located at the 3 'end of strand S1. 10. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3'-Ende des Strangs S1 gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist. 10. Medicament according to one of the preceding claims, wherein the dsRNA only at one, in particular at the 3 'end of the Strand S1 located, end of a single-stranded Has overhang. 11. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA neben dem Strang S1 einen Strang S2 aufweist. 11. Medicament according to one of the preceding claims, wherein the dsRNA has a strand S2 in addition to the strand S1. 12. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strang S1 oder der Strang S2 zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des K-ras-Gens komplementär ist. 12. Medicament according to one of the preceding claims, wherein strand S1 or strand S2 to the primary or processed RNA transcript of the K-ras gene complementary is. 13. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA aus dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 5 und dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht. 13. Medicament according to one of the preceding claims, wherein the dsRNA from strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 1 and strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 2 or the Strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 3 and strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 4 or the strand S2 with the Sequence SEQ ID NO: 5 and strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 6 according to the attached sequence listing consists. 14. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA in dem Medikament in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer, oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, oder einem Kapsid umschlossen vorliegt. 14. Medicament according to one of the preceding claims, wherein the dsRNA in the drug in a solution, in particular a physiologically acceptable buffer, or from one micellar structure, preferably a liposome, or enclosed in a capsid. 15. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament eine Zubereitung aufweist, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumoralen Infusion oder Injektion, geeignet ist. 15. Medicament according to one of the preceding claims, wherein the drug has a preparation that is used for Inhalation, oral intake, infusion or injection, especially for intravenous, intraperitoneal or intratumoral infusion or injection. 16. Medikament nach Anspruch 15, wobei die Zubereitung aus einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA besteht. 16. Medicament according to claim 15, wherein the preparation of a physiologically acceptable buffer, in particular a phosphate buffered saline, and the dsRNA consists. 17. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA pro vorgesehener Verabreichungseinheit in einer Menge enthalten ist, welche einer Dosierung von höchstens 5 mg pro kg Körpergewicht, insbesondere 200 µg pro kg Körpergewicht, entspricht. 17. Medicament according to one of the preceding claims, wherein the dsRNA per intended administration unit in one Amount is included, which is a dosage of at most 5 mg per kg body weight, in particular 200 µg per kg Body weight. 18. Verwendung einer zur Hemmung der Expression eines K-ras- Gens geeigneten doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Pankreaskarzinoms. 18. Use of a to inhibit the expression of a K-ras Double stranded ribonucleic acid (dsRNA) for the manufacture of a medicament for the treatment of a Pancreatic cancer. 19. Verwendung einer zur Hemmung der Expression eines K-ras- Gens geeigneten doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Behandlung eines Pankreaskarzinoms. 19. Use of a to inhibit the expression of a K-ras Double stranded ribonucleic acid (dsRNA) to treat pancreatic cancer. 20. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, wobei das K-ras-Gen derart mutiert ist, dass dadurch eine permanente Aktivierung von K-ras bewirkt wird. 20. Use according to claim 18 or 19, wherein the K-ras gene is mutated in such a way that it creates a permanent Activation of K-ras is effected. 21. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das K-ras-Gen in den Codons 12, 13 oder 61 mutiert ist. 21. Use according to one of claims 18 to 20, wherein the K-ras gene is mutated in codons 12, 13 or 61. 22. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei im mutierten K-ras-Gen das Codon 12 für Arginin, Serin, Alanin, Valin, Cystein oder Asparaginsäure, das Codon 13 für Asparaginsäure oder das Codon 61 für Histidin oder Leucin kodiert. 22. Use according to one of claims 18 to 21, wherein in mutated K-ras gene codon 12 for arginine, serine, Alanine, valine, cysteine or aspartic acid, the codon 13 for Aspartic acid or codon 61 for histidine or leucine coded. 23. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei ein Strang S1 der dsRNA einen zum K-ras-Gen zumindest abschnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinander folgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich aufweist. 23. Use according to one of claims 18 to 22, wherein a Strand S1 of the dsRNA one at least to the K-ras gene complementary in sections, in particular from fewer as 25 consecutive nucleotides, Area. 24. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei der komplementäre Bereich 19 bis 24, bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweist. 24. Use according to any one of claims 18 to 23, wherein the complementary range 19 to 24, preferably 21 to 23, in particular has 22 nucleotides. 25. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei der Strang S1 weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweist. 25. Use according to any one of claims 18 to 24, wherein the Strand S1 less than 30, preferably less than 25, particularly preferably has 21 to 24 nucleotides. 26. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist. 26. Use according to any one of claims 18 to 25, wherein at least one end of the dsRNA one from 1 to 4, in particular 2 or 3 single-stranded nucleotides Has overhang. 27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei sich der einzelsträngige Überhang am 3'-Ende des Strangs S1 befindet. 27. Use according to claim 26, wherein the single-stranded overhang located at the 3 'end of strand S1. 28. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 27, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3'-Ende des Strangs S1 gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist. 28. Use according to any one of claims 18 to 27, wherein the dsRNA only at one, especially that at the 3 'end of the Strand S1 located, end of a single-stranded Has overhang. 29. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 28, wobei die dsRNA neben dem Strang S1 einen Strang S2 aufweist. 29. Use according to one of claims 18 to 28, wherein the dsRNA has a strand S2 in addition to the strand S1. 30. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 29, wobei der Strang S1 oder der Strang S2 zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des K-ras-Gens komplementär ist. 30. Use according to one of claims 18 to 29, wherein the Line S1 or line S2 to the primary or processed RNA transcript of the K-ras gene is complementary. 31. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 30, wobei die dsRNA aus dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 und dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 5 und dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht. 31. Use according to one of claims 18 to 30, wherein the dsRNA from strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 1 and the strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 2 or the Strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 3 and strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 4 or the strand S2 with the Sequence SEQ ID NO: 5 and strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 6 according to the attached sequence listing consists. 32. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 31, wobei die dsRNA zur Applikation in einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, oder einem Kapsid umschlossen vorliegt. 32. Use according to one of claims 18 to 31, wherein the dsRNA for application in a physiological compatible buffers, especially a phosphate buffered Saline, or of a micellar structure, preferably a liposome or a capsid. 33. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 32, wobei die dsRNA in einer Zubereitung vorliegt, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumoralen Infusion oder Injektion, geeignet ist. 33. Use according to one of claims 18 to 32, wherein the dsRNA is present in a preparation that is suitable for inhalation, oral intake, infusion or injection, in particular for intravenous, intraperitoneal or intratumoral Infusion or injection. 34. Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Zubereitung aus einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA besteht. 34. Use according to claim 33, wherein the preparation of a physiologically acceptable buffer, in particular a phosphate buffered saline, and the dsRNA consists. 35. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 34, wobei die dsRNA oral, mittels Inhalation, Infusion oder Injektion, insbesondere intravenösen, intraperitonealen oder intratumoralen Infusion oder Injektion, verabreicht wird. 35. Use according to one of claims 18 to 34, wherein the dsRNA orally, by inhalation, infusion or injection, especially intravenous, intraperitoneal or intratumoral infusion or injection. 36. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 35, wobei die dsRNA in einer Dosierung von höchstens 5 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, insbesondere 200 µg pro kg Körpergewicht pro Tag, einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, verabreicht wird. 36. Use according to one of claims 18 to 35, wherein the dsRNA in a dosage of at most 5 mg per kg Body weight per day, especially 200 µg per kg Body weight per day, one mammal, preferably one People being administered.
DE10230996A 2001-10-26 2002-07-09 Method for inhibiting viral replication, useful particularly for treating hepatitis C infection, by altering the 3'-untranslated region of the virus Withdrawn DE10230996A1 (en)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10230996A DE10230996A1 (en) 2001-10-26 2002-07-09 Method for inhibiting viral replication, useful particularly for treating hepatitis C infection, by altering the 3'-untranslated region of the virus
DE10230997A DE10230997A1 (en) 2001-10-26 2002-07-09 Drug to increase the effectiveness of a receptor-mediates apoptosis in drug that triggers tumor cells
EP02785312A EP1438406A1 (en) 2001-10-26 2002-10-25 Drug for treating a carcinoma of the pancreas
PCT/EP2002/011970 WO2003035870A1 (en) 2001-10-26 2002-10-25 Drug for treating a carcinoma of the pancreas
CNA028261798A CN1608131A (en) 2001-10-26 2002-10-25 Drug for adenocarcinoma of pancreas
JP2003538370A JP2005506385A (en) 2001-10-26 2002-10-25 Medicament for treating pancreatic cancer
PCT/EP2002/011971 WO2003035082A1 (en) 2001-10-26 2002-10-25 Drug for inhibiting expression of a target gene
US10/384,434 US20040121348A1 (en) 2001-10-26 2003-03-07 Compositions and methods for treating pancreatic cancer
US10/382,634 US20040038921A1 (en) 2001-10-26 2003-08-11 Composition and method for inhibiting expression of a target gene
US10/666,458 US20040126791A1 (en) 2001-10-26 2003-09-19 Compositions and methods for treating trail-resistant cancer cells

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10155280 2001-10-26
DE10158411 2001-11-29
DE10160151A DE10160151A1 (en) 2001-01-09 2001-12-07 Inhibiting expression of target gene, useful e.g. for inhibiting oncogenes, by administering double-stranded RNA complementary to the target and having an overhang
PCT/EP2002/000152 WO2002055693A2 (en) 2001-01-09 2002-01-09 Method for inhibiting the expression of a target gene
PCT/EP2002/000151 WO2002055692A2 (en) 2001-01-09 2002-01-09 Method for inhibiting the expression of a target gene and medicament for treating a tumor disease
DE10230996A DE10230996A1 (en) 2001-10-26 2002-07-09 Method for inhibiting viral replication, useful particularly for treating hepatitis C infection, by altering the 3'-untranslated region of the virus
PCT/EP2002/011968 WO2003035868A1 (en) 2001-10-26 2002-10-25 Medicament that increases the effectiveness of a drug that induces receptor-mediated apoptosis in tumor cells
PCT/EP2002/011971 WO2003035082A1 (en) 2001-10-26 2002-10-25 Drug for inhibiting expression of a target gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE10230996A1 true DE10230996A1 (en) 2003-07-17

Family

ID=37667408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE10230996A Withdrawn DE10230996A1 (en) 2001-10-26 2002-07-09 Method for inhibiting viral replication, useful particularly for treating hepatitis C infection, by altering the 3'-untranslated region of the virus

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE10230996A1 (en)
WO (1) WO2003035082A1 (en)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
US7763590B2 (en) 2001-10-12 2010-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a mutant gene
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7846907B2 (en) 2002-01-22 2010-12-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded RNA (dsRNA) and method of use for inhibiting expression of a fusion gene
US7868160B2 (en) 2001-01-09 2011-01-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US8101742B2 (en) 1999-01-30 2012-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10100586C1 (en) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Inhibiting gene expression in cells, useful for e.g. treating tumors, by introducing double-stranded complementary oligoRNA having unpaired terminal bases
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
CN1217700C (en) * 2003-07-08 2005-09-07 中国医学科学院血液学研究所 Multi-medicine medicine-resistant RNA interference medicine for resisting tumor
DE10350256A1 (en) * 2003-10-01 2005-06-02 Grünenthal GmbH PIM-1-specific siRNA compounds
FR2898908A1 (en) 2006-03-24 2007-09-28 Agronomique Inst Nat Rech Process, useful to prepare differentiated avian cells from avian stem cells grown in culture medium, comprises induction of stem cells differentiation by inhibiting expression/activity of gene expressed in the stem cells e.g. Nanog gene

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
EP2314700A1 (en) * 1999-01-28 2011-04-27 Medical College of Georgia Research Institute, Inc Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (en) * 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
KR20070118315A (en) * 1999-04-21 2007-12-14 와이어쓰 Compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
GB9927444D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
PT2796553T (en) * 2000-03-30 2019-09-27 Massachusetts Inst Technology Rna sequence-specific mediators of rna interference
WO2002044321A2 (en) * 2000-12-01 2002-06-06 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference mediating small rna molecules

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8183362B2 (en) 1999-01-30 2012-05-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8114981B2 (en) 1999-01-30 2012-02-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US9902955B2 (en) 1999-01-30 2018-02-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US9133454B2 (en) 1999-01-30 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8729037B2 (en) 1999-01-30 2014-05-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8101742B2 (en) 1999-01-30 2012-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8114851B2 (en) 1999-01-30 2012-02-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8101584B2 (en) 1999-01-30 2012-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8202980B2 (en) 1999-01-30 2012-06-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US7868160B2 (en) 2001-01-09 2011-01-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
US7763590B2 (en) 2001-10-12 2010-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a mutant gene
US7846907B2 (en) 2002-01-22 2010-12-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded RNA (dsRNA) and method of use for inhibiting expression of a fusion gene

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003035082A1 (en) 2003-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2003035870A1 (en) Drug for treating a carcinoma of the pancreas
EP1349927B1 (en) Method for inhibiting the expression of a target gene and medicament for treating a tumor disease
DE60037938T2 (en) ANTISENSE THERAPY FOR TRPM-2
DE10163098B4 (en) Method for inhibiting the replication of viruses
DE60310944T3 (en) OTHER NEW FORMS OF INTERFERING RNS MOLECULES
DE10230997A1 (en) Drug to increase the effectiveness of a receptor-mediates apoptosis in drug that triggers tumor cells
DE69634698T2 (en) TISSUE SPECIFIC AND TARGET RNA SPECIFIC RIBOZYMES
WO2003035868A1 (en) Medicament that increases the effectiveness of a drug that induces receptor-mediated apoptosis in tumor cells
WO2003062432A1 (en) Method for increasing the efficiency of an inhibitor of tyrosine kinase activity
DE10230996A1 (en) Method for inhibiting viral replication, useful particularly for treating hepatitis C infection, by altering the 3'-untranslated region of the virus
EP2195430B1 (en) Down regulation of gene expression using virus-like particles charged with nucleic acid
WO2016166285A1 (en) Arenaviruses for use in the treatment and/or prevention of tumors and method for producing arenaviruses with (improved) tumor-regression properties
EP1325122A2 (en) Modulation of the transcription of pro-inflammatory gene products
DE60038680T2 (en) ANTISENSE THERAPY FOR HORMONE-REGULATED TUMORS
WO2000063363A1 (en) Peptide from antigen muc-1 for triggering an immune response to tumor cells
EP1438406A1 (en) Drug for treating a carcinoma of the pancreas
EP1259263B1 (en) Complexation of rna, especially ribozymes, with polyethylenimines for the stabilization and cellular introduction thereof
US7700134B2 (en) Prevention of cisplatin induced deafness
EP0945507A1 (en) Tumor specific expression controll region and its use
DE102018215551A1 (en) Process for the production of an antitumoral arenavirus and arenavirus mutants
DE69733320T2 (en) DIFFERENTIATIVE FACTOR OF HYPOPHYSIS AND METHODS OF USE THEREOF.
EP2945645B1 (en) Selective cell-death-inducing binary enzyme system
WO2017218638A1 (en) Methods for treating subjects suffering from acute myeloid leukemia with flt3 ligand-targeted mir-150 nanoparticles
DE60023943T2 (en) ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FOR THE INHIBITION OF THE EXPRESSION OF TYPE I PROCOLLAGEN
DE69933382T2 (en) PREPARATION OF SSDNA INSIDE THE CELL

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8139 Disposal/non-payment of the annual fee