DE10222858A1 - Process for the fermentative production of sulfur-containing fine chemicals - Google Patents

Process for the fermentative production of sulfur-containing fine chemicals

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Abstract

The invention relates to methods for the production of sulfur-containing fine chemicals, in particular L-methionine, by fermentation using bacteria in which a nucleotide sequence encoding an S-adenosylmethionine synthase (metK) gene is expressed.

Description

Gegenstand der Erfindung ist neues Verfahren zur fermentativen Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin und L-Cystein, bei dem Bakterien genutzt werden, in denen Nukleotidsequenzen exprimiert werden, die für Mutanten der S-Adenosylmethionin-Synthase (metK) (E.C.2.5.1.6) kodieren; Nukleotidsequenzen, welche für diese Mutanten kodieren, sowie die damit transformierten, rekombinanten Mikroorganismen sowie neuartige metK-Mutanten mit veränderter Enzymaktivität. The invention relates to a new process for the fermentative production of sulfur-containing fine chemicals, especially L-methionine and L-cysteine, in which Bacteria are used in which nucleotide sequences are expressed, which are mutants encode the S-adenosylmethionine synthase (metK) (E.C.2.5.1.6); nucleotide which code for these mutants, as well as the recombinants transformed therewith Microorganisms and novel metK mutants with modified enzyme activity.

Stand der TechnikState of the art

Schwefelhaltige Feinchemikalien, wie zum Beispiel Methionin, Homocystein, S-Adenosyl- Methionin, Glutathion, Cystein, Biotin, Thiamin, Liponsäure werden über natürliche Stoffwechselprozesse in Zellen hergestellt und werden in vielen Industriezweigen verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie. Diese Substanzen, die zusammen als "schwefelhaltige Feinchemikalien" bezeichnet werden, umfassen organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Vitamine und Cofaktoren. Ihre Produktion erfolgt am zweckmäßigsten im Großmaßstab mittels Anzucht von Bakterien, die entwickelt wurden, um große Mengen der jeweils gewünschten Substanz zu produzieren und sezernieren. Für diesen Zweck besonders geeignete Organismen sind die gram-positiven, nicht-pathogenen coryneformen Bakterien. Sulfur-containing fine chemicals, such as methionine, homocysteine, S-adenosyl Methionine, glutathione, cysteine, biotin, thiamine, lipoic acid are natural Metabolic processes are made in cells and are used in many industries including the food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries. These substances, collectively referred to as "sulfur-containing fine chemicals", include organic acids, both proteinogenic and non-proteinogenic Amino acids, vitamins and cofactors. Their production takes place most conveniently in the Large scale by growing bacteria that are designed to handle large quantities of the to produce and secrete the desired substance. For this purpose Particularly suitable organisms are the gram-positive, non-pathogenic coryne forms Bacteria.

Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zum Produkt, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen. It is known that amino acids coryneformer by fermentation of strains Bacteria, especially Corynebacterium glutamicum, are produced. Because of the Of great importance is the constant improvement of manufacturing processes. Process improvements can include fermentation measures, such as Stirring and supplying oxygen, or the composition of the nutrient media, such as for example the sugar concentration during the fermentation, or the work-up to Product, for example by ion exchange chromatography, or the intrinsic Performance characteristics of the microorganism concern itself.

Über Stammselektion sind eine Reihe von Mutantenstämmen entwickelt worden, die ein Sortiment wünschenswerter Verbindungen aus der Reihe der schwefelhaltigen Feinchemikalien produzieren. Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen hinsichtlich der Produktion eines bestimmten Moleküls werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Dies ist jedoch ein zeitaufwendiges und schwieriges Verfahren. Auf diese Weise erhält man z. B. Stämme, die resistent gegen Antimetabolite, wie z. B. die Methionin-Analoga α-Methyl-Methionin, Ethionin, Norleucin, N-Acetylnorleucin, S-Trifluoromethylhomocystein, 2-Amino-5- heprenoitsäure, Seleno-Methionin, Methioninsulfoximin, Methoxin, 1-Aminocyclopentan- Carboxylsäure oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und schwefelhaltige Feinchemikalien, wie z. B. L-Methionin, produzieren. A number of mutant strains have been developed via strain selection Assortment of desirable compounds from the range of sulfur-containing Produce fine chemicals. To improve the performance characteristics of this Microorganisms regarding the production of a particular molecule become methods mutagenesis, selection and mutant selection. However, this is a time-consuming and difficult procedure. In this way you get z. B. strains that resistant to antimetabolites such as B. the methionine analogues α-methyl-methionine, Ethionine, norleucine, N-acetylnorleucine, S-trifluoromethylhomocysteine, 2-amino-5- heprenoitic acid, seleno-methionine, methionine sulfoximine, methoxine, 1-aminocyclopentane Carboxylic acid or auxotroph for regulatory metabolites are and sulfur-containing fine chemicals, such as. B. L-methionine.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht. Methods of recombinant DNA technology have also been used for some years Strain improvement of L-amino acid producing strains of Corynebacterium used by amplifying individual amino acid biosynthesis genes and the Impact on amino acid production examined.

Aus der JP-A-06-020809 ist eine Nukleotidsequenz für ein S-Adenosylmethionin kodierendes Gen aus Brevibacterium flavum MJ-233, einem coryneformen Bakterium, bekannt. Die korrespondierende Aminosäuresequenz umfasst 412 Aminosäuren. Das Protein weist unter anderem in den Positionen 24 und 94 jeweils einen Cysteinrest auf, welche in den entsprechenden Enzymen zahlreicher anderer coryneformer Bakterien konserviert sind. Die offenbarte Aminosäuresequenz besitzt einen charakteristischen Sequenzabschnitt zwischen den Resten 137 und 154. Die Herstellung von Mutanten und deren Verwendung bei der fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Feinchemikalien ist darin nicht beschrieben JP-A-06-020809 describes a nucleotide sequence for an S-adenosylmethionine Gene from Brevibacterium flavum MJ-233, a coryneform bacterium, known. The corresponding amino acid sequence comprises 412 amino acids. The protein teaches others in positions 24 and 94 each have a cysteine residue, which in the corresponding enzymes of numerous other coryneform bacteria are conserved. The The amino acid sequence disclosed has a characteristic sequence section between residues 137 and 154. The production of mutants and their use in It does not describe the fermentative production of sulfur-containing fine chemicals

Aus der WO-A-01/00843 ist ein metK-Gen aus C. glutamicum bekannt, welches für ein Protein mit 407 Aminosäuren kodiert und eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 16 aufweist. A metK gene from C. glutamicum is known from WO-A-01/00843, which for a Protein encoded with 407 amino acids and has a sequence according to SEQ ID NO: 16.

Verbesserungen der fermentativen Herstellung von Feinchemikalien korrelieren in der Regel mit Verbesserungen von Stoffflüssen und Ausbeuten. Wichtig dabei ist es, Zwischen- oder Endprodukthemmungen wichtiger Syntheseenzyme zu verhindern oder zu verringern. Ebenso ist es von Vorteil, Abflüsse des Kohlenstoffflusses in ungewünschte Produkte oder Seitenprodukte zu verhindern oder zu verringern. Improvements in the fermentative production of fine chemicals usually correlate with improvements in material flows and yields. It is important to intermediate or Prevent or reduce end product inhibitions of important synthetic enzymes. Likewise, it is advantageous to drain the carbon flow into unwanted products or Prevent or reduce side products.

Der Einfluss von Stoffwechselmetaboliten auf die enzymatischen Aktivitäten von Stoffwechselenzymen kann untersucht werden. Beispiele für solche Enzyme können metA, metB, metC, MetY, metH, metE, metF und weitere Enzyme im Stoffwechsel von Mikroorgamismen sein. Ein wichtiges Stoffwechselprodukt des Methionins und damit ein wesentlicher Abfluß ist S-Adenosylmethionin. The influence of metabolic metabolites on the enzymatic activities of Metabolic enzymes can be examined. Examples of such enzymes can be metA, metB, metC, MetY, metH, metE, metF and other enzymes in the metabolism of Be microorganisms. An important metabolite of methionine and therefore one essential outflow is S-adenosylmethionine.

Gleichzeitig ist S-Adenosylmethionin aber auch ein entscheidender Regulator der Methioninbiosynthese. Es ist zum Beispiel bekannt, dass die Biosynthese von L-Methion in E. coli durch S-Adenosylmethionin inhibiert wird. S-Adenosylmethionin wirkt dort als ein Co- Repressor des Repressors metJ (Weissbach, H. Brot, N. (1991) "Mol. Microbiol.", 5 (7), 1593-1597). At the same time, S-adenosylmethionine is also a crucial regulator of Methionine biosynthesis. For example, it is known that the biosynthesis of L-methion in E. coli is inhibited by S-adenosylmethionine. S-adenosylmethionine acts there as a co- Repressor des Repressors metJ (Weissbach, H. Brot, N. (1991) "Mol. Microbiol.", 5 (7), 1593-1597).

Die Synthese des S-Adenosylmethionins ist gleichzeitig ein wesentlicher Abfluß des gewünschten Wertproduktes L-Methionin. Deshalb ist es aus mehreren Gründen wünschenswert, die Menge des gebildeten S-Adenosylmethionins zu verringern:

  • a) die Menge des gebildeten L-Methionins würde erhöht,
  • b) die Repression von Genen der Methionin-Biosynthese verringert und
  • c) die Feedback-Inhibition von Enzymen der Methionin-Biosynthese würde verringert.
The synthesis of S-adenosylmethionine is also an essential outflow of the desired product of value L-methionine. Therefore, it is desirable to reduce the amount of S-adenosylmethionine formed for several reasons:
  • a) the amount of L-methionine formed would be increased,
  • b) the repression of genes of methionine biosynthesis is reduced and
  • c) the feedback inhibition of enzymes in methionine biosynthesis would be reduced.

Die Deletion des metK-Gens wäre der einfachste Weg, die Bildung des S-Adenosylmethionins zu verhindern. In Wei, Y. und Newman, E. B. (2002), "Mol. Microbiol.", 43 (6), 1651-1656 wird metK aber als ein essentielles Gen beschrieben und scheint somit für den Fachmann als Ansatzpunkt für eine verbesserte, fermentative Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere von L-Methionin, auszuscheiden. The deletion of the metK gene would be the easiest way, the formation of the S-adenosylmethionine to prevent. In Wei, Y. and Newman, E. B. (2002), "Mol. Microbiol.", 43 (6), 1651-1656 metK, however, is described as an essential gene and thus appears to the skilled person as Starting point for an improved, fermentative production of sulfur-containing Eliminate fine chemicals, especially L-methionine.

Kurze Beschreibung der ErfindungBrief description of the invention

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur verbesserten, fermentativen Herstellung von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, und die dafür erforderlichen Mittel bereitzustellen. The object of the invention is therefore to develop a new method for improved fermentative production of sulfur-containing fine chemicals, especially L-methionine, and to provide the necessary means.

Gelöst wird obige Aufgabe überraschenderweise durch Bereitstellung eines Verfahrens zur fermentativen Herstellung einer schwefelhaltigen Feinchemikalie, umfassend die Expression einer metK-Nukleotidsequenz in einem coryneformen Bakterium, wobei die Nukleotidsequenz für eine S-Adenosylmethionin-Synthase-Mutante kodiert, deren Aktivität gegenüber dem Wildtyp-Enzym verändert, vorzugsweise verringert, ist. Beispielsweise ist die Mutante von der S-Adenosylmethionin-Synthase aus Corynebacterium glutamicum abgeleitet und zeigt, gemessen in Corynebacterium glutamicum, eine geringere Aktivität als das Wildtyp-Enzym. The above object is surprisingly achieved by providing a method for fermentative production of a sulfur-containing fine chemical, comprising expression a metK nucleotide sequence in a coryneform bacterium, the Nucleotide sequence encodes an S-adenosylmethionine synthase mutant, its activity changed compared to the wild-type enzyme, preferably reduced. For example, the Mutant derived from the S-adenosylmethionine synthase from Corynebacterium glutamicum and shows less activity than that measured in Corynebacterium glutamicum Wild-type enzyme.

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung wenigstens einer schwefelhaltigen Feinchemikalie, welches folgende Schritte umfasst:

  • a) Fermentation einer die gewünschte schwefelhaltige Feinchemikalie produzierenden, coryneformen Bakterienkultur, wobei in den coryneformen Bakterien zumindest eine Nukleotidsequenz exprimiert wird, welche für ein Protein mit veränderter S- Adenosylmethionin-Synthase(metK)-Aktivität kodiert;
  • b) Anreicherung der schwefelhaltigen Feinchemikalie im Medium und/oder in den Zellen der Bakterien und
  • c) Isolieren der schwefelhaltigen Feinchemikalie, welche vorzugsweise L-Methionin umfasst.
A first subject of the invention relates to a process for the fermentative production of at least one sulfur-containing fine chemical, which comprises the following steps:
  • a) fermentation of a coryneform bacterial culture producing the desired sulfur-containing fine chemical, wherein at least one nucleotide sequence is expressed in the coryneform bacteria which codes for a protein with altered S-adenosylmethionine synthase (metK) activity;
  • b) accumulation of the sulfur-containing fine chemical in the medium and / or in the cells of the bacteria and
  • c) isolating the sulfur-containing fine chemical, which preferably comprises L-methionine.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das mutierte, coryneforme Bakterium außerdem eine im Vergleich zum nichtmutierten Wildtyp verbesserte metY-Aktivität und/oder eine gesteigerte L-Methionin-Menge (z. B. in g/l, Fermentationsbrühe). According to a preferred embodiment, the mutated, coryneform bacterium also an improved metY activity compared to the non-mutated wild type and / or an increased amount of L-methionine (e.g. in g / l, fermentation broth).

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird als metK-kodierende Sequenz insbesondere eine kodierende Nukleotidsequenz verwendet?, welche für ein Protein mit verringerter metK- Aktivität kodiert, in welchem wenigstens ein Cysteinrest des Wildtyp-Proteins substituiert ist. In the method according to the invention, a metK-coding sequence is in particular a coding nucleotide sequence used?, which for a protein with reduced metK- Activity encodes in which at least one cysteine residue of the wild-type protein is substituted.

Vorzugsweise ist die metK-kodierende Sequenz eine kodierende Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit metK-Aktivität kodiert, welches folgende Aminosäureteilsequenz gemäß SEQ ID NO: 23 aufweist:

G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V,

worin
X1 und X2 unabhängig voneinander für eine beliebige Aminosäure stehen;
und
X3 für eine von Cys verschiedene Aminosäure steht. The metK-coding sequence is preferably a coding nucleotide sequence which codes for a protein with metK activity which has the following partial amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 23:

G (F / Y) (D / S) X 1 X 2 (S / T) X 3 (G / A) V,

wherein
X 1 and X 2 independently of one another represent any amino acid;
and
X 3 represents an amino acid other than Cys.

Besonders bevorzugt ist ein Verfahren gemäß obiger Definition, bei welchem die metK- kodierende Sequenz für ein Protein mit metK-Aktivität kodiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz von Val1 bis Ala407 gemäß SEQ ID NO: 22 oder eine dazu homologe Aminosäuresequenz, welche für ein Protein mit funktionaler Äquivalenz steht, umfasst. A method according to the above definition is particularly preferred, in which the metK coding sequence encodes a protein with metK activity, the protein being a Amino acid sequence from Val1 to Ala407 according to SEQ ID NO: 22 or a homologous one Amino acid sequence, which stands for a protein with functional equivalence.

Die erfindungsgemäß eingesetzte, metK-kodierende Sequenz umfasst vorzugsweise eine kodierende Sequenz gemäß SEQ ID NO: 21 oder eine dazu homologe Nukleotidsequenz, welche für ein Protein mit metK-Aktivität kodiert. The metK-coding sequence used according to the invention preferably comprises one coding sequence according to SEQ ID NO: 21 or a nucleotide sequence homologous thereto, which codes for a protein with metK activity.

Die kodierende metK-Sequenz ist vorzugsweise eine in coryneformen Bakterien replizierbare oder eine stabil in das Chromosom intregrierte DNA oder eine RNA. The coding metK sequence is preferably a replicable in coryneform bacteria or a DNA or RNA stably integrated into the chromosome.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt, indem man:

  • a) einen mit einem Plasmidvektor transformierten Bakterienstamm einsetzt, der wenigstens eine Kopie der kodierenden metK-Sequenz unter der Kontrolle regulativer Sequenzen trägt, oder
  • b) einen Stamm einsetzt, in dem die kodierende metK-Sequenz in das Chromosom des Bakteriums integriert wurde.
According to a preferred embodiment, the method according to the invention is carried out by:
  • a) uses a bacterial strain transformed with a plasmid vector which carries at least one copy of the coding metK sequence under the control of regulatory sequences, or
  • b) uses a strain in which the coding metK sequence has been integrated into the chromosome of the bacterium.

Besonders bevorzugt sind Stämme obiger Definition, in denen zusätzlich die Aktivität des metK-Wildtyp-Enzyms vollständig oder teilweise entfernt wurde, wie z. B. durch Deletion der kodierenden Sequenz des Wildtyp-Enzyms. Strains of the above definition, in which the activity of the metK wild-type enzyme was completely or partially removed, such as. B. by deleting the coding sequence of the wild-type enzyme.

Außerdem kann es wünschenswert sein, Bakterien zu fermentieren, in denen zusätzlich wenigstens ein weiteres Gen des Biosyntheseweges der gewünschten, schwefelhaltigen Feinchemikalie verstärkt ist, und/oder in denen wenigstens ein Stoffwechselweg zumindest teilweise ausgeschaltet sind, der die Bildung der gewünschten, schwefelhaltigen Feinchemikalie verringert. It may also be desirable to ferment bacteria in which additional at least one other gene of the biosynthetic pathway of the desired sulfur-containing Fine chemical is reinforced, and / or in which at least one metabolic pathway at least are partially switched off, the formation of the desired, sulfur-containing Fine chemical reduced.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden deshalb coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene, ausgewählt unter:

  • 1. dem für eine Aspartat-Kinase kodierenden Gen lysC,
  • 2. dem für eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase kodierenden Gen asd
  • 3. dem für die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierenden Gen gap,
  • 4. dem für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierenden Gen pgk,
  • 5. dem für die Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gen pyc,
  • 6. dem für die Triosephosphat-Isomerase kodierenden Gen tpi,
  • 7. dem für die Homoserin-O-Acetyltransferase kodierenden Gen metA,
  • 8. dem für die Cystahionin-gamma-Synthase kodierenden Gen metB,
  • 9. dem für die Cystahionin-gamma-Lyase kodierenden Gen metC,
  • 10. dem für die Methionin-Synthase kodierenden Gen metH,
  • 11. dem für die Serin-Hydroxymethyltransferase kodierenden Gen glyA,
  • 12. dem für die O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase kodierenden Gen metY,
  • 13. dem für die Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase kodieren Gen, metF
  • 14. dem für die Phosphoserin-Aminotransferase kodieren Gen serC
  • 15. dem für die Phosphoserin-Phosphatase kodieren Gen serB,
  • 16. dem für die Serine-Acetyl-Transferase kodieren Gen cysE,
  • 17. dem für die Cystein-Synthase kodierenden gen cysK,
  • 18. dem für die Homoserin-Dehydrogenase kodieren Gen hom,
überexprimiert ist. According to a further embodiment of the method according to the invention, coryneform bacteria are therefore fermented in which at least one of the genes selected at the same time is selected from:
  • 1. the lysC gene coding for an aspartate kinase,
  • 2. the gene coding for an aspartate semialdehyde dehydrogenase asd
  • 3. the gene gap coding for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,
  • 4. the gene pgk coding for the 3-phosphoglycerate kinase,
  • 5. the pyc gene coding for the pyruvate carboxylase,
  • 6. the gene tpi coding for the triose phosphate isomerase,
  • 7. the gene metA coding for the homoserine O-acetyltransferase,
  • 8. the metB gene coding for cystahionin gamma synthase,
  • 9. the metC gene coding for the cystahionin gamma lyase,
  • 10. the metH gene coding for methionine synthase,
  • 11. the glyA gene coding for the serine hydroxymethyltransferase,
  • 12. the metY gene coding for the O-acetylhomoserine sulfhydrylase,
  • 13. the gene coding for methylene tetrahydrofolate reductase, metF
  • 14. The gene coding for the phosphoserine aminotransferase serC
  • 15. the gene coding for the phosphoserine phosphatase, serB,
  • 16. the gene coding for the serine acetyl transferase, cysE,
  • 17. the gene cysK coding for the cysteine synthase,
  • 18. the gene hom coding for homoserine dehydrogenase,
is overexpressed.

Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene, ausgewählt unter Genen der oben genannten Gruppe 1) bis 18), so mutiert ist, dass die korrespondierenden Proteine, verglichen mit nicht mutierten Proteinen, in geringerem Maße oder nicht durch Stoffwechselmetabolite in ihrer Aktivität beeinflusst werden und dass insbesondere die erfindungsgemäße Produktion der Feinchemikalie nicht beeinträchtigt wird, oder so dass ihre spezifische, enzymatische Aktivität gesteigert wird:
Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene, ausgewählt unter:

  • 1. dem für die Homoserine-Kinase kodierenden Gen thrB,
  • 2. dem für die Threonin-Dehydratase kodierenden Gen ilvA,
  • 3. dem für die Threonin-Synthase kodierenden Gen thrC
  • 4. dem für die Meso-Diaminopimelat-D-Dehydrogenase kodierenden Gen ddh
  • 5. dem für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierenden Gen pck,
  • 6. dem für die Glucose-6-Phosphat-6-Isomerase kodierenden Gen pgi,
  • 7. dem für die Pyruvat-Oxidase kodierenden Gen poxB,
  • 8. dem für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierenden Gen dapA,
  • 9. dem für die Dihydrodipicolinat-Reduktase kodierenden Gen dapB; oder
  • 10. dem für die Diaminopicolinat-Decarboxylase kodierenden Gen lysA
abschwächt ist, insbesondere durch Verringerung der Expressionsrate des korrespondierenden Gens. According to another embodiment of the method according to the invention, coryneform bacteria are fermented, in which at least one of the genes selected from genes of the above-mentioned group 1) to 18) is mutated at the same time so that the corresponding proteins are less compared to non-mutated proteins Dimensions or not influenced by metabolic metabolites in their activity and that in particular the production of the fine chemical according to the invention is not impaired, or so that their specific, enzymatic activity is increased:
According to another embodiment of the method according to the invention, coryneform bacteria are fermented in which at least one of the genes selected at the same time is selected from:
  • 1. the gene coding for the homoserine kinase thrB,
  • 2. the ilvA gene coding for threonine dehydratase,
  • 3. the thrC gene coding for the threonine synthase
  • 4. the ddh gene coding for the mesodiaminopimelate D-dehydrogenase
  • 5. the gene pck coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase,
  • 6. the gene pgi coding for the glucose-6-phosphate-6-isomerase,
  • 7. the poxB gene coding for pyruvate oxidase,
  • 8. the gene dapA coding for the dihydrodipicolinate synthase,
  • 9. the gene coding for the dihydrodipicolinate reductase dapB; or
  • 10. the gene coding for the diaminopicolinate decarboxylase lysA
is weakened, in particular by reducing the expression rate of the corresponding gene.

Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene der obigen Gruppen 19) bis 28) mutiert ist, so dass die enzymatische Aktivität des korrespondierenden Proteins teilweise oder vollständig verringert wird. According to another embodiment of the method according to the invention coryneform bacteria fermented, in which at least one of the genes of the Groups 19) to 28) above is mutated, so that the enzymatic activity of the corresponding protein is partially or completely reduced.

Vorzugsweise werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum eingesetzt. Microorganisms of the type Corynebacterium glutamicum used.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines L- Methionin-haltigen Tierfuttermittel-Additivs aus Fermentationsbrühen, welches folgende Schritte umfasst:

  • a) Kultivierung und Fermentation eines L-Methionin produzierenden Mikroorganismus, vorzugsweise mit verringerter metK-Aktivität gemäß obiger Definition, in einem Fermentationsmedium;
  • b) Entfernung von Wasser aus der L-Methionin-haltigen Fermentationsbrühe;
  • c) Entfernung der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100 Gew.-%, und
  • d) Trocknung der gemäß b) und/oder c) erhaltenen Fermentationsbrühe, um das Tierfuttermittel-Additiv in der gewünschten Pulver- oder Granulatform zu erhalten.
The invention further relates to a method for producing an L-methionine-containing animal feed additive from fermentation broths, which comprises the following steps:
  • a) cultivation and fermentation of an L-methionine-producing microorganism, preferably with reduced metK activity as defined above, in a fermentation medium;
  • b) removal of water from the fermentation broth containing L-methionine;
  • c) removal of the biomass formed during the fermentation in an amount of 0 to 100% by weight, and
  • d) drying the fermentation broth obtained according to b) and / or c) in order to obtain the animal feed additive in the desired powder or granule form.

Die Erfindung betrifft außerdem isolierte Polynukleotide, die für ein Polypeptid mit verringerter metK-Aktivität gemäß obiger Definition kodieren, sowie metK-Mutanten mit verringerter Aktivität, welche von diesen Polynukleotiden kodiert werden. The invention also relates to isolated polynucleotides that are used for a polypeptide encode reduced metK activity as defined above, as well as metK mutants reduced activity encoded by these polynucleotides.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem rekombinante, coryneforme Bakterien, die ein mutiertes metK-Gen gemäß obige Definition exprimieren und insbesondere solche rekombinanten, coryneformen Bakterien, welche das metK-Wildtyp-Enzym nicht mehr exprimieren. The invention also relates to recombinant, coryneform bacteria which a Express mutated metK gene as defined above and in particular those recombinant, coryneform bacteria, which the metK wild-type enzyme no longer express.

Bevorzugte rekombinante, coryneforme Bakterien zeigen im Vergleich zum korrespondierenden Wildtyp-Stamm wenigstens eines der folgenden Merkmale:

  • a) geringeren, intrazellulären S-Adenosylmethionin-Titer
  • b) geringere, intrazelluläre S-Adenosylmethionin-Synthase-Konzentration oder
  • c) geringere Aktivität der S-Adenosylmethionin-Synthase, bestimmt anhand der S-Adenosylmethionin-Bildungsrate
und zusätzlich gegebenenfalls wenigstens eines der folgenden Merkmale:
  • a) verbesserte metY-Aktivität oder
  • b) gesteigerte L-Methionin-Menge.
Preferred recombinant, coryneform bacteria show at least one of the following features in comparison to the corresponding wild-type strain:
  • a) Lower intracellular S-adenosylmethionine titer
  • b) lower, intracellular S-adenosylmethionine synthase concentration or
  • c) lower activity of S-adenosylmethionine synthase, determined on the basis of the S-adenosylmethionine formation rate
and in addition, if necessary, at least one of the following features:
  • a) improved metY activity or
  • b) increased amount of L-methionine.

Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention a) Allgemeine Begriffea) General terms

Als Proteine mit der biologischen Aktivität der "S-Adenosylmethionin-Synthase", kurz auch metK genannt (E.C.2.5.1.6), werden solche Proteine bezeichnet, die in der Lage sind, L- Methionin und ATP zu S-Adenosyl-Methionin umzusetzen. Dem Fachmann sind weitere Details des metK-Proteins bekannt. Die enzymatische Aktivität von metK kann durch Enzymtests nachgewiesen werden, Vorschriften dafür finden sich in: Markham, G. D. et al. (1983), "Methods in Enzymology", 94: 219-222. As proteins with the biological activity of "S-adenosylmethionine synthase", in short also called metK (E.C.2.5.1.6), are proteins that are able to Implement methionine and ATP to S-adenosyl-methionine. Those skilled in the art are more Details of the metK protein known. The enzymatic activity of metK can be determined by Enzyme tests are detected, regulations for this can be found in: Markham, G. D. et al. (1983), "Methods in Enzymology", 94: 219-222.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff "schwefelhaltige Feinchemikalie" jegliche chemische Verbindung, die wenigstens ein Schwefelatom kovalent gebunden enthält und durch ein erfindungsgemäßes Fermentationsverfahrens zugänglich ist. Nichtlimitierende Beispiele dafür sind Methionin, Homocystein, S-Adenosyl-Methionin, Cystein und insbesondere Methionin und S-Adenosyl-Methionin. In the context of the present invention, the term “sulfur-containing fine chemical” includes any chemical compound that contains at least one sulfur atom covalently bonded and is accessible by a fermentation process according to the invention. Nonlimiting Examples include methionine, homocysteine, S-adenosyl methionine, cysteine and especially methionine and S-adenosyl-methionine.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen die Begriffe "L-Methionin", "Methionin", "Homocystein" und "S-Adenosylmethionin" auch die korrespondierenden Salze, wie z. B. Methionin-Hydrochlorid oder Methionin-Sulfat. In the context of the present invention, the terms “L-methionine”, “methionine”, "Homocysteine" and "S-adenosylmethionine" also the corresponding salts, such as. B. Methionine hydrochloride or methionine sulfate.

"Polynukleotide" bezeichnet im allgemeinen Polyribonukleotide (RNA) und Polydeoxyribonukleotide (DNA), wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann. "Polynucleotides" generally refers to polyribonucleotides (RNA) and Polydeoxyribonucleotides (DNA), which are unmodified RNA or DNA or modified RNA or DNA can act.

Unter "Polypeptiden" versteht man erfindungsgemäß Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten. According to the invention, “polypeptides” are understood to mean peptides or proteins which contain two or contain more amino acids linked via peptide bonds.

Der Begriff "Stoffwechselmetabolit" bezeichnet chemische Verbindungen, die im Stoffwechsel von Organismen als Zwischen- oder auch Endprodukte vorkommen und die neben ihrer Eigenschaft als chemische Bausteine auch modulierende Wirkung auf Enzyme und ihre katalytische Aktivität haben können. Dabei ist aus der Literatur bekannt, dass solche Stoffwechselmetabolite sowohl hemmend als auch stimulierend auf die Aktivität von Enzymen wirken können ("Biochemistry", Stryer, Lubert, 1995 W. H. Freeman & Company, New York, New York.). In der Literatur ist auch beschrieben, dass es möglich ist, durch Maßnahmen, wie Mutation der genomischen DNA durch UV-Strahlung, ionisierender Strahlung oder mutagene Substanzen und nachfolgender Selektion auf bestimmte Phänotypen, in Organismen solche Enzyme zu produzieren, in denen die Beeinflussung durch Stoffwechselmetabolite verändert wurde (Sahm H., Eggeling L., de Graaf A. A., "Biological Chemistry", 381 (9-10): 899-910, 2000; Eikmanns BJ., Eggeling L., Sahm H. Antonie von Leeuwenhoek. 64: 145-63, 1993-94). Diese veränderten Eigenschaften können auch durch gezielte Maßnahmen erreicht werden. Dabei ist dem Fachmann bekannt, in Genen für Enzyme auch gezielt bestimmte Nukleotide der für das Protein kodierenden DNA so zu verändern, dass das aus der exprimierten DNA-Sequenz resultierende Protein bestimmte neue Eigenschaften aufweist. So kann zum Beispiel erreicht werden, dass die modulierende Wirkung von Stoffwechselmetaboliten gegenüber dem nicht veränderten Protein verändert ist. Enzyme können auch derart in ihrer Aktivität beeinflusst werden, dass es zu einer Verringerung der Reaktionsgeschwindigkeit oder zu einer Veränderung der Affinität gegenüber dem Substrat kommt. The term "metabolic metabolite" refers to chemical compounds that in the Metabolism of organisms occur as intermediate or end products and the in addition to their property as chemical building blocks, also a modulating effect on enzymes and can have their catalytic activity. It is known from the literature that such Metabolic metabolites both inhibit and stimulate the activity of Enzymes can act ("Biochemistry", Stryer, Lubert, 1995 W. H. Freeman & Company, New York, New York.). The literature also describes that it is possible to go through Measures such as mutation of genomic DNA by UV radiation, ionizing Radiation or mutagenic substances and subsequent selection for certain Phenotypes to produce such enzymes in organisms in which the interference was changed by metabolic metabolites (Sahm H., Eggeling L., de Graaf A. A., "Biological Chemistry", 381 (9-10): 899-910, 2000; Eikmanns BJ., Eggeling L., Sahm H. Antonie by Leeuwenhoek. 64: 145-63, 1993-94). These changed properties can also can be achieved through targeted measures. It is known to the skilled worker in genes for Enzymes also specifically target certain nucleotides of the DNA coding for the protein change that the protein resulting from the expressed DNA sequence determined has new properties. For example, it can be achieved that the modulating Effect of metabolic metabolites on the unchanged protein changed is. Enzymes can also be influenced in their activity in such a way that Decrease in reaction speed or change in affinity towards the substrate.

Die Begriffe "exprimieren" bzw. "Verstärkung" oder "Überexpression" beschreiben im Kontext der Erfindung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen Organismus einbringen, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren. The terms "express" or "amplification" or "overexpression" describe in context the invention the production or increase of the intracellular activity of one or more Enzymes in a microorganism that are encoded by the corresponding DNA. To For example, you can insert a gene into an organism, an existing gene replace with another gene, increase the number of copies of the gene or genes, one Use a strong promoter or use a gene that is appropriate for an appropriate enzyme encoded with a high activity and you can take these measures if necessary combine.

Die Begriffe "abschwächen" und "verringern" beschreiben im Kontext der Erfindung die Abschwächung oder Verringerung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einem Organismus deletieren, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl eines Transkriptes des Gens bzw. der Gene erniedrigen, einen schwachen Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigeren Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren. The terms "weaken" and "decrease" describe in the context of the invention Attenuation or decrease in the intracellular activity of one or more enzymes in a microorganism that are encoded by the corresponding DNA. This can you delete a gene in an organism, for example, by deleting an existing gene replace another gene, the copy number of a transcript of the gene or genes decrease, use a weak promoter or use a gene that is responsible for a corresponding enzyme with a lower activity is encoded and one can if necessary combine these measures.

Die "verringerte Aktivität" einer erfindungsgemäßen S-Adenosylmethionin-Synthase-Mutante oder eines funktionelle Äquivalents kann durch den Vergleich mit der Aktivität der nativen S- Adenosylmethionin-Synthase, wie z. B. aus Corynebacterium-glutamicum-Wildtyp, ATCC 13032, bestimmt werden. Geeigneterweise bringt man dazu Plasmide, die in Corynebacterium glutamicum replizieren und die die Gene für S-Adenosylmethionin- Synthase-Mutanten tragen, durch Transformation z. B. in Corynebacterium-glutamicum- Wildtyp, ATCC 13032 ein. Außerdem bringt man entsprechende Plasmide in Corynebacterium-glutamicum-Wildtyp, ATCC 13032 ein, die das Wildtyp-Enzym S- Adenosylmethionin-Synthase exprimieren. Solchermaßen erhaltene Corynebacterium- glutamicum-Transformanten werden in geeigneten Medien kultiviert und in der logarithmischen Phase des Wachstums bei gleicher OD600 geerntet. Danach werden aus den geernteten Zellen beider Transformanten nach bekannten Protokollen Proteinextrakte hergestellt. Gleiche Mengen dieser Proteinextrakte (nach Proteinbestimmung) werden dann in einen S-Adenosylmethionin-Synthase-Assay nach Markham Markham, G. D. et al. (1983), "Methods in Enzymology", 94: 219-222 eingesetzt. Die Radioaktivität des gebildeten S- Adenosylmethionins wird in einem Szintillationszähler bestimmt. Unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität des radioaktiven L-Methionins sowie der eingesetzten Proteinmenge läßt sich die Rate der S-Adenosylmethionin-Bildung aus der Zunahme der eingebauten Radioaktivität pro Zeiteinheit bestimmen. Ihre Einheit lautet µmol S- Adenosylmethionin/min.mg Protein. Diese Rate kann zwischen Wildtypenzym und Mutantenenzym verglichen werden. Nach dem gleichen Prinzip sind, ausgehend von anderen Wildtyp-Enzymen, mit S-Adenosylmethionin-Synthase-Aktivität erfindungsgemäß brauchbare Mutanten herstellbar. The "reduced activity" of an S-adenosylmethionine synthase mutant according to the invention or of a functional equivalent can be compared to the activity of the native S-adenosylmethionine synthase, such as, for. B. from Corynebacterium glutamicum wild type, ATCC 13032. Appropriately, plasmids which replicate in Corynebacterium glutamicum and which carry the genes for S-adenosylmethionine synthase mutants are brought about by transformation, for example by B. in Corynebacterium glutamicum wild type, ATCC 13032 a. Corresponding plasmids are also introduced into wild-type Corynebacterium glutamicum, ATCC 13032, which express the wild-type enzyme S-adenosylmethionine synthase. Corynebacterium glutamicum transformants obtained in this way are cultivated in suitable media and harvested in the logarithmic phase of growth at the same OD 600 . Then protein extracts are produced from the harvested cells of both transformants according to known protocols. Equal amounts of these protein extracts (after protein determination) are then in an S-adenosylmethionine synthase assay according to Markham Markham, GD et al. (1983), "Methods in Enzymology", 94: 219-222. The radioactivity of the S-adenosylmethionine formed is determined in a scintillation counter. Taking into account the specific activity of the radioactive L-methionine and the amount of protein used, the rate of S-adenosylmethionine formation can be determined from the increase in the built-in radioactivity per unit of time. Its unit is µmol S-adenosylmethionine / min.mg protein. This rate can be compared between wild type enzyme and mutant enzyme. Using the same principle, mutants which can be used according to the invention can be prepared with S-adenosylmethionine synthase activity, starting from other wild-type enzymes.

Eine "verringerte Aktivität" erfindungsgemäß ist insbesondere dann gegeben, wenn die spezifische Aktivität der Mutante auf eine Restaktivität von etwa 1 bis 90%, vorzugsweise bis 70%, wie z. B. 5 bis 10% der Wildtyp-Aktivität verringert ist. A "reduced activity" according to the invention is particularly given when the specific activity of the mutant to a residual activity of about 1 to 90%, preferably up to 70%, such as. B. 5 to 10% of wild-type activity is reduced.

b) Erfindungsgemäße metK-Proteineb) metK proteins according to the invention

Die erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenzen kodieren für Proteine mit veränderter, insbesondere verringerter S-Adenosylmethionin-Synthase-Aktivität gemäß obiger Definition. The polynucleotide sequences according to the invention code for proteins with modified, in particular reduced S-adenosylmethionine synthase activity as defined above.

Vorzugsweise sind die erfindungsgemäß brauchbaren Mutanten durch Substitution eines oder mehrerer konservierter Cysteinreste innerhalb der metK-Aminosäuresequenz grampositiver und/oder gramnegativer, oder insbesondere coryneformer Bakterien zugänglich. Konservierte Cysteinreste sind anhand von Sequenzalignments leicht feststellbar. Als nichtlimitierendes Beispiele für konservierte Cys-Reste in S- Adenosylmethionin-Synthasen aus Bakterien sind Cys24 und Cys94 des Enzyms aus C. glutamicum zu nennen, welche in einer Vielzahl von Bakterien zu finden sind. The mutants which can be used according to the invention are preferably by substitution of a or more conserved cysteine residues within the metK amino acid sequence Gram-positive and / or gram-negative, or in particular coryneform bacteria accessible. Preserved cysteine residues are easy using sequence alignments ascertainable. As a non-limiting example of conserved Cys residues in S- Adenosylmethionine synthases from bacteria are Cys24 and Cys94 of the enzyme from C. To name glutamicum, which can be found in a variety of bacteria.

In einer bevorzugten Gruppe von erfindungsgemäßen Mutanten sind Cys24 und oder Cys94 (gemäß metK aus C. glutamicum ATCC 13032) durch eine von Cys verschiedene Aminosäure, vorzugsweise Alanin, substituiert, wodurch die Enzymaktivität in obiger Weise verringert wird. In a preferred group of mutants according to the invention are Cys24 and or Cys94 (according to metK from C. glutamicum ATCC 13032) by one other than Cys Amino acid, preferably alanine, substituted, causing enzyme activity in the above manner is reduced.

"Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z. B. Substratspezifität, besitzen. "Functional equivalents" or analogs of the specifically disclosed polypeptides are within the scope the present invention different polypeptides thereof, which further the desired biological activity, such as B. substrate specificity.

Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten, biologische Aktivität besitzen. "Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d. h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden. According to the invention, “functional equivalents” means in particular mutants, which, in at least one of the above sequence positions, a different one than that but specifically mentioned amino acid still have one of the above, possess biological activity. "Functional equivalents" thus include those by or several amino acid additions, substitutions, deletions and / or inversions available mutants, the changes mentioned in any sequence position can occur as long as they become a mutant with the invention Property profile. Functional equivalence is especially given if the reactivity pattern between mutant and unchanged polypeptide is qualitative match, d. H. for example the same substrates at different speeds be implemented.

"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln. "Functional equivalents" naturally also include polypeptides which are from others Organisms are accessible, as well as naturally occurring variants. For example can be determined by sequence comparison areas of homologous sequence regions and in Determine equivalent enzymes based on the specific requirements of the invention.

"Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z. B. die gewünschte, biologische Funktion aufweisen. "Functional equivalents" also include fragments, preferably individual domains or sequence motifs of the polypeptides according to the invention which, for. B. the desired have biological function.

"Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete, funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C- terminaler Verknüpfung (d. h. ohne gegenseitige, wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitiernde Beispiele für derartige, heterologe Sequenzen sind z. B. Signalpeptide, Enzyme, Immunoglobuline, Oberflächenantigene, Rezeptoren oder Rezeptorliganden. "Functional equivalents" are also fusion proteins which are one of the above Polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further, functionally different, heterologous sequence in functional N- or C- terminal linkage (i.e. without mutual, substantial functional impairment of the fusion protein parts). Non-limiting examples of such heterologous ones Sequences are e.g. B. signal peptides, enzymes, immunoglobulins, surface antigens, Receptors or receptor ligands.

Erfindungsgemäß mit umfasste "funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 20%, 30% oder etwa 40%, 50%, vorzugsweise wenigstens etwa 60%, 65%, 70% oder 75%, insbesondere wenigstens 85%, wie z. B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, "Proc. Natl. Acad, Sci." (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. "Functional equivalents" encompassed according to the invention are homologs to the concrete disclosed proteins. These have at least 20%, 30% or about 40%, 50%, preferably at least about 60%, 65%, 70% or 75%, in particular at least 85%, such as B. 90%, 95% or 99%, homology to one of the specifically disclosed sequences, calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, "Proc. Natl. Acad, Sci." (UNITED STATES) 85 (8), 1988, 2444-2448.

Insbesondere sind Mutanten und funktionale Analoga bevorzugt, welche die charakteristische Teilsequenz:

G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V

gemäß obiger Definition enthalten, wobei X3 eine von Cys verschiedene, durch Mutation eingeführte Aminosäure, insbesondere Alanin, darstellt. X3 entspricht Cys94 der metK- Wildtyp-Sequenz von C. glutamicum (SEQ ID NO: 16). X2 steht vorzugsweise für Ala, Glu, Asp, Asn oder Arg, und X1 steht vorzugsweise für Gly, Cys, Ser oder Ala. In particular, mutants and functional analogs are preferred which have the characteristic partial sequence:

G (F / Y) (D / S) X 1 X 2 (S / T) X 3 (G / A) V

contained according to the above definition, wherein X 3 represents an amino acid other than Cys, introduced by mutation, in particular alanine. X 3 corresponds to Cys94 of the metK wild-type sequence of C. glutamicum (SEQ ID NO: 16). X 2 preferably represents Ala, Glu, Asp, Asn or Arg, and X 1 preferably represents Gly, Cys, Ser or Ala.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z. B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins. Der Begriff "Homolog", wie er hier verwendet wird, betrifft eine variante Form des Proteins, die als Agonist oder Antagonist der Protein-Aktivität wirkt. Homologs of the proteins or polypeptides according to the invention can be obtained by mutagenesis are generated, e.g. B. by point mutation or shortening of the protein. The term "Homologous", as used here, refers to a variant form of the protein which is called Agonist or antagonist of protein activity acts.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z. B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z. B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z. B. Narang, S. A. (1983) "Tetrahedron", 39: 3; Itakura et al. (1984) "Annu. Rev. Biochem.", 53: 323; Itakura et al., (1984) "Science", 198: 1056; Ike et al. (1983), "Nucleic Acids Res.", 11: 477). Homologs of the proteins of the invention can be combinatorial by screening Banks of mutants such as B. shortening mutants can be identified. For example can display a varied library of protein variants through combinatorial mutagenesis Nucleic acid level are generated, such as. B. by enzymatic ligating one Mixture of synthetic oligonucleotides. There are a variety of procedures available for Manufacturing banks of potential homologues from a degenerate Oligonucleotide sequence can be used. The chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be carried out in a DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into an appropriate expression vector. The use of a degenerate gene set makes it possible to provide all of them Sequences in a mixture that contain the desired set of potential protein sequences encode. Methods for the synthesis of degenerate oligonucleotides are known to the person skilled in the art known (e.g. Narang, S.A. (1983) "Tetrahedron", 39: 3; Itakura et al. (1984) "Annu. Rev. Biochem. ", 53: 323; Itakura et al., (1984)" Science ", 198: 1056; Ike et al. (1983)," Nucleic Acids Res. ", 11: 477).

Zusätzlich können Banken von Fragmenten des Protein-Codons verwendet werden, um eine variegierte Population von Protein-Fragmenten zum Screening und zur anschließenden Selektion von Homologen eines erfindungsgemäßen Proteins zu erzeugen. Bei einer Ausführungsform kann eine Bank von kodierenden Sequenzfragmenten durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragmentes einer kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, unter denen ein Nicking nur etwa einmal pro Molekül erfolgt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA, die Sense-/Antisense-Paare von verschiedenen, genickten Produkten umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit S1-Nuclease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente mit verschiedenen Größen des erfindungsgemäßen Proteins kodiert. In addition, banks of fragments of the protein codon can be used to generate a varied population of protein fragments for screening and subsequent To generate selection of homologues of a protein according to the invention. At a Embodiment can treat a bank of coding sequence fragments a double-stranded PCR fragment of a coding sequence with a nuclease under conditions where the nicking occurs only about once per molecule, Denaturing the double stranded DNA, renaturing the DNA to form double-stranded DNA, the sense / antisense pairs of different nodded products may include removing single-stranded sections from newly formed duplexes Treatment with S1 nuclease and ligating the resulting fragment library into one Expression vector can be generated. This procedure allows an expression bank are derived, the N-terminal, C-terminal and internal fragments with different Encoded sizes of the protein of the invention.

Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zur Mutagenese von Genen bekannt: Coco, WM et al. 2001. "DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes". "Nature Biotechnol.", 19: 354-359; DE 199 53 854; Leung DW et al. 1989. "A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction". "Technique" 1: 11-15; Stemmer WPC 1994. "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution". "Proc. Natl. Acad. Sci." USA 91: 10747-10751; und US 5811238. Diese Verfahren sind zur Herstellung erfindungsgemäß brauchbarer Mutanten einsetzbar. Several techniques for mutagenesis of genes are known in the prior art: Coco, WM et al. 2001. "DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes "." Nature Biotechnol. ", 19: 354-359; DE 199 53 854; Leung DW et al. 1989." A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction "." Technique "1: 11-15; Stemmer WPC 1994." DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution "." Proc. Natl. Acad. Sci. "USA 91: 10747-10751; and US 5811238. These processes are according to the invention for the production usable mutants.

Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese von erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive- Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992), "PNAS", 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993), "Protein Engineering", 6(3): 327-331. There are several techniques for screening gene products in the prior art combinatorial banks that have been created by point mutations or shortening and for screening cDNA libraries for gene products with a selected one Property known. These techniques can be applied to the rapid screening of the Adapt gene banks by combinatorial mutagenesis of the invention Homologues have been generated. The most commonly used screening techniques Large gene banks that are subject to high throughput analysis include this Cloning the gene bank in replicable expression vectors, transforming the appropriate Cells with the resulting vector library and expression of the combinatorial genes under conditions under which the detection of the desired activity isolates the Vector encoding the gene whose product has been detected. Recursive Ensemble mutagenesis (REM), a technique that measures the frequency of functional mutants in the Enlarged banks can be used in combination with the screening tests Identify homologs (Arkin and Yourvan (1992), "PNAS", 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) "Protein Engineering", 6 (3): 327-331.

c) Erfindungsgemäße Polynukleotidec) Polynucleotides according to the invention

Gegenstand der Erfindung sind ebenso Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z. B. cDNA und mRNA), kodierend für ein erfindungsgemäßes metK-Enzym und deren funktionale Äquivalente, welche z. B. auch unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind. The invention also relates to nucleic acid sequences (single and double-stranded DNA and RNA sequences, such as. B. cDNA and mRNA) coding for a metK enzyme according to the invention and their functional equivalents, which, for. Belly are accessible using artificial nucleotide analogs.

Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die z. B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßen, kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können. The invention relates both to isolated nucleic acid molecules which are suitable for the invention Encode polypeptides or proteins or biologically active sections thereof, and Nucleic acid fragments, e.g. B. for use as hybridization probes or primers Identification or amplification of coding nucleic acids according to the invention can be used.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten The nucleic acid molecules according to the invention can also untranslated sequences contained from the 3 'and / or 5' end of the coding gene region

Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulärem Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird. An "isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules, which are present in the natural source of nucleic acid and can also be found in be substantially free of other cellular material or culture medium when passed through recombinant techniques are produced, or free of chemical precursors or others Be chemicals when it's chemically synthesized.

Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon. The invention further includes the nucleotide sequences specifically described complementary nucleic acid molecules or a portion thereof.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z. B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert. The nucleotide sequences according to the invention enable the generation of probes and Primers used to identify and / or clone homologous sequences in others Cell types and organisms can be used. Such probes or primers include usually a nucleotide sequence region that occurs under stringent conditions at least about 12, preferably at least about 25, e.g. B. about 40, 50 or 75 successive nucleotides of a sense strand of an invention Nucleic acid sequence or a corresponding antisense strand hybridized.

Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von SEQ ID NO: 21 und unterscheiden sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil. Dies können Polynukleotide sein, die zu obigen Sequenzen in mindestens etwa 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80% oder 90%, vorzugsweise in mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Sequenzpositionen identisch sind. Further nucleic acid sequences according to the invention are derived from SEQ ID NO: 21 and differ from each other in addition, substitution, insertion or deletion several nucleotides, but continue to code for polypeptides with the desired one Property profile. These can be polynucleotides that link to the above sequences in at least about 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80% or 90%, preferably in at least about 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of the sequence positions are identical.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eines speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z. B. Allelvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d. h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen. Such nucleic acid sequences, the so-called include silent mutations or according to the codon usage of a specific one Origin or host organism compared to a specific sequence are changed, as well as naturally occurring variants, such as. B. allele variants thereof. It is also subject to conservative nucleotide substitutions (i.e. the one in question Amino acid is replaced by an amino acid of the same charge, size, polarity and / or Solubility Replaces) available sequences.

Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5% in der Nukleotidsequenz eines Gens. The invention also specifically relates to sequence polymorphisms disclosed nucleic acid derived molecules. These genetic polymorphisms can vary between individuals within a population due to natural variation exist. These natural variations usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of a gene.

Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten, kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden. Furthermore, the invention also encompasses nucleic acid sequences which are hybridize coding sequences or are complementary thereto. These polynucleotides can be found by screening genomic or cDNA banks and if necessary, multiply from it with suitable primers by means of PCR and then isolate with suitable probes, for example. Another option is the Transformation of suitable microorganisms with polynucleotides according to the invention or Vectors, the multiplication of the microorganisms and thus the polynucleotides and their subsequent insulation. In addition, polynucleotides according to the invention can also can be synthesized chemically.

Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide "hybridisieren" zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50-70°C, vorzugsweise 60-65°C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1 × SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20 × SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z. B. in Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben. The property of being able to "hybridize" to polynucleotides means those Ability of a poly or oligonucleotide under stringent conditions to almost to bind complementary sequence while non-specific under these conditions There are no ties between non-complementary partners. To do this, the Sequences to be 70-100%, preferably 90-100%, complementary. The property complementary sequences, to be able to bind to each other specifically, are made for example in the Northern or Southern blot technique or in the primer binding in Use PCR or RT-PCR. Usually, oligonucleotides with a length of 30 base pairs used. Stringent conditions are understood, for example, in the Northern blot technique the use of a 50-70 ° C, preferably 60-65 ° C warm washing solution, for example 0.1 × SSC buffer with 0.1% SDS (20 × SSC: 3 M NaCl, 0.3 M Na citrate, pH 7.0) for the elution of non-specifically hybridized cDNA probes or Oligonucleotides. As mentioned above, only a very large number of complementary ones remain Nucleic acids bound together. The setting of stringent conditions is that Known expert and is such. B. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989) 6.3.1-6.3.6. described.

d) Isolierung der kodierenden metK-Gene und anderer Gened) isolation of the coding metK genes and other genes

Die für das Enzym S-Adenosylmethionin-Synthase (EC 2.5.1.6) kodierenden metK-Gene sind in an sich bekannter Weise isolierbar. The metK genes coding for the enzyme S-adenosylmethionine synthase (EC 2.5.1.6) can be isolated in a manner known per se.

Zur Isolierung der metK-Gene oder auch anderer Gene anderer Organismen wird zunächst eine Genbank dieses Organsimus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern ausführlich beschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: "Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie" (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E.-coli-K- 12-Stammes W3110, die von Kohara et al. ("Cell", 50, 495-508 (198)) in λ-Vektoren angelegt wurde. For the isolation of the metK genes or other genes of other organisms is first a gene bank of this organism was created in Escherichia coli (E. coli). The creation of Genebanks are detailed in well-known textbooks and manuals described. An example is the textbook by Winnacker: "Genes and clones, one Introduction to genetic engineering "(Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990) or the Manual by Sambrook et al .: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A very well-known gene bank is that of E. coli K 12 strain W3110 by Kohara et al. ("Cell", 50, 495-508 (198)) in λ vectors has been.

Zur Herstellung einer Genbank in E. coli können Cosmide, wie der Cosmidvektor SuperCos I (Wahl et al. (1987), "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA 84: 2160-2164), aber auch Plasmide, wie pBR322 (Bolivar; "Life Sciences", 25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, "Gene", 19: 259-268), verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E.-coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. ("Proceedings of the National Academy of Sciences", USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten, langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. ("Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America", 74: 5463-5467, 1977) beschrieben ist. To produce a gene bank in E. coli, cosmids, such as the cosmid vector SuperCos I (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84: 2160-2164), but also plasmids such as pBR322 (Bolivar; "Life Sciences", 25, 807-818 (1979)) or pUC9 (Vieira et al., 1982, "Gene", 19: 259-268) can be used. Are particularly suitable as hosts those E. coli strains that are defective in restriction and recombination. An example of this is the strain DH5αmcr, which was developed by Grant et al. ("Proceedings of the National Academy of Sciences ", USA, 87 (1990) 4645-4649). With the help of cosmids cloned, long DNA fragments can then in turn be used for the Sequencing suitable vectors are subcloned and then sequenced, so how it z. B. Sanger et al. ("Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America ", 74: 5463-5467, 1977).

Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen, wie z. B. dem von Staden ("Nucleic Acids Research" (1986) 14, 217-232), dem von Marck ("Nucleic Acids Research" (1988) 16, 1829-1836) oder dem GCG-Programm von Butler ("Methods of Biochemical Analysis" (1998) 39, 74-97), untersucht werden. The DNA sequences obtained can then be used with known algorithms or Sequence analysis programs, such as B. that of Staden ("Nucleic Acids Research" (1986) 14, 217-232), that of Marck ("Nucleic Acids Research" (1988) 16, 1829-1836) or that GCG program by Butler ("Methods of Biochemical Analysis" (1998) 39, 74-97) become.

Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide für Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. ("International Journal of Systematic Bacteriology" (1991) 41: 255-260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: "Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994). Instructions on how to identify DNA sequences using hybridization can be found at Expert among others in the manual "The DIG System Users Guide for Filters Hybridization "from Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) and in Liebl et al. ("International Journal of Systematic Bacteriology" (1991) 41: 255-260). Instructions for amplifying DNA sequences using the polymerase chain reaction The person skilled in the art will find (PCR) in the Gait handbook, inter alia: synthesis: A Practical Approach "(IRL Press, Oxford, UK, 1984) and by Newton and Graham: "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994).

Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (1987), "Journal of Bacteriology", 169: 751-757, bei O'Regan et al. (1989) "Gene", 77: 237-251, bei Sahin-Toth et al. (1994), "Protein Sciences" 3: 240-247, bei Hochuli et al. (1988), "Biotechnology" 6: 1321-1325 und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. It is also known that changes in the N- and / or C-terminus of a protein thereof Can not significantly impair function or even stabilize. Information about this the expert finds among others in Ben-Bassat et al. (1987), Journal of Bacteriology, 169: 751-757, O'Regan et al. (1989) "Gene", 77: 237-251, in Sahin-Toth et al. (1994) "Protein Sciences" 3: 240-247, by Hochuli et al. (1988), "Biotechnology" 6: 1321-1325 and in well-known textbooks of genetics and molecular biology.

e) Erfindungsgemäß verwendete Wirtszellene) Host cells used according to the invention

Für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet man vorzugsweise coryneforme Bakterien, deren verringerte metK-Aktivität über wenigstens eine der folgenden Eigenschaften nachweisbar ist:

  • a) einen im Vergleich zum Wildtyp-Stamm geringeren, intrazellulären S- Adenosylmethionin-Titer;
  • b) eine geringere, intrazelluläre S-Adenosylmethionin-Synthase-Konzentration (weniger S-Adenosylmethionin-Synthase, bezogen auf Gesamtprotein); oder
  • c) eine geringere, intrazelluläre S-Adenosylmethionin-Synthase-Aktivität (weniger S- Adenosylmethionin-Synthase-Enzymaktivität, bezogen auf S-Adenosylmethionin- Synthase-Proteingehalt.
For the process according to the invention, preference is given to using coryneform bacteria whose reduced metK activity can be detected via at least one of the following properties:
  • a) a lower, intracellular S-adenosylmethionine titer compared to the wild-type strain;
  • b) a lower, intracellular S-adenosylmethionine synthase concentration (less S-adenosylmethionine synthase, based on total protein); or
  • c) a lower, intracellular S-adenosylmethionine synthase activity (less S-adenosylmethionine synthase enzyme activity, based on S-adenosylmethionine synthase protein content).

Sämliche dieser Eigenschaften sind in einfacher Weise vom Fachmann, gegebenenfalls unter Heranziehung der vorliegenden Beschreibung, bestimmbar. All of these properties are in a simple manner by a person skilled in the art, if appropriate using the present description, determinable.

Weitere Gegenstände der Erfindung betreffen insbesondere als Wirtszelle dienende Mikroorganismen, insbesondere coryneforme Bakterien, die einen Vektor, insbesondere Pendelvektor oder Plasmidvektor, der wenigstens ein metK-Gen erfindungsgemäßer Definition trägt, enthalten, oder in denen ein erfindungsgemäßes metK-Gen mit verringerter Aktivität exprimiert ist. Further objects of the invention relate in particular to serving as a host cell Microorganisms, especially coryneform bacteria, that have a vector, in particular Pendulum vector or plasmid vector, the at least one metK gene according to the invention Definition carries, contain, or in which an inventive metK gene with reduced Activity is expressed.

Diese Mikroorganismen können schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Vorzugsweise sind dies coryneforme Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium. Aus der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren. These microorganisms can contain sulfur-containing fine chemicals, especially L-methionine, from glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose or from Make glycerin and ethanol. These are preferably coryneform bacteria, especially the genus Corynebacterium. Is from the genus Corynebacterium in particular to name the species Corynebacterium glutamicum, which is known in the professional world for their Ability to produce L-amino acids is known.

Als Beispiele für geeignete Stämme coryneformer Bakterien sind solche der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), wie:
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
oder der Gattung Brevibacterium, wie:
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
zu nennen
oder davon abgeleitete Stämme, wie:
Corynebacterium glutamicum KFCC10065
Corynebacterium glutamicum ATCC21608
welche ebenfalls die gewünschte Feinchemikalie oder deren Vorstufe(n) produzieren, aufgeführt. (KFCC = Korean Federation of Culture Collection; ATCC = American Type Culture Collection). Examples of suitable strains of coryneform bacteria are those of the genus Corynebacterium, in particular of the species Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), such as:
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
or the genus Brevibacterium, such as:
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 and
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
to call
or strains derived therefrom, such as:
Corynebacterium glutamicum KFCC10065
Corynebacterium glutamicum ATCC21608
which also produce the desired fine chemical or its precursor (s). (KFCC = Korean Federation of Culture Collection; ATCC = American Type Culture Collection).

f) Durchführung der erfindungsgemäßen Fermentationf) carrying out the fermentation according to the invention

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass coryneforme Bakterien nach Expression eines erfindungsgemäßen metK-Gens in vorteilhafter Weise schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, produzieren. According to the invention it was found that coryneform bacteria after expression of a metK gene according to the invention advantageously sulfur-containing fine chemicals, especially L-methionine.

Um die Aktivität oder Menge eines Enzyms, z. B. der S-Adenosylmethionin-Synthase, metK, zu verringern, kann der Fachmann unterschiedliche Maßnahmen einzeln oder in Kombinationen ausführen. Durch Reduktion der Transkriptionshäufigkeit des Gens, das für das erfindungsgemäße Protein kodiert, kann die Konzentration des betreffenden Proteins gesenkt werden. Dies kann der Fachmann durch Veränderung oder Austausch der Promotor- oder Regulationsregion sowie der Ribosomenbindungsstelle des kodierenden Gens erreichen. Stromab der kodierenden Region kann der Fachmann Terminatoren verändern oder Sequenzen einfügen, die zu einer verringerten Stabilität des Transkriptes führen. Diese, die Lebensdauer der mRNA verringernden Maßnahmen ermöglichen, die Expression des zugehörigen Proteins und damit seine Konzentration abzusenken. To determine the activity or amount of an enzyme, e.g. B. S-adenosylmethionine synthase, metK, to reduce, the expert can take different measures individually or in Execute combinations. By reducing the frequency of transcription of the gene responsible for the protein of the invention encodes the concentration of the protein in question be lowered. The person skilled in the art can do this by changing or exchanging the Promoter or regulatory region and the ribosome binding site of the coding Reach gens. Downstream of the coding region, the person skilled in the art can use terminators alter or insert sequences that lead to reduced stability of the transcript to lead. These measures, which reduce the lifespan of the mRNA, enable Expression of the associated protein and thus lower its concentration.

Auf der Ebene des exprimierten Enzyms können fusionierte Sequenzen zu einer erhöhten Abbaurate und damit ebenfalls zu einer Absenkung der Konzentration des Proteins führen. Außerdem kann der Fachmann durch gezielte oder ungerichtete Mutagenese des kodierenden Gens die Aktivität, die Substrataffinität und die Substratspezifität verändern. Enzyme können durch Mutationen in den korrespondierenden Genen derart in ihrer Aktivität beeinflußt werden, dass es zu einer teilweisen oder vollständigen Verringerung der Reaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion kommt. Beispiele für solche Mutationen sind dem Fachmann bekannt (Motoyama H. Yano H. Terasaki Y. Anazawa H. "Applied & Environmental Microbiology", 67: 3064-70, 2001, Eikmanns BJ. Eggeling L. Sahm H. Antonie von Leeuwenhoek. 64: 145-63, 1993-94) Mutanten des Proteins können auch zu verringerter oder verhinderter Homo- oder Heteromultimerisierung von Enzymkomplexen und damit ebenfalls zu einer Verschlechterung der enzymatischen Eigenschaften führen. At the level of the expressed enzyme, fused sequences can increase Degradation rate and thus also lead to a decrease in the concentration of the protein. In addition, the person skilled in the art can use targeted or undirected mutagenesis of the coding gene change the activity, the substrate affinity and the substrate specificity. Enzymes can be so mutated in the corresponding genes in their activity be influenced that there is a partial or complete reduction in the Reaction speed of the enzymatic reaction comes. Examples of such Mutations are known to the person skilled in the art (Motoyama H. Yano H. Terasaki Y. Anazawa H. "Applied & Environmental Microbiology", 67: 3064-70, 2001, Eikmanns BJ. Eggeling L. Sahm H. Antonie by Leeuwenhoek. 64: 145-63, 1993-94) mutants of the protein can also reduced or prevented homo- or heteromultimerization of enzyme complexes and thus also lead to a deterioration in the enzymatic properties.

Solchermaßen veränderte Gene können entweder in Plasmiden oder bevorzugt im Chromosom integriert vorliegen. Dabei kann das ursprüngliche, nicht auf diese Art veränderte Gen noch zusätzlich vorhanden sein, bevorzugt aber gegen das veränderte Gen ausgetauscht sein. Such modified genes can either in plasmids or preferably in Chromosome integrated. The original, not in this way modified gene may also be present, but is preferred to the modified gene be exchanged.

Um die Aktivität eines Enzyms, z. B. der S-Adenosylmethionin-Synthase (metK), gemessen in einem coryneformen Bakterium, zu verringern, kann es ausreichend sein, Gene, die für funktionale Äquivalente, wie künstlich hergestellte Mutanten oder natürliche Homologe aus anderen Organsimen kodieren, zu exprimieren. Dabei kann das ursprüngliche Gen noch zusätzlich vorhanden sein, bevorzugt aber gegen das veränderte oder homologe Gen ausgetauscht sein. To the activity of an enzyme, e.g. B. S-adenosylmethionine synthase (metK), measured in a coryneform bacterium, it may be sufficient to reduce genes responsible for functional equivalents, such as artificially produced mutants or natural homologs encode other organisms to express. The original gene can still additionally present, but preferably against the modified or homologous gene be exchanged.

Zusätzlich kann es für die Produktion von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L- Methionin, durch Fermentation in coryneformen Bakterien, vorteilhaft sein, neben einer Expression eines erfindungsgemäßen metK-Gens eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, des Cystein-Stoffwechselwegs, der Aspartatsemialdehyd-Synthese, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Pentose-Phosphat-Stoffwechsels, des Zitronensäure-Zyklus oder des Aminosäure-Exports zu verstärken. It can also be used for the production of sulfur-containing fine chemicals, especially L- Methionine, by fermentation in coryneform bacteria, may be beneficial in addition to one Expression of a metK gene according to the invention one or more enzymes of the respective Biosynthetic pathway, the cysteine pathway, the aspartate semialdehyde synthesis, the Glycolysis, anaplerotic, pentose-phosphate metabolism, the citric acid cycle or to increase the export of amino acids.

So kann für die Herstellung von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, eines oder mehrere der folgenden Gene verstärkt sein:

  • - das für eine Aspartatkinase kodierende Gen lysC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281),
  • - das für eine Aspartat-Semialdehyd kodierende Gen asd (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 282),
  • - das für die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
  • - das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
  • - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
  • - das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
  • - das für die Homoserin-O-Acetyltransferase kodierende Gen metA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 725),
  • - das für die Cystahionin-gamma-Synthase kodierende Gen metB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3491),
  • - das für die Cystahionin-gamma-Lyase kodierende Gen metC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061),
  • - das für die Methionin-Synthase kodierende Gen metH (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663),
  • - das für die Serin-Hydroxymethyltransferase kodierende Gen glyA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 1110),
  • - das für die O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase kodierende Gen metY (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726),
  • - das für die Methylentetrahydrofolat-Reduktase kodierende Gen metF (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379),
  • - das für die Phosphoserin-Aminotransferase kodierende Gen serC (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 928)
  • - ein für die Phosphoserin-Phosphatase kodierendes Gen serB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767)
  • - das für die Serine-Acetyl-Transferase kodierende Gen cysE (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818)
  • - das für die Cystein-Synthase kodierende Gen cysK (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817),
  • - das für eine Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 1306)
For example, one or more of the following genes can be amplified for the production of sulfur-containing fine chemicals, in particular L-methionine:
  • the gene coding for an aspartate kinase lysC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281),
  • the gene asd coding for an aspartate semialdehyde (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 282),
  • the gene gap coding for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
  • the gene pgk coding for the 3-phosphoglycerate kinase (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
  • the pyc gene coding for pyruvate carboxylase (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
  • the gene tpi coding for the triose phosphate isomerase (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
  • the gene metA coding for the homoserine O-acetyltransferase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 725),
  • the metB gene coding for cystahionin gamma synthase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 3491),
  • the metC gene coding for the cystahionin gamma lyase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 3061),
  • the gene coding for the methionine synthase metH (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663),
  • the glyA gene coding for the serine hydroxymethyltransferase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 1110),
  • the metY gene coding for the O-acetylhomoserine sulfhydrylase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726),
  • the gene coding for methylene tetrahydrofolate reductase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379),
  • the serC gene coding for phosphoserine aminotransferase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 928)
  • a gene coding for the phosphoserine phosphatase serB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767)
  • - The gene coding for the serine acetyl transferase cysE (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818)
  • the gene coding for the cysteine synthase cysK (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817),
  • the gene coding for a homoserine dehydrogenase hom (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 1306)

So kann für die Herstellung von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin in coryneformen Bakterien, vorteilhaft sein, gleichzeitig wenigstens eines der nachfolgenden Gene zu mutieren, so dass die korrespondierenden Proteine, verglichen mit nicht mutierten Proteinen, in geringerem Maße oder nicht durch einen Stoffwechselmetaboliten in ihrer Aktivität beeinflusst werden oder so, dass ihre spezifische Aktivität gesteigert wird:

  • - das für eine Aspartatkinase kodierende Gen lysC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281),
  • - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
  • - das für die Homoserin-O-Acetyltransferase kodierende Gen metA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 725),
  • - das für die Cystahionin-gamma-Synthase kodierende Gen metB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3491),
  • - das für die Cystahionin-gamma-Lyase kodierende Gen metC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061),
  • - das für die Methionin-Synthase kodierende Gen metH (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663),
  • - das für die Serin-Hydroxymethyltransferase kodierende Gen glyA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 1110),
  • - das für die O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase kodierende Gen metY (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726),
  • - das für die Methylentetrahydrofolat-Reduktase kodierende Gen metF (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379),
  • - das für die Phosphoserin-Aminotransferase kodierende Gen serC (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 928)
  • - ein für die Phosphoserin-Phosphatase kodierendes Gen serB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767)
  • - das für die Serine-Acetyl-Transferase kodierende Gen cysE (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818)
  • - das für die Cystein-Synthase kodierende Gen cysK (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817),
  • - das für eine Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 1306)
Thus, for the production of sulfur-containing fine chemicals, in particular L-methionine in coryneform bacteria, it can be advantageous to mutate at least one of the following genes at the same time, so that the corresponding proteins, to a lesser extent or not by a metabolic metabolite, compared to non-mutated proteins be influenced by their activity or in such a way that their specific activity is increased:
  • the gene coding for an aspartate kinase lysC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281),
  • the pyc gene coding for pyruvate carboxylase (Eikmanns (1992), "Journal of Bacteriology", 174: 6076-6086),
  • the gene metA coding for the homoserine O-acetyltransferase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 725),
  • the metB gene coding for cystahionin gamma synthase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 3491),
  • the metC gene coding for the cystahionin gamma lyase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 3061),
  • the gene coding for the methionine synthase metH (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663),
  • the glyA gene coding for the serine hydroxymethyltransferase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 1110),
  • the metY gene coding for the O-acetylhomoserine sulfhydrylase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726),
  • the gene coding for methylene tetrahydrofolate reductase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379),
  • the serC gene coding for phosphoserine aminotransferase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 928)
  • a gene coding for phosphoserine phosphatase serB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767)
  • - The gene coding for the serine acetyl transferase cysE (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818)
  • the gene coding for the cysteine synthase cysK (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817),
  • the gene coding for a homoserine dehydrogenase hom (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 1306)

Weiterhin kann es für die Produktion von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L- Methionin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Expression eines der erfindungsgemäßen metK- Gene eines oder mehrere der folgenden Gene abzuschwächen, insbesondere deren Expression zu verringern, oder auszuschalten:

  • - das für die Homoserine-Kinase kodierende Gen thrB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3453)
  • - das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2328)
  • - das für die Threonin-Synthase kodierende Gen thrC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3486)
  • - das für die Meso-Diaminopimelat-D-Dehydrogenase kodierende Gen ddh (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3494)
  • - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3157)
  • - das für die Glucose-6-Phosphat-6-Isomerase kodierende Gen pgi (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 950)
  • - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2873)
  • - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3476)
  • - das für die Dihydrodipicolinat-Reduktase kodierende Gen dapB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3477)
  • - das für die Diaminopicolinat-Decarboxylase kodierende Gen lysA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3451)
In addition, for the production of sulfur-containing fine chemicals, in particular L-methionine, it may be advantageous, in addition to the expression of one of the metK genes according to the invention, to weaken one or more of the following genes, in particular to reduce their expression or to switch them off:
  • the gene coding for the homoserine kinase thrB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3453)
  • - The gene coding for threonine dehydratase ilvA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2328)
  • the thrC gene coding for the threonine synthase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3486)
  • - The gene ddh coding for the mesodiaminopimelate D-dehydrogenase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3494)
  • - The gene pck coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3157)
  • - The pgi gene coding for glucose-6-phosphate-6-isomerase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 950)
  • - The poxB gene coding for pyruvate oxidase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2873)
  • - The gene dapA coding for the dihydrodipicolinate synthase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3476)
  • - The gene dapB coding for the dihydrodipicolinate reductase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 3477)
  • - The lysA gene coding for the diaminopicolinate decarboxylase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 3451)

Weiterhin kann es für die Produktion von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L- Methionin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Expression eines der erfindungsgemäßen metK- Gene in coryneformen Bakterien gleichzeitig wenigstens eines der folgenden Gene so zu mutieren, dass die enzymatische Aktivität des korrespondierenden Proteins teilweise oder vollständig verringert wird:

  • - das für die Homoserine-Kinase kodierende Gen thrB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3453)
  • - das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2328)
  • - das für die Threonin-Synthase kodierende Gen thrC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3486)
  • - das für die Meso-Diaminopimelat-D-Dehydrogenase kodierende Gen ddh (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3494)
  • - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3157)
  • - das für die Glucose-6-Phosphat-6-Isomerase kodierende Gen pgi (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 950)
  • - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2873)
  • - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3476)
  • - das für die Dihydrodipicolinat-Reduktase kodierende Gen dapB (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3477)
  • - das für die Diaminopicolinat-Decarboxylase kodierende Gen lysA (EP 1 108 790 A2; DNA- SEQ NO. 3451)
Furthermore, it may be advantageous for the production of sulfur-containing fine chemicals, in particular L-methionine, to mutate at least one of the following genes simultaneously in addition to the expression of one of the metK genes according to the invention in coryneform bacteria in such a way that the enzymatic activity of the corresponding protein is partially or completely is reduced:
  • the gene coding for the homoserine kinase thrB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3453)
  • - The gene coding for threonine dehydratase ilvA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2328)
  • the thrC gene coding for the threonine synthase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3486)
  • - The gene ddh coding for the mesodiaminopimelate D-dehydrogenase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3494)
  • - The gene pck coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3157)
  • - The pgi gene coding for glucose-6-phosphate-6-isomerase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 950)
  • - The poxB gene coding for pyruvate oxidase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2873)
  • - The gene dapA coding for the dihydrodipicolinate synthase (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3476)
  • - The gene dapB coding for the dihydrodipicolinate reductase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 3477)
  • - The lysA gene coding for the diaminopicolinate decarboxylase (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ NO. 3451)

Weiterhin kann es für die Produktion von schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L- Methionin, vorteilhaft sein, neben der Expression eines erfindungsgemäßen metK-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: "Overproduction of Microbial Products", Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). It can also be used for the production of sulfur-containing fine chemicals, especially L- Methionine, be advantageous in addition to the expression of a metK gene according to the invention to eliminate undesirable side reactions (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms ", in:" Overproduction of Microbial Products ", Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Zur Erzielung einer Überexpression kann der Fachmann unterschiedliche Maßnahmen einzeln oder in Kombination ergreifen. So kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlauf der fermentativen L-Methionin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. The person skilled in the art can take various measures to achieve overexpression take individually or in combination. So the copy number of the corresponding genes can be increased, or it can be the promoter and regulatory region or the Ribosome binding site located upstream of the structural gene can be mutated. Expression cassettes which act upstream of the structural gene act in the same way to be built in. By inducible promoters it is also possible to increase expression increase in the course of fermentative L-methionine production. Through measures to Extending the life of the mRNA also improves expression. Furthermore, by preventing the breakdown of the enzyme protein Enzyme activity increased. The genes or gene constructs can either be found in plasmids different number of copies are present or integrated and amplified in the chromosome. Alternatively, overexpression of the genes in question by alteration can continue media composition and culture management.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. ("Biotechnology", 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. ("Gene", 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga ("Bio/Technology", 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. ("Gene", 102, 93-98 (1991)), in der EP 0472869, in US 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler ("Biotechnology", 9, 84-87 (1991), bei Remscheid et al. ("Applied and Environmental Microbiology", 60, 126-132 (1994), bei LaBarre et al. ("Journal of Bacteriology", 175, 1001-1007 (1993)), in der WO 96/15246, bei Malumbres et al. ("Gene", 134, 15-24 (1993)), in der JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer ("Biotechnology and Bioengineering", 58,. 191-195 (1998)), bei Makrides ("Microbiological Reviews", 60: 512-538 (1996) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Instructions for this can be found by Martin et al. ("Biotechnology", 5, 137-146 (1987)), by Guerrero et al. ("Gene", 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga ("Bio / Technology", 6, 428-430 (1988)), by Eikmanns et al. ("Gene", 102, 93-98 (1991)), in EP 0472869, in U.S. 4,601,893 to Schwarzer and Pühler ("Biotechnology", 9, 84-87 (1991)) Remscheid et al. ("Applied and Environmental Microbiology", 60, 126-132 (1994), at LaBarre et al. ("Journal of Bacteriology", 175, 1001-1007 (1993)), in WO 96/15246, at Malumbres et al. ("Gene", 134, 15-24 (1993)), in JP-A-10-229891, by Jensen and Hammer ("Biotechnology and Bioengineering", 58, 191-195 (1998)), at Makrides ("Microbiological Reviews ", 60: 512-538 (1996) and in well-known textbooks of genetics and Molecular biology.

Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte. Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen, kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'- stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche, regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer "operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Aktivierungssequenzen sowie Enhancer und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete, regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology", 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990). The invention therefore also relates to expression constructs containing the genetic control of regulatory nucleic acid sequences one for an inventive Nucleic acid sequence encoding polypeptide and vectors comprising at least one of these expression constructs. Preferably include those of the invention Constructs a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and 3'- downstream a terminator sequence and, if appropriate, further customary, regulatory ones Elements, each operatively linked to the coding sequence. Under one "operative linkage" means the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and optionally other regulatory elements such that each of the regulatory elements has its role in the expression of the coding Can fulfill sequence as intended. Examples of sequences that can be linked operatively are activation sequences as well as enhancers and the like. Other regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication and like. Suitable regulatory sequences are e.g. B. described in Goeddel, "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990).

Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt, es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert, und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein. In addition to the artificial regulatory sequences, the natural Regulatory sequence before the actual structural gene is still present. By genetic modification can switch this natural regulation off if necessary and the expression of the genes can be increased or decreased. The gene construct can also be constructed more simply, that is, there are no additional regulation signals the structural gene is inserted, and the natural promoter with its regulation will not away. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that none Regulation takes place more and the gene expression is increased or decreased. The Nucleic acid sequences can be contained in one or more copies in the gene construct his.

Beispiele für brauchbare Promotoren sind: die Promotoren, ddh, amy, lysC, dapA, lysA aus Corynebacterium glutamicum, aber auch gram-positiven Promotoren SPO2, wie sie in "Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives", Sonenshein, Abraham L.,Hoch, James A., Losick, Richard; ASM Press, District of Columbia, Washington und Patek M. Eikmanns BJ. Patek J. Sahm H. "Microbiology", 142, 1297-309, 1996 beschrieben sind, oder aber auch cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, I-PR- oder im I-PL- Promotor, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Bevorzugt ist auch die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z. B. licht- und insbesondere temperaturinduzierbarer Promotoren, wie der PrPl-Promotor. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden. Examples of useful promoters are: the promoters, ddh, amy, lysC, dapA, lysA from Corynebacterium glutamicum, but also gram-positive promoters SPO2, as described in "Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives", Sonenshein, Abraham L., Hoch, James A., Losick, Richard; ASM Press, District of Columbia, Washington and Patek M. Eikmanns BJ. Patek J. Sahm H. "Microbiology", 142, 1297-309, 1996, or else cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac- , laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, I-PR or in the I-PL promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria. Also preferred is the use of inducible promoters, such as. B. light- and in particular temperature-inducible promoters, such as the P r P l promoter. In principle, all natural promoters with their regulatory sequences can be used. In addition, synthetic promoters can also be used advantageously.

Die genannten, regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. The regulatory sequences mentioned are intended for the targeted expression of the Enable nucleic acid sequences and protein expression. This can happen, for example according to host organism mean that the gene is only expressed after induction or is overexpressed, or that it is immediately expressed and / or overexpressed.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression negativ beeinflussen und dadurch verringern. So kann eine Abschwächung auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem schwache Transkriptionssignale, wie Promotoren und/oder "Enhancer", verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Abschwächung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verringert wird. The regulatory sequences or factors can preferably be the expression influence negatively and thereby reduce. So a weakening on the Transcription levels are done by using weak transcription signals, such as promoters and / or "enhancers" can be used. But there is also a weakening of Translation possible, for example by reducing the stability of the mRNA.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale, wie Promotoren und/oder "Enhancer", verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. The regulatory sequences or factors can preferably be the expression influence positively and thereby increase or decrease. So can reinforce the regulatory elements advantageously take place at the transcription level by strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers" can be used. In addition, an increase in translation is also possible, for example, by Stability of the mRNA is improved.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors, einer geeigneten Shine-Dalgarnow-Sequenz mit einer metK-Nukleotidsequenz sowie einem geeigneten Terminationssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in "Current Protocols in Molecular Biology", 1993, John Wiley & Sons, Incorporated, New York, New York, "PCR Methods", Gelfand, David H., Innis, Michael A., Sinsky, John J. 1999, Academic Press, Incorporated, California, San Diego,., "PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology Ser.", Vol. 192, 2nd ed., Humana Press, New Jersey, Totowa. T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, "Experiments with Gene Fusions", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) und in Ausubel, F. M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. An expression cassette is produced by fusion of a suitable promoter, a suitable Shine-Dalgarnow sequence with a metK nucleotide sequence and one suitable termination signal. Common recombination and Cloning techniques, such as those used in "Current Protocols in Molecular Biology", 1993, John Wiley & Sons, Incorporated, New York, New York, "PCR Methods," Gelfand, David H., Innis, Michael A., Sinsky, John J. 1999, Academic Press, Incorporated, California, San Diego,., "PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology Ser.", Vol. 192, 2nd ed., Humana Press, New Jersey, Totowa. T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and in T. J. Silhavy, M. L. Berman and L. W. Enquist, "Experiments with Gene Fusions ", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) and in Ausubel, F. M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam - New York - Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. The recombinant nucleic acid construct or gene construct is used for expression in a suitable host organism is advantageously inserted into a host-specific vector, which enables optimal expression of the genes in the host. Vectors are known to the person skilled in the art well known and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., ed., Elsevier, Amsterdam - New York - Oxford, 1985). Among vectors are in addition to plasmids, all other vectors known to the person skilled in the art, such as, for example Phages, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA too understand. These vectors can replicate autonomously in the host organism or chromosomally be replicated.

Erfindungsgemäße metK-Gene werden beispielhaft mit Hilfe von episomalen Plasmiden exprimiert. Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie z. B. pZ1 (Menkel et al., "Applied and Environmental Microbiology" (1989), 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., "Gene" 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., "Gene" 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren, wie z. B. pCLiK5MCS, SEQ ID NO: 9, oder solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160) oder pNG2 (Serwold-Davis et al., "FEMS Microbiology Letters", 66, 119-124 (1990)) oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden. MetK genes according to the invention are exemplified with the aid of episomal plasmids expressed. Suitable plasmids are those which are replicated in coryneform bacteria. Numerous known plasmid vectors, such as. B. pZ1 (Menkel et al., "Applied and Environmental Microbiology "(1989), 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al.," Gene "102: 93-98 (1991)) or pHS2-1 (Sonnen et al., "Gene" 107: 69-74 (1991)) are based on the cryptic Plasmids pHM1519, pBL1 or pGA1. Other plasmid vectors, such as. B. pCLiK5MCS, SEQ ID NO: 9, or those based on pCG4 (US-A 4,489,160) or pNG2 (Serwold-Davis et al., "FEMS Microbiology Letters", 66, 119-124 (1990)) or pAG1 (US-A 5,158,891), can be used in the same way.

Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Remscheid et al. ("Applied and Environmental Microbiology", 60, 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., "Bio/Technology", 1,784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., "Gene", 145,69-73 (1994)), Bernard et al., "Journal of Molecular Biology", 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, "Journal of Bacteriology", 173: 4510-4516) oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, "Gene", 41: 337-342) in Frage. Andere Plasmidvektoren, wie z. B. pCLiK5MCS integrativ sacB, SEQ ID NO: 12, können in gleicher Weise verwendet werden. Also suitable are those plasmid vectors with the aid of which the method of Can apply gene amplification through integration into the chromosome, just like it does for example by Remscheid et al. ("Applied and Environmental Microbiology", 60, 126-132 (1994)) for the duplication or amplification of the hom-thrB operon. at In this method, the complete gene is cloned into a plasmid vector that is in a host (typically E. coli), but cannot replicate in C. glutamicum. Come as vectors for example pSUP301 (Simon et al., "Bio / Technology", 1,784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schaefer et al., "Gene", 145, 69-73 (1994)), Bernard et al., "Journal of Molecular Biology ", 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991," Journal of Bacteriology ", 173: 4510-4516) or pBGS8 (Spratt et al., 1986, "Gene", 41: 337-342) in question. Other Plasmid vectors, e.g. B. pCLiK5MCS integrative sacB, SEQ ID NO: 12, can be used in the same Way to be used.

Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. ("Applied Microbiology and Biotechnology", 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan ("Biotechnology", 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. ("FEMS Microbiological Letters", 123, 343-347 (1994)) beschrieben. The plasmid vector which contains the gene to be amplified is then by Transformation into the desired strain of C. glutamicum. Methods of Transformation are, for example, in Thierbach et al. ("Applied Microbiology and Biotechnology ", 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (" Biotechnology ", 7, 1067-1070 (1989)) and Tauch et al. ("FEMS Microbiological Letters", 123, 343-347 (1994)).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch(Zulaufverfahren)oder repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zur Produktion von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel ("Bioprozeßtechnik, 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav-Fischer-Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas ("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen" (Vieweg-Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden. The microorganisms produced according to the invention can be continuous or discontinuously in batch process (set cultivation) or in fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) for the production of sulfur-containing fine chemicals, especially L-methionine, can be cultivated. A A summary of well-known cultivation methods is in Chmiel's textbook ("Bioprocess engineering, 1st introduction to bioprocess engineering" (Gustav-Fischer-Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas ("Bioreactors and peripheral facilities" (Vieweg-Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).

Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. The culture medium to be used suitably meets the requirements of the respective Enough tribes. Descriptions of culture media from various microorganisms are in the American Society's "Manual of Methods for General Bacteriology" Bacteriology (Washington DC, USA, 1981).

Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente. These media which can be used according to the invention usually comprise one or more Carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or Trace elements.

Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette, wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett; Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure; Alkohole, wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol, und organische Säuren, wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure. Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides. Very good Carbon sources are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, Sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose. you Sugar can also have complex compounds, such as molasses, or other by-products give the sugar refining to the media. Mixtures may also be advantageous different carbon sources. Other possible carbon sources are oils and fats such as B. Soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil; Fatty acids such as B. Palmitic acid, stearic acid or linoleic acid; Alcohols such as B. glycerol, methanol or Ethanol, and organic acids such as e.g. B. acetic acid or lactic acid.

Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or Materials that contain these compounds. Exemplary nitrogen sources include Ammonia gas or ammonium salts, such as ammonium sulfate, ammonium chloride, Ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, Amino acids or complex nitrogen sources, such as corn steep liquor, soy flour, soy protein, Yeast extract, meat extract and others. The nitrogen sources can be used individually or as Mixture can be used.

Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen. Inorganic salt compounds that may be included in the media include those Chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, Potassium, manganese, zinc, copper and iron.

Als Schwefelquelle für die Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere von Methionin, können anorganische, schwefelhaltige Verbindungen, wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide, aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden. As a sulfur source for the production of sulfur-containing fine chemicals, in particular of methionine, inorganic, sulfur-containing compounds, such as Sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides, but also organic Sulfur compounds such as mercaptans and thiols can be used.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or Dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts are used become.

Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure. Chelating agents can be added to the medium to dissolve the metal ions hold. Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols such as catechol or Protocatechuat, or organic acids such as citric acid.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietem beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen. The fermentation media used according to the invention usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, for example Biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine include. Growth factors and salts often come from complex media components such as Yeast extract, molasses, corn steep liquor and the like. The culture medium can Suitable precursors are also added. The exact composition of the Media connections depend heavily on the respective experiment and will be for everyone individual case decided individually. Information about media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Growth media can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.

Sämtliche Medienkomponenten werden entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden. All media components are either heated (20 min at 1.5 bar and 121 ° C) or sterilized by sterile filtration. The components can either be together or sterilized separately if necessary. All media components can Be present at the beginning of the cultivation or optionally continuously or in batches be added.

Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experiments konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht läßt sich während der Anzucht durch Zugabe von basischen Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder sauren Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete, selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. The temperature of the culture is usually between 15 ° C and 45 ° C, preferably at 25 ° C to 40 ° C and can be kept constant or changed during the experiment become. The pH of the medium should range from 5 to 8.5, preferably around 7.0 lie. The pH value for the cultivation can be adjusted by adding basic compounds, such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or Ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid check. To control the development of foam, anti-foaming agents, such as. B. Fatty acid polyglycol esters can be used. To maintain the stability of Plasmids can contain suitable, selectively acting substances, such as e.g. B. antibiotics, to be added. To maintain aerobic conditions, oxygen or Oxygen-containing gas mixtures, such as. B. ambient air, entered in the culture. The The temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, and preferably 25 ° C to 40 ° C. The culture is continued until there is a maximum of the desired product has formed. This goal is usually achieved within 10 hours to 160 hours reached.

Die so erhaltenen, insbesondere L-Methionin enthaltenden Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-%. The fermentation broths thus obtained, in particular containing L-methionine, have usually a dry matter of 7.5 to 25% by weight.

Vorteilhaft ist außerdem auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, insbesondere jedoch über mindestens 30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, dass während dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium auf ≥ 0 bis 3 g/l, gehalten, beziehungsweise abgesenkt wird. It is also advantageous if the fermentation, at least at the end, in particular however, the sugar is used for at least 30% of the fermentation time. The means that during this time the concentration of usable sugar in the Fermentation medium is kept at ≥ 0 to 3 g / l, or is lowered.

Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. The fermentation broth is then processed further. Depending on the requirement, the Biomass in whole or in part by separation methods, such as. B. centrifugation, Filtration, decantation or a combination of these methods from the fermentation broth removed or left entirely in it.

Anschließend kann die Fermentationsbrühe mit bekannten Methoden, wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, oder durch Nanofiltration, eingedickt beziehungsweise aufkonzentriert werden. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknung, Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren aufgearbeitet werden. The fermentation broth can then be prepared using known methods, such as, for. B. with help of a rotary evaporator, thin film evaporator, falling film evaporator, by Reverse osmosis, or by nanofiltration, thickened or concentrated become. This concentrated fermentation broth can then by Freeze drying, spray drying, spray granulation or by other methods be worked up.

Es ist aber auch möglich, die schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesonder L-Methionin, weiter aufzureinigen. Hierzu wird die produkthaltige Brühe nach dem Abtrennen der Biomasse einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Produkt oder die Verunreinigungen ganz oder teilweise auf dem Chromatographieharz zurückgehalten werden. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist. However, it is also possible to use the sulfur-containing fine chemicals, especially L-methionine, to further purify. For this, the product-containing broth is removed after the Biomass subjected to chromatography with a suitable resin, the desired product or all or part of the impurities on the Chromatography resin are retained. These chromatography steps can if necessary, be repeated, using the same or different chromatography resins be used. The person skilled in the art is in the selection of the suitable chromatography resins and their most effective application. The purified product can be filtered or ultrafiltration and stored at a temperature at which the Stability of the product is maximum.

Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindung(en) kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtests oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) "Appl. Environ. Microbiol.", 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) "Biotekhnologiya" 11 27-32; und Schmidt et al. (1998), "Bioprocess Engineer.", 19: 67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587; Michal, G. (1999), "Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology", John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987), "Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Bd. 17. The identity and purity of the isolated compound (s) can be determined by techniques of the prior art of technology. These include high performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining methods, thin layer chromatography, NIRS, Enzyme tests or microbiological tests. These analysis methods are summarized in: Patek et al. (1994) "Appl. Environments Microbiol.", 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) "Biotekhnologiya" 11 27-32; and Schmidt et al. (1998), "Bioprocess Engineer.", 19: 67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, p. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 and pp. 581-587; Michal, G. (1999), "Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology ", John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987), "Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology ", vol. 17.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden, nicht-limitierenden Beispiele näher beschrieben:
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse eines radioaktiven metK-Assays, durchgeführt mit Wildtyp-Enzym bzw. C94A-Mutante. The invention is now described in more detail with reference to the following, non-limiting examples:
Fig. 1 shows the results of a radioactive metK assays performed with wild-type enzyme or C94A mutant.

Beispiel 1example 1 Herstellung des Vektors pCLiK5MCSProduction of the vector pCLiK5MCS

Zunächst wurden Ampicillinresistenz und Replikationsursprung des Vektors pBR322 mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. SEQ ID NO: 1 5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3' SEQ ID NO: 2 5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3'
First, ampicillin resistance and origin of replication of the vector pBR322 were amplified with the oligonucleotide primers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 using the polymerase chain reaction (PCR). SEQ ID NO: 1 5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3 ' SEQ ID NO: 2 5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3'

Neben den zu pBR322 komplementären Sequenzen enthält der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 1 in 5'-3'-Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Smal, BamHl, Nhel und Ascl und der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 2 in 5'-3'-Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Xbal, Xhol, Notl und Dral. Die PCR- Reaktion wurde nach Standardmethode, wie Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press (1990)) mit PfuTurbo-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 2,1 kb wurde mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Die stumpfen Enden des DNA- Fragmentes wurden mit dem Rapid-DNA-Ligation-Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers miteinander ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Ampicillin(50 µg/ml)-haltigen LB-Agar (Lennox, 1955, "Virology", 1: 190) erreicht. In addition to the sequences complementary to pBR322, the oligonucleotide primer contains SEQ ID NO: 1 in the 5'-3 'direction the interfaces for the restriction endonucleases Smal, BamHl, Nhel and Ascl and the oligonucleotide primer SEQ ID NO: 2 in the 5'-3 'direction Interfaces for the restriction endonucleases Xbal, Xhol, Notl and Dral. The PCR The reaction was carried out according to a standard method, such as Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications ", Academic Press (1990)) with PfuTurbo-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA). The obtained DNA fragment with a size of approximately 2.1 kb was performed with the GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) cleaned according to the manufacturer. The blunt ends of the DNA Fragments were made using the Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) Manufacturer's information ligated together and the ligation approach according to Standard methods as described in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, described (1989)), in competent E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformed. A selection for plasmid-carrying cells was carried out by the Plating on LB agar containing ampicillin (50 µg / ml) (Lennox, 1955, "Virology", 1: 190) reached.

Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep-Spin-Miniprep-Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK1. The plasmid DNA of an individual clone was obtained using the Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) isolated according to the manufacturer and via restriction digestion checked. The plasmid obtained in this way is named pCLiK1.

Ausgehend vom Plasmid pWLT1 (Liebl et al., 1992) als Template für eine PCR-Reaktion wurde mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 eine Kanamycin- Resistenzcassette amplifiziert. SEQ ID NO: 3 GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3' SEQ ID NO: 4 GAGAGGCGCGGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCCAGGCA-3'
Starting from the plasmid pWLT1 (Liebl et al., 1992) as a template for a PCR reaction, a kanamycin resistance cassette was amplified with the oligonucleotide primers SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 3 GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3 ' SEQ ID NO: 4 GAGAGGCGCGGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCCAGGCA-3'

Neben den zu pWLT1 komplementären Sequenzen enthält der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 3 in 5'-3'-Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Xbal, Smal, BamHl, Nhel und der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 4 in 5'-3'-Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Ascl und Nhel. Die PCR-Reaktion wurde nach Standardmethode, wie Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press (1990)) mit PfuTurbo-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 1,3 kb wurde mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Das DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen Xbal und Ascl (New England Biolabs, Beverly, USA) geschnitten und im Anschluß daran erneut mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Der Vektor pCLiK1 wurde ebenfalls mit den Restriktionsendonukleasen Xbal und Ascl geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Nach Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel wurde der linearisierte Vektor (ca. 2,1 kb) mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor- Fragment wurde mit Hilfe des Rapid-DNA-Ligation-Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers mit dem geschnittenen PCR-Fragment ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Ampicillin (50 µg/ml) und Kanamycin (20 µg/ml) haltigen LB-Agar (Lennox, 1955, "Virology", 1: 190) erreicht. In addition to the sequences complementary to pWLT1, the oligonucleotide primer contains SEQ ID NO: 3 in the 5'-3 'direction the interfaces for the restriction endonucleases Xbal, Smal, BamHl, Nhel and the oligonucleotide primer SEQ ID NO: 4 in the 5'-3 'direction the interfaces for the restriction endonucleases Ascl and Nhel. The PCR reaction was made after Standard method, such as Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press (1990)) with PfuTurbo polymerase (Stratagene, La Jolla, USA). The DNA fragment of approximately 1.3 kb in size was obtained with the GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) Manufacturer's information cleaned. The DNA fragment was compared with the Restriction endonucleases Xbal and Ascl (New England Biolabs, Beverly, USA) cut and then again with the GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) cleaned according to the manufacturer. The vector pCLiK1 was also cut with restriction endonucleases Xbal and Ascl and with alkaline phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) according to the Manufacturer dephosphorylated. After electrophoresis in a 0.8% agarose gel, the linearized vector (approx. 2.1 kb) with the GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) isolated according to the manufacturer. This vector Fragment was made using the Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) Manufacturer's information ligated with the cut PCR fragment and the Ligation approach according to standard methods, as in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual ", Cold Spring Harbor, described (1989)), in competent E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A selection for plasmid-bearing cells was made by plating on LB agar containing ampicillin (50 µg / ml) and kanamycin (20 µg / ml) (Lennox, 1955, "Virology", 1:19).

Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK2. The plasmid DNA of an individual clone was analyzed using the Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) isolated according to the manufacturer and via restriction digestion checked. The plasmid obtained in this way is named pCLiK2.

Der Vektor pCLiK2 wurde mit der Restriktionsendonuklease Dral (New England Biolabs, Beverly, USA) geschnitten. Nach Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel wurde ein ca. 2,3 kb großes Vektorfragment mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor- Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers religiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben(1989)), in kompetente E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20 µg/ml) haltigen LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) erreicht. The vector pCLiK2 was with the restriction endonuclease Dral (New England Biolabs, Beverly, USA). After electrophoresis in a 0.8% agarose gel, a 2.3 kb vector fragment with the GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) isolated according to the manufacturer. This vector Fragment was made using the Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) Information from the manufacturer is religious and the ligation approach according to standard methods, as in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, described (1989)), in competent E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformed. A selection for plasmid-bearing cells was made by plating Kanamycin (20 ug / ml) containing LB agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) reached.

Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK3. The plasmid DNA of an individual clone was analyzed using the Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) isolated according to the manufacturer and via restriction digestion checked. The plasmid obtained in this way is named pCLiK3.

Ausgehend vom Plasmid pWLQ2 (Liebl et al., 1992) als Template für eine PCR-Reaktion wurde mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 der Replikationsursprung pHM1519 amplifiziert. SEQ ID NO: 5 GAGAGGGCGGCCGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3' SEQ ID NO: 6 5'-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3'
Starting from the plasmid pWLQ2 (Liebl et al., 1992) as a template for a PCR reaction, the origin of replication pHM1519 was amplified with the oligonucleotide primers SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 5 GAGAGGGCGGCCGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3 ' SEQ ID NO: 6 5'-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3'

Neben den zu pWLQ2 komplementären Sequenzen enthalten die Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 Schnittstellen für die Restriktionsendonuklease Notl. Die PCR- Reaktion wurde nach Standardmethode, wie Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press (1990)) mit PfuTurbo-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 2,7 kb wurde mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Das DNA-Fragment wurde mit der Restriktionsendonuklease Notl (New England Biolabs, Beverly, USA) geschnitten und im Anschluß daran erneut mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Der Vektor pCLiK3 wurde ebenfalls mit der Restriktionsendonuklease Notl geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Nach Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel wurde der linearisierte Vektor (ca. 2,3 kb) mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor- Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers mit dem geschnittenen PCR-Fragment ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20 µg/ml) haltigen LB-Agar (Lennox, 1955, "Virology", 1: 190) erreicht. In addition to the sequences complementary to pWLQ2, the oligonucleotide primers contain SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 interfaces for the restriction endonuclease Notl. The PCR The reaction was carried out according to a standard method, such as Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications ", Academic Press (1990)) with PfuTurbo-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA). The resulting DNA fragment, approximately 2.7 kb in size was performed with the GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) cleaned according to the manufacturer. The DNA fragment was made with the Restriction endonuclease Notl (New England Biolabs, Beverly, USA) cut and im Then again with the GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) cleaned according to the manufacturer. The vector pCLiK3 was also cut with the restriction endonuclease Notl and with alkaline Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) according to the manufacturer dephosphorylated. After electrophoresis in a 0.8% agarose gel, the linearized vector (approx. 2.3 kb) with the GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) isolated according to the manufacturer. This vector Fragment was made using the Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) Manufacturer's information ligated with the cut PCR fragment and the Ligation approach according to standard methods, as in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual ", Cold Spring Harbor, described (1989)), in competent E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A selection for plasmid-bearing cells was made by plating on LB agar containing kanamycin (20 μg / ml) (Lennox, 1955, "Virology", 1: 190) reached.

Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK5. The plasmid DNA of an individual clone was analyzed using the Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) isolated according to the manufacturer and via restriction digestion checked. The plasmid obtained in this way is given the name pCLiK5.

Für die Erweiterung von pCLiK5 um eine "multiple cloning site" (MCS) wurden die beide synthetischen, weitestgehend komplementären Oligonukleotide SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8, die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Swal, Xhol, Aatl, Apal, Asp718, MluI, NdeI, SpeI, EcoRV, SalI, ClaI, BamHI, XbaI und SmaI enthalten, durch gemeinsames Erhitzen auf 95°C und langsames Abkühlen zu einem doppelsträngigen DNA-Fragment vereinigt. SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 8

For the expansion of pCLiK5 by a "multiple cloning site" (MCS), the two synthetic, largely complementary oligonucleotides SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, the interfaces for the restriction endonucleases Swal, Xhol, Aatl, Apal, Asp718, Contain MluI, NdeI, SpeI, EcoRV, SalI, ClaI, BamHI, XbaI and SmaI, combined by heating to 95 ° C. and slowly cooling to a double-stranded DNA fragment. SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 8

Der Vektor pCLiK5 wurde mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und BamHI (New England Biolabs, Beverly, USA) geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Nach Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel wurde der linearisierte Vektor (ca. 5,0 kb) mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor-Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers mit dem synthetischen, Doppelsträngigen DNA-Fragment ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20 µg/ml) haltigen LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) erreicht. The vector pCLiK5 was with the restriction endonucleases XhoI and BamHI (New England Biolabs, Beverly, USA) cut and treated with alkaline phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) dephosphorylated according to the manufacturer. After electrophoresis in one The linearized vector (approx. 5.0 kb) with the GFX ™ PCR, DNA was 0.8% agarose gel and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) according to the Manufacturer isolated. This vector fragment was generated using the Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) according to the manufacturer's instructions with the synthetic, Double-stranded DNA fragment ligated and the ligation approach according to standard methods, as in Sambrook et al. ("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, described (1989)), in competent E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformed. A selection for plasmid-bearing cells was made by plating Kanamycin (20 ug / ml) containing LB agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) reached.

Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK5MCS. The plasmid DNA of an individual clone was analyzed using the Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) isolated according to the manufacturer and via restriction digestion checked. The plasmid obtained in this way is called pCLiK5MCS.

Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977), "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA 74: 5463-5467 durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und ausgewertet. Sequencing reactions were carried out according to Sanger et al. (1977), "Proceedings of the National Academy of Sciences ", USA 74: 5463-5467. The sequencing reactions were carried out separated and evaluated using ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

Das entstandene Plasmid pCLiK5MCS ist als SEQ ID NO: 9 aufgeführt. The resulting plasmid pCLiK5MCS is listed as SEQ ID NO: 9.

Beispiel 2Example 2 Herstellung des Vektors pCLiK5MCS integrativ sacBProduction of the vector pCLiK5MCS integrative sacB

Ausgehend vom Plasmid pK19mob (Schäfer et al., "Gene", 145,69-73(1994)) als Template für eine PCR-Reaktion wurde mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 das Bacillus-subtilis-sacB-Gen amplifiziert. SEQ ID NO: 10 5'-GAGAGCGGCCGCCGATCCTTTTTAACCCATCAC-3' SEQ ID NO: 11 5'-AGGAGGCGGCCGCCATCGGCATTTTCTTTTGCG-3'
Starting from the plasmid pK19mob (Schäfer et al., "Gene", 145, 69-73 (1994)) as a template for a PCR reaction, the bacillus subtilis with the oligonucleotide primers SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 sacB gene amplified. SEQ ID NO: 10 5'-GAGAGCGGCCGCCGATCCTTTTTAACCCATCAC-3 ' SEQ ID NO: 11 5'-AGGAGGCGGCCGCCATCGGCATTTTCTTTTGCG-3'

Neben den zu pK19mobsac komplementären Sequenzen enthalten die Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 Schnittstellen für die Restriktionsendonuklease Notl. Die PCR-Reaktion wurde nach Standardmethode, wie Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press (1990)) mit PfuTurbo-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 1,9 kb wurde mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Das DNA-Fragment wurde mit der Restriktionsendonuklease Notl (New England Biolabs, Beverly, USA) geschnitten und im Anschluß daran erneut mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Der Vektor pCLiK5MCS wurde ebenfalls mit der Restriktionsendonuklease Notl geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Nach Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel wurde ein ungefähr 2,4 kb großes Vektorfragment mit dem GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor- Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers mit dem geschnittenen PCR-Fragment ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20 µg/ml) haltigen LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) erreicht. In addition to the sequences complementary to pK19mobsac, the oligonucleotide primers contain SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 interfaces for the restriction endonuclease Notl PCR reaction was carried out according to standard methods, such as Innis et al. ("PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications ", Academic Press (1990)) with PfuTurbo-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA). The DNA fragment obtained, approximately 1.9 kb in size was performed with the GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) cleaned according to the manufacturer. The DNA fragment was made with the Restriction endonuclease Notl (New England Biolabs, Beverly, USA) cut and im Then again with the GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) cleaned according to the manufacturer. The vector pCLiK5MCS was also cut with the restriction endonuclease Notl and with alkaline Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) according to the manufacturer dephosphorylated. After electrophoresis in a 0.8% agarose gel, an approx 2.4 kb vector fragment with the GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) isolated according to the manufacturer. This vector Fragment was made using the Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) Manufacturer's information ligated with the cut PCR fragment and the Ligation approach according to standard methods as in Sambrook et al. (Molecular cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, described (1989)), in competent E. coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA). A selection for plasmid-bearing cells was made by plating on LB agar containing kanamycin (20 μg / ml) (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) reached.

Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK5MCS integrativ sacB. The plasmid DNA of an individual clone was analyzed using the Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) isolated according to the manufacturer and via restriction digestion checked. The plasmid obtained in this way is given the name pCLiK5MCS integrative sacB.

Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977, "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA 74: 5463-5467 durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und ausgewertet. Sequencing reactions were carried out according to Sanger et al. (1977, "Proceedings of the National Academy of Sciences ", USA 74: 5463-5467. The sequencing reactions were carried out separated and evaluated using ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

Das entstandene Plasmid pCLiK5MCS integrativ sacB ist als SEQ ID NO: 12 aufgeführt. The resulting plasmid pCLiK5MCS integrative sacB is listed as SEQ ID NO: 12.

Beispiel 3Example 3 Isolierung und Klonierung des metK-Gens aus C. glutamicumIsolation and cloning of the metK gene from C. glutamicum

Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde nach Tauch et al. (1995), "Plasmid", 33: 168-179 oder Eikmanns et al. (1994), "Microbiology", 140: 1817-1828 präpariert. Die folgenden Oligonukleotidprimer wurden, ausgehend von der metK-Sequenz, aus Großmann et al. (2000), "FEMS Microbiology Letters", 193: 99-103 synthetisiert: SEQ ID NO: 13 5'-GAGAGCCCGGGAAGAAGGGCTGCGGACCTCCTCAT-3'

und SEQ ID NO: 14 5'-CTCTCACGCGTCATATGCAGGTGAGGGTAACCCCA-3'
Chromosomal DNA from C. glutamicum ATCC 13032 was developed according to Tauch et al. (1995), "Plasmid", 33: 168-179 or Eikmanns et al. (1994), "Microbiology", 140: 1817-1828. The following oligonucleotide primers were, based on the metK sequence, from Großmann et al. (2000), "FEMS Microbiology Letters", 193: 99-103 synthesized: SEQ ID NO: 13 5'-GAGAGCCCGGGAAGAAGGGCTGCGGACCTCCTCAT-3 '

and SEQ ID NO: 14 5'-CTCTCACGCGTCATATGCAGGTGAGGGTAACCCCA-3 '

Nach Standardmethoden, wie Innis et al. (1990), "PGR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic Press, und unter Einsatz der aufgeführten Oligonukleotidprimer, sowie PfuTurbo-Polymerase (Fa. Stratagene) wurde ein DNA-Fragment von 1640 Basenpaaren aus der genomischen DNA von C. glutamicum amplifiziert. According to standard methods, such as Innis et al. (1990), "PGR Protocols. A Guide to Methods and Applications ", Academic Press, and using the listed oligonucleotide primers, and PfuTurbo polymerase (from Stratagene) was a DNA fragment from 1640 Base pairs amplified from the C. glutamicum genomic DNA.

Das Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen Mlu I und Sma I (Roche Diagnostics, Mannheim), die über die PCR-Oligonukleotidprimer eingebracht wurden, gespalten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurde das DNA-Fragment mit GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) aus der Agarose aufgereinigt. The fragment was treated with the restriction enzymes Mlu I and Sma I (Roche Diagnostics, Mannheim), which were introduced via the PCR oligonucleotide primers, cleaved and separated by gel electrophoresis. The DNA fragment was then analyzed with GFX ™ PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) from the agarose purified.

Der Vektor pCLiK5MCS, SEQ ID NO: 9 wurde ebenfalls mit den Restriktionsenzymen Sma I und Mlu I gespalten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Vektor und DNA-Fragment wurden mit T4- DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg) ligiert und nach Standardmethoden, wie in Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben, in E. coli XL-1Blue (Fa. Stratagene) transformiert. The vector pCLiK5MCS, SEQ ID NO: 9 was also with the restriction enzymes Sma I and Mlu I cleaved and with alkaline phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim) dephosphorylated according to the manufacturer. Vector and DNA fragment were labeled with T4 DNA ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg) ligated and according to standard methods as in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, described, transformed into E. coli XL-1Blue (from Stratagene).

Die Präparation der Plasmid-DNA wurde nach Methoden und mit Materialien der Fa. Quiagen durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977), "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA 74: 5463-5467 durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und ausgewertet. The plasmid DNA was prepared using methods and materials from Quiagen performed. Sequencing reactions were carried out according to Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 74: 5463-5467. The Sequencing reactions were carried out using ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) separated and evaluated.

Das entstandene Plasmid pCLiK5MCS/metKwt ist als SEQ ID NO: 15 aufgeführt. The resulting plasmid pCLiK5MCS / metKwt is listed as SEQ ID NO: 15.

Beispiel 4Example 4 Mutagenese des metK-Gens aus C. glutamicumMutagenesis of the metK gene from C. glutamicum

Die gerichtete Mutagenese des metK-Gens aus C. glutamicum wurde mit dem QuickChange Kit (Fa. Stratagene) und nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Mutagenese wurde im Plasmid pCLiK5MCS/metKwt, SEQ ID NO: 15 durchgeführt. Für den Austausch von Cystein 94 aus SEQ ID NO: 16 nach Alanin 94 wurden folgende Oligonukleotidprimer synthetisiert: SEQ ID NO: 17 5'-GATTCGACGGACGCACCGCTGGCGTCTCAGTATCCATC-3'

und SEQ ID NO: 18 5'-GATGGATACTGAGACGCCAGCGGTGCGTCCGTCGAATC-3'
The directed mutagenesis of the metK gene from C. glutamicum was carried out using the QuickChange Kit (from Stratagene) and according to the manufacturer's instructions. The mutagenesis was carried out in the plasmid pCLiK5MCS / metKwt, SEQ ID NO: 15. The following oligonucleotide primers were synthesized for the exchange of cysteine 94 from SEQ ID NO: 16 for alanine 94: SEQ ID NO: 17 5'-GATTCGACGGACGCACCGCTGGCGTCTCAGTATCCATC-3 '

and SEQ ID NO: 18 5'-GATGGATACTGAGACGCCAGCGGTGCGTCCGTCGAATC-3 '

Der Einsatz dieser Oligonukleotidprimer führt in SEQ ID NO: 15 zu einem Austausch der Nukleotide in Position 1056 (von C nach G) und 1057 (von A nach C). Der resultierende Aminosäureaustausch Cys94Ala im metK-Gen wurde nach Transformation und Plasmidpräparation durch Sequenzierungsreaktionen bestätigt. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pCLiK5MCS/metKC94A und ist als SEQ ID NO: 19 aufgeführt. In SEQ ID NO: 15, the use of these oligonucleotide primers leads to an exchange of the Nucleotides at position 1056 (from C to G) and 1057 (from A to C). The resulting one Amino acid exchange Cys94Ala in the metK gene was carried out after transformation and Plasmid preparation confirmed by sequencing reactions. The plasmid received the Designation pCLiK5MCS / metKC94A and is listed as SEQ ID NO: 19.

Beispiel 5Example 5 SAM-Synthetase(metK)-AssaySAM synthetase (metK) assay

C.-glutamicum-Stämme, die entweder mit dem Plasmid pCLiK5MCS/metKwt, SEQ ID NO: 15, oder mit dem Plasmid pCLiK5MCS/metKC94A, SEQ ID NO: 19 transformiert wurden, wurden in BHI/Glucose-Medium (37 g/l, Brain Heart Infusion Fertigmedium, Fa. Difco, 10 mM (NH4)2SO4, 4% Glucose) bei 30°C bis zu einer OD600 von 20 angezogen. Die Zellen wurden bei 4°C abzentrifugiert, und das Pellet wurde mit kalter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurden 0,25 g feuchtes Zellpellet mit 1 mL Aufschlußpuffer (50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 mM DTT) bei 4°C resuspendiert. In einem Ribolyser der Fa. Hybaid und in blauen Ribolyserröhrchen der Fa. Hybaid und bei einer Rotationseinstellung von 6,0 wurde die Bakteriensuspension dreimal für jeweils 30 Sekunden lysiert. Das Lysat wurde durch 45minütige Zentrifugation bei 13.000 rpm in einer Eppendorfzentrifuge geklärt und der Überstand 1 : 10 mit Wasser verdünnt. Der Proteingehalt wurde nach Bradford, M. M. (1976), "Anal. Biochem.", 72: 248-254 bestimmt. C. glutamicum strains transformed either with plasmid pCLiK5MCS / metKwt, SEQ ID NO: 15 or with plasmid pCLiK5MCS / metKC94A, SEQ ID NO: 19, were in BHI / glucose medium (37 g / l , Brain Heart Infusion ready medium, Difco, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 4% glucose) at 30 ° C up to an OD 600 of 20. The cells were centrifuged at 4 ° C and the pellet was washed with cold, physiological saline. After renewed centrifugation, 0.25 g of moist cell pellet were resuspended at 1 ° C. with 1 ml of digestion buffer (50 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , 50 mM KCl, 1 mM DTT). The bacterial suspension was lysed three times for 30 seconds each in a Hybaid ribolyser and in Hybaid blue ribolysis tubes and at a rotation setting of 6.0. The lysate was clarified by centrifugation at 13,000 rpm in an Eppendorf centrifuge for 45 minutes and the supernatant was diluted 1:10 with water. Protein content was determined according to Bradford, MM (1976), "Anal. Biochem.", 72: 248-254.

Die enzymatische Aktivität der SAM-Synthase wurde nach Markham, G. D. et al. (1983), "Methods in Enzymology", 94: 219-222, mit folgenden Modifikationen bestimmt. The enzymatic activity of the SAM synthase was determined according to Markham, G. D. et al. (1983) "Methods in Enzymology", 94: 219-222, with the following modifications.

Reaktionsansätze von 100 µl mit 100 mM Tris pH 8.0, 100 mM KCl, 20 mM MgCl2, 1,2 mM L- Methionin, 10 mM ATP, 1 µl 35S-L-Methionin, entsprechend 15,15 µCi (Amersham SJ204, spez. Aktivität 1 Ci/µmol) und H2O ad 100 µl wurden mit 100 µg der jeweiligen Proteinlysate gestartet und bei 37°C inkubiert. Zu den Zeitpunkten 0, 5, 10, 20, 30 und 60 Minuten wurden 10 µl Aliquots des Reaktionsansatzes entnommen und auf Eis mit 20 µl 50 mM EDTA gestoppt. Reaction batches of 100 µl with 100 mM Tris pH 8.0, 100 mM KCl, 20 mM MgCl 2 , 1.2 mM L-methionine, 10 mM ATP, 1 µl 35 SL-methionine, corresponding to 15.15 µCi (Amersham SJ204, spec. Activity 1 Ci / µmol) and H 2 O ad 100 µl were started with 100 µg of the respective protein lysates and incubated at 37 ° C. At the times 0, 5, 10, 20, 30 and 60 minutes, 10 ul aliquots of the reaction mixture were removed and stopped on ice with 20 ul 50 mM EDTA.

30 µl der abgestoppten Reaktion wurden auf Phosphocellulose-Filtereinheiten (Fa. Pierce, Nr. 29520) gegeben und bei 6.000 rpm in einer Eppendorf-Zentrifuge für 1 Minute abzentrifugiert. Der Filter wurde zweimal mit 500 µl 75 mM Phosphorsäure gewaschen und dann in ein Zählröhrchen mit Szintillationsflüssigkeit gegeben. Die Radioaktivität des gebildeten S-Adenosylmethionins wird in einem Szintillationszähler (Fa. Beckman) bestimmt. 30 μl of the stopped reaction were placed on phosphocellulose filter units (Pierce, No. 29520) and at 6,000 rpm in an Eppendorf centrifuge for 1 minute centrifuged. The filter was washed twice with 500 ul 75 mM phosphoric acid and then placed in a counting tube with scintillation fluid. The radioactivity of the S-adenosylmethionine formed is determined in a scintillation counter (Beckman).

Die Messergebnisse sind in beiliegender Fig. 1 dargestellt. The measurement results are shown in the attached FIG. 1.

Unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität des radioaktiven L-Methionins sowie der eingesetzten Proteinmenge läßt sich die Rate der S-Adenosylmethionin-Bildung aus der Zunahme der eingebauten Radioaktivität pro Zeiteinheit bestimmen. Ihre Einheit lautet µmol S-Adenosylmethionin/min.mg Protein. Diese Rate kann zwischen Wildtyp-Enzym und Mutanten-Enzym verglichen werden. Taking into account the specific activity of the radioactive L-methionine as well as the the amount of protein used, the rate of S-adenosylmethionine formation from the Determine the increase in built-in radioactivity per unit of time. Their unit is µmol S-adenosylmethionine / min.mg protein. This rate can vary between wild-type enzyme and Mutant enzyme can be compared.

Beispiel 6Example 6 Bestimmung des zellulären S-Adenosylmethionin-Titers in C. glutamicumDetermination of the cellular S-adenosylmethionine titer in C. glutamicum

Zur Bestimmung der zellulären Titer von S-Adenosylmethionin in C.-glutamicum-Stämmen, die entweder mit pCLiK5MCS/metKwt (SEQ ID NO: 15) oder pCLiK5MCS/metKC94A (SEQ ID NO: 19) transformiert wurden, wurde wie folgt verfahren. Ein wie in Beispiel 5 erhaltenes Zellpellet, das mit eiskalter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen wurde, wurde mit Trichloressigsäure (200 µl TCA pro 0,1 g feuchtes Pellet) resuspendiert. Nach 5 Minuten auf Eis wurde die Suspension bei 4°C und 13.000 rpm für 5 min in einer Eppendorf-Zentrifuge geklärt. Der S-Adenosylmethionin-Gehalt im Überstand wurde mittels HPLC bestimmt (Ionospher-5C-Kationenaustauschersäule, 10 µl Injektionsvolumen; Laufmittel: 70% vol/vol 0,2 M Ammoniumformiat pH 4,0 30% vol/vol Methanol; UV-Detektion 260 nm; 40°C; Retentionszeit 8,5 Min.). Tabelle 1 S-Adenosylmethionin-Titer

The procedure for determining the cellular titer of S-adenosylmethionine in C. glutamicum strains which had been transformed with either pCLiK5MCS / metKwt (SEQ ID NO: 15) or pCLiK5MCS / metKC94A (SEQ ID NO: 19) was as follows. A cell pellet obtained as in Example 5, which was washed with ice-cold, physiological saline, was resuspended with trichloroacetic acid (200 μl TCA per 0.1 g moist pellet). After 5 minutes on ice, the suspension was clarified at 4 ° C. and 13,000 rpm for 5 minutes in an Eppendorf centrifuge. The S-adenosylmethionine content in the supernatant was determined by HPLC (Ionospher-5C cation exchange column, 10 μl injection volume; eluent: 70% vol / vol 0.2 M ammonium formate pH 4.0 30% vol / vol methanol; UV detection 260 nm; 40 ° C; retention time 8.5 min.). Table 1 S-adenosylmethionine titer

Beispiel 7Example 7 Austausch des metK-wt-Gens in C. glutamicum durch metK C94AExchange of the metK wt gene in C. glutamicum by metK C94A

Für den allelischen Austausch des metK-Wildtyp-Gens in C. glutamicum KFCC10065 durch die Mutante metK C94A wurde zunächst die metK-C94A-Sequenz aus SEQ ID NO: 19 in pCLiK5MCS integrativ sacB (SEQ ID NO: 12) kloniert. Dazu wurde das Plasmid pCLiK5MCS/metKC94A (SEQ ID NO: 19) mit den Restriktionsendonukleasen Bgl II und Xho I (Fa. NEB, Schwalbach) gespalten. Das erhaltene Fragment der Größe 1962 Basenpaare wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, gereinigt. Der Vektor pCLiK5MCS integrativ sacB wurde ebenfalls mit Bgl II und Xhol gespalten und, wie in Beispiel 3 beschrieben, aufgereinigt. Vektor und Fragment wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, ligiert, in E. coli XL- 1Blue transformiert. Das Plasmid wurde gereinigt und nach Sequenzierung bestätigt. Das erhaltene Plasmid pCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94A ist als SEQ ID NO: 20 aufgeführt. Das Plasmid pCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94A wurde in C. glutamicum KFCC10065 mittels Elektroporation, wie bei Liebl, et al. (1989), "FEMS Microbiology Letters", 53: 299-303 beschrieben, transformiert. Modifikationen des Protokolls sind in DE 100 46 870 beschrieben. Die chromosomale Anordnung des metK-Lokus einzelner Transformanten wurde mit Standardmethoden durch Southern-Blot und Hybridisierung, wie in Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, beschrieben, überprüft. Dadurch wurde sichergestellt, daß es sich bei den Transformanten um solche handelt, die das transformierte Plasmid durch homologe Rekombination am metK-Lokus integriert haben. Nach Wachstum solcher Kolonien über Nacht in Medien, die kein Antibiotikum enthalten, werden solche Transformanten dann auf ein Saccharose-CM-Agarmedium (10% Saccharose) ausplattiert und bei 30°C für 24 Stunden inkubiert. For the allelic exchange of the metK wild-type gene in C. glutamicum KFCC10065 by the mutant metK C94A was first the metK-C94A sequence from SEQ ID NO: 19 in pCLiK5MCS integrative sacB (SEQ ID NO: 12) cloned. To do this, the plasmid pCLiK5MCS / metKC94A (SEQ ID NO: 19) with the restriction endonucleases Bgl II and Xho I (NEB, Schwalbach) split. The fragment of 1962 base pairs obtained was cleaned as described in Example 3. The vector pCLiK5MCS integrative sacB was also cleaved with Bgl II and Xhol and, as described in Example 3, purified. Vector and fragment were ligated as described in Example 3 in E. coli XL- 1Blue transformed. The plasmid was purified and confirmed after sequencing. The Plasmid pCLiK5MCS obtained integratively sacB / metKC94A is listed as SEQ ID NO: 20. The plasmid pCLiK5MCS integrative sacB / metKC94A was in C. glutamicum KFCC10065 by means of electroporation, as in Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 described, transformed. Modifications to the protocol are described in DE 100 46 870. The chromosomal arrangement of the metK locus of individual transformants was included Standard methods by Southern blot and hybridization, as in Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor. This ensured that the transformants are those that have integrated the transformed plasmid by homologous recombination at the metK locus. After overnight growth of such colonies in media containing no antibiotic, such transformants are then placed on a sucrose CM agar medium (10% Sucrose) and incubated at 30 ° C for 24 hours.

Da das im Vektor pCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94A enthaltende sacB-Gen Saccharose in ein toxisches Produkt umwandelt, können nur solche Kolonien anwachsen, die das sacB- Gen durch einen zweiten homologen Rekombinationsschritt zwischen dem Wildtyp-metK- Gen und dem mutierten metKC94A-Gen deletiert haben. Während der homologen Rekombination kann entweder das Wildtyp-Gen, oder das mutierte Gen zusammen mit dem sacB-Gen deletiert werden. Wenn das sacB-Gen zusammen mit dem Wildtyp-Gen entfernt wird, resultiert eine mutierte Transformante. Since the sacB gene containing sacB / metKC94A integratively in the vector pCLiK5MCS sucrose converted into a toxic product, only those colonies can grow that contain the sacB- Gene by a second homologous recombination step between the wild-type metK Gene and the mutated metKC94A gene have deleted. During the homologous Recombination can either be the wild-type gene, or the mutated gene along with that sacB gene can be deleted. When the sacB gene is removed along with the wild-type gene a mutant transformant results.

Anwachsende Kolonien wurden gepickt, ihre genomische DNA präpariert und das metK-Gen mit zwei Methoden analysiert. Zum einen wurde der Austausch von zwei Nukleotiden, wie in Beispiel 4 beschrieben, genutzt. Mit Hilfe eines spezifischen PCR-Oligonukleotidprimers, der an seinem 3'-Ende zwischen beiden Allelen differenzieren kann und eines zweiten metK- spezifischen Oligonukleotidprimers konnten diagnostische PCR-Fragmente generiert werden. Zum anderen wurden bei etwa 100 Transformanten der metK-Lokus nach PCR- Amplifikation mit PCR-Oligonukleotidprimern, die stromauf, bzw. stromab der Mutation binden, sequenziert. Es wurden mehrere mutierte metK-Klone erhalten. Ein solcher Klon wurde mit KFCC1006SmetKC94A bezeichnet. Die Aminosäuresequenz der Mutante C94A entspricht SEQ ID NO: 22. Growing colonies were picked, their genomic DNA prepared and the metK gene analyzed using two methods. On the one hand, the exchange of two nucleotides, as in Example 4 described, used. Using a specific PCR oligonucleotide primer, the can differentiate at its 3 'end between the two alleles and a second metK- specific PCR primers could be generated for specific oligonucleotide primers become. On the other hand, in about 100 transformants the metK locus after PCR Amplification with PCR oligonucleotide primers upstream or downstream of the mutation bind, sequenced. Several mutant metK clones were obtained. Such a clone was designated KFCC1006SmetKC94A. The amino acid sequence of the mutant C94A corresponds to SEQ ID NO: 22.

Beispiel 8Example 8

Herstellung von Methionin mit dem Stamm KFCC10065metKC94AProduction of methionine with the strain KFCC10065metKC94A

Der in Beispiel 6 hergestellte Stamm KFCC10065metKC94A wurde auf einer Agar-Platte mit BHI-Medium (Difco) für 2 Tage bei 30°C angezogen. Die aufgewachsenen Zellen wurden in Saline von der Agarplatte suspendiert und mit einer OD 600 nm von 1,5 in das Medium II überführt. Das Medium II wurde wie folgt zusammengesetzt. Medium IIA 0.6 g/l KH2PO4
0.4 g/l MgSO4.7H2O
25 g/l (NH4)2SO4
40 g/l Rohzucker
60 g/l Melasse
The strain KFCC10065metKC94A prepared in Example 6 was grown on an agar plate with BHI medium (Difco) for 2 days at 30 ° C. The grown cells were suspended in saline from the agar plate and transferred to medium II with an OD 600 nm of 1.5. Medium II was composed as follows. Medium IIA 0.6 g / l KH 2 PO 4
0.4 g / l MgSO 4 .7H 2 O
25 g / l (NH 4 ) 2 SO 4
40 g / l raw sugar
60 g / l molasses

Das so angesetzte Medium wurde mit NH4OH auf pH 7,8 eingestellt und bei 120°C für 30 min sterilisiert. Medium IIB 0.3 mg/l Thiamin.HCl
1 mg/l Biotin
2 mg/l FeSO4
2 mg/l MnSO4
0.1 mg/l Vit.B12
The medium thus prepared was adjusted to pH 7.8 with NH 4 OH and sterilized at 120 ° C. for 30 minutes. Medium IIB 0.3 mg / l thiamine.HCl
1 mg / l biotin
2 mg / l FeSO 4
2 mg / l MnSO 4
0.1 mg / l Vit.B12

Medium IIB wurde separat angesetzt, durch Filtration sterilisiert und dem Medium IIA zugefügt. Beide Bestandteile IIa und IIB ergeben zusammen das Medium II. Medium IIB was prepared separately, sterilized by filtration and the medium IIA added. Both components IIa and IIB together form the medium II.

Vom Medium II (= IIA + B) wurden 10 ml in einem 100-ml-Erlenmyerkolben mit 0,5 g sterilisiertem CaCO3 mit Zellen des oben genannten Stamms versetzt, für 72 h auf einem Orbitalschüttler mit 200 Upm bei 30°C inkubiert. Medium II (= IIA + B) was mixed with 10 ml in a 100 ml Erlenmyer flask with 0.5 g sterilized CaCO 3 with cells from the above-mentioned strain, incubated for 72 h on an orbital shaker at 200 rpm at 30 ° C.

Gebildetes Methionin in der Kulturbrühe wurde mit Hilfe der Aminosäuresäure- Bestimmungsmethode von Agilent auf einer Agilent 1100 Series LC System HPLC. Eine Vorsäulenderivatisierung mit Ortho-Phthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäuren; die Auftrennung des Aminosäuregemischs findet auf einer Hypersil-AA-Säule (Agilent) statt. SEQUENCE LISTING























































Methionine formed in the culture broth was determined using Agilent's amino acid determination method on an Agilent 1100 Series LC System HPLC. A precolumn derivatization with orthophthalaldehyde allows the quantification of the amino acids formed; the amino acid mixture is separated on a Hypersil-AA column (Agilent). SEQUENCE LISTING























































Claims (21)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung wenigstens einer schwefelhaltigen Feinchemikalie, welches folgende Schritte umfasst: a) Fermentation einer die gewünschte, schwefelhaltige Feinchemikalie produzierenden, coryneformen Bakterienkultur, wobei in den coryneformen Bakterien zumindest eine Nukleotidsequenz exprimiert wird, welche für ein Protein mit veränderter S-Adenosylmethionin-Synthase(metK)-Aktivität kodiert; b) Anreicherung der schwefelhaltigen Feinchemikalie im Medium und/oder in den Zellen der Bakterien und c) Isolieren der schwefelhaltigen Feinchemikalie. 1. A process for the fermentative production of at least one sulfur-containing fine chemical, which comprises the following steps: a) fermentation of a coryneform bacterial culture producing the desired sulfur-containing fine chemical, wherein at least one nucleotide sequence is expressed in the coryneform bacteria which codes for a protein with altered S-adenosylmethionine synthase (metK) activity; b) accumulation of the sulfur-containing fine chemical in the medium and / or in the cells of the bacteria and c) Isolation of the sulfur-containing fine chemical. 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die schwefelhaltige Feinchemikalie L-Methionin umfasst. 2. The method according to claim 1, wherein the sulfur-containing fine chemical L-methionine includes. 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man mutierte, coryneforme Bakterien mit im Vergleich zum nichtmutierten Wildtyp verringerter metK-Aktivität einsetzt. 3. The method according to any one of the preceding claims, wherein mutating, coryneform bacteria with reduced compared to the non-mutated wild type uses metK activity. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mutierte, coryneforme Bakterium außerdem eine im Vergleich zum nichtmutierten Wildtyp verbesserte metY-Aktivität und/oder eine gesteigerte L-Methionin-Menge aufweist. 4. The method according to any one of the preceding claims, wherein the mutated, coryneform bacterium also a compared to the non-mutated wild type has improved metY activity and / or an increased amount of L-methionine. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die metK-kodierende Sequenz eine kodierende Nukleotidsequenz ist, welche für ein Protein mit verringerter metK-Aktivität kodiert, in welchem wenigstens ein Cysteinrest des Wildtyp-Proteins substituiert ist. 5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the metK-coding Sequence is a coding nucleotide sequence, which for a protein with encoded reduced metK activity, in which at least one cysteine residue of Wild-type protein is substituted. 6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die metK-kodierende Sequenz eine kodierende Nukleotidsequenz ist, die für ein Protein mit metK-Aktivität kodiert, welches folgende Aminosäureteilsequenz aufweist:

G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V,

worin
X1 und X2 unabhängig voneinander für eine beliebige Aminosäure stehen;
und
X3 für eine von Cys verschiedene Aminosäure steht. 6. The method according to claim 5, wherein the metK coding sequence is a coding nucleotide sequence which codes for a protein with metK activity, which has the following partial amino acid sequence:

G (F / Y) (D / S) X 1 X 2 (S / T) X 3 (G / A) V,

wherein
X 1 and X 2 independently of one another represent any amino acid;
and
X 3 represents an amino acid other than Cys. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die metK-kodierende Sequenz für ein Protein mit metK-Aktivität kodiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz von Val1 bis Ala407 gemäß SEQ ID NO: 22 oder eine dazu homologe Aminosäuresequenz, welche für ein Protein mit funktionaler Äquivalenz steht, umfasst. 7. The method according to any one of the preceding claims, wherein the metK-coding Sequence encodes a protein with metK activity, the protein being a Amino acid sequence from Val1 to Ala407 according to SEQ ID NO: 22 or one thereto homologous amino acid sequence, which is for a protein with functional equivalence stands includes. 8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die kodierende metK- Sequenz eine in coryneformen Bakterien replizierbare oder eine stabil in das Chromosom integrierte DNA oder eine RNA ist. 8. The method according to any one of the preceding claims, wherein the coding metK- Sequence a replicable in coryneform bacteria or a stable one in that Chromosome is integrated DNA or an RNA. 9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man: a) einen mit einem Plasmidvektor transformierten Bakterienstamm einsetzt, der wenigstens eine Kopie der mutierten metK-Sequenz unter der Kontrolle regulativer Sequenzen trägt, oder b) einen Stamm einsetzt, in dem die mutierte metK-Sequenz in das Chromosom des Bakteriums integriert wurde. 9. The method according to any one of the preceding claims, wherein: a) uses a bacterial strain transformed with a plasmid vector which carries at least one copy of the mutated metK sequence under the control of regulatory sequences, or b) uses a strain in which the mutated metK sequence has been integrated into the chromosome of the bacterium. 10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man Bakterien fermentiert, in denen zusätzlich wenigstens ein weiteres Gen des Biosyntheseweges der gewünschten, schwefelhaltigen Feinchemikalie verstärkt ist. 10. The method according to any one of the preceding claims, wherein bacteria fermented, in which additionally at least one other gene of the biosynthetic pathway the desired sulfur-containing fine chemical is reinforced. 11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man Bakterien fermentiert, in denen wenigstens ein Stoffwechselweg zumindest teilweise ausgeschaltet ist, der die Bildung der gewünschten, schwefelhaltigen Feinchemikalie verringert. 11. The method according to any one of the preceding claims, wherein bacteria fermented in which at least one metabolic pathway is at least partially is switched off, the formation of the desired, sulfur-containing Fine chemical reduced. 12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene, ausgewählt unter: a) dem für eine Aspartatkinase kodierenden Gen lysC, b) dem für eine Aspartat-Semialdehyd-Dehdrogenase kodierenden Gen asd c) dem für die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierenden Gen gap, d) dem für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierenden Gen pgk, e) dem für die Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gen pyc, f) dem für die Triosephosphat-Isomerase kodierenden Gen tpi, g) dem für die Homoserin-O-Acetyltransferase kodierenden Gen metA, h) dem für die Cystahionin-gamma-Synthase kodierenden Gen metB, i) dem für die Cystahionin-gamma-Lyase kodierenden Gen metC, j) dem für die Methionin-Synthase kodierenden Gen metH, k) dem für dis Serin-Hydroxymethyltransferase kodierenden Gen glyA, l) dem für die O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase kodierenden Gen metY, m) dem für die Methylentetrahydrofolat-Reduktase kodierenden Gen metF Gen, n) dem für die Phosphoserin-Aminotransferase kodierenden Gen serC Gen, das für die kodiert, o) dem für die Phosphoserin-Phosphatase kodierenden Gen serB, p) dem für die Serin-Acetyl-Transferase kodierenden Gen cysE, q) dem für die Cystein-Synthase kodierenden Gen cysK, und r) dem für die Homoserin-Dehydrogenase kodierenden Gen hom überexprimiert ist, und/oder in denen gleichzeitig wenigstens eines dieser Gene so mutiert ist, dass das korrespondierende Protein verglichen mit dem nicht mutierten Protein in geringerem Maße oder nicht mehr durch einen Stoffwechselmetaboliten in seiner Aktivität beeinflusst wird, oder dass dessen spezifische Aktivität gesteigert wird 12. The method according to any one of the preceding claims, wherein fermenting coryneform bacteria in which at least one of the genes selected at the same time is selected from: a) the gene coding for an aspartate kinase lysC, b) the gene coding for an aspartate semialdehyde dehydrogenase asd c) the gene gap coding for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, d) the gene pgk coding for the 3-phosphoglycerate kinase, e) the pyc gene coding for the pyruvate carboxylase, f) the gene tpi coding for the triose phosphate isomerase, g) the gene coding for the homoserine-O-acetyltransferase, h) the gene metB coding for the cystahionin gamma synthase, i) the metC gene coding for the cystahionin gamma lyase, j) the gene coding for the methionine synthase metH, k) the glyA gene coding for the serine hydroxymethyltransferase, l) the metY gene coding for the O-acetylhomoserine sulfhydrylase, m) the metF gene coding for methylene tetrahydrofolate reductase, n) the serC gene which codes for the phosphoserine aminotransferase and which codes for the o) the serB gene coding for phosphoserine phosphatase, p) the gene coding for the serine acetyl transferase, cysE, q) the gene coding for the cysteine synthase cysK, and r) the gene coding for the homoserine dehydrogenase is hom overexpressed, and / or in which at least one of these genes is mutated at the same time in such a way that the corresponding protein is less or no longer influenced in its activity by a metabolic metabolite or that its specific activity is increased compared to the non-mutated protein 13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene, ausgewählt unter: a) dem für die Homoserine-Kinase kodierenden Gen thrB, b) dem für die Threonin-Dehydratase kodierenden Gen ilvA, c) dem für die Threonin-Synthase kodierenden Gen thrC d) dem für die Meso-Diaminopimelat-D-Dehydrogenase kodierenden Gen ddh e) dem für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierenden Gen pck, f) dem für die Glucose-6-Phosphat-6-Isomerase kodierenden Gen pgi, g) dem für die Pyruvat-Oxidase kodierenden Gen poxB, h) dem für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierenden Gen dapA, i) dem für die Dihydrodipicolinat-Reduktase kodierenden Gen dapB; oder j) dem für die Diaminopicolinat-Decarboxylase kodierenden Gen lysA abschwächt ist, und /oder wobei man coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig wenigstens eines dieser Gene so mutiert ist, so dass die enzymatische Aktivivät des korrespondierenden Proteins teilweise oder vollständig verringert wird. 13. The method according to any one of the preceding claims, wherein fermenting coryneform bacteria in which at least one of the genes selected at the same time is selected from: a) the gene coding for the homoserine kinase thrB, b) the ilvA gene coding for threonine dehydratase, c) the gene coding for the threonine synthase thrC d) the gene coding for the mesodiaminopimelate D-dehydrogenase ddh e) the gene pck coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase, f) the gene pgi coding for the glucose-6-phosphate-6-isomerase, g) the gene poxB coding for the pyruvate oxidase, h) the gene dapA coding for the dihydrodipicolinate synthase, i) the gene dapB coding for the dihydrodipicolinate reductase; or j) the lysA gene coding for the diaminopicolinate decarboxylase is weakened, and / or wherein coryneform bacteria are fermented, in which at least one of these genes is mutated at the same time so that the enzymatic activity of the corresponding protein is partially or completely reduced. 14. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt. 14. The method according to one or more of the preceding claims, wherein one Uses microorganisms of the species Corynebacterium glutamicum. 15. Verfahren zur Herstellung eines L-Methionin-haltigen Tierfuttermittel-Additivs aus Fermentationsbrühen, welches folgende Schritte umfasst: a) Kultivierung und Fermentation eines L-Methionin produzierenden Mikroorganismus gemäß der Definition in einem der vorhergehenden Ansprüche in einem Fermentationsmedium; b) Entfernung von Wasser aus der L-Methionin-haltigen Fermentationsbrühe; c) Entfernung der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100 Gew.-% und d) Trocknung der gemäß b) und/oder c) erhaltenen Fermentationsbrühe, um das Tierfuttermittel-Additiv in der gewünschten Pulver- oder Granulatform zu erhalten. 15. A method for producing an L-methionine-containing animal feed additive from fermentation broths, which comprises the following steps: a) cultivation and fermentation of an L-methionine-producing microorganism as defined in one of the preceding claims in a fermentation medium; b) removal of water from the fermentation broth containing L-methionine; c) removal of the biomass formed during the fermentation in an amount of 0 to 100% by weight and d) drying the fermentation broth obtained according to b) and / or c) in order to obtain the animal feed additive in the desired powder or granule form. 16. Isoliertes Polynukleotid gemäß der Definition in einem der Ansprüche 5 bis 7, das für ein Polypeptid mit verringerter metK-Aktivität kodiert. 16. An isolated polynucleotide as defined in any one of claims 5 to 7, which is for encodes a polypeptide with reduced metK activity. 17. MetK-Mutante mit verringerter Aktivität, welches von einem Polynukleotid nach Anspruch 16 kodiert wird. 17. MetK mutant with reduced activity, which is derived from a polynucleotide Claim 16 is encoded. 18. Rekombinante, coryneforme Bakterien, die ein mutiertes metK-Gen, umfassend eine Polynukleotidsequenz gemäß der Definition in einem der Ansprüche 5 bis 7, exprimieren. 18. Recombinant, coryneform bacteria that contain a mutated metK gene Polynucleotide sequence as defined in any one of claims 5 to 7, express. 19. Rekombinante, coryneforme Bakterien nach Anspruch 18, welche das metK- Wildtyp-Enzym nicht mehr exprimieren. 19. Recombinant, coryneform bacteria according to claim 18, which the metK- No longer express wild-type enzyme. 20. Rekombinante, coryneforme Bakterien gemäß Anspruch 19, welche im Vergleich zum korrespondierenden Wildtyp-Stamm wenigstens eines der folgenden Merkmale: a) geringeren, intrazellulären S-Adenosylmethionin-Titer b) geringere, intrazelluläre S-Adenosylmethionin-Synthase-Konzentration oder c) geringere Aktivität der S-Adenosylmethionin-Synthase, bestimmt anhand der S- Adenosylmethionin-Bildungsrate,
und zusätzlich gegebenenfalls wenigstens eines der folgenden Merkmale: d) verbesserte metY-Aktivität oder e) gesteigerte L-Methionin-Menge. aufweisen. 20. Recombinant, coryneform bacteria according to claim 19, which compared to the corresponding wild-type strain at least one of the following features: a) Lower intracellular S-adenosylmethionine titer b) lower, intracellular S-adenosylmethionine synthase concentration or c) lower activity of S-adenosylmethionine synthase, determined on the basis of the S-adenosylmethionine formation rate,
and in addition, if necessary, at least one of the following features: d) improved metY activity or e) increased amount of L-methionine. exhibit. 21. Expressionskonstrukt, enthaltend unter der Kontrolle einer regulativen Nukleotidsequenz die kodierende Sequenz für eine metK-Mutante gemäß der Definition in einem der Ansprüche 5 bis 7. 21. Expression construct containing under the control of a regulative Nucleotide sequence the coding sequence for a metK mutant according to the Definition in one of claims 5 to 7.
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