DE10214260A1

DE10214260A1 - Liposomal polynucleotide complex for therapeutic or cosmetic use comprises at least two sequences coding for related products that regulate cell growth, division, differentiation, function and/or synthesis capacity

Info

Publication number: DE10214260A1
Application number: DE2002114260
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Richter; Marc Jeschke
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-03-30
Filing date: 2002-03-30
Publication date: 2003-10-23

Abstract

Liposomal polynucleotide complex comprises at least two polynucleotide sequences coding for related products that regulate cell growth, division, differentiation, function and/or synthesis capacity. An Independent claim is also included for pharmaceutical and cosmetic compositions for topical or intracutaneous administration comprising the polynucleotide complex.

Description

Die Verbesserung der dermalen Zellstruktur und Wundheilung ist ein Hauptziel der modernen Forschung für das Überleben von Patienten mit akuten Wunden, wie Verbrennungs- und Traumapatienten, sowie chronischen Wunden, wie Patienten mit einer venösen Insuffizienz, Diabetes mellitus, arteriellen Durchblutungsstörungen oder Autoimmunerkrankungen. A major goal is to improve the dermal cell structure and wound healing of modern research for the survival of patients with acute wounds, such as Burn and trauma patients, as well as chronic wounds, such as patients with a venous insufficiency, diabetes mellitus, arterial circulatory disorders or Autoimmune diseases.

Eine chronische Wunde ist eine besonders schwer zu therapierende Form der Wunde. Allein in Deutschland rechnet man mit 2 Millionen chronischen Hautwunden per annum. Mit Anstieg der Lebenserwartung ist in Zukunft mit einem weiteren Anstieg der Häufigkeit derartiger Wundheilungsprobleme zu rechnen. Zudem darf die Gefahr der malignen Entartung einer chronischen Wunde im Langzeitverlauf nicht unterschätzt werden. A chronic wound is a particularly difficult form of treatment Wound. In Germany alone, 2 million chronic skin wounds are expected per annum. With increasing life expectancy there is a further increase in the future the frequency of such wound healing problems. In addition, the danger the malignant degeneration of a chronic wound in the long term is not underestimated become.

Die Anwendung von Gentherapie im Bereich der chronischen Wunden ist ein neuer experimenteller therapeutischer Ansatz, um die dermale Regeneration und damit das klinische Bild des Patienten zu verbessern. Es gibt darüber hinaus weitere Erkrankungen, die sich möglicherweise durch eine Gentherapie der Körperoberfläche behandeln lassen, wie z. B. durch Gendefekte ausgelöste Hauterkrankungen. The use of gene therapy in the area of chronic wounds is a new experimental therapeutic approach to dermal regeneration and thus improve the clinical picture of the patient. There are also others Diseases that may result from gene therapy of the body surface get treated, such as B. skin disorders caused by genetic defects.

Auch im Bereich der Kosmetik, beispielsweise im Zusammenhang mit der Hautalterung, sind durch die genetische Steuerung von Hautzellen Möglichkeiten gegeben. Also in the field of cosmetics, for example in connection with the Skin aging are possible through the genetic control of skin cells given.

In mehreren Studien konnte durch die lokale Applikation von Wachstumsfaktoren eine Wundheilung initiiert werden. Ein neuer Ansatz, Wachstumsfaktoren im Organismus zur Wirksamkeit kommen zu lassen, ist die Transfektion von Zellen im Organismus mit Genen, die für die Synthese von Wachstumsfaktoren zuständig sind. Dazu gehört beispielsweise auch die IGF-I-Gentherapie, um kleine Mengen von IGF-I spezifisch zu Zielzellen zu liefern und somit dessen bei systemischer Gabe gravierende Nebeneffekte zu reduzieren (1-3). Im allgemeinen ist der Gentransfer ein neuer und einzigartiger Ansatz für die Behandlung von verschiedenen Erkrankungen, wie Carcinomen, Infektionen oder Leukämien (4). In several studies, the local application of growth factors wound healing can be initiated. A new approach, growth factors in To make the organism effective is the transfection of cells in the body Organism with genes that are responsible for the synthesis of growth factors. This includes, for example, IGF-I gene therapy for small amounts of IGF-I to be delivered specifically to target cells and thus with systemic administration reduce serious side effects (1-3). In general, gene transfer is a new and unique approach to the treatment of various diseases, such as carcinomas, infections or leukaemias (4).

Der Erfolg der Gentherapie hängt von der Auswahl des Vektors für den Gentransfer ab. Bis heute wurden bevorzugt virale Vektoren benutzt, weil sie sehr spezifische Transfektionsmöglichkeiten aufweisen (4-6). Viren haben jedoch die Eigenschaft, viral infektions-assoziierte, pathologische Reaktionen auszulösen, wie z. B. immunologische Reaktionen, mutagene oder karzinogene Effekte, die Viren als klinisch therapeutischen Ansatz potentiell gefährlich machen (4). The success of gene therapy depends on the selection of the vector for the Gene transfer from. To date, viral vectors have been preferred because they are very have specific transfection options (4-6). Viruses do, however Ability to trigger virally infection-associated pathological reactions, such as z. B. immunological reactions, mutagenic or carcinogenic effects, the viruses as make clinical therapeutic approach potentially dangerous (4).

Eine Alternative wäre der Gentransfer mit nicht-viraler "nackter" DNA. Diese "nackte" DNA enthält keine viralen Komponenten, allerdings ist bei systemischer Applikation die "nackte" DNA sehr fragil und wird somit äußerst schnell degradiert (7). Außerdem erreicht man keine hohen Transfektionsraten, da "nackte" DNA relativ groß ist und außerdem durch deren ungünstige elektrische Ladung ein Zelleintritt nicht wahrscheinlich ist. An alternative would be gene transfer with non-viral "naked" DNA. This "Naked" DNA does not contain any viral components, but it is systemic Application the "naked" DNA very fragile and is degraded extremely quickly (7). In addition, high transfection rates are not achieved because "naked" DNA is relatively large and also because of their unfavorable electrical charge, a cell does not enter is likely.

Liposomen als Transfektionssystem sind ein attraktives Modell, weil sie keine viralen Komponenten aufweisen, sehr stabil sind und die Fähigkeit haben, mit der Zellmembran zu interagieren (7). Die Inkorporation von Cholesterol und die Addition kationischer Eigenschaften zu der üblichen liposomalen Struktur, zusammen mit der Verwendung des Cytomegalovirus (CMV) Promoters in der cDNA haben die Effektivität und die transgene Expression von Liposomen, ähnlich wie die von adenoviralen Konstrukten, erhöht (7, 8). Zusätzlich haben kationische Liposomen die nützliche Eigenschaft, in der Behandlung von Traumata einen endogenen antiinflammatorischen Effekt auszuüben. Kationische Cholesterol-Liposomen inhibieren die Synthese von Stickoxid (NO), Interleukin-1β (IL-1β) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und vermindern somit die hypermetabolische Katabolie (9-12). Liposomes as a transfection system are an attractive model because they are not have viral components, are very stable and have the ability with the Cell membrane to interact (7). The incorporation of cholesterol and the addition cationic properties to the usual liposomal structure, along with the Use of the cytomegalovirus (CMV) promoter in the cDNA has the effectiveness and transgenic expression of liposomes similar to that of adenovirals Constructs, elevated (7, 8). In addition, cationic liposomes have the useful one Property in the treatment of trauma an endogenous anti-inflammatory To exert effect. Cationic cholesterol liposomes inhibit the synthesis of Nitric oxide (NO), interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) and thus reduce hypermetabolic catabolism (9-12).

In experimentellen Studien konnte in der Arbeitsgruppe eines der Erfinder nachgewiesen werden, dass die wöchentliche subkutane Injektion von cholesterol- kationischen Liposomen mit der cDNA codierend für das IGF-I-Gen angetrieben von einem CMV-Promotor die dermale IGF-I-Proteinkonzentrationen erhöht und somit die dermale Zellerholung und Stabilisierung verbessert und die Wundheilung beschleunigt wird (1-3). Dort wurden kürzlich auch die Mechanismen dieser Effekte definiert und bestimmt (3). Indem das Lac-Z-Gen für β-Galactosidase, ein Gen, welches in Säugetieren nicht vorhanden ist, als Markergen benutzt und in Liposomen inkorporiert wurde, identifizierte man nach einer subkutanen Injektion von Liposomen mit dem Lac- Z und IGF-I Gen transfizierte Myofibroblasten, Endothelzellen und Makrophagen und multinucleäre Zellen in der Gegend der Inflammation (3). Diese Zellen wiesen eine hohe Mitoseaktivität und damit hohe Proliferationsraten auf. Dies ist in Übereinstimmung mit Studien von Felgner und Kollegen, die aufzeigen, dass, um Genexpression zu erzielen, DNA-Plasmide in die Zellen eintreten und in den Zellnucleus diffundieren müssen, was als sog. "cellular traffecing" bezeichnet wurde (5-7). In experimental studies, one of the inventors in the working group demonstrated that weekly subcutaneous injection of cholesterol cationic liposomes with the cDNA coding for the IGF-I gene driven by a CMV promoter increases the dermal IGF-I protein concentrations and thus the dermal cell recovery and stabilization improved and wound healing accelerated becomes (1-3). The mechanisms of these effects were also recently defined there determined (3). By the Lac-Z gene for β-galactosidase, a gene which in Mammals are absent, used as a marker gene and incorporated into liposomes was identified after subcutaneous injection of liposomes with the Lac Z and IGF-I gene transfected myofibroblasts, endothelial cells and macrophages and multinuclear cells in the area of inflammation (3). These cells had one high mitotic activity and thus high proliferation rates. This is in Consistent with studies by Felgner and colleagues that show that in order To achieve gene expression, DNA plasmids enter and enter the cells Cell nucleus must diffuse what has been referred to as "cellular traffecing" (5-7).

Es existieren mehrere mögliche Zelleingangsmechanismen, allerdings ist die Endozytose der für die Transfektion wahrscheinlichste (11, 13, 14). Nach der Endozytose wird die aus den Liposomen freigesetzte cDNA vom Nucleus aufgenommen. Weil die nucleare Membran eine Barriere für deren Diffusion in den Zellkern darstellt, funktioniert die Transfektion effizienter in sich schnell teilenden Zellen, da die nucleare Membran während der Zellteilung abwesend ist (6). Die nucleare cDNA wird dann in die mRNA transkribiert, die zum rauhen endoplasmatischen Reticulum transportiert wird, wo sie in Proteine translatiert wird. There are several possible cell entry mechanisms, but that is Endocytosis most likely for transfection (11, 13, 14). After Endocytosis is the cDNA released from the liposomes by the nucleus added. Because the nuclear membrane is a barrier to its diffusion into the Represents cell nucleus, transfection works more efficiently in rapidly dividing Cells because the nuclear membrane is absent during cell division (6). The nuclear cDNA is then transcribed into the mRNA, which is used for roughing endoplasmic reticulum is transported where it is translated into proteins.

In weiteren Studien konnte nachgewiesen werden, dass duch die subcutane Injektion die Expression des transfizierten Gens spezifisch auf die Haut beschränkt werden kann (3). In dieser Studie wiesen Ratten, die den IGF-I-cDNA-Komplex subkutan injiziert bekommen hatten, Erhöhungen im Körpergewicht und in totalen Proteinkonzentration im Serum, Muskel und Leber auf. Es wurden keinerlei Anhaltspunkte für eine Transfektion oder Erhöhung von IGF-I-Expression im Blut, Leber, Milz oder Niere gefunden (1-3). Deshalb war der Schluss zwingend, dass die positiven Effekte von verbessertem Körpergewicht und verbesserter Proteinkonzentration in Serum, Leber und Muskeln auf eine beschleunigte Wundheilung zurückzuführen sind und nicht auf eine systemische Transfektion mit Änderung oder Erhöhung der zirkulierenden systemischen IGF-I-Proteinkonzentration (1-3). Further studies have shown that the subcutaneous Injection restricted the expression of the transfected gene specifically to the skin can be (3). In this study, rats identified the IGF-I cDNA complex had been injected subcutaneously, increases in body weight and in total Protein concentration in the serum, muscle and liver. There were none Evidence of transfection or increased IGF-I expression in the blood, Liver, spleen or kidney found (1-3). Therefore, the conclusion was imperative that the positive effects of improved body weight and improved Protein concentration in serum, liver and muscles accelerated Wound healing are due and not due to systemic transfection Change or increase in circulating systemic IGF-I protein concentration (1-3).

Vermutlich verursacht eine transiente Erhöhung der lokalen Expression des IGF-I Gens und Proteins begleitend auch die Stimulation von Insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) Synthese. Dadurch wird der Spiegel des biologisch aktiven Komplexes IGF-I/IGFBP-3 erhöht ohne begleitende Erhöhung des pathophysiologischen freien zirkulierenden IGF-I-Proteins. Die kleinen Mengen des IGF-I-Proteins nach der liposomalen Transfektion sind deshalb effektiv in einem parakrinen Modus. Unserer Meinung nach ist dies die Ursache, weshalb der liposomale Gentransfer keinerlei gefährlichen allgemeinen Nebenwirkungen aufweist (15, 16). Erhöhte IGF-I Proteinkonzentrationen in der Haut verbessern die Wundheilung im Sinne einer beschleunigten Reepithelisierung und verbesserten dermalen Zellerholung, Stabilität und Synthese, begleitend mit der dermalen Zellmitose. IGF-I hat mitogene Effekte auf Keratinozyten und Fibroblasten, stimuliert die Kollagensynthese und verbessert die Zellerholung und Stabilität nach einer Verletzung. All diese Faktoren beschleunigen und verbessern die Wundheilung (17, 18). Presumably causes a transient increase in local expression of IGF-I Gens and proteins also accompany the stimulation of insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) synthesis. This is the mirror of the biologically active IGF-I / IGFBP-3 complex increases without accompanying increase in pathophysiological free circulating IGF-I protein. The small amounts of IGF-I protein after liposomal transfection is therefore effective in one paracrine mode. In our opinion, this is the reason why the liposomal Gene transfer has no dangerous general side effects (15, 16). Increased IGF-I protein concentrations in the skin improve wound healing in the Meaning of an accelerated re-epithelialization and improved dermal Cell recovery, stability and synthesis, accompanying with dermal cell mitosis. IGF-I has mitogenic effects on keratinocytes and fibroblasts, stimulates collagen synthesis and improves cell recovery and stability after an injury. All these Factors accelerate and improve wound healing (17, 18).

In einer nachfolgenden Studie wurde bestimmt, wie IGF-I die Reepithelisierung beschleunigt. Hautbiopsien wurden immunhistochemisch gefärbt für das Proliferating nuclear antigen (PCNA), um eine eventuelle Erhöhung der dermalen Mitose zu identifizieren. Es wurde gezeigt, dass IGF-I die Zellmitose stimuliert, aber nicht die Differenzierung (3). A subsequent study determined how IGF-I re-epithelialization accelerated. Skin biopsies were stained immunohistochemically for proliferating nuclear antigen (PCNA) to increase the risk of dermal mitosis identify. IGF-I has been shown to stimulate cell mitosis, but not that Differentiation (3).

Basierend auf diesen Ergebnissen steht weiterhin zu vermuten, dass der IGF-I cDNA-Gentransfer weiterhin verbessert werden kann durch eine Kombination von IGF-I cDNA und Keratinocyte growth factor (KGF) cDNA. Keratinocyte growth factor (KGF) ist ein Polypetid von 17 kDalton und ein Mitglied der Fibroblast growth factor (FGF)- Familie (19). KGF stimuliert die Proliferation und hat einen antiapoptotischen Effekt auf epitheliale Zellen, die eine zentrale Rolle in der posttraumatischen Wundheilung spielen (19-21). Weiterhin scheint KGF das proliferative/differenziative Programm der dermalen Zellen von basalen zu suprabasalen Zellen in der Haut zu kontrollieren, welches ein großes therapeutisches Potential für die Beschleungung und Verbesserung des Wundheilungsprozesses beinhaltet (19, 22). Based on these results, it can further be assumed that the IGF-I cDNA gene transfer can be further improved by a combination of IGF-I cDNA and keratinocyte growth factor (KGF) cDNA. Keratinocyte growth factor (KGF) a 17 kDalton polypeptide and a member of the Fibroblast growth factor (FGF) - Family (19). KGF stimulates proliferation and has an anti-apoptotic effect epithelial cells that play a central role in post-traumatic wound healing play (19-21). Furthermore, KGF appears to be the proliferative / differential program of to control dermal cells from basal to suprabasal cells in the skin, which has great therapeutic potential for artificial insults and Improvement in the wound healing process includes (19, 22).

Individuell haben IGF-I und KGF ein großes Potential als Wachstumsfaktoren, die Wundheilung zu verbessern. Dabei scheinen beide Faktoren in Kombination geradezu ideal zu sein. IGF-I beschleunigt die Mitogenität dermaler Zellen, währenddessen KGF deren Migration als auch Differenzierung zu verbessern scheint. Allerdings gibt es bislang keinerlei Daten für eine Gentherapie mit KGF oder einer Kombination von IGF-I und KGF cDNA. Individually, IGF-I and KGF have great potential as growth factors Improve wound healing. Both factors seem to be in combination to be ideal. IGF-I accelerates the mitogenicity of dermal cells, while KGF their migration and differentiation seem to improve. However there is So far no data for gene therapy with KGF or a combination of IGF-I and KGF cDNA.

Wir haben in weiteren Studien die Effektivität von anderen Wachstumsfaktoren untersucht und nachgewiesen. So konnten wir mit den Genen für EGF, VEGF, FGF, TGF, HGF und PDGF zeigen, dass diese Gene die Wundheilung stimulieren und beschleunigen. Zusätzlich ist eine Kombinationstherapie von verschiedenen Faktoren und zu verschiedenen Zeiten auch in der Erfindung inbegriffen. We have the effectiveness of other growth factors in further studies examined and proven. So with the genes for EGF, VEGF, FGF, TGF, HGF and PDGF show that these genes stimulate wound healing and accelerate. In addition, combination therapy is based on various factors and included at various times in the invention.

Im Rahmen der Gentherapie wurde für die Transfektion von Zellen bislang ausschließlich die virale Transfektion bzw. liposomale Transfektion mit Hilfe von invasiven Methoden, vor allem Injektionen angewandt. Eine Arbeit beschreibt den Gentransfer mittels externer Applikation auf intakte Haut mit anschließender Expression. Hierbei handelte es sich jedoch um ein Nonsens-Protein, die β- Galaktosidase, welches keinerlei physiologisches Korrelat oder eine therapeutische Möglichkeit hat (19). So far, gene therapy has been used for the transfection of cells only viral transfection or liposomal transfection with the help of invasive methods, especially injections. One work describes the Gene transfer by external application to intact skin with subsequent Expression. However, this was a nonsense protein, the β- Galactosidase, which has no physiological correlate or therapeutic Possibility (19).

Die bisher publizierte Literatur beschreibt nicht den Transfer von Genen die Effektoren, Regulatoren, und Inhbitoren, mit denen physiologische Wirkungen erzielt bzw. Krankheiten erfolgreich behandelt werden können, mittels epicutaner, intracutaner oder systemischer Applikation einer Lösung, Creme o. ä. auf die betreffende intakte oder verletzte Körperoberfläche. Dies ist das Neue und Gegenstand der vorliegenden Erfindung. The literature published so far does not describe the transfer of genes Effectors, regulators, and inhibitors with which physiological effects are achieved or diseases can be successfully treated using epicutaneous, intracutaneous or systemic application of a solution, cream or the like to the intact in question or injured body surface. This is new and the subject of the present Invention.

The invention

Die vorliegende Erfindung basiert auf einem liposomalen, promotergetriebenen Carriersystem mit dessen Hilfe verschiedene cDNA-Konstrukte für unterschiedliche Wachstumsfaktoren, deren Rezeptoren, regulierende Proteine oder inhibierende Nukleinsäuren epicutan, transcutan, intracutan, subcutan oder systemisch verabreicht werden können. Die Anwendung oben beschriebener Nukleinsäuren oder deren Nukleinsäureanaloge (Phosphorothioate, PNA, LNA) kann einzeln oder in unterschiedlichster Kombination (multiplex) erfolgen. The present invention is based on a liposomal, promoter driven Carrier system with the help of different cDNA constructs for different Growth factors, their receptors, regulating proteins or inhibiting Epicutaneous, transcutaneous, intracutaneous, subcutaneous or systemic nucleic acids administered can be. The use of the nucleic acids described above or their Nucleic acid analogs (phosphorothioates, PNA, LNA) can be used individually or in different combinations (multiplex).

Zur Konstruktion von funktionellen Genkassetten werden verschiedene fachübliche Nukleinsäuretechniken eingesetzt: Mittels PCR-Amplifikation, Klonierung und RNA/DNA-Reinigungsverfahren werden künstliche, nichtvirale Nukleinsäure- Konstrukte etabliert, die den essentiellen Leserahmen (ORF) der Zielgene enthalten. Solche Genabschnitte werden zwischen einen aktiven Promoter (z. B. CMV) und einen Terminator inseriert und vermehrt. Dazu werden die resultierenden nonviralen Vektoren entweder plasmidären oder linearen Ursprungs mittels Mikroorganismen (z. B. E. coli) oder in vitro (z. B. PCR) so amplizifiert und gereinigt, daß möglichst keine Anitbiotika-Resistenzgene mehr im Endkonstrukt vorhanden sind. So ist der Einsatz verschiedener Konstrukte z. B. aus

1. einem singulären Effektor-Regulator oder Inhibitor-Gen,
2. einer Kombination entsprechender singulärer Vektormoleküle miteinander und
3. multiplen Konstrukten (Multiplex-Vehikel aus z. B. Wachstumsfaktor plus korrespondierendem Rezeptor auf gleichem Konstrukt) vorgesehen.

Various conventional nucleic acid techniques are used to construct functional gene cassettes: By means of PCR amplification, cloning and RNA / DNA purification processes, artificial, non-viral nucleic acid constructs are established that contain the essential reading frame (ORF) of the target genes. Such gene segments are inserted and propagated between an active promoter (e.g. CMV) and a terminator. For this purpose, the resulting nonviral vectors, either plasmid or linear in origin, are amplified and purified by means of microorganisms (for example coli) or in vitro (for example PCR) in such a way that, if possible, no antibiotic resistance genes are present in the final construct. So the use of different constructs z. B. from

1. a singular effector regulator or inhibitor gene,
2. a combination of corresponding singular vector molecules with one another and
3. multiple constructs (multiplex vehicle from, for example, growth factor plus corresponding receptor on the same construct) are provided.

Mit dieser Kombination der Effektoren, Regulatoren, und Inhibitoren (Orchestry) ist es erstmals möglich die komplexe Pathophysiologie der Zelleregenration im Rahmen der Wundheilung, Onkologie und Kosmetik zu modulieren. With this combination of effectors, regulators, and inhibitors (orchestry) it is possible for the first time the complex pathophysiology of cell regeneration in the Modulate framework of wound healing, oncology and cosmetics.

Als Effektoren werden Polynucleotidsequenzen für alle erdenklichen Wachstumsfaktoren bzw. deren Rezeptoren eingesetzt, wie z. B. KGF, IGF, EGF, VEGF, PDGF, FGF, TGF, HGF einzeln oder in beliebiger Kombination. Dazu gehören auch Polynucleotidsequenzen für Matrixproteine, z. B. Kollagen oder Fibrin. Polynucleotide sequences for all are conceivable as effectors Growth factors or their receptors used, such as. B. KGF, IGF, EGF, VEGF, PDGF, FGF, TGF, HGF individually or in any combination. This includes also polynucleotide sequences for matrix proteins, e.g. B. collagen or fibrin.

Als Regulatoren werden Nukleinsäuresequenzen von Induktoren verschiedener Wachstumsfaktorsystemen (Wachstumsfaktoren plus deren entsprechende Rezeptoren) oder aktivierenden Proteinen (z. B. PR 39, HIF-1α) eingesetzt. Nucleic acid sequences of inducers are different as regulators Growth factor systems (growth factors plus their corresponding Receptors) or activating proteins (e.g. PR 39, HIF-1α) are used.

Als Inhibitoren werden Antisense-Polynucleotidsequenzen (z. B. RNAi) gegen unterschiedlichste Rezeptoren, Proteasen oder Onkogene eingesetzt. Antisense polynucleotide sequences (eg RNAi) are used as inhibitors against different receptors, proteases or oncogenes used.

Als Anwendung ergibt sich durch die effektive Transfektion von Hautzellen bei Applikation auf intakte, unversehrte Haut, z. B. mit dem Zweck, deren Proliferation zu steigern oder das Absterben zu vermindern und damit das kosmetische Aussehen der Haut zu verbessern. Die transfizierten dermalen Zellen exprimieren vermutlich Proteine, welche die Zellen stabilisieren, regenerieren und zu einer vermehrten Teilung anregen. Dies führt dazu, dass die verschiedenen Kollagenarten verbessert synthetisiert und strukturierter werden, mit dem Erfolg, dass dieses azelluläre Gerüst alter Haut wieder Straffheit und Organisation und somit die Form und das Aussehen junger Haut verleiht. Zusätzlich wird durch eine Anregung der Zellteilung der Zellzyklus gesteigert, was ein Abstoßen von alten, zerstörten Zellen und ein Nachwachsen von jungen, frischen dermalen Zellen beinhaltet. The application results from the effective transfection of skin cells Application to intact, intact skin, e.g. B. with the purpose of increasing their proliferation increase or decrease the death rate and thus the cosmetic appearance of the Improve skin. The transfected dermal cells presumably express Proteins that stabilize the cells, regenerate them and increase their division stimulate. This causes the various types of collagen to improve are synthesized and structured, with the success that this acellular scaffold old skin again tightness and organization and thus the shape and appearance gives young skin. In addition, the cell cycle is stimulated by cell division increased, which is a rejection of old, destroyed cells and a regrowth of young, fresh dermal cells.

Durch Eingreifen in die Steuerung der Melaninproduktion, indem Schlüsselenzyme herauf oder herunterreguliert werden, kann die Bräunung der Haut oder deren Aufhellung bei Pigmentstörungen verursacht werden. Die Hautbräunung kann dazu führen, dass der Körper, d. h. die Haut vor Schäden durch UV bzw. Sonnenlicht besser geschützt wird. Besserer Schutz vor körperlichen Schäden kann auch bewirkt werden durch Regulation von Enzymen, die zum Schutzsystem gegen oxidativen Stress in der Haut gehören. By intervening in the control of melanin production by Key enzymes that are up or down regulated can tan the skin or whose lightening is caused by pigment disorders. The skin tan can cause the body, i.e. H. the skin from damage from UV or Sunlight is better protected. Better protection against physical damage can also caused by regulation of enzymes that protect against include oxidative stress in the skin.

Polynucleotidsequenzen, die die Zellalterung verhindern können, wie z. B. codierende Sequenzen für das Enzym Telomerase, die mit der Verhinderung der allmählichen Verkürzung der Chromosomenenden und der damit einhergehenden Zellalterung in Zusammenhang steht, können äußerst interessant im Zusammenhang mit der Verhinderung der Hautalterung sein. Polynucleotide sequences that can prevent cell aging, such as. B. coding sequences for the enzyme telomerase, with the prevention of gradual shortening of the chromosome ends and the associated Cell aging related can be extremely interesting related with preventing skin aging.

Auch Hauterkrankungen, die mit genetischen Defekten einhergehen, können mit dem liposomalen Polynucleotidkomplex behandelt werden. Durch Anwendung dieses Produktes wird eine Substitution von Polynucleotidsequenzen, die den jeweiligen Gendefekt auf molekularer, biochemischer oder zellulärer Ebene ausgleichen, ermöglicht. Dies kann erfolgen z. B. durch Aufbringen codierender Sequenzen für die intakten Proteine bzw. von Polynucleotiden, die die Expression der defekten Gene verhindern (z. B. eine entsprechende Antisense-RNA). Kandidaten dafür sind beispielsweise Epidermolysis bullosa, die bei einzelnen Patienten schon mit Defekten in den Genen für Keratin K5 bzw. K14 oder dem Typ VII Kollagen in ursächlichen Zusammenhang gebracht werden, oder Xeroderma pigmentosum, wo durch Transfektion von Zellen betroffener Patienten mit cDNA für verschiedene DNA- Reparaturenzyme in vitro die gestörten DNA-Reparatur-Charakteristiken behoben werden konnten. Skin diseases that are associated with genetic defects can also occur the liposomal polynucleotide complex are treated. By applying this Product will be a substitution of polynucleotide sequences that correspond to each Compensate for gene defects at the molecular, biochemical or cellular level, allows. This can be done e.g. B. by applying coding sequences for the intact proteins or polynucleotides, which are the expression of the defective genes prevent (e.g. an appropriate antisense RNA). Are candidates for it for example epidermolysis bullosa, which in some patients already has defects in the genes for keratin K5 or K14 or type VII collagen in causal Or Xeroderma pigmentosum, where by Transfection of cells from affected patients with cDNA for different DNA In vitro repair enzymes fixed the disturbed DNA repair characteristics could become.

Allgemein können nicht nur Polynucleotidsequenzen appliziert werden, die für die jeweiligen erwünschten Proteine codieren, sondern auch solche, die der Steuerung der Synthese in und/oder Sekretion von Substanzen, z. B. Proteinen aus den Zielzellen der Transfektion dienen. So kann etwa ein Gen dadurch aktiviert werden, dass das Gen für einen Aktivator für dieses Genes eingeschleust wird. Damit könnte die Expression chromosomal schon natürlicherweise vorliegender Gene gesteuert werden. In general, not only polynucleotide sequences can be applied for the encode respective desired proteins, but also those that control the Synthesis in and / or secretion of substances, e.g. B. Proteins from the target cells Serve transfection. For example, a gene can be activated by the gene for an activator for this gene is introduced. This could be the expression chromosomal genes that are already naturally present can be controlled.

Der liposomale Polynucleotidsequenzkomplex besteht aus Lipiden, die mit Polynucleotidsequenzen stabile Komplexe eingehen, z. B. synthetischen polaren Lipiden mit positiver Ladung, wie DMRIE (1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxylethylammoniumbromid), teils mit Zusätzen wie Cholesterol. Auch mit stark negativ geladenen Lipiden sind stabile Kompexe herstellbar, z. B. in Form von Cochleaten, spiralförmigen Bilayer-Strukturen mit positiven Ionen wie Ca2+-Ionen, die die negativen Ladungen verbinden. Auch geladene Zusätze, wie Stearylamin, können als Ladungsträger in Liposomen fungieren und so die Ausbildung stabiler Komplexe mit den jeweiligen Polynucleotidsequenzen ermöglichen. Eine ausführliche Beschreibung über die Herstellung polynucleotidhaltiger Liposomen findet sich in Lasic (13). The liposomal polynucleotide sequence complex consists of lipids that are associated with Polynucleotide sequences enter into stable complexes, e.g. B. synthetic polar Lipids with a positive charge, such as DMRIE (1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxylethylammonium bromide), some with additives such as cholesterol. Even with strong negatively charged lipids, stable complexes can be produced, e.g. B. in the form of Cochleates, spiral bilayer structures with positive ions such as Ca2 + ions connect the negative charges. Loaded additives such as stearylamine can also act as charge carriers in liposomes and thus the formation of stable complexes enable the respective polynucleotide sequences. A detailed description Lasic (13) describes the production of liposomes containing polynucleotides.

Der bevorzugte Liposomendurchmesser für eine effektive Transfektion liegt bei 200 bis 450 nm, mit geringerer Effizienz ist jedoch auch bei Liposomengrößen von 20 bis 100 nm mit einer Transfektion zu rechnen. Hinisichtlich des Verhältnisses von Liposomen zu den Polynucleotiden haben sich 1 bis 5 µg Polynucleotide plus 10 µl Lipidgemisch in 180 µl Kochsalzlösung als günstig erwiesen. Jedoch auch ein Bereich von 1 ng bis 2 mg Polynucleotiden ist prinzipiell möglich. Auch das Lipid- /Kochsalzlösungsverhältnis kann variieren, etwa von 1 : 100 bis 1 : 1 (V/V). The preferred liposome diameter for effective transfection is included 200 to 450 nm, but with lower efficiency is also with liposome sizes of 20 up to 100 nm with a transfection. Regarding the ratio of Liposomes to the polynucleotides have 1 to 5 µg polynucleotides plus 10 µl Lipid mixture in 180 µl saline proved to be favorable. But also an area In principle, from 1 ng to 2 mg of polynucleotides is possible. The lipid / Saline ratio can vary, for example from 1: 100 to 1: 1 (v / v).

Die galenische Zubereitung kann eine wässrige Suspension sein. Es bietet sich jedoch auch die Verarbeitung zu jeder weiteren geeigneten galenischen Aufbereitung von Liposomen und DNA an, z. B. als Gel, Hydrogel, Emulsion, oder auch einer Creme oder Salbe. Weitere Applikationsformen, wie Sprühpflaster, sind ebenso vorstellbar. Die Formulierung der entsprechenden Applikationsformen erfolgt gemäß den dem Fachmann bekannten Verfahren. The pharmaceutical preparation can be an aqueous suspension. It offers but also processing for any other suitable galenical preparation of liposomes and DNA, e.g. B. as a gel, hydrogel, emulsion, or a cream or ointment. Other forms of application, such as spray plasters, are also conceivable. The corresponding application forms are formulated in accordance with the Methods known to those skilled in the art.

applications

1. Can reponse
2. IGF + KGF

Example 1

Herstellung einer Suspension mit dem liposomalen Polynucleotidsequenzkomplex, bestehend aus cholesterol-kationischen Liposomen (10 µl Liposomen in 180 µl NaCl) und cDNA für IGF-I. Die IGF-I-cDNA war dabei in dem Plasmid-Vektor pcDNA3, den wir vom UTMB Sealy Center for Molecular Science Recombinant DNA Core Facility, Galveston, Texas, erhalten hatten, hinter einen Cytomegalovirus(CMV)-Promoter geschaltet. Die Wachstumsfaktor cDNA kam aus dem UTMB Sealy Center for Molecular Science Recombinant DNA Core Facility, Galveston, Texas. Wir integrierten die cDNA in das Plasmid, wie es z. B. bei Winsharley and Rapley (20) beschrieben ist. Wir verwendeten jeweils 2,2 µg der DNA. Die Liposomen bestanden aus einer Mischung von 1 : 1 (M/M) DMRIE (1,2- Dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxylethylammoniumbromid) und Cholesterol, welches in einem membrangefilterten Wasser hergestellt worden ist (Life Technologies, Rockville, MD). Diese Reagenzien interagieren spontan miteinander, so dass die cDNA sofort die liposomalen cDNA-Komplexe formen kann. Die Komplexe wurden frisch hergestellt, bevor sie appliziert wurden. Das in einigen Fällen zusätzlich verwendete Reportergen für β-Galactosidase (Lac Z cDNA) wurde in einer Konzentration von 0,2 µg zugegeben. Preparation of a suspension with the liposomal polynucleotide sequence complex consisting of cholesterol-cationic Liposomes (10 µl liposomes in 180 µl NaCl) and cDNA for IGF-I. The IGF-I cDNA was in the plasmid vector pcDNA3, which we from the UTMB Sealy Center for Molecular Science Recombinant DNA Core Facility, Galveston, Texas switched a cytomegalovirus (CMV) promoter. The growth factor cDNA came from the UTMB Sealy Center for Molecular Science Recombinant DNA Core Facility, Galveston, Texas. We integrated the cDNA into the plasmid as described e.g. B. at Winsharley and Rapley (20). We each used 2.2 µg of DNA. The liposomes consisted of a mixture of 1: 1 (M / M) DMRIE (1,2- Dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxylethylammonium bromide) and cholesterol, which has been produced in a membrane-filtered water (Life Technologies, Rockville, MD). These reagents interact with each other spontaneously, so that the cDNA can immediately form the liposomal cDNA complexes. The complexes were freshly made before they were applied. In some cases, this is additional reporter gene for β-galactosidase (Lac Z cDNA) was used in a Concentration of 0.2 µg added.

Example 2

Der analog zum Beispiel 1 hergestellte liposomale Polynucleotidsequenzkomplex mit IGF-1, EGF, KGF und PDGF, aus der gleichen Bezugsquelle wie die IGF-I cDNA; sowie dem Reportergen wurde auf Wunden appliziert. Wir verwendeten dafür je 150 Ratten mit akuten und chronischen Wunden. Die Anwendung erfolgte bei jeweils 50 Ratten jeder Gruppe durch externe oder intracutane Applikation der liposomalen Polynucleotidsequenzkomplexe. Je 50 Ratten dienten als Kontrolle. Über einen Zeitraum von 56 Tagen konnte mit der intracutanen Applikation im Schnitt eine 30%ige Verbesserung der Reepithelisierung erzielt werden, mit der externen Applikation auf die Wunden eine 25%ige Verbesserung. Die immunhistochemische Anfärbung zeigte eine Verbesserung der Kollagen-Strukturen und Formation, die einer Verbesserung der Hautqualität entspricht. Weiterhin konnten wir zeigen, dass die dermale Hautzellproliferation gesteigert und verbessert war mit der Applikation der liposomale Polynucleotidsequenzkomplexe. Für das Reportergen haben wir Immunhistochemie- sowie sowie Chemolumineszenzassays verwandt (3, 21). Damit konnte der Nachweis geführt werden, dass die Zellen effektiv transfiziert waren. Literaturstellen 1. Jeschke, M. G., Barrow, R. E., Hawkins, H. K., Yang, K., Hayes, R., Lichtenbelt, B. J., Perez-Polo, J. R., and Herndon, D. N. 1999. IGF-I gene transfer in thermally injured rats. Gene Therapy; 6: 1015-1020.
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21. O'Connor, KL., Culp, LH. 1994. Quantitaion of two histochemical markers in the same extracts using chemiluminescent substrates. Biotechniques 17: 502-509. The liposomal polynucleotide sequence complex with IGF-1, EGF, KGF and PDGF, produced analogously to Example 1, from the same source as the IGF-I cDNA; and the reporter gene was applied to wounds. We used 150 rats each with acute and chronic wounds. The application was carried out in 50 rats of each group by external or intracutaneous application of the liposomal polynucleotide sequence complexes. 50 rats were used as controls. Over a period of 56 days, an average of 30% improvement in re-epithelialization could be achieved with intracutaneous application, and 25% improvement with external application to the wounds. The immunohistochemical staining showed an improvement in the collagen structures and formation, which corresponds to an improvement in the skin quality. Furthermore, we were able to show that dermal skin cell proliferation was increased and improved with the application of the liposomal polynucleotide sequence complexes. We used immunohistochemistry and chemiluminescence assays for the reporter gene (3, 21). This provided evidence that the cells were effectively transfected. References 1. Jeschke, MG, Barrow, RE, Hawkins, HK, Yang, K., Hayes, R., Lichtenbelt, BJ, Perez-Polo, JR, and Herndon, DN 1999. IGF-I gene transfer in thermally injured rats , Gene therapy; 6: 1015-1020.
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Claims

1. Liposomal polynucleotide sequence complex, characterized in that the polynucleotide sequence complex contains at least two polynucleotide sequences which code related products, the polynucleotide sequences or the products coded by them directly or indirectly cell growth, cell division, cell differentiation, cell function and / or synthesis performance of the transfected cell regulate.

2. Liposomal polynucleotide sequence complex according to claim 1, characterized characterized that polynucleotide sequences contained therein, in any Combination, for growth factors or cytokines or their corresponding Code receptors and their activators or inhibitors.

3. liposomal polynucleotide sequence complex according to one of claims 1 to 2, characterized in that the genes for KGF, IGF, EGF, VEGF, PDGF, FGF, TGF, HGF and their receptors individually or in any Combination.

4. Liposomal polynucleotide sequence complex according to claim 1, characterized characterized in that contained polynucleotide sequences, individually or in any combination, code for enzymes.

5. Medicament for topical or intracutaneous application, containing one Liposomal polynucleotide sequence complex according to one of claims 1 to 4.

6. Cosmetic for topical or intracutaneous application, containing one Liposomal polynucleotide sequence complex according to one of claims 1 to 4.

7. Medicament according to claim 5 or cosmetic according to claim 6, characterized characterized that it is in liquid form.

8. Medicament according to claim 5 or cosmetic according to claim 6, characterized characterized that it is in the form of a gel.

9. Medicament according to claim 5 or cosmetic according to claim 6, characterized characterized that it is present as a hydrogel.

10. Medicament according to claim 5 or cosmetic according to claim 6, characterized characterized that it is present as an ointment.

11. Medicament according to claim 5 or cosmetic according to claim 6, characterized characterized that it is available as a cream.

12. Use of the liposomal polynucleotide sequence complex according to the Definition in one of the preceding claims for the treatment of wounds.

13. Use of the liposomal polynucleotide sequence complex according to the Definition in one of the preceding claims for treatment for Treatment of chronic wounds.

14. Use of the liposomal polynucleotide sequence complex according to the Definition in one of the preceding claims for the treatment of Diseases associated with genetic defects.

15. Use of the liposomal polynucleotide sequence complex according to the Definition in one of the preceding claims for protection against physical Damage.