DE10214095C1 - Dedifferenzierte, programmierbare Stammzellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung und Verwendung - Google Patents
Dedifferenzierte, programmierbare Stammzellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung und VerwendungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Herstellung von dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen aus menschlichen Monozyten durch Kultivieren von Monozyten in einem Kulturmedium, welches M-CSF und IL-3 enthält. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Präparate, welche die dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen enthalten sowie die Verwendung dieser Stammzellen zur Herstellung von Zielzellen und Zielgewebe.
Description
Die Erfindung betrifft dedifferenzierte, programmierbare Stamm
zellen abgeleitet von humanen Monozyten, sowie deren Herstellung und deren
Verwendung zur Herstellung von Körperzellen und Geweben.
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es
sich um autologe humane Stammzellen, d. h. die monozytäre Ur
sprungszelle stammt von demjenigen Patienten, der mit der aus
der Ursprungszelle hervorgegangen Stammzelle bzw. mit den aus
dieser Stammzelle hervorgegangenen Körperzellen therapiert
werden soll.
Als "Stammzellen" werden solche Zellen bezeichnet, welche (a)
die Fähigkeit zur Selbst-Vermehrung und (b) die Fähigkeit zur
Als "Stammzellen" werden solche Zellen bezeichnet, welche (a)
die Fähigkeit zur Selbst-Vermehrung und (b) die Fähigkeit zur
Bildung mindestens eines und vielfach zahlreicher spezialisier
ter Zelltypen besitzen [vergl. Peter J. Donovan und John Gear
hart, Nature 414, 92-97, (2001)]. Als "pluripotent" werden
Stammzellen bezeichnet, die sich in im wesentlichen alle denk
baren Zelltypen des menschlichen und tierischen Körpers dif
ferenzieren können. Derartige Stammzellen sind bisher nur aus
embryonalem Gewebe bzw. aus embryonalem Karzinom (testikularen
Tumoren) erhältlich (vergl. a. a. O.). Die Verwendung embryonaler
Stammzellen wird in der Öffentlichkeit insbesondere in Deutsch
land umfangreich diskutiert und als außerordentlich problema
tisch betrachtet. Neben der mit embryonalen Stammzellen verbun
denen ethischen und rechtlichen Problematik, stößt auch der
therapeutische Einsatz derartiger Zellen auf Schwierigkeiten.
Naturgemäß stammen embryonale Stammzellen von Spender-Organis
men, die gegenüber den potentiellen Empfängern von aus diesen
Zellen hervorgegangenen differenzierten Zellen oder Gewebe
(nachfolgend als Zielzellen oder Zielgewebe bezeichnet), hete
rolog sind. Es ist somit zu erwarten, daß derartige Zielzellen
in den potentiellen Empfängern eine immunologische Sofort
antwort im Sinne der Abstoßung auslösen werden.
Stammzellen lassen sich auch aus verschiedenen Geweben adulter,
d. h. ausdifferenzierter Individuen isolieren. Derartige Stamm
zellen werden als "multipotente adulte Stammzellen" bezeichnet.
Sie spielen im Körper eine Rolle bei der Geweberegeneration und
bei der Homöostase. Der wesentliche Unterschied zwischen em
bryonalen pluripotenten Stammzellen und adulten multipotenten
Stammzellen liegt in der Zahl der differenzierten Gewebe, die
aus den jeweiligen Zellen gewonnen werden können. Ursache hier
für ist vermutlich, daß pluripotente Stammzellen aus Samenzel
len oder aus Zellen hervorgehen, die Samen produzieren können,
während adulte multipotente Stammzellen aus dem Körper oder dem
Soma adulter Individuen stammen (vergl. a. a. O., Seite 94), die
zur Samenproduktion nicht in der Lage sind.
Die eigentliche Problematik bezüglich der Gewinnung und Verwen
dung adulter Stammzellen beruht jedoch auf dem seltenen Vor
kommen dieser Zellen. So finden sich im Knochenmark Stammzellen
nur im Verhältnis von 1 : 10.000, im peripheren Blut von
1 : 250.000 und in der Leber im Verhältnis von 1 : 100.000. Die
Gewinnung derartiger Stammzellen ist somit sehr aufwendig und
für den Patienten belastend. Darüber hinaus ist die Generierung
großer Zellmengen, wie sie zur klinischen Therapie benötigt
werden, mit vertretbarem Aufwand bisher kaum möglich.
Dem steht ein ständig wachsender Bedarf an Möglichkeiten zur
Behandlung von zerstörtem Gewebe im Sinne des "tissue en
gineering" oder als zelluläre Therapie gegenüber, im Rahmen
derer Haut-, Muskel-, Herzmuskel-, Leber-, Insel-, Nerven-,
Neuronen-, Knochen-, Knorpel-, und Endothelzellen und Fettzel
len etc. zu ersetzen sind.
Entscheidend ist in diesem Zusammenhang die für die westliche
Welt vorauszusehende Entwicklung des Alters- und Krankheits
profils der Bevölkerung, die für die nächsten 10 Jahre eine
drastische Wende auf dem Gesundheits- und Versorgungssektor der
westeuropäischen Bevölkerung einschl. USA und Kanada erwarten
läßt. Allein für die Bundesrepublik Deutschland läßt die demo
grafische Entwicklung bis zum Jahre 2015 einen Zuwachs der
Bevölkerung in den Altersklasse von 45-64 Jahren um 21% und in
der Gruppe der über 65jährigen einen Zuwachs von 26% vermuten.
Hieraus wird zwangsläufig eine Wandlung der Patientenstruktur
und des behandlungsbedürftigen Krankheitsspektrums resultieren.
Vorhersehbarerweise werden Erkrankungen des Herz-Kreislauf-
Systems (Hochdruck, Myocardinfarkt), Gefäßerkrankungen durch
Arteriosklerose und Stoffwechselerkrankungen, metabolische
Erkrankungen wie Diabetes mellitus, Leberstoffwechseler
krankungen, Nierenfunktionserkrankungen sowie durch al
tersbedingte Degeneration verursachte Erkrankungen des Knochen-
und Knorpelgerüstes und degenerative Erkrankungen des Cerebrums
durch neuronale und gliale Zellverluste zunehmen und innovative
Behandlungskonzepte erforderlich machen.
Vor diesem Hintergrund erklären sich die immensen nationalen
und internationalen Bemühungen an Forschung und Entwicklung
beteiligter Fachleute, Stammzellen in die Hand zu bekommen, die
sich in ausdifferenzierte gewebetypische Zellen (Leber, Kno
chen, Knorpel, Muskel, Haut etc.) programmieren lassen.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Stammzellen zur
Verfügung zu stellen, deren Generierung keine ethischen
und/oder rechtlichen Probleme verursacht, die schnell für den
geplanten Therapieeinsatz in den hierfür erforderlichen Mengen
und zu vertretbaren Herstellungskosten zur Verfügung stehen,
und die beim Einsatz als "zelluläre Therapeutika" keine oder
keine nennenswerten Nebenwirkungen im Sinne der zellulären
Abstoßung und der Induktion von Tumoren, insbesondere von bös
artigen Tumoren, in dem jeweiligen Patienten auslösen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Herstellung von
dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen aus menschlichen Monozyten
gelöst. Der Be
griff "Dedifferenzierung" ist dem auf dem einschlägigen Gebiet
tätigen Fachmann geläufig, vgl. beispielsweise Weissmann I. L.,
Cell 100, 157-168, Abb. 4, (2000). Er bedeuted die Rückführung
einer bereits spezialisierten (differenzierten) Körperzelle in
den Status einer Stammzelle, d. h. einer Zelle, welche ihrer
seits in eine Vielzahl von Zelltypen überführt (programmiert)
werden kann. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß das
erfindungsgemäße Verfahren zur Dedifferenzierung von Monozyten
führt. Die auf diese Weise hergestellten Stammzellen lassen
sich in zahlreiche verschiedene Zielzellen, bzw. Zielgewebe
umwandeln (programmieren), vgl. Beispiele. Die erfindungsge
mäßen Stammzellen exprimieren neben dem für ausdifferenzierte
Monozyten kennzeichnenden Oberflächenantigen CD14 mindestens
einen, vorzugsweise zwei oder drei, der typischen Pluri
potenzmarker CD90, CD117, CD123 und CD135. In besonders bevor
zugter Weise exprimieren die erfindungsgemäß hergestellten
Stammzellen sowohl das Oberflächenantigen CD14 als auch die
vier Pluripotenzmarker CD90, CD117, CD123 und CD135, vgl. Bei
spiel 2, Tabelle 1. Es werden damit erstmals adulte Stammzellen
zur Verfügung gestellt, die innerhalb kurzer Zeit zu vorzugs
weise autologen Geweben reprogrammierbar sind.
Die Generierung der erfindungsgemäßen Stammzellen ist für den
Patienten völlig unbedenklich und - bei autologer Anwendung -
mit einer Eigenblutspende vergleichbar. Die für die üblichen
Therapieoptionen (s. oben) benötigte Menge an Stammzellen (108
bis 109 Zellen) kann innerhalb von 10 bis 14 Tagen nach Blutab
nahme kostengünstig bereitgestellt werden. Darüber hinaus er
zeugt das für die Therapie vorgesehene Zellprodukt kein im
munologisches Problem im Sinne der Zellabstoßung, da vor
zugsweise Zellen und Empfänger genetisch identisch sind.
Die erfindungsgemäßen Stammzellen erwiesen sich ferner im Tier
versuch und in Kultur als risikolos bezüglich der Malig
nomentstehung, ein Ergebnis, welches aufgrund der monozytären
Ursprungszelle, von der sich die erfindungsgemäßen Stammzellen
ableiten, nicht anders zu erwarten ist.
Die wesentlichen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Herstellung von adulten Stammzellen umfassen:
- a) Isolieren von Monozyten aus Human-Blut,
- b) Vermehren der Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium, welches den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (nachfolgend als M-CSF bezeichnet) enthält; und
- c) Kultivieren der Monozyten in Gegenwart von Interleukin 3 (IL-3). Das Vermehren und die Behandlung mit IL-3 können in einer Stufe durchgeführt werden, indem man dem Kultur medium sowohl den Wachstumsfaktor als auch IL-3 zusetzt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden
die Zellen ferner in Gegenwart einer Mercaptoverbindung kul
tiviert. Die Kultivierung kann in einer gesonderten Verfah
rensstufe erfolgen, die sich an die oben beschriebene Kul
tivierung anschließt. Sie kann jedoch auch in der gleichen
Stufe erfolgen, indem man dem Kulturmedium, vorzugsweise be
reits zu Beginn der Kultivierung, ferner die Mercaptoverbindung
zusetzt.
Im Anschluß an die Kultivierung der Zellen in Gegenwart
von M-CSF, sowie in
Gegenwart von IL-3 und gegebenenfalls einer Mercaptoverbindung,
erfolgt vorzugsweise eine Behandlung mit einem biologisch ver
träglichen organischen Lösungsmittel.
Das erfindungsgemäße Verfahren führt überraschenderweise zur
Dedifferenzierung der Monozyten, wobei die aus der Dedifferen
zierung resultierenden Stammzellen neben dem für ausdifferen
zierte Monozyten typischen Oberflächenantigen CD14 auch mindes
tens einen oder mehrere, vorzugsweise sämtliche der Pluri
potenzmarker CD90, CD117, CD123 und CD135 exprimieren (vergl.
Tabelle 1). Die Expression der jeweiligen Marker (Oberflächen
antigene) kann mittels kommerziell erhältlicher Antikörper mit
Spezifität gegenüber den jeweils zu ermittelnden Antigenen mit
üblichen Immunnachweisverfahren nachgewiesen werden, vgl. Bei
spiel 2.
Da die Zellen während des Vermehrungs- und Dedifferenzierungs
prozesses am Boden des jeweiligen Kulturgefäßes haften, ist es
erforderlich, die Zellen nach Abschluß der Dedifferenzierung
vom Untergrund zu lösen. Die Ablösung kann mechanisch erfolgen,
bevorzugt ist jedoch die enzymatische Ablösung mit beispiels
weise Trypsin.
Die so erhaltenen, frei im Medium flottierenden dedifferenzier
ten programmierbaren Stammzellen können entweder direkt dem Re
programmierungsprozeß zugeführt werden, oder aber für einige
Tage im Kulturmedium gehalten werden, wobei in letzterem Falle
dem Medium vorzugsweise ein Zytokin oder LIF (leucaemia in
hibitory factor) zugesetzt wird, um vorzeitigen Verlust der
Programmierbarkeit zu vermeiden (vgl. Donovan und Gearhart,
a. a. O., Seite 94). Schließlich können die Zellen zum Zwecke der
Lagerung ohne Verlust der Programmierbarkeit tiefgefroren wer
den.
Die erfindungsgemäßen Stammzellen unterscheiden sich von den
bisher bekannten pluripotenten Stammzellen embryonalen Ur
sprungs und von den bekannten adulten Stammzellen aus unter
schiedlichen Geweben dadurch, daß sie neben den multipotenten
Stammzellmarkern CD90, CD117, CD123 und/oder CD135, auch den
typischen Differenzierungsmarker CD14 der Monozyten auf ihrer
Oberfläche tragen, aus denen sie hervorgegangen sind.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Stamm
zellen können zu beliebigen Körperzellen reprogrammiert werden.
Verfahren zum Reprogrammieren von Stammzellen sind im Stand der
Technik bekannt, vergl. beispielsweise Irving L. Weisman,
Science 287, 1442-1446 (2000) und Insight Review Articles
"Nature 414, 92-131, (2001), sowie das Handbuch "Methods of
Tissue Engineering", Herausg. Anthony Atala und Robert P,
Lanza, Academic Press, ISBN: 0-12-436636-8; Library of Congress
Catalog Card No. 200188747.
Beispielsweise können die erfindungsgemäßen
Stammzellen
einfach und zuverlässig in
gewünschte Zielzellen, wie beipielsweise Adipozyten (vgl. Bei
spiel 6), Hepatozyten (vgl. Beispiel 7) und Keratinozyten (vgl.
Beispiel 8) differenziert werden,
in dem man die Stammzellen in einem Medium wachsen läßt, welches den
Überstand des Kulturmediums enthält, in dem die jeweiligen
Zielzellen und/oder Fragmente derselben inkubiert wurden. Die
ser Überstand wird nachfolgend als "Zielzell-konditioniertes
Medium" bezeichnet.
Zum
Differenzieren (Reprogrammieren) der erfindungsgemäßen Stammzellen,
kann demgemäß so vorgegangen werden, daß man
- a) Gewebe zerkleinert, welches die gewünschten Zielzellen ent hält oder aus diesen besteht;
- b) die Gewebezellen (Zielzellen) und/oder Fragmente derselben gewinnt;
- c) die Zielzellen und/oder Fragmente derselben in einem geeig neten Kulturmedium inkubiert;
- d) den Überstand des Kulturmediums während und nach der Inkuba tion als Zielzell-konditioniertes Medium sammelt; und
- e) zum Reprogrammieren/Differenzieren von Stammzellen in die gewünschten Zielzellen oder Zielgewebe die Stammzellen in Gegenwart des Zielzell-konditionierten Mediums wachsen läßt.
Als Kulturmedium können übliche Zellkultur-Medien verwendet
werden (vergleiche Beispiele). Vorzugsweise enthalten die Me
dien Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise den epidermalen
Wachstumsfaktor (Epidermal Growth Factor).
Die Inkubation der Zielzellen und/oder Fragmente derselben
("Zellpellet") kann 5 bis 15, vorzugsweise 10 Tage lang erfol
gen. Vorzugsweise wird der Überstand, d. h. das Zielzell-kon
ditionierte Medium jeweils nach 2 bis 4 Tagen abgenommen und
durch frisches Medium ersetzt. Die so gewonnenen Überstände
können getrennt oder vereinigt steril filtriert und bei etwa
-20°C gelagert oder direkt zum Programmieren von Stammzellen
eingesetzt werden. Wie oben dargelegt, erfolgt die Program
mierung der Stammzellen in die gewünschten Zielzellen dadurch,
daß man Stammzellen in Gegenwart des mit den jeweiligen Ziel
zellen konditionierten Mediums wachsen läßt (vgl. Beispiele).
Vorzugsweise enthält das Wachstumsmedium zusätzlich einen Ziel
zell-spezifischen Wachstumsfaktor, wie beispielsweise den "He
patocyte Growth Factor" oder den "Keratinocyte Growth Factor"
(vgl. Beispiele).
Die erfindungsgemäßen dedifferenzierten, programmierbaren Stam
mzellen sind per se als pharmazeutisches Präparat einsetzbar.
Stammzellen besitzen die Fähigkeit, sich in vivo durch den di
rekten Kontakt mit dem Zellverband eines bestimmten Zelltyps
spontan in Zellen dieses Typs zu differenzieren. Verfahren zur
Gewebeherstellung unter Einsatz von re- oder um-differenzier
baren Zellen ("tissue engineering") sind im Stand der Technik
bekannt. Beispielsweise wurde von Wang, X. et al., "Liver repo
pulation and correction of metabolic liver disease by trans
planted adult mouse pancreatic cells" in Am. J. Pathol. 158
(2), 571-579 (2001) gezeigt, daß sogar bestimmte adulte Zellen
der Bauchspeicheldrüse der Maus in der Lage sind, sich in FAH
defizienten Mäusen zu Hepatozyten umzuwandeln, die den meta
bolischen Stoffwechseldefekt in diesen Tieren voll kompensieren
können. Ein weiteres Beispiel sind die Untersuchungen von La
gasse et al., "Purified hematopoietic stem cells can differen
tiate into hepatocytes in vivo", Nature Medicine, 6(11), 1229-
1234 (2000). Die Autoren haben gezeigt, daß hämatopoetische
Stammzellen aus dem Knochenmark in der Lage waren, sich nach in
vivo Transfer in FAH-defiziente Mäuse in Hepatozyten umzuwan
deln, die dann den metabolischen Defekt kompensieren konnten;
siehe auch den Übersichtsartikel von M. Grompe, "Therapeutic
Liver Repopulation for the Treatment of Metabolic Liver Disea
ses" in Hum. Cell, 12: 171-180 (1999).
Bevorzugte Applikationsformen für die erfindungsgemäßen Stamm
zellen sind Injektion, Infusion oder Implantation. Für die
Injektion oder die Infusion können die Zellen in PBS (phosphate
buffered sahne) verabreicht werden.
Bevorzugte Beispiele für in diesem Zusammenhang relevante In
dikationen sind: Leberzirrhose, Pankreasinsuffizienz, akutes
oder chronisches Nierenversagen, hormonelle Unterfunktionen,
Herzinfarkt, Lungenembolie, Schlaganfall und Hautschäden.
Für die therapeutische Verwendung der aus den erfindungsgemäßen
Stammzellen erhältlichen Zielzellen stehen zahlreiche Konzepte
zur Verfügung [siehe oben Science 287, 1442-1446 (2000) und
"Nature 414, 92-131, (2001)].
So können die Zellen direkt in die zu rekonstituierenden Organe
eingebracht werden. Das Einbringen kann über Matrixkonstruk
tionen erfolgen, die mit entsprechend differenzierten oder
differenzierungsfähigen Zellen beschichtet werden. Die Matrix
konstruktionen sind in der Regel bioabbaubar, so daß sie wäh
rend des Verwachsens der neu eingebrachten Zellen mit den vor
handenen Zellen aus dem Körper verschwinden. In Betracht kommen
unter diesem Gesichtspunkt beispielsweise zelluläre, vorzugs
weise autologe Transplantate in Form von Inselzellen, Hepatozy
ten, Fettzellen, Hautzellen, Muskeln, Herzmuskeln, Nerven,
Knochen, endokrinen Zellen etc. zur Restitution beispielsweise
nach partieller chirurgischer Resektion eines Organes, zur
Reparatur beispielsweise nach einem Trauma oder zur unterstüt
zenden Anwendung, beispielsweise bei fehlender oder zu geringer
Organfunktion.
Die erfindungsgemäßen Stammzellen und die aus ihnen hervorge
gangenen Zielzellen können ferner zur Beschichtung von Prothe
sen wie Herzklappen, Gefäßprothesen, Knochen- und Gelenkpro
thesen etc. dienen, um die Biokompatibilität zu erhöhen.
Die Zellen können auch in künstlichen Konstrukten, wie bei
spielsweise in Beuteln oder Kammern in den Körper eingebracht
werden, um beispielsweise künstliche Inselzellportkammern zur
Versorgung mit Insulin zu schaffen. Entsprechend können bei
spielsweise Adipozyten-gefüllte Polymere zum Brustaufbau nach
Operationen und für alle weiteren Indikationen der plastischen
und/oder kosmetischen Korrektur zum Einsatz kommen. Weiter
können semipermeable Portkammersysteme, bestückt mit endokrinen
Zellen verschiedenster Provenienz, in vivo zur Behandlung endo
kriner, metabolischer oder hämostatischer Erkrankungen zum Ein
satz kommen. Beispiele für derartige endokrine Zellen sind
Thyroxin, Steroide, ADH, Aldosteron, Melatonin, Seratonin,
Adrenalin, Noradrenalin, TSH, LH, FSH, Leptin, Cholezystokinin,
Gastrin, Insulin, Glucagon, oder Gerinnungsfaktoren produzie
rende Zellen.
Die aus den erfindungsgemäßen Stammzellen hervorgegangenen
Zielzellen können darüber hinaus als Zellkulturen außerhalb des
Körpers in Bioreaktoren eingesetzt werden, um beispielsweise
Entgiftungsreaktionen durchzuführen. Diese Verwendungsform ist
insbesondere bei akuten Zuständen relevant, beispielsweise bei
akutem Leberversagen als Hepatozyten-Bioreaktor oder als Peri
tonealzellen enthaltendes Dialysat zur Anwendung bei der Peri
tonaldialyse niereninsuffizienter Patienten.
Die Herstellung der oben beschriebenen Konstrukte und die
Durchführung der entsprechenden Therapieverfahren ist im Stand
der Technik bereits vielfach beschrieben, vergleiche beispiels
weise die Übersichtsartikel Lalan S., Pomerantseva I., Vacanti
J. P., "Tissue engineering and its potential impact on surgery",
World J. Surg. 2001, 25, 1458-1466; Nassen B. A., Ogawa K.,
Vacanti J. P., "Tissue engineering: an evolving 21st-century
science to provide replacement for reconstruction and trans
plantation", Surgery 2001; 130, 781-784; Fuchs J. R., Nassen
B. A., Vacanti J. P., "Tissue engineering: a 21st century solu
tion to surgical reconstruction", Ann. Thorac. Surg. 2001; 72,
577-591.
Schließlich wird durch die erfindungsgemäßen pluripotenten
Stammzellen ein weites Feld für die transgene Modifikation und
Therapie eröffnet. So können die dedifferenzierten, program
mierbaren Stammzellen gemäß der Erfindung per se oder die von
ihnen abgeleiteten Zielzellen mit spezifischen Genkonstrukten
transfiziert werden. Auf diese Weise können Gene, die für die
Aufrechterhaltung metabolischer Leistungen in bestimmten Or
ganen, wie beispielsweise Leber oder Niere, erforderlich sind,
wiederhergestellt bzw. unterstützt oder neu eingebracht werden.
Beispielsweise können Stammzellen oder von diesen abgeleitete
Hepatozyten mit dem. FAH-(Fumaryl-Acetoacetat-Hydrolase) Gen
transfiziert werden. Im FAH-defizienten Mausmodell genügte die
intrasplenische Injektion von 1000 FAH-positiven Spenderhepato
zyten, um nach 6 bis 8 Wochen die Leber komplett zu repopulari
sieren und den zur Lebercirrhose führenden metabolischen Defekt
voll zu kompensieren (vgl. Grompe M. et al. Nat. Genet. 12, 266
ff, 1996).
Entsprechend kann durch Transfektion der Stammzellen bzw. der
jeweiligen aus den Stammzellen durch Programmierung hervorge
gangenen Zielzellen (beispielsweise hämatopoetische Zellen,
Hepatozyten, Ovarzellen, Muskelzellen, Nervenzellen, Neurone,
Gliazellen, Korpel- oder Knochenzellen, etc.) mit "Multi-Drug-
Resistance-Genen" die erweiterte radikale Chemotherapie bei
malignen Erkrankungen durch entsprechende hämatopoietische
Rekonstitution ermöglicht werden oder Strahlenresistenz erzeugt
werden.
Die Erfindung wird nachfolgend im einzelnen erläutert:
Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren sind Monozyten aus humanem Blut. Vorzugsweise handelt es sich um Monozyten, die aus dem Blut desjenigen Patienten stammen, welcher mit den erfin dungsgemäßen Stammzellen oder den aus diesen hergestellten Zielzellen therapiert werden soll.
Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren sind Monozyten aus humanem Blut. Vorzugsweise handelt es sich um Monozyten, die aus dem Blut desjenigen Patienten stammen, welcher mit den erfin dungsgemäßen Stammzellen oder den aus diesen hergestellten Zielzellen therapiert werden soll.
Zur Gewinnung der Monozyten kann das Blut zunächst nach üb
licher Behandlung mit einem Antikogakulanz auf bekannte Weise,
vorzugsweise durch Zentrifugation, in Plasma sowie in weiße und
rote Blutzellen getrennt werden. Nach der Zentrifugation findet
sich das Plasma im Überstand; darunter liegt eine Schicht,
welche die Gesamtheit der weißen Blutzellen enthält. Diese
Schicht wird auch als "Buffy coat" bezeichnet. Darunter befin
det sich die rote Blutzellen enthaltende Phase (Haematokrit).
Anschließend wird die "Buffy coat" Schicht isoliert und zur
Gewinnung der Monozyten beispielsweise durch Zentrifugieren
nach bekannten Verfahren aufgetrennt. Gemäß einer bevorzugten
Verfahrensvariante wird die "Buffy coat" Schicht auf ein Lym
phozytenseparationsmedium (Ficoll Hypaque) geschichtet und
zentrifugiert (vergl. Beispiel 1). Durch weiteres Zentrifugie
ren und Spülen wird die Fraktion der Monozyten aus dem Blut
gewonnen (vergl. Beispiel 1).
Beipiele für alternative Verfahren zur Gewinnung der Monozyten
aus dem Vollblut sind das "Fluorescent-Activating Cell Sorting"
(FACS), das "Immunomagnetic Bead Sorting" und "Magnetic Ac
tivated Cell Sorting" (MACS) oder das sogenannte "Rosetting
Verfahren", vgl. Gmelig-Meyling F. et al., "Simplified proce
dure for the separation of human T and non-T cells", Vox Sang.
33, 5-8 (1977).
Für die Herstellung einer ausreichenden Menge an Stammzellen
ist es zunächst erforderlich, die Monozyten zu vermehren. Zu
diesem Zweck können bekannte, für Monozyten geeignete Wachs
tumsmedien verwendet werden, wobei das Medium
erfindungsgemäß
M-CSF (macrophage-colony-stimulating-factor)
enthält. M-CSF (auch als CSF-1 bezeichnet) wird von Monozy
ten, Fibroblasten und endothelialen Zellen produziert. Die Kon
zentration von M-CSF in dem Kulturmedium kann von 2 bis 20 µg/l
Medium, vorzugsweise 4 bis 6 µg/l und in besonders bevorzugter
Weise 5 µg/l betragen.
Anschließend oder gleichzeitig müssen die Zellen in Gegenwart
von Interleukin 3 (IL-3) kultiviert werden. Die Konzentration
von IL-3 in dem Medium kann von 0,2 bis 1 µg, vorzugsweise 0,3
bis 0,5 µg und in besonders bevorzugter Weise 0,4 µg IL-3/l
betragen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden
die Zellen zusätzlich in Gegenwart einer Mercaptoverbindung
kultiviert, in der mindestens eine Kohlenwasserstoffgruppe an
den Schwefel gebunden ist, wobei die Kohlenwasserstoffgruppe(n)
mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sein
kann (können). Durch die zusätzliche Verwendung einer derarti
gen Schwefelverbindung kann die Anzahl der durch Dedifferen
zierung der monozytären Ursprungszellen gewonnenen Stammzellen
gesteigert werden, die einen oder mehrere der Stammzellmarker
CD90, CD117, CD123 und CD135 exprimieren.
Vorzugsweise ist/sind die funktionelle(n) Gruppe(n) Hydroxyl-
und/oder Amingruppen. In besonders bevorzugter Weise ist die
Schwefelverbindung 2-Mercaptoethanol. Gemäß einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform ist die Schwefelverbindung Di
methylsulfoxid (DMSO).
Die Menge der verwendeten Schwefelverbindung kann von etwa 4
bis etwa 200 µMol/l bezogen auf den Schwefel betragen. Bevor
zugt sind etwa 100 µMol/l.
Bei Verwendung von 2-Mercaptoethanol sollte das Kulturmedium
etwa 3 µl bis etwa 13 µl, vorzugsweise etwa 7 µl 2-Mercap
toethanol/l enthalten.
Die Behandlung mit IL-3 und gegebenenfalls mit der Schwefelver
bindung kann gleichzeitig mit oder im Anschluß an die Vermeh
rung der Monozyten erfolgen. Vermehrung und Dedifferenzierung
sollten zusammengenommen nicht mehr als 10 Tage in Anspruch
nehmen, wobei die Behandlung mit IL-3 und gegebenenfalls mit
der Schwefelverbindung mindestens 3 und maximal 10 Tage,
vorzugsweise 6 Tage lang durchgeführt werden sollte.
Für die gemeinsame Durchführung der Vermehrung und De
differenzierung, wie in Beispiel 2 beschrieben, werden die
Monozyten nach Isolierung in ein Medium überführt, welches
sowohl den Wachstumsfaktor, insbesondere M-CSF, als auch das
IL-3 sowie vorzugsweise die Schwefelverbindung, insbesondere
Mercaptoethanol oder DMSO enthält.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
schließt sich im nächsten Schritt die Zugabe eines biologisch
verträglichen organischen Lösungsmittels zu dem die Zellen
enthaltenden Medium an, um die Zahl der am Ende des Verfahrens
frei im Medium flottierenden Stammzellen zu erhöhen. Die Menge
des Lösungsmittels kann 10µ1 bis 1 ml betragen. Vorzugsweise
handelt es sich um einen Alkohol mit 1-4 Kohlenstoffatomen,
wobei die Zugabe von Ethanol besonders bevorzugt ist. Gemäß
einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen
mit der Dampfphase des zuvor defininierten biologisch verträg
lichen organischen Lösungsmittels, vorzugsweise mit Ethanol
dampf, in Kontakt gebracht (vgl. Beispiel 2). Die Ein
wirkungszeit des organischen Lösungsmittels, in besonders be
vorzugter Weise des Ethanoldampfes, sollte 4-12 Stunden, vor
zugsweise 8-10 Stunden betragen.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren in Kultur
gefäßen durchgeführt, deren Oberfläche zuvor mit foetalem Käl
berserum (FCS) beschichtet wurde (vergl. Beispiel 2). Alter
nativ kann auch humanes AB-Serum männlicher Spender verwendet
werden. Die Beschichtung mit FCS kann dadurch erfolgen, daß man
die Oberfläche der Kulturgefäße vor Ingebrauchnahme mit FCS
bedeckt, und nach einer Einwirkungszeit von einigen Stunden,
insbesondere 2 bis 12 Stunden, und in besonders bevorzugter
Weise 7 Stunden, das nicht an der Oberfläche haftende FCS auf
geeignete Weise entfernt.
Aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften haften die Monozyten und
die während des Verfahrensablaufs aus diesen hervorgehenden
Stammzellen am Boden des jeweiligen Kulturgefäßes.
Wird eine Behandlung mit organischem Lösungsmittel durchge
führt, so lösen die Zellen sich bereits in dieser Verfah
rensstufe in gewissem Umfang vom Boden. Die (weitere) Ablösung
kann auf mechanische Weise, beispielsweise mit einem feinen
Zellschaber, Spachtel oder einer Pipettenspitze erfolgen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt
die vollständige Ablösung durch Behandlung mit einem geeigneten
Enzym, bespielsweise mit Trypsin (vergl. Beispiel 2). Die Tryp
sin-Lösung (0,1 bis 0,025 g/l, vorzugsweise 0,05 g/l) kann 2-10 Min.
lang bei 35°C bis 39°C, vorzugsweise bei 37°C in Gegenwart
von CO2 auf die Zellen einwirken.
Die Trypsinaktivität wird sodann auf übliche Weise blockiert
und die nun frei flottierenden dedifferenzierten, programmier
baren Stammzellen können auf übliche Weise beispielsweise durch
Zentrifugieren gewonnen werden. Sie stehen nunmehr, entweder
suspendiert in einem geeigneten Medium, beispielsweise in RPMI-
1640, für die sofortige Differenzierung in die gewünschten
Zielzellen zur Verfügung. Sie können jedoch auch einige Tage
lang in dem Medium gehalten werden, wobei dann, wenn die Zellen
länger als etwa 48 Stunden als dedifferenzierte, programmier
bare Stammzellen in Kultur gehalten werden sollen, das Hin
zufügen von Zytokinen oder LIF-Faktor (Leukemia inhibitory
factor), vergl. Nature, 414, 94, (2001 - a. a. O.) bevorzugt ist.
In einem derartige Faktoren enthaltenden Medium können die
Stammzellen mindestens 10 Tage lang als dedifferenzierte, pro
grammierbare Stammzellen gehalten werden.
Für die längere Lagerung können die Zellen tiefgefroren werden.
Protokolle zum Tiefgefrieren lebender Zellen sind im Stand der
Technik bekannt, vgl. Griffith M. et al., Epithelial Cell Cul
ture, Cornea, in Methods of Tissue Engineering, Atala A. und
Lanza RP, Academic Press 2002, Kap. 4, Seiten 131 bis 140. Ein
bevorzugtes Suspensionsmedium zum Tiefgefrieren der erfin
dungsgemäßen Stammzellen ist FCS enthaltendes DMEM, vergl.
Beispiel 2.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen weiter
erläutert und beschrieben.
Soweit nicht innerhalb der Beispiele definiert, ist die Zusam
mensetzung der verwendeten Medien und Substanzen, nachfolgend
angegeben:
10.000 Einheiten Penicillin als Natriumsalz von Penicillin
G und 1000 µg Streptomycin als Streptomycinsulfat je ml
physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%).
0,5 g Trypsin und 0,2 g EDTA (4 Na)/l
human, rekombinant hergestellt in E. coli, etwa 28 Ein
heiten/mg
RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Media 1640 sind ange
reicherte Formulierungen, mit weitreichender Anwendbarkeit
für Säugerzellen.
Qualität zur Synthese; Gehalt < 98%, Dichte 1,115 bis 1,116,
vergl. z. B. Momo, Jet al., J. Am. Chem. Soc. 73, 4961 (1951).
Lymphozyten Separationsmedium (Saccharose/Epichlorhydrin Co
polymerisat Mg 400.000, -; Dichte 1,077, eingestellt mit
Natriumdiatrizoat).
Vitamin A Säure (C20
H28
O2
), 300 µl in 1.5 ml PBS entsprechend
1 mM. Als Medium zum Programmieren von Neuronen und Gliazel
len 150 µl auf 10 ml Medium entsprechend 10-6
M verwenden.
(Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (high glucose)
vgl. Dulbecco, R. et al., Virology 8, 396 (1959)
Smith, J. D. et al., Virology 12, 158 (1960)
Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6, 2 (1993)
flüssig: 29,2 mg/ml
Vergl. Rodbell, M. et al., J. Biol. Chem. 239, 375 (1964).
Rekombinantes humanes IL-3 aus E. coli [(Yang Y. C. et al.,
Cell 47, 10 (1986)]; enthält das 133 Aminosäure-Reste umfas
sende reife IL-3 und die 134 Aminosäure-Reste umfassende
Methionyl-Form im Verhältnis von etwa 1 : 2; berechnete Mol-
Masse etwa 17.5 kD; (R Katalog Nr. 203-IL)
Die in den Beispielen verwendeten Antikörper gegen die Anti
gene CD14, CD31, CD90, CD117, CD123, CD135 sind kommerziell
erhältlich. Sie wurden aus den folgenden Quellen bezogen:
CD14: DAKO, Monoclonal Mouse Anti-Human CD14, Monocyte, Clone TÜK4, Code No. M 0825, Lot 036 Edition 02.02.01;
CD31: PharMingen International, Monoclonal Mouse Anti-Rat CD31 (PECAM-1), Clone TLD-3A12, Katalog No. 22711D, 0.5 mg;
CD90: Biozol Diagnostica, Serotec, Mouse Anti Human CDw90, Clone No. F15-42-1, MCAP90, Batch No. 0699;
CD117: DAKO, Monoclonal Mouse Anti-Human CD117, c-kit, Clone No. 104D2, Code No. M 7140, Lot 016, Edition 04.05.00;
CD123: Research Diagnostics Inc., Mouse anti-human CD123 antibodies, Clone 9F5, Katalog No. RDI-CD123-9F5;
CD135: Serotec, Mouse Anti Human CD135, MCA1843, Clone No. BV10A4H2.
CD14: DAKO, Monoclonal Mouse Anti-Human CD14, Monocyte, Clone TÜK4, Code No. M 0825, Lot 036 Edition 02.02.01;
CD31: PharMingen International, Monoclonal Mouse Anti-Rat CD31 (PECAM-1), Clone TLD-3A12, Katalog No. 22711D, 0.5 mg;
CD90: Biozol Diagnostica, Serotec, Mouse Anti Human CDw90, Clone No. F15-42-1, MCAP90, Batch No. 0699;
CD117: DAKO, Monoclonal Mouse Anti-Human CD117, c-kit, Clone No. 104D2, Code No. M 7140, Lot 016, Edition 04.05.00;
CD123: Research Diagnostics Inc., Mouse anti-human CD123 antibodies, Clone 9F5, Katalog No. RDI-CD123-9F5;
CD135: Serotec, Mouse Anti Human CD135, MCA1843, Clone No. BV10A4H2.
Zur Vermeidung der Blutgerinnung und zum Füttern der Zellen
wurden 450 ml Vollblut in einem 3-Kammerbeutel-Set mit 63 ml
einer Stabilisator-Lösung vermischt, die je Liter H2O 3,27 g
Citronensäure, 26,3 g Trinatriumcitrat, 25,5 g Dextrose, und
22,22 g Natriumdihydroxyphosphat enthielt. Der PH-Wert der
Lösung betrug 5,6-5,8.
Zur Blutkomponententrennung erfolgte anschließend eine "scharfe
Zentrifugation" dieses Gemisches zur Blutkomponententrennung,
bei 4000 rpm über 7 min bei 20°C. Hieraus resultierte eine 3-
Schichtung der korpuskulären und nicht-korpuskulären Be
standteile. Durch Einsetzen des Beutelsets in eine dafür vor
gesehene Preßmaschine wurden dann die Erythrozyten in den un
teren Beutel, das Plasma in den oberen Beutel gepreßt und der
sogenannte Buffy-coat verblieb im mittleren Beutel und enthielt
ca. 50 ml Volumen.
Die Menge von 50 ml frisch gewonnenem Buffy-coat wurde nun in
jeweils 2 Portionen á 25 ml geteilt und damit jeweils 25 ml
Ficoll-Hypaque Separationsmedium überschichtet, welches zuvor
in zwei 50 ml Falconröhrchen gefüllt worden war.
Dieser Ansatz wurde 30 Min. lang bei 2500 rpm ungebremst zen
trifugiert. Im Buffy coat noch vorhandene Erythrozyten und tote
Zellen lagen danach unterhalb der Ficoll-Phase während die
weißen Blutzellen einschließlich der Monozyten als weiße Inter
phase auf dem Ficoll separiert sind.
Anschließend wurde die weiße Interphase der Monozyten vorsich
tig abpipettiert und mit 10 ml Phosphat gepufferter physiologis
cher Kochsalzlösung (PBS) gemischt.
Danach wurde dieser Ansatz dreimal 10 Min. lang bei 1800 rpm
gebremst zentrifugiert, wobei der Überstand nach jeder Zentri
fugation abpipettiert und mit frischem PBS aufgefüllt wurde.
Das am Boden des Zentrifugationsgefäßes (Falconröhrchen) gesam
melte Zellpellet enthielt die mononukleäre Zellfraktion, d. h.
die Monozyten.
Die Kultivierung und Vermehrung der Monozyten einerseits und
die Dedifferenzierung der Zellen andererseits erfolgte in einem
Schritt in Nährmedium der folgenden Zusammensetzung:
Das Nährmedium enthielt ferner 2,5 µg/500 ml M-CSF und 0,2 µg/
500 ml Interleukin 3 (IL-3).
Die in Beispiel 1 isolierten Monozyten wurden in 5 Kammern
einer 6-Kammer-Rundlochplatte (30 mm Durchmesser pro Loch) in
einer Menge von jeweils etwa 105 Zellen je Kammer übertragen und
mit jeweils 2 ml des oben angegebenen Nährmediums aufgefüllt.
Die 6 Loch-Platte war zuvor mit reinem inaktivierten FCS ge
füllt und das FCS nach etwa 7 Stunden abgegossen worden, um auf
diese Weise eine FCS beschichtete Platte zu erhalten. Die Be
stimmung der Zellzahl für die exakte Dosierung je Loch erfolgte
nach bekannten Verfahren, vergl. Hay R. J., Cell Quantification
and Characterisation, in Methods of Tissue Engineering, Acade
mic Press 2002, Kapitel 4, S. 55-84.
Die 6-Loch-Platte wurde mit dem zugehörigen Deckel abgedeckt
und 6 Tage lang in einem Brutschrank bei 37°C gehalten. Die
Zellen setzten sich nach 24 Stunden am Boden der Kammern ab. An
jedem zweiten Tag wurde der Überstand abpipettiert und die
Kammern der 6-Loch-Platte mit jeweils 2 ml frischem Nährmedium
wieder aufgefüllt.
Am 6. Tag wurden 2 ml 70%iges Ethanol in die frei gebliebene 6.
Kammer der 6-Loch-Platte gefüllt, die Platte wurde wiederum
verschlossen und weitere 10 Stunden lang bei 37°C im Brut
schrank gehalten.
Nachfolgend wurden jeweils 1 ml einer 1 : 10 mit PBS verdünnten
Trypsinlösung in jede der Zellen enthaltenden Kammern der Rund
lochplatte pipettiert. Die geschlossene Rundlochplatte wurde 5 Min.
lang bei 37°C unter 5% CO2 im Brutschrank gehalten.
Die Trypsinaktivität wurde danach durch Zugabe von jeweils 2 ml
RPMI 1640 Medium zu den Rundlöchern geblockt. Der gesamte
Überstand der jeweiligen Kammern (1 ml Trypsin + 2 ml Medium)
wurde abpipettiert, in einem 15 ml Falconröhrchen vereinigt und
10 Min. lang bei 1800 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde
nachfolgend verworfen und der Niederschlag mit frischem RPMI
1640 Medium (2 ml/105 Zellen) versetzt.
Diese Zellsuspension konnte direkt zur Differenzierung in ver
schiedene Zielzellen verwendet werden.
Alternativ wurden die Zellen nach Zentrifugation und Verwerfen
des Trypsin enthaltenden Überstandes mit DMSO/FCS als Einfrier
medium versetzt und in einer Konzentration von 106/ml tief
gefroren.
Das Einfriermedium enthielt 95% FCS und 5% DMSO. Jeweils etwa
106 Zellen wurden in 1 ml des Mediums aufgenommen und in folgen
den Stufen abgekühlt:
30 Min. auf Eis;
2 Stunden bei -20°C im vorgekühlten Styroporkasten;
24 Stunden bei -80°C in Styropor;
Lagerung in Röhrchen in Flüssigstickstoff (N2) bei -180°C.
30 Min. auf Eis;
2 Stunden bei -20°C im vorgekühlten Styroporkasten;
24 Stunden bei -80°C in Styropor;
Lagerung in Röhrchen in Flüssigstickstoff (N2) bei -180°C.
Zur immunhistochemischen Phenotypisierung der nach obigem Ver
fahren generierten Zellpopulation dedifferenzierter pro
grammierbarer Stammzellen monozytären Ursprungs wurden jeweils
105 Zellen abgenommen und als Cytospin-Präparat auf Ob
jektträgern zur weiteren histochemischen Anfärbung fixiert.
(Ref. Watson, P. A slide centrifuge; an apparatus for con
centrating cells in suspension on a microscope slide. J Lab
Clin Med. 68: 494-501. 1966). Hiernach konnten die Zellen durch
die von Cordell JL, et al., (Literatur s. u.) beschriebene
Technik nit APAAP-Rot-Komplex gefärbt werden. Die Verdünnung
des zugesetzten Primärantikörpers erfolgte, soweit nicht ande
res angegeben, in der Verdünnung 1 : 100 mit PBS, wobei jeweils
200 µl dieser Antikörperkonzentration eingesetzt wurde. Als
Primärantikörper wurden monoklonale Antikörper gegen die in
Tabelle 1 gelisteten Zellantigenepitope eingesetzt. Abb.
6 zeigt gefärbte Cytospinpräparate und den entsprechenden Nach
weis der Stammzellmarker CD90, CD117, CD123 und CD135.
Cordell J. L. et al., Immunoenzymatic labeling of monoclonal
antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and
monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes).
J. Histochem. Cytochem. 32, 219-229 (1984)
CD14
Ferrero E., Goyert S. M.;
"Nucleotide sequence of the gene encodinig the monocyte differentiation antigen, CD14";
Nucleic Acids Res. 16: 4173-4173 (1988).
CD31
Newman P. J., Berndt M. C., Gorski J., White J. C. II, Lyman S., Paddock C., Muller W. A.; "PECAM-1(CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily";
Science 247; 1219-1222 (1990).
CD90
Seki T., Spurr N., Obata F., Goyert S., Goodfellow P., Silver J.;
"The human thy-1 gene: structure and chromosomal location"; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6657-6661 (1985).
CD117
Yarden Y., Kuang W.-J., Yang-Feng T., Coussels L., Munemitsu S., Dull T. J., Chen E., Schlessinger J., Francke U., Ullrich A.;
"Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand.";
EMBO J. 6: 3341-3351 (1987).
CD123
Kitamura T., Sato N., Arai K., Miyajima A.;
"Expression cloning of the human IL-3 receptor cDNA reveals a shared beta subunit for the human IL-3 and GM-CSF receptors."; Cell 66: 165-1174 (1991).
CD135
Small D., Levenstein M., Kim E., Carow C., Amn S. Rockwell P., Witte L., Burrow C., Ratajazak M. Z., Gewirtz A. M., Civin C. I.;
"STK-1, the human honolog of Flk-2/Flt-3, is selectively expressed in CD34+ human bone marrow cells and is involved in the proliferation of early progenitor/stem cells.;
Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91: 459-463 (1994).
Ferrero E., Goyert S. M.;
"Nucleotide sequence of the gene encodinig the monocyte differentiation antigen, CD14";
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Science 247; 1219-1222 (1990).
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EMBO J. 6: 3341-3351 (1987).
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Kitamura T., Sato N., Arai K., Miyajima A.;
"Expression cloning of the human IL-3 receptor cDNA reveals a shared beta subunit for the human IL-3 and GM-CSF receptors."; Cell 66: 165-1174 (1991).
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Small D., Levenstein M., Kim E., Carow C., Amn S. Rockwell P., Witte L., Burrow C., Ratajazak M. Z., Gewirtz A. M., Civin C. I.;
"STK-1, the human honolog of Flk-2/Flt-3, is selectively expressed in CD34+ human bone marrow cells and is involved in the proliferation of early progenitor/stem cells.;
Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91: 459-463 (1994).
Die angegebene Graduierung entspricht der ermittelten Antigen
positivität, die sich ab Tag 4 bis Tag 9 nach Kultivierung der
Monozyten in den entsprechend spezifizierten Medien zeigt und
erfolgte durch mikroskopischen Vergleich der jeweiligen Cyto
spin-Färbungen mit der negativen Kontrolle (beobachtete Färbung
ohne Primärantikörper).
+ deutliche Farbreaktion der Zellen mit dem Primärantikör per;
++ starke Farbreaktion der Zellen mit dem Primärantikörper.
+ deutliche Farbreaktion der Zellen mit dem Primärantikör per;
++ starke Farbreaktion der Zellen mit dem Primärantikörper.
Es wurden nur Cytospinpräparate evaluiert, die mehr als 70%
vitale Zellen mit typischer Stammzellmorphologie (s. Abb. 6)
aufwiesen.
Die Herstellung von Neuronen und Gliazellen erfolgte in Petri
schalen mit einem Durchmesser von 100 mm. Zur Vorbereitung der
Petrischalen wurden in jede Schale 5 ml reines inaktiviertes
foetales Kälberserum (FCS) gefüllt, so daß der Boden bedeckt
war. Nach 7 Std. wurde der nicht an dem Boden der Petrischale
haftende Anteil des FCS abpipettiert. Etwa 106 der gemäß
Beispiel 2 hergestellten Zellen wurden in eine der vorbereite
ten Petrischalen gegeben und es wurden 10 ml Nährmedium der
folgenden Zusammensetzung hinzugefügt:
Das Nährmedium enthielt ferner Retinsäure in einer Menge von
1 × 100-6 M/500 ml.
Die Reprogrammierung/Differenzierung der eingesetzten Stammzel
len in Neurone und Gliazellen erfolgte innerhalb von 10 Tagen,
wobei das Medium im Abstand von etwa 3 Tagen gewechselt wurde.
Die Zellen waren nach diesem Zeitraum zum größten Teil adhärent
am Boden der Kammer und konnten analog, wie zuvor für die
Stammzellen beschrieben, durch kurzzeitige Trypsinierung vom
Plattenboden gelöst werden.
Zur späteren immunohistochemischen Charakterisierung der durch
die dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen induzierten
Zielzellen wurden die aus Monozyten generierten Stammzellen (105
Zellen/Deckelglas) auf Deckelgläschen (20 mm × 20 mm), die auf
den Boden der 6-Rund-Lochplatten (30 mm Durchmesser pro Kammer)
plaziert wurden, aufgetragen und mit dem Nährmedium (2 ml) pro
Lochplatte kultiviert. Nach Ausdifferenzierung der jeweiligen
Zielzellen wurden diese wie folgt fixiert: Nach Abnahme des
Nährmediums (Überstand) erfolgte die Fixierung der gezüchteten
Zielzellen durch Zugabe von 2 ml Methanol, welches 10 Minuten
lang einwirkte. Danach erfolgte das Abpipettieren des Ethanols
und die Lochplatten wurden zweimalig mit PBS (jeweils 2 ml)
gewaschen. Hiernach konnten die Zellen durch die von Cordell,
J. L. et al. Immunoenzymatic labeling monoclonal antibodies
using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal
anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes). J. Histochem.
Cytochem. 32, 219-229 (1994) beschriebene Technik mit APAAP-
Rot-Komplex gefärbt werden. Die Verdünnung des zugesetzten
Primärantikörpers erfolgte, soweit nicht anderes spezifiziert,
in der Verdünnung 1 : 100 mit PBS, wobei jeweils 200 µl dieser
Antikörperkonzentration in jedes der 6 Rundlöcher pipettiert
wurde.
Neuronale Vorläuferzellen wurden durch Färbung der Zellen mit
dem Antikörper gegen das 5100 Antigen nachgewiesen, vgl. mitt
leres Bild der Abb. 1 (x200).
Neurone wurden durch spezifische Expression von Synaptophysin
MAP2 (microtubular associates protein 2) oder Neurofillament 68
mit den entsprechenden spezifischen Antikörpern (Primärantikör
per 1 : 300 mit PBS verdünnt) nachgewiesen, rechtes Bild der
Abb. 1, x200.
Gliazellen, wie zum Beispiel Astrozyten, wurden durch Detektion
von GFAP (glial fibrillary associated protein) (Primärantikör
per 1 : 200 mit PBS verdünnt) nachgewiesen, linkes Bild der
Abb. 1, x200.
Die Trennung von Neuronen und Gliazellen erfolgte durch spezi
fische Antikörper gegen MAP2 (Neurone) oder GFAP (Gliazellen),
mittels MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) nach dem Verfah
ren, wie es beispielsweise in Carmiol S, Cell Isolation and
Selection in Methos of Tissue Engineering, Academic Press 2002,
Kapitel 2, Seiten 19-35 beschrieben ist.
Die mittels Anfärbung sichtbar gemachten Zelltypen sind in
Abb. 1 gezeigt.
Zur Züchtung von Endothelzellen wurde als Matrix Matrigel®
(Beckton und Dickinson, Heidelberg, DE) verwendet. Dabei han
delt es sich um eine Matrix aus Fibronektin, Laminin und den
Collagenen I und IV.
Die gefrorene Matrix wurde über einen Zeitraum von 12 Stunden
bei 4°C im Kühlschrank langsam aufgetaut. Dabei änderte sich
die Zustandsform, d. h. die ursprünglich feste Matrix wurde
schwammig/flüssig. Sie wurde in diesem Zustand in eine 48-Loch-
Platte (10 mm Durchmesser je Kammer) in solcher Weise aufgetra
gen, daß der Boden der jeweiligen Kammern bedeckt war.
Nach dem Auftragen wurde die Platte 30 Min. lang bei Raum
temperatur gehalten, bis sich das Gel auf dem Boden als ad
härente Schicht verfestigt hatte.
Anschließend wurden etwa 1 × 102 Zellen je Kammer mit Zusatz des
Nährmediums (wie in Beispiel 2 beschrieben) auf Matrigel® inku
biert.
Nach 4-5 Tagen zeigten sich die ersten tubulären Zellstränge,
die sich nach 6-8 Tagen in dreidimensionale Zellnetzwerke ent
wickelten. Auf den Zellen konnten die Endothelmarker CD31, und
Faktor VIII mit den jeweils spezifischen Primärantikörpern (200 µl,
jeweils 1 : 100 mit PBS verdünnt) nachgewiesen werden.
In einem alternativen Verfahren wurde die verflüssigte Matrix
auf eine Gefäßprothese aufgetragen und diese anschließend mit
den dedifferenzierten programmierbaren adulten Stammzellen
gemäß Beispiel 2 beschichtet. Nach etwa 6 Tagen war ein Endot
helrasen zu erkennen, der die Prothese zirkulär ausgekleidete.
Die durch Färbung mit entsprechenden Endothel-spezifischen
Antikörpern (s. o.) sichtbar gemachten Endothelzellen sind in
Abb. 2 gezeigt. Im mittleren Bild sind die Zellen nach 5 Tagen
Inkubation auf Matrigel® dargestellt. Erste tubuläre Stränge
verbinden einzelne Zellaggregate. Die dunkelbraun markierten
Zellen exprimieren CD31-Antigen (x200 mit Gelbfilter). Nach 8
Tagen kommt es zunehmend zur Bildung von dreidimensionalen
Netzwerkstrukturen (anti-CD31-Antigen-Färbung, x200 mit Gelb
filter). Nach 12 Tagen bilden die neu-differenzierten CD31+-
Zellen, die auf Matrigel® gezüchtet wurden, eine Gefäßähnliche
dreidimensionale Röhre mit mehrschichtigen Wandstrukturen aus,
die bereits morphologisch an ein Gefäß erinnert. Man erkennt,
daß nunmehr nahezu alle Zellen das CD31-Antigen exprimieren
(CD31-Färbung, x400, Blaufilter), rechte Abbildung.
Für die Programmierung/Differenzierung der adulten Stammzel
len gemäß Beispiel 2 in Fettzellen wurde zunächst ein kon
ditioniertes Medium generiert. Hierzu wurden 20 g eines
autologen Fettgewebes, d. h. von Fettgewebe der gleichen
Spenderperson, aus deren Blut auch die Monozyten stammten,
wie folgt aufgearbeitet:
Zunächst wurde das Fettgewebe in einer Petrischale zerklei nert und die zerkleinerten Gewebebrocken wurden durch ein Sieb (Durchmesser der Löcher 100 µm) passiert.
Zunächst wurde das Fettgewebe in einer Petrischale zerklei nert und die zerkleinerten Gewebebrocken wurden durch ein Sieb (Durchmesser der Löcher 100 µm) passiert.
Die so erhaltene Suspension wurde anschließend in eine Pe
trischale mit einem Durchmesser von 100 mm überführt und 10 ml
DMEM-Medium mit einem Gehalt an 30 mg Collagenase Typ II
hinzugefügt. Zur Einwirkung der Collagenase auf die Fettzel
len wurde der Ansatz etwa 60 Min. lang bei Raumtemperatur
(22°C ± 2°C) stehen gelassen.
Anschließend wurde das Gemisch in 50 ml Falconröhrchen über
führt und die Röhrchen wurden 10 Min. lang bei 1800 rpm
zentrifugiert.
Nach Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das
aus Adipozyten und Vorläuferzellen bestehende Zellpellet in
8 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung aufgenommen
und in Petrischalen (Durchmesser 100 mm) 10 Tage lang bei
37°C im Brutschrank inkubiert:
Die Insulinlösung enthielt 18 mg Insulin (Sigmal-0259) ge
löst in 2 ml Essigwasser (bestehend aus 40 ml H2O und 0,4 ml
Eisessig). Die Lösung wird mit Essigwasser im Verhältnis
1 : 10 verdünnt.
Während der 10 Tage dauernden Inkubation bildete sich das
Fettzell-konditionierte Medium, FCCM als Überstand. Der
Überstand wurde nach jeweils 2 bis 4 Tagen durch frisches
Nährmedium ersetzt. Das jeweils beim Mediumwechsel gewonne
FCCM wurde steril filtriert und bei -20°C gelagert. An
schließend wurden 10 ml des oben beschriebenen FCCM mit etwa
106 Stammzellen gemäß Beispiel 2 in eine Petrischale (Durch
messer 100 mm) gegeben. Die ersten Fettvakuolen enthaltenden
Vorläuferzellen wurden nach 4 Tagen sichtbar (Abb. 3A). Nach
6 Tagen erschienen vereinzelte, mit Sudan-Rot anfärbbare
Adipozyten (Abb. 3B und C). Nach 10 Tagen kam es zur typi
schen Aggregation und Clusterbildung dieser Zellen, die in
diesem Stadium bereits makroskopisch als Fettgewebe erken
nbar wurden (Abb. 3D).
Die durch Anfärben sichtbar gemachten Fettzellen in den
Abb. 3A-3D unterscheiden sich damit ganz wesentlich
von den Kontrollen 3E und 3F: Abb. 3E zeigt die monozytären
Ursprungszellen, die im Nährmedium (wie in Beispiel 2 an
gegeben) für 6 Tage gezüchtet wurden, jedoch ohne Zusatz von
IL-3 und 2-Mercaptoethanol zu dem Nährmedium. Hiernach er
folgte die Zugabe des FCCM. Diese Zellen waren nicht in der
Lage, in Fettzellen zu differenzieren. Abbildung F. zeigt Zellen,
die 6 Tage lang mit komplettem Medium (gemäß Beispiel 2)
kultiviert wurden, und die dann, statt mit FCCM mit Nährme
dium (gemäß Beispiel 2) für weitere 6 Tage behandelt wurden.
Das FCCM enthält also Komponenten, die als Signalgeber für
die Differenzierung in Fettzellen benötigt werden.
Das Färben der Zellen mit Sudan-Rot erfolgte nach der von
Patrick Jr., C. W. et al., Epithelial Cell Culture: Breast,
in Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, Kapi
tel 4, S. 141-149. 3A, B, C und D gezeigt.
Zusätzlich zur Phänotypisierung der Fettzellen durch Färbung
mit Sudan-Rot erfolgte eine molekularbiologische Cha
rakterisierung der Fettzellen auf mRNA-Ebene, um zu überprü
fen, ob das genetische Programm der Fettzelle nach entspre
chender Programmierung mit dem eingesetzten Fettzell-kon
ditionierenden Medium eine entsprechende Alteration erfährt
und typische, für Fettzellen beschriebene messenger-Ribonuk
leinsäure (mRNA)-Transkripte in den aus programmierbaren
Monozyten programmierten Fetzellen nachweisbar sind. Zwei
für den Fettzellstoffwechsel typische mRNA-Seguenzen wurden
mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus isolierten RNA-
Proben von dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen
monozytären Ursprungs und, in einem parallelen Versuchsan
satz, aus den programmierten Fettzellen amplifiziert, näm
lich "peroxisome proliferative activated receptor gamma"
(PPARG) mRNA, (Ref. Tontonoz, P., et al. Stimulation of adi
pogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated
transcription factor. Cell 79, 1147-1156, 1994), Genbank
Zugangscodenummer; NM_005037) und "leptin (obesity homolog,
mouse)" mRNA, (Rf. Zhang Y., et al. Positional cloning of
the mouse obese gene and its human homologue. Nature 372,
425-432, 1994), Genbank, Zugangscodenummer: NM_000320).
Die hierfür notwendige RNA-Isolierung, die reverse Trans
kriptionsmethodik und die Bedingungen der PCR-Amplifikation
der gewünschten mRNA-Sequenzen wurden wie im Stand der Tech
nik detailliert beschrieben, durchgeführt, s. hierzu, Un
gefroren H., et al., "Human pancreatic adenocarcinomas ex
press Fas und Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated
apoptosis", Cancer Res. 58, 1741-1749 (1998).
Zu diesem Zweck wurden die jeweiligen zur PCR-Amplifikation
hergestellten Primer so ausgewählt, daß der forward and
reverse Primer an mRNA Sequenzen binden, deren homologe
Bereiche im chromosomalen Gen in zwei verschiedenen Exons
liegen und durch ein großes Intron voneinander getrennt
sind. Hierdurch konnte sichergestellt werden, daß das erhal
tene Amplifikationsfragment von der in der Zelle enthaltenen
mRNA und nicht von der in der chromosomalen DNA vorhandenen
Sequenz stammt. Im Einzelnen wurde für PPAR-γ und für Leptin
folgende Primersequenzen ausgewählt:
PPAR-γ: forward-primer; 265-288 (korespondierende Gensequenz
in Exon 1), reverse-primer: 487-465 (korrespondierende Gese
quenz in Exon 2), damit ergibt sich ein Amplifikationsfrag
ment von 487 - 265 bp = 223 bp, s. Abb. 3G. Wie ferner aus
Abb. 3G ersichtlich, sind Spuren an transkribierter PPAR-γ-
spezifischer mRNA bereits in der programmierbaren Stammzelle
und in der Tumorzellinie HL-60 (einer humanen promyeloischen
Leukäme-Zelllinie) nachweisbar, allerdings mit signifikant
geringerer Signalbande als in der Fettzelle selbst. Dagegen
läßt sich das Fettzell-spezifische Protein Leptin nur in den
aus der programmierbaren Stammzellen abgeleiteten Fettzellen
auf mRNA-Ebene durch reverse-Transkriptase-PCR nachweisen.
Die zur Kontrolle eingesetzten programmierbaren Stammzellen
(progr. Stammzelle) und die humanen Tumorzelllinien HL-60,
Panc-1 und WI-38 transkribieren kein Leptin. Als Negativ
kontrollen wurden alle Ansätze ohne Zusatz der reversen
Transkriptase (Fettzelle/-RT) und H2O-Proben simultan mit
bestimmt. Durch Nachweis des GAPDH-housekeeping Gens in den
Positivkontrollen ist sichergestellt, daß die jeweiligen
PCR-Amplifizierungsschritte in den Einzelansätzen ordnungs
gemäß durchgeführt wurden.
Für die Programmierung der dedifferenzierten programmier
baren Stammzellen monozytären Ursprungs gemäß Beispiel 2 in
Leberzellen wurde zunächst ein konditioniertes Medium gene
riert. Hierzu wurden 40 g humanes Lebergewebe wie folgt
aufgearbeitet.
Zunächst wurde das Lebergewebe mehrmals in PBS gespült, um
es weitestgehend von Erythrozyten zu befreien. Anschließend
wurde das Gewebe in einer Petrischale zerkleinert und mit
einer Dissoziationslösung etwa 45 Min. lang bei Raum
temperatur inkubiert. Die Dissoiationslösung bestand aus 40 ml
PBS (Phosphate buffered sahne), 10 ml einer 1 : 10 mit PBS
verdünnten Trypsinlösung und 30 mg Collagenase Typ II (Rod
bel M., et al. J. Biol Chem 239; 375, 1964). Nach 45minütiger
Inkubation wurden die Gewebebrocken durch ein Sieb (s. Bei
spiel 6) passiert.
Anschließend wurde das Gemisch in 50 ml Falconröhrchen über
führt, bis auf 50 ml mit PBS aufgefüllt und 10 Min. lang bei
1800 rpm zentrifugiert.
Nach Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das
die Leberzellen enthaltende Zellpellet wurde erneut mit 50 ml
PBS gewaschen und zentrifugiert. Der so entstandene Über
stand wurde wiederum verworfen und das Zellpellet in 25 ml
eines Mediums der folgenden Zusammensetzung aufgenommen und
in Zellkulturflaschen (250 ml Volumen) 10 Tage lang bei 37°C
im Brutschrank inkubiert:
Das Nährmedium enthielt zusätzlich 5 µg (10 ng/ml Epidermal
growth factor (Pascall, I. C., et al., 1994, J. Mol. Endocinol.
12, 313). Die Zusammensetzung der Insulinlösung wurde in
Bsp. 6 beschrieben.
Während der 10 Tage dauernden Inkubation bildete sich das
Leberzell-konditionierte Medium, LCCM als Überstand. Der
Überstand wurde nach jeweils 2 bis 4 Tagen durch frisches
Nährmedium ersetzt. Das jeweils beim Mediumwechsel gewonnene
LCCM wurde steril filtriert (Filter mit 0,2 µm Porengröße)
und bei -20°C gelagert.
1 × 106 dedifferenzierte Stammzellen wurden dann mit 10 ml
eines Mediums der folgenden Zusammensetzung in einer Petri
schale (Ø 100 mm) oder einer Kulturflasche kultiviert.
"Hepytocyte growth factor" [Kobayashi, Y. et al. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 220, 7, (1996)] wurde in der Kon
zentration 40 ng/ml eingesetzt. Nach einigen Tagen konnten
morphologische Veränderungen zu flachen, polygonalen mono-
oder diploiden Zellen beobachtet werden (Abb. 4A). Nach 10-12
Tagen konnten aus dedifferenzierten Stammzellen entstandene
Hepatozyten durch einen immunhistochemischen Nachweis des
leberspezifischen Antigens "Alpha-Fetoprotein" identifiziert
werden (Jacobsen et al., Am. J. Surg. Pathol. 1981; 5: 257-66),
wie auf den Abb. 4B und 4C gezeigt.
Zusätzlich zur Phänotypisierung der Hepatozyten durch immun
histochemischen Nachweis des Alpha-Foetoproteins erfolgte
eine molekularbiologische Charakterisierung der Hepatozyten
auf mRNA-Ebene um zu überprüfen, ob das genetische Programm
der Stammzellen nach entsprechender Programmierung mit dem
eingesetzten Leberzell-konditionierenten Medium eine ent
sprechende Alteration erfährt und als typisch für Leberzel
len beschriebene messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) in den
aus den erfindungsgemäßen Stammzellen hervorgegangenen He
patozyten nachweisbar sind. Zu diesem Zweck wurde das Vor
handensein von fünf verschiedenen, für Hepatozyten typischen
mRNA-Sequenzen mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in
isolierten RNA-Proben aus dedifferenzierten programmierbaren
Stammzellen monozytären Ursprungs und, in einem parallelen
Versuchsansatz, aus den durch Programmieren der Stammzellen
erhaltenen Leberzellen untersucht. Im einzelnen handelte es
sich um "Homos sapiens albumin mRNA", [Ref. Lawn, R. M. et al.
The sequence of human serum albumin cDNA and its expression
in E. coli. Nucleic Acids Res.. 9,6103-6114, (1981)], Genbank
Zugangscodenummer: NM-000477; "alpha-fetoprotein mRNA" [Ref.
Morinaga T, et al. Primary structures of human alpha-feto
protein and its mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.80, 4604-
4608, (1983)], Genbank Zugangscodenummer: V01514; "Human
carbamyl phosphate synthetase I mRNA" [Ref. Haraguchi, Y.,
et al., Cloning and sequence of a cDNA encoding human carb
amyl phosphate synthetase I: molecular analysis of hyper
ammonemia, Gene 107, 335-340 (1991)], Genbank Zugangscode
nummer D90282, "Homo sapiens coagulation factor II" (Throm
bin, F2) mRNA [Ref. Degen, S. J. et al. Characterization of
the complementary deoxyribonucleic acid and gene coding for
human prothrombin, Biochemistry 22, 2087-2097, (1983)], Gen
bank Zugangscodenummer NM-000506; "Homo sapiens coagulation
factor VII" (serum prothrombin conversion accelerator, F7)
mRNA [Ref. NCBI Annotation Project. Direct Submission, 06-
Feb-2002, National Center for Biotechnology Information,
NIH, Bethesda, MD 20894, USA] Genbank Zugangscodenummer XM-
027508.
Die hierfür notwendige RNA-Isolierung, die reverse Trans
kriptionsmethodik und die Bedingungen der PCR-Amplifikation
der gewünschten mRNA-Sequenzen wurden wie im Stand der Tech
nik detailliert beschrieben durchgeführt, siehe hierzu Un
gefroren H. et al. "Human pancreatic adenocarcinomas express
Fas and Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated apop
tosis", Cancer Res. 58, 1741-1749 (1998).
Die jeweiligen Primer zur PCR-Amplifikation wurden so aus
gewählt, daß der "forward" und "reverse" Primer an mRNA-Se
quenzen binden, deren homologe Bereiche im chromosomalen Gen
in zwei verschiedenen Exons liegen und durch ein großes
Intron voneinander getrennt sind. Auf diese Weise konnte
sichergestellt werden, daß das erhaltene Amplifikationsfrag
ment von der in der Zelle enthaltenen mRNA und nicht von der
in der chromosomalen DNA vorhandenen Sequenz stammt.
Es wurden die nachfolgend angegebenen Primersequenzen ausge
wählt; die Ergebnisse der jeweiligen PCR Analysen sind in
Abb. 4D wiedergegeben. Die erfindungsgemäßen dedif
ferenzierten, programmierbaren Stammzellen sind dort als
"progr. Stammzelle" und die durch Programmieren von diesen
abgeleiteten Hepatozyten als "progr. Hepatozyt" bezeichnet.
- - Alpha-Foetoprotein: forward-primer: 1458-1478 (korres
pondierende Gensequenz in Exon 1), reverse-primer: 1758-1735
(korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich
ein Amplifikationsfragment von 1758-1458 bp = 391 bp, siehe
Abb. 4D.
Wie Abb. 4 zeigt, läßt sich die programmierbare Stam mzelle (progr. Stammzelle), in der selbst keine spezifischen mRNA-Transkripte für Alpha-Fötoprotein nachweisbar sind, in einen Hepatozyten programmieren (progr. Hepatozyt), der die ses mRNA-Transkript enthält (positive Bande mit dem Moleku largewicht von 301 bp). Hieraus erklärt sich auch die immun histochemische Nachweisbarkeit des Alpha-Fötoproteins, wie auf den Abb. 4B und 4C gezeigt. Die Positiv-Kontrol len, namentlich humanes Lebergewebe und die Lebertumorzel linie HepG2 transkribieren ebenfalls Alphafötoprotein-spezi fische mRNA, wie die Banden von 301 bp bestätigen. - - Albumin: "forward-primer": 1450-1473 (korrespondierende Gen
sequenz in Exon 1), "reverse-primer": 1868-1844 (korres
pondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergab sich ein
Amplifikationsfragment von 1868 - 1450 bp = 419 bp. siehe
Abb. 4D.
Abb. 4D zeigt Spuren an transkribierter Albumin-spezi fischer mRNA bereits in der programmierbaren Stammzelle, während die durch Programmieren der Stammzellen erhaltenen Hepatozyten, sowie die positiv-Kontrollen, nämlich normales Lebergewebe und die Tumorzellinie HepG2 starke Banden expri mieren. - - Carbamyolphosphatase Synthetase I: forward-primer 3135-3157
(korrespondierende Gensequenz in Exon 1), reverse-primer:
4635-4613 (korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit
ergibt sich ein Amplifikationsfragment von 4635 - 3135 = 1500 bp,
siehe Abb. 4D.
Die Carbamoylphosphat Synthetase I stellt ein für den Hepa tozyten spezifisches Enzym dar, welches eine wichtige Rolle bei der Metabolisierung von Harnstoff im sogenannten Harn stoffzyklus übernimmt. Diese Entgiftungsfunktion wird durch funktionsfähige Hepatozyten gewährleistet. Wie Abb. 4D belegt, lassen sich sowohl in den aus programmierbaren Stammzellen generierten Hepatozyten als auch in den Posi tiv-Kontrollen (aus humanem Lebergewebe und die HepG2 Tumor zellinie) die spezifischen mRNA-Banden (1500 bp) für Car bamoylphosphat Synthetase I nachweisen. Die etwas schwächere Expression der mRNA Bande für die programmierten Hepatozyten (progr. Hepatozyt) erklärt sich durch das fehlende Substrat angebot in der Kulturschale. - - Gerinnungssfaktor II: forward-primer 1458-1481 (korrespon
dierende Gensequenz in Exon 1), reverse-primer: 1901-1877
(korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich
ein Amplifikationsfragment von 1901 - 1458 = 444 bp, siehe
Abb. 4D.
Dieses ebenfalls Hepatozyten-spezifische Protein läßt sich lediglich in dem programmierten Hepatozyten (progr. Hepato zyt) und in der Positiv-Kontrolle aus humanem Lebergewebe auf mRNA-Ebene durch Bandenexpression bei 444 bp nachweisen, wogegen die programmierbare Stammzelle (progr. Stammzelle) diese Bande nicht zeigt, d. h. das Gen wird dort nicht transkribiert, wie in Abb. 4D gezeigt. - - Gerinnungsfaktor VII: forward-primer 725-747 (korres
pondierende Gensequenz in Exon 1), reverse-primer: 1289-1268
(korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich
ein Amplifikationsfragment von 1289 - 725 = 565 bp, siehe
Abb. 4D.
Ebenso wie der Gerinnungsfaktor II wird auch dieses Protein lediglich in programmierten Hepatozyten (progr. Hepatozyt) und in der Positivkontrolle (humanes Lebergewebe) transkri biert (siehe Banden bei 656 bp), wenn auch schwächer als der Gerinnungsfaktor II. Weder die programmierbare Stammzelle noch die Negativkontrolle (H2O) zeigen diese spezifische mRNA-Bande. - - Glyzerinaldehyd-dehydrogenase: Dieses auch als "house keeping gene" bezeichnete Gen läßt sich in jeder eukaryotis chen Zelle nachweisen und dient als Kontrolle einer in allen Proben ordnungsgemäß durchgeführten PCR-Amplifikation, die parallel mitbestimmt wird und durch Zugabe einer definierten Menge an RNA aus den jeweiligen Zellproben zustande kommt.
- - Als Negativkontrollen wurde in allen Ansätzen H2O-Proben simultan mitbestimmt. Da H2O keine RNA enthält, wird auch nichts amplifiziert und die Bande bleibt aus (dient damit als Gegenkontrolle).
Für die Programmierung der dedifferenzierten programmierbaren
Stammzellen monozytären Ursprungs gemäß Beispiel 2 in Hautzel
len wurde zunächst ein konditioniertes Medium generiert. Hierzu
wurde 1-2 cm2 humane Vollhaut wie folgt aufgearbeitet.
Das Hautmaterial wurde zunächst unter sterilen Bedingungen von
der Subcutis befreit. Das Gewebe wurde nun insgesamt 10x mit
PBS in einem sterilen Behälter durch kräftiges Schütteln gewas
chen. Nach der 2. Waschung wurde das Gewebe nochmals von demar
kierten Bindegewebsresten befreit.
Danach wurde das Hautmaterial in eine Petrischale mit einem
Durchmesser von 60 mm gegeben, dort mit 3 ml einer 1 : 10 mit PBS
verdünnten Trypsinlösung versetzt und in kleine Stücke (etwa
0,5 bis 1 mm3) geschnitten. Danach wurden dem Gemisch erneut 3 ml
der 1 : 100 mit PBS verdünnten Trypsinlösung zugesetzt und die
Mischung wurde bei 37°C 60 Minuten lang unter intermittierendem
Schütteln inkubiert.
Danach ließ man die größeren Partikel sedimentieren und der die
Keratinozyten enthaltende Überstand wurde abgegossen und bei
800 rpm 5 min. lang zentrifugiert. Der nun entstandene Über
stand wurde abpipettiert und das Zellpellet in 3 ml eines
Mediums der folgenden Zusammensetzung aufgenommen und in Petri
schalen (ø 100 mm) 15 Tage lang im Brutschrank bei 37°C inku
biert.
Das Nährmedium enthielt 5 µg "Epidermal growth factor" (genaue
Spezifizierung, s. Beispiel 7) und 5 mg Hydrocortison (Ref.
Merck Index: 12, 4828).
Während der 15 Tage dauernden Inkubation bildet sich das Kera
tinozytenzell-konditionierte Medium KCCM als Überstand. Der
Überstand wurde nach jeweils 2-4 Tagen durch frisches Nährme
dium ersetzt. Das jeweils beim Mediumwechsel gewonnene KCCM
wurde steril filtriert und bei -20°C gelagert.
1 × 106 dedifferenzierte Stammzellen wurden dann mit 10 ml eines
Mediums der folgenden Zusammensetzung in einer Petrischale
100 mm) oder einer Kulturflasche kultiviert.
Keratinocyte growth factor wurde in einer Konzentration von 25 ng/ml
eingesetzt, wie beschrieben von Finch et al., 1996, Gas
troenterology 110: 441.
Nach einigen Tagen konnte eine morphologische Veränderung der
Zellen beobachtet werden. Nach 6 Tagen ließen sich die kera
tinozyten-spezifischen Antigene, Cytokeratin 5 und 6, die beide
von dem verwendeten Primärantikörper gebunden werden, (Exp.
Cell. Res. 1986, 162: 114) nachweisen (Abb. 5A). Nach 10 Tagen
erfolgte bereits in Kultur eine Zelladhärenz der deutlich grö
ßeren Einzelzellen, die einen sichtbaren Zellgewebeverband kon
fluierender Zellen erkennen ließen (Abb. 5B).
Zur Abklärung, inwieweit die programmierbaren Stammzellen in
vivo nach Injektion über die Pfortader in die Leber eines gene
tisch-identischen Empfängertieres durch die im Leberorgan vor
handenen Signalgeber eine spezifische Differenzierung erfahren,
wurden Leberorgane weiblicher LEW-Ratten zunächst mit Retrorsin
behandelt, um die in der Leber vorhandenen Hepatozyten (Leber
parenchymzellen) in ihrer Prolieferationsaktivität zu hemmen
[Ref. Lacone E. et al. "Long-term, near-total liver replacement
by transplantation of isolated hepatocytes in rats treated with
retrorsine, Am J Path 153, 319-329, (1998)].
Zu diesem Zweck erhielten die LEW-Ratten 30 mg des Pyrro
lizidin-Alkaloids Retrorsin, intraperitoneal zweimalig, inner
halb von 14 Tagen gespritzt. Anschließend erfolgte eine 80%
Resektion der so vorbehandelten Lebern gefolgt von der Gabe von
5 × 105 der programmierbaren Stammzellen in 1 ml PBS in die
Pfortader der verbliebenen Restleber. Die Stammzellen waren wie
in Beispiel 2 beschrieben aus Monozyten männlicher LEW-Ratten
gewonnen worden. 5 Tage nach Gabe der Stammzellen erfolgte eine
Stanzbiopsie der Leber zur histologischen Beurteilung der Leber
und zum Nachweis der aus den Stammzellen differenzierten Zell
typen mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit Y-
Chromosom spezifischen Sonden, wie ausführlich in Hoebee B., de
Stoppelaar JM, et al. Isolation of rat chromosome-specific
paint probes by bivariate flow sorting followed by degenerate
oligonucleotide primed-PCR. Cytogenet Cell Genet 66: 277-282
(1994) beschrieben.
Abb. 7A zeigt die aus den männlichen LEW-Stammzellen ab
geleiteten Y-Chromosom-positiven (rote Punkte im Zellkern)
Heptozyten am 5. Tage nach intraportaler Injektion in Retror
sin-vorbehandelte 80%-resezierte Leberorgane weiblicher Empfän
gertiere. Die selektive Entnahme der gleichen Leber am Tag 25
nach Stammzellinjektion zeigt die Differenzierung der Stammzel
len in Hepatozyten, Endothelzellen und Gallengangsepithelien.
Zu diesem Zeitpunkt hat die Lebergröße bereits wieder Nor
malgröße erreicht und < 90% der Zellen weisen ein Y-Chromosom
auf. Hieraus kann gefolgert werden, daß die injizierten syn
genen programmierbaren Stammzellen monozytären Ursprungs in der
Lage sind, in vivo eine komplette Wiederherstellung des Leber
organs mit normaler metabolischer Funktion zu bewerkstelligen.
Abb. 7C zeigt hierzu die Überlebenskurven nach Kaplan-
Meier (n = 4 pro Gruppe), Stammzell-behandelter versus unbehandel
ter Empfängerratten nach Retrorsingabe und 80% Leberresektion.
Die Funktionsparameter Bilirubin und Ammoniak (NH3) belegen die
volle metabolische Funktion der langzeit überlebenden Stamm
zell-behandelten Tiere (Abb. 7D und 7E).
Claims (24)
1. Verfahren zur Herstellung von dedifferenzierten, pro
grammierbaren Stammzellen humanen monozytären Ursprungs,
dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) Monozyten aus Human-Blut isoliert;
- b) die Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium ver mehrt, welches den zellulären Wachstumsfaktor M-CSF enthält;
- c) die Monozyten gleichzeitig mit oder im Anschluß an Stufe b) in einem IL-3 enthaltenden Kulturmedium kul tiviert; und
- d) die in Stufe c) gebildeten humanen adulten dedifferen zierten, programmierbaren Stammzellen gewinnt, indem man die Zellen von dem Kulturmedium abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
dem Kulturmedium in Stufe c) ferner eine Mercaptoverbindung
zusetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Mercaptoverbindung verwendet, in der mindestens eine
Kohlenwasserstoffgruppe an den Schwefel gebunden ist, wobei
die Kohlenwasserstoffgruppe(n) mit einer oder mehreren wei
teren funktionellen Gruppen substituiert sein kann (kön
nen).
4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Mercaptoverbindung 2-Mercaptoethanol oder
Dimethylsulfoxid ist.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich
net, daß man die Zellen im Anschluß an Stufe c) und vor
Stufe d) mit einem biologisch verträglichen organischen Lö
sungsmittel in Kontakt bringt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das
biologisch verträgliche organische Lösungsmittel ein Alko
hol mit 1-4 Kohlenstoffatomen ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der
Alkohol Ethanol ist.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeich
net, daß man die Zellen mit der Dampfphase des biologisch
verträglichen organischen Lösungsmittels in Kontakt bringt.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Zellen im Anschluß an Stufe e) in einem geeig
neten Zellkulturmedium suspendiert.
10. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das
Medium RPMI oder DMEM ist.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 9 oder 10, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Medium ein Zytokin oder LIF enthält.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekenn
zeichnet, daß man die Zellen in einem flüssigen Medium
suspendiert und anschließend tiefgefriert.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das
Medium ein Zellkulturmedium ist.
14. Dedifferenzierte, programmierbare Stammzellen humanen mono
zytären Ursprungs.
15. Stammzellen nach Anspruch 14, erhältlich nach dem Verfahren
gemäß den Ansprüchen 1 bis 13.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die de
differenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den
Ansprüchen 14 oder 15.
17. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stamm
zellen nach den Ansprüchen 14 oder 15, zur Herstellung von
Zielzellen und Zielgewebe.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß
man
- a) die gewünschten Zielzellen enthaltendes Gewebe zer kleinert;
- b) die Zielzellen und/oder Fragmente derselben aus dem zerkleinerten Gewebe gewinnt;
- c) die Zielzellen und/oder Fragmente derselben in einem geeigneten Kulturmedium inkubiert;
- d) den Überstand des Kulturmediums während und nach der Inkubation als Zielzell-konditioniertes Medium sam melt; und
- e) zum Reprogrammieren/Differenzieren der Stammzellen in die gewünschten Zielzellen die Stammzellen in Gegen wart des Zielzell-konditionierten Mediums wachsen läßt.
19. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung
von Adipocyten.
20. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung
von Neuronen und Gliazellen.
21. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung
von Endothelzellen.
22. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung
von Keratinocyten.
23. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung
von Hepatozyten.
24. Verwendung nach den Ansprüchen 17 oder 18 zur Herstellung
von Inselzellen.
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