DE10209071A1 - Standardized polynucleotide system, useful for quantitative, real-time determination of nucleic acid, comprises stabilized standards, primers and probe - Google Patents
Standardized polynucleotide system, useful for quantitative, real-time determination of nucleic acid, comprises stabilized standards, primers and probeInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft standardisierte Polynukleotidsysteme für den quantitativen "real- time" Nachweis von Nukleinsäure-Zielsequenzen unter Nutzung enzymatischer Vervielfältigungsverfahren. Jedes Polynukleotidsystem besteht aus mindestens einem Satz exakt kalibrierten Standard DNA- oder RNA Fragmente bekannter Konzentration, mindestens einer Trägernukleinsäure, mindestens drei Oligonukleotiden, wobei zwei Oligonukleotide als sog. Primer und mindestens ein Oligonukleotid als Target-spezifische, mit mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff-Molekül markierte Sonde zum spezifischen Nachweis der gebildeten Amplifizierungsprodukte fungiert, sowie einem zugehörigen Protokoll. Mögliche Anwendungsgebiete sind die qualitative und quantitative Analyse von Genen und Genprodukten, insbesondere für die individualisierte medizinische Diagnostik, die funktionelle Genomanalyse, die klinische Pharmakologie, Pharmakogenetik sowie die Lebensmittel- und Umweltanalytik, sowie der Einsatz für den ultrasensitiven Nachweis von Proteinen mittels Immuno-PCR (iPCR). The invention relates to standardized polynucleotide systems for quantitative "real" time "Detection of nucleic acid target sequences using enzymatic Duplication process. Each polynucleotide system consists of at least one set exactly calibrated standard DNA or RNA fragments of known concentration, at least a carrier nucleic acid, at least three oligonucleotides, two oligonucleotides as So-called primers and at least one oligonucleotide as target-specific, with at least one Fluorescent dye molecule labeled probe for specific detection of the formed Amplification products acts, as well as an associated protocol. Possible Areas of application are the qualitative and quantitative analysis of genes and Genetic products, especially for individualized medical diagnostics functional genome analysis, clinical pharmacology, pharmacogenetics and Food and environmental analysis, as well as the use for the ultrasensitive detection of Proteins using immuno-PCR (iPCR).
Viele Bereiche in der klinischen Forschung und Diagnostik, der pharmakologischen Wirkstoffprüfung, Veterinärmedizin sowie der Lebensmittel- und Umweltanalytik machen es erforderlich, die exakte Qualität oder Quantität von Target-Desoxyribonukleinsäuren (DNA), -Ribonukleinsäuren (RNA) oder -Proteinen in einer zu analysierenden Probe zu kennen. Zur Messung insbesondere extrem geringer Mengen dieser Moleküle, wie sie z. B. in Blut, Gewebeproben, Zellkulturen, gentechnisch veränderten Lebensmitteln, etc. nachweisbar sind, wird zunehmend die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt, eine in vitro Methode zur exponentiellen Vermehrung (Amplifikation) der zu messenden Ziel-Nukleinsäure1,2. Die PCR ist sowohl für qualitative als auch quantitative Aussagen einsetzbar. Das Prinzip der quantitativen PCR besteht darin, aus der Menge der in vitro synthetisierten PCR-Produkte auf die initial im Reaktionsansatz befindliche Menge von Zielmolekülen zu schließen. Neuere Detektionstechnologien erlauben es, die in vitro Synthese von PCR-Produkten "real-time", d. h. homogen direkt im jeweils verwendeten PCR-Reaktionsgefäß zu messen. Bekannte Verfahren hierfür stellen das auf "Fluorescence resonance energy transfer (FRET) basierenden "Dyelabeled oligonucleotide ligation (DOL) Verfahren3,4 (US 6,027,889; US 6,268,148), das 5'- Nuklease oder TaqMan™-Assay5,6 (US 5,210,015; US 5,487,972; US 5,804,375), sowie das "Adjacent hybridization probes"-Verfahren (US 5,532,129; US 5,565,322, US 5,914,230) dar. Zu den sog. nicht FRET-basierende Detektionsverfahren gehören die "Molecular beacons"6 (US 5,989,823), die "Self priming probes" (US 5,866,336) sowie das PCR-unabhängige Invader-Assay6-8. Many areas in clinical research and diagnostics, pharmacological drug testing, veterinary medicine and food and environmental analysis require the exact quality or quantity of target deoxyribonucleic acids (DNA), ribonucleic acids (RNA) or proteins in a sample to be analyzed to know. To measure especially extremely small amounts of these molecules, such as z. B. in blood, tissue samples, cell cultures, genetically modified foods, etc., the polymerase chain reaction (PCR) is increasingly used, an in vitro method for exponential amplification (amplification) of the target nucleic acid to be measured 1,2 . The PCR can be used for both qualitative and quantitative statements. The principle of quantitative PCR is to use the amount of PCR products synthesized in vitro to infer the amount of target molecules initially in the reaction mixture. Newer detection technologies make it possible to measure the in vitro synthesis of PCR products "real-time", ie homogeneously directly in the PCR reaction vessel used. Known methods for this are the "Fluorescence resonance energy transfer (FRET) based" Dyelabeled oligonucleotide ligation (DOL) method 3.4 (US 6,027,889; US 6,268,148), the 5'-nuclease or TaqMan ™ assay 5,6 (US 5,210,015 ; US 5,487,972; US 5,804,375), and the "Adjacent hybridization probes" method (US 5,532,129; US 5,565,322, US 5,914,230). The so-called non-FRET-based detection methods include "Molecular beacons" 6 (US 5,989,823), the "Self priming probes" (US 5,866,336) and the PCR-independent invader assay 6-8 .
Für Nukleinsäure-Quantifizierungsreaktionen wird häufig das homogene, sehr robuste 5'-3'-Exonuklease-Assay (TaqMan™-Assay, US 5,210,015) angewandt. Dieses Verfahren beruht auf einem dem Fachmann bekannten konventionellen PCR-Prinzip, wobei eine gleichzeitig im Ansatz enthaltene, Amplicon-komplementäre, einzelsträngige DNA-Sonde zwischen den Primerbindungsstellen am Target anhybridisiert. Diese am 5'-Ende mit einem Reporter- und am 3'-Ende mit einem Quencher-Farbstoff markierte Sonde wird infolge Primerextension durch die 5'-3'-Exonuklease Aktivität der Taq-Polymerase hydrolysiert, wobei resultierend der Quench-Effekt aufgehoben und ein der Menge an Target-Produkt proportionales Fluoreszenzsignal erzeugt wird5,9-11. The homogeneous, very robust 5'-3 'exonuclease assay (TaqMan ™ assay, US Pat. No. 5,210,015) is frequently used for nucleic acid quantification reactions. This method is based on a conventional PCR principle known to the person skilled in the art, an amplicon-complementary, single-stranded DNA probe simultaneously contained in the mixture hybridizing between the primer binding sites on the target. This probe labeled at the 5'-end with a reporter and at the 3'-end with a quencher dye is hydrolyzed as a result of primer extension by the 5'-3'-exonuclease activity of the Taq polymerase, the quenching effect being abolished and a fluorescence signal proportional to the amount of target product is generated 5.9-11 .
Sollen quantitative Aussagen über die Menge von Target-Molekülen in einer Probe getroffen werden, sind neben den erforderlichen Reagenzien sequenzhomologe Standards oder Kontrollen definierter Konzentration erforderlich, die entweder in demselben Ansatz oder in parallelen Ansätzen simultan unter Proben-identischen Bedingungen coamplifiziert werden. Anhand der erhaltenen Messdaten für die Kontrollen kann beispielsweise über eine Referenzkurve die jeweilige initiale Menge an Ziel-Nukleinsäuren oder Proteinen in der Probe exakt ermittelt werden. Are intended to provide quantitative statements about the amount of target molecules in a sample in addition to the required reagents are sequence homologous standards or Defined concentration controls are required, either in the same approach or in parallel approaches are co-amplified simultaneously under sample-identical conditions. Using the measurement data obtained for the controls, for example, a Reference curve the respective initial amount of target nucleic acids or proteins in the sample can be determined exactly.
Der derzeitige Stand der Technik besteht dahin, dass nur wenige, zudem unstandardisierte und mehreren Störgrößen unterworfene Testsysteme für quantitative Nukleinsäuremessungen zur Verfügung stehen, die sich durch mangelnde Stabilität, komplizierte Handhabung, aufwendiges und kontaminationsbehaftetes Herstellen von Verdünnungsreihen der Kontrollen, schlechte Kit-Ausnutzung, Unflexibilität in der Anwendung, eingeschränkte Plausibilität der Messergebnisse, fehlende Validierung und mangelnde Sensitivität auszeichnen. Quantitative Anwendungen, beispielsweise für die individualisierte Tumordiagnostik, setzen aber standardisierte Polynukleotidsysteme voraus, die hohe Spezifität, Sensitivität, Stabilität, Präzision und Reproduzierbarkeit in der Anwendung garantieren und somit den gewünschten Gebrauchswert erzielen. Standardisierte Polynukleotidsysteme sind bislang weder Stand der Technik noch wissenschaftlich publiziert oder in Patentschriften offengelegt. The current state of the art is that only a few, moreover unstandardized and multiple disturbance test systems for quantitative Nucleic acid measurements are available that are characterized by a lack of stability, complicated handling, complex and contaminated production of Dilution series of controls, poor kit utilization, inflexibility in the Application, limited plausibility of the measurement results, lack of validation and characterize lack of sensitivity. Quantitative applications, for example for the individualized tumor diagnostics, but require standardized polynucleotide systems, the high specificity, sensitivity, stability, precision and reproducibility in the Guarantee application and thus achieve the desired use value. standardized Polynucleotide systems have so far been neither state of the art nor scientifically published or disclosed in patent specifications.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Lösungen zu beseitigen und neue Möglichkeiten für den quantitativen Nachweis von Nukleinsäure- Zielsequenzen bereitzustellen. The invention has for its object to the disadvantages of the known solutions eliminate and new opportunities for the quantitative detection of nucleic acid To provide target sequences.
Die Aufgabe wurde durch die erfindungsgemäßen, standardisierten Polynukleotidsysteme bestehend aus mindestens einer Trägernukleinsäure, mindestens drei als Primer bzw. Target-spezifische, fluoreszenzmarkierte Sonde fungierenden Oligonukleotiden, optional mindestens einem Satz stabilisierter Kontrollen (Standard DNA oder -RNA) definierter Konzentration sowie einem zugehörigen Protokoll gelöst. Die Sequenzen der stabilisierter Kontrollen definierter Konzentration, der Primer bzw. der Target-spezifischen, fluoreszenzmarkierten Sonden sind werden weiter unten näher beschrieben. The object was achieved by the standardized according to the invention Polynucleotide systems consisting of at least one carrier nucleic acid, at least three as Primer or target-specific, fluorescence-labeled probe acting oligonucleotides, optionally at least one set of stabilized controls (standard DNA or RNA) defined concentration and an associated protocol. The sequences of the stabilized controls of defined concentration, the primer or the target-specific, fluorescence-labeled probes are described in more detail below.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass mit den erfindungsgemäßen Polynukleotidsystemen erstmals eine Anwendung für die technisch und medizinisch validierte Quantifizierung definierter Zielnukleinsäuren unter standardisierten, für die Hochdurchsatzanalytik geeigneten Bedingungen möglich ist. Surprisingly, it has been found that with the invention Polynucleotide systems for the first time an application for the technically and medically validated Quantification of defined target nucleic acids under standardized, for which High throughput analysis suitable conditions is possible.
Die standardisierten Polynukleotidsysteme bestehen im Sinne der Erfindung aus einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA oder RNA, synthetischen Analoga von einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA und RNA, sowie einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA, deren native Desoxy-Thymidin (dT)-Basen gegebenenfalls vollständig oder partiell durch Desoxy-Uracil (dU) oder andere Nukleotidanaloga ersetzt wurden. The standardized polynucleotide systems consist in the sense of the invention single-stranded or double-stranded DNA or RNA, synthetic analogues of single-stranded or double-stranded DNA and RNA, as well as single-stranded or double-stranded DNA, whose native deoxy-thymidine (dT) bases may be complete or have been partially replaced by deoxy-uracil (dU) or other nucleotide analogs.
Als Primer werden erfindungsgemäß Paare synthetisch hergestellter, einzelsträngiger DNA-Polynukleotide verwendet, deren Synthese in bekannter Weise erfolgt und deren Sequenz komplementär zur jeweils zu quantifizierenden Zielnukleinsäuresequenz ist. According to the invention, pairs of synthetically produced, single-stranded are used as primers DNA polynucleotides are used, their synthesis takes place in a known manner and their Sequence is complementary to the target nucleic acid sequence to be quantified in each case.
Als Sonden fungieren idealerweise einzelsträngige DNA-Oligonukleotide, die vorzugsweise am 5'-Ende einen fluorogenen Reporterfarbstoff, wie z. B. 6-Carboxyfluorescein (FAM), 2,7-Dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein (JOE) oder Hexachloro-6- carboxyfluorescein (HEX) enthalten, während das 3'-Ende mit einem Quencher-Farbstoff (z. B. 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin [TAMRA]) oder sog. Dark-Quencher (z. B. DABCYL) markiert ist. Die als Sonden fungierenden Polynukleotide können für ihre Funktionalität aber auch andere Markierungen tragen. Das Design der Primer- und Sondensequenzen erfolgte mittels Primer Express™ 2.0 Software (Applera Genomics) oder Oligo 6.51 Software (Molecular Biology Insights). Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Primer und Sonden entweder mit einem Satz stabilisierter DNA Kontrollen definierter Konzentration oder einem Satz stabilisierter RNA Kontrollen definierter Konzentration verwendet werden. Ideally, single-stranded DNA oligonucleotides act as probes preferably at the 5 'end a fluorogenic reporter dye, such as. B. 6-carboxyfluorescein (FAM), 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein (JOE) or hexachloro-6- contain carboxyfluorescein (HEX) while the 3 'end with a quencher dye (e.g. 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine [TAMRA]) or so-called dark quencher (e.g. DABCYL) is marked. The polynucleotides functioning as probes can, however, for their functionality also carry other markings. The design of the primer and probe sequences was done using Primer Express ™ 2.0 software (Applera Genomics) or Oligo 6.51 software (Molecular Biology Insights). In principle, the primers and probes according to the invention either with a set of stabilized DNA controls of a defined concentration or one Set of stabilized RNA controls with a defined concentration can be used.
Als Trägernukleinsäure zur Messung von Target-DNA wird vorzugsweise Lamda- DNA verwendet, die nach dem Lösen durch eine 10-15 minütige Ultraschallbehandlung in kleinere Fragmente von ca. 2000 Basenpaaren überführt wird. Als Trägernukleinsäure zur Messung von Target-RNA wird vorzugsweise E. coli Transport-RNA (tRNA) eingesetzt. Lamda is preferably used as the carrier nucleic acid for measuring target DNA. DNA is used which, after dissolving in a 10-15 minute sonication smaller fragments of approximately 2000 base pairs are transferred. As carrier nucleic acid for E. coli transport RNA (tRNA) is preferably used to measure target RNA.
Als Standard-Nukleinsäuren bzw. Kontrollen werden synthetische oder native, auf enzymatischem Wege oder mittels Vermehrung von geeigneten Inserts enthaltenden Plasmiden hergestellte Amplifizierungsprodukte oder synthetische Nukleinsäuren verwendet, deren Nukleotidsequenz der zu bestimmenden Zielsequenz mindestens in der amplifizierten Detektionssequenz homolog ist, vorzugsweise identisch oder gekennzeichnet durch eine oder mehrere Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen ist, die vorzugsweise außerhalb der für die Detektion verwendeten Primer- und Sondenbindungsstellen liegen. The standard nucleic acids or controls are synthetic or native enzymatically or by increasing suitable inserts Plasmid-produced amplification products or synthetic nucleic acids are used, the nucleotide sequence of the target sequence to be determined at least in the amplified Detection sequence is homologous, preferably identical or characterized by an or is multiple point mutations, deletions, or insertions, preferably outside of that for the detection used primer and probe binding sites.
Die Herstellung geeigneter Standard-DNA erfolgt in einer dem Fachmann bekannten Art, vorzugsweise mittels enzymatischer Amplifikation von Target-Subsequenzen mittels PCR, unter Nutzung spezifischer Primer-Oligonukleotide, die vorzugsweise nicht oder nur partiell mit den in den Polynukleotidsystemen verwendeten Primern identisch sind und längere Amplifizierungsprodukte als das detektierte PCR-Fragment generieren. Standard-DNA kann aber auch synthetisch, mittels Klonierung oder mit weiteren, dem Fachmann bekannten molekularbiologischen Methoden hergestellt werden. Suitable standard DNA is produced in a manner known to the person skilled in the art Kind, preferably by means of enzymatic amplification of target sub-sequences by means of PCR, using specific primer oligonucleotides that are preferably not or only are partially identical to the primers used in the polynucleotide systems and longer Generate amplification products as the detected PCR fragment. Standard DNA can but also synthetically, by means of cloning or with other known to the expert molecular biological methods are produced.
Standard RNA-Fragmente werden in bekannter Weise hergestellt, indem zunächst mittels PCR oder weiterer enzymatischer Vervielfältigungsverfahren ein zur Zielnukleinsäure homologes DNA-Fragment hergestellt wird, an das entweder direkt oder nach Klonierung in geeignete Plasmide flankierende Promotersequenzen, vorzugsweise T7- oder SP6-Promoter, angefügt werden. Das resultierende Fragment oder Plasmid wird nachfolgend in bekannter Weise gereinigt und unter Nutzung von geeigneten RNA-Polymerasen, beispielsweise T7- Polymerase, mittels in vitro RNA-Synthese in für die Standardisierung quantitativer RNA- Bestimmungsmethoden geeignete synthetische RNA-Fragmente überführt12. Standard-RNA kann aber auch synthetisch, oder mit weiteren, dem Fachmann bekannten molekularbiologischen Methoden hergestellt werden. Standard RNA fragments are produced in a known manner by first producing a DNA fragment homologous to the target nucleic acid by means of PCR or other enzymatic amplification processes, to which promoter sequences, preferably T7 or SP6 promoters, are added either directly or after cloning into suitable plasmids become. The resulting fragment or plasmid is subsequently purified in a known manner and, using suitable RNA polymerases, for example T7 polymerase, by means of in vitro RNA synthesis is converted into synthetic RNA fragments suitable for the standardization of quantitative RNA determination methods 12 . Standard RNA can, however, also be produced synthetically or using other molecular biological methods known to the person skilled in the art.
Die hergestellten Nukleinsäurefragmente werden anschließend einer Reinigungsprozedur unterzogen, wobei DNA vorzugsweise mittels präparativer Agarosegelelektrophorese und anschließender Extraktion der Standard-Nukleinsäure aus dem präparativen Trenngel gereinigt wird, während in vitro hergestellte RNA nach Verdau der Template-DNA mit DNase I in einer dem Fachmann bekannten Weise aus dem in vitro Synthese-Ansatz extrahiert wird. Die exakte Messung der Konzentration von gereinigten DNA-Fragmenten (Kalibrierung) erfolgt vorzugsweise mittels Hochdruck- Flüssigchromatographie2,13, wohingegen RNA nach einem nicht offengelegten Verfahren, der sogenannten funktionellen Kalibrierung charakterisiert wird. The nucleic acid fragments produced are then subjected to a purification procedure, DNA being purified preferably by means of preparative agarose gel electrophoresis and subsequent extraction of the standard nucleic acid from the preparative separating gel, while RNA produced in vitro after digestion of the template DNA with DNase I in a manner known to the person skilled in the art the in vitro synthesis approach is extracted. The exact measurement of the concentration of purified DNA fragments (calibration) is preferably carried out by means of high-pressure liquid chromatography 2.13 , whereas RNA is characterized by an undisclosed method, the so-called functional calibration.
Die so hergestellten und charakterisierten DNA- bzw. RNA-Standards werden nach Herstellung von Verdünnungsstufen im physiologischen Messbereich mittels eines offengelegten Verfahrens in eine lagerstabile "ready-to-use" Form überführt (PCT/DE 99/02715) und dienen nach Komplettierung mit den zugehörigen, als Primer bzw. Sonden fungierenden Oligonukleotiden zur Herstellung von Polynukleotidsystemen. In einer bevorzugten Art der Ausgestaltung werden die erfindungsgemäßen Polynukleotidsysteme so konfektioniert, dass komplette anwendungsspezifische Polynukleotidsysteme in einer gebrauchsfertigen, stabilisierten, ready-to-use Darreichungsform vorliegen. The DNA and RNA standards thus produced and characterized are based on Production of dilution levels in the physiological measuring range by means of a disclosed process in a storage-stable "ready-to-use" form (PCT / DE 99/02715) and serve after completion with the associated, as a primer or Probes acting oligonucleotides for the production of polynucleotide systems. In a The preferred type of embodiment is the polynucleotide systems according to the invention assembled that complete application-specific polynucleotide systems in one Ready-to-use, stabilized, ready-to-use dosage forms are available.
Methodenspezifische Protokolle bevorzugt basierend auf dem TaqMan™-Prinzip werden in einer dem Fachmann bekannten Weise erstellt, optimiert und angewandt. Method-specific protocols preferably based on the TaqMan ™ principle are created, optimized and applied in a manner known to those skilled in the art.
In einer weiteren Form der Ausgestaltung werden die erfindungsgemäßen Polynukleotidsysteme zum qualitativen oder quantitativen Nachweis von Proteinen mittels iPCR eingesetzt. In dieser Ausführungsform wird die Standard-Nukleinsäure nicht in freier sondern konjugierter Form, d. h. in definierter Konzentration kovalent an einem sekundärer Antikörper gebunden, eingesetzt. In a further form of configuration, the inventive Polynucleotide systems for the qualitative or quantitative detection of proteins using iPCR used. In this embodiment, the standard nucleic acid is not released but conjugated form, d. H. in a defined concentration covalently on a secondary Antibody bound, used.
Erstaunlicherweise zeigte sich in mehreren klinischen Studien, dass die erfindungsgemäßen Polynukleotidsysteme zur standardisierten Quantifizierung von Genexpressionen in Tumorproben9,10,14-16 und zur Messung der Viruslast in Serum-, Plasma- oder Gewebeproben besonders geeignet sind. Surprisingly, several clinical studies have shown that the polynucleotide systems according to the invention are particularly suitable for the standardized quantification of gene expressions in tumor samples 9, 10, 14-16 and for measuring the viral load in serum, plasma or tissue samples.
Die Vorteile der Erfindung liegen somit einerseits darin, dass die oben benannten
Nachteile des Standes der Technik abgestellt werden und andererseits erstmalig standardisierte
Messungen von Nukleinsäuren möglich werden. Weitere Vorteile bestehen darin, dass die
erfindungsgemäßen Polynukleotidsysteme folgende neuartige Gebrauchseigenschaften
aufweisen:
- - einfachste und sichere Handhabung, selbst durch molekulardiagnostisch ungeschultes Laborpersonal
- - keine aufwendigen, kontaminationsbehafteten Verdünnungsreihen der Kontrollen mehr erforderlich
- - optimale Reagenzien-Ausnutzung durch garantierte Langzeitstabilität
- - Flexibilität in der Anwendung, da prinzipiell für alle 96- und 384-well "real-time" Messgeräte geeignet
- - Hohe Plausibilität der Messergebnisse
- - Sensitivität bis zu einem Targetmolekül bei Intraassay-Varianzen zwischen ±10% (ca. 1000 Target-Moleküle pro Ansatz) und ±50% (ca. 2 Moleküle pro Ansatz)
- - Klinische Erprobung in mehreren klinischen Studien und Einsatz beim 1. Ringversuch "bcr-abl Quantifizierung durch RT-PCR" im Rahmen des Kompetenznetzes "Akute und chronische Leukämien"
- - Easiest and safest handling, even by molecularly untrained laboratory staff
- - Elaborate, contaminated series of dilutions of the controls are no longer required
- - Optimal use of reagents through guaranteed long-term stability
- - Flexibility in use, since in principle suitable for all 96- and 384-well "real-time" measuring devices
- - High plausibility of the measurement results
- - Sensitivity up to one target molecule with intra-assay variances between ± 10% (approx. 1000 target molecules per approach) and ± 50% (approx. 2 molecules per approach)
- - Clinical testing in several clinical studies and use in the first round robin test "bcr-abl quantification by RT-PCR" within the framework of the competence network "Acute and Chronic Leukemia"
Das Wesen der Erfindung liegt somit in einer Kombination bekannter Elemente und neuer Lösungswege, die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass nunmehr Polynukleotidsysteme für den quantitativen Nachweis ausgewählter Nukleinsäuren in biologischen Substanzen zur Verfügung stehen. The essence of the invention thus lies in a combination of known elements and new ones Solutions that influence each other and unite in their new overall effect Use advantage and the desired success, which lies in the fact that now Polynucleotide systems for the quantitative detection of selected nucleic acids in biological substances are available.
Die Anwendung der erfindungsgemäßen Polynukleotidsysteme besteht im Einsatz für die validierte, standardisierte Quantifizierung von Target DNA, RNA oder Proteinen in vorzugsweise biologischen Untersuchungsmaterialien, bevorzugt nach dem TaqMan™- Prinzip, wobei einzelne Polynukleotide, insbesondere Standards und Primer, auch aus dem System herausgelöst separat für PCR-unabhängige enzymatische Amplifizierungsreaktionen, gegebenenfalls auch in Verbindung mit anderen Detektionstechniken (Hybridization Probes, Scorpions, Molecular Beacons, etc) nutzbar sein können. The polynucleotide systems according to the invention are used for the validated, standardized quantification of target DNA, RNA or proteins in preferably biological test materials, preferably according to the TaqMan ™ - Principle, whereby individual polynucleotides, especially standards and primers, also from the System detached separately for PCR-independent enzymatic amplification reactions, possibly also in connection with other detection techniques (hybridization probes, Scorpions, molecular beacons, etc.) can be used.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotidsysteme finden Anwendung zur Messung von:
- - Kanamycin RNA
- - HCV RNA (Hepatitis C Virus, 5'-untranslatierte Region [UTR])
- - humaner Mdr-1 mRNA (Multidrug Resistance Gen 1)
- - humaner Tyrosinase mRNA (Melanommarker)
- - mitochondrialer DNA mit Spezifität für die Spezies bos taurus (Rinder-DNA)
- - mitochondrialer, 16S RNA codierender DNA (Spezies: Rind, Schwein, Hammel, Dammwild, Kaninchen, Wildhase, Pute, Ente, Huhn)
- - HBV DNA (Hepatitis B virus, surface antigen, HBsAg gene)
- - CMV DNA (Cytomegalovirus, major immediate-early protein, IE)
- - humaner Cyclin D2 mRNA
- - humaner MRP mRNA (Multidrug resistance-associated protein)
- - humaner Mdm-2B mRNA (Murine double minute-2, human splice variant B)
- - Mdm-2 mRNA (Murine double minute-2, human splice variants A, B, C, and D, Spezies: Mensch, Maus)
- - Bcl-xL mRNA (B cell leukemia/lymphoma X gene, long form, Spezies: Mensch, Ratte Maus, Schwein, Rind, Schaf)
- - humaner Bcl-2 mRNA (B cell lymphomal leukemia-2 gene)
- - humaner Bad mRNA (Bcl-2 antagonist of cell death)
- - Bax mRNA (Bcl-2 associated X protein, Spezies: human alternative spliced bax alpha, beta, delta, sigma, zeta; Ratte, Maus)
- - GAPDH mRNA (Glutaraldehydphosphat Dehydrogenase, Spezies: Mensch, Rind, Ratte, Maus, Hamster, Meerschweinchen)
- - humaner Survivin mRNA
- - humaner bcr-abl mRNA, t(9; 22) Minor Breakpoint Cluster Region Translokation e1a2 (m-bcr)
- - humaner bcr-abl mRNA, t(9; 22) Major Breakpoint Cluster Region Translokation b2a2, b3a2b (M-bcr)
- - Kanamycin RNA
- - HCV RNA (hepatitis C virus, 5'-untranslated region [UTR])
- - human Mdr-1 mRNA (Multidrug Resistance Gen 1)
- - human tyrosinase mRNA (melanoma marker)
- - mitochondrial DNA with specificity for the species bos taurus (bovine DNA)
- - mitochondrial, 16S RNA coding DNA (species: cattle, pork, mutton, fallow deer, rabbit, wild hare, turkey, duck, chicken)
- - HBV DNA (hepatitis B virus, surface antigen, HBsAg gene)
- - CMV DNA (cytomegalovirus, major immediate-early protein, IE)
- human cyclin D2 mRNA
- - human MRP mRNA (multidrug resistance-associated protein)
- - human Mdm-2B mRNA (murine double minute-2, human splice variant B)
- - Mdm-2 mRNA (Murine double minute-2, human splice variants A, B, C, and D, species: human, mouse)
- - Bcl-x L mRNA (B cell leukemia / lymphoma X gene, long form, species: human, rat mouse, pig, cattle, sheep)
- - human Bcl-2 mRNA (B cell lymphomal leukemia-2 gene)
- - human bath mRNA (Bcl-2 antagonist of cell death)
- - Bax mRNA (Bcl-2 associated X protein, species: human alternative spliced bax alpha, beta, delta, sigma, zeta; rat, mouse)
- - GAPDH mRNA (glutaraldehyde phosphate dehydrogenase, species: human, bovine, rat, mouse, hamster, guinea pig)
- - human survivin mRNA
- - human bcr-abl mRNA, t (9; 22) minor breakpoint cluster region translocation e1a2 (m-bcr)
- - human bcr-abl mRNA, t (9; 22) major breakpoint cluster region translocation b2a2, b3a2b (M-bcr)
Fig. 1 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 68 separaten Experimenten für die Messung von M-bcr-abl Transkripten unter Nutzung eines M-bcr-abl- spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (1.604.000; 32.080; 10.025; 2.506; 627; 157; 39 und 4 Moleküle/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 7%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 1 shows an average reference curve obtained from 68 separate experiments for the measurement of M-bcr-abl transcripts using an M-bcr-abl specific Polynukleotidsystems containing a set of calibrated standard DNA (1,604,000; 32,080; 10,025; 2,506; 627; 157; 39 and 4 molecules / approach). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y-axis (intercept) based on the mean was <7% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 2 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 7 separaten Experimenten für die Messung von m-bcr-abl Transkripten unter Nutzung eines m-bcr-abl- spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (100.000; 10.000; 2.500; 500; 100; 50; 25 und 5 Moleküle/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 3%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 2 is an average reference curve obtained from 7 separate experiments for the measurement of m-bcr-abl transcripts using shows an m-bcr-abl specific Polynukleotidsystems containing a set of calibrated standard DNA (100,000; 10,000; 2,500; 500; 100; 50; 25 and 5 molecules / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y axis (intercept) based on the mean was <3% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 3 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 11 separaten Experimenten für die Messung von Survivin-Transkripten unter Nutzung eines Survivinspezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (146,693; 14,670; 2,934; 1,467; 0,2934; 0,1467; 0,02934 und 0,00587 zmol/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 6%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. FIG. 3 shows an average reference curve obtained from 11 separate experiments for the measurement of survivin transcripts using a survivin-specific polynucleotide system containing a set of calibrated standard DNA (146.693; 14.670; 2.934; 1.467; 0.2934; 0.1467; 0 , 02934 and 0.00587 cmole / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y-axis (intercept) based on the mean was <6% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 4 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 111 separaten Experimenten für die Messung von Glutaraldehydphosphat Dehydrogenase (GAPDH)- Transkripten unter Nutzung eines GAPDH-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (10,010; 2,002; 0,501; 0,050; 0,010; 0,002; 0,0004004 und 0,0002002 amol/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 4%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 4 shows an average reference curve obtained from 111 separate experiments for the measurement of Glutaraldehydphosphat dehydrogenase (GAPDH) - transcripts using a GAPDH-specific Polynukleotidsystems containing a set of calibrated standard DNA (10,010; 2,002; 0,501; 0,050; 0,010; 0,002 ; 0.0004004 and 0.0002002 amol / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y axis (intercept) based on the mean was <4% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 5 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 29 separaten Experimenten für die Messung von Bcl-2 associated X protein (Bax)-Transkripten unter Nutzung eines Bax-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (166,058; 83,029; 16,606; 8,303; 1,661; 0,8303; 0,1661 und 0,0415 zmol/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 5%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 5 shows an average reference curve obtained from 29 separate experiments for the measurement of Bcl-2 associated X protein (Bax) transcripts using a Bax-specific polynucleotide system containing a set of calibrated standard DNA (166.058; 83.029; 16.606; 8.303 ; 1,661; 0.8303; 0.1661 and 0.0415 zmol / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y-axis (intercept) based on the mean was <5% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 6 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 15 separaten Experimenten für die Messung von Bcl-2 antagonist of cell death (Bad)-Transkripten unter Nutzung eines Bad-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (262,850; 105,140; 26,285; 10,514; 5,257; 2,629; 0,526 und 0,105 zmol/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 8%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 6 shows an average reference curve obtained from 15 separate experiments for the measurement of Bcl-2 antagonist of cell death (Bad) transcripts using a bath-specific Polynukleotidsystems containing a set of calibrated standard DNA (262.850; 105.140; 26.285; 10.514, 5.257, 2.629, 0.526 and 0.105 cmole / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y-axis (intercept) based on the mean was <8% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 7 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 18 separaten Experimenten für die Messung von B cell lymphomal leukemia-2 gene (Bcl-2)-Transkripten unter Nutzung eines Bcl-2-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (138,000; 13,800; 6,900; 2,760; 1,380; 0,690; 0,276 und 0,0552 zmol/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 7%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 7 shows an average reference curve obtained from 18 separate experiments for the measurement of B cell lymphomal leukemia-2 gene (Bcl-2) transcripts using a Bcl-2-specific Polynukleotidsystems containing a set of calibrated standard DNA (138,000; 13,800; 6,900; 2,760; 1,380; 0.690; 0.276 and 0.0552 zmol / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y-axis (intercept) based on the mean was <7% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 8 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 17 separaten Experimenten für die Messung von B cell leukemia/lymphoma X gene, long form (Bcl-xL)- Transkripten unter Nutzung eines Bcl-xL-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (162,500; 65,000; 16,250; 6,500; 3,250; 1,625; 0,325 und 0,065 zmol/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 5%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. . Transcripts using a Bcl-x L, a set -specific Polynukleotidsystems containing calibrated standard - Figure 8 is an average reference curve obtained from 17 separate experiments for the measurement of B cell leukemia / lymphoma X gene, long form (Bcl-x L) shows -DNA (162,500; 65,000; 16,250; 6,500; 3,250; 1,625; 0.325 and 0.065 cmole / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y-axis (intercept) based on the mean was <5% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 9 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 22 separaten Experimenten für die Messung von humanen Murine double minute-2 (Mdm-2)-Transkripten unter Nutzung eines Mdm-2-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (412,193; 82,439; 41,219; 16,488; 4,122; 1,031; 0,4122 und 0,0824 zmol/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 11%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 9 is an average reference curve obtained from 22 separate experiments for the measurement of human Murine double a set showing minute-2 (Mdm-2) transcripts using a Mdm-2 specific Polynukleotidsystems containing calibrated standard DNA (412.193; 82.439 ; 41,219; 16,488; 4,122; 1,031; 0.4122 and 0.0824 zmol / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y axis (intercept) based on the mean was <11% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 10 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 6 separaten Experimenten für die Messung von humanen Murine double minute-2 (Mdm-2)-Transkripten, human splice variant B, unter Nutzung eines Mdm-2B-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (415,144; 83,0289; 41,514; 16,606; 4,151; 0,830; 0,415 und 0,083 zmol/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 3%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. FIG. 10 shows an average reference curve, obtained from 6 separate experiments for the measurement of human murine double minute-2 (Mdm-2) transcripts, human splice variant B, using an Mdm-2B-specific polynucleotide system containing a set of calibrated standards -DNA (415.144; 83.0289; 41.514; 16.606; 4.151; 0.830; 0.415 and 0.083 cmole / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y axis (intercept) based on the mean was <3% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 11 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 3 separaten Experimenten für die Messung von Multidrug resistance-associated protein (MRP)- Transkripten unter Nutzung eines MRP-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (1660,578; 415,144; 41,514; 8,303; 1,661; 0,415; 0,166 und 0,0415 zmol/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 2%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. . 415.144;; 41.514; a set of transcripts using an MRP-specific Polynukleotidsystems containing calibrated standard DNA (1660.578 - Figure 11 shows an average reference curve obtained from 3 separate experiments for the measurement of multidrug resistance-associated protein (MRP) 8.303; 1.661; 0.415; 0.166 and 0.0415 cmole / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y-axis (intercept) based on the mean was <2% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 12 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 3 separaten Experimenten für die Messung von humanen Cyclin D2-Transkripten unter Nutzung eines Cyclin D2-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (1.127,630; 112,763; 22,553; 11,276; 2,255; 1,128; 0,2553 und 0,0451 zmol/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 2%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. FIG. 12 shows an average reference curve obtained from 3 separate experiments for the measurement of human cyclin D2 transcripts using a cyclin D2-specific polynucleotide system containing a set of calibrated standard DNA (1,127,630; 112,763; 22,553; 11,276; 2,255; 1.128, 0.2553 and 0.0451 mmol / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y-axis (intercept) based on the mean was <2% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 13 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 7 separaten Experimenten für die Messung von Cytomegalovirus (CMV)-DNA (major immediate-early protein, IE) unter Nutzung eines CMV-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (1.000.000; 100.000; 10.000; 2.500; 1.000; 250; 50 und 10 Moleküle/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 4%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 13 is an average reference curve obtained from 7 separate experiments for the measurement of cytomegalovirus (CMV) DNA (major immediate-early protein, IE) using shows a CMV specific Polynukleotidsystems containing a set of calibrated standard DNA (1,000,000 ; 100,000; 10,000; 2,500; 1,000; 250; 50 and 10 molecules / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y axis (intercept) based on the mean was <4% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 14 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 4 separaten Experimenten für die Messung von Hepatitis B Virus (HBV)-DNA (surface antigen, HBsAg gene) unter Nutzung eines HBV-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (10.000.000; 1.000.000; 100.000; 10.000; 1.000; 100; 50 und 10 Moleküle/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 1%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 14 shows an average reference curve obtained from 4 separate experiments for the measurement of hepatitis B virus (HBV) DNA (surface antigen, HBsAg gene) using an HBV-specific Polynukleotidsystems containing a set of calibrated standard DNA (10,000,000 ; 1,000,000; 100,000; 10,000; 1,000; 100; 50 and 10 molecules / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y axis (intercept) based on the mean was <1% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 15 zeigt Referenzkurven für die Messung des prozentualen Anteils von Rindfleisch in einer analysierten Probe unter Nutzung eines Polynukleotidsystems zur Messung von Boviner mitochondrialer DNA (tRNAGlu/Cytochrom b Fusionsbereich) sowie eines Polynukleotidsystems zur Messung von mitochondrialer, 16S RNA codierender DNA enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (100; 50; 10; 1; 0,1% Rindanteil). A) Darstellung der Einzelkurven (Anteil boviner mt-DNA im Standard und Gesamt-Fleischanteil [16S] im Standard). B) Darstellung der Einzelkurven unter A) nach der ΔΔCT-Methode (CT Werte [bovin]-CT Werte 16S). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 13%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 15 shows reference curves for the measurement of the percentage of beef in a sample analyzed using a Polynukleotidsystems for measurement of bovine mitochondrial DNA (tRNA Glu / cytochrome b fusion region) as well as a Polynukleotidsystems for measuring mitochondrial, 16S RNA encoding DNA containing a set calibrated standard DNA (100; 50; 10; 1; 0.1% bovine content). A) Representation of the individual curves (proportion of bovine mt-DNA in the standard and total meat proportion [16S] in the standard). B) Representation of the individual curves under A) according to the ΔΔC T method (C T values [bovin] -C T values 16S). The variance of the individual values for the increase (β) based on the mean was on average <13%. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 16 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 2 separaten Experimenten für die Messung von humanen Tyrosinase-Transkripten unter Nutzung eines Tyrosinase-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-DNA (105; 104; 2,5 × 103; 5 × 102; 102; 5 × 101; 2,5 × 101 und 5 Moleküle/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 12%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 100%. Fig. 16 shows an average reference curve obtained from 2 separate experiments for the measurement of human tyrosinase transcripts using a tyrosinase-specific Polynukleotidsystems containing a set of calibrated Standard DNA (10 5, 10 4, 2.5 × 10 3; 5 × 10 2 ; 10 2 ; 5 × 10 1 ; 2.5 × 10 1 and 5 molecules / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y axis (intercept) based on the mean was <12% on average. The correlation (R) of the data was 100% on average.
Fig. 17 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 3 separaten Experimenten für die Messung von Multidrug Resistance Gen 1 (Mdr-1)-Transkripten unter Nutzung eines Mdr-1-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-RNA (8.006.249; 800.625; 80.063; 16.012; 8.006; 1.601; 800; 160 Moleküle/Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 2%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 17 shows an average reference curve obtained from 3 separate experiments for the measurement of multidrug resistance gene 1 (MDR-1) transcripts using an MDR-1 specific Polynukleotidsystems containing a set of calibrated standard RNA (8006249; 800625 ; 80.063; 16.012; 8.006; 1.601; 800; 160 molecules / batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y-axis (intercept) based on the mean was <2% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 18 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 14 separaten Experimenten für die Messung von HCV-RNA unter Nutzung eines HCV-spezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter HCV Standard-RNA (107; 106; 105; 104 103; 102; 5 × 101 und 101 Moleküle pro Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert betrug durchschnittlich < 8%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 99%. Fig. 18 shows an average reference curve obtained from 14 separate experiments for the measurement of HCV-RNA using an HCV-specific Polynukleotidsystems containing a set of calibrated HCV Standard RNA (10 7 10 6 10 5 10 4 10 3; 10 2 ; 5 × 10 1 and 10 1 molecules per batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y-axis (intercept) based on the mean was <8% on average. The correlation (R) of the data was 99% on average.
Fig. 19 zeigt eine durchschnittliche Referenzkurve, erhalten aus 2 separaten
Experimenten für die Messung von Kanamycin-RNA unter Nutzung eines
Kanamycinspezifischen Polynukleotidsystems enthaltend ein Set kalibrierter Standard-RNA (107; 106;
105; 104; 103; 102; 5 × 101 und 101 Moleküle pro Ansatz). Die Varianz der Einzelwerte für den
Anstieg (β) sowie den Schnittpunkt mit der Y-Achse (Intercept) bezogen auf den Mittelwert
betrug durchschnittlich < 4%. Die Korrelation (R) der Daten betrug im Durchschnitt 100%.
Ausführungsbeispiele
Optimierte TaqMan™-Protokolle unter Nutzung der erfindungsgemäßen
Polynukleotidsysteme, Anwendung am ABI PRISM™ 7700 Sequence Detection System oder
GeneAmp™ 5700 Sequence Detection System
(1) optimiertes M-bcr-abl TaqMan™-Protokoll
(2) optimiertes bcr-abl (E1A2) TaqMan™-Protokoll
(3) optimiertes Survivin TaqMan™-Protokoll
(4) optimiertes GAPDH-TaqMan™-Protokoll
(5) optimiertes Bax TaqMan™-Protokoll
(6) optimiertes Bad TaqMan™-Protokoll
(7) optimiertes Bcl-2 TaqMan™-Protokoll
(8) optimiertes BclxL TaqMan™-Protokoll
(9) optimiertes Mdm-2 TaqMan™-Protokoll
(10) optimiertes Mdm-2B TaqMan™-Protokoll
(11) optimiertes MRP TaqMan™-Protokoll
(12) optimiertes CycD2 TaqMan™-Protokoll
(13) optimiertes TaqMan™ CMV-Protokoll
(14) optimiertes TaqMan™ HBV-Protokoll
(15) optimiertes Bovin mitochondriale tRNAGlu/Cytochrom b TaqMan™-Protokoll
(16) optimiertes 16S-TaqMan™ Protokoll
(17) optimiertes Tyrosinase-TaqMan™ Protokoll
(18) optimiertes Mdr-1 rTth-TaqMan™-Protokoll
(19) optimiertes HCV rTth-TaqMan™ Protokoll
(20) optimiertes Kanamycin TaqMan™-Protokoll
Literatur
1. Zimmermann, K. & Mannhalter, J. W. Biotechniques 21, 268-269 (1996).
2. Köhler, T. Lassner, D. Rost, A. K. Thamm, B. Pustowoit, B. & Remke, H. Quantitation
of mRNA by polymerase chain reaction - Nonradioactive PCR methods
(Springer-Verlag, Heidelberg, 1995).
3. Chen, X., Livak, K. J. & Kwok, P. Y. Genome Res. 8, 549-556 (1998).
4. Landegren, U., Nilsson, M. & Kwok, P. Y. Genome Res. 8, 769-776 (1998).
5. Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R. & Gelfand, D. H.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88, 7276-7280 (1991).
6. Didenko, V. V. Biotechniques 31, 1106-1 (2001).
7. Kwiatkowski, R. W., Lyamichev, V., de Arruda, M. & Neri, B. Mol.Diagn. 4, 353-364
(1999).
8. Cooksey, R. C., Holloway, B. P., Oldenburg, M. C., Listenbee, S. & Miller, C. W.
Antimicrob.Agents Chemother. 44, 1296-1301 (2000).
9. Köhler, T., Lerche, D., Meye, A., Weisbrich, C. & Wagner, O. J. Lab.Med. 23, 408-414
(1999).
10. Taubert, H., Köhler, T., Meye, A., et al. Mol.Med 6, 50-59 (2000).
11. Kappler, M., Kohler, T., Kampf, C., et al. Int.J. Cancer 95, 360-363 (2001).
12. Grassi, G., Zentilin, L., Tafuro, S., et al. Nucleic.Acids.Res. 22, 4547-4549 (1994).
13. Köhler, T., Rost, A. K. & Remke, H. Biotechniques 23, 722-726 (1997).
14. Köhler, T., Schill, C., Deininger, M. W., et al. Leukemia 16, 22-29 (2002).
15. Lange, T., Deininger, M. W., Köhler, T., et al. Bone Marrow Transplant. 25, S29-S29
(2000).
16. Würl, P., Kappier, M., Meye, A., et al. Lancet (2002), in press.
Abkürzungsverzeichnis
PCR Polymerasekettenreaktion
iPCR Immuno-PCR
DNA Desoxyribonukleinsäure
RNA Ribonukleinsäure
FRET Fluorescence resonance energy transfer
DOL Dyelabeled oligonucleotide ligation
FAM 6-Carboxyfluorescein
JOE 2,7-Dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein
HEX Hexachloro-6-carboxyfluorescein
TAMRA 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin
DABCYL 4-(4'-Dimethylaminophenylazo) benzoesäure
tRNA Transport-RNA
GAPDH Glutaraldehydphosphat Dehydrogenase
bcr breakpoint cluster region (Chromosom 22)
abl Abelson murine leukemia virus-Protoonkogen (Chromosom 9)
Bax Bcl-2 associated X protein
Bad Bcl-2 antagonist of cell death
Bcl-2 B cell lymphomal leukemia-2 gene
Bcl-xL B cell leukemia/lymphoma X gene, long form
Mdm-2 Murine double minute-2
MRP Multidrug resistance-associated protein
CMV Cytomegalovirus
IE major immediate-early protein
HBV Hepatitis B Virus
Mdr-1 Multidrug Resistance Gen 1
ROX 6-Carboxy-X-rhodamin
dATP 2'-Deoxyadenosin-5'-triphosphat
dCTP 2'-Deoxycytidin-5'-triphosphat
dGTP 2'-Deoxyguanosin-5'-triphosphat
dUTP 2'-Desxyuridin-5'-triphosphat
FIG. 19 is an average reference curve obtained from 2 separate experiments for the measurement of Kanamycin RNA using shows a Kanamycinspezifischen Polynukleotidsystems containing a set of calibrated standard RNA (10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 ; 5 × 10 1 and 10 1 molecules per batch). The variance of the individual values for the increase (β) and the intersection with the Y axis (intercept) based on the mean was <4% on average. The correlation (R) of the data was 100% on average. Exemplary embodiments Optimized TaqMan ™ protocols using the polynucleotide systems according to the invention, application to the ABI PRISM ™ 7700 Sequence Detection System or GeneAmp ™ 5700 Sequence Detection System (1) optimized M-bcr-abl TaqMan ™ protocol
(2) optimized bcr-abl (E1A2) TaqMan ™ protocol
(3) optimized Survivin TaqMan ™ protocol
(4) optimized GAPDH-TaqMan ™ protocol
(5) optimized Bax TaqMan ™ protocol
(6) optimized Bad TaqMan ™ protocol
(7) optimized Bcl-2 TaqMan ™ protocol
(8) optimized Bclx L TaqMan ™ protocol
(9) optimized Mdm-2 TaqMan ™ protocol
(10) optimized Mdm-2B TaqMan ™ protocol
(11) optimized MRP TaqMan ™ protocol
(12) optimized CycD2 TaqMan ™ protocol
(13) optimized TaqMan ™ CMV protocol
(14) optimized TaqMan ™ HBV protocol
(15) optimized Bovin mitochondrial tRNA Glu / Cytochrome b TaqMan ™ protocol
(16) optimized 16S-TaqMan ™ protocol
(17) optimized Tyrosinase-TaqMan ™ protocol
(18) optimized Mdr-1 rTth-TaqMan ™ protocol
(19) optimized HCV rTth-TaqMan ™ protocol
(20) optimized Kanamycin TaqMan ™ protocol
Literature 1. Zimmermann, K. & Mannhalter, JW Biotechniques 21, 268-269 (1996).
2. Koehler, T. Lassner, D. Rost, AK Thamm, B. Pustowoit, B. & Remke, H. Quantitation of mRNA by polymerase chain reaction - Nonradioactive PCR methods (Springer-Verlag, Heidelberg, 1995).
3. Chen, X., Livak, KJ & Kwok, PY Genome Res. 8, 549-556 (1998).
4. Landegren, U., Nilsson, M. & Kwok, PY Genome Res. 8, 769-776 (1998).
5. Holland, PM, Abramson, RD, Watson, R. & Gelfand, DH Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88, 7276-7280 (1991).
6. Didenko, VV Biotechniques 31, 1106-1 (2001).
7. Kwiatkowski, RW, Lyamichev, V., de Arruda, M. & Neri, B. Mol.Diagn. 4, 353-364 (1999).
8. Cooksey, RC, Holloway, BP, Oldenburg, MC, Listenbee, S. & Miller, CW Antimicrob.Agents Chemother. 44, 1296-1301 (2000).
9. Köhler, T., Lerche, D., Meye, A., Weisbrich, C. & Wagner, OJ Lab.Med. 23: 408-414 (1999).
10. Taubert, H., Köhler, T., Meye, A., et al. Mol. Med 6, 50-59 (2000).
11. Kappler, M., Kohler, T., Kampf, C., et al. Int Cancer 95, 360-363 (2001).
12. Grassi, G., Zentilin, L., Tafuro, S., et al. Nucleic.Acids.Res. 22, 4547-4549 (1994).
13. Koehler, T., Rost, AK & Remke, H. Biotechniques 23, 722-726 (1997).
14. Koehler, T., Schill, C., Deininger, MW, et al. Leukemia 16, 22-29 (2002).
15. Lange, T., Deininger, MW, Köhler, T., et al. Bone marrow transplant. 25, S29-S29 (2000).
16. Würl, P., Kappier, M., Meye, A., et al. Lancet (2002), in press. List of abbreviations PCR polymerase chain reaction
iPCR immuno-PCR
DNA deoxyribonucleic acid
RNA ribonucleic acid
FRET fluorescence resonance energy transfer
DOL Dyelabeled oligonucleotide ligation
FAM 6 carboxyfluorescein
JOE 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein
HEX Hexachloro-6-carboxyfluorescein
TAMRA 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine
DABCYL 4- (4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid
tRNA transport RNA
GAPDH glutaraldehyde phosphate dehydrogenase
bcr breakpoint cluster region (chromosome 22)
abl Abelson murine leukemia virus proto-oncogene (chromosome 9)
Bax Bcl-2 associated X protein
Bad Bcl-2 antagonist of cell death
Bcl-2 B cell lymphomal leukemia-2 genes
Bcl-x L B cell leukemia / lymphoma X gene, long form
Mdm-2 Murine double minute-2
MRP multidrug resistance-associated protein
CMV cytomegalovirus
IE major immediate-early protein
HBV hepatitis B virus
Mdr-1 Multidrug Resistance Gen 1
ROX 6-carboxy-X-rhodamine
dATP 2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate
dCTP 2'-deoxycytidine 5'-triphosphate
dGTP 2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate
dUTP 2'-desxyuridine-5'-triphosphate
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1806416A2 (en) * | 2003-03-07 | 2007-07-11 | Université de la Méditerranée | Standardized and optimized real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction method for detection of MRD in leukemia |
CN112029830A (en) * | 2020-09-16 | 2020-12-04 | 上海上药第一生化药业有限公司 | Method for improving sensitivity of PCR (polymerase chain reaction) for identifying pig, cattle and sheep derived components in protein biochemical raw material crude product |
US11920129B2 (en) | 2017-10-25 | 2024-03-05 | National University Of Singapore | Ligation and/or assembly of nucleic acid molecules |
-
2002
- 2002-02-28 DE DE2002109071 patent/DE10209071A1/en not_active Withdrawn
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1806416A2 (en) * | 2003-03-07 | 2007-07-11 | Université de la Méditerranée | Standardized and optimized real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction method for detection of MRD in leukemia |
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CN112029830A (en) * | 2020-09-16 | 2020-12-04 | 上海上药第一生化药业有限公司 | Method for improving sensitivity of PCR (polymerase chain reaction) for identifying pig, cattle and sheep derived components in protein biochemical raw material crude product |
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OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: AJ ROBOSCREEN GMBH, 04129 LEIPZIG, DE |
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R119 | Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee |
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