DE102019215029A1

DE102019215029A1 - Filter sequence, syringe attachment and method for separating particles from a body fluid

Info

Publication number: DE102019215029A1
Application number: DE102019215029.2A
Authority: DE
Inventors: Tanja Maucher; Franz Laermer; Stefanie Fischer; Eva Hoch
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2021-04-01

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Filterabfolge (100) zur Separierung von Partikeln aus einer Körperflüssigkeit, insbesondere zur Separierung von zellulären Bestandteilen, mindestens aufweisend eine erste Filterschicht (110) und eine zweite Filterschicht (120), wobei die erste Filterschicht (110) größere Partikel als die zweite Filterschicht (120) passieren lässt. Ferner betrifft die Erfindung einen Spritzenaufsatz (200), eine Spritze (300) sowie eine mikrofluidische Vorrichtung mit einer Filterabfolge (100) und ein Verfahren (600) zur Separierung von Partikeln aus einer Körperflüssigkeit mit einer Filterabfolge (100).The invention relates to a filter sequence (100) for separating particles from a body fluid, in particular for separating cellular components, at least comprising a first filter layer (110) and a second filter layer (120), the first filter layer (110) being larger than the particles second filter layer (120) can pass. The invention also relates to a syringe attachment (200), a syringe (300) and a microfluidic device with a filter sequence (100) and a method (600) for separating particles from a body fluid with a filter sequence (100).

Description

Stand der TechnikState of the art

Mikrofluidische Vorrichtungen, insbesondere als Lab-on-Chip-Lösungen (kurz „LoC“) bezeichnete teil- oder vollautomatisierte Vorrichtungen, werden häufig zur Prozessierung von Körperflüssigkeiten oder -proben wie beispielsweise Blut oder Schleimhautabstriche eingesetzt. Häufig werden die Proben in sogenannten Transportmedien, wie beispielsweise Amies, aufgenommen und daraus analysiert. Dabei können Bestandteile der Körperflüssigkeiten, insbesondere Nukleinsäuren, zum Nachweis von Infektionen und Krankheiten untersucht werden, was regelmäßig zunächst eine Abtrennung dieser Bestandteile, beispielsweise Zellen oder zellfreie Nukleinsäuren, aus einer Probe einer Körperflüssigkeit erfordert. Im Falle einer Blutprobe ist es beispielsweise besonders herausfordernd, direkt in der Lab-on-Chip-Vorrichtung Blutplasma für eine Analyse von darin befindlichen zellfreien Nukleinsäuren von den restlichen Blutbestandteilen, insbesondere den roten und weißen Blutkörperchen, zu trennen.Microfluidic devices, in particular partially or fully automated devices referred to as lab-on-chip solutions (“LoC” for short), are often used to process body fluids or samples such as blood or mucous membrane swabs. The samples are often taken up in so-called transport media, such as Amies, and analyzed from them. Components of the body fluids, in particular nucleic acids, can be examined for the detection of infections and diseases, which regularly first requires a separation of these components, for example cells or cell-free nucleic acids, from a sample of a body fluid. In the case of a blood sample, for example, it is particularly challenging to separate blood plasma from the remaining blood components, in particular the red and white blood cells, directly in the lab-on-chip device for an analysis of cell-free nucleic acids contained therein.

Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention

Vorteile der ErfindungAdvantages of the invention

Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung eine Filterabfolge zur Separierung von Partikeln aus einer Körperflüssigkeit. Die Filterabfolge umfasst mindestens eine erste Filterschicht und eine zweite Filterschicht, wobei die erste Filterschicht größere Partikel als die zweite Filterschicht passieren lässt. Mit anderen Worten ist eine Mindestgröße von Partikeln, die von der ersten Filterschicht zurückgehalten werden, größer als eine Mindestgröße von Partikeln, die von der zweiten Filterschicht zurückgehalten werden.Against this background, the invention relates to a filter sequence for separating particles from a body fluid. The filter sequence comprises at least a first filter layer and a second filter layer, the first filter layer allowing larger particles to pass through than the second filter layer. In other words, a minimum size of particles that are retained by the first filter layer is larger than a minimum size of particles that are retained by the second filter layer.

Unter einer Filterabfolge ist insbesondere eine gestapelte Anordnung von Schichten von Filtern zu verstehen, also ein Filterstapel oder Filterstack. Bei der Körperflüssigkeit kann es sich um eine Flüssigkeit aus einem menschlichen oder tierischen Körper handeln, beispielsweise um Blut, Sputum, Urin, einen Abstrich oder eine Mischung derselben mit einem kommerziellen Transportmedium wie beispielsweise Amies-Medium. Bei den Partikeln kann es sich insbesondere um feste Bestandteil in der Körperflüssigkeit handeln, beispielsweise zelluläre Bestandteile wie rote oder weiße Blutkörperchen oder Blutplättchen, aber auch andere Körperzellen, Mikroorganismen oder Fremdkörper, insbesondere Pathogene oder wie beispielsweise Bakterien oder Viren oder andere Mikroorganismen.A filter sequence is to be understood in particular as a stacked arrangement of layers of filters, that is to say a filter stack or filter stack. The body fluid can be a fluid from a human or animal body, for example blood, sputum, urine, a swab or a mixture thereof with a commercial transport medium such as Amies medium. The particles can in particular be solid constituents in the body fluid, for example cellular constituents such as red or white blood cells or platelets, but also other body cells, microorganisms or foreign bodies, in particular pathogens or such as bacteria or viruses or other microorganisms.

Die erfindungsgemäße Filterabfolge kann vorteilhafterweise zur Abtrennung oder Filterung von Flüssigkeiten mit unterschiedlich großen Bestandteilen, insbesondere unterschiedlich großen Partikeln, verwendet werden, beispielsweise zur Separierung von zellulären Bestandteilen aus Blut. Bevorzugt weisen die Filterschichten dazu unterschiedlich große Durchgangsöffnungen, insbesondere unterschiedlich große Poren oder unterschiedlich große Abstände im Filtermaterial auf, insbesondere im Falle von aus Gewebe aufgebauten Filtern oder Fritten. Unter Poren sind dabei insbesondere allgemein Durchgangsöffnungen durch eine Filterschicht zu verstehen, beispielsweise in Form von Löchern und/oder Kanälen durch die Filterschicht. Dadurch, dass die erste Filterschicht größere Partikel als die zweite Filterschicht passieren lässt, erfolgt die Filterung vorteilhafterweise stufenweise, indem die größten Partikel durch die erste Schicht und vergleichsweise kleinere Partikel durch die zweite Schicht zurückgehalten werden. Dies erlaubt vorteilhafterweise nicht nur eine Ausfilterung dieser Partikel, sondern auch bereits eine zumindest grobe Größentrennung der Partikel für eine nachfolgende Weiterverarbeitung. Ferner hat die erfindungsgemäße Filterabfolge den Vorteil, dass aufgrund der stufenweisen Filterung die Gefahr einer frühzeitigen Verstopfung des Filters deutlich reduziert wird. Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Filterabfolge liegt daher ferner darin, dass die Filterabfolge in einer Lab-on-Chip-Vorrichtung in einfacher Weise statt üblicherweise in Form von einlagigen Glasfritten ausgebildeten Filtern eingesetzt werden kann. Letztere verstopfen leicht und werden dadurch in Verbindung mit schwieriger zu verarbeitenden Probenmaterialien wie insbesondere Vollblut schnell unbrauchbar. Gegenstand der Erfindung ist somit auch eine mikrofluidische Vorrichtung, insbesondere eine Lab-on-Chip-Vorrichtung, mit einer erfindungsgemäßen Filterabfolge.The filter sequence according to the invention can advantageously be used to separate or filter liquids with components of different sizes, in particular particles of different sizes, for example to separate cellular components from blood. For this purpose, the filter layers preferably have through openings of different sizes, in particular pores of different sizes or distances of different sizes in the filter material, in particular in the case of filters or frits made of fabric. In this context, pores are to be understood in particular in general as through openings through a filter layer, for example in the form of holes and / or channels through the filter layer. Because the first filter layer allows larger particles to pass through than the second filter layer, the filtering is advantageously carried out in stages, in that the largest particles are retained by the first layer and comparatively smaller particles by the second layer. This advantageously not only allows these particles to be filtered out, but also at least a rough size separation of the particles for subsequent further processing. Furthermore, the filter sequence according to the invention has the advantage that the risk of premature clogging of the filter is significantly reduced due to the step-by-step filtering. A particular advantage of the filter sequence according to the invention is therefore that the filter sequence can be used in a lab-on-chip device in a simple manner instead of filters usually designed in the form of single-layer glass frits. The latter clog easily and quickly become unusable in connection with sample materials that are more difficult to process, such as whole blood in particular. The invention therefore also relates to a microfluidic device, in particular a lab-on-chip device, with a filter sequence according to the invention.

Die erfindungsgemäße Filterabfolge ermöglicht somit, bei entsprechender Anpassung der Durchgangsöffnungen, vorteilhafterweise ein Abtrennen von Material definierter Mindestgröße vom Rest einer Probe, beispielsweise zelluläres Material aus einer Vollblutprobe unter Extraktion von zellfreiem Blutplasma mit darin enthaltenen Nukleinsäuren, Exosomen und Proteinen. Dies kann vorteilhafterweise für eine nachfolgende sogenannte „liquid biopsy“ eingesetzt werden, um aus zirkulierender DNA/RNA/Nukleinsäuren/gelösten Proteinen Rückschlüsse auf eine (Krebs-) Erkrankung, auf Tumormutationen oder andere im Körper vorhandene Mutationen, genetische translationale Defekte und damit Therapie-relevante Informationen gewinnen zu können. Alternativ kann es für die Aufkonzentration von Zellen, beispielsweise von in einer Probe enthaltenen Mikroorganismen genutzt werden.The filter sequence according to the invention thus advantageously enables material of a defined minimum size to be separated from the rest of a sample, for example cellular material from a whole blood sample with the extraction of cell-free blood plasma with nucleic acids, exosomes and proteins contained therein, with appropriate adjustment of the passage openings. This can advantageously be used for a subsequent so-called "liquid biopsy" in order to draw conclusions from circulating DNA / RNA / nucleic acids / dissolved proteins about a (cancer) disease, about tumor mutations or other mutations present in the body, genetic translational defects and thus therapy- to be able to obtain relevant information. Alternatively, it can be used to concentrate cells, for example microorganisms contained in a sample.

Geeignete Filtermaterialien für die Filterschichten können beispielsweise Teflonmaterialien (PTFE), Polyvinyldifluoriden (PVDF), Polypropylen, Polyethylen, Polystyrole, Polysulfone, Glasfaser, Polyether, Zelluloseacetat, Zellulosenitrat und jeweils entsprechende Gewebe sein. Diese haben den Vorteil, dass sie unter geeigneten (insbesondere antichaotropen) Pufferbedingungen keine chemischen oder physikalischen Bindungseigenschaften gegenüber Nukleinsäuren oder Proteinen aufweisen, somit also gegenüber Nukleinsäuren oder Proteinen zumindest weitgehend inert sind. Einige der angeführten Filtermaterialien weisen insbesondere keine polaren funktionalen Gruppen auf, an die sich Nukleinsäuren binden können und sind somit unter allen Pufferbedingungen inert.Suitable filter materials for the filter layers can, for example, Teflon materials (PTFE), polyvinyl difluorides (PVDF), polypropylene, Polyethylene, polystyrenes, polysulfones, fiberglass, polyether, cellulose acetate, cellulose nitrate and respective fabrics. These have the advantage that, under suitable (in particular anti-chaotropic) buffer conditions, they have no chemical or physical binding properties with respect to nucleic acids or proteins, so that they are at least largely inert with respect to nucleic acids or proteins. In particular, some of the filter materials listed do not have any polar functional groups to which nucleic acids can bind and are therefore inert under all buffer conditions.

In vorteilhaften Ausgestaltungen der Erfindung kann die Filterfolge noch eine dritte Filterschicht oder auch noch eine vierte Filterschicht oder noch weitere Filterschichten aufweisen. Dies hat den Vorteil, dass die Filtrierung nach zurückgehaltenen Partikelgrößen gestreckt und damit verfeinert werden kann und gleichzeitig das Risiko der Verstopfung weiter sinkt. Vorzugsweise sind dabei eine oder mehrere oder alle der Filterschichten ausgebildet, Partikel unterschiedlicher Mindestgröße zurückzuhalten, was eine Trennung der Partikel gemäß dem entsprechenden örtlichen Größenspektrum erlaubt.In advantageous refinements of the invention, the filter sequence can also have a third filter layer or also a fourth filter layer or even further filter layers. This has the advantage that the filtration can be stretched and thus refined according to the particle sizes retained, and at the same time the risk of clogging is further reduced. One or more or all of the filter layers are preferably designed to hold back particles of different minimum sizes, which allows the particles to be separated according to the corresponding local size spectrum.

In einer besonders bevorzugten Weiterbildung der Erfindung sind die Filterschichten und insbesondere Durchgangsöffnungen, beispielsweise Poren, der Filterschichten der Filterabfolge so ausgebildet, dass die Filterabfolge sukzessive oder schrittweise kleinere Partikel an den Filterschichten zurückhält. Dies unterstützt vorteilhafterweise die oben beschriebene stufenweise Filterung von Partikeln in abnehmender Größe. Vorzugsweise sind die Filterschichten derart zueinander in der Filterabfolge angeordnet, dass entlang der Anordnung der Schichten die Mindestgröße der zurückhaltbaren Partikel sinkt. Dabei kann die Filterabfolge zwischen Filterschichten mit sukzessiv kleineren Durchgangsöffnungen auch Filterschichten mit vergleichsweise größeren oder gleich großen Durchgangsöffnungen aufweisen, sofern insgesamt entlang der Filterabfolge eine, insbesondere tendenzielle, Verkleinerung der Durchgangsöffnungen vorliegt. Mit anderen Worten muss nicht jede Filterschicht in der Filterabfolge so ausgebildet sein, dass sie Partikeln mit kleinerer Mindestgröße als eine jeweils davor angrenzende Filterschicht zurückhält. Es ist in dieser Weiterbildung ausreichend, wenn eine örtlich danach angeordnete Filterschicht ausgebildet ist, dass sie Partikeln mit kleinerer Mindestgröße als diese davor angrenzende Filterschicht zurückhält. Solch eine Anordnung von zwischendurch wieder größeren oder gleich großen Durchgangsöffnungen kann vorteilhafterweise zu einer weiteren Verringerung der Gefahr einer Verstopfung beitragen, da eventuell von vorherigen Schichten noch nicht gefilterte größere Partikel durch diese weiteren Schichten mit größeren Durchgangsöffnungen aufgefangen werden können. In einer bevorzugten Ausgestaltung weist die Filterabfolge sukzessiv feinere Filter auf, beispielsweise durch sukzessiv kleinere Durchgangsöffnungen oder Poren entlang der Abfolge der Filterschichten, so dass die Filterabfolge eine Abfolge von grobporigen zu immer feinporigeren Filterschichten oder Filtermatten umfasst.In a particularly preferred further development of the invention, the filter layers and in particular through openings, for example pores, of the filter layers of the filter sequence are designed in such a way that the filter sequence successively or step-by-step retains smaller particles on the filter layers. This advantageously supports the above-described step-by-step filtering of particles in decreasing size. The filter layers are preferably arranged in relation to one another in the filter sequence in such a way that the minimum size of the particles that can be retained decreases along the arrangement of the layers. The filter sequence between filter layers with successively smaller through openings can also have filter layers with comparatively larger or equally large through openings, provided that there is an overall, in particular tendency, reduction in size of the through openings along the filter sequence. In other words, it is not necessary for each filter layer in the filter sequence to be designed in such a way that it retains particles with a smaller minimum size than a respective filter layer adjoining it. In this further development, it is sufficient if a filter layer arranged locally thereafter is formed so that it retains particles with a smaller minimum size than this filter layer adjoining in front of it. Such an arrangement of through openings that are again larger or of the same size in between can advantageously contribute to a further reduction in the risk of clogging, since larger particles possibly not yet filtered by previous layers can be captured by these further layers with larger through openings. In a preferred embodiment, the filter sequence has successively finer filters, for example through successively smaller through openings or pores along the sequence of filter layers, so that the filter sequence comprises a sequence from coarse-pored to increasingly fine-pored filter layers or filter mats.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind eine oder mehrere der Filterschichten als Volumenfilter ausgebildet. Unter einem Volumenfilter ist dabei ein Filter zu verstehen, welcher Partikel nicht an seiner Oberfläche, sondern in seinem Inneren zurückhält. Beispielsweise können Volumenfilter als Gewebefilter insbesondere Gewebe oder Fritten wie zum Beispiel Glaswolle, Borsilikatglaswolle oder Baumwolle aufweisen. Die Verwendung von Volumenfiltern hat den Vorteil, dass die Gefahr einer Verstopfung aufgrund der Verteilung der Partikel im Inneren des Filters dank der Größe und Aufnahmefähigkeit des inneren Volumens reduziert ist, insbesondere gegenüber einem ebenen Filter, welcher Partikel durch ausreichend kleine Löcher nur an seiner Oberfläche zurückhält.According to a preferred embodiment of the invention, one or more of the filter layers are designed as volume filters. A volume filter is to be understood as a filter which does not retain particles on its surface but in its interior. For example, volume filters as fabric filters can in particular have fabrics or frits such as glass wool, borosilicate glass wool or cotton. The use of volume filters has the advantage that the risk of clogging due to the distribution of the particles inside the filter is reduced thanks to the size and capacity of the inner volume, especially compared to a flat filter which only retains particles on its surface through sufficiently small holes .

In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung weist die Filterabfolge eine Sterilfilterschicht auf, bevorzugt als letzte Filterschicht zur Abtrennung von Partikeln mit der vergleichsweise geringsten Mindestgröße. Unter einer Sterilfilterschicht ist dabei ein Filter zu verstehen, welcher, insbesondere für eine vorgegebene Körperflüssigkeit, keine menschlichen und/oder tierischen Zellen und/oder Mikroorganismen passieren lässt. Eine solche Filterschicht umfasst beispielsweise eine Membran aus beispielsweise extrudiertem und dadurch porös gemachten Teflon® (PTFE), PES, Nylon oder besonders bevorzugt Zelluloseacetat mit Durchgangsöffnungen oder Löchern im Durchmesserbereich von einigen 10 Nanometern bis einigen 100 Nanometern. Bevorzugt handelt es sich bei dem Sterilfilter um einen Sterilfilter für Blut zur Separation von Blutplasma mit den darin gelösten Nukleinsäuren, Proteinen und Salzen von zellulären Blutbestandteilen. Aufgrund der Filterabfolge und der damit bewirkten Vorfilterung durch die anderen Filterschichten kann ein Sterilfilter vorteilhafterweise eingesetzt werden, ohne durch ebensolche zellulären Blutbestandteile zu verstopfen. Das Ergebnis ist dann ein „sauberes“ Blutplasma, das für eine molekulare Diagnostik weiterverwendet werden kann. In einer besonders bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist eine der Filterschichten, insbesondere die Sterilfilterschicht, ausgebildet, Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, insbesondere Staphylococcus aureus-Bakterien, aus Körperflüssigkeiten und/oder Transportmedien, wie zum Beispiel Amies-Medium, zurückzuhalten. Dies hat den Vorteil, dass diese Bakterien auf einfache Weise aus der Körperflüssigkeit beziehungsweise dem Transportmedium für eine weitere molekularbiologische Verarbeitung isoliert werden können. Eine Ausfilterung von Staphylococcus aureus-Bakterien hat ferner den Vorteil, dass diese potentiell methicillin-resistenten Bakterien, „MRSA“ genannt, für eine Untersuchung auf eine solche Resistenz in einfacher Weise aufbereitet werden können.In a particularly advantageous development of the invention, the filter sequence has a sterile filter layer, preferably as the last filter layer for separating particles with the comparatively smallest minimum size. A sterile filter layer is to be understood as a filter which, in particular for a given body fluid, does not allow any human and / or animal cells and / or microorganisms to pass through. Such a filter layer comprises, for example, a membrane made of, for example, extruded and thereby made porous Teflon® (PTFE), PES, nylon or particularly preferably cellulose acetate with through openings or holes in the diameter range from a few 10 nanometers to a few 100 nanometers. The sterile filter is preferably a sterile filter for blood for the separation of blood plasma with the nucleic acids, proteins and salts of cellular blood components dissolved therein. Due to the filter sequence and the resulting pre-filtering by the other filter layers, a sterile filter can advantageously be used without being clogged by such cellular blood components. The result is then a “clean” blood plasma that can be used for molecular diagnostics. In a particularly preferred development of the invention, one of the filter layers, in particular the sterile filter layer, is designed to hold back microorganisms, in particular bacteria, in particular Staphylococcus aureus bacteria, from body fluids and / or transport media, such as Amies medium. This has the advantage that these bacteria are easily removed from the body fluid or the transport medium for another molecular biological processing can be isolated. Filtering out Staphylococcus aureus bacteria also has the advantage that these potentially methicillin-resistant bacteria, called “MRSA”, can be processed in a simple manner for an examination of such resistance.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist eine der Filterschichten zur Zurückhaltung von roten Blutkörperchen ausgebildet. Da es sich bei Erythrozyten um vergleichsweise große Partikel im Blut handelt, kann vorzugsweise eine der ersten Filterschichten, insbesondere die erste Filterschicht ausgebildet sein, rote Blutkörperchen zurückzuhalten vorteilhafterweise ohne dabei zu verstopfen.In a further advantageous embodiment of the invention, one of the filter layers is designed to hold back red blood cells. Since erythrocytes are comparatively large particles in the blood, one of the first filter layers, in particular the first filter layer, can preferably be designed to hold back red blood cells, advantageously without clogging.

Die Filterabfolge kann in einer vorteilhaften Ausgestaltung von einem Filtergehäuse umgeben sein, wobei das Filtergehäuse vorzugsweise aus Kunststoff gefertigt ist. Dies ermöglicht vorteilhafterweise eine fluiddichte Abschirmung der Filterabfolge.In an advantageous embodiment, the filter sequence can be surrounded by a filter housing, the filter housing preferably being made of plastic. This advantageously enables a fluid-tight shielding of the filter sequence.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Spritzenaufsatz, welcher eine erfindungsgemäße Filterabfolge aufweist. Unter einem Spritzenaufsatz ist ein mit einer Spritze verbindbares Teil zu verstehen, insbesondere ein mit dem Ausgang oder der Spitze der Spritze verbindbares Teil. Der Spritzenaufsatz ist dabei vorzugsweise lösbar mit der Spritze verbindbar, was den Vorteil eines modularen Aufbaus mit einem schnellen Wechsel, insbesondere bei Einwegteilen, mit sich bringt. Der Spritzenaufsatz hat den Vorteil, dass eine Probe der Körperflüssigkeit mit Hilfe der Spritzenfunktionalität durch die Filterabfolge gedrückt werden kann. Durch den damit erzielbaren hohen Druck ist eine besonders effektive Filterung mit der Filterabfolge möglich. Gegenstand der Erfindung ist damit auch eine Spritze umfassend einen erfindungsgemäßen Spritzenaufsatz.The invention also relates to a syringe attachment which has a filter sequence according to the invention. A syringe attachment is to be understood as meaning a part that can be connected to a syringe, in particular a part that can be connected to the outlet or the tip of the syringe. The syringe attachment is preferably releasably connectable to the syringe, which has the advantage of a modular structure with a quick change, especially in the case of disposable parts. The syringe attachment has the advantage that a sample of the body fluid can be pressed through the filter sequence with the aid of the syringe functionality. The high pressure that can be achieved in this way enables particularly effective filtering with the filter sequence. The invention thus also relates to a syringe comprising a syringe attachment according to the invention.

Der erfindungsgemäße Spritzenaufsatz ist besonders vorteilhaft im Zusammenhang mit Lab-on-chip-Vorrichtungen einsetzbar. Eine alternativ mögliche Filterung direkt in der Lab-on-Chip-Vorrichtung führt nämlich aufgrund der in der Vorrichtung häufig nur begrenzt möglichen Drücke bis 1,5 bar und der für Filter begrenzten Fläche und begrenzten Volumina oftmals zu Verstopfungen, so dass bisher insbesondere Vollblut extern aufwändig vorgefiltert beziehungsweise zentrifugiert werden muss. Der erfindungsgemäße Spritzenaufsatz stellt hingegen eine effektive und einfache Vorrichtung zur Übertragung von gefilterten Körperflüssigkeiten, insbesondere von Blutplasma, in eine Lab-on-Chip-Vorrichtung dar.The syringe attachment according to the invention can be used particularly advantageously in connection with lab-on-chip devices. An alternative possible filtering directly in the lab-on-chip device namely often leads to blockages due to the pressures of up to 1.5 bar that are often only possible in the device and the limited area and limited volumes for filters, so that whole blood in particular has hitherto been external laboriously pre-filtered or centrifuged. The syringe attachment according to the invention, on the other hand, represents an effective and simple device for transferring filtered body fluids, in particular blood plasma, into a lab-on-chip device.

Bevorzugt weist der Aufsatz eine Verschraubmechanismus zum Verschrauben mit der Spritze auf, insbesondere einen Luer-Lock-Anschluss. Dies hat den Vorteil, dass der Spritzenaufsatz auch bei einem für die Filterung der Körperflüssigkeit durch die Filterabfolge möglicherweise erforderlichen hohen Druck robust mit der Spritze verbunden bleibt und durch den Druck nicht abgesprengt werden kann.The attachment preferably has a screw mechanism for screwing to the syringe, in particular a Luer lock connection. This has the advantage that the syringe attachment remains robustly connected to the syringe even at a high pressure that may be required for filtering the body fluid through the filter sequence and cannot be blown off by the pressure.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Separierung von Partikeln aus einer Probe, insbesondere einer Flüssigkeit, insbesondere einer Körperflüssigkeit, einem Gewebeabstrich oder einem Transportmedium wie zum Beispiel Amies-Medium, insbesondere zur Separierung von zellulären Bestandteilen. Dabei wird eine solche Probe zusammen mit geeigneten Pufferlösungen oder eine Probe in einem Transportmedium z.B. Amies-Medium auf eine erfindungsgemäße Filterabfolge derart aufgebracht wird, dass die Flüssigkeit zuerst über die erste der Filterschichten gefiltert wird und zumindest ein Teil der Partikel aus der Probe in der Filterabfolge zurückgehalten wird. Bevorzugt handelt es sich bei den Partikeln um oben beschriebene zelluläre Bestandteile, wobei die zellulären Bestandteile anschließend lysiert und Nukleinsäuren aus den zellulären Bestandteilen für eine weitere Verarbeitung, beispielsweise eine DNA-Amplifikation, eluiert werden.The invention also relates to a method for separating particles from a sample, in particular a liquid, in particular a body fluid, a tissue swab or a transport medium such as Amies medium, in particular for separating cellular components. Such a sample is applied to a filter sequence according to the invention together with suitable buffer solutions or a sample in a transport medium, e.g. Amies medium, in such a way that the liquid is first filtered through the first of the filter layers and at least some of the particles from the sample in the filter sequence is held back. The particles are preferably cellular components described above, the cellular components then being lysed and nucleic acids being eluted from the cellular components for further processing, for example DNA amplification.

Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens und den folgenden vorteilhaften Weiterbildungen und Ausgestaltungen wird auch auf die oben ausgeführten korrespondierenden Vorteile der erfindungsgemäßen Filterabfolge verwiesen.With regard to the advantages of the method according to the invention and the following advantageous developments and refinements, reference is also made to the corresponding advantages of the filter sequence according to the invention set out above.

Vorzugsweise wird die Probe dabei mit Hilfe einer Spritze mit Hochdruck durch die Filterabfolge gepresst. Unter Hochdruck ist dabei insbesondere ein Druck zwischen 1 und 10 bar zu verstehen, welcher auf die Probe bzw. der mit geeigneten Puffern versetzten Probe in der Spritze und somit auf die Filterabfolge ausgeübt wird. Vorteilhafterweise kann ein solch hoher Druck über moderate händisch ausgeübte Kräfte auf den Kolben der Spritze erzeugt werden. Bevorzugt ist der Spritzenaufsatz dazu mit der Spritze verbunden, insbesondere verschraubt, beispielsweise über eine Luer-Lock-Verbindung.The sample is preferably pressed through the filter sequence with the aid of a syringe at high pressure. In this context, high pressure is to be understood in particular as a pressure between 1 and 10 bar which is exerted on the sample or the sample to which suitable buffers have been added in the syringe and thus on the filter sequence. Such a high pressure can advantageously be generated by means of moderate manually exerted forces on the plunger of the syringe. For this purpose, the syringe attachment is preferably connected to the syringe, in particular screwed, for example via a Luer lock connection.

FigurenlisteFigure list

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.Embodiments of the invention are shown schematically in the drawings and explained in more detail in the description below.

Es zeigen

1 ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Filterabfolge 100,
2 ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung 1000,
3, 4 ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Spritzenaufsatzes 200 und einer erfindungsgemäßen Spritze 300 sowie
5 ein Ablaufdiagramm eines erfindungsgemäßen Verfahrens 600.

Show it

1 an embodiment of a filter sequence according to the invention 100 ,
2 an embodiment of a microfluidic device according to the invention 1000 ,
3 , 4th an embodiment of a syringe attachment according to the invention 200 and a syringe according to the invention 300 as
5 a flow chart of a method according to the invention 600 .

Ausführungsformen der ErfindungEmbodiments of the invention

1 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Filterabfolge 100 mit einer ersten Filterschicht 110 und einer zweiten Filterschicht 120. Wie dargestellt, kann die Filterabfolge darüber hinaus eine dritte Filterschicht 130 und eine vierte Filterschicht 140 aufweisen. Die Filterschichten 110, 120, 130, 140 umfassen Durchgangsöffnungen 151, 152, 153, 154, die derart ausgebildet sind, dass die Filterabfolge sukzessive kleinere Partikel an den Filterschichten zurückhält. Die Filterabfolge, auch Filterstack genannt, umfasst somit eine Abfolge von grobporigen zu immer feinporigeren Filterschichten, auch Filtermatten genannt. Die Filterschichten können dabei nur aufeinander gelegt und vorzugsweise über eine äußere Beschränkung wie beispielsweise eine Klammer oder ein Gehäuse gegeneinander fixiert sein. Alternativ können die Filterschichten auch direkt miteinander verbunden sein, beispielsweise über eine stellenweise Verklebung zum Beispiel am Rand der Filterfritten bzw. -schichten. Eine oder mehrere der Filterschichten 110, 120, 130, 140 kann dabei auch als oben beschriebener Volumenfilter ausgeführt sein, welcher Partikel vorwiegend nicht an einer Oberfläche, sondern in seinem Inneren zurückhält und damit einer vorzeitigen Verstopfung vorbeugt. 1 shows an embodiment of a filter sequence according to the invention 100 with a first filter layer 110 and a second filter layer 120 . As shown, the filter sequence can also have a third filter layer 130 and a fourth filter layer 140 exhibit. The filter sheets 110 , 120 , 130 , 140 include through openings 151 , 152 , 153 , 154 which are designed in such a way that the filter sequence successively retains smaller particles on the filter layers. The filter sequence, also called filter stack, thus comprises a sequence of coarse-pored to increasingly fine-pored filter layers, also called filter mats. The filter layers can only be placed on top of one another and preferably fixed to one another via an external restriction such as a clamp or a housing. Alternatively, the filter layers can also be connected directly to one another, for example by gluing them in places, for example at the edge of the filter frits or layers. One or more of the filter layers 110 , 120 , 130 , 140 can also be designed as a volume filter as described above, which predominantly does not retain particles on a surface but in its interior and thus prevents premature clogging.

Für eine bevorzugte Anwendung der Erfindung geht der vorliegende Ansatz von der Überlegung aus, dass aus einer Patientenblutprobe mit üblicherweise 7,5 Milliliter („ml“) Blutvolumen eine kontrollierte Übertragung einer Teilmenge von zum Beispiel 0,5 - 1 ml in die Lab-on-Chip-Vorrichtung (kurz „LoC“) erfolgen soll. Dazu bedient man sich üblicherweise einer Pipette oder einem adäquaten Werkzeug, mit dessen Hilfe die gewünschte Teilmenge aus dem den Patienten abgenommenen Blutvolumen aufgenommen, zur LoC-Eingabekammer transportiert und in diese hinein wieder abgegeben wird. Die Probeneingabekammer fasst oftmals maximal 1,5 ml Probenmaterial, wobei der LoC-interne Diagnostikprozess davon eine beliebige Menge, beispielsweise ca. 0,5 ml abnehmen und im mikrofluidischen Netzwerk weiterverarbeiten kann. 2 zeigt beispielhaft eine LoC-Kartusche 1000 mit einer Eingabekammer 1100. Die erfindungsgemäße Filterabfolge 100 kann in einer solchen LoC-Kartusche aufgenommen oder integriert sein, so dass 2 auch ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung zeigt. Die Filterabfolge 100 kann dabei beispielsweise unmittelbar fluidisch mit der Eingabekammer 1100 verbunden sein.For a preferred application of the invention, the present approach is based on the consideration that a controlled transfer of a partial amount of, for example, 0.5-1 ml into the lab-on from a patient's blood sample with usually 7.5 milliliters (“ml”) of blood volume -Chip device ("LoC" for short) should take place. For this purpose, a pipette or an adequate tool is usually used, with the help of which the desired partial amount is taken from the blood volume removed from the patient, transported to the LoC input chamber and released into it again. The sample input chamber often holds a maximum of 1.5 ml of sample material, whereby the LoC-internal diagnostic process can take any amount, for example approx. 0.5 ml, and process it further in the microfluidic network. 2 shows an example of a LoC cartridge 1000 with an input chamber 1100 . The filter sequence according to the invention 100 can be received or integrated in such a LoC cartridge so that 2 also shows an embodiment of a microfluidic device according to the invention. The filter sequence 100 can for example be directly fluidic with the input chamber 1100 be connected.

Wie oben ausgeführt, umfasst in diesem Ausführungsbeispiel die Filterabfolge 100 zumindest zwei Schichten 110, 120 mit filterschichtweise immer kleiner werdenden Poren. Vorzugsweise filtert die erste Filterschicht 110 rote Blutkörperchen und ist dabei bevorzugt als Volumenfilter, insbesondere als Gewebefilter ausgeführt, beispielsweise auf Basis von Glaswolle, Borsilikatglaswolle, Baumwolle, oder beispielsweise auf Basis eines Porex®-Filters. Somit bleiben Zellen im Inneren des Filtervolumens hängen und verstopfen dabei den Filter nicht vollständig. Besonders bevorzugt ist die letzte Filterschicht, hier die vierte Filterschicht 140, als ebener Filter, beispielsweise als Membran mit Löchern ausgeführt, beispielsweise als extrudierte poröse Teflon- oder Nylon-Membran. Dabei kann es sich um eine oben beschriebene Sterilfilterschicht handeln, welche beispielsweise Bakterien wie Staphylococcus aureus-Bakterien aus Blut, Körperflüssigkeit und/oder einem Transportmedium zurückhält. Dazwischen angeordnete weitere Filter, hier die zweite Filterschicht 130 und die dritte Filterschicht 140 können vorzugsweise ausgebildet sein, insbesondere aufgrund der Größe ihrer Durchgangsöffnungen weitere kleinere Zellen wie beispielsweise Leukozyten zurückzuhalten. Das Filtermaterial kann beispielsweise Porengrößen von 0,005 - 0,9 Mikrometer (µm) aufweisen, vorzugsweise 0,01-0,65 Mikrometer, besonders bevorzugt 0,45 Mikrometer, was im letzteren Fall einer Zurückhaltung von Partikeln mit einer Mindestgröße größer 0,45 Mikrometer entspräche. Die erste Filterschicht 110 sollte für eine Zurückhaltung von roten Blutkörperchen beispielsweise eine Größe der Durchgangsöffnungen oder Poren von einigen Mikrometer bis einigen 10 Mikrometer im Querschnitt aufweisen. Die zweite Filterschicht 120 und die dritte Filterschicht 130 können beispielsweise eine Größe der Durchgangsöffnungen Poren von einigen Mikrometer beziehungsweise Poren von einigen 0,1 Mikrometer aufweisen. Eine als Sterilfilter 140 ausgebildete vierte Filterschicht 140 sollte eine Größe der Durchgangsöffnungen Poren von 0,01 Mikrometer bis 0,5 Mikrometer aufweisen. Das Filtermaterial, oder die Kombination von Filtermaterialien, sollte darüber hinaus zumindest unter geeignet einstellbaren Pufferbedingungen (insbesondere anti-chaotropen Pufferbedingungen) keine chemischen oder physikalischen Bindungseigenschaften gegenüber Nukleinsäuren oder Proteinen aufweisen, soll somit also gegenüber Nukleinsäuren oder Proteinen unter den erwähnten Bedingungen inert sein. Gegenüber Nukleinsäuren inerte Materialien sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie keine polaren funktionalen Gruppen aufweisen, an die sich Nukleinsäuren binden können. In diesem Zusammenhang geeignete Filtermaterialien sind beispielsweise Teflonmaterialien bzw. Teflongewebe (PTFE), Polyvinyldifluoriden (PVDF) beziehungsweise entsprechende Gewebe, sowie Polypropylen und Polyethylen. Andere Gewebe wie z.B. Polystyrole, Polysulfone, Glasfaser, Polyether, Zelluloseacetat und andere weisen zwar Bindestellen auf. Die Nukleinsäuren lassen sich in diesen Fällen aber gegenüber den potenziellen Bindestellen durch geeignete antichaotrope Puffer „maskieren“. As stated above, the filter sequence comprises in this exemplary embodiment 100 at least two layers 110 , 120 with pores that are getting smaller and smaller. The first filter layer preferably filters 110 red blood cells and is preferably designed as a volume filter, in particular as a fabric filter, for example based on glass wool, borosilicate glass wool, cotton, or for example based on a Porex® filter. This means that cells get stuck inside the filter volume and do not completely clog the filter. The last filter layer, here the fourth filter layer, is particularly preferred 140 , designed as a flat filter, for example as a membrane with holes, for example as an extruded porous Teflon or nylon membrane. This can be a sterile filter layer described above which, for example, retains bacteria such as Staphylococcus aureus bacteria from blood, body fluid and / or a transport medium. Further filters arranged in between, here the second filter layer 130 and the third filter layer 140 can preferably be designed to hold back further smaller cells such as leukocytes, in particular due to the size of their passage openings. The filter material can, for example, have pore sizes of 0.005-0.9 micrometers (μm), preferably 0.01-0.65 micrometers, particularly preferably 0.45 micrometers, which in the latter case results in retention of particles with a minimum size greater than 0.45 micrometers would correspond to. The first filter layer 110 should, for example, have a size of the passage openings or pores of a few micrometers to a few tens of micrometers in cross-section for a retention of red blood cells. The second filter layer 120 and the third filter layer 130 For example, the size of the through openings can have pores of a few micrometers or pores of a few 0.1 micrometers. One as a sterile filter 140 formed fourth filter layer 140 the size of the through openings should have pores of 0.01 micrometers to 0.5 micrometers. The filter material, or the combination of filter materials, should also have no chemical or physical binding properties to nucleic acids or proteins, at least under suitably adjustable buffer conditions (in particular anti-chaotropic buffer conditions), and should therefore be inert to nucleic acids or proteins under the conditions mentioned. Materials which are inert towards nucleic acids are generally characterized in that they do not have any polar functional groups to which nucleic acids can bind. Suitable filter materials in this context are, for example, Teflon materials or Teflon fabric (PTFE), polyvinyl difluoride (PVDF) or corresponding fabrics, as well as polypropylene and polyethylene. Other fabrics such as polystyrenes, polysulfones, fiberglass, Polyether, cellulose acetate and others do have binding sites. In these cases, however, the nucleic acids can be “masked” from the potential binding sites by means of suitable anti-chaotropic buffers.

3 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Spritzenaufsatzes 200 und einer erfindungsgemäßen Spritze 300, welche einen Hohlraum 350 zur Aufnahme von Flüssigkeit und den Spritzenaufsatz 200 umfasst. Die Spritze 300 hat beispielsweise ein Spritzenvolumen von 1,5 ml sowie vorzugsweise einen ausgangsseitige Verschraubungsmechanismus 320 als Interface, beispielsweise eine Luer-Verschraubung 320. Der Spritzenaufsatz 200 umfasst eine erfindungsgemäße Filterabfolge 100, in der schematischen Darstellung gemäß 3 eine Filterabfolge 100 mit zwei Filterschichten, beispielsweise umfassend die oben beschriebene erste Filterschicht 110 zur Zurückhaltung der roten Blutkörperchen und die vierte Filterschicht 140 als Sterilfilter. Alternativ kann die Filterabfolge 100 wie oben beschrieben weitere Filterschichten umfassen, beispielsweise gemäß dem obigen Ausführungsbeispiel nach 1 vier Filterschichten. Ferner kann der Spritzenaufsatz 200 ein Filtergehäuse 210 umfassen, vorzugsweise aus Kunststoff. Das Filtergehäuse 210 kann zum Beispiel flach ausgebildet sein mit einer Höhe von beispielsweise 0,5 - 1 cm und demgegenüber einen großen Durchmesser von beispielsweise 1,3 - 5 cm aufweisen. Dadurch soll eine große wirksame Fläche für die Filtration einer vergleichsweise großen Flüssigkeitsmenge bereitgestellt werden, beispielsweise für eine Flüssigkeitsmenge von 1,5 ml Vollblut. Solche Filtergehäuse aus Kunststoff sind aus dem Stand der Technik bekannt (z.B. Polycap™, Filterhalter der Sartorius AG). 3 shows an embodiment of a syringe attachment according to the invention 200 and a syringe according to the invention 300 which has a cavity 350 for absorbing liquid and the syringe attachment 200 includes. The syringe 300 has, for example, a syringe volume of 1.5 ml and preferably a screw connection mechanism on the outlet side 320 as an interface, for example a Luer fitting 320 . The syringe attachment 200 comprises a filter sequence according to the invention 100 , in the schematic representation according to 3 a filter sequence 100 with two filter layers, for example comprising the first filter layer described above 110 to hold back the red blood cells and the fourth filter layer 140 as a sterile filter. Alternatively, the filter sequence 100 as described above, comprise further filter layers, for example according to the above exemplary embodiment 1 four filter layers. Furthermore, the syringe attachment 200 a filter housing 210 include, preferably made of plastic. The filter housing 210 can, for example, have a flat design with a height of, for example, 0.5-1 cm and, in contrast, a large diameter of, for example, 1.3-5 cm. This is intended to provide a large effective area for the filtration of a comparatively large amount of liquid, for example for a liquid amount of 1.5 ml whole blood. Such filter housings made of plastic are known from the prior art (eg Polycap ™, filter holder from Sartorius AG).

Der Spritzenaufsatz 200 umfasst vorzugsweise einen Verschraubmechanismus 220 zum Verschrauben mit der Spritze 300, insbesondere einen Luer-Lock-Anschluss 220, um einen Eingang 230 in den Spritzenaufsatz 200 fluiddicht und robust mit der Spritze 300 zu verbinden. Die Filterabfolge 100 ist dabei derart in dem Spritzenaufsatz 200 angeordnet, dass bei einem Durchtritt von Fluid durch den Eingang 230 Fluid auf die erste Filterschicht 110 zuerst trifft und zunächst durch die erste Filterschicht 110 gefiltert werden kann. Mit anderen Worten ist die Filterabfolge insbesondere derart in dem Spritzenaufsatz orientiert, dass sich die erste Filterschicht 110 näher als die anderen Filterschichten 120, 130, 140 am Eingang 230 befindet. Ferner umfasst der Spritzenaufsatz 200 einen Ausgang 240 für eine Entnahme von im Spritzenaufsatz 200 gefiltertem Fluid, beispielsweise für eine Überführung in die LoC-Vorrichtung 1000. Der Spritzenaufsatz kann dabei auf nach dem Stand der Technik bekannten Filtergehäusen basieren (z.B. Sartorius Minisart®, VWR Spritzenvorsatzfilter, Acrodisc®, PuraDisc™, Spartan™).The syringe attachment 200 preferably comprises a screwing mechanism 220 for screwing with the syringe 300 , especially a Luer lock connector 220 to get an entrance 230 into the syringe attachment 200 fluid-tight and robust with the syringe 300 connect to. The filter sequence 100 is in this way in the syringe attachment 200 arranged that upon passage of fluid through the entrance 230 Fluid on the first filter layer 110 hits first and first through the first filter layer 110 can be filtered. In other words, the filter sequence is oriented in particular in the syringe attachment in such a way that the first filter layer is located 110 closer than the other filter layers 120 , 130 , 140 at the entrance 230 is located. The syringe attachment also includes 200 an exit 240 for taking from in the syringe attachment 200 filtered fluid, for example for transfer to the LoC device 1000 . The syringe attachment can be based on filter housings known from the prior art (for example Sartorius Minisart®, VWR syringe filter, Acrodisc®, PuraDisc ™, Spartan ™).

Zur Aufnahme einer Flüssigkeit, insbesondere Blut, in den Hohlraum 350 der Spritze 300, kann die Spritze 300, wie in 4 gezeigt, eine modulare, verschraubbare insbesondere stumpfe Kanüle 400 aufweisen, vorzugsweise ebenfalls eingangsseitigen Luer-Interface 420 zum Verschrauben mit der Spritze 300. Der Durchmesser der Kanüle 400 beläuft sich auf beispielsweise 0,5 - 2 mm. Dadurch sollen Scherkräfte, die auf das Blut einwirken, minimiert werden.To absorb a liquid, especially blood, into the cavity 350 the syringe 300 , can the syringe 300 , as in 4th shown, a modular, screwable, in particular blunt cannula 400 have, preferably also on the input side Luer interface 420 for screwing with the syringe 300 . The diameter of the cannula 400 amounts to, for example, 0.5 - 2 mm. This is intended to minimize shear forces acting on the blood.

5 zeigt ein Ablaufdiagramm 600 eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens 600, welches beispielsweise mit den oben beschriebenen Ausführungsbeispielen des erfindungsgemäßen Spritzenaufsatzes 200 und der erfindungsgemäßen Spritze 300 durchgeführt werden kann. Zunächst wird in einem ersten Schritt 601 die stumpfe Kanüle 400 auf die Spritze 300 geschraubt und damit wird aus einem Probenröhrchen mit 7,5 ml Patientenblut durch Aufziehen der Spritze 300 ein Teilvolumen von zum Beispiel 1,5 ml in den Hohlraum 350 der Spritze 300 eingesogen. Eine Begrenzung des Kolbenwegs der Spritze über einen „Stopper“ kann vorteilhaft dafür sorgen, dass nicht mehr als 1,5 ml aufgesogen werden können. 5 shows a flow chart 600 of an embodiment of the method according to the invention 600 , which, for example, with the above-described embodiments of the syringe attachment according to the invention 200 and the syringe according to the invention 300 can be carried out. First, in a first step 601 the blunt cannula 400 on the syringe 300 screwed and thus a sample tube with 7.5 ml of patient's blood is drawn by pulling on the syringe 300 a partial volume of, for example, 1.5 ml into the cavity 350 the syringe 300 sucked in. Limiting the plunger travel of the syringe with a "stopper" can advantageously ensure that no more than 1.5 ml can be aspirated.

Anschließend wird in einem zweiten Schritt 602 die aufgeschraubte stumpfe Kanüle 400 von der Spritze 300 abgeschraubt und der Spritzenaufsatz 200 auf die Spritze 300 aufgeschraubt. Vorzugsweise kann die Spritze 300 dann zur Eingabekammer 1100 der LoC-Vorrichtung 1000 transportiert. In einem dritten Schritt 603 wird der Ausgang 240 des Spritzenaufsatzes 200 in die Eingabekammer 1100 eingeführt und dann die Blutmenge in der Spritze 300 händisch ausgedrückt. Dabei ist zu berücksichtigen, dass bereits durch eine moderate händisch ausgeübte Kraft auf den Spritzenkolben hohe Drücke in der Flüssigkeit von einigen bar bis zu mehr als 10 bar (0,1 - 1 MPa) aufgebaut werden können. Aus diesem Grund ist auch eine stabile Verschraubung der Spritze 300 mit dem Spritzenaufsatz 200 beispielsweise über ein Luer-Interface besonders bevorzugt, um ein Lösen der Verbindung durch diesen hohen Druck vorteilhafterweise zu vermeiden. Dank des durch Fingerkraft mühelos aufgebauten hohen Drucks und der großen Filterfläche wird das Blut mit nur geringem Verstopfungsrisiko und relativ schnell durch die Filterabfolge 100 gepresst, wobei nur das Blutplasma mit enthaltenem genetischen Material (insbesondere Nukleinsäuren) und Proteine durch den Filter hindurchtreten kann, während vorzugsweise sämtlich zellulären Bestandteile von den Filterschichten 110, 120, 130, 140 zurückgehalten werden. Somit ist es vorteilhafterweise möglich, praktisch das gesamte Plasma aus der in der Spritze 300 befindlichen Blutmenge nach Abzug der Totvolumina des Spritzenaufsatzes (Filtermaterialhohlräume und Leerräume zusammengenommen) in die LoC-Probeneingabekammer 1100 zu überführen, was einer effektiven Plasmamenge von beispielsweise 0,3 - 1 ml entspricht. Aus dem in die Probenkammer 1100 eingebrachten Plasmavolumen kann in einem vierten Schritt 604 durch gezieltes Pumpen ein ausgewähltes Teilvolumen von beispielsweise 0,2 - 0,7 ml Plasma zur weiteren Prozessierung, in das mikrofluidische Netzwerk der LoC-Vorrichtung 1000 transportiert werden. Auf der Filterabfolge 100 zurückgehaltene Zellen könnten in einer Weiterbildung des Verfahrens in einem fünften Schritt 605 von den Filterschichten 110, 120, 130, 140 eluiert und für eine weitere Analyse lysiert werden. Letzteres ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Filteranordnung als Teil eines LoC's in dieses integriert wird, um beispielsweise Mikroorganismen aus einer Körperflüssigkeit und/oder einem Transportmedium wie z.B. Amies-Medium auf dem letzten Filter, insbesondere einem Sterilfilter zurückzuhalten und anschließend für die weitere molekularbiologische Verarbeitung zu lysieren.Then in a second step 602 the screwed-on blunt cannula 400 from the syringe 300 unscrewed and the syringe attachment 200 on the syringe 300 unscrewed. Preferably the syringe 300 then to the input chamber 1100 the LoC device 1000 transported. In a third step 603 becomes the exit 240 of the syringe attachment 200 into the input chamber 1100 inserted and then the amount of blood in the syringe 300 expressed manually. It must be taken into account that even a moderate force exerted by hand on the syringe plunger can build up high pressures in the liquid of a few bar up to more than 10 bar (0.1-1 MPa). For this reason there is also a stable screw connection of the syringe 300 with the syringe attachment 200 For example, particularly preferred via a Luer interface in order to advantageously avoid loosening the connection due to this high pressure. Thanks to the high pressure, which is easily built up by the force of the fingers, and the large filter surface, the blood passes through the filter sequence with little risk of blockage and relatively quickly 100 pressed, whereby only the blood plasma with contained genetic material (in particular nucleic acids) and proteins can pass through the filter, while preferably all cellular components from the filter layers 110 , 120 , 130 , 140 be held back. Thus it is advantageously possible to remove practically all of the plasma from the syringe 300 after subtracting the dead volume of the syringe attachment (filter material cavities and empty spaces taken together) into the LoC sample input chamber 1100, which corresponds to an effective plasma amount of, for example, 0.3-1 ml. From the into the sample chamber 1100 introduced plasma volume can in a fourth step 604 by targeted pumping a selected partial volume of, for example, 0.2-0.7 ml plasma for further processing into the microfluidic network of the LoC device 1000 be transported. On the filter sequence 100 Retained cells could in a further development of the method in a fifth step 605 from the filter sheets 110 , 120 , 130 , 140 eluted and lysed for further analysis. The latter is particularly advantageous when the filter arrangement is integrated into it as part of a LoC, for example to retain microorganisms from a body fluid and / or a transport medium such as Amies medium on the last filter, in particular a sterile filter, and then for further molecular biological processing to lyse.

Claims

Filter sequence (100) for separating particles from a sample, in particular from a body fluid or a tissue swab and / or a transport medium, in particular for separating cellular components, at least comprising a first filter layer (110) and a second filter layer (120), wherein the first filter layer (110) allows larger particles to pass through than the second filter layer (120).

Filter sequence (100) Claim 1 , wherein the filter layers (110, 120, 130, 140), in particular through openings (151, 152, 153, 154), in particular pores, of the filter layers (110, 120, 130, 140) of the filter sequence (100) are designed such that the filter sequence (100) gradually retains smaller particles on the filter layers (151, 152).

The filter sequence (100) according to any one of the preceding claims, wherein the filter sequence (100) has a sterile filter layer (140).

Filter sequence (100) according to one of the preceding claims, wherein one of the filter layers (110, 120, 130, 140), in particular the sterile filter layer (140), is designed to hold back microorganisms, in particular bacteria, in particular Staphylococcus aureus bacteria.

Filter sequence (100) according to one of the preceding claims, wherein at least one filter layer (110, 120, 130, 140) is designed as a volume filter, in particular for retaining body cells, in particular red or white blood cells.

The filter sequence (100) according to any one of the preceding claims, wherein one of the filter layers (110, 120, 130, 140) is designed to hold back red blood cells.

Filter sequence (100) according to one of the preceding claims, comprising a filter housing (210), preferably made of plastic.

Syringe attachment (200) comprising a filter sequence (100) according to one of the preceding claims.

Syringe attachment (200) Claim 8 wherein the syringe attachment (200) has a screwing mechanism (220) for screwing to a syringe (300), in particular a Luer lock connection.

Syringe (300) with a syringe attachment (200) according to one of the Claims 8 or 9 .

Microfluidic device (1000), in particular lab-on-chip device (1000), with a filter sequence (100) according to one of the Claims 1 to 7th .

Method (600) for separating particles from a sample, in particular a body fluid, a tissue swab or a transport medium, in particular for separating cellular components, the sample being applied to a filter sequence (100) according to one of the Claims 1 to 7th is applied in such a way that the sample is first filtered through the first of the filter layers (110) and at least some of the particles from the sample are retained in the filter sequence (100).

Method (600) according to Claim 12 , the particles being cellular components, the cellular components then being lysed and nucleic acids being eluted from the cellular components.

Method (600) according to Claim 12 or 13th , the sample being pressed through the filter sequence (100) at high pressure with the aid of a syringe (300).

Method (600) according to Claim 14 wherein the syringe attachment (200) is connected, in particular screwed, to the syringe (300) and the sample is pressed through the filter sequence (200) under high pressure with the aid of the syringe (300).