DE102016120312B3

DE102016120312B3 - Method for illuminating focus positions on the object side of a microscope objective and microscope

Info

Publication number: DE102016120312B3
Application number: DE102016120312.2A
Authority: DE
Inventors: Christian Schumann; Cornell Peter Gonschior
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2017-10-05
Anticipated expiration: 2036-10-26

Abstract

Es wird ein Verfahren zum Beleuchten von Fokuspositionen (115) objektseitig eines Objektivs (110) eines Mikroskops (100) vorgeschlagen, bei dem unter Verwendung einer bildseitig des Objektivs (110) angeordneten Abtasteinrichtung (104, 105) ein Lichtbündel (111, 112, 113) abgelenkt und in das Objektiv (110) eingestrahlt wird. Dabei ist vorgesehen, dass das Lichtbündel (111, 112, 113) in nichtkollimiertem Zustand in das Objektiv (110) eingestrahlt wird, und dass die Abtasteinrichtung (104, 105) derart angesteuert wird, dass jeweils eine aufgrund des nichtkollimierten Zustands des Lichtbündels (111, 112, 113) gegenüber einem kollimierten Referenzzustand bedingte Ablage der Fokuspositionen (115) kompensiert wird. Ein entsprechendes Mikroskop (100) ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.A method is proposed for illuminating focal positions (115) on the object side of a lens (110) of a microscope (100), in which a light bundle (111, 112, 113) is used by means of a scanning device (104, 105) arranged on the image side of the objective (110) ) is deflected and irradiated in the lens (110). In this case, it is provided that the light bundle (111, 112, 113) is irradiated into the objective (110) in the uncollimated state, and that the scanning device (104, 105) is controlled such that in each case one due to the non-collimated state of the light bundle (111 , 112, 113) relative to a collimated reference state conditional storage of the focus positions (115) is compensated. A corresponding microscope (100) is likewise the subject of the present invention.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Beleuchten von Fokuspositionen objektseitig eines Objektivs eines Mikroskops, insbesondere eines zur Weitfelddetektion und/oder Weitfeldbeobachtung eingerichteten Mikroskops, und ein entsprechendes Mikroskop gemäß den Oberbegriffen der unabhängigen Patentansprüche.The present invention relates to a method for illuminating focus positions on the object side of a microscope objective, in particular of a microscope set up for wide-field detection and / or wide-field observation, and to a corresponding microscope according to the preambles of the independent patent claims.

Stand der TechnikState of the art

Aus dem Stand der Technik sind unterschiedliche optische Abtastsysteme bekannt, insbesondere für die Verwendung in Mikroskopen, beispielsweise für rasternde Konfokalmikroskope. Zum grundlegenden Aufbau entsprechender Abtastsysteme sei auf einschlägige Fachliteratur, insbesondere E. H. K. Stelzer, The Intermediate Optical System of Laser-Scanning Confocal Microscopes, Kapitel 9 in J. B. Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3. Auflage 2006, Springer-Verlag, verwiesen.Different optical scanning systems are known from the prior art, in particular for use in microscopes, for example for scanning confocal microscopes. Reference may be made to the relevant literature for the basic structure of corresponding scanning systems, in particular E.H.K. Stelzer, The Intermediate Optical System of Laser-Scanning Confocal Microscopes, Chapter 9 in J.B. Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Edition 2006, Springer-Verlag.

Um in derartigen Abtastsystemen einen telezentrischen Abtastvorgang zu gewährleisten, bei welchem die Position des abtastenden Lichtbündels in der hinteren Brennebene des Objektivs stationär ist, ist es vonnöten, das oder die Abtastelemente, die zur Ablenkung eines zum Abtasten verwendeten Lichtbündels verwendet werden, jeweils in einer zur hinteren Brennebene des Objektivs konjugierten Ebene anzuordnen. Die hintere Brennebene des Objektivs ist im Allgemeinen mechanisch nicht zugänglich, so dass in dieser ein reelles Bild mit Hilfe eines Kepler-Fernrohrsystems (auch „Scanoptik” genannt) erzeugt wird. Da Objektive für entsprechende Mikroskope objektseitig telezentrisch ausgebildet sind und somit die bildseitige Pupille in der hinteren Brennebene liegt, werden die Begriffe „hintere Brennebene” und „Pupille” des Objektivs nachfolgend synonym verwendet.In order to ensure a telecentric scanning operation in such scanning systems, in which the position of the scanning light beam in the rear focal plane of the lens is stationary, it is necessary to use the one or more scanning elements used to deflect a light beam used for scanning, each in a rear focal plane of the lens conjugate plane to arrange. The rear focal plane of the objective is generally not mechanically accessible, so that in this a real image with the aid of a Kepler telescope system (also called "scan optics") is generated. Since lenses for corresponding microscopes are objectively telecentric on the object side, and thus the image-side pupil lies in the rear focal plane, the terms "rear focal plane" and "pupil" of the objective are used interchangeably below.

Die Realisierbarkeit eines vollständig telezentrischen Abtastvorgangs hängt von der Art der verwendeten Abtastelemente und ggf. der Verwendung zusätzlicher optischer Einrichtungen ab. Wie in der zuvor zitierten Literatur (Seite 215, Abschnitt „Single Mirror/Double Tilt”) beschrieben, ist es vergleichsweise einfach, ein Abtastelement in die zur hinteren Brennebene bzw. Pupille des Objektivs konjugierte Ebene zu legen, falls dieses eine Verschwenkung um zwei Achsen zulässt.The realizability of a complete telecentric scanning process depends on the type of scanning elements used and possibly the use of additional optical devices. As described in the previously cited literature (page 215, "Single Mirror / Double Tilt" section), it is comparatively easy to place a scanning element in the plane conjugate to the rear focal plane or pupil of the objective, if this involves a pivoting about two axes allows.

Sollten entsprechende Abtastelemente dagegen nur einen Abtastvorgang entlang einer Achse unterstützen, wie beispielsweise bei auf Galvanometern montierten Umlenkspiegeln der Fall, so ist die Verwendung von mindestens zwei solcher Abtastelemente erforderlich, von denen ohne weitere Maßnahmen zwangsläufig zumindest eines außerhalb der zur hinteren Brennebene bzw. Pupille des Objektivs konjugierten Ebene liegt. Dies hat zur Folge, dass keine exakt telezentrische Abtastung möglich ist.On the other hand, if corresponding scanning elements support only one scanning operation along one axis, as is the case with deflecting mirrors mounted on galvanometers, the use of at least two such scanning elements is required, of which without further measures at least one outside of the to the rear focal plane or pupil of the Lens conjugate level lies. As a result, no exact telecentric sampling is possible.

Um einen telezentrischen Abtastvorgang zu realisieren ist, kann ein System mit drei Abtastelementen verwendet werden (siehe beispielsweise DE 402 61 30 C2 ), oder die Pupille kann von einem Abtastelement auf das andere abgebildet werden. Dies kann entweder mit reflektiver Optik ( US 4,997,242 A , US 6,433,908 B2 , DE 103 28 308 A1 ) oder mit refraktiver Optik erfolgen. Nachteil solcher Anordnungen ist der hohe apparative Aufwand, welcher entweder zusätzliche Abtastelemente beinhaltet, die synchronisiert werden müssen, oder aber aufwändige und/oder toleranzempfindliche Optik, welche die Abbildungsqualität des Abtastsystems negativ beeinflussen kann.In order to realize a telecentric scanning operation, a system with three scanning elements can be used (see for example DE 402 61 30 C2 ), or the pupil can be imaged from one scanning element to the other. This can be done either with reflective optics ( US 4,997,242 A . US 6,433,908 B2 . DE 103 28 308 A1 ) or with refractive optics. Disadvantage of such arrangements is the high expenditure on equipment, which includes either additional sensing elements that need to be synchronized, or complex and / or tolerance-sensitive optics, which can adversely affect the imaging quality of the scanning system.

Weitere Möglichkeiten einer telezentrischen Anordnungen sind beispielsweise sogenannte K-Scanner ( DE 196 54 210 A1 ) oder kardanische Aufhängungen. Durch die mechanische Unterscheidung beider Abtastrichtungen in diesen Anordnungen existieren allerdings immer eine „schnelle” und eine „langsame” Achse, was solche Systeme für vektorbasierte Abtastprozesse ungeeignet bzw. unvorteilhaft macht.Further possibilities of a telecentric arrangements are, for example, so-called K-scanners ( DE 196 54 210 A1 ) or gimbals. However, due to the mechanical distinction between the two scanning directions in these arrangements, there is always a "fast" and a "slow" axis, which makes such systems unsuitable for vector-based scanning processes.

Bei der Verwendung lediglich zweier Abtastelemente ohne zusätzliche Optiken, die aus baulichen, Geschwindigkeits- und steuerungstechnischen Gründen wünschenswert ist, kann beispielsweise die zur hinteren Brennebene bzw. Pupille des Objektivs konjugierte Ebene zwischen die zwei (dann möglichst nahe beieinander angeordneten) Abtastelemente gelegt werden, um einen telezentrischen Abbildungsvorgang zu approximieren. Mit anderen Worten werden die beiden Abtastelemente so nahe wie möglich zu der zur hinteren Brennebene bzw. Pupille des Objektivs konjugierte Ebene angeordnet, weisen aber einen endlichen Abstand zu dieser auf. Es findet daher keine exakt telezentrische Abbildung statt. Entsprechende Anordnungen sind auch als „Closely Spaced Galvo Pair” bekannt. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung derartiger Abtastsysteme.When using only two scanning elements without additional optics, which is desirable for structural, speed and control reasons, for example, the conjugate to the rear focal plane or pupil of the lens plane between the two (then arranged as close to each other) sensing elements can be placed to to approximate a telecentric imaging process. In other words, the two scanning elements are arranged as close as possible to the plane to the rear focal plane or pupil of the lens, but have a finite distance to this. Therefore, there is no exact telecentric mapping. Corresponding arrangements are also known as "Closely Spaced Galvo Pair". In particular, the invention relates to the use of such scanning systems.

Die vorliegende Erfindung stellt sich die Aufgabe, entsprechende Abtastsysteme, Verfahren und Mikroskope, insbesondere zur Weitfelddetektion und/oder Weitfeldbeobachtung eingerichteter Mikroskope, zu verbessern.The object of the present invention is to improve corresponding scanning systems, methods and microscopes, in particular for wide field detection and / or wide field observation of equipped microscopes.

Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention

Vor diesem Hintergrund schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Beleuchten von Fokuspositionen objektseitig eines Objektivs eines Mikroskops, insbesondere eines zur Weitfelddetektion und/oder Weitfeldbeobachtung eingerichteten Mikroskops, und ein entsprechendes Mikroskop mit den Merkmalen der jeweiligen Oberbegriffe der unabhängigen Patentansprüche vor. Bevorzugte Ausgestaltungen sind jeweils Gegenstand der abhängigen Patentansprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.Against this background, the present invention proposes a method for illuminating focus positions object side of a lens of a microscope, in particular a set up for wide-field detection and / or wide field observation microscope, and a corresponding microscope with the Features of the respective preambles of the independent claims before. Preferred embodiments are the subject of the dependent claims and the following description.

Vorteile der ErfindungAdvantages of the invention

Für die Verwendung eines Abtastsystems als reines Photomanipulationssystem ohne konfokale Detektion ist es ausreichend, eine Positionierung eines Zielpunkts eines zur Beleuchtung verwendeten Lichtbündels axial und lateral zu einer Weitfelddetektion zu adressieren. Es ist kein physikalischer Überlapp zweier Fokusvolumina in der Probe erforderlich wie bei einer konfokalen Detektion.For the use of a scanning system as a pure photomanipulation system without confocal detection, it is sufficient to address a positioning of a target point of a light beam used for illumination axially and laterally to a wide field detection. There is no physical overlap of two focus volumes in the sample required as in a confocal detection.

Ein derartiger Einsatz eines Abtastsystems kann beispielsweise für eine gezielte Fluoreszenzanregung durch Abtasten einer Probe durch einen Laserstrahl erfolgen, bei der jedoch keine konfokale Detektion sondern eine Weitfelddetektion erfolgt. Hierbei kann beispielsweise über ein entsprechendes Abtastsystem Anregungslicht einer ersten Wellenlänge eingestrahlt und über die Weitfelddetektion Fluoreszenzlicht einer zweiten Wellenlänge detektiert werden. Allgemein wird ein über ein entsprechendes Abtastsystem in ein Objektiv eingestrahltes Lichtbündel nachfolgend auch als „Manipulationsstrahl” bezeichnet. Der Strahlengang eines entsprechenden Manipulationsstrahls wird auch als Manipulationsstrahlengang bezeichnet. Ein Manipulationsstrahl kann für beliebige Manipulationen einer Probe verwendet werden, beispielsweise auch dazu, Bereiche aus einem Objekt herauszutrennen.Such a use of a scanning system can be carried out, for example, for a targeted fluorescence excitation by scanning a sample by a laser beam, but in which no confocal detection but a wide-field detection takes place. In this case, for example, excitation light of a first wavelength can be irradiated via a corresponding scanning system, and fluorescent light of a second wavelength can be detected via the wide-field detection. In general, a light beam irradiated into a lens via a corresponding scanning system is also referred to below as a "manipulation beam". The beam path of a corresponding manipulation beam is also referred to as a manipulation beam path. A manipulation beam can be used for any manipulation of a sample, for example also to separate areas from an object.

Bei der Verwendung von Objektiven mit residualem Farblängsfehler zwischen Manipulationswellenlänge und Detektionswellenlänge, bzw. im Rahmen der vorliegenden Erfindung allgemeiner zwischen der Wellenlänge des Manipulationsstrahls und der detektierten Wellenlänge, kann eine axiale Übereinstimmung der beiden Fokusebenen dadurch bewerkstelligt werden, dass das für unendliche bildseitige Abbildungslänge (also für die Verwendung mit einer Tubuslinse) korrigierte Objektiv im Manipulationsstrahlengang mit einer von unendlich verschiedenen Eingangsschnittweite bestrahlt wird, also mit vorfokussiertem Licht anstelle von kollimiertem Licht, welches üblicherweise verwendet wird.When using lenses with residual chromatic aberration between the manipulation wavelength and detection wavelength, or in the present invention more generally between the wavelength of the manipulation beam and the detected wavelength, an axial coincidence of the two focal planes can be accomplished that for infinite image-side imaging length (ie For use with a tube lens) corrected lens in the manipulation beam path is irradiated with an infinitely different input incision, so with pre-focused light in place of collimated light, which is commonly used.

Wird ein vorfokussiertes Lichtbündel eingesetzt, hat dies jedoch zur Folge, dass bei der Nutzung des nicht oder nur näherungsweise telezentrischen Abtastsystems zur Beleuchtung der Objektivpupille unter einem Winkel, also zur Beleuchtung eines Punkts abseits der optischen Achse im Objekt, ein lateraler Versatz der Ausleuchtung in der hinteren Brennebene des Objektivs eine laterale Ablage im Objekt bewirkt. Bei der Nutzung einer nichttelezentrischen Abtastanordnung tritt gerade ein solcher Versatz auf, wie insbesondere in den 1A und 1B veranschaulicht. Der erläuterte Versatz tritt nur bei nicht telezentrischen Anordnungen auf. Der erläuterte Winkel hingegen tritt in jeder Anordnung auf.If a pre-focused light bundle is used, this has the consequence that when using the non-or only approximately telecentric scanning system for illuminating the objective pupil at an angle, ie for illuminating a point away from the optical axis in the object, a lateral offset of the illumination in the rear focal plane of the lens causes a lateral deposit in the object. When using a non-telecentric Abtastanordnung just such an offset occurs, especially in the 1A and 1B illustrated. The illustrated offset occurs only in non-telecentric arrangements. The illustrated angle, however, occurs in any arrangement.

Die 1A und 1B zeigen den Effekt einer nichttelezentrischen Abtastanordnung im Falle eines kollimierten Beleuchtungsbündels (1A) bzw. eines vorfokussierten Beleuchtungsbündels (1B). Die Größe des Versatzes ist vom Abbildungsmaßstab der Scanoptik, der Position der Abtastelemente, der Vorfokussierung sowie von den optischen Eigenschaften des Objektivs abhängig. Details hierzu sind in den 2A und 2B gezeigt, in 4 ist die Form einer Quadrattrajektorie im Objekt für dieses Beispiel dargestellt. Weitere Details sind im Rahmen der Figurenbeschreibung erläutert.The 1A and 1B show the effect of a non-telecentric scanning arrangement in the case of a collimated illumination beam ( 1A ) or a pre-focused illumination beam ( 1B ). The size of the offset depends on the imaging scale of the scanning optics, the position of the scanning elements, the pre-focusing as well as the optical properties of the lens. Details are in the 2A and 2 B shown in 4 is the shape of a quadratic trajectory in the object shown for this example. Further details are explained in the context of the description of the figures.

Weil für ein Manipulationsabtastsystem in einem Weitfeldmikroskop, wie erwähnt, kein physikalischer Überlapp zweier Fokus-Volumina in der Probe erforderlich ist, ist es, wie im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen, möglich, den entstehenden Ablagefehler durch eine passende Ansteuerung der verwendeten Abtastelemente zu korrigieren. Die vorliegende Erfindung gibt damit ein Verfahren an, das auch bei nichtkollimierter Nutzung des Objektivs die Korrelation zwischen Weitfelddetektion und Position des Manipulationsstrahls in der Probe sicherstellt und dadurch die Verwendung vergleichsweise einfacher Abtasteinrichtungen, insbesondere solcher mit nur zwei Abtastelementen, ermöglicht. Die vorliegende Erfindung betrifft also insbesondere Abtasteinrichtungen mit zwei Abtastelementen, beispielsweise Galvanometerspiegeln, vor und hinter einer zu der Objektivpupille konjugierten Ebene, wie eingangs beschrieben.As mentioned above, since no physical overlap of two focus volumes in the sample is required for a manipulation scanning system in a wide-field microscope, it is possible, as proposed in the present invention, to correct the resulting storage error by appropriately driving the scanning elements used. The present invention thus provides a method which, even with non-collimated use of the objective, ensures the correlation between far-field detection and the position of the manipulation beam in the sample and thereby enables the use of comparatively simple scanning devices, in particular those having only two scanning elements. The present invention thus relates in particular to scanning devices with two scanning elements, for example galvanometer mirrors, in front of and behind a plane conjugate to the objective pupil, as described above.

Unter einem „Abtastelement” wird hier ein insbesondere reflektierendes optisches Element verstanden, das nach Maßgabe einer Steuerung um wenigstens eine Achse senkrecht zu einer Einstrahlrichtung eines Richtungsstrahls eines zur Abtastung einer Probe verwendeten Lichtbündels verschwenkt werden kann. Eine „Abtasteinrichtung” umfasst, falls das Abtastelement eine Verschwenkung um zwei orthogonale Achsen zulässt, wenigstens ein Abtastelement. Ist, wie insbesondere im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Fall, nur eine Verschwenkung um eine Achse möglich, sind, wie erwähnt, wenigstens zwei Abtastelemente in einer Abtasteinrichtung vorhanden.A "scanning element" is here understood to mean in particular a reflective optical element which, according to a control, can be pivoted about at least one axis perpendicular to an irradiation direction of a directional beam of a light beam used for scanning a sample. A "scanning device" comprises, if the scanning element allows pivoting about two orthogonal axes, at least one scanning element. If, as is the case in particular in the context of the present invention, only pivoting about an axis is possible, as mentioned, at least two scanning elements are present in a scanning device.

Die vorliegende Erfindung schlägt hierbei ein Verfahren zum Beleuchten von Fokuspositionen objektseitig eines Objektivs eines Mikroskops, insbesondere eines zur Weitfelddetektion und/oder Weitfeldbeobachtung eingerichteten Mikroskops, vor, bei dem unter Verwendung einer bildseitig des Objektivs angeordneten Abtasteinrichtung ein Lichtbündel abgelenkt und in das Objektiv eingestrahlt wird. Erfindungsgemäß ist dabei vorgesehen, dass das Lichtbündel in nichtkollimiertem Zustand in das Objektiv eingestrahlt wird, und dass die Abtasteinrichtung derart angesteuert wird, dass jeweils eine aufgrund des nichtkollimierten Zustands des Lichtbündels gegenüber einem kollimierten Referenzzustand bedingte Ablage der Fokuspositionen kompensiert wird.In this case, the present invention proposes a method for illuminating focus positions on the object side of a microscope objective, in particular a microscope set up for wide-field detection and / or wide-field observation, in which a image is used on the objective using the objective arranged scanning device deflected a light beam and is irradiated into the lens. According to the invention, it is provided that the light beam is irradiated into the objective in the non-collimated state, and that the scanning device is controlled in such a way that in each case a storage of the focus positions caused by the non-collimated state of the light bundle relative to a collimated reference state is compensated.

Eine entsprechende Kompensation kann insbesondere umfassen, auf Grundlage einer theoretischen oder praktisch durchgeführten Referenzabbildung mit einem kollimierten Lichtbündel eine sich mit dem kollimierten Lichtbündel bei einer vorgegebenen Ansteuerung ergebende Fokusposition in der Objektebene zu ermitteln und die Ablage in Form einer Abweichung gegenüber der sich bei der Referenzabbildung ergebenden Fokusposition, insbesondere in Form eines Korrekturwerts, zu ermitteln.A corresponding compensation may in particular comprise determining, based on a theoretical or practically performed reference image with a collimated light bundle, a focal position in the object plane which results with the collimated light beam at a given control and the deviation in the form of a deviation from that resulting from the reference image Focus position, in particular in the form of a correction value to determine.

Mit anderen Worten kann die Abtasteinrichtung unter Verwendung von die Fokuspositionen beschreibenden Zielwerten und die Ablage beschreibenden Korrekturwerten angesteuert werden. Die Zielwerte beschreiben dabei insbesondere die lateralen Fokuspositionen, die entsprechende Lichtbündel in der Objektebene hätten, wenn sie kollimiert in das Objektiv eingestrahlt würden. Sie können, wie erwähnt, sich auf eine Referenzabbildung mit einem kollimierten Lichtbündel beziehen. Wie erwähnt, ergibt sich gegenüber diesen Zielwerten bei nichtkollimierter und insbesondere bei nichttelezentrischer Einstrahlung eine laterale Abweichung, die hier, wie in der Fachwelt üblich, als „Ablage” bezeichnet wird.In other words, the scanner can be driven using target values describing the focus positions and correction values describing the tray. The target values describe in particular the lateral focus positions which would have corresponding light bundles in the object plane if they were collimated into the objective. As mentioned, they can refer to a reference image with a collimated light beam. As mentioned above, with respect to these target values, there is a lateral deviation in the case of non-collimated and in particular non-telecentric irradiation, which is referred to here as "storage", as is customary in the art.

Insbesondere weist die Abtasteinrichtung zwei Abtastelemente auf, die, insbesondere symmetrisch, um eine mit einer Objektivpupille des Objektivs konjugierte Ebene angeordnet sind. Die Anordnung ist also insbesondere derart, dass sich die mit der Objektivpupille des Objektivs konjugierte Ebene zwischen diesen Abtastelementen befindet. Derartige Anordnungen sind, wie erläutert, dem Fachmann aus der Fachliteratur bekannt. Wie erläutert, ergibt sich dabei eine nichttelezentrische Beleuchtung.In particular, the scanning device has two scanning elements, which are arranged, in particular symmetrically, about a plane conjugated to an objective pupil of the objective. The arrangement is thus in particular such that the plane conjugate with the objective pupil of the objective is located between these scanning elements. Such arrangements are, as explained, known to those skilled in the art. As explained, this results in a non-telecentric illumination.

Zur Erlangung des Korrekturdatensatzes bzw. entsprechender Korrekturwerte können unterschiedliche Verfahrensvarianten vorgesehen sein. So kann einerseits durch ein analytisches Modell die Ablage des Hauptstrahls berechnet werden. Dies kann insofern effizient durchgeführt werden, als in Gauß'scher Näherung lediglich die Eingangsschnittweite R(s) am unteren Tubusrand (mechanische Referenz des Objektivs), die Pupillenlage P bzgl. der mechanischen Referenz, die virtuelle Position D eines telezentrisch angeordneten Abtastelements sowie die Lateralvergrößerung M der Scanoptik bekannt sein müssen. In diesem Fall berechnet sich bei symmetrischer Anordnung der Abtastelemente jeweils Δx vor bzw. hinter dem Bild der Objektivpupille die Position des Hauptstrahls im Objekt die Ablage h_x und h_y in x- und y-Richtung zu

To obtain the correction data set or corresponding correction values, different method variants can be provided. Thus, on the one hand, the deposition of the main ray can be calculated by means of an analytical model. This can be carried out efficiently insofar as in Gaussian approximation only the input incision R (s) at the lower end of the tube (mechanical reference of the objective), the pupil position P with respect to the mechanical reference, the virtual position D of a telecentrically arranged scanning element and the lateral magnification M the scan optics must be known. In this case, the sensing elements each Ax the tray h _x and h _y in the x- and y-direction is calculated in a symmetrical arrangement before and after the picture of the objective pupil, the position of the main beam at the object to

Die nominelle Position bei kollimiertem Eingangsstrahl h ist dabei gegeben als h = αf, mit α dem Feldwinkel und f der Brennweite des Objektivs. Die Eingangsschnittweite in Abhängigkeit eines Parameters s kann entweder analytisch aus den Daten der vorfokussierenden Optik oder numerisch aus einem Fit einer Simulation des optischen Systems an eine passende Funktion berechnet oder aber experimentell ermittelt und in einer elektronisch lesbaren Tabelle hinterlegt werden. Dies quantifiziert in nullter Näherung den durch die obig beschriebene Systemanordnung bedingten Positionierungsfehler h_x – h bzw. h_y – h, so dass dieser durch eine passende Ansteuerung der Abtastelemente kompensiert werden kann.The nominal position with collimated input beam h is given as h = αf, with α the field angle and f the focal length of the lens. The input slice size as a function of a parameter s can either be calculated analytically from the data of the pre-focusing optics or numerically from a fit of a simulation of the optical system to a suitable function or determined experimentally and stored in an electronically readable table. This quantified in the zeroth approximation due to the above-described system arrangement of positioning errors h _x - h or h _y -, so that this can be compensated by an appropriate activation of the sensing elements h.

Eine weitere Möglichkeit der Ermittlung der Korrekturwerte ist eine numerische Simulation des Abtastsystems, deren Ergebnisse in einer elektronisch lesbaren Tabelle abgelegt werden. Auch eine geeignete Parametrierung, z. B. bezüglich Abtastwinkeln, Objektivbrennweite, Pupillenposition und dem Parameter s, welcher den Grad der Vorfokussierung beschreibt, kann zur Beschreibung der Korrekturwerte genutzt werden. Weiterhin ist es auch möglich, die Korrekturwerte durch experimentelle Untersuchung zu gewinnen und in einer passenden Form (elektronisch lesbare Tabelle) abzulegen.Another possibility of determining the correction values is a numerical simulation of the scanning system, the results of which are stored in an electronically readable table. Also a suitable parameterization, z. B. with respect to scanning angles, lens focal length, pupil position and the parameter s, which describes the degree of Vorfokussierung, can be used to describe the correction values. Furthermore, it is also possible to obtain the correction values by experimental investigation and store them in an appropriate form (electronically readable table).

Mit anderen Worten können die Korrekturwerte zumindest zum Teil unter Verwendung eines analytischen Modells, zumindest zum Teil durch eine Parametrisierung eines numerischen Modells und/oder zumindest zum Teil experimentell ermittelt werden. Die Korrekturwerte können jeweils zumindest zum Teil elektronisch abgelegt werdenIn other words, the correction values can be determined at least in part using an analytical model, at least in part by parameterizing a numerical model and / or at least partially experimentally. The correction values can each be stored at least partially electronically

Insbesondere ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich, dass das Lichtbündel in zwei oder mehreren unterschiedlichen Fokussierungsgraden in das Objektiv eingestrahlt wird, und dabei die Ablage für die zwei oder mehreren unterschiedlichen Fokussierungsgrade kompensiert wird. Wie erwähnt, können dabei beispielsweise unterschiedliche Parametersätze bestimmt und elektronisch abgelegt werden.In particular, it is possible within the scope of the present invention that the light beam is irradiated into the objective in two or more different degrees of focusing, and the tray is compensated for the two or more different degrees of focusing. As mentioned, for example different parameter sets are determined and filed electronically.

Wenngleich die vorliegende Erfindung überwiegend unter Bezugnahme auf Galvanometerspiegel als Abtastelemente beschrieben wurde und wird, kann die vorliegende Erfindung in gleicher Weise unter Verwendung von akustooptischen Abtastelementen (engl. Acousto-Optic Deflectors, AOD) und elektrooptischen Abtastelementen (engl. Electro-Optic Deflectors, EOD) realisiert werden.Although the present invention has been and will be described primarily with reference to galvanometer mirrors as sensing elements, the present invention may equally be practiced using acousto-optic deflectors (AOD) and electro-optic deflectors (EODs) ) will be realized.

Insbesondere kann die vorliegende Erfindung mit Abtasteinrichtungen zum Einsatz kommen, die zwei Abtastelemente aufweist, die beidseitig einer zu einer Pupillenebene des Objektivs konjugierten Ebene angeordnet sind, wie mehrfach erläutert. Daher ist gemäß der vorliegenden Erfindung der unter Verwendung der Abtasteinrichtung eingestrahlte Beleuchtungsstrahl insbesondere nichttelezentrisch.In particular, the present invention can be used with scanning devices having two sensing elements, which are arranged on both sides of a plane conjugate to a pupil plane of the objective, as explained in more detail. Therefore, according to the present invention, the illumination beam irradiated using the scanner is, in particular, non-telecentric.

Die vorliegende Erfindung erstreckt sich, wie erwähnt, auch auf ein entsprechendes Mikroskop, insbesondere auf ein zur Weitfelddetektion und/oder Weitfeldbeobachtung ausgebildetes Mikroskop. In diesem ist zum Beleuchten von Fokuspositionen objektseitig eines Objektivs des Mikroskops eine Abtasteinrichtung bereitgestellt, die ein Lichtbündel ablenkt und in das Objektiv einstrahlt. Erfindungsgemäß ist ein Fernrohrsystem vorgesehen, das das Lichtbündel in nichtkollimiertem Zustand in die Abtasteinrichtung einstrahlt, und eine Steuereinrichtung, die eine Ansteuerung der Abtasteinrichtung derart vornimmt, dass jeweils eine aufgrund des nichtkollimierten Zustands des Lichtbündels gegenüber einem kollimierten Referenzzustand bedingte Ablage der Fokuspositionen wie erläutert kompensiert wird.As mentioned, the present invention also extends to a corresponding microscope, in particular to a microscope designed for wide-field detection and / or wide field observation. In this, a scanning device is provided for illuminating focus positions object side of a lens of the microscope, which deflects a light beam and irradiates into the lens. According to the invention, a telescope system is provided which irradiates the light bundle into the scanning device in the non-collimated state, and a control device which controls the scanning device in such a way that one due to the non-collimated state of the light bundle relative to a collimated reference state conditional storage of the focus positions is compensated as explained ,

Zu Merkmalen und Vorteilen eines entsprechenden Mikroskops sei ausdrücklich auf die obigen Erläuterungen verwiesen. Das Mikroskop ist vorteilhafterweise zur Durchführung eines Verfahrens eingerichtet, wie es zuvor erläutert wurde.For features and advantages of a corresponding microscope, reference is expressly made to the above explanations. The microscope is advantageously arranged for carrying out a method, as explained above.

Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung.Further advantages and embodiments of the invention will become apparent from the description and the accompanying drawings.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It is understood that the features mentioned above and those yet to be explained below can be used not only in the particular combination given, but also in other combinations or in isolation, without departing from the scope of the present invention.

Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispiels in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben. Die Figuren zeigen:The invention is illustrated schematically with reference to an embodiment in the drawing and will be described below with reference to the drawing. The figures show:

1A zeigt schematisch einen Strahlengang eines nichttelezentrischen Manipulationsstrahls in einem Mikroskop bei kollimierter Abtastung. 1A schematically shows a beam path of a non-telecentric manipulation beam in a microscope with collimated scanning.

1B zeigt schematisch einen Strahlengang eines nichttelezentrischen Manipulationsstrahls in einem Mikroskop bei nichtkollimierter Abtastung. 1B schematically shows a beam path of a non-telecentric manipulation beam in a microscope in uncollimated scanning.

2A zeigt eine Detailvergrößerung des Bereichs A objektseitig des Objektivs des in 1A veranschaulichten Strahlengangs. 2A shows a detail enlargement of the area A on the object side of the lens in 1A illustrated beam path.

2B zeigt eine Detailvergrößerung des Bereichs B objektseitig des Objektivs des in der 1B veranschaulichten Strahlengangs. 2 B shows a detail enlargement of the area B on the object side of the lens in the 1B illustrated beam path.

3 zeigt eine Ablage einer Trajektorie objektseitig eines Objektivs bei kollimierter und nichtkollimierter Abtastung. 3 shows a storage of a trajectory on the object side of a lens with collimated and uncollimated scanning.

In den Figuren sind einander entsprechende Elemente jeweils mit identischen Bezugszeichen angegeben und werden der Übersichtlichkeit halber nicht wiederholt erläutert. Dies gilt insbesondere für die in den 1A und 1B schematisch dargestellten Strahlengänge von nichttelezentrischen Manipulationsstrahlen in Mikroskopen bei kollimierter und nichtkollimierter Abtastung.In the figures, corresponding elements are indicated in each case with identical reference numerals and will not be explained repeatedly for the sake of clarity. This is especially true for those in the 1A and 1B schematically illustrated beam paths of non-telecentric manipulation beams in microscopes with collimated and uncollimated scanning.

1A zeigt schematisch einen Strahlengang eines nichttelezentrischen Manipulationsstrahls in einem als Weitfeldmikroskop ausgebildeten Mikroskop 100 bei kollimierter Abtastung. Dieser verläuft ausgehend von einem variablen Fernrohrsystem 101, das im dargestellten Beispiel eine erste Linse oder Linsengruppe 102 und eine zweite Linse oder Linsengruppe 103 umfasst. Es versteht sich, dass in einem entsprechenden variablen Fernrohrsystem 101 auch weitere optische Elemente wie Linsen oder Linsengruppen, Blenden und dergleichen vorgesehen sein können. In dem variablen Fernrohrsystem 101 sind insbesondere die erste Linse oder Linsengruppe 102 und die zweite Linse oder Linsengruppe 103 in einem variablen Abstand zueinander angeordnet, so dass durch eine nicht dargestellte Lichtquelle emittiertes Licht mit unterschiedlichen Schlussschnittweiten bzw. Fokussierungsgraden ausgestrahlt werden kann. In 1A beträgt die Schlussschnittweite unendlich, das Licht wird also kollimiert abgestrahlt. 1A schematically shows a beam path of a non-telecentric manipulation beam in a microscope designed as a wide-field microscope 100 with collimated sampling. This runs from a variable telescope system 101 in the example shown, a first lens or lens group 102 and a second lens or lens group 103 includes. It is understood that in a corresponding variable telescope system 101 It is also possible to provide further optical elements such as lenses or lens groups, diaphragms and the like. In the variable telescope system 101 are in particular the first lens or lens group 102 and the second lens or lens group 103 arranged at a variable distance from one another, so that light emitted by a light source, not shown, light can be emitted with different final cutting widths or Fokussierungsgraden. In 1A If the final incision is infinite, the light is radiated collimated.

Das Mikroskop 100 ist aus Gründen der Allgemeinheit insgesamt stark vereinfacht gezeigt und kann sämtliche für ein Mikroskop der erläuterten Art übliche Elemente umfassen. Nicht dargestellt sind dabei insbesondere eine Lichtquelle, mittels derer das Licht des Manipulationsstrahlengangs, insbesondere mit einer vorgegebenen bzw. einstellbaren Wellenlänge, bereitgestellt wird, und ein Abbildungs- bzw. Detektionssystem. Zu entsprechenden Details sei auf Fachliteratur verwiesen. Beispielsweise kann mittels des Manipulationsstrahlengangs Laserlicht mit einer (Anregungs-)Wellenlänge bereitgestellt und unter Verwendung eines entsprechenden Detektionssystems Laserlicht insbesondere einer anderen Wellenlänge detektiert werden. Insbesondere in letzterem Fall ergibt sich das eingangs erläuterte Problem unterschiedlicher Farblängsfehler.The microscope 100 For the sake of the general public, it is shown in greatly simplified form and can comprise all elements customary for a microscope of the type explained. Not shown are in particular a light source, by means of which the light of the manipulation beam path, in particular with a predetermined or adjustable wavelength, is provided, and an imaging or detection system. To appropriate Details are referred to technical literature. For example, laser light with an (excitation) wavelength can be provided by means of the manipulation beam path, and laser light, in particular of a different wavelength, can be detected using a corresponding detection system. Especially in the latter case, the problem explained at the beginning of different longitudinal chromatic aberrations results.

Ein Lichtbündel eines Manipulationsstrahls innerhalb des variablen Fernrohrsystems 101 ist in Form durchgezogener Linien, die die Randstrahlen und den Richtungsstrahl bzw. die optische Achse des Lichtbündels veranschaulichen, dargestellt. Das Lichtbündel wird aus dem variablen Fernrohrsystem 101 kollimiert in eine Abtasteinrichtung eingestrahlt, die im dargestellten Beispiel ein erstes, um eine erste Achse verschwenkbares Abtastelement 104, insbesondere einen ersten Scanspiegel, und ein zweites, um eine zweite Achse verschwenkbares Abtastelement 105, insbesondere einen zweiten Scanspiegel, umfasst Das Lichtbündel kann in der Scaneinrichtung eine entsprechende Ablenkung erfahren. Die erste Abtasteinheit 104 ist entgegen der Lichtrichtung „hinter” einer mit einer Objektivpupille 109 konjugierten Ebene, die Abtasteinheit 105 „vor” dieser angeordnet.A light beam of a manipulation beam within the variable telescope system 101 is shown in the form of solid lines, which illustrate the marginal rays and the directional beam or the optical axis of the light beam. The light beam is from the variable telescope system 101 collimated in a scanning device irradiated, in the example shown, a first, pivotable about a first axis sensing element 104 , in particular a first scanning mirror, and a second scanning element pivotable about a second axis 105 , in particular a second scanning mirror, comprises The light beam can undergo a corresponding deflection in the scanning device. The first scanning unit 104 is opposite to the light direction "behind" one with an objective pupil 109 conjugate level, the scanning unit 105 Arranged in front of it.

Befinden sich die Scaneinheiten 104 und 105 im Grundzustand, kann das Lichtbündel, das hier weiterhin in Form durchgezogener Linien, die die Randstrahlen und den Richtungsstrahl bzw. die optische Achse des Lichtbündels veranschaulichen, dargestellt ist, gegenüber der optischen Achse eines Okulars 106 und einer Tubuslinse 107, die gemeinsam ein Kepler-Fernrohrsystem 108 bilden, und durch die Objektivpupille 109 und das eigentliche Objektiv 110 auf eine Fokusposition objektseitig des Objektivs 110 fokussiert werden. Das Lichtbündel ist hier zusätzlich mit 111 bezeichnet.Are the scanning units located? 104 and 105 In the ground state, the light beam, which continues to be shown here in the form of solid lines, which illustrate the marginal rays and the directional beam or the optical axis of the light beam, with respect to the optical axis of an eyepiece 106 and a tube lens 107 , which together form a Kepler telescope system 108 form, and through the lens pupil 109 and the actual lens 110 on a focus position object side of the lens 110 be focused. The light beam is here additionally 111 designated.

Durch Verschwenken des ersten Abtastelements 104 um die erste Achse lässt sich eine Ablenkung des Lichtbündels erzielen. Ein entsprechend abgelenktes Lichtbündel ist hier in Form punktierter Linien, die die Randstrahlen und den Richtungsstrahl bzw. die optische Achse des Lichtbündels veranschaulichen, dargestellt und zusätzlich mit 112 bezeichnet. Durch Verschwenken des zweiten Abtastelements 105 um die zweite Achse lässt sich ebenfalls eine Ablenkung des Lichtbündels erzielen. Ein entsprechend abgelenktes Lichtbündel ist hier in Form gestrichelter Linien, die ebenfalls die Randstrahlen und den Richtungsstrahl bzw. die optische Achse des Lichtbündels veranschaulichen, dargestellt und zusätzlich mit 113 bezeichnet. Der Verlauf der jeweiligen Lichtbündel zwischen dem ersten und dem zweiten Abtastelement 104, 105 ist jeweils der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt. Zur Ansteuerung der Abtastelemente 104, 105 bzw. der Abtasteinrichtung ist eine Steuereinrichtung 120 vorgesehen und beispielsweise über geeignete Steuerleitungen angebunden.By pivoting the first scanning element 104 A deflection of the light beam can be achieved around the first axis. A correspondingly deflected light beam is shown here in the form of dotted lines, which illustrate the marginal rays and the directional beam or the optical axis of the light beam, and additionally with 112 designated. By pivoting the second sensing element 105 A deflection of the light beam can likewise be achieved around the second axis. A corresponding deflected light beam is here in the form of dashed lines, which also illustrate the marginal rays and the directional beam or the optical axis of the light beam, shown and additionally with 113 designated. The course of the respective light bundles between the first and the second scanning element 104 . 105 is in each case not shown for the sake of clarity. For controlling the scanning elements 104 . 105 or the scanning device is a control device 120 provided and connected for example via suitable control lines.

Bezüglich der Beleuchtung entspricht das dargestellte System im Wesentlichen dem in der Literatur Publizierten (siehe beispielsweise 9.2 in E. H. K. Stelzer, The Intermediate Optical System of Laser-Scanning Confocal Microscopes, Kapitel 9 J. B. Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3. Auflage 2006, Springer-Verlag.With regard to lighting, the illustrated system essentially corresponds to that published in the literature (see, for example, US Pat 9.2 in EHK Stelzer, The Intermediate Optical System of Laser-Scanning Confocal Microscopes, Chapter 9 JB Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Edition 2006, Springer-Verlag.

Wie eingangs erwähnt, kann bei einer Weitfelddetektion bei einer Verwendung von Objektiven mit residualem Farblängsfehler zwischen Manipulationswellenlänge und Detektionswellenlänge eine axiale Übereinstimmung der beiden Fokusebenen dadurch bewerkstelligt werden, dass das für unendliche bildseitige Abbildungslänge (also für die Verwendung mit einer Tubuslinse) korrigierte Objektiv im Manipulationsstrahlengang mit einer von unendlich verschiedenen Eingangsschnittweite bestrahlt wird, also mit vorfokussiertem Licht anstelle von kollimiertem Licht.As mentioned above, in a wide-field detection when using lenses with residual Farblängsfehler between manipulation wavelength and detection wavelength axial coincidence of the two focal planes can be accomplished that for infinite image-side imaging length (ie for use with a tube lens) corrected lens in the manipulation beam path with is irradiated with an infinitely different input incision, so with pre-focused light instead of collimated light.

Dies ist in 1B veranschaulicht, die schematisch einen Strahlengang eines Manipulationsstrahls in einem Weitfeldmikroskop 100 bei nichtkollimierter Abtastung zeigt. Bei dieser wird, wie hier aus Gründen der Anschaulichkeit sehr stark übertrieben dargestellt, das Lichtbündel vorfokussiert in die Scaneinrichtung und damit auch das Objektiv 110 eingestrahlt. Die Darstellung ist insbesondere deshalb nichtrealistisch und damit übertrieben, als ein Brennpunkt des Lichtbündels jeweils weiterhin zwischen dem Okular 106 und der Tubuslinse 107 und nicht, wie in 1B gezeigt, zwischen dem Abtastelement 105 und dem Okular 106 liegt. Im Regelfall wird, wie erwähnt, lediglich eine weitaus geringfügigere Fokussierung eines entsprechenden Lichtbündels vorgenommen, um einen Farblängsfehler auszugleichen.This is in 1B schematically illustrates a beam path of a manipulation beam in a wide-field microscope 100 in uncollimated sampling. In this case, as shown here very clearly exaggerated for reasons of clarity, the light beam is pre-focused into the scanning device and thus also the objective 110 irradiated. The representation is therefore in particular unrealistic and thus exaggerated, as a focal point of the light beam in each case continues between the eyepiece 106 and the tube lens 107 and not, as in 1B shown between the sensing element 105 and the eyepiece 106 lies. As a rule, as mentioned, only a much smaller focus of a corresponding light beam is made to compensate for a longitudinal chromatic aberration.

Die Erläuterungen zu 1A gelten im Wesentlichen weiter für 1B, mit dem Unterschied, dass hier durch Verstellen des variablen Fernrohrsystems 101 bzw. der ersten Linse oder Linsengruppe 102 gegenüber der zweiten Linse oder Linsengruppe 103 das Licht nun mit einer Schlussschnittweite ungleich Unendlich, also nicht kollimiert abgestrahlt wird. Dies hat zur Folge, dass bei der Nutzung des Abtastsystems zur Beleuchtung der Objektivpupille unter einem Winkel, also zur Beleuchtung eines Punkts abseits der optischen Achse im Objekt, ein lateraler Versatz der Ausleuchtung in der hinteren Brennebene des Objektivs eine laterale Ablage im Objekt bewirkt.The explanations to 1A essentially continue to apply for 1B , with the difference that here by adjusting the variable telescope system 101 or the first lens or lens group 102 opposite to the second lens or lens group 103 the light is now radiated with a final incision unequal to infinity, that is not collimated. As a result, when using the scanning system for illuminating the objective pupil at an angle, ie for illuminating a point away from the optical axis in the object, a lateral offset of the illumination in the rear focal plane of the objective effects a lateral deposition in the object.

In 2A ist eine Ausschnittsvergrößerung des Bereichs A der 1A und in 2B ist eine Ausschnittsvergrößerung des Bereichs B der 1B dargestellt. Hierbei ist jeweils eine Fokusebene 114 gezeigt, auf die die Lichtbündel 111, 112 und 113 fokussiert werden. Fokuspositionen sind mit 115 angegeben. Die Ausschnittvergrößerung gemäß 2B zeigt eine Abweichung der lateralen Positionen der Lichtbündel 112 und 113 in der Fokusebene bei Benutzung der unterschiedlichen Abtastelemente 104 und 105. So ist im Vergleich zur Referenzanordnung gemäß 1A (Ausschnittsvergrößerung A gemäß 2A) bei Benutzung des Abtastelements 104 die laterale Position achsferner, bei Benutzung des Abtastelements 105 die Position hingegen achsnäher.In 2A is a partial enlargement of the area A of 1A and in 2 B is a detail enlargement of the area B of 1B shown. Here is in each case a focal plane 114 shown on the the light bundles 111 . 112 and 113 be focused. Focus positions are with 115 specified. The cut-out enlargement according to 2 B shows a deviation of the lateral positions of the light beams 112 and 113 in the focal plane using the different scanning elements 104 and 105 , So is compared to the reference arrangement according to 1A (Detail enlargement A according to 2A ) using the sensing element 104 the lateral position farther away when using the sensing element 105 the position, however, closer to the axis.

Die Abtastelemente 104 und 105 sind, wie erwähnt, jeweils um zwei Achsen verschwenkbar, die in einem realen Mikroskop zueinander senkrecht stehen. Damit wird durch die Verschwenkung der Abtastelemente 104 und 105 eine Abtastung entlang zueinander senkrechter Achsen vorgenommen, die im Falle der Darstellung gemäß der 1A, 2A, 1B und 2B auch eine Verlagerung des Fokuspunkts objektseitig des Objektivs aus der Papierebene heraus bewirken würde. Zur Veranschaulichung des unterschiedlichen Effekts einer Verschwenkung der Abtastelemente 104 und 105 im Falle der nichtkollimierten Abtastung im Vergleich zu einer kollimierten Abtastung ist in den genannten Figuren daher eine Abtastung entlang derselben Achsen dargestellt. In den 1A und 2A würde auch eine Abtastung senkrecht zur Papierebene dieselbe Verlagerung des Fokuspunkts in dieser Richtung bewirken, wohingegen sich gemäß 1B und 2B ein entsprechender Unterschied einstellen würde.The scanning elements 104 and 105 are, as mentioned, each pivotable about two axes, which are perpendicular to each other in a real microscope. This is done by the pivoting of the sensing elements 104 and 105 a scan taken along mutually perpendicular axes, which in the case of the illustration according to the 1A . 2A . 1B and 2 B would also cause a shift of the focal point on the object side of the lens out of the plane of the paper out. To illustrate the different effect of pivoting the sensing elements 104 and 105 in the case of uncollimated scanning, as compared to a collimated scan, therefore, a scan along the same axes is shown in these figures. In the 1A and 2A Also, a scan perpendicular to the plane of the paper would cause the same shift of the focal point in that direction, whereas according to FIG 1B and 2 B would make a difference.

3 veranschaulicht eine Ablage einer Trajektorie objektseitig eines Objektivs bei kollimierter und nichtkollimierter Abtastung. Zu dem zugrunde liegenden Strahlengang sei auf die 1A bzw. 1B verwiesen. Ziel ist eine quadratförmige Abtastung. Die Abtastung mit einem kollimierten Lichtbündel (vgl. 1A) ist mit 301, jene mit einem nichtkollimierten Lichtbündel (vgl. 1B) mit 302 bezeichnet. Wie ersichtlich, ergibt sich bei nichtkollimierter Abtastung eine deutliche Abweichung. 3 FIG. 9 illustrates a drop of a trajectory on the object side of an objective in the case of collimated and uncollimated scanning. The underlying beam path is on the 1A respectively. 1B directed. The goal is a square scan. The scanning with a collimated light beam (see. 1A ) is with 301 , those with a non-collimated light bundle (cf. 1B ) With 302 designated. As can be seen, results in uncollimated sampling a significant deviation.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

106106: Okulareyepiece
107107: Tubuslinsetube lens
108108: Kepler-FernrohrKepler telescope
109109: Objektivpupilleobjective pupil
110110: Objektivlens
111111: Lichtbündellight beam
112112: Lichtbündellight beam
113113: Lichtbündellight beam
114114: Fokusebenefocal plane
115115: Zielpositiontarget position
120120: Steuereinrichtungcontrol device
301301: Trajektorie bei kollimierter AbtastungTrajectory with collimated sampling
302302: Trajektorie bei kollimierter AbtastungTrajectory with collimated sampling

Claims

Method for illuminating focus positions ( 115 ) on the object side of a lens ( 110 ) of a microscope ( 100 ), in which by using a side of the lens ( 110 ) arranged scanning device ( 104 . 105 ) a light beam ( 111 . 112 . 113 ) and into the lens ( 110 ) is irradiated, characterized in that the light beam ( 111 . 112 . 113 ) in non-collimated state into the lens ( 110 ) is irradiated, and that the scanning device ( 104 . 105 ) is controlled such that in each case one by the non-collimated state of the light beam ( 111 . 112 . 113 ) relative to a collimated reference state conditional storage of the focus positions ( 115 ) is compensated.

Method according to Claim 1, in which the microscope ( 100 ) is designed for wide-field detection and / or wide-field viewing.

Method according to Claim 1 or 2, in which the scanning device ( 104 . 105 ) is driven using target values describing the focus positions and correction values describing the bin.

Method according to Claim 3, in which the correction values are predetermined at least in part using an analytical model.

Method according to Claim 3 or 4, in which the correction values are predetermined at least in part by a parameterization of a numerical model.

Method according to one of Claims 3 to 5, in which the correction values are determined at least partially experimentally.

Method according to one of Claims 3 to 6, in which the correction values are at least partly stored electronically.

Method according to one of the preceding claims 1 to 7, wherein the light beam ( 111 . 112 . 113 ) in two or more different degrees of focusing in the lens ( 100 ) is irradiated.

The method of claim 8, wherein the bin is compensated for the two or more different degrees of focus.

Method according to one of the preceding claims 1 to 9, in which the scanning device ( 104 . 105 ) Comprises sensing elements selected from galvanometer mirrors, acousto-optic deflectors, and electro-optic deflectors.

Method according to one of the preceding claims, in which a microscopic object in the object plane is illuminated by sequentially illuminating a plurality of focus positions ( 115 ) is scanned.

Microscope ( 100 ) used to illuminate focus positions ( 115 ) on the object side of a lens ( 110 ) of the microscope ( 100 ) a scanning device ( 104 . 105 ) having a light beam ( 111 . 112 . 113 ) and into the lens ( 110 ), characterized by a telescope system ( 101 ), which the light beam ( 111 . 112 . 113 ) in non-collimated state into the lens ( 110 ), and by a control device ( 120 ), which controls the scanning device ( 104 . 105 ) such that each one due to the uncollimated state of the light beam ( 111 . 112 . 113 ) relative to a collimated reference state conditional storage of the focus positions ( 115 ) is compensated.

Microscope ( 100 ) according to claim 12, arranged for carrying out a method according to one of claims 1 to 11.