DE102011051086A1 - Method for imaging fluorescent dye with labeled structure in sample, involves emitting fluorescent light in form of detectable photons, and assigning image of structure from location to photons over repetitive scanning of scanning area - Google Patents

Method for imaging fluorescent dye with labeled structure in sample, involves emitting fluorescent light in form of detectable photons, and assigning image of structure from location to photons over repetitive scanning of scanning area Download PDF

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Abstract

The method involves scanning sample (21) in scanning area repeatedly. The fluorescent light (22) emitted from scanning region is detected and the respective location is assigned to focal point. The scanning conditions are shifted relative to sample. The light intensities of light intensity distribution characteristics and concentration of fluorescent dye in scanning area are matched, so that fluorescent light in the form of detectable photons is emitted from scanning area, and image of structure assembled from location is assigned to photons over repetitive scanning of scanning area. An independent claim is included for device for imaging fluorescent dye with labeled structure in sample.

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNGTECHNICAL FIELD OF THE INVENTION

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur in einer Probe, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patenanspruchs 1 aufweist, sowie auf eine Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens mit den Merkmalen des nebengeordneten Patentanspruchs 9.The invention relates to a method for imaging a structure marked with a fluorescent dye in a sample having the features of the preamble of the independent patent claim 1, and to an apparatus for carrying out such a method having the features of the independent claim 9.

Die Erfindung fällt damit auf das Gebiet der Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die hochauflösende Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie, bei der Maßnahmen getroffen sind, die es erlauben, aus einem Abtastbereich einer Probe emittiertes Fluoreszenzlicht mit höherer Ortsauflösung als der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts einem Ort der Probe zuzuordnen. Dieser Ort der Probe, bei dem es sich tatsächlich um einen Bereich um den Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichtstrahls mit den Abmessungen der erreichten räumlichen Auflösung handelt, wird hier auch als Messbereich bezeichnet. Mit dem "Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichtstrahls" wird hierbei auf den geometrischen Fokuspunkt Bezug genommen. The invention thus falls within the field of scanning fluorescence microscopy. In particular, the present invention relates to high-resolution scanning fluorescence microscopy, in which measures are taken which allow to associate fluorescence light emitted from a scanning region of a sample with a higher spatial resolution than the diffraction limit at the wavelength of the excitation light to a location of the sample. This location of the sample, which is actually an area around the focal point of the focused excitation light beam with the dimensions of the achieved spatial resolution, is also referred to herein as a measurement area. The "focus point of the focused excitation light beam" refers to the geometric focal point.

Die genannten Maßnahmen sind in der Regel damit verbunden, dass die Probe mit einer Lichtintensitätsverteilung abgetastet wird, die sich über ein größeres Volumen erstreckt als es der Ortsauflösung bei der Zuordnung des Fluoreszenzlichts zu dem jeweiligen Ort der Probe entspricht. Dies hat zur Folge, dass beim Abtasten der Probe mit der Lichtintensitätsverteilung die Probe bereits erheblichen Lichtintensitäten ausgesetzt worden ist, bevor sie von dem Messbereich erreicht wird. The measures mentioned are generally associated with the sample being scanned with a light intensity distribution which extends over a larger volume than corresponds to the spatial resolution in the assignment of the fluorescent light to the respective location of the sample. As a result, when the sample is scanned with the light intensity distribution, the sample has already been exposed to significant light intensities before being reached by the measurement area.

Bereits bei der konfokalen Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie können diese Lichtintensitäten, denen die Probe vor dem eigentlichen Messen, d. h. dem Ermitteln der lokalen Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe, ausgesetzt wird, unerwünschte Folgen haben, wie beispielsweise ein teilweises Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs. Bei der hochauflösenden Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie, bei der neben dem Anregungslichtstrahl ein weiterer Lichtstrahl, so wie ein Stimulationslichtstrahl in der STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie, eingesetzt wird, können die dem eigentlichen Messbereich vorlaufenden Lichtintensitäten und deren negative Auswirkungen sehr groß werden. Dies gilt insbesondere dann, wenn die räumliche Auflösung durch hohe Lichtintensitäten dieses zusätzlichen Lichtstrahls maximiert wird. Empfindliche Fluoreszenzfarbstoffe sind deshalb für die bisher bekannten Verfahren der hochauflösenden Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie nicht geeignet, da sie vor dem Erreichen mit dem Messbereich bereits mit so hohen Intensitäten des Anregungslichtstrahls und eines Stimulationslichtstrahls beaufschlagt werden, dass sie vollständig gebleicht sind.Already in confocal scanning fluorescence microscopy, these light intensities, the sample before the actual measurement, d. H. upon detecting the local concentration of the fluorescent dye in the sample, may have undesirable consequences such as partial bleaching of the fluorescent dye. In the high-resolution scanning fluorescence microscopy, in which in addition to the excitation light beam, another light beam, such as a stimulation light beam in the STED scanning fluorescence microscopy is used, the light intensities leading to the actual measuring range and their negative effects can be very large. This is especially true when the spatial resolution is maximized by high light intensities of this additional light beam. Sensitive fluorescent dyes are therefore not suitable for the hitherto known methods of high-resolution scanning fluorescence microscopy because they are already subjected to such high intensities of the excitation light beam and a stimulation light beam before reaching the measuring range that they are completely bleached.

STAND DER TECHNIKSTATE OF THE ART

Ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 9 sind aus der WO 2010/069987 A1 bekannt. Dieses Dokument befasst sich mit der konstruktiven Ausgestaltung eines Rasterscanners, der die miteinander kombinierten Anregungs- und Stimulationslichtstrahlen so gegenüber der Pupille einer gemeinsamen fokussierenden Optik dynamisch ausrichtet, dass eine Nullstelle der Intensitätsverteilung des Stimulationslichts am Fokuspunkt des Anregungslichts über den gesamten Abtastbereich erhalten bleibt.A method having the features of the preamble of independent claim 1 and a device having the features of independent claim 9 are known from WO 2010/069987 A1 known. This document deals with the structural design of a raster scanner, which dynamically aligns the excitation and stimulation light beams combined with respect to the pupil of a common focusing optics such that a zero point of the intensity distribution of the stimulation light at the focal point of the excitation light is maintained over the entire scanning range.

Aus der DE 10 2005 027 896 A1 sind ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des nebengeordneten Patentanspruchs 9 bekannt, bei denen durch Bereitstellen der Lichtintensitätsverteilung in Pulsen mit vergleichsweise großen zeitlichen Abständen und/oder durch vergleichsweise schnelles Abtasten der Probe mit der Lichtintensitätsverteilung dieselben Bereiche der Probe nur in einem optimierten zeitlichen Wiederholungsabstand der Lichtintensitätsverteilung ausgesetzt werden. Auf diese Weise wird die Intensität des von der Probe erhältlichen Fluoreszenzlichts erhöht, weil die Rate, mit der der jeweilige Fluoreszenzfarbstoff aus einem angeregten Zwischenzustand durch weitere Anregung in einen permanenten oder nur langsam abklingenden Dunkelzustand gelangt, erheblich reduziert wird. Anders gesagt wird mit einem relativ großen Wiederholungsabstand des Beaufschlagens jedes einzelnen Bereichs der Probe mit der Lichtintensitätsverteilung die in einem bestimmten Zeitraum von der gesamten Probe erhältliche Menge an Fluoreszenzlicht maximiert. Konkret wird dazu beispielsweise eine Wiederholungsfrequenz einer gepulsten Lichtintensitätsverteilung von 80 MHz auf 50 kHz abgesenkt. Diese bekannte Vorgehensweise reduziert auch eine Neigung des Fluoreszenzfarbstoffs, unter Einwirkung der Lichtintensitätsverteilung zu bleichen, weil eine stärkere Besetzung von angeregten Zuständen, aus denen heraus eine photochemische Zerstörung des Fluoreszenzfarbstoffs erfolgt, vermieden wird. Das photochemische Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs ist aber nicht die der DE 10 2005 027 896 A1 zugrunde liegende Problematik. From the DE 10 2005 027 896 A1 For example, a method having the features of independent claim 1 and a device having the features of the preamble of independent patent claim 9 are known in which the same is provided by providing the light intensity distribution in pulses having comparatively large time intervals and / or by relatively fast scanning the sample with the light intensity distribution Sections of the sample can be exposed only at an optimized time repetition distance of the light intensity distribution. In this way, the intensity of the fluorescence light obtainable from the sample is increased because the rate at which the respective fluorescent dye passes from an excited intermediate state by further excitation into a permanent or only slowly decaying dark state is considerably reduced. In other words, with a relatively large repetition interval of exposing each individual area of the sample to the light intensity distribution, the amount of fluorescent light available from the entire sample in a given period of time is maximized. Specifically, for example, a repetition frequency of a pulsed light intensity distribution is lowered from 80 MHz to 50 kHz. This known procedure also reduces the tendency of the fluorescent dye to bleach under the influence of the light intensity distribution, because a stronger occupation of excited states, out of which a photochemical destruction of the fluorescent dye takes place, is avoided. The photochemical bleaching of the fluorescent dye is not that of DE 10 2005 027 896 A1 underlying problem.

Wenn gemäß der DE 10 2005 027 896 A1 die Abtastgeschwindigkeit erhöht wird, mit der die jeweilige Probe abgetastet wird, werden die Photonen von den Probe vorzugsweise mit einem ein- oder zweidimensionalen Lichtsensorarray registriert, auf das zumindest ein Teil der Probe zeitlich invariant abgebildet wird. Der sich beim Abtasten der Probe gegenüber der Probe verschiebende Fokuspunkt des Fluoreszenzlichts wird so fortlaufend auf andere Lichtsensorarrays abgebildet, wobei jedoch derselbe Lichtsensor immer Photonen aus demselben Bereich der Probe registriert. So ist mit dem schnellen Abtasten der Probe kein Problem bei der Trennung von Photonen aus verschiedenen Bereichen der Probe verbunden. Das Lichtsensorarray kann eine Kamera, insbesondere eine elektronische Kamera, wie beispielsweise eine CCD- oder CMOS-Kamera sein. Wenn in diesem Zusammenhang in der DE 10 2005 027 896 A1 von Photonen die Rede ist, geht es nicht darum, mit dem Lichtsensorarray einzelne Photonen, sondern Lichtintensitäten des von der Probe kommenden Fluoreszenzlichts zu erfassen.If according to the DE 10 2005 027 896 A1 the scanning speed is increased, with which the respective sample is scanned, the Photons of the sample are preferably registered with a one- or two-dimensional light sensor array, on which at least part of the sample is imaged in a time-invariant manner. The focal point of the fluorescent light which shifts when the sample is scanned relative to the sample is thus continuously imaged onto other light sensor arrays, but the same light sensor always registers photons from the same region of the sample. Thus, fast sampling of the sample is not associated with a problem in separating photons from different regions of the sample. The light sensor array may be a camera, in particular an electronic camera, such as a CCD or CMOS camera. If in this context in the DE 10 2005 027 896 A1 It is not a question of photons with the Lichtsensorarray single photons, but to capture light intensities of the fluorescent light coming from the sample.

AUFGABE DER ERFINDUNGOBJECT OF THE INVENTION

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur einer Probe aufzuzeigen, die die Durchführung hochauflösender Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie auch mit gegenüber Bleichen höchstempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen erlauben.The invention has for its object to provide a method and apparatus for imaging a marked with a fluorescent dye structure of a sample, which allow the implementation of high-resolution scanning fluorescence microscopy also with respect to bleaching highly sensitive fluorescent dyes.

LÖSUNGSOLUTION

Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des nebengeordneten Patentanspruchs 9 gelöst. The object of the invention is achieved by a method having the features of the independent patent claim 1 and a device having the features of the independent claim 9.

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in den abhängigen Patentansprüchen definiert.Preferred embodiments of the method and the device according to the invention are defined in the dependent claims.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDESCRIPTION OF THE INVENTION

Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur einer Probe, bei dem die Probe in einem Abtastbereich mit einer um einen Fokuspunkt eines fokussierten Anregungslichtstrahls lokalisierten Lichtintensitätsverteilung wiederholt abgetastet wird und aus dem Abtastbereich emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und dem jeweiligen Ort des Fokuspunkts zugeordnet wird, werden die Abtastbedingung insgesamt so eingestellt, dass das Fluoreszenzlicht in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Abtastbereich emittiert wird. Ein Bild der Struktur wird dann aus den Orten zusammengesetzt, die den detektierten Photonen während mehrerer Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zugeordnet wurden. In a method according to the invention for imaging a structure of a sample marked with a fluorescent dye, in which the sample is repeatedly scanned in a scanning region with a light intensity distribution located around a focal point of a focused excitation light beam and fluorescent light emitted from the scanning region is detected and assigned to the respective location of the focal point , the scanning conditions are adjusted as a whole so that the fluorescent light in the form of individually detectable photons is emitted from the scanning region. An image of the structure is then assembled from the locations assigned to the detected photons during multiple repetitions of scanning the scan area.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Rate, mit der Bilder der interessierenden Struktur erstellt werden, viel kleiner als die Rate, mit der der Abtastbereich abgetastet wird. Während jedes Abtastens des Abtastbereichs mit der um den Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichtstrahls lokalisierten Lichtintensitätsverteilung werden typischerweise nur wenige Photonen detektiert und einzeln dem jeweiligen Ort des Fokuspunkts zugeordnet. Erst aus einer größeren Zahl solcher Zuordnungen über mehrere Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs hinweg entsteht ein zunehmend vollständiger werdendes Bild der interessierenden Struktur. In the method of the invention, the rate at which images of the structure of interest are made is much smaller than the rate at which the scan area is scanned. During each scanning of the scanning area with the light intensity distribution localized around the focal point of the focused excitation light beam, typically only a few photons are detected and individually associated with the respective location of the focal point. It is only from a larger number of such assignments over several repetitions of scanning the scanning range that an increasingly complete picture of the structure of interest is created.

Indem jedes detektierte Photon bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Berücksichtigung findet, findet ein jedes Molekül des Fluoreszenzfarbstoffs, mit dem die interessierende Struktur markiert ist, bei dem Bild der interessierenden Struktur Berücksichtigung, soweit es nur ein einzelnes Photon emittiert hat, das anschließend detektiert wurde. Allein deshalb ist das erfindungsgemäße Verfahren auch für hochempfindliche, d. h. stark zum Bleichen neigende Fluoreszenzfarbstoffe geeignet. Darüber hinaus bedeutet die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs zur Emission von Fluoreszenzlicht im Umfang nur weniger Photonen während jedes Abtastens des Abtastbereichs, dass der Fluoreszenzfarbstoff in dem gesamten Abtastbereich während jeder Wiederholung des Abtastens des Abtastbereichs mit einer nur sehr geringen Wahrscheinlichkeit gebleicht wird. Dieser Zusammenhang gilt immer, weil die Wahrscheinlichkeit des Bleichens mit der Wahrscheinlichkeit der Anregung von Fluoreszenzlicht positiv korreliert ist, gleich wie die Zusammenhänge im Einzelnen aussehen.By taking into account each detected photon in the method according to the invention, each molecule of the fluorescent dye with which the structure of interest is marked is taken into account in the image of the structure of interest, insofar as it emitted only a single photon which was subsequently detected. For this reason alone, the inventive method is also for highly sensitive, d. H. highly suitable for bleaching fluorescent dyes. In addition, the excitation of the fluorescent dye to emit fluorescent light in the scope of only a few photons during each scanning of the scanning area means that the fluorescent dye is bleached in the entire scanning area during each repetition of scanning of the scanning area with only a very low probability. This relationship always applies because the likelihood of bleaching is positively correlated with the likelihood of fluorescence excitation, no matter what the context looks like.

Dies bedeutet insbesondere, dass mit dem Messbereich, der sich innerhalb der lokalisierten Lichtintensitätsverteilung, mit der der Abtastbereich abgetastet wird, um den Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichtstrahls erstreckt, jeder Punkt des Abtastbereichs erreicht wird, bevor selbst ein hochempfindlicher, d. h. stark zum Bleichen neigender Fluoreszenzfarbstoff zu relevanten Teilen gebleicht ist. Dies gilt selbst dann, wenn die Lichtintensitätsverteilung neben dem Anregungslichtstrahl einen weiteren, zur Erhöhung der Ortsauflösung eingesetzten Lichtstrahl, so wie einen Stimulationslichtstrahl in der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie, umfasst, dessen Intensitätsverteilung an dem Fokuspunkt des Anregungslichtstrahls zwar eine Nullstelle aber im Umfeld des Fokuspunkts des Anregungslichtstrahls eine sehr hohe Intensität aufweist. This means, in particular, that with the measuring range which extends within the localized light intensity distribution with which the scanning region is scanned, around the focal point of the focused excitation light beam, each point of the scanning region is reached, before even a highly sensitive, i. H. strongly bleaching-prone fluorescent dye is bleached to relevant parts. This is true even if the light intensity distribution comprises, in addition to the excitation light beam, a further light beam used to increase the spatial resolution, such as a stimulation light beam in STED fluorescence light microscopy whose intensity distribution at the focal point of the excitation light beam is indeed a zero but in the vicinity of the focal point of the excitation light beam has a very high intensity.

Die bleichende Wirkung eines solchen Stimulationslichtstrahls basiert üblicherweise auf der Wechselwirkung mit dem Anregungslichtstrahl. Wenn die Abtastbedingungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren so gewählt werden, dass nur einzelne, getrennt detektierbare Photonen aus dem Abtastbereich emittiert werden, ist dies gleichbedeutend damit, dass auch diese Wechselwirkung nur ein geringes Maß annimmt und damit nur mit geringer Wahrscheinlichkeit zum Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs führt.The bleaching effect of such a stimulation light beam is usually based on the interaction with the excitation light beam. If the scanning conditions in the method according to the invention are selected so that only individual, separately detectable photons are emitted from the scanning region, this means that this interaction also assumes only a small degree and thus leads to bleaching of the fluorescent dye with little probability.

Die Abtastbedingungen, mit denen erreicht wird, dass das Fluoreszenzlicht beim Abtasten in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Abtastbereich emittiert wird, umfassen neben der Abtastgeschwindigkeit, mit der der Fokuspunkt gegenüber der Probe verschoben wird, und den Lichtintensitäten der Lichtintensitätsverteilung insbesondere die Eigenschaften und die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Abtastbereich. Dabei kann zum Abstimmen der Abtastbedingungen auf den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff und die jeweilige Probe, wie schon erwähnt, die Lichtintensität des fokussierten Anregungslichtstrahls reduziert werden. Dies kann effektiv auch durch hochfrequentes Modulieren der Lichtintensität des fokussierten Anregungslichtstrahls realisiert werden. The scanning conditions, which are achieved by emitting the fluorescent light from the scanning region in the form of individually detectable photons, include, in addition to the scanning speed with which the focal point is shifted relative to the sample and the light intensities of the light intensity distribution, in particular the properties and the concentration of the fluorescent dye in the scanning area. In this case, to tune the scanning conditions to the respective fluorescent dye and the respective sample, as already mentioned, the light intensity of the focused excitation light beam can be reduced. This can be effectively realized by high-frequency modulating the light intensity of the focused excitation light beam.

Egal wie die Abtastbedingungen abgestimmt werden, um das erfindungsgemäße Kriterium der einzeln registrierbaren Photonen des Fluoreszenzlichts aus dem Abtastbereich einzuhalten, wird erreicht, dass die Belastung des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe bei jedem Abtasten des Abtastbereichs so klein bleibt, dass die Wahrscheinlichkeit des Bleichens eines bestimmten Moleküls des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe nur gering ist, bis es beim Abtasten in den Messbereich um den Fokuspunkt des Anregungslichtstrahls gelangt. Dass es in dem Messbereich zur Emission eines Photons durch Fluoreszenz angeregt wird, das auch detektiert wird, ist bei den Abtastbedingungen zwar ebenfalls nicht sehr wahrscheinlich. Diese Wahrscheinlichkeit ist aber viel höher als dann, wenn das betrachtete Molekül des Fluoreszenzfarbstoffs bereits vor dem ersten Gelangen in den Messbereich durch die dem Messbereich vorlaufenden Lichtintensitäten mit höchster Wahrscheinlichkeit gebleicht wäre.No matter how the scanning conditions are tuned to comply with the inventive criterion of individually recordable photons of fluorescent light from the scanning region, it is achieved that the load of the fluorescent dye in the sample remains so small each time the scanning region is scanned that the likelihood of bleaching a particular molecule of the fluorescent dye in the sample is only slight until it reaches the focal point of the excitation light beam during scanning into the measuring range. That it is excited in the measuring range for the emission of a photon by fluorescence, which is also detected, is also not very probable under the sampling conditions. However, this probability is much higher than if the observed molecule of the fluorescent dye were already bleached by the light intensities leading to the measurement range before the first gain in the measurement range with the highest probability.

Wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Abstimmen der Abtastbedingungen die Abtastgeschwindigkeit erhöht wird, wird der angestrebte Effekt der reduzierten Belastung des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe bei jedem Abtasten des Abtastbereichs erreicht, ohne dass sich die Durchführung des Verfahrens, bis ausreichend Photonen für ein Bild der interessierenden Struktur in der Probe registriert sind, lange hinzieht. Für das erfindungsgemäße verfahren kommt es nicht darauf an, die Emission nur weniger Photonen in einem bestimmten Zeitraum hervorzurufen, sondern die Emission nur weniger Photonen bei jeder Wiederholung des Abtastens des Abtastbereichs. Daher kann durch eine erhöhte Abtastgeschwindigkeit und eine damit erhöhte Frequenz, mit der der Abtastbereich abgetastet wird, die Ausbeute an Photonen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren schadlos erhöht werden.In the inventive method for tuning the scanning conditions, when the scanning speed is increased, the desired effect of reduced exposure of the fluorescent dye in the sample is achieved each time the scanning area is scanned without carrying out the process until there are enough photons for an image of the structure of interest are registered in the sample, long draws. For the method according to the invention, it is not important to cause the emission of only a few photons in a certain period, but the emission of only a few photons with each repetition of the scanning of the scanning region. Therefore, by an increased scanning speed and thus increased frequency at which the scanning is scanned, the yield of photons in the inventive method can be increased harmless.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können die räumlichen Verteilungen auch von gegenüber Bleichen hochempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen mit hochauflösender Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie, insbesondere mit STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie, erfasst werden.With the method according to the invention, the spatial distributions of fluorescent dyes which are highly sensitive to bleaching can also be detected with high-resolution scanning fluorescence microscopy, in particular with STED scanning fluorescence microscopy.

Konkret kann beim Abstimmen der Abtastbedingungen die Abtastgeschwindigkeit so hoch eingestellt werden, dass eine Pixel-Dwell-Time von kleinergleich 10 ns, vorzugsweise kleinergleich 7 ns und am meisten bevorzugt etwa 6 ns erreicht wird. Die Pixel-Dwell-Time ist die Zeit, binnen derer der geometrische Fokuspunkt eine Strecke zurücklegt, die der räumlichen Auflösung des jeweiligen Rasterfluoreszenzlichtmikroskopieverfahrens entspricht. Bei STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie liegt die räumliche Auflösung bei 20 nm. Entsprechend beträgt die Abtastgeschwindigkeit dann vorzugsweise etwa 3 nm/ns, d. h. 3 m/s oder etwa 10 km/h.Specifically, when tuning the sampling conditions, the sampling rate can be set so high that a pixel dwell time of less than or equal to 10 ns, preferably less than or equal to 7 ns, and most preferably about 6 ns, is achieved. The pixel dwell time is the time during which the geometric focus point travels a distance that corresponds to the spatial resolution of the respective scanning fluorescence light microscopy method. In STED scanning fluorescence microscopy, the spatial resolution is 20 nm. Accordingly, the scan speed is then preferably about 3 nm / ns, ie. H. 3 m / s or about 10 km / h.

Durch die geringe Anzahl von Photonen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren während jedes Abtastens des Abtastbereichs detektiert und einzelnen Orten der Probe zugeordnet werden, müssen die den einzelnen Photonen während allermindestens 3, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 100 und am meisten bevorzugt mindestens 1000 aufeinanderfolgenden Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zugeordnet wurden, zu einem Bild der Struktur zusammengesetzt werden. Due to the small number of photons detected in the inventive method during each scanning of the scanning area and assigned to individual locations of the sample, the individual photons must have at least 3, preferably at least 20, more preferably at least 100, and most preferably at least 1000 successive repetitions of scanning the scanning area have been combined to form an image of the structure.

Die während einer längeren Messperiode den einzelnen Photonen zugeordneten Orte der Probe können aber auch verwendet werden, um einen Film, d. h. eine Folge von zeitlich aneinander anschließenden Bildern der Probe zu generieren, indem aus den Orten, die den einzelnen Photonen während einer Vielzahl von aufeinanderfolgenden Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zugeordnet wurden, mehrere zeitlich aufeinanderfolgenden Bilder der Struktur zusammengesetzt werden. Dieses Zusammensetzen erfolgt im Auswertestadium des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das heißt, es kann ohne Informationsverlust ausprobiert werden, wie viele Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zusammengefasst werden müssen, um ein einzelnes Bild mit der gewünschten Informationsdichte bereitzustellen.However, the locations of the sample associated with the individual photons during a longer measurement period may also be used to form a film, i. H. generate a sequence of temporally contiguous images of the sample by composing several temporally successive images of the structure from the locations associated with the individual photons during a plurality of successive repetitions of scanning the scan area. This assembly takes place in the evaluation stage of the method according to the invention. That is, it can be tried without loss of information how many repetitions of scanning the scan area must be combined to provide a single image with the desired density of information.

Es versteht sich, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch alle anderen bekannten vorteilhaften Detailausgestaltungen zur Anwendung kommen können, wie sie aus der Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie grundsätzlich bekannt sind. Hierzu zählt es beispielsweise, den Abtastbereich auf solche Bereiche der Probe zu konzentrieren, in denen sich interessierende Strukturen befinden. Hierzu zählt es auch, das Abtastend des Abtastbereichs in einem ganz genau definierten Muster mit möglichst konstanter Abtastgeschwindigkeit und konstantem Zeilenvorschub durchzuführen. Ein definiertes Abtastmuster ist z. B. Voraussetzung dafür, den Ort des Fokuspunkts des Anregungslichtstrahls in der Probe, der einem einzelnen Photon des Fluoreszenzlichts aus dem Abtastbereich zugeordnet wird, allein aus dem Zeitpunkt der Detektion des Photons bestimmen zu können. Bei einer konstanten Abtastgeschwindigkeit und einem konstanten Zeilenvorschub können zum Beispiel die Ortskoordinaten des Orts des Fokuspunkts in der Probe aus Zählerständen von Zählern abgeleitet werden, von denen einer längs jeder Zeile und der zweite die Zeilenvorschübe zählt. It is understood that in the method according to the invention also all other known advantageous detailed embodiments can be used, as they are basically known from the scanning fluorescence microscopy. This includes, for example, concentrating the scanning region on those regions of the sample in which structures of interest are located. This also includes performing the scan end of the scan area in a well-defined pattern with as constant a scan speed as possible and a constant line feed. A defined scanning pattern is z. B. Prerequisite for being able to determine the location of the focal point of the excitation light beam in the sample, which is assigned to a single photon of the fluorescent light from the scanning, only from the time of detection of the photon. For example, at a constant sweep rate and a constant linefeed, the location coordinates of the location of the focus point in the sample may be derived from counts from counters, one counting along each line and the second counting the line feeds.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist eine Anregungslichtquelle zur Bereitstellung des Anregungslichtstrahls, ein Objektiv zum Fokussieren des Anregungslichtstrahls, einen Rasterscanner zum wiederholten Abtastens des Abtastbereichs mit der um den Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichtstrahls lokalisierten Lichtintensitätsverteilung, ein Detektor zum Detektieren des aus dem Abtastbereichs emittierten Fluoreszenzlichts und eine Auswerteeinrichtung auf, die das Fluoreszenzlicht dem jeweiligen Ort des Fokuspunkts zuordnet. Dabei ist eine Steuerung vorgesehen, die die Abtastbedingungen, mit denen der Abtastbereich abgetastet wird, so abstimmt, dass das Fluoreszenzlicht in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Abtastbereich emittiert wird. Dann setzt die Auswerteeinrichtung ein Bild der Struktur aus den Orten zusammen, die den detektierten Photonen während mehrerer Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zugeordnet wurden. An apparatus according to the invention for carrying out the method according to the invention comprises an excitation light source for providing the excitation light beam, a lens for focusing the excitation light beam, a raster scanner for repeatedly scanning the scanning area with the light intensity distribution located around the focal point of the focused excitation light beam, a detector for detecting the light emitted from the scanning area Fluorescence light and an evaluation, which assigns the fluorescent light to the respective location of the focal point. In this case, a control is provided which tunes the scanning conditions with which the scanning region is scanned in such a way that the fluorescent light is emitted in the form of individually detectable photons from the scanning region. Then, the evaluator assembles an image of the structure from the locations associated with the detected photons during several repetitions of scanning the scan area.

Die Anregungslichtquelle und eine etwaige Stimulationsquelle können jeweils einen Dauerstrichlaser aber auch einen hochfrequenzgepulsten Laser aufweisen. Der Rasterscanner weist typischerweise zumindest für das schnelle Scannen längs einer Zeile einen elektrooptischen Deflektor auf. Der Zeilenvorschub kann durch einen vergleichsweise langsameren Scanner beispielsweise auf Basis eines Galvanometers realisiert sein.The excitation light source and any stimulation source may each comprise a continuous wave laser but also a high frequency pulsed laser. The raster scanner typically has an electro-optical deflector at least for fast scanning along a line. The line feed can be realized by a comparatively slower scanner, for example based on a galvanometer.

Der Detektor der neuen Vorrichtung ist vorzugsweise ein Punktdetektor, dieser kann konfokal zu dem Fokuspunkt des Anregungslichtstrahls angeordnet sein. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen so genannten Hybriddetektor, der mehrere Detektoreinheiten aufweist, um auch dicht zeitlich aufeinanderfolgende Photonen einzeln zeitgenau detektieren zu können.The detector of the new device is preferably a point detector, which may be arranged confocally to the focal point of the excitation light beam. Particularly preferably, it is a so-called hybrid detector, which has a plurality of detector units in order to be able to detect photons which are closely spaced in time individually one after the other.

Weitere bevorzugte Details der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurden bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erläutert.Further preferred details of the device according to the invention have already been explained in connection with the method according to the invention.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile von allen erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Advantageous developments of the invention will become apparent from the claims, the description and the drawings. The advantages of features and of combinations of several features mentioned in the introduction to the description are merely exemplary and can come into effect alternatively or cumulatively without the advantages of all the embodiments according to the invention having to be achieved. Further features are the drawings - in particular the illustrated geometries and the relative dimensions of several components to each other and their relative arrangement and operative connection - refer. The combination of features of different embodiments of the invention or features of different claims is also possible and is hereby stimulated. This also applies to those features which are shown in separate drawings or are mentioned in their description. These features can also be combined with features of different claims.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGURENBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Die Erfindung wird im Folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert und beschrieben. The invention is explained in more detail below with reference to an embodiment with reference to the accompanying drawings and described.

1 zeigt den Aufbau eines STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskops als Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. 1 shows the construction of a STED scanning fluorescent light microscope as an embodiment of the device according to the invention.

2 zeigt illustriert das einmalige Abtasten eines Abtastbereichs mit einem Fokuspunkt eines Anregungslichtstrahls in dem STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop gemäß 1. 2 FIG. 11 illustrates the one-time scanning of a scanning area with a focal point of an excitation light beam in the STED scanning fluorescent microscope according to FIG 1 ,

3 zeigt ein Bild einer Struktur in einer Probe, das nach dem wiederholten Abtasten der Probe gemäß 2 aus den Orten generiert wurde, die dabei einzeln detektierten Photonen von Fluoreszenzlicht aus dem Abtastbereich zugeordnet wurden. 3 FIG. 12 shows an image of a structure in a sample that after repeated sampling of the sample according to FIG 2 was generated from the locations that were individually assigned photons of fluorescent light from the scanning assigned.

FIGURENBESCHREIBUNGDESCRIPTION OF THE FIGURES

Das in 1 als Beispiel für eine erfindungsgemäße Vorrichtung 1 illustrierte STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop 2 weist eine Anregungslichtquelle 3 in Form eines Lasers auf, der einen Anregungslichtstrahl 4 abgibt. Die Wellenlänge des Anregungslichtstrahls 4 wird hier durch ein akustisch-optisch einstellbares Filter 5 selektiert, um das Anregungslicht später chromatisch von Fluoreszenzlicht trennen zu können, das durch das Anregungslicht angeregt wird. Neben der Anregungslichtquelle 3 ist eine Stimulationslichtquelle 6 vorgesehen, die einen Stimulationslichtstrahl 7 abgibt, der mit einer Optik 8 geformt, einem Spiegel 9 zu einem dichroitischen Strahlteiler 10 umgelenkt und vor dem Auftreffen auf den dichroitischen Strahlteiler 10 mit einem Wellenfrontmodulator 11 bezüglich seiner Wellenfronten aberriert wird. Mit Hilfe des dichroitischen Spiegels 10 werden der Anregungslichtstrahl 4 und der Stimulationslichtstrahl 7 auf einer optischen Achse zusammengefasst. Auf dieser treten sie zunächst durch einen elektro-optischen Modulator 34 hindurch, bevor sie von einem Spiegel 12 umgelenkt werden und durch einen elektro-optischen Deflektor 13 hindurchtreten. Diesem folgt eine Optik 14 zur Strahlformung, eine Umlenkanordnung aus einem Spiegel 15 und einem zugleich als Bandpassfilter dienenden Spiegel 16. Anschließend lenkt ein weiterer Spiegel 17 die Lichtstrahlen in ein Objektiv 18, vor dem noch ein Galvanometer 19 und eine Phasenplatte 20 angeordnet sind. Das Objektiv 18 fokussiert die beiden Lichtstrahlen 4, 7 in einer Probe 21 auf einen gemeinsamen Fokuspunkt. Dabei weist das Anregungslicht des Anregungslichtstrahls 4 in dem Fokuspunkt seine maximale Intensität auf, während das Stimulationslichts des Stimulationslichtstrahls 7 hier aufgrund seiner aberrierten Wellenfronten eine Nullstelle hat. Da das Stimulationslicht des Stimulationslichts 7 fluoreszenzverhindernd wirkt, kann von dem Anregungslicht des Anregungslichtstrahls 4 angeregtes Fluoreszenzlicht praktisch nur aus dem Bereich unmittelbar um den Fokuspunkt des Anregungslichts 4 stammen und damit aus einem kleineren Bereich als einem beugungsbegrenzten Spot. Registriert wird das Fluoreszenzlicht 22 von der Probe 21 mit einem Detektor 23, der hinter dem Spiegel 16 angeordnet ist, wobei dessen Bandpassfilter auf die Wellenlänge des Fluoreszenzlichts 22 abgestimmt ist. Im Strahlengang des separierten Fluoreszenzlichts 22 sind hier zwei Spiegel 24 und 25, eine zweiteilige Optik 26 und eine Schlitzblende 27 vorgesehen. Aufgrund der Schlitzblende 27 ist die Anordnung des Detektors 23 in einer Richtung konfokal bezüglich des Fokuspunkts des Anregungslichtstrahls 4 in der Probe 21. Das separierte Fluoreszenzlicht 22 ist an dem Spiegel 16 aber noch nicht vollständig entscannt, weil Verschiebungen der Lichtstrahlen 4 und 7 mittels des elektro-optischen Deflektors 13 noch nicht rückgängig gemacht sind. Dieser elektrooptische Deflektor 13 dient zum schnellen zeilenweisen Scannen oder Abtasten eines Abtastbereichs in der Probe 21 mit dem Fokuspunkt des Anregungslichtstrahls. Demgegenüber ist das Galvanometer 19 für den etwas langsameren Vorschub zwischen den einzelnen Zeilen beim Scannen des Abtastbereichs vorgesehen. Der elektro-optische Modulator 34 kann genutzt werden, um beispielsweise beim Scannen einen Zeilenrücklauf ohne Beaufschlagung der Probe mit Anregungslicht und Stimulationslicht vorzusehen. Die Phasenplatte 20 dient zur Optimierung der Polarisation des Fluoreszenzlichts 22 im Hinblick auf seine Transmission bis zu und damit seine Detektionsausbeute in dem Detektor 23.This in 1 as an example of a device according to the invention 1 illustrated STED scanning fluorescence light microscope 2 has one Excitation light source 3 in the form of a laser emitting an excitation light beam 4 emits. The wavelength of the excitation light beam 4 is here by an acousto-optically adjustable filter 5 selected to later chromatically separate the excitation light of fluorescent light, which is excited by the excitation light. Next to the excitation light source 3 is a stimulation light source 6 provided that a stimulation light beam 7 who gives with an optic 8th shaped, a mirror 9 to a dichroic beam splitter 10 redirected and before hitting the dichroic beam splitter 10 with a wavefront modulator 11 aberrated with respect to its wavefronts. With the help of the dichroic mirror 10 become the excitation light beam 4 and the stimulation light beam 7 summarized on an optical axis. On this they first pass through an electro-optical modulator 34 through before going off a mirror 12 be redirected and through an electro-optical deflector 13 pass. This is followed by a look 14 for beam shaping, a deflection arrangement of a mirror 15 and at the same time serving as a bandpass filter mirror 16 , Then another mirror steers 17 the light rays in a lens 18 , in front of the still a galvanometer 19 and a phase plate 20 are arranged. The objective 18 focuses the two beams of light 4 . 7 in a sample 21 to a common focus point. In this case, the excitation light of the excitation light beam 4 in the focal point its maximum intensity, while the stimulation light of the stimulation light beam 7 here has a zero due to its aberrated wavefronts. Because the stimulation light of the stimulation light 7 prevents fluorescence, can from the excitation light of the excitation light beam 4 excited fluorescent light practically only from the area immediately around the focal point of the excitation light 4 come from a smaller area than a diffraction-limited spot. The fluorescence light is registered 22 from the sample 21 with a detector 23 , behind the mirror 16 is arranged, wherein the bandpass filter to the wavelength of the fluorescent light 22 is tuned. In the beam path of the separated fluorescent light 22 here are two mirrors 24 and 25 , a two-piece look 26 and a slit 27 intended. Due to the slit diaphragm 27 is the arrangement of the detector 23 in a direction confocal with respect to the focal point of the excitation light beam 4 in the sample 21 , The separated fluorescent light 22 is at the mirror 16 but not yet fully escaped, because shifts of the light rays 4 and 7 by means of the electro-optical deflector 13 not yet undone. This electro-optical deflector 13 Used for fast line-by-line scanning or scanning of a scan area in the sample 21 with the focal point of the excitation light beam. In contrast, the galvanometer 19 for the slightly slower feed between each line when scanning the scanning area provided. The electro-optical modulator 34 can be used, for example, during scanning to provide a line retrace without exposure to the sample with excitation light and stimulation light. The phase plate 20 serves to optimize the polarization of the fluorescent light 22 in terms of its transmission up to and thus its detection efficiency in the detector 23 ,

2 skizziert einen Abtastbereich 28, der mit dem Fokuspunkt 29 des Anregungslichtstrahls 4 gemäß 1 abgetastet wird. Dabei ist die Zeilenrichtung 30, in der ein schnelles Abtasten erfolgt, hier senkrecht und die Zeilenvorschubrichtung 31 hier waagerecht wiedergegeben. Beispielsweise möge jede Zeile 6 µm lang sein und binnen 2 µs abgetastet werden. Die Ortsauflösung in der STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie beträgt etwas 20 nm. Dies bedeutet, dass auf jede Zeile etwa 300 auflösbare Pixel entfallen, von denen jedes von dem Fokuspunkt 29 binnen weniger als 7 ns durchlaufen wird. In der Zeilenvorschubrichtung 21 erfolgt der Zeilenvorschub zwischen zwei benachbarten Zeilen um jeweils die Auflösungsgrenze von 20 nm (2 ist zwischen der Zeilenrichtung 30 und der Zeilenvorschubrichtung 31 nicht maßstabgerecht). Während des Abtastens des Abtastbereichs 28 mit dem Fokuspunkt 29 mit Hilfe des Detektors 23 gemäß 1 detektierte einzelne Photonen werden den Orten 32 zugeordnet, an denen sich der Fokuspunkt 29 während des Detektierens des jeweiligen Photons befand. Aus den derart über mehrere Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs 28 gewonnenen Informationen wird ein Bild zusammengesetzt, das die Verteilung des Fluoreszenzlichts von der Probe wiedergibt und damit eine Darstellung einer Struktur ist, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der dieses Fluoreszenzlicht emittiert, in der Probe markiert ist. 2 outlines a scanning area 28 that with the focus point 29 of the excitation light beam 4 according to 1 is scanned. Where is the row direction 30 , in which a fast scanning takes place, here perpendicular and the line feed direction 31 shown horizontally here. For example, let each line be 6 μm long and scanned within 2 μs. The spatial resolution in STED scanning fluorescence microscopy is about 20 nm. This means that each line has about 300 resolvable pixels, each of which is from the focal point 29 within less than 7 ns. In the line feed direction 21 the line feed takes place between two adjacent lines by the resolution limit of 20 nm ( 2 is between the row direction 30 and the line feed direction 31 not to scale). While scanning the scanning area 28 with the focus point 29 with the help of the detector 23 according to 1 Detected individual photons become the places 32 assigned, at which the focus point 29 while detecting the respective photon. From such over several repetitions of scanning the scan area 28 information obtained, an image is composed representing the distribution of the fluorescent light from the sample and thus a representation of a structure which is labeled with a fluorescent dye which emits this fluorescent light in the sample.

Ein solches Bild ist in 3 illustriert. Die Summe der einzelnen Orte 32 über eine Vielzahl von Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs 28 lässt die interessierende Struktur 33 deutlich werden. Ein solches Bild kann bei der beschriebenen Vorgehensweise auch dann aufgenommen werden, wenn der Fluoreszenzfarbstoff, mit dem die Struktur 33 markiert ist, hochempfindlich gegenüber einem Bleichen durch die auf ihn einwirkenden Lichtintensitäten des Stimulationslichtstrahls 7 und des Anregungslichtstrahls 4 ist, denen er ausgesetzt wird, bevor er in den Bereich des Fokuspunkts 29 gelangt. Indem die Abtastbedingungen hier so gewählt sind, dass bei jedem Abtastvorgang nur einzelne Photonen von Fluoreszenzlicht detektiert werden, ist bei jedem einzelnen Abtasten des Abtastbereichs nicht nur die Wahrscheinlichkeit der Emission von Fluoreszenzlicht sondern auch die Wahrscheinlichkeit des Bleichens des Fluoreszenzfaktors gering. Soweit ein Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs auftritt, erfolgt dies über viele Wiederholungen des Abtasten des Abtastbereichs über den gesamten Abtastbereich hinweg, so dass vor dem endgültigen Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs von allen seinen Molekülen, die über den Abtastbereich 28 verteilt sind, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit Photonen detektiert werden konnten. Bei herkömmlicher STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie hingegen, bei der an jedem Ort des Fokuspunkts 29 möglichst viel Fluoreszenzlicht aufgefangen wird, kann hingegen ein empfindlicher Fluoreszenzfarbstoff von den vorlaufenden Lichtintensitäten vollständig gebleicht werden, bevor er von dem eigentlichen Messpunkt erreicht wird.Such a picture is in 3 illustrated. The sum of the individual places 32 over a plurality of repetitions of scanning the scan area 28 leaves the structure of interest 33 become clear. Such an image can also be recorded in the procedure described if the fluorescent dye with which the structure 33 is highly sensitive to bleaching by the light intensities of the stimulation light beam acting on it 7 and the excitation light beam 4 he is exposed to before he enters the area of the focal point 29 arrives. Here, by selecting the sampling conditions such that only single photons of fluorescent light are detected in each scan, not only the probability of emission of fluorescent light but also the likelihood of bleaching of the fluorescence factor is small with each scan of the scan area. As far as bleaching of the fluorescent dye occurs, this is done over many repetitions of scanning the scan area over the entire scan area, such that prior to the final bleaching of the fluorescence dye from all of its molecules over the scan area 28 are distributed, with a high probability photons could be detected. In contrast, with conventional STED scanning fluorescence microscopy, at each location of the focal point 29 As much fluorescence light is collected, however, a sensitive fluorescent dye can be completely bleached from the leading light intensities before it is reached by the actual measuring point.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

11
Vorrichtung contraption
22
STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop STED scanning fluorescence light microscope
33
Anregungslichtquelle Excitation light source
44
Anregungslichtstrahl Excitation light beam
55
akustisch-optisch einstellbares Filter acousto-optically adjustable filter
66
Stimulationslichtquelle Stimulating light source
77
Stimulationslichtstrahl Stimulation light beam
88th
Optik optics
99
Spiegel mirror
1010
dichroitischer Strahlenteiler dichroic beam splitter
1111
Wellenfrontenmodulator Wavefront modulator
1212
Spiegel mirror
1313
elektro-optischer Deflektor electro-optical deflector
1414
Optik optics
1515
Spiegel mirror
1616
Spiegel mit Bandpassfilter Mirror with bandpass filter
1717
Spiegel mirror
1818
Objektiv lens
1919
Galvanometer galvanometer
2020
Phasenplatte phase plate
2121
Probe sample
2222
Fluoreszenzlicht fluorescent light
2323
Detektor detector
2424
Spiegel mirror
2525
Spiegel mirror
2626
Optik optics
2727
Schlitzblende slit
2828
Abtastbereich scanning
2929
Fokuspunkt focus point
3030
Zeilenrichtung line direction
3131
Zeilenvorschubrichtung Line feed direction
3232
Ort place
3333
Struktur structure
3434
elektro-optischer Modulator electro-optical modulator

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • WO 2010/069987 A1 [0005] WO 2010/069987 A1 [0005]
  • DE 102005027896 A1 [0006, 0006, 0007, 0007] DE 102005027896 A1 [0006, 0006, 0007, 0007]

Claims (15)

Verfahren zum Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur (33) in einer Probe (21), – wobei die Probe (21) in einem Abtastbereich (28) mit einer um einen Fokuspunkt (29) eines fokussierten Anregungslichtstrahls (4) lokalisierten Lichtintensitätsverteilung wiederholt abgetastet wird und – wobei aus dem Abtastbereich (28) emittiertes Fluoreszenzlicht (22) detektiert und dem jeweiligen Ort (32) des Fokuspunkts (29) zugeordnet wird, dadurch gekennzeichnet, dass Abtastbedingungen, die neben einer Abtastgeschwindigkeit, mit der der Fokuspunkt (29) gegenüber der Probe (21) verschoben wird, und Lichtintensitäten der Lichtintensitätsverteilung Eigenschaften und eine Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Abtastbereich (28) umfassen, so aufeinander abgestimmt werden, dass das Fluoreszenzlicht (22) in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Abtastbereich (28) emittiert wird; und dass ein Bild der Struktur (33) aus den Orten (32) zusammengesetzt wird, die den detektierten Photonen während mehrerer Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs zugeordnet wurden.Method for imaging a structure labeled with a fluorescent dye ( 33 ) in a sample ( 21 ), - whereby the sample ( 21 ) in a scanning area ( 28 ) with one around a focal point ( 29 ) of a focused excitation light beam ( 4 ) localized light intensity distribution is repeatedly sampled and - wherein from the sampling area ( 28 ) emitted fluorescent light ( 22 ) and the respective location ( 32 ) of the focal point ( 29 ), characterized in that scanning conditions, in addition to a scanning speed at which the focal point ( 29 ) against the sample ( 21 ), and light intensities of the light intensity distribution properties and a concentration of the fluorescent dye in the scanning region (FIG. 28 ) are coordinated so that the fluorescent light ( 22 ) in the form of individually detectable photons from the scanning region ( 28 ) is emitted; and that a picture of the structure ( 33 ) from the places ( 32 ) associated with the detected photons during several repetitions of scanning the scan area. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtintensitätsverteilung einen bezüglich des Verlaufs seiner Wellenfronten aberrierten, fokussierten Stimulationslichtstrahl (7) umfasst, dessen Stimulationslichtintensitätsverteilung an dem Fokuspunkt (29) des Anregungslichtstrahls (4) eine Nullstelle aufweist. A method according to claim 1, characterized in that the light intensity distribution a aberrated with respect to the course of its wavefronts, focused stimulation light beam ( 7 ) whose stimulation light intensity distribution at the focal point ( 29 ) of the excitation light beam ( 4 ) has a zero. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abstimmen der Abtastbedingungen die Lichtintensität des fokussierten Anregungslichtstrahls (4) reduziert wird. Method according to one of the preceding claims, characterized in that for adjusting the scanning conditions, the light intensity of the focused excitation light beam ( 4 ) is reduced. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abstimmen der Abtastbedingungen die Lichtintensität des fokussierten Anregungslichtstrahls (4) hochfrequent moduliert wird. Method according to one of the preceding claims, characterized in that for adjusting the scanning conditions, the light intensity of the focused excitation light beam ( 4 ) is modulated at high frequency. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abstimmen der Abtastbedingungen die Abtastgeschwindigkeit erhöht wird. Method according to one of the preceding claims, characterized in that for tuning the sampling conditions, the scanning speed is increased. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass beim Abstimmen der Abtastbedingungen die Abtastgeschwindigkeit so hoch eingestellt wird, dass eine Pixel-Dwell-Time von kleiner gleich 10 ns, vorzugsweise von kleiner gleich 7 ns erreicht wird. Method according to one of the preceding claims, characterized in that when tuning the scanning conditions, the scanning speed is set so high that a pixel dwell time of less than or equal to 10 ns, preferably less than or equal to 7 ns is achieved. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Bild der Struktur (33) aus den Orten (32) zusammengesetzt wird, die den einzelnen Photonen während mindestens 3, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt wenigstens 100 und am meisten bevorzugt mindestens 1000 aufeinander folgenden Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs (28) zugeordnet wurden. Method according to one of the preceding claims, characterized in that an image of the structure ( 33 ) from the places ( 32 ), which are coupled to the individual photons for at least 3, preferably at least 20, more preferably at least 100, and most preferably at least 1000 consecutive repetitions of scanning the scan area (FIG. 28 ). Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass aus den Orten (32), die einzelnen Photonen während einer Vielzahl von aufeinander folgenden Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs (28) zugeordnet wurden, mehrere zeitlich aufeinander folgende Bilder der Struktur (33) zusammengesetzt werden. Method according to one of the preceding claims, characterized in that from the locations ( 32 ), the individual photons during a plurality of successive repetitions of the scanning of the scanning area ( 28 ), several temporally successive images of the structure ( 33 ). Vorrichtung (1) zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, – mit einer Anregungslichtquelle (3) zur Bereitstellung eines Anregungslichtstrahls(4); – mit einem Objektiv (18) zum Fokussieren des Anregungslichtstrahls (4); – mit einem Rasterscanner zum wiederholten Abtasten eines Abtastbereichs (28) mit einer um einen Fokuspunkt (29) des fokussierten Anregungslichtstrahls (4) lokalisierten Lichtintensitätsverteilung; – mit einem Detektor (23) zum Detektieren von aus dem Abtastbereich (28) emittiertem Fluoreszenzlicht (22); und – mit einer Auswerteeinrichtung, die das Fluoreszenzlicht dem jeweiligen Ort des Fokuspunkts (29) zugeordnet, dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuerung vorgesehen ist, die Abtastbedingungen, die neben einer Abtastgeschwindigkeit, mit der der Fokuspunkt (29) gegenüber der Probe (21) verschoben wird, und Lichtintensitäten der Lichtintensitätsverteilung Eigenschaften und eine Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Abtastbereich (28) umfassen, so aufeinander abstimmt, dass das Fluoreszenzlicht (22) in Form einzeln detektierbarer Photonen aus dem Abtastbereich (28) emittiert wird; und dass die Auswerteeinrichtung ein Bild der Struktur (33) aus den Orten (32) zusammensetzt, die den detektierten Photonen während mehrerer Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs (28) zugeordnet wurden. Contraption ( 1 ) for carrying out the method according to one of the preceding claims, - with an excitation light source ( 3 ) for providing an excitation light beam ( 4 ); - with a lens ( 18 ) for focusing the excitation light beam ( 4 ); With a raster scanner for repeated scanning of a scanning area ( 28 ) with one around a focal point ( 29 ) of the focused excitation light beam ( 4 ) localized light intensity distribution; With a detector ( 23 ) for detecting from the scanning area ( 28 ) emitted fluorescent light ( 22 ); and - with an evaluation device which directs the fluorescent light to the respective location of the focal point ( 29 ), characterized in that a control is provided, the scanning conditions, in addition to a scanning speed at which the focal point ( 29 ) against the sample ( 21 ), and light intensities of the light intensity distribution properties and a concentration of the fluorescent dye in the scanning region (FIG. 28 ) is coordinated with one another so that the fluorescent light ( 22 ) in the form of individually detectable photons from the scanning region ( 28 ) is emitted; and that the evaluation device has an image of the structure ( 33 ) from the places ( 32 ) which detects the detected photons during several repetitions of scanning the scan area (FIG. 28 ). Vorrichtung (1) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Stimulationslichtquelle (6) vorgesehen ist, die einen bezüglich des Verlaufs seiner Wellenfronten aberrierten Stimulationslichtstrahl (7) bereitstellt, welcher von dem Objektiv (18) in den Fokuspunkt (29) des Anregungslichtstrahls (4) fokussiert und von dem Rasterscanner mit dem Anregungslichtstrahl (4) verschoben wird, wobei die Lichtintensitätsverteilung eine Stimulationslichtintensitätsverteilung mit einer Nullstelle an dem Fokuspunkt (29) des Anregungslichtstrahls (4) aufweist. Contraption ( 1 ) according to claim 9, characterized in that a stimulation light source ( 6 ) is provided which a aberrated with respect to the course of its wavefronts stimulation light beam ( 7 ) which of the lens ( 18 ) into the focal point ( 29 ) of the excitation light beam ( 4 ) and from the raster scanner with the excitation light beam ( 4 ), wherein the light intensity distribution has a stimulation light intensity distribution with a zero point at the focal point ( 29 ) of the excitation light beam ( 4 ) having. Vorrichtung (1) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtquelle (3) und die Stimulationslichtquelle (6) jeweils einen Dauerstrichlaser oder einen hochfrequent gepulsten Laser aufweisen. Contraption ( 1 ) according to claim 9, characterized in that the excitation light source ( 3 ) and the stimulation light source ( 6 ) each have a continuous wave laser or a high-frequency pulsed laser. Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Rasterscanner einen elektro-optischen Deflektor aufweist.Contraption ( 1 ) according to one of the preceding claims 9 to 11, characterized in that the raster scanner has an electro-optical deflector. Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (23) ein Punktdetektor ist. Contraption ( 1 ) according to one of the preceding claims 9 to 12, characterized in that the detector ( 23 ) is a point detector. Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (23) ein Hybriddetektor ist. Contraption ( 1 ) according to one of the preceding claims 9 to 13, characterized in that the detector ( 23 ) is a hybrid detector. Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteeinrichtung aus den Orten (32), die einzelnen Photonen während einer Vielzahl von aufeinander folgenden Wiederholungen des Abtastens des Abtastbereichs (28) zugeordnet wurden, mehrere zeitlich aufeinander folgende Bilder der Struktur (33) zusammensetzt. Contraption ( 1 ) according to one of the preceding claims, characterized in that the evaluation device from the locations ( 32 ), the individual photons during a plurality of successive repetitions of the scanning of the scanning area ( 28 ), several temporally successive images of the structure ( 33 ).
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