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Gebiet der Erfindung
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Zur Messung der Fluoreszenzlebensdauer einzelner Moleküle wird eine Anregungslichtquelle benötigt, die Pulse generiert deren Wellenlänge im Absorptionsspektrum der untersuchten Substanz liegt und deren Pulsdauer deutlich kürzer als die erwartete Fluoreszenz-Lebensdauer ist. Zur Fluoreszenzanregung einzelner Moleküle in z. B. biologischen Proben genügen dabei Pulsenergien von 10 bis 20 pJ (pJ = Pikojoule).
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Zur spezifischen Untersuchung molekularer Vorgänge in lebenden Zellen erlangen selbstfluoreszierende Proteine mehr und mehr Bedeutung. Der Absorptionsbereich dieser modifizierten Proteine reicht vom blauen bis in den orange/roten Wellenlängenbereich.
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Blaue, rote und infrarote Anregungsquellen existieren in Form von gewinngeschalteten Diodenlasern mit Pulsdauern im Pikosekundenbereich. Ihre Vorteile sind eine einfache Bedienung, Wartungsfreiheit und eine frei wählbare Repetitionsrate mit der Möglichkeit, einzelne Laserpulse beliebig zu triggern.
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Obwohl große Teile des Spektrums vom nahen UV bis zum nahen Infrarot durch direkte oder frequenzverdoppelte Diodenlaser abgedeckt sind, fehlt es nach wie vor völlig an vergleichbaren Anregungsquellen zwischen 530 nm und 630 nm. Gerade dieser Bereich gewinnt in der biologischen Forschung mit selbstfluoreszierenden Proteinen (Fluorescent Proteins: GFP (green fluorescent Protein), YFP (yellow fluorescent Protein), mStrawberry, mCherry, mRaspberry [http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore]) an Bedeutung. Außerdem wäre eine Anregungsquelle mit kontinuierlich durchstimmbarer Wellenlänge ein wichtiges Universalwerkzeug für die Grundlagenforschung.
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Neben der wählbaren Wellenlänge hätte eine ideale Anregungsquelle für zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen auch eine frei wählbare Pulswiederholfrequenz.
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Zur Aufzeichnung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildern möchte man einerseits eine möglichst hohe Wiederholfrequenz um die kürzestmögliche Messzeit zu erreichen. Andererseits muss die Periode zwischen zwei Pulsen lang genug sein, um den Fluoreszenzabfall hinreichend verfolgen zu können. Da die Fluoreszenz-Lebensdauern je nach untersuchtem Farbstoff variieren, ist eine Anpassung der Wiederholfrequenz je nach Messaufgabe wünschenswert.
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Sollen Wechselwirkungen zwischen mehreren Farbstoffen mittels Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET) (ohne Fehler durch unvollständige FRET-Paare) untersucht werden, müssen mindestens zwei Anregungsquellen unterschiedlicher Wellenlänge in einem bestimmten zeitlichen Regime miteinander synchronisiert werden (PIE-FRET = Pulsed Interleaved Excitation FRET). Dazu sind elektrisch frei triggerbare Laser besonders vorteilhaft.
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Ein Superkontinuum, also weißes Licht, entsteht durch die gezielte Ausnutzung nichtlinearer optischer Effekte, wie Raman-Streuung, Vierwellenmischung und Selbstphasenmodulation, die eine Verbreiterung des Spektrums verursachen. Werden kurze infrarote Pulse mit einer sehr hohen Spitzenleistung in eine spezielle Photonische Kristallfaser (Photonic Crystal Fibre = PCF) eingekoppelt, so kann sich durch das Zusammenwirken der o. g. Effekte das Spektrum auf den gesamten sichtbaren Bereich verbreitern.
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Stand der Technik
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Durchstimmbare, gepulste Laser werden im sichtbaren Spektralbereich mit Hilfe von Weißlichtquellen erzeugt, kombiniert mit akustooptisch betriebenen Filtern (acousto optic tunable filters = AOTF) zur Isolierung von Pulsen. Diese Systeme basieren auf modengekoppelten Faserlasern, mit deren emittierten Pulsen ein Superkontinuum (Weißlicht) erzeugt wird. Prinzipbedingt arbeiten solche Laser statisch bei einer festen Wiederholrate. Mittels der akustooptischen Modulatoren (sogenannter Pulspicker) kann die Wiederholfrequenz zwar reduziert werden, ein externes Triggern und damit synchronisieren verschiedener Laserquellen für Pulsed Interleaved Excitation Anwendungen ist damit jedoch nicht zu realisieren. Pulspicker weisen auch meist nur eine Unterdrückung der Pulse mit einem Kontrast von 1:200 auf, womit ein substantieller Untergrund verbleibt, welcher bei Fluoreszenzmessungen extrem störend wirkt.
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Derartige Lichtquellen werden z. B. beschrieben in den Schriften
US 5,999,548 ,
US 7,277,169 ,
US 7,224,518 ,
US 2006/0159398 A1 ,
DE 101 15 590 A1 und
US 6,097,870 . Alle diese Lichtquellen basieren auf modengekoppelten Femtosekunden-Lasern mit fester Wiederholrate.
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Aufgabe
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Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Laserpulse von wenigen hundert Pikosekunden Pulsdauer bei einer wählbaren Wellenlänge in einem vorgegebenen zeitlichen Ablauf zu erzeugen.
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Lösung
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Diese Aufgabe wird durch die Erfindung mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
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Zur Lösung der Aufgabe wird eine Lichtquelle vorgeschlagen mit:
- a) einem elektrisch frei triggerbaren Diodenlaser zur Erzeugung von Lichtpulsen (1);
- b) einem mehrstufigen optischen Verstärker (2, 3) für die von dem Diodenlaser erzeugten Lichtpulse;
- c) einer nichtlinearen Faser (4) zur spektralen Verbreiterung der verstärkten Lichtpulse;
- d) einem Wellenlängenselektor (5) zur Selektion von Teilen des Spektrums der verstärkten und spektral verbreiterten Lichtpulse; und
- e) einer Steuerelektronik (6) zur Steuerung der Lichtquelle.
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Ein frei triggerbarer Diodenlaser erzeugt mit jedem elektrischen Signal einen einzelnen Lichtpuls bei einer bestimmten Wellenlänge mit einer Pulsdauer von Pikosekunden (ps) und einer Pulsenergie von Pikojoule. Die Pulsenergie und Pulsform sind weitgehend unabhängig von der Pulsperiode. Typische Pulsdauern liegen im Bereich von 10 bis 300 ps, vorzugsweise 50 bis 300 ps, weiter vorzugsweise 100 bis 200 ps.
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Die Lichtquelle ist frei triggerbar. Frei triggerbar bedeutet, dass ein einzelner Laserpuls durch die Flanke eines elektrischen Steuersignals ausgelöst werden kann. Die zeitliche Abfolge der elektrischen Steuersignale bestimmt die zeitliche Abfolge der Laserpulse. Es können einzelne Pulse erzeugt werden, ebenso wie beliebige Pulsfolgen und periodisch sich wiederholende Pulsmuster. Ist das Steuersignal periodisch im ms-Bereich, stellt sich nach wenigen Periodendauern ein hochstabiles Ausgangssignal hinsichtlich Pulsenergie und Pulsbreite ein. Bei den derzeit üblichen frei triggerbaren Diodenlasern sind minimale Pulsabstände bis 10 ns möglich.
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In einem nachfolgenden, mehrstufigen optischen Verstärker werden die Pulse um mehrere Größenordnungen auf Pulsenergien von Mikrojoule (μJ) verstärkt.
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Diese sehr intensiven Pulse einer Wellenlänge verbreitern sich nachfolgend in einer speziellen nichtlinearen Faser (Photonische Kristallfaser, PCF) auf ein Spektrum von mehreren hundert Nanometern. Der Effekt der spektralen Verbreiterung hängt stark von der Pulsspitzenleistung ab, die in die Faser gespeist wird. Durch den Einsatz von Pulsen mit ca. 100 ps wird eine deutlich homogenere Spektralverteilung im Vergleich zu Systemen auf Basis von Femtosekunden erreicht.
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Im Ergebnis sind blau-verschobene Wellenlängen-Anteile im Bereich von 400 bis 1.000 nm, vorzugsweise 450 bis 800 nm, weiter vorzugsweise 500 bis 700 nm, erreichbar.
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Die Lichtquelle ist nicht nur frei triggerbar, sondern auch durchstimmbar. Zu diesem Zweck besitzt sie einen Wellenlängenselektor zur Selektion von Teilen des Spektrums der verstärkten und spektral verbreiterten Lichtpulse. Als Wellenlängenselektor eignen sich z. B. ein AOTF (s. o.), Prismen, Gitter oder Filter.
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Ferner wird die Lichtquelle von einer Steuerelektronik gesteuert.
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Mit dem Wellenlängenselektor können aus dem erzeugen Superkontinuum ein oder mehrere schmalbandige Bereiche ausgefiltert werden, womit eine frei triggerbare, durchstimmbare Lichtquelle geschaffen ist.
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Der zeitliche Abstand zwischen den Pulsen ist stufenlos und in weitem Bereich einstellbar.
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Durch eine Mehrzahl von einzelnen triggerbaren Lasern, die jeweils auf unterschiedliche Wellenlängen gestimmt sind, können ebenfalls Sequenzen von Pulsen mit unterschiedlichen Wellenlängen erzeugt werden.
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Auf diese Weise können Wechselwirkungen zwischen fluoreszierenden Farbstoffen untersucht werden, die sich sowohl in ihren spektralen Eigenschaften als auch in ihrer Fluoreszenzlebensdauer unterscheiden.
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Die Lichtquelle eignet sich für die Anwendung in der Beobachtung von Fluoreszenzdynamiken, also für die Spektroskopie und Mikroskopie, insbesondere für konfokale Mikroskopie, hierbei vorallem zur Analyse von Fluoreszenzlebensdauern (FLIM, fluorescence lifetime imaging), oder für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS, fluorescence correlation spectroscopy).
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Die mittlere Leistung des gepulsten Eingangslasers hängt, bei konstanter Pulsenergie, linear von der Pulswiederholfrequenz ab. Bei einem frei triggerbaren Eingangslaser kann diese einen sehr weiten Bereich abdecken und sich, bei wechselndem Steuersignal, plötzlich ändern. Diesen Änderungen muss mit angepassten Pumpleistungen im optischen Verstärker begegnet werden.
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Die Wirkung des optischen Verstärkers hängt sehr stark von der Inversion ab, also davon, wie viele Ionen sich im angeregten Zustand befinden. Bei höherer mittlerer Eingangsleistung muss mehr Pumplicht zugeführt werden, bei geringer mittlerer Eingangsleistung muss die Pumpleistung reduziert werden, um den Verstärker vor Zerstörung zu schützen.
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Da die Qualität des Spektrums am Ende der nichtlinearen Faser stark von der Pulsspitzenleistung des Laserpulses abhängt, muss gewährleistet sein, dass diese möglichst konstant und unabhängig von der Pulswiederholfrequenz ist. Deshalb muss nicht nur zum Schutz des Verstärkers sondern auch zur Erhaltung der Qualität des Spektrums die Pumpleistung an die mittlere Eingangsleistung angepasst werden.
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Zu diesem Zweck wird die Größe der mittleren Leistung an mehreren Stellen überwacht. Die Pumpleistungen der einzelnen Verstärkerstufen werden von einem Mikrokontroller so gesteuert, dass sich der Gesamtaufbau in einem optimalen Betriebszustand befindet. Das Nutzsignal am Ausgang des Wellenlängenselektors kann ebenfalls permanent überwacht werden.
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Weitere Einzelheiten und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweiligen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die Möglichkeiten, die Aufgabe zu lösen, sind nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt. So umfassen beispielsweise Bereichsangaben stets alle – nicht genannten – Zwischenwerte und alle denkbaren Teilintervalle.
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Die Ausführungsbeispiele sind in den Figuren schematisch dargestellt. Im Einzelnen zeigt:
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1 eine schematische Darstellung der Lichtquelle;
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2 eine schematische Darstellung einer Lichtpulsfolge; und
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3 eine schematische Darstellung einer Lichtpulsfolge mit unterschiedlichen Wellenlängen.
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Aufbau
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1 zeigt einen Diodenlaser 1. Der Diodenlaser 1 nutzt einen Gallium-Arsenid-Multiquantumwell-Laserchip und emittiert infrarotes Licht im Bereich zwischen 1000 und 1070 nm. Die Pulslängen liegen im Bereich von 50 bis 120 ps, bei ca. 1 W Spitzenleistung bzw. Pulsenergien von bis zu 100 pJ.
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Das Licht des Diodenlasers 1 wird in eine erste Stufe 2 eines optischen Verstärkers eingekoppelt. Der optische Verstärker besteht aus einem dotierten Faserverstärker, welche zahlreich in der Literatur beschrieben sind. Lichtwellenleiter die mit Ionen von Metallen der seltenen Erden dotiert sind werden durch intensives Pumplicht 21 in einen angeregten Zustand versetzt. Durch stimulierte Emission, verursacht durch das gepulste Eingangslicht, entsteht der optische Verstärkungseffekt.
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Vorzugsweise kommt ein zweistufiger Ytterbium-dodierter Faserverstärker (YDFA) 2, 3 zum Einsatz. YDFA haben ihr Verstärkungsmaximum bei 1030 nm und Absorptionsmaxima bei 976 nm und 915 nm. Die erste Stufe 2 besteht aus einer stark Ytterbium-dotierten Single-Mode-Faser, in deren Kern 976 nm Pumplicht mittels eines Wavelength Division Multiplexers (WDM) eingekoppelt wird. Die Leistungsstufe 3 besteht entweder aus einer Doppelkernfaser, bei der das Pumplicht in eine zweite Lage zwischen Kern und Mantel eingekoppelt wird, oder aus einer Large Mode Area Faser (LMA-Faser) mit einem Kerndurchmesser von 30 μm oder mehr, die aber durch eine spezielle Lochstruktur im Mantel Eigenschaften von Single-Mode-Fasern besitzt. Die zweite Verstärkerstufe 3 wird von mehreren Pumpdioden 21 bei 976 nm oder 915 nm und 10 bis 50 W Pumpleistung getrieben.
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Im Ergebnis dieser Verstärkung liegen infrarote Pulse mit Spitzenleistungen größer 1 kW vor.
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Die verstärkten Lichtpulse werden zur spektralen Verbreiterung in eine Photonische Kristallfaser (PCF)
4 eingekoppelt. In einer Photonischen Kristallfaser können optische Parameter durch gezielte Anordnung von Luftlöchern im Fasermantel verändert werden. Durch eine spezielle chromatische Dispersion in der Faser können verschiedene nichtlineare Effekte (im Wesentlichen die eingangs genannten Selbstphasenmodulation, Vierwellenmischung und Raman-Streuung) gezielt zur Verbreiterung des Spektrums ausgenutzt werden. Abhängig von Spitzenleistung der Laserpulse und Länge der Faser verbreitert sich das Spektrum ausgehend von der eingespeisten Wellenlänge von etwa 1060 nm mehr und mehr, bis der gesamte sichtbare und nahinfrarote Bereich abgedeckt wird. Da die Pulsenergie hierbei nicht nur die Intensität, sondern auch die Form des Spektrums beeinflusst, ist der Einfluss der Pulsenergie des infraroten Eingangspulses auf die Pulsenergie bei einer bestimmten sichtbaren Wellenlänge am Ende der PCF besonders gross [s. a.
W. J. Wadsworth et al., "Supercontinuum generation and four-wave mixing with Q-switched Pulses in endlessly single-mode photonic crystal fibres", Opt. Express 12 (2), 299 (2004)].
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Typische Faserlängen liegen im Bereich von z. B. 0,1 bis 10 m oder mehr; die Länge hängt vom Fasertyp und von der eingekoppelten Pulsenergie ab.
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Abschließend durchläuft der Weißlicht-Puls den Wellenlängenselektor 5.
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Im Ergebnis werden Pulse mit wählbarer Wellenlänge im sichtbaren Bereich erreicht, mit Pulslängen im Bereich von 100 ps und Pulsenergien im Bereich von 1–10 pJ/nm.
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Steuerung
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Da die Pulsenergie der Ausgangspulse stark von diversen Parametern der vorhergehenden Stufen der Lichtquelle abhängt, werden verschiedene Maßnahmen ergriffen, um die Pulsenergie der Ausgangspulse zu stabilisieren.
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Zum einen werden die mittleren Leistungen des Lichts am Ausgang der einzelnen Stufen mittels geeigneten Messgeräten 22 überwacht.
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Zum anderen weist die Lichtquelle eine Steuerung 6 auf. Die Steuerung 6 regelt und überwacht die Pumpleistung aller Verstärkerstufen. Damit wird sichergestellt, dass unter wechselnden Eingangsbedingungen (insbesondere wechselnder mittlerer Wiederholfrequenz) konstante Ausgangsbedingungen (Pulsenergie bei gewählter Wellenlänge) sichergestellt sind. An mehreren Stellen wird mittels Sensoren die mittlere Leistung am Ausgang der jeweiligen Stufe gemessen und mit Sollwerten verglichen. Die Pumpleistungen der einzelnen Verstärkerstufen werden entsprechend nachgeregelt. Erfahrungsbasierte Regelalgorithmen oder ggf. Wertetabellen für unterschiedliche Betriebsmodi stellen zu jeder Zeit den optimalen Betrieb sicher. Die optionale Überwachung des eigentlichen Nutzsignals hinter dem Wellenlängenselektor erlaubt zusätzlich den Ausgleich von Inhomogenitäten des Weisslichtspektrums unter wechselnden Bedingungen.
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Beispiele erzeugter Pulsmuster
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2 zeigt eine mit der Lichtquelle gemäß 1 erzeugbare Pulsfolge bei einer Wellenlänge. Erzeugt wurde eine Abfolge von Pulspaketen (sog. Bursts) 24. Ein Burst 24 besteht aus jeweils (in diesem Beispiel) vier Pulsen 26. Aufgetragen ist die Lichtleistung P über der Zeit t.
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Typische Pulsabstände (auch für periodische Pulse) liegen im Bereich von 10 bis 1.000 ns. Abstände zwischen den Bursts liegen im Bereich von 100 bis 10.000 ns.
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Eine solche Art von Burstfolgen ist wichtig, um z. B. Moleküle durch eine kurzzeitig intensive Anregung (Burst) in einen bestimmten Zustand (z. B. Triplett) anzuregen. Die auf den Burst folgende längere Anregungspause ermöglicht die gezielte Beschränkung der Verweildauer in diesem Zustand um zum Beispiel die Anregung in höhere Triplettzustände zu minimieren [siehe z. B.
Donnert G., Eggeling C., Hell SW.: "Triplet-relaxation microscopy with bunched pulsed excitation", Photochemical & Photobiological Sciences, Vol. 8 (4), Seiten 481–485, 2009].
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3 zeigt eine andere mit der Lichtquelle gemäß 1 erzeugbare Pulsfolge bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen (durchgezogene und gestrichelte Linie). Erzeugt wurde wieder eine Abfolge von Pulspaketen (sog. Bursts) 30. Ein Burst 30 besteht in diesem Beispiel aus jeweils zunächst zwei Pulsen 32 der ersten Wellenlänge gefolgt von vier Pulsen 34 der zweiten Wellenlänge. Aufgetragen ist wieder die Lichtleistung P über der Zeit t.
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Dabei können z. B. die Pulse der ersten Wellenlänge von einem frei triggerbaren, gepulsten Diodenlaser stammen, während die Pulse der zweiten Wellenlänge aus einer als Slave betriebenen Lichtquelle stammen, wie sie hier beschrieben ist.
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Zwischen den einzelnen Pulsen 32, 34 besteht z. B. ein zeitlicher Abstand von 12 ns. Zwischen den Bursts 30 besteht ein Abstand von z. B. 5 × 12 ns = 60 ns.
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Derartige Pulsmuster sind zum Beispiel bei der Zwei- oder auch Mehrfarbanregung von FRET Paaren notwendig, um den Energieübertrag zwischen den FRET-Fluorophoren und damit deren Abstand charakterisieren zu können.
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Eine unterschiedliche Anzahl von Pulsen pro Wellenlänge kann genutzt werden, um bei bereits maximaler Anregungsleistung pro Puls dennoch über die Pulsfolge integriert für verschiedene Anregungsfarben unterschiedliche Anregungsleistungen zu realisieren. Auf diese Weise können Unterschiede im Absorptionskoeffizienten oder der Detektionseffizienz ausgeglichen werden. Auch können auf diese Weise spezielle statistisch relevante Detektionssignalverhältnisse eingestellt werden [siehe z. B.
Zarrabi N., Ernst S., Düser M. G., Golovina-Leiker A., Becker W., Erdmann R., Dunn S. D., Börsch M.: "Simultaneous monitoring of the two coupled motors of a single FoFl-ATP synthase by three-color FRET using duty cycle-optimized triple-ALEX"; Proceedings of SPIE, Vol. 7185, Seiten 718505-718505–14 (2009)]. Daneben sollten Bursts mit unterschiedlichen Farben aus den oben für einfarbige Bursts genannten Gründen ebenso mit Anregungspausen kombiniert werden können.
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Ähnliche Pulsregime werden z. B. in der Gewebespektroskopie angewendet, wo verschiedene Wellenlängen quasi-simultan unterschiedliche Gewebeeigenschaften abfragen.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Diodenlaser
- 2
- erste Stufe des optischen Verstärkers
- 3
- zweite Stufe des optischen Verstärkers
- 4
- nicht-lineare Faser zur spektralen Verbreiterung
- 5
- Wellenlängenselektor
- 6
- Steuerung
- 21
- Pumpdioden
- 22
- Messgerät für die mittlere Leistung
- 24
- Burst
- 26
- Lichtpuls
- 30
- Burst
- 32
- Pulsen der ersten Wellenlänge
- 34
- Pulsen der zweiten Wellenlänge
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Patentliteratur
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- US 5999548 [0010]
- US 7277169 [0010]
- US 7224518 [0010]
- US 2006/0159398 A1 [0010]
- DE 10115590 A1 [0010]
- US 6097870 [0010]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore [0004]
- W. J. Wadsworth et al., ”Supercontinuum generation and four-wave mixing with Q-switched Pulses in endlessly single-mode photonic crystal fibres”, Opt. Express 12 (2), 299 (2004) [0039]
- Donnert G., Eggeling C., Hell SW.: ”Triplet-relaxation microscopy with bunched pulsed excitation”, Photochemical & Photobiological Sciences, Vol. 8 (4), Seiten 481–485, 2009 [0048]
- Zarrabi N., Ernst S., Düser M. G., Golovina-Leiker A., Becker W., Erdmann R., Dunn S. D., Börsch M.: ”Simultaneous monitoring of the two coupled motors of a single FoFl-ATP synthase by three-color FRET using duty cycle-optimized triple-ALEX”; Proceedings of SPIE, Vol. 7185, Seiten 718505-718505–14 (2009) [0053]
