DE102006031962A1

DE102006031962A1 - Amidated insulin glargine

Info

Publication number: DE102006031962A1
Application number: DE102006031962A
Authority: DE
Inventors: Paul Dr. Habermann; Frank Dr. Zocher
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2006-07-11
Filing date: 2006-07-11
Publication date: 2008-01-17
Also published as: EP2041169A1; JP2009542741A; ATE522545T1; AR061866A1; US8048854B2; US20090176692A1; TW200817432A; JP5325778B2; EP2041169B1; WO2008006496A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein durch Amidierung modifiziertes Insulin Glargin, insbesondere Gly (A21), Arg (B31), Arg-Amid (B32) Humaninsulin (Insulin Glarginamid).The invention relates to an insulin modified by amidation glargine, in particular Gly (A21), Arg (B31), Arg-amide (B32) human insulin (insulin glargine amide).

Description

Die Erfindung betrifft ein durch Amidierung modifiziertes Insulin Glargin, insbesondere Gly(A21), Arg(B31), Arg-Amid (B32) Humaninsulin (Insulin Glarginamid).The The invention relates to an amidation-modified insulin glargine, in particular Gly (A21), Arg (B31), Arg-amide (B32) human insulin (insulin glarginamide).

Weltweit leiden etwa 177 Mio. Menschen an Diabetes mellitus. Darunter sind etwa 17 Mio. Typ I-Diabetiker, für welche die Substitution der fehlenden endokrinen Insulinsekretion die einzige derzeit mögliche Therapie darstellt. Die Betroffenen sind lebenslang, in der Regel mehrmals täglich, auf Insulininjektionen angewiesen. Im Gegensatz zum Typ I-Diabetes besteht beim Typ II-Diabetes nicht grundsätzlich ein Mangel an Insulin, jedoch wird in einer Vielzahl von Fällen, vor allem im fortgeschrittenen Stadium, die Behandlung mit Insulin, gegebenenfalls in Kombination mit einem oralen Antidiabetikum, als günstigste Therapieform angesehen.Worldwide About 177 million people suffer from diabetes mellitus. Below are about 17 million type I diabetics, for which is the substitution of the missing endocrine insulin secretion the only one currently possible Represents therapy. The sufferers are lifelong, as a rule several times a day, dependent on insulin injections. Unlike type I diabetes In type II diabetes, there is generally no shortage of insulin, However, in a large number of cases, especially at an advanced stage, the treatment with insulin, if appropriate in combination with one oral antidiabetic, as cheapest Therapy form viewed.

Beim Gesunden ist die Insulinfreisetzung durch die Beta-Zellen des Pankreas strikt an die Konzentration der Blutglucose gekoppelt. Erhöhte Blutglucosespiegel, wie sie nach Mahlzeiten auftreten, werden durch eine entsprechende Steigerung der Insulinsekretion rasch kompensiert. Im nüchternen Zustand sinkt der Plasmainsulinspiegel auf einen basalen Wert ab, der ausreicht, eine kontinuierliche Versorgung insulinsensitiver Organe und Gewebe mit Glucose zu gewährleisten und die hepatische Glucoseproduktion in der Nacht niedrig zu halten. Der Ersatz der körpereigenen Insulinsekretion durch exogene, meist subkutane Applikation von Insulin erreicht in der Regel die oben beschriebene Qualität der physiologischen Regulation der Blutglucose nicht. Häufig kommt es zu Entgleisungen der Blutglucose, da Diabetiker die jeweilige Situation falsch einschätzen. Daneben stellen jedoch auch über Jahre erhöhte Blutglucosespiegel ohne anfängliche Symptome ein erhebliches Gesundheitsrisiko dar. Die groß angelegte sog. DCCT- Studie in den USA ( The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977-986 ) wies eindeutig nach, dass chronisch erhöhte Blutglucosespiegel wesentlich für die Entwicklung diabetischer Spätschäden verantwortlich sind. Diabetische Spätschäden sind mikro- und makrovaskuläre Schädigungen, die sich u. U. als Retino-, Nephro-, oder Neuropathie manifestieren und zu Erblindung, Nierenversagen sowie dem Verlust von Extremitäten führen und darüber hinaus mit einem erhöhten Risiko für Herz/Kreislauferkrankungen einhergehen. Daraus ist abzuleiten, dass eine verbesserte Therapie des Diabetes in erster Linie darauf abzielen muss, die Blutglucose möglichst eng im physiologischen Bereich zu halten. Nach dem Konzept der intensivierten Insulintherapie soll dies durch mehrmals tägliche Injektionen von schnell und langsam wirkenden Insulinzubereitungen erreicht werden. Rasch wirkende Formulierungen werden zu den Mahlzeiten gegeben, um den postprandialen Anstieg der Blutglucose auszugleichen. Langsam wirkende Basalinsuline sollen die Grundversorgung mit insulin insbesondere während der Nacht sicherstellen, ohne zu einer Hypoglykämie zu führen.In healthy individuals, insulin release by the beta cells of the pancreas is strictly coupled to the concentration of blood glucose. Increased blood glucose levels, as they occur after meals, are rapidly compensated by a corresponding increase in insulin secretion. In the fasting state, the plasma insulin level drops to a basal level sufficient to ensure a continuous supply of insulin-sensitive organs and tissues with glucose and to keep hepatic glucose production low at night. The replacement of the body's insulin secretion by exogenous, usually subcutaneous administration of insulin generally does not achieve the above-described quality of the physiological regulation of blood glucose. Often there are derailments of blood glucose, as diabetics misjudge the situation. In addition, however, years of high blood glucose levels without initial symptoms represent a significant health risk. The large-scale so-called DCCT study in the USA ( The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977-986 ) clearly demonstrated that chronically elevated blood glucose levels are significantly responsible for the development of diabetic late damage. Diabetic late damage is micro- and macrovascular damage, which may be u. Manifest as retinopathy, nephropathy or neuropathy and lead to blindness, renal failure and loss of extremities and also go along with an increased risk of cardiovascular disease. From this it can be deduced that an improved therapy of diabetes must primarily aim to keep the blood glucose as close as possible to the physiological range. According to the concept of intensified insulin therapy, this should be achieved by injections of fast-acting and slow-acting insulin preparations several times a day. Fast-acting formulations are given at meal times to compensate for the postprandial increase in blood glucose. Slow-acting basal insulins are designed to ensure basic insulin supply, especially at night, without leading to hypoglycaemia.

Insulin ist ein Polypeptid aus 51 Aminosäuren, die sich auf 2 Aminosäureketten verteilen: die A Kette mit 21 Aminosäuren und die B-Kette mit 30 Aminosäuren. Die Ketten sind durch 2 Disulfidbrücken miteinander verbunden. Insulinzubereitungen werden seit vielen Jahren zur Diabetestherapie eingesetzt. Dabei werden nicht nur natürlich vorkommende Insuline verwendet, sondern neuerdings auch Insulinderivate und -analoga.insulin is a polypeptide of 51 amino acids, based on 2 amino acid chains distribute: the A chain with 21 amino acids and the B chain with 30 amino acids. The Chains are through 2 disulfide bridges connected with each other. Insulin preparations have been around for many years used for diabetes therapy. Not only naturally occurring Insulins used, but more recently also insulin derivatives and analogs.

Insulinanaloga sind Analoga von natürlich vorkommenden Insulinen, nämlich Humaninsulin oder tierischen Insulinen, welche sich durch Substitution wenigstens eines natürlich auftretenden Aminosäurerestes mit anderen Aminosäureresten und/oder Addition/Entfernen wenigstens eines Aminosäurerestes von dem entsprechenden, ansonsten gleichen natürlich vorkommenden Insulin unterscheiden. US 5,656,722 z. B. beschreibt z.B. insulin Glargin (Arg(B31), Arg(B32), Gly(A21) Humaninsulin). Es kann sich bei den hinzugefügten und/oder ersetzten Aminosäureresten auch um solche handeln, die nicht natürlich vorkommen.Insulin analogs are analogs of naturally occurring insulins, namely human insulin or animal insulins, which differ in substitution of at least one naturally occurring amino acid residue with other amino acid residues and / or addition / removal of at least one amino acid residue from the corresponding otherwise identical naturally occurring insulin. US 5,656,722 z. B. describes, for example, insulin glargine (Arg (B31), Arg (B32), Gly (A21) human insulin). The added and / or replaced amino acid residues may also be those that are not naturally occurring.

Insulinderivate sind Derivate von natürlich vorkommenden Insulinen oder Insulinanaloga, bei denen einer oder mehrere Aminosäurereste und/oder die N- oder C-Termini der A- und/oder B-Kette durch funktionelle Gruppen substituiert sind. Die funktionellen Gruppen sind ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend Amidreste, Aminreste, Carboxlyreste, Alkylreste, Alkoholreste und Alkoxyreste.insulin derivatives are derivatives of naturally occurring ones Insulins or insulin analogues in which one or more amino acid residues and / or the N or C termini of the A and / or B chain by functional Groups are substituted. The functional groups are selected from a group containing amide radicals, amine radicals, carboxy radicals, alkyl radicals, Alcohol radicals and alkoxy radicals.

Eine effektive Insulintherapie macht Gebrauch von sogenannten Basal-Insulinen. Darunter versteht man Formulierungen, die ein langsames, kontinuierliches Freisetzen von exogen appliziertem Insulin ermöglichen. Dadurch wird über längere Zeit eine basale Insulinkonzentration im Körper erreicht, die sich vorteilhaft auf den physiologischen Zustand des an Diabetes erkrankten Menschen auswirkt. Idealerweise setzt die Insulinwirkung verzögert und als möglichst flaches Zeit/Wirkungsprofil ein, so dass die Gefahr einer kurzfristigen Unterzuckerung deutlich minimiert ist und die Applikation ohne vorherige Einnahme von Nahrungsmitteln erfolgen kann.A effective insulin therapy makes use of so-called basal insulins. By this one understands formulations, which are a slow, continuous Allow release of exogenously applied insulin. This will be a long time basal insulin concentration in the body achieved, which is beneficial to the physiological state of affects people with diabetes. Ideally, the Delayed insulin action and as possible flat time / impact profile, so the risk of a short-term Hypoglycaemia is significantly minimized and the application without prior Taking food can be done.

Das rekombinante Insulinanalog Arg(B31), Arg(B32), Gly(A21) Humaninsulin (Insulin Glargin; US 5,656,722 ) zeichnet sich dabei dadurch aus, dass es bei vielen Patienten nur alle 24 Stunden – also nur einmal am Tag – dem Körper zugeführt werden muss, um eine basale Wirkung zu erreichen. Es kommt zu einer verbesserten Blutzuckerkontrolle die z.B. zu einer Verringerung des Hba1c Wertes führt.The recombinant insulin analog Arg (B31), Arg (B32), Gly (A21) human insulin (insulin glargine; US 5,656,722 ) is characterized by the fact that in many patients it only needs to be supplied to the body every 24 hours - ie only once a day - in order to achieve a basal effect. It comes to an improved blood sugar control, for example, to egg reducing the Hba1c value.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass Insulin Glarginamid, welches durch Amidierung des Arginin in Position B32 von Insulin Glargin entsteht, ein deutlich flacheres und damit vorteilhafteres Zeit/Wirkungsprofil zeigt als Insulin Glargin selbst. Bei Wirkungseintritt fällt der Blutzuckerwert ohne deutlichen Tiefstpunkt (Nadir) ab. Damit hat Insulin Glarginamid eine überraschend vorteilhafte Qualität im pharmakologischen Sinne. Die Gefahr einer Hypoglykämie bei der Applikation wird somit minimiert. Durch die Applikation von Lantusamid stellt sich ein normal nüchternen Blutzuckerspiegel von 70-110 mg/dl Glukose ein. Zudem zeigt Insulin Glarginamid gegenüber Insulin Glargin überraschend eine verlängerte Wirkung. Insulin Glarginamid ist somit Gegenstand der Erfindung.It was now surprising found that insulin glarginamide, which by amidation of arginine in position B32 of insulin glargine arises, a much flatter and thus shows a more advantageous time / effect profile than insulin Glargine itself. When the onset of action, the blood sugar value drops without clear Lowest point (Nadir) from. Insulin glarginamide has a surprising effect on this advantageous quality in pharmacological sense. The danger of hypoglycemia in the application is thus minimized. Through the application of Lantusamide raises a normal fasting blood sugar level of 70-110 mg / dl glucose. In addition, insulin glarginamide shows insulin Glargin surprising an extended one Effect. Insulin glargine amide is thus the subject of the invention.

Dem Fachmann ist dabei klar, dass das Insulin Glarginamid Gegenstand einer pharmazeutischen Formulierung ist. Darunter versteht man ein pharmazeutisches Gemisch, das sich nach Applikation vorteilhaft in bester Art und Weise die Wirkung von Insulin Glarginamid entfaltet. Dabei geht man von wässrigen Lösungen aus. Entsprechend müssen weitere Komponenten mischbar sein. Es ist vorteilhaft, dass die Zubereitung keine Komponenten enthalten sollte, die aus tierischen Quellen stammen. Damit wird die Gefahr viraler Kontamination minimiert. Es ist weiterhin vorteilhaft, durch Zusatz von Konservierungsmitteln eine mikrobielle Verunreinigung zu verhindern. Durch den Zusatz isotoner Agentien kann eine mögliche negative Auswirkung der Formulierung auf die Physiologie der Gewebezellen an der Applikationsstelle kompensiert werden. Stabilisierend kann sich der Zusatz von Protamin auswirken, so dass man weitgehend salzfreien Insulinzubereitung gelangen kann, wenn man der Formulierung Protamin zufügt. Der Zusatz von einer phenolischen Komponente kann zu einer Stabilisierung der Hexamerstruktur des Insulinanalogons führen und begünstigt so den Verzögerungseffekt beim Wirkungseintritt.the The expert is clear that the insulin glarginamide subject a pharmaceutical formulation. By this one understands one pharmaceutical mixture which is advantageous after application in the best way unfolds the effect of insulin glargine amide. It goes from aqueous solutions out. Accordingly must be miscible further components. It is beneficial that the Preparation should not contain components derived from animal Sources come from. This minimizes the risk of viral contamination. It is furthermore advantageous to add preservatives to prevent microbial contamination. By the addition isotonic agents can be a possible negative impact of the formulation on the physiology of tissue cells be compensated at the application site. Stabilizing can the addition of protamine affect, so that one is largely salt-free Insulin preparation can be obtained by taking the formulation protamine inflicts. Of the Addition of a phenolic component can lead to stabilization the hexameric structure of the insulin analog leads and favors so the delay effect at the onset of action.

Das Glarginamid kann parallel zu schnellwirksamen Insulinen wie Apidra^®, NovoRapid^®, Humalog^® oder sich in Entwicklung befindlichen Insulinderivaten oder Formulierungen mit entsprechendem Zeit-/Aktionsprofil gegeben werden. Dabei ist es dem Fachmann klar, dass dazu auch entsprechend formulierte Mischungen der jeweiligen Insulinkom-ponenten verwendet werden können. Das Amid kann zudem auch von Individuen bevorzugt genommen werden, die inhalierbares insulin wie Exubera^® anwenden. Weiterhin kann Glarginamid in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden, die Peptide, die durch eine dem GLP-1 (Glucagon like Peptide-1) vergleichbare Aktivität beschrieben sind, enthalten.The glargine amide may be added in parallel to fast-acting insulins such as Apidra ^®, NovoRapid ^®, Humalog ^® or under development insulin derivatives or formulations with a corresponding time / action profile. It is clear to the person skilled in the art that correspondingly formulated mixtures of the respective insulin components can be used for this purpose. The amide can be taken also preferred by individuals also who use inhalable insulin Exubera ^® as. Furthermore, glarginamide can be used in pharmaceutical preparations containing peptides described by activity comparable to GLP-1 (glucagon like peptide-1).

Beispiel für solche Peptide stellen GLP-1 (7-37), Exenatide (Byetta^®) oder Peptide, deren Herstellung in den Patentanmeldungen WO 2006/058620 , WO 2001/04156 und WO 2004/005342 beschreiben, dar.Examples of such peptides are GLP-1 (7-37), Exenatide (Byetta ^®) or peptides, their preparation in patent applications WO 2006/058620 . WO 2001/04156 and WO 2004/005342 describe, dar.

Die am gleichen Tage wie diese Patentanmeldung eingereichte Patentanmeldung mit dem Titel „Verfahren zur Herstellung von Insulinanaloga mit dibasischem B-Kettenende" beschreibt u.a. ein Verfahren zur Herstellung von Insulin Glarginamid. Dabei wird über eine Trypsin-katalysierte Ligation Argininamid an Gly(A21), Arg (B31) Humaninsulin mit hoher Ausbeute addiert. Dabei kann man die Reaktion so steuern, dass bevorzugt das Insulinanaloga der Form Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-Amid entsteht. In der Literatur wird beschrieben, dass insbesondere geschützte Argininderivate in verschiedenen Lösungsmitteln instabil sein können. Daher werden in der Peptidchemie stetig neue Schutzgruppen entwickelt, die eine verbesserte Stabilität bewirken. Entsprechend der Schutzgruppen oder Amidgruppe kann durch Variation der Reaktionsbedingungen die Ausbeute positiv beeinflusst werden kann. Dies ist dem Fachmann geläufig und auch Gegenstand der Erfindung. In dem Patent US 5,656,722 sind die Plasmide pB40 und pINT91d beschrieben, welche die Expression von Miniproinsulin als Teil eines Fusionsproteins erlauben. Wenn man Asparagin in Postion 21 der Insulin-A-Kette durch Glycin ersetzt, kann man aus diesen Fusionsproteinen direkt Arg(B31), Gly(A21) Miniproinsulin herstellen, das nach tryptischem Verdau direkt in die Vorstufe zur Herstellung von Insulin Glarginamid umgewandelt werden kann. Entsprechende Fusionsproteine müssen nicht notwendigerweise intrazellulär hergestellt werden. Es ist dem Fachmann klar, dass dieses Proinsulinanalogon auch durch bakterielle Expression mit anschließender Sekretion in das Periplasma und/oder in den Kulturüberstand hergestellt werden können. Die Europäische Patentanmeldung EP-A 1 364 029 beschreibt dies beispielhaft. Auch die Verwendung von Arg(B31), Gly(A21)-Humaninsulin-Vorstufen, die direkt nach Expression aus solchen bakteriellen Verfahren entstehen, ist Gegenstand der Erfindung.The patent application filed on the same date as this patent application entitled "Process for the Preparation of Insulin Analogues Having a Dibasic B-Chain End" describes, inter alia, a process for the production of insulin glargine-amide using a trypsin-catalyzed ligation of argininamide on Gly (A21), Arg (B31) Human insulin is added in high yield, and the reaction can be controlled to preferentially produce the insulin analogues Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) amide Therefore, in peptide chemistry, new protective groups are constantly being developed which bring about improved stability According to the protective groups or amide groups, the yield can be positively influenced by varying the reaction conditions, which is familiar to the person skilled in the art and is also the subject of Invention In the patent US 5,656,722 For example, plasmids pB40 and pINT91d are described which allow the expression of minipro insulin as part of a fusion protein. When glycine is substituted for asparagine in position 21 of the insulin A chain, Arg (B31), Gly (A21) miniprosulin can be directly prepared from these fusion proteins, which can be converted directly into the precursor for the production of insulin glargine amide after tryptic digestion , Corresponding fusion proteins do not necessarily have to be produced intracellularly. It is clear to the person skilled in the art that this proinsulin analog can also be prepared by bacterial expression with subsequent secretion into the periplasm and / or into the culture supernatant. The European patent application EP-A 1 364 029 describes this by way of example. The use of Arg (B31), Gly (A21) human insulin precursors, which arise directly after expression from such bacterial processes, is the subject of the invention.

Die Amidierung von Insulinanaloga kann generell an verschiedenen Stellen erfolgen. Insulin Glargin, bei welchem die C-terminale Carboxylgruppe amidiert ist, wird als Insulin Glarginamid bezeichnet.The Amidation of insulin analogues can generally occur at different sites respectively. Insulin glargine, in which the C-terminal carboxyl group amidated, insulin is called glarginamide.

Dem Fachmann ist ferner geläufig, dass die beispielhaft beschriebenen Expressionssysteme nur einen kleinen Ausschnitt der für die rekombinante Herstellung von Proteinen entwickelten Wirts/Vektorsysteme darstellen. Wirts/Vektor Systeme, die die Herstellung der Zielpeptide erlauben, sind somit auch Bestandteil der Erfindung.the One skilled in the art is also familiar with that the exemplary expression systems described only one small section of the for the recombinant production of proteins developed host / vector systems represent. Host / vector systems that produce the target peptides allow, are thus part of the invention.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit amidiertes Insulin Glargin, insbesondere amidiertes Insulin Glargin der Form Gly(A21), Arg (B31), Arg(B32)-NH₂ Humaninsulin (Insulin Glarginamid).The present invention thus relates to amidated insulin glargine, in particular amidated insulin glargine of the form Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH ₂ human insulin (insulin glargine amide).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines amidierten Insulin Glarginamids, insbesondere Insulin Glarginamids, wobei ein Vorläufer des Insulin Glarginamids der Form Gly(A21), Arg(B31) Humaninsulin rekombinant hergestellt wird, eine Kupplung mit Argininamid in Gegenwart eines Enzyms mit Trypsinaktivität durchgeführt wird, und das Insulin Glarginamid isoliert wird.One Another object of the invention is a process for the preparation an amidated insulin glarginamide, in particular insulin glarginamide, wherein a precursor of insulin glarginamide of the form Gly (A21), Arg (B31) human insulin recombinant, a coupling with arginine amide in the presence an enzyme with trypsin activity carried out and the insulin glarginamide is isolated.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Insulin Glarginamid in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes, insbesondere Diabetes Typ I oder Typ II Diabetes.One Another object of the invention is the use of insulin Glarginamide in a process for the preparation of a medicament for the treatment of diabetes, especially diabetes type I or type II diabetes.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend Insulin Glarginamid, welches insbesondere eine wässrige Formulierung oder ein Pulver darstellt.One Another object of the invention is a medicament containing Insulin glarginamide, which in particular an aqueous formulation or a Represents powder.

Das Arzneimittel ist eine pharmazeutische Zubereitung, die vorzugsweise eine Lösung oder Suspension zu Injektionszwecken ist; sie ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem amidierten Insulin Glargin, insbesondere Insulinglarginamid, und/oder mindestens einem von deren physiologisch verträglichen Salzen in gelöster, amorpher und/oder kristalliner – vorzugsweise in gelöster – Form.The Medicament is a pharmaceutical preparation which is preferably a solution or suspension for injection purposes; it is marked by a content of at least one amidated insulin glargine, in particular insulin glargamide, and / or at least one of them physiologically compatible Salts in dissolved, amorphous and / or crystalline - preferably in dissolved form.

Die Zubereitung weist vorzugsweise einen pH-Wert zwischen etwa 2,5 und 8,5, insbesondere zwischen etwa 4,0 und 8,5 auf,
enthält ein geeignetes Isotoniemittel,
ein geeignetes Konservierungsmittel
und gegebenenfalls einen geeigneten Puffer,
sowie vorzugsweise auch eine bestimmte Zinkionen-Konzentration,
alles natürlich in steriler wässriger Lösung. Die Gesamtheit der Zubereitungsbestandteile außer dem Wirkstoff bildet den Zubereitungs-Träger.The preparation preferably has a pH of between about 2.5 and 8.5, in particular between about 4.0 and 8.5,
contains a suitable isotonic agent,
a suitable preservative
and optionally a suitable buffer,
and preferably also a certain zinc ion concentration,
all of course in sterile aqueous solution. The entirety of the preparation components except the active ingredient forms the preparation carrier.

Geeignetes Isotoniemittel sind z.B. Glycerin, Glukose, Mannit, NaCl, Calcium- oder Magnesium-Verbindungen wie CaCl₂ etc.Suitable isotonic agents are, for example, glycerol, glucose, mannitol, NaCl, calcium or magnesium compounds such as CaCl ₂ etc.

Durch die Wahl des Isotoniemittels und/oder Konservierungsstoffes beeinflusst man die Löslichkeit des amidierten Insulin Glargins bzw. dessen physiologisch verträglichen Salzes bei den schwach sauren pH-Werten.By the choice of the isotonic agent and / or preservative influenced one the solubility the amidated insulin glargine or its physiologically acceptable Salt at the slightly acidic pH values.

Geeignete Konservierungsmittel sind z.B. Phenol, m-Cresol, Benzylalkohol und/oder p-Hydroxybenzoesäureester.suitable Preservatives are e.g. Phenol, m-cresol, benzyl alcohol and / or p-hydroxy.

Als Puffersubstanzen, insbesondere zur Einstellung eines pH-Wertes zwischen etwa 4,0 und 8,5 können z.B. Natriumacetat, Natriumcitrat, Natriumphosphat etc. verwendet werden. Ansonsten sind zur Einstellung des pH-Wertes auch physiologisch unbedenkliche verdünnte Säuren (typischerweise HCl) bzw. Laugen (typischerweise NaOH) geeignet.When Buffer substances, in particular for adjusting a pH between about 4.0 and 8.5 can e.g. Sodium acetate, sodium citrate, sodium phosphate, etc. used become. Otherwise, to adjust the pH also physiological harmless diluted acids (typically HCl) or alkalis (typically NaOH).

Wenn die Zubereitung einen Zinkgehalt besitzt, ist ein solcher von 1 μg/ml bis 2 mg/ml, insbesondere von 5 μg bis 200 μg Zink/ml bevorzugt.If the preparation has a zinc content, such is from 1 μg / ml to 2 mg / ml, in particular of 5 μg up to 200 μg Zinc / ml preferred.

Zwecks Variation des Wirkstoffprofils der erfindungsgemäßen Zubereitung kann auch unmodifiziertes Insulin, vorzugsweise Rinder-, Schweine- oder Human-Insulin, insbesondere Human-Insulin, oder Insulinanaloga und Derivate davon zugemischt werden. Ebenfalls können ein oder mehrere Exendin-4 Derivate oder Peptide, die durch eine dem GLP-1 (Glucagon like peptide-1) vergleichbare Aktivität charakterisiert sind, zugemischt werden. Solche Arzneimittel (Zubereitungen) sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.For the purpose of Variation of the drug profile of the preparation of the invention may also be unmodified Insulin, preferably bovine, porcine or human insulin, in particular Human insulin, or insulin analogs and derivatives thereof. Likewise one or more exendin-4 derivatives or peptides produced by a the GLP-1 (glucagon like peptide-1) comparable activity characterized are to be mixed. Such drugs (preparations) are also the subject of the invention.

Bevorzugte Wirkstoffkonzentrationen sind solche entsprechend etwa 1-1500, weiter bevorzugt etwa 5-1000 und insbesondere etwa 40-400 internationale Einheiten/ml.preferred Drug concentrations are those corresponding to about 1-1500, further preferably about 5-1000 and especially about 40-400 international Units / ml.

FigurenlegendeFigure Legend

1: Hypoglykämischer Effekt verschiedener Insulinanaloga in Hunden. RR-COOH = Insulin Glargin; RR-NH₂ = Insulin Glarginamid Die Erfindung wird im Folgenden durch die Beispiele näher beschrieben, ohne sich auf diese zu beschränken. 1 : Hypoglycemic effect of various insulin analogues in dogs. RR-COOH = insulin glargine; RR-NH ₂ = insulin glargine amide The invention is described in more detail below by the examples, without being limited to these.

Beispiel 1: Gensequenz zu Sekretion eines Hirudin Arg(B31), Gly(A21) Insulin-Fusionsproteins durch BäckerhefeExample 1: Gene sequence for secretion of a Hirudin Arg (B31), Gly (A21) insulin fusion protein by baker's yeast

Die Patentanmeldung EP-A 1 364 032 schlägt die Verwendung von Hirudin als Fusionspartner zur Expression und Sekretion von pharmazeutisch interessanten Wertproteinen in Hefen vor.The patent application EP-A 1 364 032 suggests the use of hirudin as a fusion partner for the expression and secretion of pharmaceutically interesting value proteins in yeasts.

Beispiel 1 der Patentanmeldung EP-A 1 364 032 beschreibt ein Wirtsvektorsystem zur Herstellung eines Fusionsproteins, das aus einem Hirudinderivat und Miniproinsulin besteht. Dieses System kann man für die Herstellung von Miniproinsulinen, die als Vorstufe zu dem beanspruchten Insulin Glarginamid führen, verwenden.Example 1 of the patent application EP-A 1 364 032 describes a host vector system for producing a fusion protein consisting of a hirudin derivative and minipro insulin. This system can be used for the preparation of miniproinsulins leading to the claimed insulin glarginamide as a precursor.

Die Konstruktion des Expressionsvektors erfolgt in Analogie zu dem Beispiel der Patentanmeldung EP-A 1 364 032 , indem man den Primer insnco1rev ersetzt und so das Codon in Position A21 verändert wird.The construction of the expression vector is analogous to the example of the patent application EP-A 1 364 032 by replacing the primer insnco1rev and thus changing the codon in position A21.

Zur Herstellung der für ein Fusionsprotein enthaltend Miniproinsulin kodierenden Sequenz (wobei aus dem Miniproinsulin später Gly(A21), Arg(B31) Humaninsulin entsteht), wird folgender Primer synthetisiert:
ins_gly_a21_rev
TTTTTTCCATGGGTCGACTATCAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG (SEQ ID NO.: 1)To produce the sequence coding for a fusion protein containing miniproinsulin (from which miniprosulin later Gly (A21), Arg (B31) human insulin is produced), the following primer is synthesized:
ins_gly_a21_rev
TTTTTTCCATGGGTCGACTATCAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG (SEQ ID NO: 1)

Der Primer überdeckt dabei vollständig den für die Aminosäuren A15-A21 des Insulinanalogs kodierenden Genabschnitt. Kombiniert man diesen Primer mit dem Primer SEQ ID NO: 4 aus Beispiel 1 der Patentanmeldung EP-A 1 364 032 und verwendet das Plasmid pADH2Hir_ins als 'Template', so lässt sich über PCR ein DNA Fragment generieren, dass nach Verdau mit den Restriktionsenzymen KpnI und NcoI in den entsprechend geöffneten Expressionsvektor insertiert wird und das gewünschte Fusionsprotein enthält.The primer completely covers the gene segment coding for the amino acids A15-A21 of the insulin analogue. Combining this primer with the primer SEQ ID NO: 4 of Example 1 of the patent application EP-A 1 364 032 and uses the plasmid pADH2Hir_ins as a 'template', it can be generated via PCR, a DNA fragment that is inserted after digestion with the restriction enzymes KpnI and NcoI in the corresponding open expression vector and contains the desired fusion protein.

Der Vektor erhält die Bezeichnung pADH2Hir_ins_glyA21. Das Fusionsprotein wird entsprechend Beispiel 3 der der Patentanmeldung EP-A 1 364 032 exprimiert und entsprechend Beispiel 6 zu Gly(A21)-Miniproinsulin prozessiert und über Kationentausch-Chromatographie gereinigt. Das Material der Fraktion die Miniproinsulin enthält, wird zur Herstellung von Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-NH₂ Humaninsulin entsprechend Beispiel 5 der vorliegenden Anmeldung verwendet.The vector is named pADH2Hir_ins_glyA21. The fusion protein is according to Example 3 of the patent application EP-A 1 364 032 expressed and processed according to Example 6 to Gly (A21) -Miniproinsulin and purified by cation exchange chromatography. The material of the fraction containing minipro insulin is used to prepare Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH ₂ human insulin according to Example 5 of the present application.

Beispiel 2: Gensequenz zur direkten Sekretion der Gly(A21), Arg(B31), Humaninsulin-Vorstufe durch BäckerhefeExample 2: Gene sequence for direct secretion the Gly (A21), Arg (B31), human insulin precursor by baker's yeast

DNA des in Beispiel 7 der Patentanmeldung EP-A 1 364 032 beschriebenen Plasmides pADH2Hir_ins_glyA21 wird zur Herstellung eines Vektorkonstruktes zur direkten Sekretion von Gly(A21), Arg(B31) Humaninsulin verwendet.DNA of Example 7 of the patent application EP-A 1 364 032 The plasmid pADH2Hir_ins_glyA21 described is used to prepare a vector construct for the direct secretion of Gly (A21), Arg (B31) human insulin.

Folgende Primer werden synthetisiert.
alpha_insf1
5'-TTTTTTGGATCCTTTGGAATAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3' (SEQ ID NO.: 2)The following primers are synthesized.
alpha_insf1
5'-TTTTTTGGATCCTTTGGAATAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 2)

Er überdeckt die Sequenz kodierend den C-Terminus des alpha-Faktors, Codone für Lys-Arg und des N-Terminus der Miniproinsulin Sequenz.
ins_gly_rev2
5'-TTTTTTCCATGGGTCGCTATCAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG-3' (SEQ ID NO.: 3) It covers the sequence encoding the C-terminus of the alpha factor, codons for Lys-Arg and the N-terminus of the miniproinsulin sequence.
ins_gly_rev2
5'-TTTTTTCCATGGGTCGCTATCAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG-3 '(SEQ ID NO: 3)

Der Primer hybridisiert mit dem 3'Ende der in das Plasmid pADH2Hir_ins_glyA21 klonierten Insulinanaloga-Sequenz. In einer PCR (Standardbedingungen) wird ein DNA Fragment generiert, das nach Verdau mit den Restriktionsenzymen KpnI und NcoI in den entsprechend geöffneten Expressionsvektor insertiert wird und das gewünschte Fusionsprotein enthält. Das in kompetente Zellen des Hefestammes Y79 transformiert. Transformanten werden anschließend wie in Beispiel 7 der genannten Patentanmeldung beschrieben, exprimiert Gly(A21), Arg(B31)-Miniproinsulin wird entsprechend EP-A 0 347 781 , Beispiel 9, angereichert und nach Trypsinspaltung über Kationenaustausch-Chromatographie gereinigt. Material der Fraktion, die Miniproinsulin enthält, wird zur Herstellung von Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32) Humaninsulin entsprechend Beispiel 5 der vorliegenden Anmeldung verwendet.The primer hybridizes to the 3 'end of the insulin analogue sequence cloned into the plasmid pADH2Hir_ins_glyA21. In a PCR (standard conditions), a DNA fragment is generated which, after digestion with the restriction enzymes KpnI and NcoI, is inserted into the appropriately opened expression vector and contains the desired fusion protein. The transformed into competent cells of yeast strain Y79. Transformants are then described as described in Example 7 of said patent application expressing Gly (A21), Arg (B31) -miniiproinsulin corresponding to EP-A 0 347 781 , Example 9, enriched and purified after trypsin cleavage via cation exchange chromatography. Material of the fraction containing miniprosulin is used to prepare Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) human insulin according to Example 5 of the present application.

Beispiel 3: Gensequenz zu Sekretion eines Hirudin-Gly(A21), Arg(B31) Humaninsulin-Fusionsproteins durch Pichia pastorisExample 3: Gene sequence for secretion of a Hirudin-Gly (A21), Arg (B31) human insulin fusion protein by Pichia pastoris

Die Klonierung des Expressionsvektors erfolgt in Analogie zu Beispiel 4 der Patentanmeldung EP-A 1 364 032 . Anstelle der Sequenz Primer pichia_H_Irev2 wird dabei der Primer ins_gly_rev2, der später die Möglichkeit der Expression von Gly(A21) Humaninsulin mit dem PCR-Produkt ermöglicht, eingesetzt:
5'-TTTTTGGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG-3' (SEQ ID NO.: 4)The cloning of the expression vector is carried out in analogy to Example 4 of the patent application EP-A 1 364 032 , Instead of the sequence primer pichia_H_Irev2, the primer ins_gly_rev2, which later makes possible the possibility of expressing Gly (A21) human insulin with the PCR product, is used:
5'-TTTTTGGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG-3 '(SEQ ID NO: 4)

Das entstandene Plasmid erhält die Bezeichnung pPich_Hir_ins-GlyA21. Die Reinigung von Gly(A21), Arg(B31)-Miniproinsulin als Ausgangsmaterial wird wie beschrieben durchgeführt.The resulting plasmid receives the name pPich_Hir_ins-GlyA21. Purification of Gly (A21), Arg (B31) -miniipro insulin as starting material is described as follows carried out.

Beispiel 4: Gensequenz zur direkten Sekretion der Gly(A21), Arg(B31)-Vorstufe durch Pichia pastorisExample 4: Gene sequence for direct secretion the Gly (A21), Arg (B31) precursor by Pichia pastoris

In Analogie zu Beispiel 7 der Patentanmeldung EP-A 1 364 032 erfolgt die Konstruktion des entsprechenden Expressionsvektors. Man benötigt die DNA des Plasmides pPich_Hir_ins-GlyA21 und zwei Primer pich_insgly_dirf und pich_insgly_dirrev
pich_insgly_dirf
5'-TTTTTTCTCGAGAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3' (SEQ ID NO.: 5)
pich_insgly_dirrev
5'-TTTTTTGGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCAC-3' (SEQ ID NO.: 6)In analogy to Example 7 of the patent application EP-A 1 364 032 the construction of the corresponding expression vector takes place. One needs the DNA of the plasmid pPich_Hir_ins-GlyA21 and two primers pich_insgly_dirf and pich_insgly_dirrev
pich_insgly_dirf
5'-TTTTTTCTCGAGAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 5)
pich_insgly_dirrev
5'-TTTTTTGGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCAC-3 '(SEQ ID NO: 6)

Die Reinigung von Gly(A21), Arg(B31)-Miniproinsulin als Ausgangsmaterial wird wie beschrieben durchgeführt.The Purification of Gly (A21), Arg (B31) -miniproinsulin as starting material is carried out as described.

Beispiel 5: Herstellung von Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-NH₂-Humaninsulin aus einer Gly(A21), Arg(B31) Humaninsulin-Vorstufe über Kupplung mit ArgininamidExample 5: Preparation of Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH ₂ -human insulin from a Gly (A21), Arg (B31) human insulin precursor via coupling with arginine amide

100 mg Gly(A21), Arg(B31) Humaninsulin, die entsprechend den Beispielen 1-4 dargestellt wurden, werden in 0.95 ml Argininamidlösung (446 g/L) gelöst, 0.13 ml M Na-Acetatpuffer (pH 5.8) und 2 ml DMF zugegeben. Die Reaktionsmischung wird auf 12°C gekühlt und durch Zugabe von 0.094 ml Trypsin (0.075 mg, Roche Diagnostics) gestartet.100 mg Gly (A21), Arg (B31) human insulin prepared according to Examples 1-4 are dissolved in 0.95 ml arginine amide solution (446 g / L). dissolved, added 0.13 ml of M Na acetate buffer (pH 5.8) and 2 ml of DMF. The reaction mixture is cooled to 12 ° C and started by adding 0.094 ml of trypsin (0.075 mg, Roche Diagnostics).

Nach 8 h wird die Reaktion durch Zugabe von TFA bis pH 2.5 gestoppt und per HPLC analysiert. Es bildet sich > 60% Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32) Humaninsulin. Nach Zusatz von Trypsininhibitorlösung erfolgt die Reinigung des amidierten Analogons (Insulin Glarginamid) in Analogie zu US 5,656,722 .After 8 h, the reaction is stopped by addition of TFA to pH 2.5 and analyzed by HPLC. It forms> 60% Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) human insulin. After addition of trypsin inhibitor solution, the amidated analogue (insulin glarginamide) is purified analogously to US 5,656,722 ,

Beispiel 6: Gensequenz zur direkten Sekretion einer Lys(B31)-Vorstufe durch BäckerhefeExample 6: Gene sequence for direct secretion a Lys (B31) precursor by baker's yeast

Zwei Primer werden synthetisiert, die zur Einfüfrung der Sequenz Ala(B30), Ala(C1), Lys(C2) dienen:
a29_a30_k31f
5'-GTTTCTTCTACACTCCAAAGGCGGCTAAAGGTATCGTTGAACAATGTTG-3' (SEQ ID NO.: 7)
und a29_a30_k31rev
5'-CAACATTGTTCAACGATACCTTTAGCCGCCTTTGGAGTGTAGAAGAAAC-3' (SEQ ID NO.: 8)Two primers are synthesized which serve to introduce the sequence Ala (B30), Ala (C1), Lys (C2):
a29_a30_k31f
5'-GTTTCTTCTACACTCCAAAGGCGGCTAAAGGTATCGTTGAACAATGTTG-3 '(SEQ ID NO: 7)
and a29_a30_k31rev
5'-CAACATTGTTCAACGATACCTTTAGCCGCCTTGGAGTGTAGAAGAAAC-3 '(SEQ ID NO: 8)

Der Primer alpha_insf1
5'-TTTTTTGGATCCTTTGGAATAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3' (SEQ ID NO.: 9)
überdeckt die Sequenz des C-Terminus des alpha-Faktors, Codone für Lys-Argund des N-Terminus der Miniproinsulin Sequenz. DNA des Plasmides pADH2Hir_ins aus Beispiel 1 der Anmeldung WO 02/070722 A1 dient als Template für zwei Polymerasekettenrektionen. In Reaktion 1 werden die Primer a29_a30_k31f und insnco1rev (SEQ ID NO.: 6 aus WO 02/070722 A1 ) und in Reaktion 2 die Primer a29_a30_k31re und alpha_insf1 benutzt. Die Standardreaktionen werden durchgeführt und die entstandenen PCR-Fragmente isoliert. Aliquots der beiden Ausbeuten werden vereinigt und dienen als Template für eine dritte Reaktion mit den Primern insnco1rev und SEQ ID NO: 6 aus WO 02/070722 A1 . Das entstandene PCR-Fragment wird wie in Beispiel 8 beschrieben kloniert und exprimiert. Es entsteht Ala(B31), Ala(C1), Lys(C1)-Miniproinsulin, das mit Lysylendopeptidase in B(1-29)-A(1-21) Split Insulin umgewandelt wird und als Intermediat zur Herstellung des Zielproteins dient.The primer alpha_insf1
5'-TTTTTTGGATCCTTTGGAATAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 9)
covers the sequence of the C-terminus of the alpha factor, codons for Lys-Arg and the N-terminus of the minipro insulin sequence. DNA of the plasmid pADH2Hir_ins from Example 1 of the application WO 02/070722 A1 serves as a template for two polymerase chain reactions. In reaction 1, the primers a29_a30_k31f and insnco1rev (SEQ ID NO WO 02/070722 A1 ) and in reaction 2 the primers a29_a30_k31re and alpha_insf1 are used. The standard reactions are carried out and the resulting PCR fragments are isolated. Aliquots of the two yields are pooled and serve as templates for a third reaction with the primers insnco1rev and SEQ ID NO: 6 WO 02/070722 A1 , The resulting PCR fragment is cloned and expressed as described in Example 8. The result is Ala (B31), Ala (C1), Lys (C1) -miniiproinsulin, which is converted with lysyl endopeptidase into B (1-29) -A (1-21) split insulin and serves as an intermediate for the production of the target protein.

Beispiel 7: Umsetzung mit Lysylendopeptidase und Thr-Arg(Boc)-Arg(Boc)-NH2Example 7: Reaction with lysyl endopeptidase and Thr-Arg (Boc) -Arg (Boc) -NH2

Die Insulinvorstufe wird wie in DE 38 44 211 beschrieben mit Lysylendopeptidase (LEP) und Trypsin umgesetzt und gereinigt (Beispiel 1). Hierzu werden 10 mg der Insulinvorstufe in Tris-Puffer (pH 8.0) gelöst und LEP aus Lysobacter enzymogenes zugegeben (0.01 ml einer 1 mg/ml konz. Lösung in Wasser, Merckbiosciences). Es wird bei Raumtemperatur 2 h inkubiert und über RP-HPLC aufgereinigt (Nucleosil 120-5 Säule). Die Gly(A21) B(1-29)-A(1-20) Split Insulinvorstufe wird in Anlehnung an DE 38 44 211 mit Thr-Arg(Boc)-Arg(Boc)-NH2 umgesetzt. Hierzu werden 10 mg der des Thr-Insulinvorstufe in 0.25 ml 10 M Essigsäure gelöst und 0.7 ml 1.5 M Thr-Arg(Boc)-Arg(Boc)-NH2 in DMSO/1,3-Butandiol (1:1) gelöst zugegeben. Es wird dann 0.15 ml LEP (15 mg/ml, gelöst in Wasser). Es wird bei Raumtemperatur 2 h inkubiert. Das Protein wird dann durch Zugabe von 5 ml Methanol/Methyl-tert.-butylether (v/v = 1:4) gefällt und getrocknet. Die Abspaltung der Schutzgruppe erfolgt durch Zugabe von 1 M HCl/Essigsäure und Inkubation bei 0°C.The insulin precursor is as in DE 38 44 211 reacted with lysyl endopeptidase (LEP) and trypsin and purified (Example 1). For this purpose, 10 mg of the insulin precursor are dissolved in Tris buffer (pH 8.0) and LEP from Lysobacter enzymogenes added (0.01 ml of a 1 mg / ml conc. Solution in water, Merckbiosciences). It is incubated at room temperature for 2 h and purified by RP-HPLC (Nucleosil 120-5 column). The Gly (A21) B (1-29) -A (1-20) split insulin precursor is modeled on DE 38 44 211 reacted with Thr-Arg (Boc) -Arg (Boc) -NH 2. For this purpose, 10 mg of the thr insulin precursor are dissolved in 0.25 ml of 10 M acetic acid and 0.7 ml of 1.5 M Thr-Arg (Boc) -Arg (Boc) -NH 2 dissolved in DMSO / 1,3-butanediol (1: 1) added. It is then 0.15 ml LEP (15 mg / ml, dissolved in water). It is incubated at room temperature for 2 h. The protein is then precipitated by the addition of 5 ml of methanol / methyl tert-butyl ether (v / v = 1: 4) and dried. The deprotection is carried out by addition of 1 M HCl / acetic acid and incubation at 0 ° C.

Beispiel 8: Blutzuckersenkende Wirkung von Insulin GlarginamidExample 8: Blood sugar lowering effect of insulin glarginamide

Der blutzuckersenkende Effekt wird an gesunden männlichen Hunden der Rasse Beagle untersucht. Subkutan wird eine Dosis von 0,3 IU/kg Körpergewicht verabreicht. In einer Kontrollgruppe werden Hunde mit der gleichen Dosis Insulin Glargin behandelt und eine weitere Gruppe erhält eine Placeboinjektion ohne Insulinzusatz. Während der ersten 2 Stunden nach Injektion wird den Tieren jede halbe Stunde zur Blutzuckerbestimmung Blut entnommen, danach bis zur achten Stunde stündlich. Es zeigt sich, dass Insulin Glarginamid wie auch Insulin Glargin ein verzögertes Zeit/Wirkungsprofil aufweisen, jedoch ist das Profil des Amids deutlich vorteilhaft, da bei Wirkungseintritt der Blutzuckerwert ohne deutlichen Tiefpunkt (Nadir) abfällt. Das Ergebnis ist in 1 dargestellt.The hypoglycemic effect is studied in healthy Beagle male dogs. Subcutaneously, a dose of 0.3 IU / kg body weight is administered. In a control group dogs are treated with the same dose of insulin glargine and another group receives a placebo injection without insulin supplement. During the first 2 hours after injection, the animals are bled every half hour for blood glucose determination, then every hour until the eighth hour. It has been shown that insulin glargine-amide as well as insulin glargine have a delayed time / effect profile, but the profile of the amide is clearly advantageous, since when the onset of action, the blood sugar value drops without a distinct low point (nadir). The result is in 1 shown.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows Sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can of the official publication platform downloaded from the DPMA.

Claims

Amidated insulin glargine.

Amidated insulin glargine according to claim 1, which is of the form Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH ₂ human insulin (insulin glargine amide).

Process for the preparation of an amidated insulin Glarginamids according to one the claims 1 or 2.

Process according to claim 3 for the preparation of insulin glarginamide according to claim 2, wherein a precursor of the insulin glarginamide of the form Gly (A21), Arg (B31) recombinantly produces human insulin a coupling with arginine amide in the presence of an enzyme having trypsin activity is performed, and the insulin glargine amide is isolated.

Use of amidated insulin glargine according to claim 1 in a process for the preparation of a medicament for treatment of diabetes.

Use according to claim 5, wherein insulin glarginamide in a process for the preparation a drug for the treatment of type I or type II diabetes is used.

Medicaments containing insulin glarginamide.

Medicament according to claim 7, which is an aqueous Formulation represents.

Medicament according to claim 7, which represents a powder.

Medicament according to claim 8, in which the insulin glarginamide in dissolved, crystalline and / or amorphous Form exists.

Medicament according to claim 8, in addition one or more exendin-4 derivatives or peptides produced by a the GLP-1 (glucagon like peptide-1) comparable activity characterized are, contains.