DE102005029811B4

DE102005029811B4 - Oligonucleotide arrangements, methods for their use and their use

Info

Publication number: DE102005029811B4
Application number: DE102005029811A
Authority: DE
Inventors: Thomas Ehben; Christian Dr. Zilch
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: BIOVILLE GMBH, DE
Priority date: 2005-06-27
Filing date: 2005-06-27
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2025-06-28
Also published as: US20070003959A1; DE102005029811A1; US20100323360A1

Abstract

Oligonukleotidanordnungen aufweisend jeweils mindestens zwei durch mindestens einen Spacer verknüpfte hybridisierbare Oligonukleotidsequenzen als Primersequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer ausgewählt ist aus funktionalisierten linearen oder verzweigten Kohlenstoffketten.oligonucleotide arrays each having at least two by at least one spacer linked hybridizable oligonucleotide sequences as primer sequences, characterized characterized in that the spacer is selected from functionalized linear or branched carbon chains.

Description

Die Erfindung betrifft Oligonukleotidanordnungen aufweisend jeweils mindestens zwei über zumindest einen Spacer (Verbindungsstück) verknüpfte Oligonukleotidsequenzen und ein Verfahren unter Verwendung der Oligonukleotidanordnungen zur Amplifikation und/oder Detektierung von Nukleinsäuresequenzen sowie deren Verwendung in der Lifescience-Forschung und im Rahmen von High-Throughput-Techniken.The The invention relates to oligonucleotide assemblies comprising each at least two over at least one spacer (linker) linked oligonucleotide sequences and a method using the oligonucleotide assemblies for the amplification and / or detection of nucleic acid sequences and their use in life science research and in the context of high-throughput techniques.

Nukleinsäureassays stellen in zunehmendem Maße ein wichtiges Instrument dar, um Aufschluss über Erkrankungen, Gesundheitsrisiken und Therapiemöglichkeiten eines Patienten zu erhalten und sind insbesondere zur Detektion von Krankheitserregern geeignet, da sie in der Lage sind, Erreger spezifisch anhand bestimmter in diesen auftretender DNA- oder RNA-Sequenzen zu identifizieren.nucleic acid assays increasingly make an important tool for understanding diseases, health risks and therapy options of a patient and are particularly for detection of pathogens, since they are able to pathogen specific based on certain occurring in these DNA or RNA sequences to identify.

Diese Tests bieten gegenüber bisher angewandten labordiagnostischen Methoden viele Vorteile, weil das Kultivieren von Bakterien oder Viren oder der Nachweis einer Immunantwort im menschlichen Körper präparativ aufwendig ist und häufig unwirtschaftlich lange Analysezeiten erfordert.These Tests offer hitherto applied laboratory diagnostic methods have many advantages, because cultivating bacteria or viruses or detecting an immune response in the human body is preparatively expensive and often uneconomical requires long analysis times.

Die meisten herkömmlichen Immunoassays zur Diagnose von Infektionen können lediglich die Präsenz von Erregern indirekt über die Erfassung einer Immunantwort des menschlichen Körpers nachweisen. Mit einem Nukleinsäureassay, das das Genom des Erregers analysiert, lassen sich zusätzlich Informationen über den Erreger gewinnen, z. B. über Subtypen oder Mutationen, die zu Resistenzen gegenüber bestimmten Medikamenten geführt haben. Solche Informationen haben zusätzliche therapeutische Relevanz. Diese spezifischen Erregerinformationen werden heute u. a. bei der Diagnose von HIV, HCV, Chlamydia und Gonorrhoe verwendet.The most conventional Immunoassays to diagnose infections can only reduce the presence of Indirect indirectly demonstrate the detection of an immune response of the human body. With a nucleic acid assay, which analyzes the genome of the pathogen, additional information about the Gain pathogens, z. Eg via subtypes or mutations that lead to drug resistance guided to have. Such information has additional therapeutic relevance. This specific pathogen information is today u. a. in the Diagnosis of HIV, HCV, Chlamydia and Gonorrhea used.

Durch den direkten Nachweis der Erreger können Nukleinsäureassays Infektionskrankheiten häufig in einem früheren Stadium als herkömmliche Assays erkennen, wenn z. B. ein Virus bereits latent im Patienten vorhanden ist, die Krankheit aber noch nicht ausbricht und somit noch keine Immunreaktion im Patienten ausgelöst hat.By The direct detection of the pathogens can be performed by nucleic acid assays Infectious diseases common in an earlier Stage as conventional assays recognize if z. B. a virus already latent in the patient is, but the disease is still not breaking out and therefore not yet Triggered immune reaction in the patient.

Bisher haben in der Anwendung im wesentlichen zwei Varianten eines Nukleinsäureassays zum Stand der Technik beigetragen.So far have in the application essentially two variants of a nucleic acid assay contributed to the prior art.

(1) Dies ist zum einen der homogene Nukleinsäureassay mit Hybridisierungssonden. Dabei werden bestimmte Sequenzabschnitte, die in einer nukleinsäurehaltigen Probe enthalten sind, mit zu diesen Abschnitten komplementären markierten Oligonukleotiden (Sonden) hybridisiert und mittels der Marker detektiert.(1) On the one hand, this is the homogeneous nucleic acid assay with hybridization probes. In this case, certain sequence sections that are in a nucleic acid-containing Sample are included, with marked complementary to these sections Oligonucleotides (probes) hybridized and detected by means of the marker.

Die Polymerase-Ketten-Reaktion ("Polymerase Chain Reaction", PCR) kann weiterhin Teil eines Nukleinsäureassays sein und die oben genannten Hybridisierungssonden ersetzten oder generieren. Hier werden an Starteroligonukleotidsequenzen (Primer) freie Desoxynukleotide unter Ausnutzung des Templateffektes einer Zielsequenz, die in einer DNA-Probe vorliegt, und unter Zuhilfenahme einer DNA-Polymerase angefügt, was die Zielsequenzen in hohem Maße vervielfacht. Diese so durch Amplifikation gewonnenen Nukleinsäuresequenzen werden dann auch als Amplikons bezeichnet.The Polymerase chain reaction ("polymerase Chain Reaction ", PCR) may further be part of a nucleic acid assay and those described above replace or generate said hybridization probes. Here become starter oligonucleotide sequences (primer) free deoxynucleotides taking advantage of the template effect of a target sequence present in a DNA sample present, and added with the aid of a DNA polymerase, which the target sequences to a large extent multiplied. These thus obtained by amplification nucleic acid sequences are then also referred to as amplicons.

Alternative Verfahren zur PCR bzw. deren Weiterentwicklungen sind z. B. die "strand displacement amplification" (Walker, G. T., et al., Nucleic Acids Res. (1992)7, 1691–1996), die Ligase-Kettenreaktion ("ligase chain reaction"), die "rolling circle amplification", die Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation ("nucleic acid sequence-based amplification"), die "branched DNA", die transkriptions-vermittelte Amplifikation ("transcription-mediated amplification"), "hybrid capture" und "Invader".alternative Methods for PCR or their developments are z. B. the "strand displacement amplification "(Walker, G.T., et al., Nucleic Acids Res. (1992) 7, 1691-1996), the ligase chain reaction ("ligase chain reaction"), the "rolling circle amplification", the nucleic acid sequence-based amplification ("nucleic acid sequence-based amplification ") the branched DNA, the transcription-mediated Amplification ("transcription-mediated amplification ")," hybrid capture "and" Invader ".

Gängige bekannte Methoden zur Detektierung beinhalten z. B. den Einsatz von Fluoreszenzmarkern, Enzymen, Radioisotopen, magnetischen Partikeln, Quantum Dots (Nanokristalle), die Detektierung mittels Antikörpern und interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen.Common known Methods for detection include z. B. the use of fluorescent markers, Enzymes, radioisotopes, magnetic particles, quantum dots (nanocrystals), the detection by means of antibodies and intercalating fluorescent dyes.

Unter Anwendung homogener Nukleinsäureassays werden der Flüssigphase zur Detektierung zu Beginn i. d. R. Moleküle zugegeben, die ein fluoreszenzoptisches Signal abgeben, dessen Intensität vom Verlauf der Amplifikationsreaktion abhängig ist. Am häufigsten sind folgende Verfahren:

– FRET (Fluorescent Resonant Energy Transfer): Während jeder Phase der Amplifikationszyklen, in denen die Nukleinsäuren einzelsträngig vorliegen, lagern sich hieran Fluoreszenzmoleküle und sogenannte Quencher ("Auslöscher") in unmittelbarer Nähe an. Die Quencher führen durch Resonanzeffekte zu einer lokalen Auslöschung der optischen Emission der Fluoreszenzmoleküle, solange diese Nähe aufrechterhalten bleibt. Kommt es zu einer Amplifikation der jeweiligen Nukleinsäure, werden hierbei sowohl die Fluoreszenzmoleküle als auch die Quencher von der Nukleinsäure gelöst und verlieren ihre räumliche Nähe. Die optische Auslöschung bricht zusammen und ein Fluoreszenzsignal kann durch die transparente Reaktionskammer hindurch gemessen werden.
– "Molecular Beacon" oder "Hairpin": Der Flüssigphase sind Moleküle beigegeben, die komplementär zur gesuchten Zielsequenz sind (oder zu einem Teil von ihr). An zwei entfernten Stellen eines solchen "Beacons" befinden sich je ein Fluoreszenz- und ein Quenchermolekül. Diese Stellen sind durch komplementäre Gruppen lose miteinander verbunden. Befindet sich ein "Beacon" frei in Lösung, formt es sich deshalb so, dass Fluoreszenzmolekül und Quencher räumlich nah beieinander sind und die optische Emission ausgelöscht wird. Sobald durch Amplifikation eine hohe Konzentration der gesuchten Nukleinsäure vor liegt, lagern sich die "Beacons" mit einer hierzu komplementären Gruppe an diese Nukleinsäuremoleküle an. Dies geschieht während der Phasen der Amplifikation, in denen die Nukleinsäuren einzelsträngig vorliegen. Die ursprünglich bestehenden losen komplementären Verbindungen werden dabei aufgebrochen, die "Beacons" werden gestreckt und Fluoreszenzmolekül und Quencher werden räumlich voneinander getrennt. Es kommt zu einer Signalemission.
– Hybridisierungssonden: Hier befinden sich z. B. zwei verschiedene Fluoreszenzmarker in der Flüssigphase, die nur in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander ein geeignetes fluoreszenzoptisches Signal emittieren. Dabei fungiert einer der Marker als Akzeptor, der andere als Donator. Die Emission wird durch Ladungsträgeraustausch initiiert. Beide Marker sind mit jeweils einer Hybridisierungssonde gekoppelt, die eine komplementäre Sequenz zu nahe beieinanderliegenden Bereichen der gesuchten Zielsequenz aufweisen. Kommt es zu einer starken Amplifikation der Zielsequenz und zu einer Steigerung von deren Konzentration, können sich die Marker vermehrt in unmittelbarer Nähe zueinander an die Zielsequenz anlagern. Dadurch wird ein Ladungsträgeraustausch ermöglicht, und ein optisches Signal wird emittiert.
– Interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe: Diese Stoffe lagern sich zwischen den Basenpaaren doppelsträngiger DNA an, wodurch eine Signalemission initiiert wird. Erhöht sich durch Amplifikation die Konzentration dieser doppelsträngigen DNA (jeweils nach jeder Elongationsphase der Zyklen), verstärkt sich somit auch die Signalemissi on.

Using homogeneous nucleic acid assays, molecules are initially added to the liquid phase for detection at the beginning, which molecules emit a fluorescence-optical signal whose intensity depends on the course of the amplification reaction. Most common are the following procedures:

- Fluorescent Resonant Energy Transfer (FRET): During each phase of the amplification cycles in which the nucleic acids are single-stranded, fluorescent molecules and so-called quenchers ("quenchers") are deposited in the immediate vicinity. The quenchers cause local extinction of the optical emission of the fluorescence molecules as a result of resonance effects, as long as this proximity is maintained. If an amplification of the respective nucleic acid occurs, both the fluorescence molecules and the quenchers are released from the nucleic acid and lose their spatial proximity. The optical extinction breaks down and a fluorescent signal can be measured through the transparent reaction chamber.
"Molecular Beacon" or "Hairpin": The liquid phase is added to molecules that are complementary to (or part of) the target sequence sought. At two remote points of such a "Beacon" are each a Fluo rescence and a quencher molecule. These sites are loosely connected by complementary groups. If a "beacon" is free in solution, it forms so that fluorescence molecule and quencher are spatially close to each other and the optical emission is extinguished. As soon as a high concentration of the desired nucleic acid is present by amplification, the "beacons" with a complementary group to these nucleic acid molecules. This happens during the phases of amplification in which the nucleic acids are single-stranded. The originally existing loose complementary compounds are thereby broken, the "beacons" are stretched and fluorescence molecule and quencher are spatially separated from each other. It comes to a signal emission.
- Hybridization probes: Here are z. B. two different fluorescent markers in the liquid phase, which emit only in the immediate vicinity of each other a suitable fluorescent optical signal. One of the markers acts as an acceptor and the other as a donor. The emission is initiated by charge carrier exchange. Both markers are each coupled to a hybridization probe that has a complementary sequence to closely spaced regions of the targeted target sequence. If there is a strong amplification of the target sequence and an increase in their concentration, the markers can accumulate increasingly close to each other to the target sequence. Thereby, a carrier exchange is enabled, and an optical signal is emitted.
- Intercalating fluorescent dyes: These substances bind between the base pairs of double-stranded DNA, which initiates signal emission. Increasing the concentration of this double-stranded DNA by amplification (after each elongation phase of the cycles), thus also amplifies the Signalemissi on.

Diese Verfahren sind in der Forschung und teilweise in der medizinischen Routine etabliert, haben aber z. T. den Nachteil, dass sie einen erheblichen apparativen Aufwand mit sich bringen und die Kosten für die speziellen Marker relativ hoch liegen. Diese Verfahren können jedoch auch im Rahmen des Detektionsschrittes für die vorliegende Erfindung Anwendung finden.These Procedures are in research and partly in medical Established routine, but have z. T. the disadvantage that they have a involve considerable expenditure on equipment and the costs for the special markers are relatively high. However, these procedures can also in the context of the detection step for the present invention Find application.

Bei der technischen Realisierung der Nukleinsäureassays für die klinische Routine sind zwei Varianten von Bedeutung.at the technical realization of nucleic acid assays for clinical routine two variants of importance.

Bei homogenen Assays finden die erforderlichen chemischen Reaktionen in einer homogenen Flüssigphase statt. Die z. B. aus Blut oder anderen Patientenproben gewonnene und aufbereitete Nukleinsäure wird hierbei zyklisch amplifiziert, d. h. bei jedem extern durch Temperaturschwankungen gesteuerten Reaktionszyklus nimmt die Anzahl der Nukleinsäuremoleküle (Amplikons) zu, sofern die gesuchte Sequenz in der Patientenprobe vorhanden war.at homogeneous assays find the required chemical reactions in a homogeneous liquid phase instead of. The z. B. derived from blood or other patient samples and processed nucleic acid is amplified cyclically, d. H. at each external by Temperature fluctuations controlled reaction cycle decreases the number the nucleic acid molecules (amplicons) if the searched sequence is present in the patient sample was.

Spezifische Primerpaare in der Lösung sorgen dabei dafür, dass nur die gesuchte Zielsequenz amplifiziert wird. Durch Mischung verschiedener Primerpaare ist es auch möglich, mehrere Zielsequenzen gleichzeitig zu amplifizieren (Multiplex-Verfahren).specific Primer pairs in the solution make sure that that only the desired target sequence is amplified. By mixture different primer pairs, it is also possible to have multiple target sequences simultaneously to amplify (multiplex method).

Qualitative Messungen sind möglich, indem nach einer vorher definierten Anzahl von Amplifikationszyklen geprüft wird, ob die Konzentration der aufgedoppelten Nukleinsäuremoleküle einen bestimmten Schwellwert übersteigt.qualitative Measurements are possible by after a predefined number of cycles of amplification checked whether the concentration of the doubled nucleic acid molecules is one exceeds a certain threshold.

Für eine Quantifizierung wird diese Konzentration nach jedem Zyklus erfasst und die Anzahl der Zyklen bis zum Erreichen eines bestimmten Schwellwertes bestimmt. Diese Anzahl ist ein Maß für die Konzentration der gesuchten Nukleinsäure in der Patientenprobe.For a quantification this concentration is recorded after each cycle and the number determines the cycles until a certain threshold is reached. This number is a measure of the concentration the sought nucleic acid in the patient sample.

Das Multiplex-Verfahren wird hierbei auch eingesetzt, um parallel zur Patientenprobe auch Kontrollen mitzuverstärken, die man der Lösung vor Beginn der Amplifikation in bekannter Menge zugibt.The Multiplex method is also used to parallel to Patient sample also reinforce controls that one of the solution Beginning of the amplification in a known amount admits.

(2) Als weiteres Verfahren eines Nukleinsäureassays sind die sogenannten Mikroarrays (gelegentlich auch "Gen- oder Biochips" genannt) bekannt. Hier werden die Nukleinsäureassays in Gegenwart einer mit einem Trägermaterial verbundenen DNA-Sequenz (gleich Fängermolekül) durchgeführt. Statt jedoch die Konzentration der gesuchten Zielsequenz in der homogenen Flüssigphase zu messen, wird nach der Amplifikation eine Hybridisierung durchgeführt, bei der lokal immobilisierte Fängermoleküle bestimmte Nukleinsäuren spezifisch anlagern. Die Konzentrationen der Anlagerungen am Trägermaterial werden infolge der erhöhten Signalemission messtechnisch erfasst. Bei qualitativen Assays ist das Überschreiten eines bestimmten Schwellwertes ein Indiz für das Vorhandensein einer gesuchten Zielsequenz in der Patientenprobe. Bei quantitativen Assays wird die Menge der jeweils an spezifischen Fängermolekülen angelagerten Nukleinsäuren erfasst. Sie ist ein Maß für die Konzentration der jeweiligen Nukleinsäuresequenz in der Patientenprobe.(2) Another method of a nucleic acid assay are the so-called Microarrays (sometimes called "gene or biochips ") known. Here, the nucleic acid assays in the presence of a with a carrier material linked DNA sequence (same catcher molecule) performed. Instead of however, the concentration of the desired target sequence in the homogeneous liquid phase After hybridization, hybridization is performed after amplification the locally immobilized catcher molecules determined nucleic acids specifically attach. The concentrations of the deposits on the carrier material are due to the increased Signal emission recorded by measurement. For qualitative assays, this is overshoot a certain threshold is an indication of the presence of a sought-after Target sequence in the patient sample. For quantitative assays the amount of each attached to specific capture molecules nucleic acids detected. she is a measure of concentration the respective nucleic acid sequence in the patient sample.

Der wesentliche Vorteil von Mikroarrays gegenüber homogenen Assays ist die hohe Parallelisierung. Bei der Amplifikation können Primer eingesetzt werden, die z. T. nicht spezifisch für bestimmte Zielsequenzen sind, sondern bestimmte Sequenzabschnitte unabhängig von genetischen Variationen der Patientenprobe verstärken. Während der Hybridisierung erfolgt dann eine feine Differenzierung durch die Verwendung einer Vielzahl verschiedener Fängermoleküle. Die für die klinische Diagnostik entwickelten Mikroarrays haben z. T. über 100 verschiedene Fängermoleküle.The main advantage of microarrays over homogeneous assays is the high level of parallelization. In the amplification primer can be used, the z. T. are not specific for certain target sequences, but certain Sequenzab amplify sections regardless of genetic variations of the patient sample. During hybridization, a subtle differentiation then takes place through the use of a multiplicity of different capture molecules. The microarrays developed for clinical diagnostics have z. T. over 100 different catcher molecules.

Bei Mikroarrays werden während der Amplifikation alle amplifizierten Kopien der Nukleinsäuresequenzen mit einem Marker gekoppelt. Meist handelt es sich um fluoreszenzoptische Marker, z. B. Cy3 oder Cy5. Ist eine bestimmte Nukleinsäuresequenz in hoher Konzentration in der Patientenprobe vorhanden, wird sie stark amplifiziert und während der Hybridisierung in großer Konzentration von den jeweiligen Fängermolekülen angelagert. Es kommt zu einer lokal erhöhten Fluoreszenzemission, die messtechnisch für die verschiedenen Fängermoleküle erfasst wird.at Microarrays will be during the amplification of all amplified copies of the nucleic acid sequences coupled with a marker. Most are fluorescent optical Markers, e.g. Cy3 or Cy5. Is a particular nucleic acid sequence in high concentration in the patient sample, it becomes strong amplified and during the hybridization in large Concentration of the respective catcher molecules attached. It comes to one locally elevated Fluorescence emission, which is detected metrologically for the different catcher molecules.

Auch dieses Verfahren ist etabliert, hat aber den Nachteil, dass die Signalemission durch die begrenzte Hybridisierungseffizienz beeinträchtigt ist, d. h. nicht jedes der Fängermoleküle lagert auch tatsächlich ein markiertes Nukleinsäuremolekül an. Zusätzlich problematisch ist die Notwendigkeit, die Emission der durch Fängermoleküle angelagerten, markierten Nukleinsäuren von denjenigen nichtangelagerten, also frei in Lösung befindlichen Nukleinsäuren zu unterscheiden. Dies wird entweder durch mehrere Waschschritte nach abgeschlossener Hybridisierung oder durch dreidimensional auflösende Signalerfassung erreicht (z. B. Messung im evaneszenten Feld oder konfokale Optik).Also This method is established, but has the disadvantage that the Signal emission is affected by the limited hybridization efficiency, d. H. not every catcher molecule is stored indeed a labeled nucleic acid molecule. Additionally problematic is the need to mark the emission of the attached by capture molecules nucleic acids of those non-attached, that is free in solution nucleic acids differ. This is done either by several washes completed hybridization or by three-dimensional resolution signal acquisition achieved (eg measurement in the evanescent field or confocal optics).

Durch die Technologie der Amplifikation kann die Sensitivität stark erhöht werden, was vor allem für die Detektion von Nukleinsäuren wichtig ist, die in nur sehr geringer Konzentration in der Patientenprobe vorkommen. Für die Bestimmung dieser Konzentration ist eine hohe Sensitivität und eine große dynamische Bandbreite sehr wichtig.By the technology of amplification can increase the sensitivity elevated be, especially for the detection of nucleic acids important is that in very low concentration in the patient sample occurrence. For the determination of this concentration is a high sensitivity and a size dynamic bandwidth very important.

Bei der Amplifizierung wird ein bestimmter Abschnitt auf der Ziel-DNA des zu untersuchenden Materials (z. B. eines Bakteriums, Viruses oder Chromosoms) unter Zuhilfenahme passender Oligonukleotide als Primer kopiert. Die Primer sind üblicherweise mit geeigneten Markern (mit z. B. fluoreszierenden, radioaktiven oder enzymatischen Eigenschaften) verknüpft, die nach der Aufbereitung der Amplifikations-Produkte eine Detektierung ermöglichen (Schweitzer, B., Kingsmore, S., Curr. Opin. Biotech. (2001) 12, 21–27).at the amplification becomes a specific section on the target DNA of the material to be investigated (eg a bacterium, virus or chromosomes) with the aid of suitable oligonucleotides as Copied primer. The primers are common with suitable markers (with eg fluorescent, radioactive or enzymatic properties) after preparation enable the amplification products to detect (Schweitzer, B., Kingsmore, S., Curr. Opin. Biotech. (2001) 12, 21-27).

In der WO 03/038059 A2 sind Oligonukleotid-Primer für PCR-Reaktionen beschrieben, die an Nanopartikel, insbesondere kolloidale Goldpartikel gebunden sind. Die Primer sind über Linker, z. B. Thiolgruppen oder Kohlenstoffketten, an die Goldpartikel gekoppelt.In the WO 03/038059 A2 describes oligonucleotide primers for PCR reactions that are bound to nanoparticles, in particular colloidal gold particles. The primers are via linkers, z. As thiol groups or carbon chains, coupled to the gold particles.

Nicewarner-Pena et al haben in Journal of the American Chemical Society (2002) 124, 7314–7323 ebenfalls an Nanopartikel gebundene Oligonukleotide für Hybridisierungsreaktionen und enzymatische Primer-Extension beschrieben.Nice Warner Pena et al., Journal of the American Chemical Society (2002) 124, 7314-7323 nanoparticle-bound oligonucleotides for hybridization reactions and enzymatic primer extension.

Durch Godrich et al wurden in Langmuir (2004) 20, 10246–10251 DNA: Nanospären-Biokonjugate beschrieben, welche mit komplementären Nukleinsäuren Aggregate bilden.By Godrich et al. Were described in Langmuir (2004) 20, 10246-10251 DNA: Nanospären bioconjugates described which aggregates with complementary nucleic acids form.

Obwohl die oben genannten Techniken eine ausgeprägte Sensitivität besitzen, beinhalten sie jedoch die Probleme eines hohen Zeit- und apparativen Aufwandes, hohe Kosten der Marker und eventuell aufwendige Schutzvorrichtungen wie im Falle der Radioisotope. Es herrscht somit ein steigendes Verlangen nach einfacheren und kostengünstigeren Messmethoden, die einen hohen Probendurchsatz ermöglichen und zumindest vergleichbare Analysenkraft aufweisen. Weiterhin sollte auch der personelle und apparative Aufwand für die Auswertung möglichst gering sein, um einen dezentralen Einsatz der Methode zu ermöglichen. Sie sollten dabei jedoch keinen negativen Einfluss auf die sensible Reaktionskinetik der Nukleinsäureamplifikation haben.Even though the above-mentioned techniques have a pronounced sensitivity, However, they involve the problems of a high-temporal and apparative Effort, high cost of the markers and possibly expensive protective devices as in the case of radioisotopes. There is thus an increasing desire for simpler and cheaper methods of measurement, which allow a high sample throughput and at least comparable Have analysis force. Furthermore, the personal and apparative effort for the evaluation as possible be low to allow a decentralized use of the method. However, you should not negatively affect the sensitive Reaction kinetics of nucleic acid amplification to have.

Obige Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche oder nachfolgend beschrieben.Above Problem was solved by the invention the subject of the independent Claims. Preferred embodiments are the subject of the dependent claims or described below.

Die Erfindung besteht somit u. a. in der Bereitstellung von Oligonukleotidanordnungen, die jeweils mindestens zwei, vorzugsweise mehr als drei, besonders bevorzugt mehr als 100 und insbesondere mehr als 1000, durch einen oder mehrere Spacer verbundene hybridisierbare Oligonukleotidsequenzen aufweisen, wobei zumindest einer der Spacer mindestens einen Marker aufweisen kann. Bei dem Marker kann es sich um Fluoreszenzmoleküle, andere optisch aktive Moleküle, magnetische Partikel, Quantum Dots, Enzyme, elektrisch aktive Moleküle oder Radioisotope handeln.The Invention thus exists u. a. in the provision of oligonucleotide arrays, each at least two, preferably more than three, especially preferably more than 100 and in particular more than 1000, by one or more spacers connected hybridizable oligonucleotide sequences have, wherein at least one of the spacers at least one marker can have. The marker may be fluorescent molecules, others optically active molecules, magnetic particles, quantum dots, enzymes, electrically active molecules or Radioisotopes act.

Weiterhin können die Marker aber auch affinitiv zu ihrem Komplementär wirken, wie z. B. bei Antigen(Hapten)/Antikörperwechselwirkungen (z. B. Digoxigenin oder Biotin) oder Thiolgruppen auf Goldoberflächen. Die Marker können aber auch lediglich zur Unterstützung der Konglomeratbildung dienen. Als derartige "passive" Marker können u. a. Metalle, Metallionen und Polymere eingesetzt werden. Auch Marker, die einen optischen Farbumschlag als Folge der Konglomeratbildung auslösen, sind Teil der Erfindung.Farther can but the markers also affinitively act as their complement, such as In antigen (hapten) / antibody interactions (e.g. Digoxigenin or biotin) or thiol groups on gold surfaces. The Markers can but also only for support conglomerate serve. As such "passive" markers u. a. Metals, metal ions and polymers are used. Also, markers that have an optical Color change as a result of conglomerate triggering are Part of the invention.

Schließlich kann die Detektion der gebildeten Netzwerke auch rein optisch, wie z. B. mittels Trübungsmessung, oder gravi metrisch, wie z. B. mittels der Piezo-Sensor-Technik der Siemens AG, durchgeführt werden.Finally, can the detection of the networks formed also purely optically, such as. B. by turbidity measurement, or gravi metric, such as. B. by means of the piezo-sensor technology of Siemens AG, performed become.

Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation und/oder Detektierung von Nukleinsäuren unter Verwendung dieser Marker bereit. Die hybridisierbaren Oligonukleotidsequenzen werden im Folgenden auch als Primer bzw. Primersequenzen bezeichnet.Farther the invention provides a method for amplification and / or detection of nucleic acids ready using these markers. The hybridizable oligonucleotide sequences are also referred to below as primers or primer sequences.

Die Erfindung ist weiterhin dadurch ausgezeichnet, dass "upstream"-(komplementär zur sense DNA) und "downstream"-(komplementär zur antisense DNA)hybridisierbare Oligonukleotidsequenzen gleichzeitig Bestandteil einer Oligonukleotidanordnung sein können oder die Oligonukleotidanordnungen in der Summe aus jeweils Oligonukleotidanordnungen mit lediglich "upstream"- und solchen mit lediglich "downstream"-hybridisierbaren Oligonukleotidsequenzen zusammengesetzt sind.The Invention is further characterized in that "upstream" (complementary to sense DNA) and "downstream" - (complementary to the antisense DNA) hybridizable Oligonucleotide sequences simultaneously part of an oligonucleotide assembly could be or the oligonucleotide arrays in the sum of each oligonucleotide arrays with only "upstream" - and those with only "downstream" hybridizable oligonucleotide sequences are composed.

In den Oligonukleotidanordnungen dienen die Oligonukleotide als Primer (Starteroligonukleotide) in gewohnter Weise für Amplifizierungsreaktionen oder als Sonden zur Hybridisierung zu der den Zielsequenzen komplementären Oligonukleotiden.In The oligonucleotides serve as primers for the oligonucleotide arrangements (Starter oligonucleotides) in the usual way for amplification reactions or as probes for hybridization to the oligonucleotides complementary to the target sequences.

Die in der Erfindung offenbarten, die hybridisierbaren Oligonukleotide verbindenden, Spacer sind selbst nicht zur Hybridisierung befähigt und z. B. aus funktionalisierten linearen oder verzweigten Kohlenstoffketten mit z. B. 5 bis 20 Kohlenstoffatomen aufgebaut. Anstatt von Kohlenstoffketten kann der Fachmann aber auch Oligonukleotidanordnungen synthetisieren, die einen andersartigen Spacer aufweisen. Ein Spacer kann erfindungsgemäß gleichzeitig auch mehr als zwei Oligonukleotidsequenzen binden.The disclosed in the invention, the hybridizable oligonucleotides connecting, spacers are themselves not capable of hybridization and z. B. from functionalized linear or branched carbon chains with z. B. 5 to 20 carbon atoms. Instead of carbon chains However, the person skilled in the art can also synthesize oligonucleotide arrangements, which have a different spacer. A spacer can according to the invention simultaneously also bind more than two oligonucleotide sequences.

Die Oligonukleotidanordnungen können weiterhin mit mindestens einem Marker versehen sein, wobei dieser, für den Fall, dass nur ein Spacer in der Anordnung vorhanden ist, mit der Oligonukleotidanordnung, vorzugsweise im Bereich des Spacers, ver knüpft ist. Wenn mehrere Spacer zur Anordnung gehören, ist der Marker mit mindestens einem dieser Spacer verbunden.The Oligonucleotide arrangements can continue to be provided with at least one marker, this, for the Case that only one spacer is present in the arrangement, with the Oligonukleotidanordnung, preferably in the region of the spacer, is linked ver. If several spacers are part of the arrangement, the marker is at least connected to one of these spacers.

Die Oligonukleotidanordnungen können in den eingangs beschriebenen Mikroarrays oder homogenen Assays eingesetzt werden.The Oligonucleotide arrangements can in the microarrays or homogeneous assays described above be used.

Weiterhin Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Vernetzung von Nukleinsäuresequenzen bzw. solche enthaltenden Molekülen, indem die erfindungsgemäßen Oligonukleotidanordnungen durch Koppelung an den Nukleinsäuresequenzen an mehrere der hybridisierbaren Oligonukleotidsequenzen einer Oligonukleotidanordnung Konglomerate bilden.Farther The invention relates to a method for crosslinking nucleic acid sequences or molecules containing such, by the oligonucleotide according to the invention by Coupling to the nucleic acid sequences to several of the hybridizable oligonucleotide sequences of an oligonucleotide array Form conglomerates.

Die Nukleinsäuresequenzen bzw. solche enthaltenden Moleküle sind hierbei vorzugsweise durch eine Elongation im Rahmen einer Amplifikationsreaktion oder einer Primer-Extension generierte DNA-Teilstränge.The nucleic acid sequences or molecules containing such are hereby preferably by an elongation in the context of a Amplification reaction or a primer extension generated DNA partial strands.

Die Oligonukleotidanordnungen lagern sich nach der Amplifizierungs-, Primer-Extentsion- und/oder Hybridisierungsreaktion zu Netzwerken von Nukleinsäuresequenzen zusammen, die die Reaktionslösung messbar eintrüben und deren Konzentration so nach einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung mittels Trübungsmessung oder colorimetrisch bestimmt werden kann.The Oligonucleotide assemblies are deposited after amplification, Primer extentsion and / or hybridization reaction to networks of nucleic acid sequences together, which is the reaction solution measurably clouding and their concentration according to another object of the present invention Invention by turbidity measurement or can be determined colorimetrically.

Vorteilhaft ist dabei der geringe apparative Aufwand für die Detektierung, der sich nach einer Ausführungsform der Erfindung lediglich auf leicht zugängliche Spektrophotometer mit einer Lichtquelle im sichtbaren Bereich erstreckt. Diese Lichtquellen sind dadurch sehr einfach gehalten und können somit z. B. in tragbaren Analysegeräten eingesetzt werden. Weiterhin führt die Signalverstärkung durch Konglomeratbildung zu einem verbesserten Signal-Rauschverhältnis.Advantageous This is the low expenditure on equipment for the detection, which is according to one embodiment the invention only on easily accessible spectrophotometer with extends a light source in the visible range. These light sources are characterized very simple and can thus z. B. in portable analyzers be used. Continue leads the signal amplification by conglomerate formation to an improved signal-to-noise ratio.

Beim Einsatz in Verbindung mit homogenen Assays sind keine signalemittierenden Marker erforderlich, wodurch sich die Kosten pro Assay verringern lassen und ggf. sogar eine Assayauswertung mit bloßem Auge ermöglicht wird.At the Use in conjunction with homogeneous assays are not signal-emitting Marker required, which reduces the cost per assay and possibly even an assay evaluation with the naked eye allows becomes.

Beim Einsatz in Verbindung mit Mikroarrays kommt es durch die hohe Anzahl der im Bereich der Fänger angelagerten Markermoleküle zu einem besonders großen Konzentrationsgefälle zwischen Markern an der Oberfläche und Markern in Lösung. Dadurch können nicht nur etwaige Waschschritte entfallen, sondern es verringern sich auch die Anforderungen an eine dreidimensionale Differenzierung bei der Auswertung, z. B. die Verwendung einer konfokalen Optik. Bei Minimierung des Kavitätsvolumens (weitere Steigerung des Konzentrationsgefälles) und Verzicht auf jegliche Waschschritte kann so ganz auf eine dreidimensionale Auflösung verzichtet werden.At the Use in connection with microarrays is due to the high number the one in the catcher area attached marker molecules to a particularly big one concentration gradient between markers on the surface and markers in solution. Thereby can not just any washing steps are eliminated, but reduce it also the requirements for a three-dimensional differentiation at the evaluation, z. B. the use of a confocal optics. at Minimization of the cavity volume (further Increase in the concentration gradient) and doing without any washing steps can be so completely on a three-dimensional resolution be waived.

Die erfindungsgemäßen Oligonukleotidanordnungen führen so überraschend zu einer optimierten Signalemission und stellen somit eine sensitivere, einfachere und kostengünstigere Detektierungstechnik für amplifizierte DNA-Sequenzen aus Nukleinsäureassays dar.The oligonucleotide assemblies according to the invention to lead so surprising to an optimized signal emission and thus provide a more sensitive, simpler and cheaper Detection technique for amplified DNA sequences from nucleic acid assays.

Die Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Primer solche Moleküle umfassen, die mit Nukleinsäuren, wie z. B. DNA, RNA, oder derivatisierten Nukleinsäuren und deren Gemischen hybridisieren.The invention is further characterized in that the primers comprise such molecules which are reacted with nucleic acids, such as. As DNA, RNA, or derivatized nucleic acids and mixtures thereof hy bridisieren.

Die Erfindung ist auch dadurch gekennzeichnet, dass die Detektierungsmethode auch für die "Real-time" PCR (Echtzeit-PCR) sowie bei der Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) in der Gegenwart von Reverser Transkriptase zur Bestimmung von RNA eingesetzt werden kann.The Invention is also characterized in that the detection method also for the real-time PCR (real-time PCR) as well as the Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) in the presence of reverse Transcriptase can be used for the determination of RNA.

Weiterhin liefert das erfindungsgemäße Verfahren Vorteile im Bereich der High-Throughput-Verfahren und im mobilen/dezentralen Einsatzbereich ('Point-of-care'-Bereich).Farther provides the method according to the invention Advantages in the area of high-throughput methods and in mobile / decentralized Field of application ('point-of-care' area).

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Anwendung dieses Verfahrens in Amplifizierungsreaktionen wie z. B. der PCR, der Ligase-Kettenreaktion ("ligase chain reaction"), "strand displacement amplification" (Strang-Verdrängungs-Amplification), "rolling circle amplification", "nucleic acid sequence-based amplification" (Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation), "branched DNA", "transcription-mediated amplification" (Transkriptions-vermittelnde Amplifikation), "hybrid capture" oder "Invader".Also The invention is the application of this method in Amplification reactions such. As the PCR, the ligase chain reaction ("ligase chain reaction"), "strand displacement amplification", "rolling circle amplification", "nucleic acid sequence-based" amplification "(nucleic acid sequence-based Amplification), "branched DNA "," transcription-mediated amplification "(Transcription-mediating Amplification), "hybrid capture "or" Invader ".

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist der Einsatz von miteinander verknüpften Nukleinsäuresequenzen, die als Hybridisierungssonden eingesetzt werden können (multivalente Nukleinsäuresonden). Diese Sonden können nun entweder aus zwei oder mehreren Nukleinsäuresequenzen, die zu einer bestimmten Region oder zu verschiedenen Regionen der Zielsequenz komplementär sind, bestehen.One Another object of the invention is the use of each other linked Nucleic acid sequences, which can be used as hybridization probes (multivalent Nucleic acid probes). These probes can now either from two or more nucleic acid sequences that belong to one particular Region or to different regions of the target sequence are complementary, consist.

Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung, dass die erwähnten Sonden alle dem Fachmann bekannten Markermoleküle tragen können.Farther It is the object of the invention that the mentioned probes are all known to the person skilled in the art known marker molecules can carry.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf allen Gebieten, auf denen Nukleinsäureanalysen betrieben werden, angewandt werden, wie z. B. in der medizinischen, forensischen, Lebensmittel- und Umweltanalytik, im Pflanzenschutz, der Tiermedizin oder allgemein in der Life Science Forschung.The inventive method can be used in all areas where nucleic acid analyzes are carried out, be applied, such. In medical, forensic, Food and environmental analysis, in crop protection, veterinary medicine or generally in life science research.

Das erfindungsgemäße Detektionsverfahren kann z. B. vorteilhaft bei Erbkrankheiten und in der Onkologie eingesetzt werden.The Detection method according to the invention z. B. used advantageously in hereditary diseases and in oncology become.

Es lässt sich so beispielhaft das somatische Genom daraufhin untersuchen, ob Erbkrankheiten vorliegen (z. B. zystische Fibrose), ob ein Patient ein erhöhtes Erkrankungsrisiko trägt (z. B. für Brustkrebs, nachweisbar durch Mutationen auf den BRCA1- und BRCA2-Genen) oder ob ein bestimmtes Therapeutikum mit seinem individuellen Genom verträglich ist (z. B. Herceptin-Test von Abbott). Ein weiteres Einsatzgebiet ist die HLA-Typisierung. Bei der Gewebstypisierung im Vorfeld von Trans plantationen erlauben Nukleinsäureassays wesentlich differenziertere Aussagen über die Übereinstimmung von Gewebetypen. Dies ist vor allem bei Knochenmarkstransplantationen wichtig, und bei Organtransplantationen lassen sich so bessere Verträglichkeiten erreichen.It let yourself to exemplify the somatic genome for hereditary diseases (eg, cystic fibrosis), whether a patient has an increased risk of disease carries (z. For example Breast cancer, detectable by mutations on the BRCA1 and BRCA2 genes) or whether a particular therapeutic with its individual genome compatible is (for example, Abbott's Herceptin test). Another application is the HLA typing. To permit tissue typing in advance of transplantations nucleic acid assays much more differentiated statements about the consistency of tissue types. This is especially important in bone marrow transplants, and Organ transplants can be better tolerated to reach.

Den sich in herkömmlichen Mikroarrays oftmals negativ auf die Sensitivität auswirkenden sterischen Einflüssen bei der Hybridisierung der Nukleinsäuresequenzen an den immobilisierten Fängermolekülen wird mit der Erfindung begegnet, weil vorliegend die Konglomeratbildung zu einem verbesserten Signal-Rauschverhältnis und somit zu einer Signalverstärkung führt.The yourself in conventional Microarrays often negatively impact on the sensitivity of steric influences the hybridization of the nucleic acid sequences at the immobilized capture molecules encountered with the invention, because in this case the conglomerate formation leads to an improved signal-to-noise ratio and thus to a signal amplification.

Erreicht werden kann eine Einstellung der Konglomeratbildungsgeschwindigkeit durch Variation folgender Parameter:

1) Die Multivalenz der Oligonukleotidanordnungen, also die Anzahl der Primersequenzen, die eine Oligonukleotidanordnung aufweist.
2) Das Verhältnis der jeweils zu einer Zielsequenz gehörenden "upstream"- und "downstream"-Primersequenzen, die in einer Anordnung enthalten sind. Ein in etwa ausgewogenes Verhältnis ermöglicht eine maximale Hybridisierung der zueinander komplementären Amplikons, während ein stark "upstream"- oder "downstream"-lastiges Verhältnis der Primer dazu führt, dass die Zahl der erzeugten Amplikons, die sich wegen ihrer Komplementarität verbinden können, geringer ausfällt und
3) ggf. das Hinzufügen von monovalenten und niedrigervalenten Primern zur 'Verdünnung' bzw. zunehmender Linearisierung der Netzwerke.
4) Ein weiterer Steuerparameter ist das Ausmaß des Vorhandenseins freier Primer.

An adjustment of the conglomeration rate can be achieved by varying the following parameters:

1) The multivalence of the oligonucleotide arrangements, ie the number of primer sequences comprising an oligonucleotide arrangement.
2) The ratio of the respective "upstream" and "downstream" primer sequences belonging to one target sequence, which are contained in one arrangement. A well-balanced ratio allows for maximum hybridization of the complementary amplicons, while a highly upstream or downstream primer ratio results in less of the number of amplicons generated that can combine because of their complementarity and
3) if necessary, the addition of monovalent and low-valent primers for 'dilution' or increasing linearization of the networks.
4) Another control parameter is the extent of the presence of free primers.

Gemäß einer typischen Anwendung der Erfindung finden die erforderlichen chemischen Reaktionen in einer homogenen Flüssigphase statt. Die z. B. aus Blut oder anderen Patientenproben gewonnene und aufbereitete Nukleinsäure wird hierbei der Reaktionskammer, die bereits alle erforderlichen Agenzien (einschließlich der Oligonukleotidanordnungen) enthält, zugegeben und zyklisch amplifiziert, d. h. bei jedem extern durch Temperaturschwankungen gesteuerten Reaktionszyklus nimmt die Anzahl der Nukleinsäuremoleküle exponentiell zu, sofern die fragliche Sequenz in der Patientenprobe vorhanden war.According to one typical application of the invention find the required chemical Reactions in a homogeneous liquid phase instead of. The z. B. derived from blood or other patient samples and processed nucleic acid This is the reaction chamber, which already has all the required Agents (including the oligonucleotide assemblies) added and cycled amplified, d. H. at each external by temperature fluctuations controlled reaction cycle, the number of nucleic acid molecules increases exponentially if the sequence in question is present in the patient sample was.

Die spezifischen Primersequenzen an der Oligonukleotidanordnung sorgen dabei dafür, dass nur die gesuchte Zielsequenz amplifiziert wird. Durch Mischung verschiedener Oligonukleotidanordnungen oder von Oligonukleotidanordnungen mit unterschiedlichen Primersequenzen ist es auch möglich, mehrere Zielsequenzen gleichzeitig zu amplifizieren (Multiplex).The provide specific primer sequences on the oligonucleotide array doing so that only the desired target sequence is amplified. By mixture various oligonucleotide arrays or oligonucleotide arrays with different primer sequences it is also possible to have several Simultaneously amplify target sequences (multiplex).

Qualitative Messungen sind möglich, indem nach einer vorher definierten Anzahl von Reaktionszyklen geprüft wird, ob die Konzentration der angelagerten Nukleinsäuremoleküle einen bestimmten Schwellwert übersteigt. Für eine Quantifizierung kann diese Konzentration nach jedem Zyklus erfasst und die Anzahl der Zyklen bis zum Erreichen eines bestimmten Schwellwertes bestimmt werden. Diese Anzahl ist ein Maß für die Konzentration der gesuchten Nukleinsäure in der Patientenprobe.qualitative Measurements are possible by checking for a pre-defined number of reaction cycles, whether the concentration of the attached nucleic acid molecules exceeds a certain threshold. For one Quantification can capture this concentration after each cycle and the number of cycles to reach a certain threshold be determined. This number is a measure of the concentration of the sought nucleic acid in the patient sample.

Das Multiplex-Verfahren kann hierbei genutzt werden, um parallel zur Patientenprobe auch Kontrollen mitzuverstärken, die man der Lösung vor Beginn der Amplifikation in bekannter Menge zugibt.The Multiplex method can be used to parallel to Patient sample also reinforce controls, which one of the solution before beginning the amplification in a known amount admits.

Bei Anwendung der Erfindung in homogenen Assays werden jeweils mehrere Oligonukleotidsequenzen (Primersequenzen), die für die Zielsequenz spezifisch sind, untereinander durch geeignete Spacer gekoppelt. Während der Amplifikationszyklen werden die Oligonukleotidanordnungen über ihre Primersequenzen an die neu entstehenden Nukleinsäurekopien (Amplikons) angefügt, so dass Konglomerate von Nukleinsäuremolekülen entstehen, deren Größe von Zyklus zu Zyklus zunimmt. Die Bildung dieser Konglomerate hängt dabei stark von der Anzahl der gekoppelten Primersequenzen ab. Ab einer bestimmten Anzahl von Zyklen erreicht die Konglomeratgröße Ausmaße, die zu einer optischen Eintrübung oder einer Präzipitation der vorher homogenen Flüssigphase führt.at Application of the invention in homogeneous assays are each several Oligonucleotide sequences (primer sequences) specific for the target sequence are coupled to each other by suitable spacers. During the Amplification cycles are the oligonucleotide arrangements on their Primer sequences are added to the newly formed nucleic acid copies (amplicons), so that Conglomerates of nucleic acid molecules arise, their size of cycle increases to cycle. The formation of these conglomerates depends on this strongly dependent on the number of coupled primer sequences. From one For a given number of cycles, the conglomerate size reaches extents that to a visual clouding or a precipitation the previously homogeneous liquid phase leads.

Diese Eintrübung führt bei Durchleuchtung des Assays mit sichtbarem Licht zu einer Streuung und/oder Absorption. Diese kann mit einfacher, dem Fachmann bekannter Messtechnik erfasst werden und macht eine Fluoreszenzoptik überflüssig. Die Assays werden dadurch kostengünstiger, und der Geräteaufwand sinkt. Bei qualitativen Assays ist sogar eine Erkennung der Eintrübung mit bloßem Auge denkbar, wodurch der Geräteaufwand weiter vereinfacht werden kann. Dies kann bei dezentralen und/oder mobilen Applikationen mit geringem Testdurchsatz sinnvoll sein.These downturn leads Screening of the Assay with Visible Light for Scattering and / or Absorption. This can be done with simple measuring technique known to the person skilled in the art be captured and makes a fluorescent optics superfluous. The assays are thereby cost-effective, and the equipment costs sinks. In qualitative assays, there is even an indication of cloudiness with naked Eye conceivable, which reduces the equipment costs can be further simplified. This can be done with decentralized and / or be useful for mobile applications with low test throughput.

Die Wirkung der Molekülkonglomerate auf die Lichtdurchlässigkeit lässt sich noch weiter steigern, indem die gekoppelten Primer zusätzlich mit Markermolekülen verbunden werden. Diese müssen nicht aktiv Signale emittieren, sondern können lediglich dazu dienen, während der Amplifikation die Eintrübung durch Konglomeratbildung zu verstärken. Als die Eintrübung verstärkende passive Marker kommen neben Metallen auch Metallionen oder Polymere in Frage. Weiterhin kann, in Gegenwart von farbgebenden Substanzen, eine durch die Konglomeratbildung verursachte Farbvertiefung bzw. ein Farbumschlag der Lösung zur Detektion herangezogen werden.The Effect of the molecule conglomerates on the translucency let yourself even further increase by the coupled primer additionally associated with marker molecules become. These do not have to actively emit signals but can only serve to while amplification clouding to reinforce by conglomerate formation. As the deterioration reinforcing passive In addition to metals, markers are also metal ions or polymers. Furthermore, in the presence of coloring substances, a by the conglomerate formation caused color deepening or a color change the solution be used for detection.

Bei Einsatz der erfindungsgemäßen Oligonukleotidanordnungen in üblichen Mikroarrays mit separaten Amplifikations- und Hybridisierungsschritten werden an die immobilisierten Fängermoleküle schichtenweise Netzwerke von über die Amplikons miteinander verbundenen Marker enthaltenden Oligonukleotidanordnungen angelagert und verbinden diese so zu großen Konglomeraten aus Nukleinsäuren und Markern, vorzugsweise erfolgt die Netzwerkbildung schichtweise vom Träger aufwachsend. Gleichfalls kann es Gegenstand der Erfindung sein, dass sich an die immobilisierten Fängermoleküle, statt einzelner, markierter Oligonukleotidanordnungen, nun bereits ausgedehnte, vorgeformte Konglomerate anlagern. Beide Möglichkeiten führen aber letztendlich zu einer Steigerung der Signalemission im Bereich der jeweiligen Fängermoleküle.at Use of the Oligonukleotidanordnungen invention in usual Microarrays with separate amplification and hybridization steps become layered on the immobilized capture molecules Networks of over the amplicons interconnected marker oligonucleotide assemblies attached and connect them so large conglomerates of nucleic acids and Markers, preferably the network formation takes place layer by layer from carrier Growing up. Likewise, it may be the subject of the invention that to the immobilized capture molecules, instead single, labeled oligonucleotide assemblies, now already extensive, Apply preformed conglomerates. Both options ultimately lead to it to an increase of the signal emission in the range of the respective Capture molecules.

Zwar kann es theoretisch durch die Größe der Konglomerate zu sterischen Inhibitionen bei der Hybridisierung an den Fängermolekülen kommen, jedoch tritt dieser Aspekt in den Hintergrund, wenn man zusätzlich die geringe Hybridisierungseffizienz eines Mikroarrays in Betracht zieht, d. h. von den immobilisierten Fängermolekülen lagert sich ohnehin nur ein geringer Teil Nukleinsäuremoleküle aus der Lösung an. Am durchschnittlichen Abstand dieses Teils der Fängermoleküle muss sich die Größenordnung der Konglomeratabmessungen orientieren, damit eine signifikante sterische Inhibition vermieden wird.Though It may theoretically be due to the size of the conglomerates come to sterical inhibitions in the hybridization of the capture molecules, however, this aspect fades into the background, in addition to the considers low hybridization efficiency of a microarray, d. H. stored by the immobilized capture molecules In any case, only a small part of nucleic acid molecules from the solution. At the average distance of this part of the catcher molecules must be the order of magnitude the conglomerate dimensions, so that a significant steric inhibition is avoided.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat folgende Vorteile:

– die Signalverstärkung durch Konglomeratbildung führt zu einem verbesserten Signal-/Rauschverhältnis
– beim Einsatz in Verbindung mit homogenen Assays sind nicht notwendigerweise signalemittierende Marker erforderlich, wodurch sich die Kosten pro Assay verringern lassen und ggf. sogar eine Assayauswertung mit bloßem Auge ermöglicht wird
– beim Einsatz in Verbindung mit Mikroarrays kommt es durch die hohe Anzahl der im Bereich der immobilisierten Fänger angelagerten Markermoleküle zu einem besonders großen Konzentrationsgefälle zwischen Markern an der Oberfläche und Markern in Lösung. Dadurch verringern sich die Anforderungen an eventuelle Waschschritte oder an eine dreidimensionale Differenzierung bei der Auswertung, z. B. die Verwendung einer konfokalen Optik. Ggf. kann bei Minimierung des Kavitätsvolumens (weitere Steigerung des Konzentrationsgefälles) ganz auf eine dreidimensionale Auflösung verzichtet werden

The method according to the invention has the following advantages:

- The signal gain by conglomerate formation leads to an improved signal / noise ratio
When used in conjunction with homogeneous assays, signal-emitting markers are not necessarily required, thereby reducing the cost per assay and possibly even enabling assay evaluation with the naked eye
When used in conjunction with microarrays, the large number of marker molecules deposited in the region of the immobilized catcher leads to a particularly large concentration gradient between markers on the surface and markers in solution. This reduces the requirements for any washing steps or a three-dimensional differentiation in the evaluation, z. B. the use of a confocal optics. Possibly. can be dispensed with minimizing the Kavitätsvolumens (further increase in the concentration gradient) on a three-dimensional resolution

Die Erfindung ist auch zur Durchführung in einem neuartigen Assay einsetzbar, der in der zeitgleich eingereichten Patentanmeldung „ Verfahren zum Nachweis von Oligonukleotidsequenzen" desselben Anmelders und derselben Erfinder beschrieben ist und durch Verweis auch zum Gegenstand dieser Anmeldung gemacht wird.The invention can also be used for carrying out in a novel assay, which is described in the simultaneously filed patent application "Verfahren for the detection of oligonucleotide sequences "of the same applicant and the same inventor and is also made by reference to the subject of this application.

In den 1 bis 8 wird die Erfindung beispielhaft veranschaulicht. Es zeigen:In the 1 to 8th the invention is exemplified. Show it:

1: Doppelsträngiger Ausschnitt einer die Zielsequenz enthaltenden DNA-Sequenz, wobei S1 und S2 die Enden der sense Ziel-DNA und S1* (in den Figuren als "S1-Überstrich" dargestellt) und S2* (in den Figuren als "S2-Überstrich" dargestellt) die Enden der antisense Ziel-DNA abkürzen. Dementsprechend sind als Primer S1* und S2 in den Oligonukleotideanordnungen enthalten. S0 bzw. S0* (in den Figuren als "S0-Überstrich" dargestellt) bezeichnen schließlich die von S1/S2 und S1*/S2* eingeschlossene DNA Sequenz. Die eigentliche Zielsequenz S0 bzw. S0* kann grundsätzlich die Enden S1/S2 bzw. S1*/S2* umfassen. 1 Figure 2. Double-stranded section of a DNA sequence containing the target sequence, wherein S1 and S2 represent the ends of the sense target DNA and S1 * (shown as "S1-overline" in the figures) and S2 * (in the figures as "S2-overline"). Shorten the ends of the antisense target DNA. Accordingly, primers S1 * and S2 are included in the oligonucleotide arrays. Finally, S0 and S0 * (shown in the figures as "S0 overflow") designate the DNA sequence included by S1 / S2 and S1 * / S2 *. The actual target sequence S0 or S0 * can basically include the ends S1 / S2 or S1 * / S2 *.

2: Minimale Ausstattung einer Oligonukleotidanordnung mit zwei Primern, die über nur einen Spacer verbunden sind. 2 : Minimal Equipment of an Oligonucleotide Assembly Having Two Primers Connected Via Only One Spacer.

3: Ausstattung einer Oligonukleotidanordnung mit beispielsweise vier Primern und wahlweise einem Marker, der hier durch einen mittig angeordneten Kreis dargestellt ist. 3 : Equipment of an oligonucleotide arrangement with, for example, four primers and optionally a marker, which is represented here by a centrally arranged circle.

4: Einzelne Oligonukleotideanordnung nach einer Elongationsreaktion, wie z. B. Amplifikation oder Primer-Extension, vor der Konglomeratbildung. 4 : Single Oligonukleotideanordnung after a elongation reaction, such. As amplification or primer extension, before conglomerate formation.

5: Schematische Bildung von Molekülkonglomeraten oder -netzwerken nach erfolgter Hybridisierung der Anordnungen aus 4. 5 : Schematic formation of molecular conglomerates or networks after hybridization of the arrays 4 ,

6: Anordnung, wie sie bei Mikroarrays auftreten kann, wobei einer der beiden Primer als Fängerprimer an eine Matrix gebunden wurde, und der Zusatz der erfindungsgemäßen Oligonukleotidanordnungen nach erfolgter Amplifikation und Hybridisierung wiederum ein Netzwerk aufbaut, das jetzt aber immobilisiert und mit dem Träger verbunden vorliegt. 6 : Arrangement as it can occur in microarrays, wherein one of the two primers was bound as a capture primer to a matrix, and the addition of the oligonucleotide assemblies according to the invention after amplification and hybridization in turn builds up a network which is now immobilized and connected to the carrier.

7: Die auf eine Dimension reduzierte zweidimensionale Anordnung der an die Amplikons unmittelbar oder mittelbar gekoppelten Markermoleküle nach erfolgter Hybridisierung mit den Fängermolekülen, wie sie in einem bekannten Mikroarray besteht. 7 : The reduced to one dimension two-dimensional arrangement of the amplicons directly or indirectly coupled marker molecules after hybridization with the capture molecules, as it consists in a known microarray.

8: Die auf zwei Dimensionen reduzierte dreidimensionale schichtenweise Anordnung der an die Amplikons beispielsweise unmittelbar oder mittelbar gekoppelten Markermoleküle nach erfolgter Hybridisierung mit den Fängermolekülen, wie sie in einem erfindungsmäßigen Mikroarray auftreten. Die schichtenweise Anhäufung der Markermoleküle führt so zu einer Steigerung der Signalemission im Bereich der jeweiligen Fängermoleküle. 8th The reduced to two dimensions three-dimensional layered arrangement of the amplicons, for example, directly or indirectly coupled marker molecules after hybridization with the capture molecules, as they occur in an inventive microarray. The layered accumulation of the marker molecules thus leads to an increase in the signal emission in the region of the respective capture molecules.

Claims

Oligonucleotide arrangements each having at least two linked by at least one spacer hybridizable oligonucleotide sequences as primer sequences, characterized in that the spacer is selected from functionalized linear or branched carbon chains.

Oligonucleotide arrangements according to claim 1, characterized in that the oligonucleotide arrangements have no marker.

Oligonucleotide arrangements according to claim 1, characterized in that in that the oligonucleotide arrangements each have at least one marker which preferably binds to at least one spacer is.

Oligonucleotide arrangements according to one of the preceding Claims, characterized in that each oligonucleotide array has more than three, more preferably more than 100 and in particular more than 1000, Hybridisable oligonucleotide sequences linked by one or more spacers having.

Oligonucleotide arrangements according to one of the preceding Claims, characterized in that the oligonucleotide arrangements such include, exclusively have hybridizable oligonucleotide sequences that are either "upstream" of a target sequence or those having hybridizable oligonucleotide sequences, the "downstream" of a target sequence are, preferably about equal proportions.

Oligonucleotide arrangements according to one of claims 1 or 2, characterized in that each oligonucleotide arrangement at least includes an oligonucleotide sequence upstream of a target sequence is, and one, the "downstream" of a target sequence is.

Oligonucleotide arrangements according to one of the preceding Claims, characterized in that the oligonucleotide sequences of 5 to 100, preferably from 10 to 35 and more preferably from 15 to 30, nucleotides are constructed.

Oligonucleotide arrangements according to one of the preceding claims, characterized in that the nucleotides AMP, GMP, CMP, TMP, UMP, IMP and its derivatives include.

Oligonucleotide arrangements according to one of the preceding Claims, characterized in that a spacer links all the oligonucleotide sequences.

Oligonucleotide arrangements according to claim 3, characterized in that that the markers are selected are made up of one or more members of the group consisting of optically, electrochemically or magnetically active molecules or Molecular residues, magnetic particles or quantum dots, dyes, radioisotopes, Enzymes, vitamins, haptens or antibodies.

Oligonucleotide arrangements according to one of the preceding Claims, characterized in that the oligonucleotide assemblies via binding sites for conglomerate formation accelerating passive markers, preferably selected from the group comprising metals, metal ions, dyes or polymers.

A method for the determination of target nucleic acids, comprising the steps (a) adding a sample solution containing a target nucleic acid a reaction chamber comprising all agents containing oligonucleotide assemblies according to one the claims 1 to 11, (b) amplification, primer extension or reverse transcription, (C) Hybridization and (d) detection of the target nucleic acids.

Method according to claim 12, characterized in that the hybridization of the at Oligonukleotidanordnungen and a target sequence resulting amplicon leads each other to conglomerate formation.

Method according to one the claims 12 and 13, characterized in that the method in microarrays carried out is using immobilized oligonucleotides, which in the Amplification amplicons form and these are in solution Bind amplicons.

Process according to claims 12 or 13, characterized in that the method in the course of Amplification the step of hybridization of formed in solution Networks to the immobilized amplicons.

Method according to one the claims 12 to 15, characterized in that the step of detecting the determination of the presence of conglomerates qualitatively or the conglomerate concentration quantitatively by turbidity measurement, gravimetric and electrochemical methods or, in the case of Presence of marks, also by optical, preferably colorimetric and magnetic methods.

Method according to one the claims 12 to 15, characterized in that the step of detecting the determination of the conglomerate concentration quantitatively by turbidity measurement or gravimetrically, gravimetrically especially under piezoelectronic Excitation and vibration measurement.

Method according to one the claims 12 to 17, characterized in that the method in the context real-time PCR and reverse transcriptase PCR in the presence is used by reverse transcriptase for the determination of RNA.

Method according to one of claims 12 to 17, characterized that it is used in the high-throughput process.

A method according to any one of claims 12 to 18, wherein the step the polymerase chain reaction, ligase chain reaction, strand displacement "amplification", "rolling circle amplification", a "nucleic acid sequence-based amplification", "branched DNA", "transcription-mediated amplification "," hybrid capture "or" Invader ".

Method according to one of claims 10 to 17 comprising the Use of passive markers for accelerated conglomerate formation.

Use of the method according to at least one of claims 12 to 21 as part of the medical, forensic, food and environmental analysis, in crop protection, veterinary medicine or in general in life science research.

Use of the method according to at least one of claims 12 to 21 in the context of high-throughput techniques and mobile and decentralized application area.