DE102004042822A1

DE102004042822A1 - Compounds and methods of treatment, diagnosis and prognosis in pancreatic diseases

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Publication number: DE102004042822A1
Application number: DE200410042822
Authority: DE
Inventors: Günter Prof. Dr. Klöppel; Jutta Prof. Dr. Lüttges; Holger Prof. Dr. Kalthoff; Ole Dr. Ammerpohl; Robert Dr. Grützmann; Christian Dr. Pilarsky; Hans Detlev Prof. Dr. Saeger; Ingo Dr. Alldinger
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2004-08-31
Filing date: 2004-08-31
Publication date: 2006-03-16
Also published as: DE112005002742A5; DE112005002742B4; WO2006024283A2; WO2006024283A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Diagnose und Prognose des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas, Verfahren zum Screenen nach Wirkstoffen zur Therapie des Pankreaskarzinoms, sowie die Verwendung von Antisense-Konstrukten bzw. siRNA-Molekülen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms. DOLLAR A Durch die vergleichende Untersuchung der Genexpression im Pankreaskarzinom und im normalen Pankreasepithelgewebe wurden insgesamt 1419 differentiell exprimierte Gene gefunden (650 hochregulierte und 769 herunterregulierte Gene). Von 1267 der gefundenen 1419 Gene war bisher nicht bekannt, dass sie im Zusammenhang mit Pankreastumor stehen. DOLLAR A Durch die Bestimmung der Menge an Genprodukt eines solchen differentiell exprimierten Gens in einer Probe biologischen Ursprungs eines Individuums und den Vergleich mit der Menge an üblicherweise im Pankreasgewebe vorliegendem Genprodukt kann ermittelt werden, ob ein Pankreaskarzinom vorliegt.The invention relates to a method for the diagnosis and prognosis of pancreatic carcinoma, in particular ductal adenoma carcinoma of the pancreas, methods for screening for active substances for the treatment of pancreatic carcinoma, and the use of antisense constructs or siRNA molecules for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of pancreatic carcinoma. DOLLAR A Through the comparative study of gene expression in pancreatic carcinoma and normal pancreatic epithelial tissue, a total of 1419 differentially expressed genes were found (650 upregulated and 769 downregulated genes). Of 1267 of the 1419 genes found, it has not been known to be related to pancreatic tumors. DOLLAR A By determining the amount of gene product of such a differentially expressed gene in a sample of biological origin of an individual and the comparison with the amount of gene product usually present in the pancreatic tissue can be determined whether a pancreatic carcinoma is present.

Description

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen sowie hierdurch kodierte Peptide bzw. Proteine, als auch die Verwendung von hieraus abgeleitenden Sequenzen zum Screenen nach daran bindenden Substanzen als auch die Verwendung von an den Nukleinsäuren und der daraus abgeleiteten Peptide bzw. Proteine bindenden Substanzen zur Diagnose, Prognose, sowie zur therapeutischen Behandlung bei Pankreastumoren, insbesondere beim duktalen Adenomakarzinom des Pankreas.The The invention relates to nucleic acid sequences and thereby encoded peptides or proteins, as well as the use from sequences derived therefrom for screening for binding thereto Substances as well as the use of on the nucleic acids and the peptides or protein-binding substances derived therefrom for diagnosis, prognosis and therapeutic treatment Pancreatic tumors, especially in ductal adenoma carcinoma of the Pancreas.

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas ist eine der häufigsten krebsbedingten Todesursachen. In den USA werden jährlich ca. 30 000 Todesfälle dadurch verursacht und das Pankreaskarzinom rangiert auf Platz 5 unter den krebsbedingten Todesursachen. Die Diagnose eines Pankreaskarzinoms bei einem Patienten stellt eine infauste Prognose dar. Die Überlebenszeit aller Patienten mit einem duktalen Pankreaskarzinom beträgt im Mittel nur 1 Jahr, und nur etwa 4% der Patienten überleben einen Zeitraum von 5 Jahren. Neben der speziellen Biologie des Pankreaskarzinoms ist auch die späte Diagnose dieser Tumore ein Grund für die schlechte Überlebensrate.The ductal adenocarcinoma of the pancreas is one of the most common cancer-related causes of death. In the US approx. 30 000 deaths caused and the pancreatic carcinoma ranks at number 5 among cancer-related causes of death. The diagnosis of pancreatic carcinoma in one patient represents an infertile prognosis. The survival time all patients with ductal pancreatic carcinoma are on average only 1 year, and only about 4% of patients survive a period of 5 years. Besides the special biology of pancreatic carcinoma is also the late one Diagnosing these tumors is one reason for the poor survival rate.

Die histologische Differentialdiagnose von Pankreastumoren ist oft schwierig. Es existieren verschiedene in der pathologischen Routine angewendete Antikörper (z. B. gegen Zytokeratin 18), mit welchen aber nicht immer eine Prognose zum Krankheitsverlauf möglich ist. Bei der Untersuchung von Absiedelungen (Metastasen) von verschiedenen Karzinomen des Pankreas, der Gallenwege und der Gallenblase, wie auch der Papilla vateri ist meist die histologische Zuordnung zum Primärtumor nicht möglich. Eine Zuordnung dieser Metastasen zum Primärtumor ist zur Wahl einer angepassten palliativen Chemotherapie wichtig.The Histological differential diagnosis of pancreatic tumors is often difficult. There are several applied in the pathological routine antibody (eg against cytokeratin 18), but with which not always one Forecast for disease progression possible is. In the investigation of settlements (metastases) of different Carcinomas of the pancreas, biliary tract and gallbladder, such as The Papilla vateri is usually the histological mapping to the primary tumor not possible. An assignment of these metastases to the primary tumor is to choose an adapted important for palliative chemotherapy.

Für die Früherkennung, die laborchemische Differentialdiagnose von Pankreastumoren zu anderen Bauchspeicheldrüsenerkrankungen und der Verlaufskontrolle nach Operation gibt es bisher nur einen Marker, das CA19-9. Dieser im Blut zu bestimmende Tumormarker ist allerdings nicht sehr spezifisch und sensitiv, d.h. es gibt Patienten mit chronischer Pankreatitis (Bauchspeicheldrüsenentzündung), welche einen stark erhöhten Ca19-9 Wert haben und Patienten mit normalem Ca19-9, welche einen Pankreastumor haben.For early detection, the laboratory chemical differential diagnosis of pancreatic tumors to other pancreatic diseases and the follow-up after surgery, there is only one Marker, the CA19-9. This tumor marker to be determined in the blood is but not very specific and sensitive, i. there are patients with chronic pancreatitis (pancreatitis), which is a strong increased Ca19-9 Have value and patients with normal Ca19-9 who have a pancreatic tumor to have.

Die Behandlung des duktalen Pankreaskarzinoms ist derzeit auf die Operation und Chemotherapie begrenzt. Die operative Entferung des Tumors bietet als einzige Option eine Heilungschance. Die Chemotherapie mit dem meist eingesetzten Chemotherapeutikum bietet nur in wenigen Fällen eine Lebensverbesserung, aber keine Heilung. Es können zur Zeit nur weniger als 40% der Patienten kurativ behandelt werden und selbst dieser Teil der Patienten stirbt im Durchschnitt nach 2 Jahren. Die typischen Symptome im Endstadium des Pankreaskarzinoms sind eine Auszehrung des Körpers und starke Schmerzen. Beide Faktoren beeinträchtigen die Lebensqualtität der Patienten erheblich.The Treatment of ductal pancreatic cancer is currently on surgery and chemotherapy limited. The surgical removal of the tumor offers the only option is a chance of recovery. Chemotherapy with the Most commonly used chemotherapeutic provides only in a few cases Life improvement, but no cure. At the moment, only less than 40% of patients are treated curatively and even this part The patient dies on average after 2 years. The typical Symptoms of end-stage pancreatic cancer are wasting of the body and severe pain. Both factors affect the quality of life of patients considerably.

In den letzten Jahren wurden einige mit der Krebsentstehung in Verbindung stehende Gene im duktalen Adenomakarzinom des Pankreas identifiziert. K-ras, DPC4, p53 und p16 scheinen dabei eine wichtige Rolle bei der Entstehung des Pankreaskarzinoms zu spielen (1-4). Seit kurzem werden auch Microarray-Techniken zur Untersuchung der tumorspezifischen Genexpression bei verschiedenen Krebsarten, u.a. auch beim Pankreaskarzinom, angewendet (5-20). Bisherige Untersuchungen der tumorspezifischen Genexpression beim Pankreaskarzinom wurden mit ganzen Gewebeproben oder mit Zelllinien durchgeführt. In Zelllinien können aber durch die Bedingungen in vitro Veränderungen in der Genexpression induziert werden, die so in vivo nicht vorliegen.In In recent years, some have been linked to carcinogenesis identified genes in the ductal adenoma carcinoma of the pancreas. K-ras, DPC4, p53 and p16 seem to play an important role in this the development of pancreatic carcinoma (1-4). Recently Also, microarray techniques are used to study the tumor specific Gene expression in various types of cancer, i.a. also in pancreatic carcinoma, applied (5-20). Previous investigations of the tumor-specific Gene expression in pancreatic carcinoma was assessed using whole tissue samples or performed with cell lines. In cell lines can but by the conditions in vitro changes in gene expression be induced, which are not so in vivo.

Sowohl der Tumor als auch das Pankreasnormalgewebe verfügen über eine heterogene Struktur. Gewebeproben aus dem duktalen Adenomakarzinom des Pankreas enthalten daher verschiedene Zelltypen, wie duktale Zellen, azinöse Zellen, Inselzellen, Entzündungs- und Nervenzellen, sowie fibrozystische Elemente. Wenn ganze Gewebeproben in Microarray-Untersuchungen eingesetzt werden, kann das erhaltene Expressionsprofil sowohl das Tumorgewebe als auch das benachbarte nicht-neoplastische Gewebe repräsentieren, was die erhaltenden Daten fragwürdig erscheinen läßt.Either the tumor as well as the normal pancreatic tissue have a heterogeneous structure. Tissue samples from the ductal adenoma of the pancreas therefore different cell types, such as ductal cells, acinar cells, Islet cells, inflammatory and nerve cells, as well as fibrocystic elements. When whole tissue samples in microarray examinations can be used, the expression profile obtained both the Tumor tissue as well as the adjacent non-neoplastic tissue represent what the data obtained questionable to appear.

Aufgabe der Erfindung ist es, neue Verfahren für die Diagnose und Prognose sowie neue Verbindungen für die Behandlung des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas, bereitzustellen.task The invention is to provide new methods for diagnosis and prognosis as well as new connections for the treatment of pancreatic carcinoma, especially of the ductal Adenoma carcinoma of the pancreas.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur in vitro Diagnose eines Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas, wobei die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene in einer Probe biologischen Ursprungs eines Individuums bestimmt wird. Die Menge an Genprodukt in der Probe biologischen Ursprungs eines Individuums wird mit der Menge des entsprechenden Genprodukts, die in normalem Pankreasepithelgewebe üblicherweise vorliegt, verglichen. Falls es sich um ein in der Tabelle 1 aufgeführtes Gen handelt, ist eine erhöhte Menge des Genprodukt ein Indiz für das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms. Falls es sich um ein in der Tabelle 2 aufgeführtes Gen handelt, ist eine erniedrigte Menge des Genprodukts ein Indiz für das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms.According to the invention Task solved by a method for the in vitro diagnosis of a pancreatic carcinoma, in particular the ductal adenoma carcinoma of the pancreas, wherein the Amount of gene product of at least one of the in Table 1 and / or Table 2 listed Genes in a sample of biological origin of an individual determined becomes. The amount of gene product in the sample of biological origin of an individual is compared with the amount of the corresponding gene product, which is usually present in normal pancreatic epithelial tissue compared. If it is a gene listed in Table 1, is an increased amount of the gene product an indication of the presence of pancreatic carcinoma. If it is in the Table 2 listed Gene is a decreased amount of the gene product is an indication for the Presence of pancreatic carcinoma.

Der Erfindung liegt eine Untersuchung zugrunde, in der ermittelt wurde, welche Gene im Pankreaskarzinom eine veränderte Expressionshöhe gegenüber dem normalen Pankreasephithelgewebe erfahren. Dazu wurde eine Mikrodissektion von humanem Pankreastumorgewebe und von normalem ductalem Pankreasepithelgewebe durchgeführt und anschließend eine vergleichende Untersuchung der Genexpression mittels des U133 Sets von Affymetrix (Affymetrix Human Genome U133 Set, Santa Clara, CA, USA, Bestellnummer: 900444) durchgeführt, das 45 000 Fragmente, die zu 33 000 bekannten Genen und 6 000 expressed sequence tags (ESTs) korrespondieren, enthält.Of the Invention is based on an investigation in which it was determined Which genes in pancreatic carcinoma have an altered expression level compared to normal pancreatic epithelial tissue. This was a microdissection of human pancreatic tissue and of normal ductal pancreatic epithelial tissue carried out and subsequently a comparative study of gene expression using the U133 Sets of Affymetrix (Affymetrix Human Genome U133 Set, Santa Clara, CA, USA, Order Number: 900444) containing 45,000 fragments, the genes known to be 33,000 and 6,000 expressed sequence tags (ESTs) correspond.

Auf diese Weise wurden Nukleinsäuresequenzen und Proteine identifiziert, die im Pankreaskarzinom eine veränderte Expressionshöhe gegenüber dem normalen Pankreasepithelgewebe erfahren. Die veränderte Expression dieser Gene ist ursächlich mit dem Pankreastumor verbunden.On this way, were nucleic acid sequences and proteins identified in pancreatic carcinoma an altered expression level over the normal pancreatic epithelial tissue. The altered expression of these genes is the cause connected to the pancreatic tumor.

Bei der Erfindung zugrunde liegenden wissenschaftlichen Untersuchung wurde das Verfahren der Mikrodissektion zur Probengewinnung angewandt, um sicherzustellen, dass die verwendeten Pankreastumorgewebeproben homogen sind und kein nicht-neoplastisches Gewebe enthalten. Aufgrund der reduzierten Heterogenität des mikrodissektierten Gewebes können auch kleinste Veränderungen in der Genexpression beobachtet werden.at The invention underlying scientific investigation the method of microdissection was used for sample collection, to make sure the pancreatic tumor tissue samples used are homogeneous and contain no non-neoplastic tissue. by virtue of the reduced heterogeneity of the microdissected tissue even the smallest changes be observed in gene expression.

Zudem wurde in den bisherigen Untersuchungen nur ein kleiner Teil des menschlichen Transkriptoms untersucht. Damit war es bisher nicht möglich, alle Gene, deren Expression beim duktalen Adenomakarzinom des Pankreas verändert ist, zu identifizieren. Bei der zugrundelegenden Untersuchung mit dem Affymetrix U133 Chip wurde hingegen das komplette Genom untersucht.moreover was in the previous investigations only a small part of the examined human transcriptome. It has not been that way yet possible, all genes whose expression in ductal adenoma carcinoma of the pancreas changed is to identify. In the underlying investigation with The Affymetrix U133 chip, on the other hand, was used to examine the entire genome.

Beim Vergleich der erhaltenen Genexpressionsprofile wurden insgesamt 1419 differentiell exprimierte Gene gefunden (650 hochregulierte und 769 herunterregulierte Gene). Überraschenderweise war nur ein Bruchteil dieser Gene bereits zuvor von anderen Gruppen als mit Pankreastumor in Verbindung stehend beschrieben worden. Von 1267 der gefundenen 1419 Gene war hingegen nicht bekannt, dass sie im Zusammenhang mit Pankreastumor stehen.At the Comparison of the gene expression profiles obtained were overall 1419 differentially expressed genes were found (650 upregulated and 769 downregulated genes). Surprisingly, it was only a fraction of these genes previously from other groups than with pancreatic tumor has been described. From 1267 of the 1419 genes found, however, were not known to be related to pancreatic tumor.

In Tabelle 1 sind Gene aufgeführt, deren Expression im duktalen Adenomakarzinom des Pankreas im Mittel mindestens doppelt so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe. D. h. der Quotient („Fold Change") aus den Expressionswerten im mikrodissektierten duktalen Adenomakarzinom des Pankreas (Mittel über 14 Patienten) und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten duktalen Pankreasepithelgewebe (Mittel über 11 Personen) ist für diese Gene > 2. Wird für ein Gen der Quotient („Fold Change") 1000 angegeben, bedeutet dies, dass das Gen nur in dem Tumor-, aber nicht in dem Normalgewebe nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind fortlaufend nummeriert. Zur Charakterisierung werden jeweils die Identifikationsnummer des Affymetrix-Probensets, das Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale Lokalisation, die repräsentative Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes und die des zugehörigen Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern in der Entrez-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert (in Prozent) gibt an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete Auswerteprogramm eine differentielle Genexpression voraussagt.In Table 1 lists genes, their expression in ductal adenoma carcinoma of the pancreas on average is at least twice as high as expression in normal pancreatic epithelial tissue. Ie. the quotient ("Fold Change ") from the Expression levels in microdissected ductal adenoma carcinoma of the pancreas (means over 14 patients) and the expression levels in the healthy microdissected ductal pancreatic epithelial tissue (mean over 11 people) is for this Genes> 2. Used for a gene the quotient ("fold change") 1000 indicated, this means that the gene is only present in the tumor, but not in the tumor Normal tissue could be detected. The genes are continuous numbered. To characterize each identification number of the Affymetrix sample set, the gene symbol, the gene name, the chromosomal Localization, the representative Identification number (ID), the identification number of the transcript and those of the associated Protein indicated (publication numbers in the Entrez database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). The q value (in percent) indicates with which statistical error the used Evaluation program predicts a differential gene expression.

In Tabelle 2 sind Gene aufgeführt, deren Expression im duktalen Adenomakarzinom des Pankreas im Mittel maximal halb so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe. D. h. der Quotient („Fold Change") aus den Expressionswerten im mikrodissektierten duktalen Adenomakarzinom des Pankreas (Mittel über 14 Patienten) und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten duktalen Pankreasepithelgewebe (Mittel über 11 Personen) ist für diese Gene < 0,5. Wird für ein Gen der Quotient („Fold Change") 1000 angegeben, bedeutet dies, dass das Gen nur im Normalgewebe, aber nicht im Tumorgewebe nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind ab der Nummer 541 fortlaufend nummeriert. Zur Charakterisierung werden jeweils die Identifikationsnummer des Affymetrix-Probensets, das Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale Lokalisation, die repräsentative Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes und die des zugehörigen Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern in der Entrez-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert (in Prozent) gibt an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete Auswerteprogramm eine differentielle Genexpression voraussagt.In Table 2 lists genes, their expression in ductal adenoma carcinoma of the pancreas on average at most half as high as expression in normal pancreatic epithelial tissue. Ie. the quotient ("Fold Change ") from the Expression levels in microdissected ductal adenoma carcinoma of the pancreas (means over 14 patients) and the expression levels in the healthy microdissected ductal pancreatic epithelial tissue (mean over 11 people) is for this Gene <0.5. Becomes for a Gen the quotient ("Fold Change ") 1000, This means that the gene is only in normal tissue, but not in tumor tissue could be detected. The genes are consecutive from number 541 numbered. To characterize each identification number of the Affymetrix sample set, the gene symbol, the gene name, the chromosomal Localization, the representative Identification number (ID), the identification number of the transcript and those of the associated Protein indicated (publication numbers in the Entrez database National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). The q-value (in percent) gives with which statistical error the evaluation program used predicts differential gene expression.

Die Probe biologischen Materials, die zur Diagnose des Pankreaskarzinoms einem Patienten entnommen wird, ist eine Gewebe- oder Blut- oder Serumprobe, die Proteine und/oder Nukleinsäuren enthält. Bevorzugt enthält die Probe Pankreasgewebe, das durch während der operativen Entfernung oder einer Feinnadelbiopsie oder einer ERCP einem Patienten entnommen wird. Das entnommene Gewebe wird in flüssigen Stickstoff eingefroren oder in andere Flüssigkeiten z.B: RNAlater eingebracht, welche die Integrität der RNA, der DNA und der Proteine gewährleistet. Alsdann werden von dem gefrorenen Gewebeblock in einem Kryostaten einzelne Schnitte mit der größe von ca. 10 μm hergestellt. Diese Schnitte werden in Ethanol fixiert und mit Hematoxilin angefärbt. Unter dem Mikrospkop wird dann mittels eines spitzen Gegenstandes oder eines Laserstrahls das entsprechende interessierende Gewebe herausgelöst und in ein Behältnis gegeben. Dazu wird eine Flüssigkeit hinzugefügt, welche die in dem Gewebe enthaltene RNA, DNS, oder Protein- Moleküle konserviert.The Sample biological material used to diagnose pancreatic carcinoma is taken from a patient, is a tissue or blood or Serum sample containing proteins and / or nucleic acids. Preferably, the sample contains Pancreatic tissue that through during the surgical removal or a fine needle biopsy or a ERCP is taken from a patient. The removed tissue is in liquid Frozen nitrogen or introduced into other liquids, for example: RNAlater, which the integrity the RNA, DNA and proteins. Then be of the frozen tissue block in a cryostat single cuts with the size of approx. 10 μm produced. These sections are fixed in ethanol and stained with hematoxylin. Under The microscope is then by means of a sharp object or a laser beam, the corresponding tissue of interest dissolved out and in a container given. This is a liquid added which conserves the RNA, DNA, or protein molecules contained in the tissue.

Alternativ erfolgt die Bestimmung in einer Blutprobe oder Serum oder Plasma, das aus dem Blut des Patienten gewonnen wurde. Desweiteren erfolgt die Bestimmung in einer Probe des Stuhls, der Gallengangs- oder der Pankreasflüssigkeit die aus dem Patienten gewonnen wurde.alternative the determination is carried out in a blood sample or serum or plasma, which was obtained from the blood of the patient. Furthermore takes place the determination in a sample of the stool, the bile duct or the pancreatic fluid which was won from the patient.

In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens wird zusätzlich die Menge an entsprechendem Genprodukt in einer Kontrollprobe untersucht und mit der Menge an Genprodukt in der Patientenprobe verglichen. Bei der Kontrollprobe handelt es sich bevorzugt um die entsprechende Gewebeprobe eines Gesunden oder gesundes Pankreasgewebe eines an Pankreaskarzinom Erkrankten.In preferred embodiments the procedure becomes additional examined the amount of corresponding gene product in a control sample and compared with the amount of gene product in the patient sample. The control sample is preferably the corresponding one Tissue sample of a healthy or healthy pancreatic tissue on Pancreatic cancer patients.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens wird zusätzlich die Menge an Genprodukt mindestens eines Referenzgens bestimmt.In further preferred embodiments the procedure becomes additional determines the amount of gene product of at least one reference gene.

Bei dem Referenzgen handelt es sich vorzugsweise um ein Gen, das sowohl im Pankreaskarzinom als auch im normalen Pankreasepithelgewebe exprimiert wird und im Pankreaskarzinom keine veränderte Expressionshöhe gegenüber dem normalen Pankreasepithelgewebe erfährt. Bevorzugte Referenzgene sind konstitutiv exprimierte sog. household genes. Bevorzugte Referenzgene sind beta-Actin (NM_001101), Cyclophilin A (NM_021130) oder G6PD (NM_000402).at the reference gene is preferably a gene that both expressed in pancreatic carcinoma as well as in normal pancreatic epithelial tissue and in pancreatic carcinoma no altered expression level compared to the normal pancreatic epithelium experiences. Preferred reference genes are constitutively expressed so-called household genes. Preferred reference genes are beta-actin (NM_001101), cyclophilin A (NM_021130) or G6PD (NM_000402).

In den Tabellen 3 und 4 sind weitere Gene aufgeführt, die im Pankreaskarzinom eine veränderte Expressionshöhe gegenüber dem normalen Pankreasepithelgewebe erfahren.In Tables 3 and 4 show other genes that are found in pancreatic carcinoma a changed one expression level across from the normal pancreatic epithelial tissue.

Von diesen Genen war bereits vor der der Erfindung zugrundeliegenden Untersuchung des kompletten Transkriptoms bekannt, dass sie mit Pankreaskarzinom in Verbindung stehen.From These genes were already before the invention of the underlying Examination of the complete transcriptome is known to be associated with Pancreatic carcinoma.

In Tabelle 3 sind dabei Gene aufgeführt, deren Expression im duktalen Adenomakarzinom des Pankreas im Mittel mindestens doppelt so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe. D. h. der Quotient („Fold Change") aus den Expressionswerten im mikrodissektierten duktalen Adenomakarzinom des Pankreas (Mittel über 14 Patienten) und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten duktalen Pankreasepithelgewebe (Mittel über 11 Personen) ist für diese Gene > 2. Wird für ein Gen der Quotient („Fold Change") 1000 angegeben, bedeutet dies, dass, dass das Gen nur in dem Tumor-, aber nicht in dem Normalgewebe nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind ab Nummer 1268 fortlaufend nummeriert. Zur Charakterisierung werden jeweils die Identifikationsnummer des Affymetrix-Probensets, das Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale Lokalisation, die repräsentative Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes und die des zugehörigen Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern in der Entrez-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert (in Prozent) gibt an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete Auswerteprogramm eine differentielle Genexpression voraussagt.In Table 3 lists genes, their expression in ductal adenoma carcinoma of the pancreas on average is at least twice as high as expression in normal pancreatic epithelial tissue. Ie. the quotient ("Fold Change ") from the Expression values in the microdissected ductal adenoma carcinoma of the Pancreas (means over 14 patients) and the expression levels in the healthy microdissected ductal pancreatic epithelial tissue (mean over 11 people) is for this Genes> 2. Used for a gene the quotient ("fold change") 1000 indicated, This means that the gene is only in the tumor, but not could be detected in the normal tissue. The genes are off Number 1268 consecutively numbered. To be characterization respectively the identification number of the Affymetrix sample set, the Gene symbol, the gene name, the chromosomal localization, the representative Identification number (ID), the identification number of the transcript and those of the associated Protein indicated (publication numbers in the Entrez database National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). The q-value (in percent) gives with which statistical error the evaluation program used predicts differential gene expression.

In Tabelle 4 sind Gene aufgeführt, deren Expression im duktalen Adenomakarzinom des Pankreas im Mittel maximal halb so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe. D. h. der Quotient („Fold Change") aus den Expressionswerten im mikrodissektierten duktalen Adenomakarzinom des Pankreas (Mittel über 14 Patienten) und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten duktalen Pankreasepithelgewebe (Mittel über 11 Personen) ist für diese Gene < 0,5. Wird für ein Gen der Quotient („Fold Change") 1000 angegeben, bedeutet dies, dass das Gen nur im Normalgewebe, aber nicht im Tumorgewebe nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind ab der Nummer 1378 fortlaufend nummeriert. Zur Charakterisierung werden jeweils die Identifikationsnummer des Affymetrix-Probensets, das Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale Lokalisation, die repräsentative Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes und die des zugehörigen Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern in der Entrez-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert (in Prozent) gibt an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete Auswerteprogramm eine differentielle Genexpression voraussagt.In Table 4 lists genes, their expression in ductal adenoma carcinoma of the pancreas on average at most half as high as expression in normal pancreatic epithelial tissue. Ie. the quotient ("Fold Change ") from the Expression levels in microdissected ductal adenoma carcinoma of the pancreas (means over 14 patients) and the expression levels in the healthy microdissected ductal pancreatic epithelial tissue (mean over 11 people) is for this Gene <0.5. Becomes for a Gen the quotient ("Fold Change ") 1000, This means that the gene is only in normal tissue, but not in tumor tissue could be detected. The genes are continuous from the number 1378 numbered. To characterize each identification number of the Affymetrix sample set, the gene symbol, the gene name, the chromosomal Localization, the representative Identification number (ID), the identification number of the transcript and those of the associated Protein indicated (publication numbers in the Entrez database National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). The q-value (in percent) gives with which statistical error the evaluation program used predicting differential gene expression.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt zusätzlich zur Bestimmung der Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene in einer Probe biologischen Ursprungs eines Individuums noch die Bestimmung der Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführten Gene. Die Menge an Genprodukt in der Probe biologischen Ursprungs eines Individuums wird mit der Menge des entsprechenden Genprodukts, die in normalem Pankreasepithelgewebe üblicherweise vorliegt, verglichen. Falls es sich um ein in der Tabelle 3 aufgeführtes Gen handelt, ist eine erhöhte Menge des Genprodukt ein Indiz für das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms. Falls es sich um ein in der Tabelle 4 aufgeführtes Gen handelt, ist eine erniedrigte Menge des Genprodukts ein Indiz für das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms.In a preferred embodiment the method according to the invention additionally for determining the amount of gene product of at least one of in Table 1 and / or Table 2 listed genes in a biological sample Origin of an individual nor the determination of the amount of gene product of at least one of the genes listed in Table 3 and / or Table 4. The amount of gene product in the sample of biological origin of a Individual is treated with the amount of the corresponding gene product, the is present in normal pancreatic epithelial tissue, compared. If it is a gene listed in Table 3, is a increased Quantity of gene product an indication of the presence of pancreatic carcinoma. If it is in the Table 4 listed Gene is a decreased amount of the gene product is an indication for the Presence of pancreatic carcinoma.

Durch die Messung eines solchen zusätzlichen Markers (Gene aus Tabelle 3 und/oder Tabelle 4) wird die Aussagekraft des erfindungsgemäßen Verfahrens noch weiter erhöht.By the measurement of such an additional Markers (genes from Table 3 and / or Table 4) becomes meaningful the method according to the invention even further increased.

Ein Genprodukt ist eine mRNA, die daraus durch reverse Transkription erhältliche cDNA, das kodierte Protein oder Fragmente davon. Die Quantifizierung der Genprodukte erfolgt dabei jeweils mit den gängigen Verfahren.One Gene product is an mRNA resulting from reverse transcription available cDNA, the encoded protein or fragments thereof. The quantification The gene products are each carried out using the usual methods.

Die Genprodukte mRNA bzw. die durch reverse Transkription der mRNA erhältliche cDNA werden bevorzugt durch den Einsatz von Hybridisierungstechniken quantifiziert, beispielsweise durch einen Northern Blot, in situ Hybridisierung mit antisense-RNA, quantitative PCR (polymerase chain reaction) oder mit Hilfe eines Oligonukleotid- oder eines cDNA-Mikroarrays (z.B. DNA-Chip).The Gene products mRNA or by reverse transcription of mRNA available cDNA are preferred through the use of hybridization techniques quantified, for example by a Northern blot, in situ Hybridization with antisense RNA, quantitative PCR (polymerase chain reaction) or with the aid of an oligonucleotide or a cDNA microarray (e.g., DNA chip).

Die Oligonukleotide, die für die verschiedenen Nachweistechniken mittels Hybridisierung eingesetzt werden, haben Sequenzen, die komplementär zu Teilsequenzen des zu detektierenden Genprodukts sind, und sind vorzugsweise mit einem chromogenen, radioaktiven, fluoreszierenden oder durch andere gängige Methoden detektierbaren Markermolekül markiert. Beispiele für solche Markermoleküle sind Digoxygenin, Biotin, Fluorescein, ³²P ³³P, usw.The oligonucleotides used for the different detection techniques by hybridization have sequences that are complementary to partial sequences of the gene product to be detected, and are preferably labeled with a chromogenic, radioactive, fluorescent or by other current methods detectable marker molecule. Examples of such marker molecules are digoxygenin, biotin, fluorescein, ³² P ³³ P, etc.

Bevorzugt erfolgt die quantitative Messung der Expression des Genprodukts mRNA mittels quantitativer RT-PCR. In dem bekannten Prozess der RT-PCR wird zunächst mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) basierend auf der isolierten RNA komplementäre DNA (cDNA) synthetisiert. Als Primer für die RT kann grundsätzlich ein Oligo-dT verwendet werden. Die Verwendung von Random-Hexamer-Primern für die RT führt jedoch zu einer deutlichen Erhöhung der Sensitivität. Das Random-Hexamer-Oligonukleotid enthält jeweils eine Mischung von A, G, T, C an allen sechs Positionen und hybridisiert unspezifisch mit mRNA-Sequenzen.Prefers the quantitative measurement of the expression of the gene product is carried out mRNA by quantitative RT-PCR. In the known process of RT-PCR is first with the help of the enzyme reverse transcriptase (RT) based on the isolated RNA complementary DNA (cDNA) synthesized. As a primer for the RT can in principle a Oligo-dT can be used. The use of random hexamer primers for the RT leads however to a significant increase the sensitivity. The random hexamer oligonucleotide each contains a mixture of A, G, T, C at all six positions and hybridizes nonspecifically with mRNA sequences.

Einzelne cDNAs werden in der anschließenden PCR mit einem sequenzspezifischen Primerpaar amplifiziert. Die Primer für die PCR haben bevorzugt eine Länge von 15 bis 30 Basenpaaren und werden Intron-überlappend konzipiert, um im Falle einer Verunreinigung der RNA mit genomischer DNA nur cDNA zu amplifizieren.Separate cDNAs are used in the subsequent PCR amplified with a sequence-specific primer pair. The primers for the PCR preferably have a length from 15 to 30 base pairs and are designed to be intron-overlapping in the In case of contamination of the RNA with genomic DNA only cDNA to amplify.

Besonders bevorzugt wird die PCR als Real-time-PCR durchgeführt. Bekannte Real-time PCR Verfahren sind z. B. die TaqMan^®, FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer), LightCycler^® und Beacon-Verfahren. Durch die Verwendung von Fluoreszenz-markierten Primern oder den Einsatz von genspezifischen Oligonukleotiden als Hybridisierungsproben mit unterschiedlicher Farbstoff- oder Fluoreszenzmarker-Anbindung (TaqMan^®, FRET, Beacon) kann bei diesen Verfahren vorteilhaft das PCR-Produkt während der PCR spezifisch quantifiziert werden.The PCR is particularly preferably carried out as a real-time PCR. Known real-time PCR methods are z. B. TaqMan ^®, FRET (fluorescence resonance energy transfer), LightCycler ^® and Beacon method. By using fluorescent-labeled primers or the use of gene-specific oligonucleotides as hybridization probes with different dye or fluorescent marker-binding (TaqMan ^®, FRET, beacon), the PCR product be specifically quantified during the PCR in these methods advantageous.

Die PCR-Verfahren eignen sich auch zur Durchführung als Multiplex-PCR. Bei einer Multiplex-PCR unterscheiden sich die Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen die Primer bzw. Hybridisierungssonden markiert sind, in ihren Absorptions- und/oder Emissionsspektren. Dies ermöglicht beispielsweise eine parallele Quantifizierung der amplifizierten cDNAs verschiedener pankreastumorspezifischen Gene bzw. die parallele Quantifizierung der cDNA eines Referenzgens bzw. einer Referenzprobe.The PCR methods are also suitable for use as multiplex PCR. at a multiplex PCR differ the fluorescent dyes, with which the primers or hybridization probes are labeled, in their absorption and / or emission spectra. This allows for example a parallel quantification of the amplified cDNAs of various pancreatic tumor-specific genes or parallel quantification the cDNA of a reference gene or a reference sample.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose mittels RT-PCR wird bevorzugt ein diagnostischer Kit verwendet, der jeweils folgende Bestandteile enthält:

1) für die cDNA-Synthese: a) Random-Hexamer-Primer, b) Reverse Transkriptase;
2) für die PCR: a) mindestens zwei Primer, die mit der cDNA eines der Gene, ausgewählt aus den Gruppen der tumorspezifischen Gene aus den Tabellen Nr. 1 und/oder Nr. 2 hybridisieren; b) eine über 80°C beständige DNA-Polymerase, wie z. B. Taq-Polymerase; sowie dNTP-Mix (bevorzugt 10mmol/l), DDT, RNase-Inhibitor und entsprechende Reaktionspuffer.

For carrying out the method according to the invention for the diagnosis by means of RT-PCR, a diagnostic kit which contains in each case the following components is preferably used:

1) for cDNA synthesis: a) random hexamer primer, b) reverse transcriptase;
2) for the PCR: a) at least two primers which hybridize with the cDNA of one of the genes selected from the groups of the tumor-specific genes from Tables No. 1 and / or No. 2; b) a more than 80 ° C resistant DNA polymerase such. B. Taq polymerase; and dNTP mix (preferably 10 mmol / l), DDT, RNase inhibitor and corresponding reaction buffer.

In einer weniger bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit für die cDNA-Synthese oligo-dT anstelle des Random-Hexamers.In a less preferred embodiment contains the kit for the cDNA synthesis oligo-dT instead of the random hexamer.

In einer alternativen Ausführungsform enthält das Kit zusätzlich mindestens zwei Primer, die mit der cDNA eines der Gene, ausgewählt aus den Gruppen der tumorspezifischen Gene aus den Tabellen 3 und 4 hybridisieren.In an alternative embodiment contains the kit in addition at least two primers containing the cDNA of one of the genes selected from hybridize to the groups of tumor-specific genes from Tables 3 and 4.

In einer Ausführungsform des Kits ist jeweils einer der Primer für das tumorspezifische Gen Fluoreszenz-markiert.In an embodiment Each of the kit is one of the primers for the tumor-specific gene Fluorescence-labeled.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der diagnostische Kit zur Durchführung einer Real-Time PCR bevorzugt als zusätzliche Bestandteile:

c) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden, die spezifisch mit einem tumorspezifischen Gen aus Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 hybridisieren, und
d) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden, die spezifisch mit dem Referenzgen hybridisieren.

In a particularly preferred embodiment, the diagnostic kit for carrying out a real-time PCR preferably contains as additional constituents:

c) a fluorescence-labeled hybridization probe or a pair of fluorescently labeled hybridization probes which specifically hybridize to a tumor-specific gene from Table 1 and / or Table 2, and
d) a fluorescently labeled hybridization probe or a pair of fluorescently labeled hybridization probes that specifically hybridize to the reference gene.

Sowohl als Primer, als auch als Hybridisierungssonden werden bevorzugt DNA-Oligonukleotide mit einer Länge von 10 bis 30 Nukleotiden gewählt.Either as primers, as well as hybridization probes are preferred DNA oligonucleotides with a length chosen from 10 to 30 nucleotides.

In einer Ausführungsform enthält die Hybridisierungssonde neben dem Fluoreszenzfarbstoff einen weiteren Farbstoff, der durch einen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) die Fluoreszenz quencht, solange die Probe nicht mit der amplifizierten cDNA hybridisiert.In an embodiment contains the hybridization probe next to the fluorescent dye another Dye, by a fluorescence resonance energy transfer (FRET) the fluorescence quenches as long as the sample does not match the amplified cDNA hybridized.

In einer alternativen Ausführungsform des Kits werden zwei Hybridisierungssonden eingesetzt, bei denen jeweils eine Sonde mit einem Farbstoff markiert ist. Ein solches Sondenpaar wird so gewählt, dass sie in einem geringen Abstand, bevorzugt im Abstand von 1-5 bp, auf der amplifizierten cDNA hybridisieren. Durch die Hybridisierung werden die Fluoreszenzfarbstoffe so nahe zueinander gebracht, dass FRET stattfindet und die cDNA quantifiziert werden kann. Anschließend werden (in der Extensionsphase der PCR), durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase, die Sonden von der cDNA abgetrennt. In einer bevorzugten Variante ist in einem Sondenpaar, die erste Sonde am 3'-Ende mit Fluoreszein (FL) und die andere an ihrem 5'-Ende mit LightCycler-Red-640 markiert.In an alternative embodiment The kit uses two hybridization probes in which one probe each is labeled with a dye. Such Probe pair is chosen that they are at a small distance, preferably at intervals of 1-5 bp, on the amplified cDNA. By the hybridization The fluorescent dyes are brought so close to each other, that FRET takes place and the cDNA can be quantified. Then be (in the extension phase of the PCR), by the exonuclease activity of the polymerase, the probes are separated from the cDNA. In a preferred variant is in a pair of probes, the first probe at the 3 'end with fluorescein (FL) and the other at its 5'-end marked with LightCycler-Red-640.

Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonden sind z. B. als LightCycler^®, TaqMan^® oder „molecular beacons" auf dem Markt und ermöglichen eine Quantifizierung während der PCR.Fluorescence-labeled hybridization probes are e.g. B. as LightCycler ^®, TaqMan ^® or "molecular beacons" in the market and enable quantification during PCR.

Der Nachweis über Hybridisierung erfolgt in einer alternativen Ausführung des Verfahrens unter Verwendung eines Nukleinsäure-Arrays, z.B. eines DNA-Chips.Of the Proof about Hybridization takes place in an alternative embodiment of the Method using a nucleic acid array, e.g. a DNA chip.

DNA-Chips, auch als DNA-Mikroarrays bekannt, sind miniaturisierte Träger, meist aus Glas oder Silizium, auf deren Oberfläche DNA-Moleküle bekannter Sequenz in einem geordneten Raster in hoher Dichte immobilisiert werden. Die oberflächengebundenen DNA-Moleküle werden mit komplementären, eventuell markierten Nukleinsäuren hybridisiert. Die Markierung ist vorzugsweise ein Fluoreszenzfarbstoff.DNA chips, Also known as DNA microarrays are miniaturized carriers, mostly made of glass or silicon, on whose surface DNA molecules known Sequence immobilized in an ordered grid in high density become. The surface-bound DNA molecules be with complementary, possibly labeled nucleic acids hybridized. The label is preferably a fluorescent dye.

Bei Oligonukleotid-Chips stellen die Oligonukleotide, die auf einem erfindungsgemäßen DNA-Chip gebunden sein können, Teilsequenzen der Genprodukte (mRNA, bzw. daraus abgeleitete cDNA) in der sense- oder antisense-Richtung dar. Es können ein oder mehrere Oligonukleotide pro Gen auf dem DNA-Chip gebunden sein. Bevorzugt sind 25 Nukleotid lange Oligonukleotide, die aus dem nicht kodierenden Strang abgeleitet sind. Diese werden bevorzugt aus dem jeweiligen 3' untranslatierten Ende des Gens ausgewählt. Zur Detektion können Oligonukleotide von einem Gen, mehreren Genen oder allen Genen ausgewählt werden.at Oligonucleotide chips represent the oligonucleotides that are on a DNA chip according to the invention can be bound Partial sequences of the gene products (mRNA, or cDNA derived therefrom) in the sense or antisense direction. One or more oligonucleotides be bound to the DNA chip per gene. 25 nucleotides are preferred long oligonucleotides derived from the noncoding strand. These are preferably selected from the respective 3 'untranslated end of the gene. to Detection can Oligonucleotides can be selected from one gene, multiple genes or all genes.

Die Erfindung betrifft daher weiterhin die Verwendung mindestens eines Oligonukleotids, das der vollständigen cDNA-Sequenz oder einer Teilsequenz bzw. komplementären Sequenz eines der in Tabelle 1 und/oder 2 aufgeführten Gene entspricht, zur Diagnoses des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas. Das Oligonukleotid kann dazu als Primer in einer PCR oder als Hybridisierungssonde eingesetzt werden. Das verwendete Oligonukleotid bzw. die verwendeten Oligonukleotide sind dabei vorzugsweise auf einem festen Träger (DNA-Chip) immobilisiert.The invention therefore furthermore relates to the use of at least one oligonucleotide which corresponds to the complete cDNA sequence or a partial sequence or complementary sequence of one of the genes listed in Table 1 and / or 2 for the diagnosis of pancreatic carcinoma, in particular of the ductal Adenoma carcinoma of the pancreas. The oligonucleotide can be used as a primer in a PCR or as a hybridization probe. The oligonucleotide used or the oligonucleotides used are preferably immobilized on a solid support (DNA chip).

In einer alternativen Ausführungsform wird zusätzlich mindestens ein Oligonukleotid, das der vollständigen cDNA-Sequenz oder einer Teilsequenz bzw. komplementären Sequenz eines der in Tabelle 3 und/oder 4 aufgeführten Gene entspricht, zur Diagnoses des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas verwendet. Das verwendete Oligonukleotid bzw. die verwendeten Oligonukleotide sind dabei vorzugsweise auf einem Chip immobilisiert.In an alternative embodiment will be added at least one oligonucleotide, that of the complete cDNA sequence or a Partial sequence or complementary Sequence corresponds to one of the genes listed in Table 3 and / or 4, to Diagnosis of pancreatic carcinoma, in particular of ductal adenoma carcinoma used by the pancreas. The oligonucleotide or the used Oligonucleotides are preferably immobilized on a chip.

Ist das zu quantifizierende Genprodukt ein Protein oder ein Proteinfragment, erfolgt die Bestimmung der Menge an Genprodukt vorzugsweise durch Antikörper-basierte Nachweismethoden.is the gene product to be quantified, a protein or a protein fragment, the determination of the amount of gene product is preferably carried out by Antibody-based Detection methods.

Dazu werden spezifische Antikörper gegen eines oder mehrere Proteine, die von den in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Genen kodiert werden, hergestellt. In einer alternativen Ausführungsform werden zusätzlich Antikörper gegen eines oder mehrere Proteine, die von den in Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführten Genen kodiert werden, eingesetzt.To become specific antibodies against one or more proteins different from those shown in Table 1 and / or Table 2 listed Genes are produced. In an alternative embodiment be additional antibody against one or more proteins different from those shown in Table 3 and / or Table 4 listed Genes are used.

Bei den Antikörpern handelt es sich beispielsweise um monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, single chain Antikörper oder Fragmente davon. Sie sind spezifisch für das gesamte Protein oder nur gegen Fragmente davon. Die Gewinnung eines solchen Antikörpers erfolgt nach Standardmethoden beispielsweise durch Immunisierung von Versuchstieren. Die Antikörper werden dann z.B. in einem ELISA (enzyme linked immunsorbent assay), in einem RIA (radio-immunoassay) oder in der Immunhistochemie zur Quantifizierung des Genprodukts verwendet.at the antibodies these are, for example, monoclonal antibodies, polyclonal Antibody, single chain antibody or fragments thereof. They are specific to the entire protein or only against fragments of it. The recovery of such an antibody takes place according to standard methods, for example by immunization of experimental animals. The antibodies will then be e.g. in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in an RIA (radio-immunoassay) or in immunohistochemistry for Quantification of the gene product used.

Ein Antikörper-Array bzw. Antikörperchip, auf dessen Oberfläche mindestens ein Antikörper, der spezifisch für ein von den in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Genen kodiertes Protein ist, in einem geordneten Rahmen in hoher Dichte immobilisiert ist, eignet sich ebenfalls zur erfindungsgemäßen Diagnose des Pankreaskarzinoms. Die Dektektion der Protein-Protein-Interaktion erfolgt vorzugsweise durch Massenspektrometrie, Fluoreszenz oder surface plasmon resonance.One Antibody Array or antibody chip, on its surface at least one antibody, specific for one of the genes listed in Table 1 and / or Table 2 coded protein is high-density, in an orderly frame is immobilized, is also suitable for the diagnosis of the invention of pancreatic carcinoma. The Dectection of Protein-Protein Interaction is preferably carried out by mass spectrometry, fluorescence or surface plasmon resonance.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörper-Chips zur Diagnose des Pankreaskarzinoms.The The invention further relates to the use of an antibody chip according to the invention for the diagnosis of pancreatic carcinoma.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Beurteilung des Krankheitsverlaufs, um z.B. den Erfolg einer Therapie zu bestimmen. In diesem Fall wird die Patientenprobe mit einer älteren Probe des Patienten verglichen.The inventive method is also suitable for assessing the course of the disease, e.g. the Determine the success of a therapy. In this case, the patient sample with an older one Sample of the patient compared.

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen nach Wirkstoffen, die zur Therapie des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas, geeignet sind.One Another aspect of the invention relates to a method of screening according to active substances used for the therapy of pancreatic carcinoma, in particular ductal adenoma carcinoma of the pancreas.

Dabei wird beispielsweise eine Zelllinie eines pankreatischen duktalen Adenomakarzinoms mit einer zu testenden Substanz kontaktiert. Anschließend wird die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene bestimmt. Die Menge an Genprodukt wird dann mit der Menge des entsprechenden Genprodukts, die in einer entsprechenden nicht mit der Testsubstanz kontaktierten Zelllinie vorliegt, verglichen.there For example, a cell line of a pancreatic ductal Adenoma carcinoma contacted with a substance to be tested. Subsequently, will the amount of gene product of at least one of those in Table 1 and / or Table 2 listed Genes determined. The amount of gene product is then compared with the amount of corresponding gene product, which in a corresponding not with the test substance contacted cell line is compared.

Falls es sich um ein in Tabelle 1 aufgeführtes Genprodukt handelt, ist eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erniedrigte Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff für die Therapie des Pankreaskarzinoms ist. Falls es sich um ein in Tabelle 2 aufgeführtes Genprodukt handelt, ist eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erhöhte Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff für die Therapie des Pankreaskarzinoms ist.If it is a gene product listed in Table 1 one opposite the untreated cell line decreased amount of the gene product Indication that the test substance is a potential drug for the Therapy of pancreatic carcinoma. If it is one in table 2 listed Gene product is one compared to the untreated cell line increased Amount of gene product an indication that the test substance a potential drug for the therapy of pancreatic carcinoma is.

In einer alternativen Ausführungsform des Screeningverfahrens werden zusätzlich zur Expression von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführten Gene bestimmt.In an alternative embodiment of the screening method are in addition to the expression of at least one of the genes listed in Table 1 and / or Table 2, the amount of gene product of at least one of the genes listed in Table 3 and / or Table 4 certainly.

Falls es sich um ein in Tabelle 3 aufgeführtes Genprodukt handelt, ist eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erniedrigte Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff für die Therapie des Pankreaskarzinoms ist. Falls es sich um ein in Tabelle 4 aufgeführtes Genprodukt handelt, ist eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erhöhte Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff für die Therapie des Pankreaskarzinoms ist.If it is a gene product listed in Table 3, an amount of the gene product that is lower than the untreated cell line is an indication that the test substance is a potential drug for the treatment of pancreatic carcinoma. If it is a gene pro listed in Table 4 is an increased amount of the gene product compared to the untreated cell line, an indication that the test substance is a potential drug for the treatment of pancreatic carcinoma.

Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung mindestens eines Antisense-Konstrukts, das mindestens 12 Nukleotide einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 1 aufgeführt ist, wobei die kodierende Sequenz bezüglich des Promotors, der ihre Expression kontrolliert, in 3' zu 5' Orientierung vorliegt, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen, wobei das Antisense-Produkt den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Antisense-Konstrukt in den Krebszellen exprimiert wird.The Invention also relates to the use of at least one antisense construct, at least 12 nucleotides of a coding sequence of a gene includes that listed in Table 1 is, wherein the coding sequence with respect to the promoter, their Expression controls in 3 ' 5 'orientation is present, for the preparation of a pharmaceutical composition for treatment of pancreatic carcinoma in humans, with the antisense product is administered to the cancer cells, so that the antisense construct in the cancer cells is expressed.

Unter Antisense-Konstrukt wird dabei eine Sequenz verstanden, die zu der kodierenden Sequenz oder einer Teilsequenz der codierenden Sequenz komplementär ist, d. h. in der Lage ist mit der codierenden Sequenz über Basenpaarung einen Nukleinsäuredoppelstrang zu bilden.Under Antisense construct is understood to mean a sequence that corresponds to the coding sequence or a partial sequence of the coding sequence complementary is, d. H. capable of base-pairing with the coding sequence a nucleic acid double strand to build.

In einer alternativen Ausführungsform wird zusätzlich mindestens ein Antisense-Konstrukt, das mindestens 12 Nukleotide einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 3 aufgeführt ist, wobei die kodierende Sequenz bezüglich des Promotors, der ihre Expression kontrolliert, in 3' zu 5' Orientierung vorliegt, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen verwendet, wobei das Antisense-Produkt den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Antisense-Konstrukt in den Krebszellen exprimiert wird.In an alternative embodiment will be added at least one antisense construct containing at least 12 nucleotides a coding sequence of a gene listed in Table 3, wherein the coding sequence with respect the promoter controlling its expression is in 3 'to 5' orientation, for the Preparation of a pharmaceutical composition for treatment of pancreatic carcinoma in humans, with the antisense product the cancer cells is administered so that the antisense construct is expressed in the cancer cells.

Das Antisense-Konstrukt wird vorzugsweise durch chemische Synthese, auch unter Verwendung von stabilisierenden Nukleotidanaloga, gewonnen.The Antisense construct is preferably prepared by chemical synthesis, also using stabilizing nucleotide analogs.

Teil der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung mindestens eines doppelsträngigen RNA-Konstrukts (siRNA – small interfering RNA), das mindestens 19 Basenpaare, besonders bevorzugt 21 oder 22 Basenpaare, maximal 29 Basenpaare, einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 1 aufgeführt ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen. Die doppelsträngige RNA wird z.B. chemisch hergestellt oder mit bekannten biologische Verfahren, beispielsweise in vitro Transkription, den Einsatz von siRNA-Expressionvektoren oder PCR-Expressionskassetten.part The invention likewise relates to the use of at least one double-stranded RNA construct (siRNA - small interfering RNA) which is at least 19 base pairs, more preferred 21 or 22 base pairs, maximum 29 base pairs, one coding Sequence of a gene listed in Table 1 for the preparation a drug for the treatment of pancreatic carcinoma in humans. The double-stranded RNA is e.g. chemically produced or with known biological Methods, such as in vitro transcription, the use of siRNA expression vectors or PCR expression cassettes.

In einem bevorzugten Verfahren wird dazu beispielsweise ein cDNA Klon verwendet. Aus diesem wird mittels PCR der kodierende Teil eines in Tabelle 1 aufgeführten Gens vervielfältigt und dann durch eine in vitro Transkription doppelsträngige RNA (dsRNA) hergestellt. Diese dsRNA wird dann mit dem Enzym Dicer verdaut. Dabei entstehen die für die Wirkung notwendigen kleinen Stücke in einer Länge von z.B. 21 bp. Das entstandene Gemisch wird dann zur Therapie eingesetzt. Dabei werden die siRNA Moleküle beispielsweise intravenös dem Patienten zugeführt. Die siRNA wirken hierbei gegen die Expression der im Pankreaskarzinom spezifisch überexprimierten Gene.In For example, a preferred method is a cDNA clone used. From this is the coding part of a PCR listed in Table 1 Gene duplicated and then by double-stranded RNA through in vitro transcription (dsRNA) produced. This dsRNA is then digested with the enzyme Dicer. This creates the for the effect necessary small pieces in a length of e.g. 21 bp. The resulting mixture is then used for therapy. In the process, the siRNA molecules become for example, intravenously supplied to the patient. The siRNA act here against the expression of pancreatic carcinoma specifically overexpressed Genes.

In einer alternativen Ausführungsform wird zusätzlich mindestens ein doppelsträngiges RNA-Konstrukt, das mindestens 19 Basenpaare, besonders bevorzugt 21 oder 22 Basenpaare, maximal 29 Basenpaare, einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 3 aufgeführt ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen verwendet. Die doppelsträngige RNA ist dabei z.B. chemisch herstellbar oder über bekannte biologische Verfahren. Dazu wird beispielsweise ein cDNA Klon verwendet. Aus diesem wird mittels PCR der kodierende Teil eines in Tabelle 3 aufgeführten Gens vervielfältigt und dann durch eine in vitro Transkription dsRNA hergestellt. Diese dsRNA wird dann mit dem Enzym Dicer verdaut. Dabei entstehen die für die Wirkung notwendigen kleinen Stücke in einer Länge von z.B. 21 bp. Das entstandene Gemisch wird dann zur Therapie eingesetzt.In an alternative embodiment will be added at least one double-stranded one RNA construct that at least 19 base pairs, more preferably 21 or 22 base pairs, a maximum of 29 base pairs, comprising a coding sequence of a gene, listed in Table 3 is for the manufacture of a medicament for the treatment of pancreatic carcinoma used in humans. The double-stranded RNA is e.g. chemical producible or over known biological processes. For this example, a cDNA Used clone. This is the coding part by means of PCR one listed in Table 3 Gene duplicated and then produced by an in vitro transcription dsRNA. These dsRNA is then digested with the enzyme Dicer. This creates the for the Effect necessary small pieces in one length from e.g. 21 bp. The resulting mixture is then used for therapy.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung mindestens eines Polynukleotids, das eine kodierende Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 2 aufgeführt ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen, wobei das Polynukleotid den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Gen in den Krebszellen exprimiert wird.The Invention further relates to the use of at least one polynucleotide, which comprises a coding sequence of a gene which is shown in Table 2 listed is for the preparation of a pharmaceutical composition for Treatment of pancreatic carcinoma in humans, wherein the polynucleotide the cancer cells are administered, leaving the gene in the cancer cells is expressed.

In einer alternativen Ausführungsform wird zusätzlich mindestens ein Polynukleotid, das eine kodierende Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 4 aufgeführt ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen verwendet, wobei das Polynukleotid den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Gen in den Krebszellen exprimiert wird.In an alternative embodiment will be added at least one polynucleotide comprising a coding sequence of a Gens listed in Table 4, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of pancreatic carcinoma used in humans, where the polynucleotide is the cancer cells is administered so that the gene is expressed in the cancer cells becomes.

Das Polynukleotid wird dazu in einen viralen Vektor eingebracht und den Patienten direkt in den Tumor oder intravenös appliziert. Das Polynukleotid, in Verbindung mit einem Promotor für die Transkription, kann auch als freie DNA dem Patienten in einem Komplex mit Lipiden oder ohne eine Lipid-Komplex dem Patienten intratumoral oder intra-venös zugeführt werden.The polynucleotide is introduced into a viral vector and the patient directly into the tumor or administered intravenously. The polynucleotide, in conjunction with a transcriptional promoter, may also be delivered as a free DNA to the patient in a complex with lipids or without a lipid complex intratumorally or intraveneously to the patient.

Durch nachfolgende Figuren und Ausführungsbeispiele werden die Erfindung und die der Erfindung zugrunde liegende wissenschaftliche Erkenntnis näher erläutert. Dabei zeigenBy following figures and embodiments The invention and the scientific underlying the invention Knowledge closer explained. Show

1: 1 :

1 zeigt photographische Aufnahmen einer manuellen Mikrodissektion von Pankreasgewebe. Dabei sind in der linken Spalte die Gewebeschnitte vor der Mikrodissektion und in der rechten Spalte nach der Mikrodissektion abgebildet. Die obere Zeile zeigt Gewebe aus duktalem Adenomakarzinom des Pankreas, die untere Zeile normales duktales Epithelgewebe. 1 shows photographs of a manual microdissection of pancreatic tissue. In the left column the tissue sections are shown before the microdissection and in the right column after the microdissection. The upper row shows tissue from ductal adenoma carcinoma of the pancreas, the lower row normal ductal epithelial tissue.

2: 2 :

2 zeigt photographische Aufnahmen präparierter Gewebeschnitte nach immunhistochemischer Analyse. 2 shows photographic images of prepared tissue sections after immunohistochemical analysis.

2A, B zeigt eine Aufnahme eine CENPF-Proteinexpression in duktalen Adenokarzinomen des Pankreas (PDAC), während 2C die nicht vorhandene Expression des CENPF Proteins in normalem Pankreasgewebe zeigt. 2A B shows a photograph of a CENPF protein expression in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) while 2C shows non-existent expression of the CENPF protein in normal pancreatic tissue.

2D, E zeigt eine Aufnahme eine MCM7-Proteinexpression in duktalen Adenokarzinomen des Pankreas (PDAC), während 2F die nicht vorhandene Expression des MCM7 Proteins in normalem Pankreasgewebe zeigt. 2D E, an uptake shows an MCM7 protein expression in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) while 2F shows the non-existent expression of the MCM7 protein in normal pancreatic tissue.

2G, H zeigt eine Aufnahme eine MCM2-Proteinexpression in duktalen Adenokarzinomen des Pankreas (PDAC), während 2I die nicht vorhandene Expression des MCM2 Proteins in normalem Pankreasgewebe zeigt. 2G , H shows a picture of MCM2 protein expression in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) while 2I shows the non-existent expression of the MCM2 protein in normal pancreatic tissue.

3: 3 :

3 zeigt die Validierung der differentiellen Expression mittels RT-PCR. 3 shows the validation of differential expression by RT-PCR.

3A: RT-PCR Analyse von 5 Genen in vier Tumor und korrespondierendem Normalgewebe. Die entstandenen PCR Produkte wurden mittels einem Agarosegel separiert und mit Ethidiumbromidanfärbung sichtbar gemacht. 3A : RT-PCR analysis of 5 genes in four tumors and corresponding normal tissue. The resulting PCR products were separated by means of an agarose gel and visualized with ethidium bromide staining.

3B: Überblick über die RT-PCR Ergebnisse von Tumor- und Normalgewebe (oben), als auch Pancreaszellinien (unten). Weiss: nicht untersucht; Hellgrau: kein verwertbares PCR Signal; Mittelgrau: schwaches PCR Signal nachweisbar; Dunkelgrau: mittelstarkes PCR-Signal und Schwarz: Starkes PCR Signal nachweisbar. Die Housekeepinggene GAPDH und G6PD dienten als Vergleichskontrolle. 3B : Overview of the RT-PCR results of tumor and normal tissue (top), as well as pancreatic cell lines (bottom). Weiss: not examined; Light gray: no usable PCR signal; Middle gray: weak PCR signal detectable; Dark gray: medium PCR signal and black: strong PCR signal detectable. The housekeeping genes GAPDH and G6PD served as comparative controls.

Ausführungsbeispiel 1: Identifizierung von Pankreaskarzinom-assoziierten GenenEmbodiment 1: Identification of pancreatic carcinoma-associated genes

Es wurde nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff frisch eingefrorenes Gewebe aus duktalem Pankreaskarzinom (N=14) und aus normalem Pankreasgewebe (N=11) verwendet. Das Normalgewebe entstammte aus Proben des Hauptduktes, die keine sichtbaren dysplastischen Veränderungen enthielten.It became liquid after removal Nitrogen freshly frozen tissue from ductal pancreatic carcinoma (N = 14) and normal pancreatic tissue (N = 11). The normal tissue originated from samples of the main product, which had no visible dysplastic changes contained.

Von den Gewebestücken wurden dann wenige 10 μm dicke Schnitte geschnitten und sofort in 70% Ethanol fixiert. Diese Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt und eingedeckt. Diese Probeschnitte dienten als Vorlage für die Mikrodissektion, da an ihnen die Areale eingezeichnet wurden, welche für die Mikrodissektion geeignet schienen. Von dem Gewebeblock wurden dann 5 μm dicke Serienschnitte angefertigt. Diese Schnitte wurden in RNase freiem 70% Ethanol fixiert und auch kurz mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Tumor- und Normale Zellen wurden aus diesen Gewebeschnitten mit einer sterilen Kanüle aus den Schnitten herausgekratzt. Pro Gewebestück wurden ca. 10000 bis 11000 Zellen isoliert, wobei darauf geachtet wurde, dass ca. 95% des mikrodisseziierten Gewebes aus Tumor bzw. normalen Epithelzellen bestand (1). Die Zellen wurden dann in eiskaltem GTC-Puffer (Guanidin-Thiocyanat-Puffer, Promege, Heidelberg) gesammelt. Aus den Zellen wurde dann die Poly-A+-RNA mittels eines Reaktionssystems (PolyAttract 1000, Promega, Heidelberg), gemäß der Anleitung, isoliert. Mit jeder Probe wurde dann dreimalig cDNA-Synthese mit anschliessender repetitiver in-vitro-Transkription durchgeführt (21). Zusammenfassend wird die cDNA-Synthese durch das Hybridisieren mit dem Affymetrix T7-oligo-dT Promoter-Primer in einer Konzentration von 0.1 mmol/l initiiert. Die Zweitstrang-Synthese geschieht durch internes Primen. Anschliessend wird eine in-vitro-Transkription unter Verwendung des Ambion Megascript T7 Reaktionssystem (Ambion, Huntington, UK) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die so hergestellte aRNA wird dazu verwendet, um erneut eine cDNA-Synthese zu initiieren, bei der die Zweitstrangsynthese durch Random-Hexamer Primer initiiert wird. Bei der dritten in-vitro-Transkription wird erneut so verfahren, allerdings werden dabei Biotin-markierte Nukleotide nach den Affymetrix-Herstellerangaben zugegeben. Die weitere Vorbereitung der Proben und die Hybridisierung verläuft nach den Angaben von Affymetrix.Of the tissue pieces were then cut a few 10 micron thick sections and immediately fixed in 70% ethanol. These sections were stained with hematoxylin and eosin and capped. These test sections served as a template for the microdissection, as they were drawn on the areas that seemed suitable for the microdissection. From the tissue block then 5 micron thick serial sections were made. These sections were fixed in RNase-free 70% ethanol and also stained briefly with hematoxylin and eosin. Tumor and normal cells were excised from these sections using a sterile cannula. Approximately 10,000 to 11,000 cells were isolated per tissue piece, care being taken that approximately 95% of the microdissected tissue consisted of tumor or normal epithelial cells ( 1 ). The cells were then collected in ice-cold GTC buffer (guanidine thiocyanate buffer, Promege, Heidelberg). From the cells, the poly A + RNA was then isolated by means of a reaction system (PolyAttract 1000, Promega, Heidelberg) according to the instructions. Each sample was then subjected to cDNA synthesis three times followed by repetitive in vitro transcription (21). In summary, the cDNA synthesis is initiated by hybridization with the Affymetrix T7-oligo-dT promoter primer at a concentration of 0.1 mmol / l. Second strand synthesis is by internal priming. Subsequently, in vitro transcription is performed using the Ambion Megascript T7 Reaction System (Ambion, Huntington, UK) according to the manufacturer's instructions. The aRNA thus prepared is used to re-initiate cDNA synthesis in which second-strand synthesis is initiated by random hexamer primers. The third in vitro transcription is repeated, but biotin-labeled nucleotides are added according to the Affymetrix manufacturer's instructions. The further preparation of the samples and the hybridization proceeds according to the data from Affymetrix.

Das Affymetrix 0133 Gene Chip Set besteht aus zwei GeneChips, auf welchen mehr als 44000 Probesets aufgetragen worden sind. Dadurch werden ca. 33.000 humane Gene und ca. 6000 humane ESTs repräsentiert. Nach der Hybridisierung werden die Signalintensitäten durch die Affymetrix MAS 5.0 Software ausgelesen und in der sogenannten Cel-Datei gespeichert. Diese wird dann zur weiteren Daten-Analyse verwendet. Zur Analyse werden die Dateien aller Experimente in das Programm dChip 1.3 (http://www.dchip.org) geladen, normalisiert und die Expressions-Werte, als auch die Werte für den Nachweis (Absolute Calls) werden mit dem PM/MM Modell bestimmt. Diese Werte werden dann in Excel und in SAM (http://www-stat.stanford.edu/ftibs/SAM/) eingelesen. Eine differentielle Expression wurde dann nachgewiesen, wenn folgende Kriterien erfüllt waren: Ein Quotient > 2 und ein q-Wert < 15% oder ein Presence call in wenigstens 60% eines Probentyps ohne einen Presence Call in dem anderen Probentyp (Tabellen 1 bis 4).The Affymetrix 0133 Gene Chip Set consists of two GeneChips on which more than 44000 sample sets have been applied. This will be represents approximately 33,000 human genes and approximately 6,000 human ESTs. After hybridization, the signal intensities through the Affymetrix MAS 5.0 software is read out and in the so-called Cel file saved. This will then be used for further data analysis used. For analysis, the files of all experiments in the Program dChip 1.3 (http://www.dchip.org) loaded, normalized and the expression values, as well as the values for the proof (Absolute Calls) are determined with the PM / MM model. These values are then in Excel and read in SAM (http://www-stat.stanford.edu/ftibs/SAM/). Differential expression was then detected when the following Criteria met were: a quotient> 2 and a q value <15% or a presence call in at least 60% of a sample type without a presence call in the other sample type (Tables 1 to 4).

Von den 616 differentiell exprimierten Gene wurden folgende zur Validierung mittels RT-PCR ausgewählt (3):
PLAG1 (Gen-Nr. 159, Tabelle 1), PTTG1 (Gen-Nr. 1315, Tabelle 3), osf-2/POSTN (Gen-Nr. 1303, Tabelle 3), RAMP (Gen-Nr. 138, Tabelle 1), ECT2 (Gen-Nr. 506, Tabelle 1), CFLAR (Gen-Nr. 526, Tabelle 1), CCNB1 (Gen-Nr. 1287, Tabelle 3), CCNB2 (Gen-Nr. 203, Tabelle 1), UP/UPP1 (Gen-Nr. 176, Tabelle 1), MADD (Gen-Nr. 1269, Tabelle 3), LOXL2 (Gen-Nr. 184, Tabelle 1), HOXC6 (Gen-Nr. 158, Tabelle 1), EFNB2 (Gen-Nr. 186, Tabelle 1), IRAK1 (Gen-Nr. 370, Tabelle 1) und CENPF (Gen-Nr. 108, Tabelle 1). Die Housekeepinggene GAPDH und G6PD dienten als Vergleichskontrolle.Of the 616 differentially expressed genes, the following were selected for validation by RT-PCR ( 3 ):
PLAG1 (gene No. 159, Table 1), PTTG1 (gene No. 1315, Table 3), osf-2 / POSTN (gene No. 1303, Table 3), RAMP (gene No. 138, Table 1 ), ECT2 (Gene No. 506, Table 1), CFLAR (Gene No. 526, Table 1), CCNB1 (Gen No. 1287, Table 3), CCNB2 (Gene No. 203, Table 1), UP / UPP1 (Gene No. 176, Table 1), MADD (Gen No. 1269, Table 3), LOXL2 (Gene No. 184, Table 1), HOXC6 (Gene No. 158, Table 1), EFNB2 (Gen. No. 186, Table 1), IRAK1 (Gen. No. 370, Table 1) and CENPF (Gen. No. 108, Table 1). The housekeeping genes GAPDH and G6PD served as comparative controls.

Für die RT-PCR Analyse wurden 9 Proben von Normalgewebe und 13 von PDAC-(pankreas ductal polyademona carcinom) Gewebe auf die Expression der ausgewählten Gene untersucht. Dazu wurde die RNA aus normalem pankreatischen Gewebe und von pankreatischem Tumorgewebe mit Hilfe des „Micro to Mini Total RNA Purification Kit" (Invitrogen) nach Herstellerangaben isoliert. Nach der reversen Transkription mit random Hexamer-Primern und der „Superscript" Reversen Transkriptase (Invitrogen) folgte eine PCR Amplifikation (58°C Annealing Temperatur, 27 Zyklen) unter Standardbedingungen. Die Primer für die PCR-Amplifikation wurden von MWG-Biotech, Ebersberg, synthetisiert. Es wurden folgende Primer eingesetzt:

For RT-PCR analysis, 9 samples of normal tissue and 13 of PDAC (pancreatic ductal polyademona carcinoma) tissues were examined for expression of the selected genes. RNA was isolated from normal pancreatic tissue and from pancreatic tumor tissue using the "Micro to Mini Total RNA Purification Kit" (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions After reverse transcription with random hexamer primers and "Superscript" reverse transcriptase (Invitrogen) followed a PCR amplification (58 ° C annealing temperature, 27 cycles) under standard conditions. The primers for PCR amplification were synthesized by MWG-Biotech, Ebersberg. The following primers were used:

Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese separiert und mit Ethidiumbromid angefärbt.The PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and stained with ethidium bromide.

Die Gesamt-RNA aus pankreatischen Zelllinien wurde mit dem RNAeasy RNA isolation kit (Qiagen, Hilden) isoliert und wie oben in cDNA transkribiert. Zur quantitativen PCR-Detektion wurde ein ABI Sequence Detection System 7700 und der Sybr Green Master Mix (ABI, Weiterstadt) nach Herstellerangaben eingesetzt.The Total RNA from pancreatic cell lines was probed with the RNAeasy RNA isolation kit (Qiagen, Hilden) and transcribed as above in cDNA. For quantitative PCR detection was an ABI Sequence Detection System 7700 and the Sybr Green Master Mix (ABI, Weiterstadt) Manufacturer information used.

Ausführungsbeispiel 2: Immunhistochemie zum Nachweis der MCM2, der MCM7 oder der CENPF Proteinexpression in Pankreastumoren zur Diagnose:Embodiment 2: Immunohistochemistry for detection of MCM2, MCM7 or CENPF protein expression in pancreatic tumors for diagnosis:

2 zeigt die Ergebnisse einer immunohistochemischen Analyse der MCM2 (Gen-Nr. 107, Tabelle 1), MCM7 (Gen-Nr. 395, Tabelle 1) und der CENPF-Proteinexpression (Gen-Nr. 108, Tabelle 1) in Pankreasgewebeschnitten. Zur Herstellung dieser Schnitte wird Pankreasgewebe in einem operativen Eingriff entnommen und zur Fixierung in gepuffertem 4% Formalin eingelegt. Nach der Fixierung wird das Gewebe nach einer gängigen Methode in Paraffin eingebettet (22). Von diesem in Paraffin eingebetteten Gewebe werden Schnitte mit einer Dicke von 4 μm mit einem Mikrotom (Leica, Nussloch) angefertigt und auf speziell vorbereitete Objektträger (Superfrost; Menzel Gläser, Braunschweig) aufgezogen. Danach werden die Schnitte durch eine Inkubation in Xylol von dem Paraffin befreit. Danach werden die Schnitte durch die Inkubation in einer absteigenden Alkoholreihe (100% Ethanol bis 0% Ethanol) rehydriert. 2 Fig. 11 shows the results of immunohistochemical analysis of MCM2 (gene No. 107, Table 1), MCM7 (gene No. 395, Table 1) and CENPF protein expression (gene No. 108, Table 1) in pancreatic tissue sections. For the preparation of these sections, pancreatic tissue is removed in an operative procedure and inserted for fixation in buffered 4% formalin. After fixation, the tissue is embedded in paraffin by a common method (22). Sections 4 μm thick are prepared from this paraffin-embedded tissue with a microtome (Leica, Nussloch) and mounted on specially prepared slides (Superfrost, Menzel Gläser, Braunschweig). The sections are then freed from the paraffin by incubation in xylene. The sections are then rehydrated by incubation in a descending alcohol series (100% ethanol to 0% ethanol).

Danach werden die Schnitte für 2 min in einem Schnellkochtopf gekocht während sie in einem Tris-EDTA-Citrat Puffer verbleiben und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen. Danach werden die Schnitte mit einer Lösung eines MCM2, MCM7 oder CENPF spezifischen primären Antikörper versetzt. Dieser Antikörper, wie z. B. ein mit humanem CENPF (Klon D8; Abcam Ltd., Cambridge, UK), humanem MCM2 (Klon CRCT2; Novocastra, Newcastle, UK), oder humanem MCM7 (Klon CRCT7; Novocastra), werden dazu in definierten Konzentration in einer Lösung aus PBS welcher 2% Pferdeserum (erhältlich von Vector Laboratories, Alexis, Grünberg) enthält gelöst. Nach einer Inkubation der Schnitte mit der Antikörperlösung für 45 min bei Raumtemperatur, werder, die Schnitte 2 mal mit PBS für jeweils 5 min gewaschen.After that will the cuts for Cooked in a pressure cooker for 2 minutes while in a Tris-EDTA citrate Buffers remain and then washed with distilled water. Then the cuts are with a solution a MCM2, MCM7 or CENPF specific primary antibody. This antibody, like z. One with human CENPF (clone D8; Abcam Ltd., Cambridge, UK), human MCM2 (clone CRCT2, Novocastra, Newcastle, UK), or human MCM7 (clone CRCT7, Novocastra) will be in defined concentration in a solution from PBS containing 2% horse serum (available from Vector Laboratories, Alexis, Grünberg) contains solved. After incubating the sections with the antibody solution for 45 min at room temperature, werder, the sections washed twice with PBS for 5 min.

Die Bindung dieser Antikörper an die jeweiliegen Zielmoleküle wird mit der folgenden Reaktion nachgewiesen:
Die Schnitte werden mit einem biotinylierten anti-Ziegen-IgG Antikörper (erhältlich als fertiges Reagenziensystem bei Vector Laboratories) in einer Konzentration von 5μg/ml inkubiert. Danach werden die Schnitte mit dem Reagenziensystem Avidin-Biotin Peroxidase (ABC ELITE, Vector Laboratories) inkubiert. Dabei wird nach der Beschreibung in den Reagenzienssystemen verfahren. Zum Schluss werden die Schnitte mit einer Lösung von Diaminobenzidin (Sigma, Taufkirchen) in 0,05 mol/l Tris-HCI pH7,0 bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Schnitte mit einem Standardverfahren mit Hematoxylin gefärbt und eingedeckt.The binding of these antibodies to the respective target molecules is detected by the following reaction:
The sections are incubated with a biotinylated anti-goat IgG antibody (available as a finished reagent system from Vector Laboratories) at a concentration of 5 μg / ml. The sections are then incubated with the reagent system avidin-biotin peroxidase (ABC ELITE, Vector Laboratories). The procedure is as described in the reagent systems. Finally, the cuts are made with a solution of Diaminobenzidine (Sigma, Taufkirchen) in 0.05 mol / l Tris-HCl pH7.0 at room temperature. The sections are then stained and covered with a standard hematoxylin procedure.

Die Färbung wird dann mikroskopisch beurteilt. Dabei steht eine positive Färbung für eine Proteinexpression.The coloring is then assessed microscopically. A positive staining stands for protein expression.

Ein Tumor äußert sich dabei in der Anfärbung der Zellen für eines der drei Proteine, während nichtmalignes Gewebe keine oder nur vernachlässigbare geringe Anfärbung zeigt. Photographische Aufnahmen derart präparierter Gewebeschnitte werden in 2 dargestellt:A tumor manifests itself in the staining of the cells for one of the three proteins, while non-malignant tissue shows little or no negligible staining. Photographs of such prepared tissue sections are in 2 shown:

Ausführungsbeispiel 3: Nachweis CENPF-mRNA-ExpressionEmbodiment 3: Detection CENPF mRNA expression

Die Analyse der CENPF-mRNA-Expression (Gen-Nr. 108, Tabelle 1) erfolgt in isolierter RNA aus Gewebestücken des Pankreas zum Nachweis eines Tumors.The Analysis of CENPF mRNA expression (gene number 108, Table 1) in isolated RNA from tissue pieces of the pancreas to detect a tumor.

Dazu wird die RNA mit Standardverfahren und Reagenziensystemen aus Gewebestücken des Pankreas isoliert (RNeasy der Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland). Dabei wird nach dem Protokoll des Reagenziensystems verfahren. Danach wird die RNA mit dem Enzym Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Die dazu notwendige Transkriptionsinitiierung wird hierbei von „Random Hexameren" (Oligonucleotide bestehend aus je 6 Nukleotiden mit variabler Sequenz) übernommen (Invitrogen, Karlsruhe). Es werden zu dem Ansatz 100 pg der „Random Hexamere" gegeben. Die Synthese wird ansonsten gemäss der Beschreibung des Herstellers durchgeführt. Nach dieser Reaktion wird die cDNA in eine quantitative PCR eingesetzt. Dazu wird 1 μl der cDNA-Lösung verwendet. Die cDNA wird zu einem Ansatz von 24 μl aus einem Mastermix bestehend aus Puffer, Taq-DNA-Polymerase (Sybr Green PCR Mastermix der Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt) und den genspezifischen Primern 5'-GTCAGCGACAAAATGCAGAA-3' (SEQ-ID 33) und 5'-ACTCCTGGTCCAGTGTTTGG-3' (SEQ-ID 34) gegeben. Dabei liegen in dem Mix die Primer in einer Konzentration von 300 nmol/l vor. Zur Herstellung dieses Mixes werden für jede Bestimmung 12,5 μl des Sybr Green PCR Mastermix jeweils 1 μl der Primer aus einer Lösung mit einer Konzentration von 3 μmol/l und 9,5 μl destilliertes Wasser gemischt. Danach wird eine PCR unter Standardbedingungen im ABI Prism Sequence Detection System durchgeführt und die Werte für die enthaltene RNA Menge werden nach der Durchführung der PCR errechnet. Dabei wird die Fluoreszenz des in die entstehenden DNA Fragmente eingelagerten Sybr Greens während der PCR gemessen und die RNA-Menge analog zum TaqMan Verfahren errechnet.To For example, the RNA is prepared using standard procedures and reagent systems from tissue pieces of the Pancreas isolated (RNeasy Fa. Qiagen, Hilden, Germany). In doing so, proceed according to the protocol of the reagent system. After that the RNA is transcribed into cDNA with the enzyme reverse transcriptase. The necessary initiation of transcription is described by "Random Hexamers "(Oligonucleotides consisting of 6 nucleotides each with variable sequence) (Invitrogen, Karlsruhe). The approach 100 pg of the "Random Hexamers "given. The synthesis is otherwise according to the description of the manufacturer. After this reaction will be the cDNA used in a quantitative PCR. For this, 1 μl of the cDNA solution is used. The cDNA is composed of a mixture of 24 μl from a master mix from buffer, Taq DNA polymerase (Sybr Green PCR Mastermix of Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt) and the gene-specific primers 5'-GTCAGCGACAAAATGCAGAA-3 '(SEQ ID 33) and 5'-ACTCCTGGTCCAGTGTTTGG-3 '(SEQ ID 34). In this case, the primers are in a concentration of 300 nmol / l in the mix in front. To prepare this mix, 12.5 μl of the Sybr Green PCR Master Mix 1 μl each the primer from a solution with a concentration of 3 μmol / l and 9.5 μl distilled water mixed. Thereafter, a PCR under standard conditions performed in the ABI Prism Sequence Detection System and the values for the included RNA amount will be after performing the PCR is calculated. The fluorescence of the resulting DNA fragments of embedded Sybr greens were measured during PCR and the amount of RNA is calculated analogously to the TaqMan method.

Analog Ausführungsbeispiel 3 werden auch das Gen FOXM1 (Gen-Nr. 1272, Tabelle 3) mit den Primern 5'-ATCCAACATCCAGTGGCTTC-3' (SEQ-ID 35) und 5'-TCGAAGGCTCCTCAACCTTA3' (SEQ-ID 36), das Gen AATF (Gen-Nr. 391, Tabelle 1) mit den Primern 5'-CTTGGACACGGACAAAAGGT-3' (SEQ-ID 37) und 5'-CACACTCCTGTTCCTCAGCA-3' (SEQ-ID 38) und das Gen BCAR3 (Gen-Nr. 73, Tabelle 1) mit den Primern 5'-AAGTTCCTTCCCCCTGAGAA-3' (SEQ-ID 39) und 5'-CCTGCAGTCCATGCTCAGTA-3' (SEQ-ID 40) bestimmt.Analogous embodiment 3 also contains the gene FOXM1 (Gen. No. 1272, Table 3) with the primers 5'-ATCCAACATCCAGTGGCTTC-3 '(SEQ ID 35) and 5'-TCGAAGGCTCCTCAACCTTA3 '(SEQ ID 36), the Gen AATF (Gene No. 391, Table 1) with the primers 5'-CTTGGACACGGACAAAAGGT-3 '(SEQ ID 37) and 5'-CACACTCCTGTTCCTCAGCA-3' (SEQ ID 38) and the gene BCAR3 (gene number 73, Table 1) with the primers 5'-AAGTTCCTTCCCCCTGAGAA-3 '(SEQ ID 39) and 5'-CCTGCAGTCCATGCTCAGTA-3 '(SEQ ID 40).

Ausführungsbeispiel 4: Bestimmung der CKLF Menge im Serum zur Diagnose eines Pankreas-KarzinomsEmbodiment 4: Determination the CKLF level in the serum for the diagnosis of a pancreatic carcinoma

Die Bestimmung der CKLF-Menge (Gen-Nr. 538, Tabelle 1) im Serum erfolgt nach Standardverfahren zum Nachweis von Proteinen im Serum. Das Serum wird von Patienten aus dem venösen Blut gewonnen und nach der Gerinnung verwendet. In einen mit Antikörpern gegen CKLF beschichtete Napf wird dann das Serum eingefüllt und 60 min gewartet, damit das Protein an die Antikörper binden kann. Danach wird der Napf mit PBS für dreimal gewaschen um überflüssiges Protein abzuwaschen. Diese Bindung wird dann mit einem zweiten gegen CKLF gerichteten Antikörper nachgewiesen. Dazu wird dieser Antikörper zu dem Napf gegeben und 60 min bei RT gewartet. Erneut wird der Napf dreimal mit PBS gewaschen. Die Bindung des zweiten Antikörpers wird durch die Zugabe eines dritten Antikörpers nachgewiesen. Dieser dritte Antikörper wird in den Napf gefüllt und es wird erneut 60 min abgewartet um die Bindung zu ermöglichen. Danach wird Peroxidase verbunden. Durch die Zugabe eines Substrates wird die gebundene Menge bestimmt.The Determination of the amount of CKLF (Gene No. 538, Table 1) in the serum according to standard methods for the detection of proteins in serum. The Serum is obtained from patients with venous blood and after coagulation used. In a coated with antibodies against CKLF Bowl is then filled with the serum and waited 60 minutes for the protein to bind to the antibodies can. Thereafter, the well is washed with PBS for three times for excess protein wash away. This bond is then replaced with a second against CKLF directed antibodies demonstrated. For this purpose, this antibody is added to the well and 60 min at RT. Again, the dish is washed three times with PBS. The binding of the second antibody is detected by the addition of a third antibody. This third antibody is filled in the bowl and it is again waited 60 minutes to allow the binding. Thereafter, peroxidase is linked. By adding a substrate the bound amount is determined.

Analog Ausführungsbeispiel 4 wird auch die KLK10 (Gen-Nr. 1279, Tabelle 3) im Serum bestimmt. Dazu wird in einen mit Antikörpern gegen KLK10 beschichteten Napf das Serum eingefüllt und 60 min gewartet, damit das Protein an den Antikörper binden kann. Danach wird der Napf dreimal mit PBS gewaschen, um überschüssiges Protein abzuwaschen. Diese Bindung wird dann mit einem zweiten gegen KLK10 gerichteten Antikörper nachgewiesen Dazu wird dieser Antikörper zu dem Napf gegeben und 60 min bei RT gewartet. Erneut wird der Napf dreimal mit PBS gewaschen. Die Bindung des zweiten Antikörpers wird durch die Zugabe eines dritten Antikörpers nachgewiesen. Dieser dritte Antikörper wird in den Napf gefüllt und es wird erneut 60 min abgewartet um die Bindung zu ermöglichen. Danach wird Peroxidase verbunden. Durch die Zugabe eines Substrates wird die gebundene Menge bestimmt.Analogously to embodiment 4, the KLK10 (gene No. 1279, Table 3) is also determined in the serum. For this purpose, the serum is filled in a cup coated with antibodies against KLK10 and waited for 60 min, so that the protein can bind to the antibody. Thereafter, the well is washed three times with PBS to wash off excess protein. This binding is then detected with a second antibody directed against KLK10. This antibody is added to the well and maintained at RT for 60 min. Again, the dish is washed three times with PBS. The binding of the second antibody is detected by the addition of a third antibody. This third antibody is filled into the well and it becomes 60 again Waited to allow the binding. Thereafter, peroxidase is linked. By adding a substrate, the bound amount is determined.

Bei einer Untersuchung von acht Patienten mit Pankreaskarzinom wurde im Mittel eine Menge von 1,62 μg/L nachgewiesen, während bei Patienten mit einer gutartigen Pankreaserkrankung im Mittel nur 0,81 μg/L nachgewiesen werden konnten.at An examination of eight patients with pancreatic carcinoma was made an average of 1.62 μg / L proved while in patients with benign pancreatic disease on average only 0.81 μg / L could be detected.

Ausführungsbeispiel 5: Therapie des Pankreaskarzinoms mittels siRNA-MolekülenEmbodiment 5: Therapy of pancreatic carcinoma using siRNA molecules

Zu der Therapie des Pankreaskarzinoms werden Patienten die siRNA Moleküle 5'-CCUUCUCUAGUGUCAAAGU-3' (SEQ-ID 41), 5'-CGAUAAGACCAAACUGGCU-3' (SEQ-ID 42), 5'-UGGACAAAGAGAGAUUACU-3' (SEQ-ID 43) und 5'-UGGAUGACCUUGGGAGCAG-3' (SEQ-ID 44) bzw. 5'-CAUGCCGGUGAAUCACCAG-3' (SEQ-ID 45), 5'-GCACGUACUGAGCAUGGAC-3' (SEQ-ID 46), 5'-CCAUUUGGCAACAGCGCGA-3' (SEQ-ID 47) und 5'-GAGCUACCUGCCGAUUGGC-3' (SEQ-ID 48) intravenös zugeführt. Die siRNAs der SEQ-Ids 41 bis 44 wirken hierbei gegen die Expression des Proteins AATF (Gen-Nr. 391, Tabelle 1) und die der SEQ-Ids 45 bis 48 gegen die Expression des Proteins BCAR3 (Gen-Nr. 73, Tabelle 1). Dieses Protein spielt bei der Signaltransduktion eine wichtige Rolle und ist im Pankreaskarzinom überexprimiert. Die siRNA wird chemisch synthetisiert. Dabei werden zunächst die komplementären Stränge des Moleküls einzeln gemäß Standardverfahren für die Synthese von Nukleinsäuren synthetisiert und dann in einem zweiten Schritt hybridisiert, damit so doppelsträngige siRNA-Moleküle entstehen.To For the treatment of pancreatic carcinoma, patients will receive the siRNA molecules 5'-CCUUCUCUAGUGUCAAAGU-3 '(SEQ ID 41), 5'-CGAUAAGACCAAACUGGCU-3' (SEQ ID 42), 5'-UGGACAAAGAGAGAUUU-UU-3 '(SEQ ID 43). and 5'-UGGAUGACCUUGGGAGCAG-3 '(SEQ ID 44) or 5'-CAUGCCGGUGAAUCACCAG-3 '(SEQ ID 45), 5'-GCACGUACUGAGCAUGGAC-3' (SEQ ID 46), 5'-CCAUUUGGCAACAGCGCGA-3 '(SEQ ID 47) and 5'-GAGCUACCUGCCGAUUGGC-3 '(SEQ ID 48) delivered intravenously. The siRNAs of SEQ IDs 41 to 44 in this case act against expression of the protein AATF (Gen. No. 391, Table 1) and those of SEQ IDs 45 to 48 against the expression of the protein BCAR3 (Gen. No. 73, Table 1). This protein plays an important role in signal transduction Role and is overexpressed in pancreatic carcinoma. The siRNA will chemically synthesized. First, the complementary strands of the molecule individually according to standard procedures for the Synthesis of nucleic acids synthesized and then hybridized in a second step so that so double-stranded siRNA molecules arise.

Ausführungsbeispiel 6: Therapie des Pankreaskarzinoms mittels Antisense-KonstruktenEmbodiment 6: Therapy of pancreatic carcinoma using antisense constructs

Als Antisense-Konstrukte für das Gen BCAR3 (Gen-Nr. 73, Tabelle 1) wird die Sequenz 5'-CATGCCGGTGAATCACCAG-3' (SEQ-ID 49), für das Gen AATF (Gen-Nr. 391, Tabelle 1) 5'-CCTTCTCTAGTGTCAAAGT-3' (SEQ-ID 50) eingesetzt.When Antisense constructs for the gene BCAR3 (Gene No. 73, Table 1) will be the sequence 5'-CATGCCGGTGAATCACCAG-3 '(SEQ ID 49), for the gene AATF (Gene No. 391, Table 1) 5'-CCTTCTCTAGTGTCAAAGT-3 '(SEQ ID 50).

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18 Gress TM, Wallrapp C, Frohme M, Muller-Pillasch F, Lacher U, Friess H, Buchler M, Adler G, and Hoheisel JD (1997). Identification of genes with specific expression in pancreatic cancer by cDNA representational difference analysis. Genes Chromosomes Cancer 19, 97 - 103.
19 Friess H, Ding J, Kleeff J, Fenkell L, Rosinski JA, Guweidhi A, Reidhaar-Olson JF, Korc M, Hammer J, and Buchler MW (2003). Microarray-based Identification of differentially expressed growth and metastasisassociated genes in pancreatic cancer. Cell Mol Life Sci 60, 1180 - 1199.
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22 Grutzmann R, Foerder M, Alldinger I, Staub E, Brummendorf T, Ropcke S, Li X, Kristiansen G, Jesnowski R, Sipos B, Lohr M, Luttges J, Ockert D, Kloppel G, Saeger HD, Pilarsky C. Gene expression profiles of microdissected pancreatic ductal adenocarcinoma. Virchow Arch. 2003 Oct; 443 (4): 508-17.
23 Carlos Thomas, Pathology. Histopathology. Textbook and Atlas on general and special pathology, Schattauer Verlag

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows a sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can from the official publication platform downloaded from the DPMA.

Claims

A method for in vitro diagnosis of pancreatic carcinoma, in which 1) the amount of gene product of at least one of in Table 1 and / or Table 2 listed genes in a biological sample Material of an individual is determined 2) the amount Gene product in the sample of biological material with the amount of corresponding gene product present in normal pancreatic epithelial tissue usually is present, is compared and 3) where, if it is one listed in Table 1 Gene acts, an increased Amount of gene product, if it is one in the table 2 listed Gen is a reduced amount of the gene product an indication for the Existence of pancreatic carcinoma.

Method according to claim 1, characterized in that that in addition the amount of gene product from at least one of the biological in the sample An individual's material examined genes in a control sample is determined.

A method according to claim 1, characterized in that in addition the amount of gene product min at least one reference gene in the sample of biological material of an individual.

Method according to claim 1, characterized in that that in addition 4) the amount of gene product of at least one of those in Table 3 and / or Table 4 listed Genes in the sample biological material of an individual determined becomes, 5) the amount of gene product in the sample biological Material of an individual with the amount of the corresponding gene product, which is usually present in normal pancreatic epithelial tissue compared will and 6) where, if it is one in the table 3 listed Gene acts, an increased Amount of gene product, if it is one in the table 4 listed Gen is a reduced amount of the gene product an indication for the Existence of pancreatic carcinoma.

Method for screening for drugs for therapy of pancreatic carcinoma, in which 1) a cell line of a pancreatic ductal adenoma carcinoma contacted with a substance to be tested becomes, 2) subsequently the amount of gene product of at least one of those in Table 1 and / or Table 2 listed Genes determined 3) and the amount of gene product then with the amount the corresponding gene product that does not exist in a corresponding compared with the test substance contacted cell line becomes, 4) where, if it is a gene product listed in Table 1 acts, one opposite the untreated cell line reduced amount of the gene product, if it is a gene product listed in Table 2, a across from increased the untreated cell line Amount of gene product an indication is that the test substance is a potential drug for the treatment of pancreatic carcinoma.

Method according to claim 5, characterized in that that 5) additionally the amount of gene product of at least one of those in Table 3 and / or Table 4 listed genes certainly 6) and the amount of gene product then with the amount the corresponding gene product that does not exist in a corresponding compared with the test substance contacted cell line becomes, 7) where if it is a gene product listed in Table 3 acts, one opposite the untreated cell line reduced amount of the gene product, if it is a gene product listed in Table 4, a across from increased the untreated cell line Amount of gene product an indication is that the test substance is a potential drug for the treatment of pancreatic carcinoma.

Diagnostic kit for the diagnosis of pancreatic carcinoma by RT-PCR, which contains at least the following components: for the cDNA synthesis: a) Random hexamer primer or oligo dT, b) reverse transcriptase; for the PCR: a) at least two primers specific to the cDNA of at least one of the genes selected from the groups of pancreatic tumor specific genes from the tables Hybridize No. 1 and No. 2; b) a more than 80 ° C resistant DNA polymerase, as well corresponding reaction buffer.

Diagnostic kit according to claim 7, characterized that he as additional Ingredients for the PCR contains: c) a fluorescence-labeled hybridization probe or a pair of fluorescence labeled hybridization probes specific with the pancreatic tumor specific Hybridize gene from Table # 1 or # 2.

Use of at least one oligonucleotide, the a partial sequence of one of the genes listed in Tables 1 and / or 2 or their complementary Sequence includes, for the diagnosis of pancreatic carcinoma.

Use of at least one oligonucleotide according to Claim 9, characterized in that additionally at least one oligonucleotide, the one partial sequence of one of the genes listed in Tables 3 and / or 4 or their complementary Sequence used for the diagnosis of pancreatic carcinoma.

Use of a gene from Table 1 or Table 2 as a specific marker for the diagnosis of pancreatic carcinoma.

Use of at least one antisense construct, at least 12 nucleotides of a coding sequence of a gene includes that listed in Table 1 is, wherein the coding sequence with respect to the promoter, their Expression controls in 3 ' 5 'orientation is present, For the preparation of a pharmaceutical composition for treatment of pancreatic carcinoma in humans, where the antisense construct the cancer cells is administered so that the antisense construct is expressed in the cancer cells.

Use of at least one antisense construct according to claim 12, characterized in that additionally at least an antisense construct that encodes at least 12 nucleotides of one Sequence of a gene listed in Table 3, wherein the coding sequence with respect the promoter controlling its expression is in 3 'to 5' orientation, is used.

Use of at least one double-stranded RNA construct (siRNA) containing at least 19 base pairs, more preferably 21 or 22 base pairs, maximum 29 base pairs, one coding sequence of a gene listed in Table 1 for the manufacture of a medicament for the treatment of pancreatic carcinoma in humans.

Use of at least one double-stranded RNA construct (siRNA) according to claim 14, characterized in that additionally at least a double-stranded one RNA construct that is at least 19 base pairs, more preferred 21 or 22 bp, a maximum of 29 base pairs, of a coding sequence of a gene listed in Table 3 is used.

Use of at least one polynucleotide which comprises a coding sequence of a gene listed in Table 2, for the preparation of a pharmaceutical composition for treatment of pancreatic carcinoma in humans, wherein the polynucleotide is the Cancer cells are administered so that the gene is in the cancer cells is expressed.

Use of at least one polynucleotide after Claim 16, characterized in that additionally at least one polynucleotide, which comprises a coding sequence of a gene which is shown in Table 4 listed is, is used.