DE10157128A1 - Detecting bacterial and viral contamination, comprises using a combination of pyrolytic dissociation, capillary separation and ion mobility spectroscopy to produce a representative signature of contamination - Google Patents
Detecting bacterial and viral contamination, comprises using a combination of pyrolytic dissociation, capillary separation and ion mobility spectroscopy to produce a representative signature of contaminationInfo
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Abstract
Description
Sporen werden von einigen Gram-positiven Bakterien in Reaktion auf bestimmte Reize gebildet. Sporen stellen aufgrund ihrer Konstitution langlebige Bioobjekte dar. Diese ermöglichen das Überleben einer Spezies selbst unter widrigen Bedingungen, stellen jedoch als pathogene Bakterien für die Gesundheit der Menschen eine dauerhafte Gefahrenquelle dar. Spores are triggered by some Gram-positive bacteria in response certain stimuli formed. Spurs pose due to their constitution long-lived bio-objects. These allow the survival of a species Even under adverse conditions, however, pose as pathogenic bacteria for the health of humans is a permanent source of danger.
Die konventionelle mikrobiologische Diagnostik im Labor ist schwierig und erfolgt über Aktivierung, Anzüchtung und Anfärbeverfahren. Diese Methoden sind personal- und zeitaufwendig, kostenintensiv und unterliegen einer subjektiven Beurteilung. Ein neues Echtzeitverfahren soll hierzu für den schnellen Nachweis von Sporen ermöglichen. Conventional microbiological diagnostics in the laboratory is difficult and takes place via activation, cultivation and staining procedure. These methods are labor-intensive and time-consuming, cost-intensive and subject to one subjective assessment. A new real-time method is intended for this purpose allow rapid detection of spores.
Sporen stellen eine langzeitstabile und erneut reaktivierbare biologische Erscheinungsform der Keimzellen definierter Mikroorganismen dar. Nach dem Ursprung wird in bakterielle oder nichtbakterielle Sporen unterschieden. Extreme Umweltbedingungen oder andere ungünstige Verhältnisse (fehlende Nährstoffe, Anhäufung von Stoffwechselprodukten) stellen die Ursache für die Bildung bakterieller Sporen dar. Auf Basis von Veränderungen im Metabolismus, der Stoffumwandlung durch Verwertung von Depotsubstanzen wird als sporenspezifische Substanz vermehrt Dipicolinsäure synthetisiert. Die Reduktion des zellulären Wassergehaltes, die Bildung langlebiger chemischer Substanzen und durch physikalische Prozesse verändert sich die morphologische Struktur der Keimzelle. Polyterpene bzw. Polypeptide stellen u. a. den Hauptbestandteil der Zellwandsubstanzen von Sporen dar. Die multischichtige Umhüllung der Spore kann bis zu 50% der Trockenmasse betragen. Reife Endosporen lassen keine Stoffwechselaktivität erkennen und verfügen über einen hohen Grad von Resistenz gegenüber thermischer, chemischer oder strahlungsbedingter Exposition. Für eine Keimung der Sporen ist nicht nur die Quellung durch Wasser essentiell sondern häufig auch eine Lichtinduktion erforderlich. Spores provide a long-term stable and reactivatable biological Manifestation of germ cells of defined microorganisms Origin is distinguished into bacterial or non-bacterial spores. Extreme environmental conditions or other unfavorable conditions (missing Nutrients, accumulation of metabolic products) are the cause of the Formation of bacterial spores. Based on changes in the Metabolism, the metabolism by utilization of depot substances As a sporic substance, dipicolinic acid is increasingly synthesized. The Reduction of cellular water content, the formation of more durable chemical Substances and physical processes are changing morphological structure of the germ cell. Polyterpenes or polypeptides provide u. a. the main constituent of the cell wall substances of spores multi-layered covering of the spore can amount to up to 50% of the dry matter. Mature endospores show no metabolic activity and feature over a high degree of resistance to thermal, chemical or radiation exposure. For germination of the spores is not only the Swelling by water is essential but often also a light induction required.
Speziell zur Gefahrenabwehr ist eine dauerhafte Überwachung sensitiver Bereiche unabdingbar, da ein hohes Gefährdungspotential gegeben ist. Zum Nachweis luftgetragener Kontaminationen müssen i. d. R. zeitaufwendige, mikrobiologischer Untersuchungen durchgeführt werden. Especially for security, permanent surveillance is more sensitive Areas indispensable, since there is a high risk potential. To the Proof of airborne contaminations must i. d. R. time consuming, microbiological investigations.
In der Anforderung an die neue Technologie soll neben einer tragbaren Apparatur auch eine einfache Handhabung sichergestellt sein. Derzeit sind Methoden zur direkten Detektion ohne Zeitverlust zwischen Probenahme und Messergebnis nicht bekannt. Als Verfahren werden neben einfachen Transmissions- und Reflektionsmessungen, Pyrolyse mit Gaschromatographischer Trennung und IMS-Detektion, Massenspektroskopische Verfahren wie MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight spectrometry), auto/fluoreszenzoptische Verfahren, molekularbiologische Methoden (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assays und auf PCR (Polymerase chain reaction)) beruhende Verfahren angegeben. Verfahren die zur Charakterisierung als Parameter lediglich die Partikelverteilung anhand von Durchmesser und Partikelform verwenden haben sich für die Analyse und den Nachweis aus komplexen Bioaerosolen nicht bewährt. Alle diese Verfahren bedingen einen hohen apparativen Aufwand und verlangen vom Anwender detailliertes Spezialwissen oder weisen eine zu geringe Sensitivität und Selektivität auf. Eine direkte Messung ohne größeren Zeitverlust ist somit nicht möglich. Dies hat für eine korrekte Diagnosestellung und Einleitung entsprechender Gegenmaßnahmen fatale Folgen. In the request for the new technology should be in addition to a portable Apparatus also be easy to use. Currently are Methods for direct detection without loss of time between sampling and Measurement result unknown. As a method, besides simple Transmission and reflection measurements, pyrolysis with Gas chromatographic separation and IMS detection, Mass spectroscopic methods such as MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption / ionization-time of flight spectrometry), auto / fluorescence optical Method, molecular biological methods (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assays and based on PCR (Polymerase Chain Reaction)) Method specified. Method of characterization as a parameter only the particle distribution based on diameter and particle shape Use for analysis and proof of complex Bioaerosols not proven. All these methods require a high expenditure on equipment and require the user detailed specialized knowledge or have too low sensitivity and selectivity. A direct one Measurement without major loss of time is therefore not possible. This has for one correct diagnosis and initiation of appropriate countermeasures fatal consequences.
Erfindungsgemäß sollen Beispielhaft anhand der Sporen der Gattung Bacillus thuringiensis und Bacillus anthraics die Charakterisierung in luftgetragenen Bio/Aerosolen mittels verschiedener Messprinzipien, die alle erfindungsgegenständlich sind, erfolgen. According to the invention by way of example with reference to the spores of the genus Bacillus thuringiensis and Bacillus anthraics characterization in airborne Bio / aerosols using different measuring principles, all erfindungsgegenständlich, take place.
Erfindungsgemäß erfolgt nach der Probenvorbereitung ein Probenaufschluss. Bestandteil des Aufschlussmechanismus ist die photothermische Pyrolyse unter Verwendung geeigneter Vorrichtungen. Als Vorrichtung wird eine Kapillare verwendet. Diese Hohlfaser/Kapillare besteht z. B. aus Saphirmaterial. Neben der Funktion innerhalb des Aufschlussmechanismus erfolgt synchron die Verwendung für einen Trennungsmechanismus. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel ist der Durchmesser und die Größe der Saphirkapillare der spezifischen Messaufgabe angepasst. Eine Belegung der inneren Oberfläche u/o. eine Dotierung mit geeigneten Materialien ist in Weiterführung des Erfindungsgedankens vorgesehen. According to the invention, a sample digestion takes place after sample preparation. Part of the digestion mechanism is photothermal pyrolysis using suitable devices. As a device is a Capillary used. This hollow fiber / capillary consists z. B. off Sapphire material. In addition to the function within the digestion mechanism Synchronous use for a separation mechanism. in the preferred embodiment is the diameter and size of the Sapphire capillary adapted to the specific measuring task. An assignment of the inner surface u / o. a doping with suitable materials is in Continuation of the inventive concept provided.
In dem bevorzugten Ausführungsbeispiel kommt es innerhalb der Hohlkapillare aufgrund von Diffusion und Konvektion zu Auftrennungseffekten an der modifizierten Kapillarinnenwand, welches eine gezieltere Detektion ermöglicht. In the preferred embodiment, it comes within the Hollow capillary due to diffusion and convection too Separation effects on the modified Kapillarinnenwand, which a more targeted detection allows.
Erfindungsgemäß erfolgt die Pyrolyse durch Interaktion der u. a. mit Sporen belasteten Gasphase mit einem Laserstrahl definierter Leistungseigenschaften und Wellenlängen. In dem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird als Laser z. B. ein CO2-Laser verwendet. Die Ankopplung der Energie erfolgt durch Strahlungsabsorption im Wellenlängenbereich von ca. 9-11 µm. Für den Energietransfer werden organische Verbindungen der Sporen in-situ genutzt. In Fortführung des Erfindungsgedanken eignen sich für die Anwendung auch andere Laser im Spektralbereich 0,15 µm-15 µm. According to the invention, the pyrolysis takes place by interaction of the gas phase, which is loaded, inter alia, with spores, with a laser beam of defined power properties and wavelengths. In the preferred embodiment is used as a laser z. B. a CO 2 laser used. The coupling of the energy is carried out by radiation absorption in the wavelength range of about 9-11 microns. For the energy transfer organic compounds of the spores are used in-situ. In continuation of the inventive idea, other lasers in the spectral range of 0.15 μm-15 μm are also suitable for the application.
In einem weiterem Ausführungsbeispiel erfolgt die Pyrolyse der Sporen an katalytischen Oberflächen wie z. B. thermisch aufgeheizten Platinnetzen; Bevorzugt jedoch oder katalytisch dotierten/beschichteten Kapillaren und Kapillarbündeln. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass bei der pyrolytischen Zersetzung des u. a. mit Sporen kontaminierten Aerosols charakteristische Fragmente der beispielhaft genannten Sporen entstehen. In dem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden diese volatilen Komponenten messtechnisch spezifisch nachgewiesen, wobei in einem erfindungswesentlichen Schritt ein Ionen-Drift-Sensor nach dem Stand der Technik verwendet wurde. In einem weiteren erfindungswesentlichen Schritt erfolgte der Nachweis dieser Pyrolysefragmente mit laserspektroskopischen Methoden. In Weiterführung des Erfindungsgedankens wurden derartige Kapillaren/Kapillarbündel mit Methoden der Sol-Gel-Technik beschichtet und überraschenderweise konnten mit speziellen stabilen molekularen Sensitizern über Fluoreszenzanregung oder Quenchingschritte Bestandteile der Sporen unmittelbar nachwiesen werden. In Weiterführung des Erfindungsgedanken ist im Vorfeld zur effektiven Kondensation partikulärer Bestandteile des Aerosols - d. h. Konzentrierung - durch die Zugabe von Gase wie z. B. von Wasserdampf auf Oberflächen vorgesehen. In a further embodiment, the pyrolysis of the spores takes place catalytic surfaces such. B. thermally heated platinum networks; Preferably, however, or catalytically doped / coated capillaries and Capillary bundles. Surprisingly, it has been shown that at the pyrolytic decomposition of the u. a. spores contaminated aerosols characteristic fragments of the exemplified spores arise. In In the preferred embodiment, these are volatile components metrologically specifically detected, wherein in one Essential to the invention step an ion drift sensor according to the prior Technique was used. In a further inventive step the detection of these pyrolysis fragments was carried out with laser spectroscopy Methods. In continuation of the inventive idea were such Capillaries / capillary bundles coated with methods of sol-gel technique and Surprisingly, with special stable molecular sensitizers via fluorescence excitation or quenching steps components of the spores be immediately demonstrated. In continuation of the inventive idea leading up to the effective condensation of particulate aerosol components - d. H. Concentration - by the addition of gases such. B. from Water vapor provided on surfaces.
Erfindungsgemäß erfolgt die Detektion der Laserpyrolyseprodukte mittels eines höchstempfindlichen Ionen-Drift-Detektors der Firma I. U. T./Berlin. Merkmal des Detektors/Sensors sind die Ionisierung der volatiblen chemischen Pyrolyseprodukte mittels Tritium. Des weiteren Ermöglicht die kapazitive Beschleunigungsstrecke für die Ionen in der Gasphase bei Normaldruck eine höchstsensitive Erfassung. Über chemometrische Auswerteprogramme erfolgte die Zuordnung der erfassten spektroskopischen Daten. Eine der in Fortführung des Erfindungsgedanken nachzuweisenden Leitkomponenten aus der pyrolytischen Zersetzung der Sporen (Taxonomie) sind u. a. Fragmente und/oder Reaktionsprodukte von bio-organischen Verbindungen (hochmolekulare Terpene, Picolinsäure und Lipide sowie deren Kondensations- und Reaktionsprodukte). According to the detection of the laser pyrolysis by means of a highly sensitive ion drift detector of the company I. U. T./Berlin. Characteristics of the detector / sensor are the ionization of the volatile chemical Pyrolysis products using tritium. Furthermore, allows the capacitive Acceleration path for the ions in the gas phase at normal pressure a highly sensitive detection. About chemometric evaluation programs took place the assignment of the acquired spectroscopic data. One in continuation of the inventive concept to be detected Leitkomponenten from the pyrolytic decomposition of spores (taxonomy) are u. a. fragments and / or reaction products of bio-organic compounds (high molecular weight terpenes, picolinic acid and lipids and their Condensation and reaction products).
Erfindungsrelevant ist des weiteren die Gewährleistung der Temperaturstabilität im Bezug auf konstante Pyrolysebedingungen in Hinsicht auf die Reproduzierbarkeit des Verfahrens. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel ist mit Blick auf Arbeitshygiene und Desinfektion die Gewährleistung der vollständigen Eliminierung bakterieller pathogener Erreger oder luftgetragener Sporen u. a. in der Hohlfaser/Kapillararray durch den Reinigungseffekt eines hochenergetischen Laserstrahls gegeben. Further relevant to the invention is the guarantee of Temperature stability with respect to constant pyrolysis conditions in terms on the reproducibility of the process. In the preferred Embodiment is with regard to work hygiene and disinfection the Ensuring complete elimination of bacterial pathogens or airborne spores u. a. in the hollow fiber / capillary array through the Cleaning effect of a high-energy laser beam given.
Im Bio/Aerosol sind zeitgleich diverse bakterielle Mikroorganismen der Umgebungsluft (Belastung mit Pilzen, Pollen etc.) enthalten, deren Konzentration/Volumen konnte überraschenderweise infolge einer Vorreinigung zugunsten des Analyten reduziert werden. Neben der prinzipiellen Detektion einer Belastung der Raum/Umgebungsluft ist Gegenstand der Erfindung die direkte Kontrolle in der Ausatemluft kontaminierter und nicht-kontaminierter Personen (Alveolar positive/negativ) gegenüber einer Hintergrundbelastung. In bio / aerosol are simultaneously various bacterial microorganisms of Ambient air (contamination with fungi, pollen, etc.), whose Concentration / volume was surprisingly due to a Pre-cleaning can be reduced in favor of the analyte. In addition to the principle detection of a load of the room / ambient air is The invention relates to direct control in the exhaled air contaminated and non-contaminated persons (alveolar positive / negative) against a background load.
In Fortführung des Erfindungsgedanken ist in einem zusätzlichen erfindungsrelevanten Verfahrensschritt die Aufkonzentrierung der Sporenpyrolyseprodukte zum Zwecke der Detektion vorgesehen. In continuation of the idea of the invention is in an additional Invention-relevant process step, the concentration of the Spore pyrolysis products intended for the purpose of detection.
In dem bevorzugten Ausführungsbeispiel erfolgt die Stoffstromführung im Gegenstrom zur Laserstrahleinkopplung, in Weiterführung des Erfindungsgedankens sind weitere technische Lösungen vorgesehen. In the preferred embodiment, the material flow guide takes place in Countercurrent to Laserstrahleinkopplung, in continuation of the According to the invention further technical solutions are provided.
Im Fortführung des Erfindungsgedanken ist ebenso eine Detektion von Kontaminationen mit viralen Erregern, den Bakteriophagen - wobei Viren aus DNA/RNA-Anteilen und einer Proteinhülle bestehen - Beispielhaft anhand von Pockenviren durchgeführt, möglich. In continuation of the inventive concept is also a detection of Contaminations with viral pathogens, the bacteriophages - where viruses out DNA / RNA portions and a protein shell consist - by way of example of Pox viruses performed, possible.
Die Erfindung ist in den Abb. 1-7 erläutert: The invention is illustrated in Figs. 1-7:
Abb. 1 Kapillare/Hohlfaser und Kapillarbündel/array Fig. 1 Capillary / hollow fiber and capillary bundle / array
Abb. 2 Laserstrahlführung und Stoffstrom erfolgt in gleicher Richtung (Gleichstromverfahren). Vorrichtung mit einer Kapillare oder Kapillarbündel Fig. 2 Laser beam guidance and material flow in the same direction (DC method). Device with a capillary or capillary bundle
Abb. 3 Laserstrahlführung und Stoffstrom in gleicher Richtung (Gleichstromverfahren). Vorrichtung mit Einzelkapillare (6.), der Laserstrahl wird seitlich eingekoppelt (3.), externe Laserleistungsmessung (4.b), nach Pyrolyse in 6. erfolgt die IMS- Detektion (8). Fig. 3 Laser beam guidance and material flow in the same direction (DC method). Device with single capillary (6.), the laser beam is coupled in laterally (3.), external laser power measurement (4.b), after pyrolysis in 6. the IMS detection ( 8 ) takes place.
Abb. 4 Laserstrahlführung und Stoffstrom in gleicher Richtung (Gleichstromverfahren). Vorrichtung mit Kapillarbündel/array (6.), der Laserstrahl wird seitlich eingekoppelt (3.), externe Laserleistungsmessung (4.b), nach synchroner Pyrolyse in 6. erfolgt die IMS-Detektion (8). Fig. 4 Laser beam guidance and material flow in the same direction (DC method). Device with capillary bundle / array (6.), the laser beam is coupled in laterally (3.), external laser power measurement (4.b), after synchronous pyrolysis in 6. the IMS detection ( 8 ) takes place.
Abb. 5 Laserstrahlführung und Stoffstrom in gleicher Richtung (Gleichstromverfahren). Vorrichtung mit Kapillarbündel/array (6.), der Laserstrahl wird seitlich eingekoppelt (3.), externe Laserleistungsmessung (4.b), nach Pyrolyse in der ersten Kapillare, werden unterschiedlich dotierte Kapillaren zur Auftrennung verwendet, dann erfolgt die IMS-Detektion (8). Fig. 5 Laser beam guidance and material flow in the same direction (DC method). Device with Kapillarbündel / array (6.), the laser beam is coupled laterally (3.), external laser power measurement (4.b), after pyrolysis in the first capillary, differently doped capillaries are used for separation, then the IMS detection ( 8 ).
Abb. 6 Laserstrahlführung und Stoffstrom in gleicher Richtung (Gleichstromverfahren).Vorrichtung mit austauschbaren, individuell dotierten Einzelkapillaren (6.), durch Dreh- oder in Form einer Verschiebeeinheit kann die Position der Kapillaren verändert werden. Der Laserstrahl wird seitlich eingekoppelt (3.), externe Laserleistungsmessung (4.b), nach Pyrolyse in 6. erfolgt die separate IMS-Detektion (8) für jede Einzelkapillare. Fig. 6 Laser beam guidance and material flow in the same direction (DC method). Device with exchangeable, individually doped single capillaries (6), by rotation or in the form of a displacement unit, the position of the capillaries can be changed. The laser beam is injected laterally (3.), external laser power measurement (4.b), after pyrolysis in 6. the separate IMS detection ( 8 ) is performed for each single capillary.
Abb. 7 Laserstrahlführung und Stoffstrom in entgegengesetzter Richtung (Gegenstromverfahren). Vorrichtung mit austauschbaren, individuell dotierten Einzelkapillaren (6.), durch Dreh- oder in Form einer Verschiebeeinheit kann die Position der Kapillaren verändert werden. Der Laserstrahl wird seitlich eingekoppelt (3.), externe Laserleistungsmessung (4.b), nach Pyrolyse in 6. erfolgt die separate IMS-Detektion (8) für jede Einzelkapillare. Fig. 7 Laser beam guidance and material flow in opposite direction (countercurrent process). Device with exchangeable, individually doped Einzelkapillaren (6.), by rotation or in the form of a displacement unit, the position of the capillaries can be changed. The laser beam is injected laterally (3.), external laser power measurement (4.b), after pyrolysis in 6. the separate IMS detection ( 8 ) is performed for each single capillary.
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