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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prüfung geringster Qualitätsunterschiede von
biologischen Geweben und mit ihnen wechselwirkenden Agenzien mittels Messung der
Biophotonenemission und der verzögerten Lumineszenz.
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Aus der EP-A-0430150 ist bekannt, dass geringe Qualitätsunterschiede von
biologischen Systemen mit Hilfe der Biophotonenemission oder verzögerten Lumineszenz
schnell, sicher und in nicht invasiver Weise erkennbar sind. Diese Verfahren, die auf
Messungen der Intensität schwacher Lichtemission aus biologischem Gewebe ohne
nun nach externer Anregung beruhen, nutzen die Intensitätsunterschiede oder die
Unterschiede in charakteristischen Abklingfunktionen der verzögerten Lumineszenz aus,
um Rückschlüsse auf Qualitätsunterschiede zu ziehen.
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Hingegen besteht die Aufgabe der Erfindung darin, ein Verfahren zur Prüfung geringster
Qualitätsunterschiede von biologischen Geweben und mit ihnen wechselwirkende
Agenzien in einer Weise, die es gestattet, geringere Qualitätsunterschiede als bisher
möglich in nicht invasiver Weise zu ermitteln.
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Die Aufgabe wird mit den Merkmalen des Patentanspruchs gelöst.
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Die Erfindung beruht auf der Messung der Photonenzählstatistik, die bei
unterschiedlichen Proben unter Umständen deutlich und überraschend unterschiedlich ausfällt.
Unter "Photonenzählstatistik" (PCS = Photocountstatistics) versteht man die
Häufigkeitsverteilung p(n,Δt), eine bestimmt Zahl n = 0, 1, 2, . . . Photonen in einem vorgegebenen
Zeitintervall Δt, die von der untersuchten Probe abgegeben wird, zu messen.
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Sie beruht auf der Erkenntnis, dass biologische Gewebe ohne oder nach geeigneter
Anregung ihre PCS empfindlich verändert, sobald geringe Qualitätsunterschiede
vorhanden sind oder schwache externe Einflüsse einwirken. Diese Erkenntnis veranlasste
zur vorliegenden Erfindung eines Verfahrens, das die Messung der
Photonenzählstatistik neben den bereits bekannten Verfahren nutzt, um Unterschiede in der Qualität der
untersuchten Gewebeproben oder mit ihnen wechselwirkenden Agenzien aufzudecken.
Das Verfahren selbst besteht darin, die Probe nicht - wie in den bisher beschriebenen
Anwendungen - nur mit einem einzigen geeigneten Photomultiplier zu messen, sondern
mindestens zwei Photomultiplier zu verwenden, um aus den Koinzidenzen der
Zählraten in en beiden Kanälen die Photonenzählstatistik p(n,Δt) zu bestimmen. Gemessen
werden die Zählraten der in den Kanälen 1 und 2 einlaufenden Photonen n1 und n2 des
gleichen Objekts in vorgegebenen, sehr kurzen Zeitintervallen Δτ << Δt. Die gesamte
Messzeit erstreckt sich über einen hinreichend langen Zeitraum von einigen Sekunden
bis Minuten, sodass genügend Daten für die statistische Auswertung vorhanden sind.
Die auf Datenträgern über die Zeit t gespeicherten Messdaten (n1(t,Δτ), n2(t,Δτ))
werden entweder online elektronisch ausgewertet - ein solches Beispiel ist angegeben - ,
oder anschliessend auch über geeignete Computerauswertungen der vorhandenen
Messdaten. Neben den extensiven Messdaten (Photonenzahlen n1, n2 pro Δτ in
Abhängigkeit von der Zeit t) erlaubt die Messung die Berechnung der PCS sowohl über die
Koinzidenzen in beiden Kanälen als auch vergleichsweise über die direkte Auswertung
der Photonenzählstatistik aus den Messdaten der einzelnen Kanäle. Die PCS hat den
Vorteil, dass sie als Gruppe intensiver Messparameter unabhängig von Grösse und
Form eines Objektes die innere Organisation charakterisiert. Die Verwendung zweier
Kanäle bietet neben höherer Sicherheit in der Ergebnisermittlung den Vorteil, auch bei
nicht-stationärer Photonenemission des Objekts, z. B. bei der Messung der verzögerten
Lumineszenz, die Photonenzählstatistik über die Koinzidenzrate unmittelbar errechnen
zu können. Überraschend hat es sich als Vorteil erwiesen, die Anregung des
untersuchten Objekts mit LEDs vorzunehmen, deren Lichtintensität auf die gleiche
Grössenordung reduziert wird wie sie die Biophotonenemission der biologischen Proben selbst
aufweisen. Bringt man die LEDs im Hintergrund der Proben an und misst das die Probe
durchschimmernde Licht, dann stellt sich heraus, dass die PCS die empfindliche Streu-
Wechselwirkung des künstlichen Lichts mit der Probe empfindlich registriert. Die PCS
der LED und die der biologischen Probe sind unter geeigneten Bedingungen bei sehr
geringen Zählraten stark unterschiedlich von der PCS des Lichts, das die Probe bei
Durchleuchtung mit der LED abgibt. Das Beispiel dokumentiert einen solchen Fall, in
dem chaotisches Licht der LED mit "super-Poissonian" PCS im Kohärenzvolumen der
Lampe nach Durchschimmern der biologischen Probe sogar in Licht mit "sub-
Poissonian" PCS transformiert wird. Das heisst, dass die Wahrscheinlichkeit P(0,Δt) für
die LED, wie erwartet; grösser als exp(- < n >) ist, wobei < n > die mittlere Photonenzahl
ist, während p(0,Δt) für das Licht, das die biologische Probe bei der Durchleuchtung mit
der LED abgibt, überraschend sogar signifikant kleiner als exp(- < n >) ausfällt. Diese
Transformation spiegelt die Wechselwirkung des LED-Lichts mit den Streuzentren der
biologischen Probe in empfindlicher Weise wider. Konsequenterweise erlaubt das
Verfahren in höchst empfindlicher Weise die Registrierung geringster Unterschiede
vergleichbarer biologischer Gewebe.
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Die Erfindung wir nachfolgend in einem Ausführungsbeispiel anhand einer Zeichnung
näher erläutert. In der Zeichnung zeigen die
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Fig. 1 ein Schaltbild eines Koinzidenz-Zählsystems
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Fig. 2 Prinzip der Koinzidenz-Zählung
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Fig. 3-5 Auswertebeispiele
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Fig. 1 zeigt das Koinzidenz-Zählsystem mit den beiden Photomultipliern P1 und P2, die
an den abgedunkelten Messraum angeschlossen sind. Über Verstärker,
Diskriminatoren D1, D2 und Zählkarten wird ein logisches Element angesteuert, das aus den
Zählraten der beiden Kanäle die Koinzidenzen zwischen den beiden Kanälen ermittelt. Die
Ergebnisse werden in einen Computer Co übertragen und dort zusammen mit den
Messdaten nach bestimmten Kriterien ausgewertet.
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Eine LED- oder eine biologische Gewebeprobe S wird in einer abgedunkelten Kammer
auf einem Verfahrwagen T, der von einem Schrittmotor angetrieben ist, angeordnet. Die
Position des Verfahrwagens T ist veränderbar. Die beiden Photomultiplier P1 und P2
arbeiten simultan, um eine Photoemission der Probe S zu erfassen. Die Signale der
Photomultiplier P1 und P2 werden mittels Vielkanal-Zählkarten M1, M2 gezählt. Das
Koinzidenz-Zählsystem K analysiert die registrierte Photonenzahl der Multiplier P1, P2
und die Zahl der Koinzidenzen wie in Fig. 2 dargestellt.
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Die Multiplier P werden mittels eines Kühlsystems C in der Kammer bis auf -30°C
gekühlt, um die Betriebsbedingungen zu verbessern.
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Fig. 2 zeigt ein Beispiel der Anwendung: Kanal 1 wird als Messkanal, Kanal 2 als
Referenzkanal geschaltet. Sobald in Kanal 1 ein Photon registriert wird, wird im
Koinzidenzkanal 3 eine Koinzidenz dann und nur dann festgestellt, wenn im Kanal 2 nach einem
sehr kleinen vorgegebenen Messzeitintervall τ ebenso ein Photon innerhalb eines
vorgegebenen Messzeitintervalls Δτ >> τ gezählt wird. Zwei unmittelbar hintereinander
stattfindende Messergebnisse im Kanal 1 zu den Zeiten t1 und t2, von denen das erste keine
Koinzidenz auslöst, verlängern die Zeitspanne Δτ um die Zeitdifferenz t2-t1. Zwei
Zählereignisse im Kanal 2, die gemeinsam in das Zeitintervall Δτ fallen, werden als zwei
Koinzidenzen gewertet. Es werden dann jeweils die Mittelwerte aus den Zählraten
n1(Δt), n2(Δt) und der Koinzidenzrate Z(Δt) in einem vorgegebenen Zeitintervall Δt >> Δτ
gebildet. Die Wahrscheinlichkeit P(0), im Kanal 1 kein Photon zu messen, erhält man
aus den Messgrössen zu
p(0, Δt) = 1 - Z(Δt/n2(Δt))
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Die Ergebnisse lassen sich vergleichen mit den Ergebnissen der Quantenstatistik, die
voraussagt, dass z. B. für chaotisches Licht innerhalb der Kohärenzzeit, die grösser als
Δτ sein muss, p(0) = 1/(1+ < n2 >), oder für kohärentes Licht p(0) = exp(- < n2 >). Für
gequetschtes Licht mit positivem Squeezfaktor r ist p(0) kleiner als p(0) für alle übrigen
Lichtquellen.
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Im Beispiel wird ein Blatt, dessen Eigenemission Werte von p(0) liefert, die grösser oder
gleich exp(- < n2 >) sind (Fig. 3), vor eine LED gestellt, deren p(0) > exp(- < n2 >) sind (Fig.
4). Überraschend emittiert das durchstrahlende Licht der LED durch seine
Vielfachwechselwirkung mit dem Blatt eine völlig neue Photonenzählstatistik, die sogar
Komponenten p(0) < exp(- < n2 >) enthält (Fig. 5). Das bedeutet, dass Biophotonen ihre
Zählstatistik stark verändern können und unter Umständen sogar gequetscht sind. Die
Aufzeichnung dieser Muster der Photonenzählstatistik liefert das bisher wohl empfindlichste
nicht-intensive Messverfahren zur Analyse biologischer Gewebe. Es ist unabhängig von
Form und Grösse der untersuchten Proben.
Bezugszeichen
A Amplifier
C Kühlsystem
Co Computer
D Diskriminator
K Koinzidenz-Zählsystem
M Zählkarte
P Photomultiplier
S Probe
T Verfahrwagen
X Poisson-Verteilung
Y geometrische Verteilung
n Zählrate
Z Koinzidenzrate
t Zeit
r Squeezfaktor
P Wahrscheinlichkeit
1 Kanal
2 Kanal
3 Koinzidenzkanal