DE10130657A1

DE10130657A1 - Neues endothetial exprimiertes Protein und seine Verwendung

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Publication number: DE10130657A1
Application number: DE10130657A
Authority: DE
Original assignee: Axaron Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2003-01-16
Also published as: WO2003001863A3; WO2003001863A2; US20040260058A1; AU2002314181A1; EP1402033A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue spezifisch exprimierte Proteine und Nukleinsäuresequenzen oder transgene Nukleinsäurekonstrukte, die für die Proteine kodieren. DOLLAR A Die Erfindung betrifft außerdem transgene Organismen oder Tiere, enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte sowie mono- oder polyklonale Antikörper und Bindefaktoren, die gegen die isolierten Proteine gerichtet sind. DOLLAR A Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität an die erfindungsgemäßen Proteine, ein Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der erfindungsgemäßen Proteine. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der Nukleinsäuresequenzen und Proteine. DOLLAR A Umfasst sind ferner Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Funktion der erfindungsgemäßen Proteine modulieren, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Arzneimitteln.

Description

Das vaskuläre Endothelium stellt aufgrund seiner anatomischen Lokalisation eine wichtige biologische Grenze dar. Es definiert intra- und extravaskuläre Kompartimente, dient als selektiv permeable Grenzschicht und bildet eine nicht-thrombogene Begrenzung des kardiovaskulären Systemes. Das vaskuläre Endothelium besitzt die Fähigkeit der Überwachung, Integration und Weiterleitung von Signalen, die im Lumen generiert worden sind. Dies gilt nicht nur für Stimuli löslicher Faktoren (z. B. Hormone und Cytokine) sondern auch für die Perzeption verschiedener Arten von mechanischen Kräften, die durch den Blutstrom auf das Endothelium wirken (z. B. Scherkräfte, Wandschubspannung, pulsatorische Dehnung der Gefäßwand). Damit stellt das Endothelium ein sensorisches Organ dar.
Das Endothel ist zum Beispiel an der Regulation des arteriellen und arteriolären Gefäßtonus beteiligt durch Synthese und Freisetzung vasoaktiver Lokalhormone (z. B. Stickoxid und Prostazyklin) und durch Aufnahme und/oder Abbau mit dem Blut zirkuierender vasoaktiver Substanzen (für eine Übersicht siehe Hierholzer K. und Schmidt R. F. (1994) Pathophysiologie des Menschen, Chapman & Hall, Weinheim). Störungen der vasomotorischen und hämostatischen Funktionen des Endothels sind an der Beeinträchtigung der Gewebeperfusion bei verschiedenen akuten und chronischen kardiovaskulären und Stoffwechselstörungen beteiligt. Damit stellen sie einen wichtigen pathogenetischen Faktor bei Krankheiten wie zum Beispiel septischer Schock, Hypertonie, Arteriosklerose, Herzinsuffizienz, Diabetes mellitus, Hyperlipidämie sowie Homocysteinurie dar.
Zu den auf das Endothel wirkenden Stimuli mit Wirkung auf den Gefäßtonus gehören unter anderem hämostatische Faktoren (z. B. ADP, ATP, Adenosin, Serotonin, plättchenaktivierender Faktor, Thrombin), Neurotransmitter und Peptide (Acetylcholin, Bradykinin, Substanz P, vasoaktives intestinales Peptid, Calcitoningene-related-peptide) sowie Hormone (Angiotensin II, Vasopressin, Noradrenalin, Adrenalin, Histamin) und physikalische Stimuli (Wandschubspannung, Pulsatilität). Bei Endothelschädigung wirken diese Stimuli direkt vasokonstriktorisch und verlieren ihren dilatierenden Einfluss, der über intakte Endothelzellen vermittelt wird, auf die Gefäße.
Endothelzellen können auf verschiedene Stimuli hin (siehe oben) endotheliale Autakoide (z. B. NO und PGI₂) bilden und freisetzen. Sie haben aber auch das Potential zur Produktion vasokonstriktiver Substanzen (z. B. Endothelin). An Gefäßspasmen, wie zum Beispiel bei Arteriosklerose, verschiedenen immunologischen Prozessen und nach thrombotischen Ereignissen, sind gestörte Endothelfunktionen beteiligt. Dabei handelt es sich um fehlregulierte, exzessive lokale Konstriktionen, die zu Ischämie in den betroffenen distalen Organgebieten führen. Arteriosklerotische Veränderungen der Gefäßwand sind mit verstärkten Konstriktionen verbunden, verursacht unter anderem durch beeinträchtigte endotheliale vasodilatorische Mechanismen. Endothelzellen sind auch an der Kontrolle der Blutkoagulation beteiligt, wobei unter physiologischen Bedingungen die antikoagulatorischen Effekte überwiegen. Störungen der Integrität der Endothelzellen führen zur schnellen Adhäsion und Aggregation von Thrombozyten und zur Aktivierung der plasmatischen Koagulationskaskade.
An Durchblutungsstörungen, die sich infolge von Arteriosklerose, Thrombose oder von Gefäßspasmen in Verbindung mit Entzündungen entwickeln, sind auch Lipidmediatoren (Metabolite der Arachidonsäure) beteiligt. Dabei ist das Gefäßsystem sowohl Bildungs- als auch Wirkungsort dieser Metaboliten (siehe zum Beispiel Hierholzer K. und Schmidt R. F. (1994) Pathophysiologie des Menschen, Chapman & Hall, Weinheim).
Vor allem das Hirn reagiert sehr empfindlich auf Störungen der Blutzufuhr. Anoxie und ischämische Zustände, die nur für Sekunden andauern, können bereits zu neurologischen Ausfallsymptomen führen. Bleibt die Blutzufuhr minutenlang unterbrochen, kommt es zu irreversiblen neuronalen Schäden. Der Blutfluss muss eine effiziente Versorgung des Hirnes mit Sauerstoff, Glucose und anderen Nährstoffen gewährleisten, sowie CO₂, Laktat und andere metabolische Produkte wieder entsorgen. Obwohl das menschliche Hirn nur etwa 2% des gesamten Körpergewichtes ausmacht, erhält es doch etwa 15% des vom Herzen ausgestoßenen Blutes und beansprucht zirka 20% des gesamten Sauerstoffbedarfs. Diese Werte unterstreichen den hohen metabolischen Umsatz des Hirnes. Die cerebralen Gefäße, die diesen hohen Anforderungen gerecht werden müssen, haben Mechanismen der Autoregulation entwickelt, um einen optimalen cerebralen Blutfluss aufrechtzuerhalten. Solche Mechanismen der Autoregulation können sehr lokal und gekoppelt an neuronale Aktivität sein, was z. B. mit MRI/PET Techniken visualisiert werden kann. In anderen Organen können u. a. ähnliche Mechanismen für die Regulation des Blutflusses verantwortlich sein (für eine Übersicht siehe Schmidt R. F. und Thews G. (1987) Physiologie des Menschen, Springer Verlag, Heidelberg).
Während und nach epileptischen Anfällen verändert sich der lokale cerebrale Blutfluss und Metabolismus in den betroffenen Hirnarealen. Dabei kommt es während des Anfalls zu starken lokalen Erhöhungen des Blutflusses, um später in eine Hypoperfusion überzugehen. Inwieweit der Blutfluss adäquat zu den gestiegenen metabolischen Anforderungen der Hirnareale reguliert wird (iktal bzw. postiktal) und ob es demzufolge zu einer relativen Hypoperfusion kommt, wird kontrovers diskutiert (siehe beispielsweise Ingvar M. und Siesjo B. K. (1983) Acta Neurol Scand 68: 129-144; Duncan R. (1992) Cerebrovasc Brain Metab Rev 4: 105-121).
Der Blutdruck wird - zumindest teilweise - von einer Vielzahl genetischer Faktoren beeinflußt. Die zugrundeliegenden Gen-Allelvarianten werden aufgrund der Natur ihres Einflusses als "Quantitative Trait Loci" (QTLs) bezeichnet. Die Identifizierung derartiger QTLs ist ein wichtiger Schritt zur Identifizierung von Genen, die an der Regulierung des Blutdruckes beteiligt sind. Eine Schwierigkeit der Identifikation besteht darin, geeignete Populationen von Individuen, die sich zwar in dem zu untersuchenden Phänotyp (hier z. B. Bluthochdruck, systolischer oder diastolischer Druck o. ä.) unterscheiden, aber sonst einen sehr ähnlichen Genotyp aufweisen. Derartige Populationen können gefunden werden in Gegenden mit sehr geringer Migrationsrate und Vermischung mit außenstehenden Bevölkerungsgruppen (z. B. Mormonen, Amischen, Isländer). Eine andere Möglichkeit besteht z. B. in der Untersuchung mono- und dizygotischer Zwillinge. Monozygotische Zwillinge haben den gleichen Genotyp und sind zumindest teilweise den gleichen Umweltfaktoren ausgesetzt. Dizygotische Zwillinge haben dagegen nur 50% identischen Genotyp und unterliegen Umwelteinflüssen zu gleichen Teilen wie monozygotische Zwillinge. Ein Vergleich von mono- und dizygotischen Zwillingen nach Phäno- und Genotyp erlaubt die Untersuchung des Anteils genetischer Faktoren an einem bestimmten Phänotyp. Die Analyse des Genotyps wird üblicherweise unter Benutzung geeigneter genomischer Marker (z. B. sogenannte Mikrosatellitenmarker) durchgeführt. Eine weitere Möglichkeit der Identifizierung genetischer Faktoren mit den Mitteln der Populationsgenetik besteht in der Untersuchung der Korrelation von Geno- und Phänotyp in Familien, ohne eine Beschränkung auf Zwillinge.
In der OMIM Datenbank (Online Mendelian Inheritance of Man; Internet-Adresse www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim) ist für die Bluthochdruckerkrankung unter der OMIM Nummer 112410 das Syndrom Hypertonie mit Brachydactylie (HTNB) mit dem Locus 12p12.2-p11.2 angegeben. Des weiteren findet sich in der Region 12p13 ein Locus für Essentiellen Bluthochdruck (Essential Hypertension; EHT, OMIM Nummer 145500). Ein weiterer Hinweis auf einen QTL auf Chromosom 12, der mit einer genetischen Prädisposition für Bluthochdruck in Verbindung gebracht wurde, kommt von einer Studie von Frossard und Lestringant, 1995 (siehe OMIM 172410 und 172410; Frossard P. M. und Lestringant G. G. (1995) Clin Genet 48: 284-287) sowie von Nagy et al. (Nagy Z. et al. (1999) J Am Soc Nephrol 10: 1709-1716).
Das HTNB-Syndrom wurde 1973 erstmals als autosomal-dominante Erkrankung mit Brachydactylie und schwerem Bluthochdruck in einer türkischen Familie beschrieben (Bilginturan N. et al. (1973) J Med Genet 10: 253-259). Die beiden Symptome wurden als komplett co-segregierend charakterisiert, so dass von einem Defekt in einem einzigen pleiotropen Gen oder zwei sehr eng benachbarten Genen auszugehen war. In einer molekularbiologischen Studie (Schuster H. et al. (1996) Hypertension 28: 1085-1092; Schuster H. et al. (1996) Nat Genet 13: 98-100) wurde das Syndrom auf Chromosom 12, zwischen den Markern D12S364 und D12S87, kartiert. Von der Lage dieser Marker kann man auf die chromosomale Region 12p12.2-p11.2 schließen (vgl. OMIM-Eintrag). Das Syndrom ist gekennzeichnet durch Bluthochdruck mit einem Unterschied von mindestens 50 mm Hg zwischen betroffenen und nicht betroffenen Familienmitgliedern. Weiterführende Arbeiten zeigten, dass die betroffenen Patienten nicht Salz-sensitiv waren und dass ihre humoralen Reaktionen (Renin, Aldosteron, Katecholamine) auf Volumenexpansion bzw. -verkleinerung normal waren, was darauf hin deutet, dass das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System und das sympathische Nervensystem nicht für den erhöhten Bluthochdruck verantwortlich sind. Damit ähnelt das HTNB-Syndrom dem essentiellen Bluthochdruck (Schuster H. et al. (1996) Hypertension 28: 1085-1092; Schuster H. et al. (1996) Nat Genet 13: 98-100).
Die Bildung von Blutgefäßen erfolgt über zwei verschiedene Prozesse: Angiogenese und Vaskulogenese. Während der Embryogenese werden sogenannte Angioblasten (d. h. vaskuläre Endothelzellen, die noch kein Lumen gebildet haben) aus mesodermalen Vorläuferzellen gebildet. Die Angioblasten differenzieren dann und es kommt zur Bildung eines ersten vaskulären Plexus, aus dem sich dann primitive Blutgefäße ausbilden. Dieser Prozess der de novo Formierung von Blutgefäßen wird Vaskulogenese genannt (Risau W. und Flamme I. (1995) Annu Rev Cell Dev Biol 11: 73-91).
Nach der Ausbildung des primären vaskulären Plexus werden weitere Endothelzellen ausgehend von den bereits existierenden Gefäßen gebildet (Angiogenese). Dabei können die neuen Kapillaren durch Aussprossen oder durch Längsteilung der Gefäße entstehen. Welcher Typ der Angiogenese überwiegt, ist von Organ zu Organ verschieden. Während sich zum Beispiel die Lungengefäße durch nicht-sprossendes Wachstum entwickeln, entstehen die Hirn-Gefäße durch Sprossen, bedingt durch ein Fehlen von Angioblasten in der Hirnanlage (Risau W. (1997) Nature 386: 671-674). Aus dem vaskulären Plexus wird ein reifes Gefäßsystem mit kleineren und größeren Gefäßen durch einen Prozess des "Beschneidens" und Remodellierens. Dabei gehen "überschüssige" Gefäße verloren, die Endothelialzellen können sich in andere Gefäße integrieren oder dedifferenzieren.
Die molekularen Mechanismen dieses Prozesses (z. B. ob und in welchem Umfange Apoptose beteiligt ist) sind noch unverstanden. In der weiteren Reifung der Blutgefäße sind sowohl extra- als auch intraluminale Faktoren beteiligt. Die Gefäße wachsen bzw. entwickeln sich zurück in Abhängigkeit von der Entwicklung des Organes, das sie versorgen. Bessere Perfusion führt zur Hyperoxygenation, wodurch es zur Rückbildung von Gefäßen kommt. Nichtperfundierte Gefäße verkümmern. Die Flussrichtung kann sich ändern; Arteriolen werden Venolen oder umgekehrt. Ursprünglich unabhängig wird das vaskuläre System immer mehr von der Durchblutung (neben zirkulierenden Signalmolekülen) und den dadurch verursachten Kräften (z. B. Scherkräfte) abhängig.
Angiogenese ist auch im adulten Organismus zu finden, so zum Beispiel im weiblichen Reproduktionssystem, beim Haarwachstum und bei der Wundheilung. Die Endothelialzellen sind nicht postmitotisch, sondern können (meist lokal und transient) zur Bildung neuer Gefäße angeregt werden. Bei pathologischen Veränderungen und bei der Wundheilung gibt es eine enge Verbindung der Angiogenese zu entzündlichen Prozessen. Die Balance zwischen lokalen inhibitorischen Kontrollen und angiogenen Induktoren ist gestört, und es kommt zu verändertem Gefäßwachstum. Diese Störungen sind ursächlich beteiligt an vielen humanen Erkrankungen, unter ihnen z. B. Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystemes, Rheumatoide Arthritis, diabetische Retinopathie und Tumorwachstum.
Der Übergang von ruhender zu aktivierter Vaskularisierung eines Tumors wird wahrscheinlich ausgelöst durch einen Hypoxie- Stimulus, wenn der Tumor eine Größe erreicht hat, bei der die einfache Diffusion nicht mehr zur Versorgung aller Tumorzellen mit Nährstoffen ausreicht (für eine Literatur-Übersicht siehe Brower V. (1999) Nat Biotechnol 17: 963-968; Zetter B. R. (1998) Annu Rev Med 49: 407-424 und darin enthaltene Referenzen). Dabei kommt es zur Expression von Hypoxie-induzierten Genen, wie z. B. Vaskulärer Endothelialer Wachstumsfaktor A (VEGF-A) und Placenta- Wachstumsfaktor (PIGF), die beide spezifisch das Wachstum von Endothelzellen über die Bindung ihrer Rezeptoren stimulieren. Endothelzellen ihrerseits produzieren viele nichtspezifische angiogene Stimulatoren (u. a. βFGF, αFGF, TGFα, TGFβ), die auch zum invasiven Wachstum beitragen. Tumor- und Endothelzellen produzieren proteolytische Enzyme (Matrix-Metalloproteinasen, Serinproteasen wie z. B. Gewebe-Plasminogen-Aktivator), die die extrazelluläre Membran abbauen. Das proteolytische Milieu aktiviert aber auch kryptische Angiogenese-Inhibitoren (die bekanntesten Vertreter sind Angiostatin und Endostatin) und verschiedene Protease-Inhibitoren. Endothelzellen exprimieren bestimmte Adhäsionsmoleküle auf ihrer Oberfläche (Integrin αvβ3 und αvβ5), die mit der extrazellulären Membran interagieren. Die Expression von einigen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosinkinasen (unter ihnen VEGFR-1 und VEGFR-2) der Endothelzellen wird hochreguliert. Die Aktivierung von Tie-1 und Tie-2 Rezeptoren scheint in der Vermittlung von Cytokin- und Angiopoetin-vermittelten Kapillar-organisierenden Signalen eine Rolle zu spielen. Cytokine und Chemokine sind auch für die Anlockung von Monozyten und Leukozyten verantwortlich, was zur Ausbildung einer lokalen Entzündungsreaktion beiträgt. Natürlich vorkommende Inhibitoren der Angiogenese können in kultivierten vaskulären Endothelzellen Apoptose auslösen (Jimenez B. et al. (2000) Nat Med 6: 41-48, und darin enthaltene Referenzen). Dies ist ein Hinweis, dass Apoptose ein wichtiger Regulator der Angiogenese sein könnte.
Eine wichtige Funktion bei der intrazellulären Regulation haben die "immediate early genes" (infolge IEGs). Ein Gen wird als IEG bezeichnet, wenn es drei Bedingungen erfüllt:

1. seine mRNA muss in ruhenden bzw. nicht stimulierten Zellen niedrig exprimiert werden,
2. seine mRNA Expression kann auch unter Abwesenheit von de novo Proteinsynthese erfolgen,
3. nach geeigneter Stimulierung transkriptionell aktiv (Nathans (1991) In Origins of Cancer: A Comprehensive Review, Brugge J., ed., S. 353-364.).

Basierend auf der Kinetik ihrer mRNA Akkumulation werden IEGs häufig in drei Klassen eingeteilt:

A) IEGs der Klasse I sind in ruhenden/nicht stimulierten Zellen oft nicht detektierbar, die maximale mRNA Konzentration wird etwa 30 bis 60 Minuten nach Stimulation erreicht. Nach etwa 1,5 bis 2 Stunden geht diese wieder auf basale Werte zurück. Beispiele sind c-fos, c-jun, zif268.
B) IEGs der Klasse II haben maximale mRNA Konzentrationen 2 Stunden nach Stimulation und erreichen basale Werte nach etwa 8 Stunden. Beispiele hierfür sind Narp, c-myc, GLUT1.
C) Gene der Klasse III werden sehr schnell induziert, ihre mRNAs akkumulieren aber über viele Stunden und haben eine lange Halbwertszeit (z. B. Fibronectin) (Lau L. und Nathans D. (1991) In The hormonal control of gene transcription, Cohen P. und Foulkes J. G., eds., S. 257-293).

Da die transkriptionelle Aktivierung von IEGs unter Abwesenheit von de novo Proteinsynthese erfolgen kann, müssen die Regulationsproteine zur Induktion der IEGs in der nicht stimulierten Zelle bereits präsent und für eine Aktivierung bereit sein. Es wurde beobachtet, dass eine Stimulation von Zellen unter Anwesenheit von Cycloheximid, einem potenten Proteinsynthese-Inhibitor, zur Superinduktion von IEGs führt. Diese Beobachtung wurde auf zwei Effekte zurückgeführt, eine verlängerte Transkriptionsdauer sowie eine erhöhte mRNA Stabilität. AT-reiche Sequenzen im 3'-untranslatiertem Bereich scheinen für die schnelle Degradation von mRNAs, die für IEGs und Cytokine kodieren, eine wichtige Rolle zu spielen. Ein AUUUA-Motiv wurde in fast allen IEG mRNAs mit kurzen Halbwertszeiten identifiziert (Lau L. und Nathans D. (1991) In The hormonal control of gene transcription, Cohen P und Foulkes J. G., eds., S. 257-293). Die Beobachtung, dass Inhibitoren der Proteinsynthese die mRNA von IEGs stabilisieren, kann mit verschiedenen Hypothesen erklärt werden. Neu synthetisierte oder labile RNasen sind für die Degradation erforderlich oder aber die Degradation der mRNA ist direkt an die Translation gekoppelt. Für beide Theorien gibt es experimentelle Indizien. Für das Gen c-myc wurde ein cytosolischer Faktor beschrieben, der c-myc mRNA nach Stimulation bindet und destabilisiert, und der bei Behandlung mit Cycloheximid nicht nachweisbar ist. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Translation eine Voraussetzung für mRNA Degradation ist (z. B. Yen T. J. et al. (1988) Nature 334: 580-585 für das Gen Tubulin).
Die funktionelle Bedeutung der neuronalen IEGs war zunächst völlig unklar, so stellte sich erst mit weiteren Untersuchungen heraus, dass diese Gene unter anderem wichtige intrazelluläre Regulationspunkte darstellen. Für das IEG Homer 1A konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass es sich dabei um eine trunkierte Variante eines Mitglieds einer größeren Genfamilie handelt und dass die Induktion dieser Variante zur (dominant-negativen) Unterbrechung der Signalweiterleitung führt, die von den anderen Mitgliedern der Genfamilie zwischen extrazellulären Rezeptoren und internen Kalziumspeichern vermittelt wird (Tu J. C. et al. (1998) Neuron 21: 717-726; Xiao B. et al. (1998) Neuron 21: 707-716). Somit führt ein externer Stimulus (z. B. Krampfanfall) zu direkten Veränderungen wichtiger Second Messenger Systeme.
Ein weiterer Beweis, welche wichtige Rolle neuronal exprimierte IEGs im Hippocampus spielen, wurde am Beispiel von Arc geliefert. Dieses Gen wird ebenfalls nach Auslösung eines Krampfanfalles in Pyramidenzellen der hippocampalen Subregionen CA1 und CA3 in seiner mRNA-Expression induziert. Es wurde gezeigt, dass die Arc mRNA Expression im CA1 Areal durch bloßes Verbringen der Ratte in eine neue Umgebung induziert wird. Da das Muster der induzierten Neuronen spezifisch für die jeweilige Umgebung war, in der sich die Ratte befand, konnte man nachweisen, dass die Induktion der Arc mRNA-Expression mit Vorgängen der neuronalen Informationsspeicherung im Hippocampus korreliert (Guzowski J. F. et al. (1999) Nat Neurosci 2: 1120-1124).
Das Gen L119 wurde bisher nur als IEG cDNA in der Ratte beschrieben (WO 99/40225). Diese cDNA wurde kloniert aufgrund der Stimulation der mRNA-Expression von L119 im Hippocampus der Ratte nach einem wiederholten maximalen elektrokonvulsivem Krampf. In dieser Arbeit ging man davon aus, dass der Stimulus zur Induktion von neuronalen Immediate Early Genes (IEG) führt. Alle bisher beschriebenen Gene, die auf diese Weise kloniert worden sind, werden neuronal exprimiert (siehe beispielsweise Yamagata K. et al., (1994) J Biol Chem 269: 16333-16339, 1994; Lyford G. L. et al. (1995) Neuron 14: 433-445; Brakeman P. R. et al. (1997) Nature 386: 284-288).
Ausgehend von der Bedeutung des Endothels bei einer Vielzahl von Erkrankungen wie beispielsweise des Gehirns, des Immunsystems, des Herz-Kreislaufsystems oder bei Krebs, und einem nach wie vor hohem Bedarf an Behandlungsmethoden für diese Erkrankungen stellte sich die Aufgabe neue Ansätze zu entwickeln, die eine effiziente Therapie der genannten Erkrankungen ermöglichen.
Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellung der L119 Proteine und der für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen, die Verwendung derselben zur Diagnose, Prophylaxe und Therapie endothelialer Erkrankungen, sowie durch neue Verfahren zur Modulation oder Normalisierung der L119 Aktivität zur Behandlung endothelialer Erkrankungen unter Einbeziehung dieser Nukleinsäuren und/oder Proteine gelöst.
Bei der Entdeckung der L119 cDNA in der Ratte (WO 99/40225) nahm man an, ein weiteres neuronales IEG identifiziert zu haben. Weiterführende Analysen zeigten aber völlig überraschend, dass die L119 mRNA weder in Neuronen noch in Gliazellen exprimiert wird, auch nicht nach Stimulation mittels eines wiederholten maximalen elektrokonvulsiven Krampfes. Die Analysen von In situ Hybridisierungen ergaben dagegen ausschließlich Signale in den Endothelzellen von Kapillaren und größeren Blutgefäßen (siehe Beispiel 5). In Experimenten mit systemischer Verabreichung eines Blockers der Proteinsynthese (Cycloheximid) wurde demonstriert, dass die Induzierbarkeit der L119 mRNA Expression nicht nur auf Blutgefäße des Hirns beschränkt ist, sondern sich in allen untersuchten Geweben und Organen nachweisen ließ (siehe Beispiel 5). Somit ist L119 kein neuronales IEG sondern vielmehr ein Gen, dessen mRNA Expression auf diverse im Folgenden im Detail beschriebenen Stimuli hin in Endothelzellen von Blutgefäßen induziert wird. L119 ist damit bisher das einzige endothelspezifische Gen, von dem bekannt ist, dass es in Endothelzellen von Blutgefäßen nach akuten Krampfanfällen induziert wird.
L119 ist exprimiert in Endothelzellen von Kapillaren und größeren Blutgefäßen im Hirn und anderen Organen. Die mRNA der Ratten cDNA für L119 hat 8 AUUUA Motive (vergleiche SEQ ID NO: 1 beziehungsweise SEQ ID NO: 2), was typisch für IEG mRNAs mit kurzen Halbwertszeiten ist (s. o.; Lau L. und Nathans D. (1991) In The hormonal control of gene transcription, Cohen P. und Foulkes J. G., eds., S. 257-293). Basierend auf den obenangegebenen Kriterien für IEGs kann L119 als IEG der Klasse I klassifiziert werden. Die experimentell beobachtete schnelle Regulation der Degradation der L119 mRNA lässt sich unter anderem mit den oben beschriebenen Mechanismen erklären.
Durch Nachweis der Expression von L119 während und nach epileptischen Anfällen in Korrelation zu Blutfluss und Metabolismus wurde eine wichtige Rolle von L119 in der Regulation dieser Prozesse gezeigt (s. Beispiel 5).
Ferner wurde eine wichtige Funktion von L119 bei der Tumorentwicklung nachgewiesen. Die L119 mRNA wird basal nur sehr niedrig exprimiert bzw. ist nicht zu detektieren. In den Gefäßen verschiedener Tumore findet sich dagegen eine hohe Expression von L119 mRNA (s. Beispiel 6). Biochemische Studien dokumentieren eine Interaktion von L119 Protein mit Membranrezeptoren, unter ihnen der VEGF-Rezeptor Neuropilin (Beispiel 9). Diese Daten und die Tatsache, dass die L119-Genexpression durch Stimuli induziert wird, die eine globale oder lokale Hypoxie erzeugen (Tiermodell siehe Beispiel 5; in vitro Zellkulturmodell siehe Beispiel 7), deuten auf einen Zusammenhang zwischen L119 Expression und Prozessen der Angiogenese hin. Dabei kann es sich sowohl um physiologische Prozesse (z. B. Neoangiogenese während der Entwicklung eines Organismus) als auch um pathologische Mechanismen, wie sie zum Beispiel bei Tumorwachstum auftreten, handeln.
Homologie-Suchen mit der genomischen Sequenz von L119 der Maus in der EMBL Nukleotiddatenbanken mit dem Programm Blast (Altschul S. F. et al. (1997) Nucleic Acids Res 25, 3389-3402) ergaben sehr hohe Ähnlichkeit mit einem Eintrag von Sequenzen humaner genomischer Daten. Bei dem Eintrag AC007215 (Release 62, last updated, Version 21; dated 24-JAN-2000) handelt es sich um 131 ungeordnete Sequenzstücke des BAC-Klones RPCI11-59H1, der vom Chromosom 12 (Region 12p12) stammt. Aufgrund der hohen Sequenzhomologie zwischen Maus L119 Sequenzen und Sequenzen aus dem Eintrag AC007215 kann davon ausgegangen werden, dass dieses BAC zumindest Teile der genomischer Sequenz von L119 enthält (siehe Beispiele 3 und 4). Zusammenfassend kann damit der humane genomische Locus von L119 dem Chromosom 12, Region 12p12 zugeordnet werden.
In der OMIM Datenbank (s. o.) wurde untersucht, ob es in der Region des L119 Locus Syndrome gibt, deren mögliche Ursache Mutationen des L119 Genes sein könnten. Dabei wurde die spezifische Expression von L119 in Blutgefäßen, seine Induzierbarkeit durch verschiedene Stimuli sowie die Interaktion mit wichtigen Rezeptoren des Blutgefäßsystems mit in Betracht gezogen. Überraschenderweise konnten in der Region des L119 Locus (12p12) zwei Syndrome identifiziert werden, für die L119 ein bona fide Kandidatengen darstellt. In unmittelbarer Nähe zum L119 Locus wurde auf Chromosom 12 überraschenderweise ein Lokus für essentiellen Bluthochdruck (s. o.) gefunden.
Die im Bereich des HTNB Locus auf Chromosom 12 lokalisierten QTLs für Bluthochdruck (Nagy Z. et al. (1999) J Am Soc Nephrol 10: 1709-1716; Frossard P. M. und Lestringant G. G. (1995) Clin Genet 48: 284-287) waren bezüglich der für ihre Lokalisation in Frage kommenden Region in beiden Fällen nur äußerst grob umrissen. Ein Rückschluss auf das ursächliche Gen war ausgehend von den in der OMIM-Datenbank zur Verfügung gestellten Informationen weder direkt noch indirekt möglich.
Die Daten zur spezifischen Expression von L119 in Blutgefäßen sowie die Regulierbarkeit der Expression durch verschiedene Stimuli machen L119 zum bona fide Kandidatengen, dessen Mutation ursächlich für die beschriebene Krankheit sein kann. Neben Familien mit diesem monogenetischen Defekt können verschiedene L119 Allelvarianten auch als QTL zu polygen vererbten Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems beitragen.
Nachdem eine Verbindung zwischen L119 und den o. g. Syndromen hergestellt wurde, ist es mit dem Fachmann geläufigen Methoden ohne weiteres möglich, die Mutation zu identifizieren und zu charakterisieren. Dabei wird man üblicherweise genomische DNA von den zu untersuchenden Patienten gewinnen. Die DNA von betroffenen Individuen wird dann auf Mutationen im L119 Locus untersucht, die in Proben gesunder Kontrollpersonen nicht (oder, bei QTLs, nicht in der Häufigkeit) vorkommen. Dazu wird die zu untersuchende genomische Region entweder in geeignete Vektoren kloniert, isoliert und anschließend analysiert oder aber mittels PCR direkt amplifiziert und analysiert. Gängige Analysemethoden sind beispielsweise Detection of Single Stranded Conformation Polymorphismus (SSCP) oder die direkte Sequenzierung von amplifizierten PCR-Produkten. Weitere Verfahren und Methoden sind unten genannt.
Aufgrund der spezifischen Expression von L119 in vaskulären Endothelzellen, der Verstärkung der L119 Expression durch verschiedene Stimuli, lässt sich eine wichtige direkte oder indirekte Beteiligung von L119 an den obengenannten regulatorischen Funktionen des Endothels herleiten. Je nach Art der Erkrankung kann eine Steigerung bzw. Verminderung eines L119 Proteins bzw. einer seiner wesentlichen Eigenschaften oder seiner Aktivität vorteilhaft sein. So kann beispielsweise eine Tumorbehandlung einen anderen Ansatz erfordern wie die Behandlung eines Schlaganfalls oder Herzinfarktes.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue spezifisch exprimierte Proteine und Nukleinsäureseguenzen, bevorzugt isolierte Proteine und Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte, die für die Proteine kodieren, sowie funktionelle Äquivalente oder funktionell äquivalente Teile derselben.
Die Erfindung betrifft außerdem transgene Organismen enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder Nukleinsäurekonstrukte in funktioneller oder nicht-funktioneller Form, sowie transgene Tiere, in deren Keimzellen und/oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz durch gentechnische Verfahren transgen verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurde.
Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zum Auffinden von Verbindungen mit spezifischer Bindungsaffinität gegen eines der erfindungsgemäßen Proteine oder Nukleinsäuren, sowie Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die wenigstens eine der wesentlichen Eigenschaften oder die Expression eines der erfindungsgemäßen Proteine modulieren oder normalisieren.
Ferner betrifft die Erfindung Verbindungen erhältlich mit den erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise mono- oder polyklonale Antikörper oder niedermolekulare Verbindungen - wie beispielsweise Agonisten und Antagonisten - für die erfindungsgemäßen Proteine.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine und Nukleinsäuresequenzen sowie der an die erfindungsgemäßen Proteine und Nukleinsäuresequenzen bindenden bzw. sie modulierenden oder normalisierenden Verbindungen zur Auffindung von spezifisch bindenden Proteinen, Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität, Auffindung von genomischen Sequenzen, sowie in analytischen, diagnostischen, prognostischen oder therapeutischen Verfahren und zur Herstellung von Arzneimitteln.
Ein "isoliertes" Protein meint ein Protein, das im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder anderen kontaminierenden Proteinen der Zelle, des Gewebes oder eines Expressionssystems ist, aus denen das Protein gewonnen wurde, oder, das im wesentlichen frei ist von chemischen Ausgangsverbindungen oder anderen Chemikalien, wenn es chemischsynthetisch hergestellt wurde.
"Im wesentlichen frei von anderem zellulären Material" meint Präparationen eines L119 Proteins in denen weniger als 30% (bezogen auf das Trockengewicht) eines Nicht-L119 Proteins enthalten sind, bevorzugt weniger als 20% eines Nicht-L119 Proteins, besonders bevorzugt weniger als 10% eines Nicht-L119 Proteins, ganz besonders bevorzugt weniger als 5% eines Nicht-L119 Proteins.
Eine "isoliertes" Nukleinsäure meint eine Nukleinsäure, die im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder anderen kontaminierenden Nukleinsäuren der Zelle, des Gewebes oder eines Expressionssystems ist, aus denen die Nukleinsäure gewonnen wurde, oder, die im wesentlichen frei ist von chemischen Ausgangsverbindungen oder anderen Chemikalien, wenn sie chemischsynthetisch hergestellt wurde.
"Im wesentlichen frei von anderem zellulären Material" meint Präparationen einer L119 Nukleinsäure in denen weniger als 30% (bezogen auf das Trockengewicht) einer Nicht-L119 Nukleinsäure enthalten sind, bevorzugt weniger als 20% einer Nicht-L119 Nukleinsäure, besonders bevorzugt weniger als 10% einer Nicht-L119 Nukleinsäure, ganz besonders bevorzugt weniger als 5% einer Nicht-L119 Nukleinsäure.
"Im wesentlichen frei von chemischen Ausgangsverbindungen oder anderen Chemikalien" umfasst Präparationen eines L119 Proteins oder L119 Nukleinsäure in den weniger als 30% (bezogen auf das Trockengewicht) einer chemischen Ausgangsverbindungen oder anderer Chemikalien enthalten sind, bevorzugt weniger als 20% einer chemischen Ausgangsverbindungen oder anderen Chemikalien, besonders bevorzugt weniger als 10% einer chemischen Ausgangsverbindungen oder anderen Chemikalien, ganz besonders bevorzugt weniger als 5% einer chemischen Ausgangsverbindungen oder anderen Chemikalien.
Als erfindungsgemäß besonders bevorzugte isolierte Proteine sind Proteine zu verstehen, die eine der in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 dargestellte Aminosäuresequenzen enthalten.
Unter einem funktionalen Äquivalent versteht man insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen einer L119 Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder einer L119 Proteinsequenzen gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 sowie deren Homologe aus anderen Tier- oder Pflanzengattungen und -arten, welche weiterhin - gegebenenfalls nach Transkription und Translation - wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften des in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 dargestellten Proteins aufweisen.
Das isolierte Protein und seine funktionellen Äquivalente lassen sich vorteilhafterweise aus dem vaskulären Endothelium von Mammalia wie Homo sapiens, Mus musculus oder Rattus norvegicus isolieren. Auch Homologe aus anderen Mammalia sind unter funktionellen Äquivalenten zu verstehen. Bevorzugt sind Homologe aus anderen Säugerarten. Besonders bevorzugt sind solche Homologe, die aus den Gattungen und Arten Mensch, Affenarten wie beispielsweise Schimpanse oder Gorilla, Maus, Ratte, Rind, Schwein, Pferd oder Schaf erhältlich sind. Ganz besonders bevorzugt sind Homologe aus dem Menschen. Weitere Beispiele für L119 Nukleinsäuresequenzen oder Proteinsequenzen lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Homologievergleiche unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder der Proteinsequenzen gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 aus Datenbanken leicht auffinden.
Natürliche oder künstliche Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotid- bzw. Aminosäureresterreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen durch die vorliegende Erfindung umfasst, welche man durch Modifikation einer L119 Nukleinsäuresequenz beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder einer Proteinsequenzen gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA- oder Aminosäuresequenzen oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel von für Transit- oder Signalpeptide kodierende Sequenzen, sein. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren oder Nukleotide in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden.
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid- Primer kommen.
Unter Substitution in Bezug auf Proteine ist der Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren bzw. Nukleotide durch eine oder mehrere Aminosäuren bzw. Nukleotide zu verstehen. Bevorzugt werden sogenannte konservative Austausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure - bzw. die Aminosäure, für die die substituierten Nukleotide kodieren - eine ähnliche physiko- chemische Eigenschaft (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc. zum Beispiele hydrophobe, saure oder basische Eigenschaft) hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gln durch Asn, Val durch Ile, Leu durch Ile, Ser durch Thr.
Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure oder Nukleotids durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.
Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren oder Nukleotiden in die Polypeptid- bzw. Polynukleotidkette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren bzw. Nukleotide ersetzt wird.
Die solchermaßen gegenüber der SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 veränderten Proteine besitzen wenigstens 60%, bevorzugt wenigstens 70% und besonders bevorzugt wenigstens 90% Sequenzidentität zu den Sequenzen in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 berechnet nach dem Algorithmus von Altschul et al. (Altschul S. F. (1990) J Mol Biol 215, 403-410).
Die solchermaßen gegenüber der SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 veränderten Nukleinsäuresequenzen besitzen wenigstens 60%, bevorzugt wenigstens 70% und besonders bevorzugt wenigstens 90% Sequenzidentität zu den Sequenzen in SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 berechnet nach dem Algorithmus von Altschul et al. (Altschul S. F. (1990) J Mol Biol 215, 403-410).
Unter einer "wesentlichen biologischen Eigenschaft" der erfindungsgemäßen Proteine ist mindestens eine der nachfolgenden Eigenschaften zu verstehen:

a) der oder die putativen transmembranen Bereiche, der aminoterminale Bereich oder der carboxyterminale Bereich, der Coiled-Coil Bereich (siehe Beispiel 2) oder
b) die Gegenwart mindestens einer der nachfolgenden Aminosäuresequenzen:
1. DALRRFQGLLLDRRGRLH
2. QVLRLREVARRLERLRRRSL
3. GALAAIVGLSLSPVTLG
4. SAVGLGVATAGGAVTITSDLSLIFCNSRE
5. RRVQEIAATCQDQMRE
6. ALYNSVYFIVFFGSRGFLIPRRAEG
7. TKVSQAVLKAKIQKL
8. ESLESCTGALDELSEQLESRVQLCTK
c) die Interaktion mit mindestens einem der nachfolgenden Proteine
1. Nel
2. Notch 4
3. Notch 3
4. Notch 2
5. Matrilin-2
6. TIED
7. Laminin alpha-4 Kette
8. Ten-m3
d) ein Molekulargewicht von 20 bis 35 kD, bevorzugt von 25 bis 30 kD, ganz besonders bevorzugt von 27 kD
e) die Expression in einer endothelialen Zelle oder Gewebe
f) die Induzierbarkeit der Expression durch Hypoxie, Cycloheximid, Pentylentetrazol, Kainat, fokale oder globale Ischämie und/oder MECS-Stimulation.

Diese Proteinbereiche ermöglichen die spezielle biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Proteine. Diese wesentlichen biologischen Eigenschaften beinhalten außerdem die Bindung spezifischer synthetischer oder natürlicher Agonisten und Antagonisten an die erfindungsgemäßen Proteine mit der in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 dargestellte Aminosäuresequenz.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, die für die oben beschriebenen Proteine kodieren, insbesondere für solche mit der in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 dargestellten Primärstruktur. Die Nukleinsäuresequenz aus Rattus norvegicus ist in SEQ ID NO: 1 bzw. in SEQ ID NO: 2, aus Mus musculus in SEQ ID NO: 4 bzw. in SEQ ID NO: 23 und aus Homo sapiens ist in SEQ ID NO: 5 bzw. in SEQ ID NO: 22 dargestellt. Erfindungsgemäß umfasst sind ferner funktionelle Äquivalente dieser Nukleinsäuresequenzen.
Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder deren funktionelle Äquivalente wie z. B. Allelvarianten erhältlich. Unter Allelvarianten sind Varianten von SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 zu verstehen, die 60% bis 100% Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 70% bis 100%, ganz besonders bevorzugt 90% bis 100% aufweisen. Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktionellen Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften des nach Transkription und Translation erhaltenen Proteins erhalten bleibt.
Ferner sind komplementäre Sequenzen zu den Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 sowie funktionelle Äquivalente oder funktionell äquivalente Teile derselben umfasst. In Bezug auf komplementäre Sequenzen meint "funktionell äquivalent" oder "funktionelles Äquivalent" allgemein solche Nukleinsäuresequenzen, die eine Homologie von mindestens 60%, bevorzugt mindestens 70% besonders bevorzugt mindesten 90% zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder einem Teil derselben aufweisen und eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden, bevorzugt mindestens 25 Nukleotiden, besonders bevorzugt mindestens 50 Nukleotiden, ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Nukleotiden haben, und die eine ihr zugedachte spezifische Funktion - beispielsweise die Verminderung der Expression eines L119 Proteins - zu erfüllen vermögen.
Homologe oder sequenzverwandte Nukleinsäuresequenzen zu den Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 können aus allen Säugerspezies einschließlich Mensch nach gängigen Verfahren zum Beispiel durch Homologiescreening durch Hybridisierung mit einer Probe der erfindungsgemäßen Nukleinsäureseguenzen oder Teilen davon isoliert werden.
Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe von SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23, beispielsweise ihre Homologen aus anderen Mammalia, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der kodierenden, nichtkodierenden oder komplementären DNA-Sequenz zu verstehen.
Solche funktionellen Äquivalente lassen sich ausgehend von den in SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 beschriebenen DNA- Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Vertebraten wie Mammalia isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide kodierend für die oben angegebenen Aminosäuresequenzen 1. bis 8. verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), S. 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42°C und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid zu verstehen. Beispielhaft seien als Hybridisierungsbedingungen genannt:

a) 45°C in 6 × SSC, oder
b) 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid,

Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA- Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Ggf. kann noch SDS zur Erhöhung der Stringenz hinzugegeben werden.
Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel F. M. et al., (1998) Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley & Sons); Hames B. D. und Higgins S. J. (1985) Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown T. A. (1991) Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Außerdem sind unter Homologe der Sequenzen SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen gemeinsam oder einzeln vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne dass aber die wesentliche Eigenschaft bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht bzw. erniedrigt werden oder auch komplett durch andere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -10000 vor dem Startkodon oder in anderen regulatorischen cis-flankierenden Elementen so verändert wurden, dass die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3'-Ende verändert wurden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäurekonstrukte, bevorzugt transgene Nukleinsäurekonstrukte, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten. In diesen Nukleinsäurekonstrukten kann beispielsweise eine transgen zu exprimierende L119 Nukleinsäuresequenz oder deren funktionelles Äquivalent mit weiteren genetischen Regulationselementen funktionell verknüpft sein. Zudem können die Nukleinsäurekonstrukte zusätzliche Funktionselemente enthalten. Bevorzugt können diese Nukleinsäurekonstrukte Vektoren oder Expressionsvektoren darstellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten. Diese sind infolge unter dem Begriff Nukleinsäurekonstrukt umfasst.
"Vektor" meint Nukleinsäuremoleküle die geeignet sind, eine andere Nukleinsäure, die mit dem Vektor verbunden wurde, zu transportieren. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, BACs, YACs, Mammalia-(Mini-)Chromosomen-Vektoren, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in einen wirtsspezifischen Vektor inseriert, der eine optimale Expression der Gene im ausgesuchten Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Pouwels P. H. (1985) Cloning Vectors, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford" entnommen werden. Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder in das Wirtsgenom integrieren und chromosomal repliziert werden. Für die chromosomale Integration in Mammalia wird vorteilhaft lineare DNA verwendet. Eine bevorzugte Form eines Vektors ist ein "Plasmid", wobei damit ein doppelsträngiges, zirkuläres DNA Molekül umfasst ist.
Unter "Nukleinsäurekonstrukt" oder "Nukleinsäuresequenz" versteht man erfindungsgemäß beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie halb- oder vollsynthetische Analoga davon. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulären Form, extrachromosomal oder integriert in das Genom vorliegen. Die L119 Nukleinsäuresequenzen können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen L119-Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
Bevorzugt sind Nukleinsäurekonstrukte, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder deren funktionelle Äquivalente oder funktionell äquivalente Teile derselben transgen beinhalten.
Außerdem sind artifizielle L119 Nukleinsäuresequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, wenigsten eine wesentliche Eigenschaft eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine in einer Zelle oder einem Organismus vermitteln oder - im Falle der Verwendung einer komplementären ("antisense") Sequenz - noch in der Lage sind, die ihr zugedachte Funktion - beispielsweise die Verminderung der Expression eines L119 Proteins - zu erfüllen.
Beispielsweise können synthetische Nukleotidsequenzen mit Kodons erzeugt werden, die von den zu transformierenden Organismen bevorzugt werden. Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft, die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen Kodonnutzung zu verändern. Diese bevorzugten Kodons können anhand der Kodonnutzung aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit in üblicher Weise bestimmt werden. Die für einen bestimmten Organismus spezifische Kodonnutzung läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln. Solche artifiziellen Nukleotid- Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter L119 Proteine oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende Nukleotid-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtsorganismus spezifischen Kodonnutzung erhalten wurden.
Alle vorstehend erwähnten Nukleotid-Sequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise in bekannter Weise nach der Phosphoamiditmethode erfolgen (Voet, Voet, Biochemistry, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897).
Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass eine Nukleotidsequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Für die Verbindung der Nukleinsäure-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
"Transgen" meint bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz (zum Beispiel von L119 Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23), einer Nukleinsäurekonstrukt enthaltend besagte Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz oder besagtem Nukleinsäurekonstrukt alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen sich entweder

a) die Nukleinsäuresequenz (zum Beispiele eine L119 Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder ein funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil derselben), oder
b) ein mit der Nukleinsäuresequenz (zum Beispiele eine L119 Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder ein funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil derselben) funktionell verknüpftes genetisches Regulationselement, zum Beispiel ein Promotor, oder
c) (a) und (b)

Bevorzugt sind die in den transgenen Nukleinsäurekonstrukten enthaltenen L119 Sequenzen funktionell mit mindestens einem genetischen Regulationselemente wie beispielsweise Transkriptions- und Translationssignalen verbunden. Diese Verknüpfung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer Erhöhung oder Erniedrigung der Genexpression eines L119 Gens führen. Mit den solchermaßen hergestellten rekombinanten transgenen Nukleinsäurekonstrukten werden anschließend Wirtsorganismen transformiert.
Der Begriff des "genetischen Regulationselementes" ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte haben. Genetische Regulationselemente gewährleisten zum Beispiel die Transkription und gegebenenfalls Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts ein Transkriptionsterminationssignal als zusätzliche genetische Regulationselemente, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente wie beispielsweise Polyadenylierungssignale oder Enhancer, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
"Funktionell verknüpft" ist breit zu verstehen und meint, dass die Nukleinsäuresequenz mit den genetischen Regulationselementen derartig verbunden wurde, dass die genetische Regulationssequenz die ihr jeweils zugedachte Funktion - optional nach Einbringung in eine Wirtszelle - wunschgemäß auf die Nukleinsäuresequenz ausüben kann. So kann sie beispielsweise die Expression der Nukleinsäuresequenz, d. h. Transkription und/oder Translation gewährleisten oder modulieren oder normalisieren.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors, einer transgen zu exprimierenden L119 Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Regulationselemente, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende L119 Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen.
Beispiele sind Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationselementen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene gesteigert wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt, es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die vorstehend erwähnten Gene insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationselement so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können auch allein vor die natürlichen Gene zur Steigerung der Aktivität gebracht werden.
Erfindungsgemäß geeignete genetische Regulationssignale sind beschrieben und dem Fachmann bekannt (s. Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)).
Eine genetische Kontrollsequenz oder eine Kombination verschiedener genetischer Kontrollsequenzen können die Expression in einem oder mehrerer eukaryotischen und/oder prokaryotischen Wirtsorganismen oder von diesen abgeleiteten Zellen ermöglichen. Geeignete Wirtsorganismen können Bakterien wie E. coli, Insektenzellen (bei z. B. Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems), Hefezellen oder Säugerzellen sein. Geeignete Wirtsorganismen sind dem Fachmann bekannt (Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)).
Alternativ kann eine Transkription und/oder Translation auch in vitro beispielsweise unter Verwendung eines T7 Promoters und einer T7 Polymerase realisiert werden.
Erfindungsgemäß umfasst sind ferner L119 Fusionsproteine oder chimäre Proteine, wobei unter diesen Begriffen solche Proteine zu verstehen sind, bei denen das L119 Polypeptid funktionell mit einem Nicht-L119 Polypeptid verbunden ist. "L119 Polypeptid" meint L119 Proteine gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder deren funktionelle Äquivalente nach der oben angegebenen Definition. "Nicht-L119" Polypeptid meint all solche Polypeptide, die von der Sequenz eines L119 Proteins wesentlich abweichen und den oben gegebenen Kriterien hinsichtlich Homologie und Funktion nicht genügen.
Die Expression eines L119 Proteins kann auch in Form eines Fusionsproteins erfolgen. Dabei wird dem zu exprimierenden Protein seitens des Nukleinsäurekonstruktes eine Anzahl von Aminosäuren N- oder C-terminal angefügt. Diese können beispielsweise die Funktion haben, die Expression des rekombinanten Proteins zu erhöhen, dessen Löslichkeit zu steigern, dessen Nachweisbarkeit zu ermöglichen oder dessen Aufreinigung zu erleichtern. Bei letzterer Eigenschaft haben die angefügten Aminosäuren beispielsweise die Funktion eines Liganden im Rahmen einer Affinitätsreinigung. Ferner können dem L119 Polypeptid Aminosäuresequenzen angefügt werden, die in bestimmten Wirtszellen (z. B. Säugerzellen) die Expression und/oder Sekretion ermöglichen oder verstärken. Fusionsproteine können ferner vorteilhaft als Antigene bei der Herstellung von anti-L119 Antikörpern verwendet werden.
Darüber können die erfindungsgemäßen L119 Proteine auch in Form therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Fragmente exprimiert werden. Zur Generierung des rekombinanten Proteins können Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen. Als solche "Tags" sind in der Literatur z. B. Hexa-Histidin-Anker bekannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (Studier F. W. et al. (1990) Methods Enzymol 185, 60-89 und Ausubel F. M. et al., (1998) Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley & Sons)).
In einer bevorzugten Ausführungsform können die angefügten Aminosäuren nach Erfüllung ihres Zweckes proteolytisch abgespalten werden. Dazu können an der Verbindungsstelle zwischen dem zu exprimierenden Protein und den zusätzlich angefügten Aminosäuren weitere Aminosäuresequenzen eingefügt werden, die als Erkennungssequenzen für sequenzspezifische Proteasen fungieren. Geeignete Proteasen sind beispielsweise Factor Xa, Thrombin oder Enterokinase. Geeignete Vektoren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte zur Expression von Fusionsproteinen umfassen beispielsweise Fusions-Expressionsvektoren wie pGEX (Pharmacia Biotech Inc. Smith D. B. und Johnson K. S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.), welche Glutathione-S-transferase (GST), Maltose-E-Bindeprotein bzw. Protein A an das transgen zu exprimierende Protein anfügen.
Aufgereinigte L119 Fusionsproteine können ihre Verwendung in Testsystemen zur Identifizierung von L119 modulierenden oder normalisierenden Verbindungen oder aber auch zur Herstellung von Antikörpern haben.
Induzierbare E. coli Expressionsvektoren umfassen beispielsweise pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). Die Techniken zur Expression sind dem Fachmann bekannt, ebenso wie Verfahren, um die Expression hinsichtlich Höhe und anderer Parameter zu optimieren, beispielsweise durch Wahl des geeigneten E. coli Stamms oder Anpassung der Kodons an die in E. coli gebräuchlichen (Gottesman S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128; Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118).
Zur Expression in Hefezellen stehen dem Fachmann verschiedene Expresionsvektoren zur Verfügung wie beispielsweise pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) und picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.).
Alternativ kann ein L119 Protein auch in Insektenzellen (z. B. Sf9 oder "High5"-Zellen) unter Verwendung von Baculovirus Expressionsvektoren exprimiert werden. Beispielhaft seien die pAc Reihe (Smith et al. (1983) Mol Cell Biol 3: 2156-2165) und die pVL Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31-39) genannt.
Bevorzugt werden die L119 Proteine in Säugerzellen exprimiert. Beispiele für zur Expression in Säugerzellen geeignete Vektoren umfassen pCDM8 (Seed B. (1987) Nature 329:840), pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J 6: 187-195) sowie Vektoren der pCDNA3-Serie (Invitrogen).
Weitere zur Expression in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen geeignete Vektoren sind beschrieben (s. Kapitel 16 und 17 bei Sambrook J., Fritsh E. F. und Maniatis T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Je nach Wirtsorganismus oder Ausgangsorganismus, der durch Einbringen der Nukleinsäurekonstrukte in einen genetisch veränderten oder transgenen Organismus überführt wird, eignen sich verschiedene Regulationselemente.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, l-PR- oder im l-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren wie amy und SPO2, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Mammaliapromotoren wie zum Beispiel vom Von Willebrand-Faktor Gen, Pre-Pro-Endothelin-1, Angiotensinconverting-enzyme, vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-2 (Flk-1), Tie-2/Tek, Vascular endothelial-cadherin, eNOS, intercellular adhesion molecule-2, ICAM-2 enthalten.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die obengenannten verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Die regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression (d. h. Transkription und/oder gegebenenfalls optional Translation) der Nukleinsäuresequenzen ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen L119 Proteine oder ihre funktionellen Äquivalente in einer zell- oder gewebespezifischen Weise exprimiert. Eine derartige spezifische Expression lässt sich durch die funktionelle Verknüpfung der L119 Nukleinsäuresequenzen oder ihrer funktionellen Äquivalente mit zell- oder gewebespezifischen transkriptionellen Regulationselementen (z. B. Promotoren oder Enhancern) erreichen. Zahlreiche derartige Sequenzen sind dem Fachmann bekannt, weitere können von Genen abgeleitet werden, deren zell- oder gewebespezifische Expression bekannt ist (WO 96/06111, v. a. S. 36-37). Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:

- Linse: g2-Crystallin (Breitman M. L. et al. (1987) Science 238: 1563-1565); aA-Crystallin (Landel C. P. et al. (1988) Genes Dev. 2: 1168-1178, Kaur S. et al. (1989) Development 105: 613-619
- Hirnanhangdrüse: Wachstumshormon (Behringer R. R. et al. (1988) Genes Dev. 2: 453-461
- Pankreas: Insulin (Ornitz D. M., Palmiter, R. D., Hammer, R. E., Brinster, R. L., Elastase (Swift G. H. und MacDonald R. J. (1985) Nature 131: 600-603; Palmiter R. D. et al. (1987) Cell 50: 435-443)
- T Zellen: lck Promoter (Chaffin K. E. et al. (1990) EMBO Journal 9: 3821-3829)
- B Zellen: Immunoglobulin (Borelli E. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7572-7576; Heyman R. A. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2698-2702
- Schwannsche Zellen: P0 Promoter (Messing A. et al. (1992) Neuron 8: 507-520), Myelin basic protein (Miskimins R. et al. (1992) Brain Res Dev Brain Res Vol 65: 217-221
- Spermatiden: Protamin (Breitman M. L. et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 474-479)
- Lunge: Surfacant Gen (Ornitz D. M. et al. (1985) Nature 131: 600-603)
- Adipozyten: P2 (Ross S. R. et al. (1993) Genes und Dev 7: 1318-24
- Muskel: Myosin light chain (Lee K. J. et al. (1992 Aug 5) J. BIol. Chem. 267: 15875-85), Alpha Actin (Muscat G. E. et al. (1992) Gene Expression 2, 111-126)
- Neuronen: Neurofilament (Reeben M. et al. (1993) BBRC 192: 465-70
- Leber: Tyrosine Aminotransferase, Albumin, Apolipoproteine.

Bevorzugte Ausführungsformen umfassen den Albumin-Promoter (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoid-spezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv Immunol 43: 235-275), Promoteren der T Zell-Rezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J 8: 729-733) und Immunglobuline (Benerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), neuronspezifische Promotoren (z. B. den Neurofilament Promoter; Byrne und Ruddle (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al. (1985) Science 230: 912-916) und brustdrüsenspezifischer Promoter (US 4,873,316, EP 0 264,166). Entwicklungsabhängig regulierte Promotoren sind ebenfalls umfasst, wie beispielsweise der murine hox Promoter (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374-379) und der α-Fetoprotein Promoter (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546). Ganz besonders bevorzugt sind Promotoren, die eine endotheliale Expression gewährleisten wie beispielsweise der Tie-2-Promotor (Fadel B. M. et al. (1998) Biochem. J 330: 335-343).
Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen insertiert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in dem Nukleinsäurekonstrukt oder im Vektor enthalten sein.
Das Nukleinsäurekonstrukt kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine gesteigerte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Unter "Enhancer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken.
Genetische Regulationselementen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von Genen.
Als weitere Regulationssequenzen seien beispielhaft die locus control regions, silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für eine gewebespezifische Expression verwendet werden.
Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt zu gelangen. Die Herstellung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes erfolgt beispielsweise bevorzugt durch direkte Fusion einer als Promotor fungierenden Nukleinsäuresequenz mit einer für ein L119 Protein kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. Bevorzugt kann die Nukleinsäurekonstrukt, bestehend aus einer Verknüpfung von Promotor und L119 Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein eukaryotisches Genom insertiert werden.
Unter einem Nukleinsäurekonstrukt sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen ein Regulationselement beispielsweise ein Promotor, ohne dass er zuvor mit der L119 Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpft wurde, zum Beispiel über eine gezielte homologe Rekombination oder eine zufällige Insertion in ein Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über eine mit ihm dann funktionell verknüpfte endogene L119 Nukleinsäuresequenz übernimmt und die transgene Expression derselben steuert. Durch Insertion des Promotors - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - vor eine für ein L119 Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz erhält man ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt, das die Expression des L119 Polypeptides steuert.
Analog kann auch eine L119 Nukleinsäuresequenz zum Beispiel durch eine homologe Rekombination hinter einen endogenen Promotor platziert werden, wodurch man ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt erhält, das die Expression der L119 Nukleinsäuresequenz steuert.
Als Regulationselemente sind in diesem Zusammenhang weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten L119 Gens gegen einen konstitutiven Promotor oder einen Promotor mit abgeänderten Spezifität ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Nukleinsäurekonstrukt aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. Methods. 1998; 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Zum Zwecke der homologen Rekombination können beispielsweise .OMEGA. oder O-Vektoren verwendet werden (Thomas und Capecchi (1987) Cell 51: 503-512; Mansour et al. (1988) Nature 336: 348-352; Joyner, et al. (1989) Nature 338: 153-156).
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte und die von ihnen abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren oder mit vorgenannten transformierte transgene Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:

a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen Antibiotika oder Biozide verleihen. Zum Beispiel das npt Gen, das eine Resistenz gegen die Aminoglycosid-Antiobiotika Neomycin (G 418), Kanamycin, und Paromycin überträgt (Deshayes A. et al., EMBO J 1985; 4(11): 2731-2737). Das hygro Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin verleiht (Marsh J. L. et al., Gene. 1984; 32(3): 481-485). Das sul Gen, das Resistenz gegen Sulfadiazin verleiht (Guerineau F. et al., Plant Mol Biol. 1990; 15(1): 127-136). Weitere geeignete Selektionsmarker-Gene sind solche, die eine Resistenz gegen Bleomycin etc. verleihen. Weitere geeignete Selektionsmarker sind solche, die eine Antimetaboliten-Resistenz verleihen, zum Beispiel das dhfr-Gen als Resistenz gegen Methotrexat (Reiss, Plant Physiol (Life Sci Adv) 1994, 13: 142-149). Geeignet sind ferner Gene wie trpB, das Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden, oder hisD, das Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden (Hartman S. C. und Mulligan R. C., Proc Natl Acad Sci USA. 1988; 85(21): 8047-8051). Geeignet ist auch das Gen der Mannose-Phosphat Isomerase, das Zellen die Verwertung von Mannose erlaubt (WO 94/20627) oder das ODC (Ornithin-Decarboxylase) Gen, das eine Resistenz gegen den ODC-Inhibitor DFMO (2-Difluoromethyl-DL-ornithin) verleiht (McConlogue, 1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.) oder die Deaminase aus Aspergillus terreus, die eine Resistenz gegen Blasticidin S vermittelt (Tamura K. etal., Biosci Biotechnol Biochem. 1995; 59(12): 2336-2338). Ebenfalls geeignet sind hprt und Thymidinkinase.
b) Marker ohne Selektionsdruck sind ferner diverse Zelloberflächenmarker geeignet wie beispielsweise Tac, CD8, CD3, Thy1 und der NGF Rezeptor.
c) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E., Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Gerdes H. H. und Kaether C., FEBS Lett. 1996; 389(1): 44-47; Chui W. L. et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel S. M. et al., Biotechniques. 23(5): 912-8, 1997), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Giacomin, Plant Sci 1996, 116: 59-72; Scikantha, J Bact 1996, 178: 121; Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414), die β-Galactosidase oder die β-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J 1987, 6, 3901-3907).
d) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Dem Fachmann ist bekannt, das auch die Funktionselemente nicht unbedingt auf einem Molekül mit den anderen Nukleinsäuresequenzen kombiniert werden müssen. Erfindungsgemäß umfasst sind ferner auch funktionelle Analoga d. h. solche Kombinationen, bei denen ein Funktionselement und die anderen Nukleinsäuren zusammen kommen durch

1. Kombination auf einem Polynukleotid (Mehrfachkonstrukte)
2. Kombination durch Kotransformation von mehreren Polynukleotiden in einer Zelle
3. Kombination durch Kreuzung verschiedener transgene Organismen, die jeweils mindestens eine der Nukleinsäuresequenzen enthalten.

Die Kotransformation bietet sich vor allen in Fällen an, wo keine physikalische Kopplung von zum Beispiel einem Markergen und den anderen Nukleinsäuresequenzen erwünscht ist. Dies kann vorteilhaft sein, da so nach der Selektion eines primären transgenen Organismus Markergen und die weiteren Nukleinsäuresequenzen in nachfolgenden Kreuzungen wieder segregieren können. Eine weitere Methode, um das Markergen wieder nachträglich zu entfernen ist die Verwendung von flankierenden DNA-Sequenzen und sequenzspezifischen Rekombinasen. Entsprechende Verfahren können beispielhaft wie auch unten beschrieben mit dem cre/lox oder FLP/FRT-System durchgeführt werden.
Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Antibiotikum oder einen Metabolismusinhibitor verleiht (s. o.). Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten.
Die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bzw. des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukts kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Genexpression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale wie Promotoren und Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert, oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird.
Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen oder homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Nukleinsäurekonstrukt eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder ein funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil derselben in "antisense" Orientierung zu einem seine Expression steuernden Promotor. "Antisense" meint Konstruktionen, in denen der komplementäre Gegenstrang zu einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder einem funktionellen Äquivalent oder einem funktionell äquivalenten Teil transkribiert wird. In Bezug auf komplementäre Sequenzen meint "funktionell äquivalent" oder "funktionelles Äquivalent" allgemein solche Nukleinsäuresequenzen, die eine Homologie von mindestens 60%, bevorzugt mindestens 70% besonders bevorzugt mindesten 90% zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder einem Teil derselben aufweisen und eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden, bevorzugt mindestens 25 Nukleotiden, besonders bevorzugt mindestens 50 Nukleotiden, ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Nukleotiden haben, und die eine ihr zugedachte spezifische Funktion - beispielsweise die Verminderung der Expression eines L119 Proteins - zu erfüllen vermögen. Dabei beträgt die Verminderung der Expression in einer mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt, das die Expression einer "antisense" Nukleinsäure ermöglicht, transformierten transgenen Zelle oder Organismus bevorzugt mindestens 20%, besonders bevorzugt mindestens 50%, ganz besonders bevorzugt mindestens 80%, am meisten bevorzugt mindestens 90% in Bezug auf die nicht-transformierte aber ansonsten gleiche Zelle oder Organismus. Die entsprechenden Verfahren zur Genregulation mittels antisense Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt (Weintraub H. et al. Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986) und werden weiter unten im Detail beschrieben.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen transformiert mit wenigstens einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder transgenen Nukleinsäurekonstrukte, sowie Zellen, Zellkulturen, Nachkommen, Organe, Gewebe oder Teile abgeleitet von solchen Organismen. Organismus umfasst sowohl mehrzellige (z. B. ganze Tiere) als auch einzellige Organismen, als auch von mehrzelligen Organismen abgeleitete Zellen.
Als Ausgangs- oder Wirtsorganismen zur Herstellung der transgenen Organismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate oder des transgenen Nukleinsäurekonstruktes ermöglichen. Wirtsorgansimus kann jede prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Mensch oder Tier wie beispielsweise Insektenzellen oder Säugerzellen (z. B. Chinese hamster ovary (CHO) or COS cells). Ganz besonders bevorzugt sind endotheliale Zellen wie HUVEC-, HUAEC-, HCAEC-, HAEC-, HMVEC, UtMVEC-, HPAEC-, ECV-304-, YPEN-1-Zellen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und Nukleinsäurekonstrukte können unter Verwendung konventioneller Transfektions- oder Transformationsverfahren in die obengenannten Wirtsorganismen zur Herstellung eines transgenen Organismus eingeführt werden. Transfektion oder Transformation meint jegliche Art von Verfahren, die zur Einbringung einer Nukleinsäuresequenz in einen Organismus verwendet werden kann. Für diesen Vorgang steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (siehe auch Keown et al. 1990 Methods in Enzymology 185: 527-537; Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). So kann die DNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln (biolistische Verfahren) eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Fusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Bevorzugte Verfahren sind Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-mediierte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Zum Zwecke der stabilen Transfektion wird in der Regel ein Gen kodierend für einen Selektionsmarker in die stabil zu transformierende Zelle eingeführt. Unter dem entsprechenden Selektionsdruck können die entsprechend stabil transfizierten Zellen selektioniert werden. Geeignete Selektionsmarker sind oben beschrieben. So erzeugte stabil oder transient transformierte transgene Organismen können beispielsweise zur rekombinanten Herstellung eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine verwendet werden.
Die transgenen Organismen können zur Herstellung nicht-menschlicher transgener Tiere verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der transgene Organismus eine befruchtete Oocyte oder eine embryonale Stammzelle in welche eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Nukleinsäurekonstrukte eingeführt wurde. Derartige Organismen können verwendet werden, um nicht-menschliche transgene Tiere zu erzeugen, in die eine exogene L119 Sequenz eingeführt oder bei denen eine endogenen L119 Sequenz - beispielsweise durch homologe Rekombination - verändert wurde. Solche Tiere können vorteilhaft zur Untersuchung der Funktion eines L119 Protein bzw. der Auswirkung der Modulation oder Normalisierung desselben verwendet werden.
Die transgenen Organismen können eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Nukleinsäurekonstrukte in funktioneller oder nicht-funktioneller Form beinhalten. Funktionelle Formen umfassen beispielsweise die transgene Überexpression eines L119 Proteins oder einer L119 antisense Nukleinsäure, während nicht-funktionelle Formen beispielsweise den "knock-out" eines L119 Gens mittels homologer Rekombination oder das Einführen von Nullmutationen umfassen.
Umfasst sind transgene oder knock-out- oder konditionelle oder regionenspezifische knock-out Tiere oder spezifische Mutationen in gentechnisch veränderten Tieren (Ausubel F. M. et al., (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; und Torres R. M. et al. (1997) Laboratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, Oxford). Über transgene Überexpression oder genetische Mutation (Nullmutation oder spezifische Deletionen, Insertionen oder Veränderungen) durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen kann man Tiermodelle erzeugen, die wertvolle weitere Informationen über die (Patho-)Physiologie der erfindungsgemäßen Sequenzen liefern. Eine bevorzugte Ausführung besteht in der Einbringung der in menschlichen Erbkrankheiten bzw. polygen vererbten Krankheiten gefundenen Mutationen des L119 Genes in die Keimbahn von transgenen Tieren. Solchermaßen hergestellte Tiermodelle können essentielle Testsysteme zur Evaluierung neuartiger Therapeutika darstellen, die die Funktion von L119 beeinflussen.
"Transgenes Tier" meint ein nicht-menschliches Tier, bevorzugt ein Säugetier, besonders bevorzugt einen Nager wie beispielsweise eine Ratte oder eine Maus. Ferner sind nicht-menschliche Primaten, Schafe, Hunde, Kühe, Ziegen, Hühner, Amphibien und dergleichen umfasst. Verfahren zur Herstellung transgener Tier sind dem Fachmann bekannt (US 4,736,866, US 4,870,009, US 4,873,191, Hogan B. Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986; Thomas K. R. und Capecchi M. R. (1987) Cell 51: 503, Li E. et al. (1992) Cell 69: 915, Bradley A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson E. J. ed. (IRL, Oxford, 1987) S. 113-152; Bradley A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2: 823-829; WO 90/11354; WO 91/01140; WO 92/0968; WO 93/04169).
Vorteilhafterweise können die genannten Ansätze mit Rekombinationssystemen wie dem cre/loxP Rekombinasesystem des Bacteriophagen P1 kombiniert werden, um eine Induzierbarkeit zu erreichen (Lakso et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 6232-6236). Alternativ kann auch das FLP Rekombinasesystem aus Saccharomyces cerevisiae verwendet werden (O'Gorman et al. (1991) Science 251: 1351-1355). Die entsprechenden Verfahren zu Erzeugung geeigneter transgener Tiere sind dem Fachmann bekannt. Klone der oben erwähnten nicht-menschlichen Tiere können unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden (Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385: 810-813, WO 97/07668, WO 97/07669).
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Nukleinsäuresequenzen oder Nukleinsäurekonstrukte mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Nukleinsäurekonstrukt in das Wirtsgenom ermöglichen.
Für den Zweck einer biochemischen Analyse kann beispielsweise die Klonierung in Vektoren zur transgenen Expression von L119 Proteinen in E. coli oder Reticulocyten-Lysat wünschenswert sein.
Zur Expression von L119 Proteinen in Säugerzellen wird die für ein L119 kodierende Nukleinsäuresequenz in einen entsprechenden Expressionsvektor, der für die Expression von Proteinen in Säugerzellen geeignet ist eingeführt. Entsprechende Vektoren sind dem Fachmann bekannt (s. o.) und in den verschiedensten Ausführungsformen kommerziell erhältlich.
Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen wie transgenen Tieren z. B. Mäusen, Ratten, Schafen, Rindern oder Schweinen zur Expression gebracht werden. Auch transgene Pflanzen sind im Prinzip denkbar. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte Knock-Out Tiere handeln.
Dabei können die transgenen Tiere eine funktionelle oder nicht funktionelle erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt enthalten.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung der oben beschriebenen transgenen Tiere sind transgene Tiere, in dessen Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen; oder in dessen Keimzellen und der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz durch gentechnische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurden.
Die Kombination aus dem Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren wie Plasmide, Viren oder Phagen wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen λ, Mu oder andere temperänte Phagen oder Transposons und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bilden ein Expressionssystem. Bevorzugt sind unter dem Begriff Expressionssysteme beispielsweise die Kombination aus Säugetierzellen wie Zellen endothelialen Ursprungs und Vektoren wie pcDNA3-Vektoren oder CMV-Vektoren, die für Säugetierzellen geeignet sind, zu verstehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zum Auffinden von Verbindungen mit spezifischer Bindeaffinität zu einem der erfindungsgemäßen Proteine oder erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Ferner umfasst die Erfindung Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die wenigstens eine wesentliche Eigenschaft oder die Expression eines der erfindungsgemäßen Proteine direkt oder indirekt modulieren oder normalisieren.
Ein Verfahren zum Auffinden von Verbindungen mit spezifischer Bindungsaffinität zu den erfindungsgemäßen Proteinen oder erfindungsgemäßen Proteinheteromer kann folgende Schritte umfassen:

a) Inkubation des oder der erfindungsgemäßen Proteine mit der zu testenden Verbindung, und
b) Detektion der Bindung der zu testenden Verbindung an das Protein.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein L119 Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder ein funktionelles Äquivalent derselben binden, umfasst, das einen oder mehrere der folgenden Schritte enthält:

a) Expression des Proteins in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen.
b) Inkubation des Proteins mit den zu testenden Substanzen.
c) Nachweis der Bindung einer Substanz an das Protein bzw. eines Effektes auf die Proteinfunktion.

Ein Verfahren zum Auffinden von Verbindungen mit spezifischer Bindungsaffinität zu einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß kann folgende Schritte umfassen:

a) Inkubation mindestens einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit der zu testenden Verbindung,
b) Detektion der Bindung der zu testenden an die Nukleinsäure.

Ein Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die mindestens eine wesentlichen Eigenschaft oder die Expression eines der erfindungsgemäßen Proteine modulieren oder normalisieren kann folgende Schritte umfassen:

a) Inkubation eines der erfindungsgemäßen Proteine oder Nukleinsäuresequenzen, einem der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte, einem der erfindungsgemäßen transgenen Organismen oder einem der erfindungsgemäßen transgenen Tiere mit der zu testenden Verbindung,
b) Bestimmung der Modulation oder Normalisierung einer wesentlichen Eigenschaft oder der Expression eines der erfindungsgemäßen Proteine.

"Spezifische Bindungsaffinität" meint in Bezug auf die obengenannten Verbindungen mit Bindungsaffinität zu einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Proteine eine Bindung unter in vitro oder in vivo Bedingungen, bevorzugt unter in vivo Bedingungen. In vivo Bedingungen umfasst das Vorliegen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, bevorzugt in eukaryotischen Zellen, besonders bevorzugt in der dem natürlichen Zustand entsprechenden Form hinsichtlich beispielsweise Lokalisation, Form, Faltung, Modifikation und Menge. Dabei ist die Bindung der Verbindung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz bzw. Protein stärker als die zu mindestens einer anderen Nicht-L119 Nukleinsäuresequenz bzw. Nicht-L119 Protein. Bevorzugt ist die Bindung um mindestens 100% stärker, besonders bevorzugt um mindestens 500% stärker, ganz besonders bevorzugt um mindestens 1000% stärker, am meisten bevorzugt um mindestens 10 000% stärker.
"Verbindung" im Rahmen eines der oben genannten Verfahren ist breit zu verstehen und meint allgemein alle stofflichen Mittel, die den gewünschten Effekt direkt oder indirekt bewirken. Umfasst sind beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, natürliche oder künstliche Binde- oder Interaktionspartner eines L119 Proteins oder einer L119 Nukleinsäuresequenz, natürliche oder künstliche Transkriptionsfaktoren, anti-L119 Antikörper, L119-Agonisten oder -Antagonisten, Peptidomimetikum eines L119 Agonisten oder Antagonisten oder niedermolekulare Verbindungen.
Bevorzugte niedermolekulare Verbindungen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie

a) ein Molekulargewicht kleiner 2000 g/Mol, bevorzugt kleiner 1000 g/Mol, besonders bevorzugt kleiner 750 g/Mol, am meisten bevorzugt kleiner 500 g/Mol haben, und
b) an eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine mit einer Bindungskonstante von kleiner 10 µM, bevorzugt kleiner 1 µM, besonders bevorzugt kleiner 100 nM, am meisten bevorzugt kleiner 10 nM binden.

Die Detektion der Bindung oder Modulation oder Normalisierung erfolgt allgemein durch Messen der Interaktion mit einem der erfindungsgemäßen L119 Proteine oder Nukleinsäuren, durch Messen der Steigerung oder Verminderung wenigstens einer wesentlichen Eigenschaften oder der Expression eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine oder der L119 Aktivität oder durch Messen einer physiologischen Wirkung von L119.
Zu diesem Zweck können direkte oder indirekte Detektionsverfahren verwendet werden, wie sie dem Fachmann zur Auffindung von Interaktionspartnern und/oder Signaltransduktionswegen geläufig sind. Diese Verfahren umfassen beispielsweise

a) eine Reihe von Verfahren, die unter dem Begriff "Yeast- N-Hybrid" System zusammen gefasst werden,
b) Antikörperselektionstechniken
c) Phagen-Display-Systeme
d) Immunpräzipitationen
e) Immuno-Assays wie ELISA oder Western-Blot
f) Reporter-Testsystemen
g) Durchmustern von Bibliotheken niedermolekularer Verbindungen,
h) "molecular modelling" unter Verwendung von Strukturinformationen eines L119 Proteins oder Nukleinsäure.

Die erfindungsgemäßen Proteine, Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder transgener Organismen können zum Auffinden von Verbindungen - beispielsweise Proteine - verwendet werden, die zum erfindungsgemäßen Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zu einem erfindungsgemäßen Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen.
Vorteilhafterweise werden hierzu "Yeast-N-Hybrid" Systeme, wie beispielsweise das "Yeast-2-Hybrid" System oder andere biochemische Verfahren allein oder in Kombination verwendet. Es lassen sich so Interaktionsdomänen des erfindungsgemäßen Proteins und damit pharmakotherapeutische Interventionspunkte bestimmen. Daher ist ein Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines "Yeast-N-Hybrid Systems" oder biochemischer Verfahren zur Identifizierung der Interaktionsdomänen von L119 und die Verwendung zur pharmakotherapeutischen Intervention.
Auch über Strukturanalysen des erfindungsgemäßen Proteins lassen sich gezielt Substanzen finden, die eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen. Derartige Substanzen können auch als pro-L119 oder anti-L119 Verbindungen gemäß nachfolgender Definition zum Einsatz kommen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen Verfahren ("Screening Assays") zur Auffindung von Verbindungen, die an L119 Proteine oder Nukleinsäuren binden oder eine Modulation oder Normalisierung mindestens einer wesentlichen Eigenschaften oder der Expression eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine oder der L119 Aktivität bewirken.
Die auf die gewünschte Eigenschaft zu testenden Verbindungen können beispielsweise mit einer der zahlreichen Verfahren zu Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken erzeugt werden. Diese Bibliotheken können biologische und/oder synthetische Bibliotheken umfassen. Die Herstellungsverfahren dieser Bibliotheken sind dem Fachmann bekannt (Lam K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145; DeWitt et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994) J Med Chem 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew Chem Int Ed Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew Chem Int Ed Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J Med Chem 37: 1233). Die Bibliotheken können in Lösung (Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421) oder gekoppelt an feste Phasen wie Kügelchen (Lam (1991) Nature 354: 82-84), Chips (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), Bakterien (Ladner U.S. Pat. No. 5,223,409), Plasmide (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869) oder auf Phagen (beispielsweise im Rahmen eines "Phagen-Display" Systems; Scott und Smith (1990) Science 249: 386-390; Devlin (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310) vorliegen.
Das Verfahren ("Screening Assay") kann ferner unter Einsatz von Zellen realisiert werden und beispielsweise die Inkubation einer Zelle, die ein L119 Protein exprimiert, mit einer zu testenden Verbindung und die anschließende Bestimmung der Modulation oder Normalisierung mindestens einer wesentlichen Eigenschaft des L119 Proteins beinhalten.
Die Bestimmung der Fähigkeit, wenigstens eine wesentliche Eigenschaft eines L119 Proteins zu modulieren oder zu normalisieren, umfasst beispielsweise die Fähigkeit eines L119 Proteins, mit einem seiner Bindungspartner, bestimmt beispielsweise mittels dem (s. Beispiel 9) zu interagieren. Die Fähigkeit einer Verbindung eine solche Interaktion zu verstärken oder zu vermindern, kann beispielsweise durch eine Immunpräzipitation ggf. in Kombination mit einer Markierung (beispielsweise einer radioaktiven Markierung) mindestens eines der beiden Interaktionspartners nachgewiesen werden. Dabei können dem Fachmann geläufige Methoden wie Gelelektrophorese und Immunoblot zum Einsatz kommen.
Ferner kann die Bindung bzw. Modulation bzw. Normalisierung auch durch andere Verfahren wie beispielsweise unter Verwendung eines Mikrophysiometers bestimmt werden (McConnell H. M. et al. (1992) Science 257: 1906-1912). Darüber hinaus sind zellfreie Methoden verwendbar (z. B. "real-time Biomolecular Interaction Analysis (BIA)"; Sjolander S. und Urbaniczky C. (1991) Anal Chem 63: 2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr Opin Struct Biol 5: 699-705). Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Die zur Bestimmung erforderlichen Geräte sind kommerziell erhältlich (z. B. BIAcore).
Bindungspartner können ferner auch aus biologischen Proben unter Verwendung von Techniken wie SELDI (surface enhanced laser desorption ionization; CIPHERGEN Inc., Fremont, CA, USA) gewonnen werden.
Zellfreie Testsysteme können lösliche als auch membrangebundene L119 Proteine beinhalten. Im Falle von membrangebundenen Proteinen kann es wünschenswert sein, ein solubilisierendes Agens zuzufügen, um das Protein in Lösung zu halten. Solubilisierende Agentien umfassen beispielsweise nicht-ionische Detergentien wie N-Octylglucosid, N-Dodecylglucosid, N-Dodecylmaltosid, Octanoyl- N-methylglucamid, Decanoyl-N-methylglucamid, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, Isotridecypoly(ethylenglycolether), 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamminio]-1-propansulfonate(CHAPS), 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamminio]-2-hydroxy-1-propansulfonate (CHAPSO) oder N-dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1- propansulfonat.
In einem der oben genannten Verfahren kann es vorteilhaft sein, eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine oder einen seiner Interaktionspartner zu immobilisieren, um beispielsweise die Abtrennung von gebundener oder von nicht gebundener Form zu ermöglichen. Immobilisation kann auf vielfältige dem Fachmann bekannte Art und Weise erfolgen. Sie kann beispielsweise an Gefäßwänden von z. B. Mikrotiterplatten oder Mikroreaktionsgefäßen erfolgen. Sie kann aber auch an einer Matrix erfolgen, beispielsweise unter Verwendung eines GST/L119-Fusionsproteins oder eines Biotin-markierten L119-Proteins.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein L119 Protein als "bait protein" in einem Two-Hybrid Assay oder Three-Hybrid Assay verwendet werden (US 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268: 12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696; WO 94/10300) um Interaktionspartner zum L119 Protein zu identifizieren. Allgemein sind diese Systeme im Rahmen dieser Erfindung als "N-Hybrid-Systeme" definiert. Funktionsweise und Durchführung dieser Systeme sind im Detail beschrieben und dem Fachmann bekannt. N-Hybrid-Systeme werden bevorzugt in Hefe ausgeführt, können aber auch in anderen eukaryotischen Zellen wie beispielsweise in Säugerzellen realisiert werden. Entsprechende Systeme sind kommerziell erhältlich oder leicht aus kommerziell erhältlichen System abzuleiten.
Zur Identifizierung von Bindepartnern oder Verbindungen die mindestens eine wesentliche Eigenschaft oder die Expression eines L119 Proteins modulieren oder normalisieren (beispielsweise anti-L119 bzw. pro-L119 Verbindungen) können vor allem Verfahren wie das "Yeast-3-Hybrid" System verwendet werden (Griffith E. C. et al. (2000) Methods Enzymol 328: 89-103. Licitra E. J. und Liu J. O. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(23): 12817-21; Topcu Z. und Borden K. L. (2000) Pharm Res 17(9): 1049-55; Kraemer B. et al. (2000) Methods Enzymol 328: 297-321; Zhang J. (2000) Methods Enzymol 328: 103-10). Mit den hier beschriebenen Systemen können Verbindungen (niedermolekulare Verbindungen, Proteine, Nukleinsäuren) identifiziert werden, die mit einem bestimmten Protein, bevorzugt einem L119 Protein, wechselwirken, oder die Wechselwirkung dieses Proteins mit anderen Interaktionspartnern verstärken oder vermindern.
Ein Gegenstand der Erfindung betrifft Antikörper, die eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine erkennen. Derartige Antikörper stellen zum einen selber Verbindungen dar, die eine spezifische Bindungsaffinität zu einem der erfindungsgemäßen Proteine aufweisen und/oder mindestens eine wesentliche Eigenschaft eines L119 Proteins modulieren oder normalisieren können. Solche Antikörper können mit einem der oben erwähnten Verfahren identifiziert werden. Zum anderen können solche Antikörper in einem der obengenannten Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die spezifisch an eines der erfindungsgemäßen Proteine binden oder mindestens eine Eigenschaft oder die Expression derselben modulieren oder normalisieren, zum Einsatz kommen. So kann über Antikörper die Proteinaktivität oder Menge der Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 bestimmt werden. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Quantifizierung der Proteinaktivität oder Menge eines Proteins mit den Sequenzen SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24.
Ausgehend von den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 können synthetische Peptide oder rekombinante Proteine generiert werden, die als Antigene für die Produktion von Antikörpern eingesetzt werden. Es ist auch möglich, das isolierte Protein selber oder Bruchstücke davon zur Generierung von Antikörpern einzusetzen.
Mit Antikörpern sind sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper gemeint. Unter erfindungsgemäßen Antikörpern oder deren Fragmente sind prinzipiell alle Immunoglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihre Subklassen wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG₁, IgG₂, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ oder IgG_M. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG₁/κ oder IgG_2b/κ. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen komplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc-Teils der Antikörper mit Enzymen wie Papain oder Pepsin, durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden. Auch genmanipulierte nicht- verkürzte Fragmente können vorteilhaft verwendet werden.
Monoklonale Antikörper sind in der dem Fachmann geläufigen Art beispielsweise über die Hybridoma-Technik zugänglich (Kohler und Milstein (1975) Nature 256: 495-497; Brown et al. (1981) J Immunol 127: 539-46; Brown et al. (1980) J Biol Chem 255: 4980-83; Yeh et al. (1976) Proc Natl Acad Sci USA 76: 2927-31; Yeh et al. (1982) Int J Cancer 29: 269-75). Erfindungsgemäß geeignete Varianten sind die humane B-Zell-Hybridomatechnik (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4: 72), die EBV-Hybridomatechnik (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96) oder Trioma-Techniken. Auch die Verfahren zur Herstellung entsprechender Hybridomas sind dem Fachmann bekannt (Kenneth R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); Lerner E. A. (1981) Yale J Biol Med 54: 387-402; Gefter M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3: 231-36; Galfre G. et al. (1977) Nature 266: 55052). Zahlreiche geeignete Myelomazelllinien sind dem Fachmann bekannt (z. B. P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 oder Sp2/O-Ag14 Myeloma-Linien) und beispielsweise über ATCC (American Type Culture Collection) zugänglich. Die Selektion positiver Hybridoma-Zelllinien kann in der dem Fachmann geläufigen Weise zum Beispiel unter Verwendung einer ELISA-Technik unter Einsatz des zur Immunisierung eingesetzten Protein (beispielsweise einem L119 Protein) realisiert werden.
Alternativ können monoklonale anti-L119 Antikörper auch mittels Durchmusterung einer kombinatorischen Immunoglobulin-Bibliothek (z. B. einer "phage display"-Bibliothek von Antikörpern) unter Verwendung des jeweiligen L119 Protein identifiziert werden. Kits zur Herstellung und Durchmusterung von "phage display"- Bibliotheken sind kommerziell erhältlich (Pharmacia Recombinant Phage Antibody System; Stratagene SurfZAP™ Phage Display Kit). Weitere in diesem Rahmen bevorzugte Verfahren sind dem Fachmann bekannt (US 5,223,409; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 7978-7982; und McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552-554).
Weiterhin können rekombinante anti-L119 Antikörper, beispielsweise chimäre oder humanisierte monoklonale Antikörper, die sowohl menschliche als auch nicht-menschliche Anteile umfassen, im Rahmen dieser Erfindung unter Verwendung von Standardverfahren erhalten werden (WO 87/02671; EP 0 184 187; EP 0 171 496; EP 0 173 494; WO 86/01533; US 4,816,567; EP 0 125 023; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Canc Res 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; Shaw et al. (1988) J Natl Cancer Inst 80: 1553-1559; Morrison S. L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; US 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; Beidler et al. (1988) J Immunol 141: 053-4060).
Die Antikörpergene für die gentechnischen Manipulationen lassen sich in einer dem Fachmann bekannten Weise beispielsweise aus den Hybridomzellen isolieren (Harlow E. und Lane D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York; Ausubel et al., 1998). Dazu werden Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zelllyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren insertiert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.
Ein anti-L119 Antikörper kann beispielsweise dazu verwendet werden, ein natürliches oder rekombinantes L119 Protein mittels Standardverfahren wie beispielsweise der Affinitätschromatographie oder Immunpräzipitation aus biologischem Material wie beispielsweise Zellen zu isolieren. Darüberhinaus kann ein derartiger Antikörper zum Nachweis eines L119 Proteins (z. B. in einem Zelllysat- oder überstand) dienen. Anti-L119 Antikörper können in diagnostischen Verfahren verwendet werden, um beispielsweise den Gewebespiegel eines L119 Proteins zu bestimmen. Damit kann beispielsweise die Notwendigkeit und/oder die Effizienz einer L119 modulierenden oder normalisierenden Therapie bestimmt werden. Zum Zwecke der Detektion wird ein anti-L119 Antikörper bevorzugt mit einer detektierbaren Verbindung markiert.
Die Herstellung dieser Antikörper, protein- oder DNA-bindenden Faktoren ist dem Fachmann geläufig (Famulok M. und Jenne A.; Curr Opin Chem Biol 1998; 2(3): 320-7; Current Protocols in Protein Science. Volume 1. Coligon, J. E., Dunn, B. M., Plough, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. eds. John Wiley & Sons, Inc. (1995) Chapter 9: Purification of DNA-Binding Proteins; Chapter 19: Identification of Protein Interactions, Antibody Production: Essential Techniques. Delves P (1997) John Wiley & Sons, Inc. New York; Antibody Technology: A Comprehensive Overview; Liddell J. E. und Weeks I. (1995) Bios Scientific Publishers, Ltd., United Kingdom; Owen M. et al., Biotechnology (N.Y.). 1992; 10(7): 790-794; Franken E. et al., Curr Opin Biotechnol. 1997; 8(4): 411-416; Whitelam Trend Plant Sci 1996, 1, 286-272).
Die Antikörper oder Fragmente können allein oder in Mischungen verwendet werden.
Spezifische Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Proteine können sich sowohl als diagnostische Reagenzien als auch als Therapeutika bei Krankheitsbildern, die u. a. durch Veränderungen von Endothelzellen charakterisiert sind, eignen.
Weitere Ausgestaltungsformen der Erfindung sind Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die die Interaktion von Liganden mit dem erfindungsgemäßen Proteinheteromer oder dem erfindungsgemäßen Proteinen mit Aminosäuresequenzen, wie sie in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 dargestellt werden, vermindern oder steigern oder ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Interaktion von Proteinen mit Aminosäuresequenzen wie SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 mit den in Tabelle 1 beschriebenen Proteinen oder anderen Signaltransduktionsmolekülen vermindern oder steigern. Die Interaktion von Proteinen mit den erfindungsgemäßen Aminosäuren läßt sich mit Hilfe des Two-hybrid Systems detektieren. Derartige Substanzen können ebenfalls als pro-L119 oder anti-L119 Verbindungen gemäß nachfolgender Definition zum Einsatz kommen.
Weiterhin lassen sich die Verfahren durch Expression der Proteine in eukaryotischen Zellen und Verknüpfung mit einem Reporter-Assay für die Aktivierung des L119-Proteins durchführen.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Proteinen mit Aminosäuresequenzen wie SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 unter Benutzung von spezifischen Agonisten oder Antagonisten. Dabei wird die L119-Ligandenbindung zur Detektion ausgenutzt.
"Modulation" oder "modulieren" meint die Steigerung oder Verminderung mindestens einer wesentliche Eigenschaft oder der Expression eines L119 Proteins.
"Normalisieren" meint, dass mindestens eine wesentliche Eigenschaft oder die Expression eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine in dem gentherapeutisch behandelten Organismus einem Normalwert, erhalten aus einem gesunden Individuums oder aus einem Mittelwert mehrerer gesunder Individuen, zu mindestens 20%, bevorzugt zu mindestens 50%, besonders bevorzugt zu mindestens 90% entspricht oder diesen um nicht mehr als 500%, bevorzugt um nicht mehr als 200%, besonders bevorzugt um nicht mehr als 100%, ganz besonders bevorzugt um nicht mehr als 50% übersteigt.
Dabei meint "pro-L119 Verbindung" allgemein solche Verbindungen die eine Steigerung mindestens einer wesentliche Eigenschaft oder der Expression eines L119 Proteins, bevorzugt eines L119 Proteins gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder eines funktionellen Äquivalents derselben, in einer Zelle oder einem Organismus bewirken.
"anti-L119 Verbindung" meint allgemein solche Verbindungen die eine Verminderung mindestens einer wesentliche Eigenschaft oder der Expression eines L119 Proteins, bevorzugt eines L119 Proteins gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder eines funktionellen Äquivalents derselben, in einer Zelle oder einem Organismus bewirken.
"Verbindung" ist in Bezug auf die pro-L119 oder anti-L119 Verbindung breit zu verstehen und meint allgemein alle stofflichen Mittel, die den gewünschten Effekt direkt oder indirekt bewirken. Beispielhaft aber nicht einschränkend können pro-L119 oder anti-L119 Verbindungen Nukleinsäuren oder Proteine, natürliche oder künstliche Binde- oder Interaktionspartner eines L119 Proteins, Antikörper, L119-Agonisten oder -Antagonisten, Peptidomimetikum eines L119 Agonisten oder Antagonisten, antisense Nukleinsäuresequenzen, Apatamere, natürliche oder künstliche Transkriptionsfaktoren, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren oder niedermolekulare Verbindungen sein.
pro-L119 oder anti-L119 können identisch sein mit Verbindungen, erhältlich nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren, die an eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Proteine binden oder mindestens eine Eigenschaft oder die Expression eines L119-Proteins modulieren oder normalisieren. Wechselseitig umfassen sich die gegebenen Definitionen und Begriffserläuterungen.
Bevorzugte niedermolekulare "pro-L119" oder "anti-L119" Verbindungen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie

"Steigerung" ist im Zusammenhang mit der Modulation oder Normalisierung mindestens einer wesentlichen Eigenschaft oder der Expression eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine weit auszulegen und umfasst die Steigerung mindestens einer Funktion eines L119 Proteins unter Verwendung einer pro-L119 Verbindung in einem Organismus oder einem davon abgeleiteten Teil, Zellen oder Gewebe. Erfindungsgemäß sind verschiedene Strategien zur Steigerung einer Funktion des L119 Proteins umfasst. Der Fachmann erkennt, dass eine Reihe verschiedener Methoden zur Verfügung stehen, um eine Funktion des L119 Proteins in gewünschter Weise zu beeinflussen. Die infolge beschriebenen Verfahren sind insofern beispielhaft und nicht einschränkend zu verstehen.
Die erfindungsgemäß bevorzugte Strategie umfasst die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz als pro-L119 Verbindung, die transgen transkribiert und gegebenenfalls zu einem Polypeptid translatiert werden kann, das mindestens eine Funktion des L119 Proteins steigert. Besonders bevorzugt sind für derartige Nukleinsäuresequenzen die oben beschriebenen L119 Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder deren funktionelle Äquivalente.
Ferner kann man auch eine Funktion eines L119 Proteins zum Beispiel durch Mutagenese von endogenen Genen, bevorzugt von L119 Genen oder den ihre Expression regulierenden Faktoren, steigern. Ferner ist eine gesteigerte Transkription und Translation der endogenen L119 Gene zum Beispiel durch Verwendung künstlicher Transkriptionsfaktoren beispielsweise vom Typ der Zinkfingerproteine zu erreichen. Diese Faktoren lagern sich in den regulatorischen Bereichen der endogenen Gene an und bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder Repression des endogenen Gens. Die Verwendung eines solchen Verfahrens ermöglicht die Repression oder Überexpression eines bestimmten endogenen Gens, ohne das dessen Sequenz gentechnisch manipuliert werden muss. Entsprechende Verfahren zur Herstellung entsprechender Faktoren sind beschrieben und dem Fachmann bekannt (Beerli R. R. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 (4): 1495-1500; Beerli R. R., et al., J Biol Chem 2000; 275(42): 32617-32627; Segal D. J. und Barbas C. F., 3rd., Curr Opin Chem Biol 2000; 4(1): 34-39; Kang J. S. und Kim J. S., J Biol Chem 2000; 275(12): 8742-8748; Beerli R. R. et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95(25): 14628-14633; Kim J. S. et al., Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94(8): 3616-3620; Klug A., J Mol Biol 1999; 293(2): 215-218; Tsai S. Y. et al., Adv Drug Deliv Rev 1998; 30(1-3): 23-31; Mapp A. K. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(8): 3930-3935; Sharrocks A. D. et al., Int J Biochem Cell Biol 1997; 29(12): 1371-1387; Zhang L. et al., J Biol Chem 2000; 275(43): 33850-33860). Die Selektion der Faktoren kann unter Verwendung der Promotorregion des Gens eines L119 Proteins erfolgen. Die entsprechenden Abschnitte sind für den Fachmann mittels Datenbankabfrage aus der Genbank oder anhand der im Rahmen dieser Erfindung bereitgestellten L119 Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 bzw. ausgehend von einer L119 cDNA, deren Gen nicht in der Genbank vorhanden ist, durch Durchmusterung einer genomischen Bibliothek nach korrespondierenden genomischen Klonen erhältlich. Die dazu erforderlichen Verfahren sind dem Fachmann geläufig. Faktoren können beispielsweise durch Verwendung eines Reportersystems gewonnen werden, bei dem die Promotorregion eines L119 Gens mit einem Marker beispielsweise Luciferase oder GFP (green fluorescence protein) verknüpft wird und dessen Expression anstelle der eines L119 Proteins steuert. Mit derartigen erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten können nach Einbringung in ein geeignetes Expressionssystem Verbindungen hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Expressionsaktivität des L119 Promotors bewertet werden.
Verbindungen, die eines der oben beschriebenen Verfahren zur Steigerung einer L119 wesentliche Eigenschaft bewirken, sind als pro-L119 Verbindungen zu verstehen. Dabei wird die Menge eines L119 Proteins oder mindestens eine seiner wesentliche Eigenschaften in einer Zelle oder einem Organismus um mindestens 50%, bevorzugt mindestens 100%, besonders bevorzugt mindestens 500%, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000% gesteigert.
"Verminderung" oder "vermindern" ist im Zusammenhang mit der Modulation oder Normalisierung mindestens einer wesentlichen Eigenschaft oder der Expression eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine weit auszulegen und umfasst die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung mindestens einer wesentliche Eigenschaft oder der Expression eines L119 Proteins unter Verwendung einer anti-L119 Verbindung in einem Organismus oder einem davon abgeleiteten Teil, Zellen oder Gewebe. Bevorzugt ist der Organismus eine Säuger. Eine Verminderung im Sinne der Erfindung umfasst auch eine mengenmäßige Verringerung eines L119 Proteins bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen des L119 Proteins (d. h. fehlende Nachweisbarkeit einer L119 wesentliche Eigenschaft oder fehlende immunologische Nachweisbarkeit eines L119 Proteins). Dabei wird die Expression eines bestimmten L119 Proteins oder mindestens eine seine wesentlichen Eigenschaften in einer Zelle oder einem Organismus bevorzugt um mehr als 50%, besonders bevorzugt um mehr als 80%, ganz besonders bevorzugt um mehr als 90% vermindert.
Erfindungsgemäß sind verschiedene Strategien zur Verminderung der L119 wesentliche Eigenschaft umfasst. Der Fachmann erkennt, dass eine Reihe verschiedener Methoden zur Verfügung stehen, um die L119 wesentliche Eigenschaft in gewünschter Weise zu beeinflussen.
Die erfindungsgemäß bevorzugte Strategie umfasst die Verwendung einer L119 Nukleinsäuresequenz als anti-L119 Verbindung, welche zu einer antisense-Nukleinsäuresequenz transkribierbar ist, die zur Verminderung der Expression eines L119 Proteins befähigt ist, z. B. indem sie die Expression des entsprechenden endogenen L119 Proteins vermindert. Die anti-L119 Nukleinsäuresequenzen können gemäß einer bevorzugten Ausführungsform die in antisense- Orientierung insertierte Nukleinsäuresequenz kodierend für ein L119 Protein, funktionelle Äquivalente oder funktionell äquivalente Fragmente derselben enthalten.
Eine "antisense" Nukleinsäure meint zunächst eine Nukleinsäuresequenz die ganz oder teilweise zu zumindest einem Teil des "sense"-Stranges einer L119 Nukleinsäuresequenz (d. h. des für ein entsprechendes L119 Protein kodierenden Stranges) komplementär ist. Bevorzugte L119 Nukleinsäuresequenzen sind dabei solche, die für Proteine beschrieben durch SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder ihre funktionellen Äquivalente oder funktionell äquivalente Teile der vorgenannten kodieren. Besonders bevorzugt sind L119 Nukleinsäuren beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder ihre funktionellen Äquivalente oder funktionell äquivalente Teile der vorgenannten. Die angegebenen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 5 oder 23 beschreiben L119 cDNA Sequenzen. Die Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 4 oder 22 beschreiben L119 Gene, die noch Introns enthalten. Dem Fachmann ist bekannt, dass er alternative cDNA oder korrespondierendes Gen als Ausgangsmatrize für entsprechende antisense-Konstrukte verwenden kann.
Bevorzugt ist die "antisense" Nukleinsäure komplementär zu dem kodierenden Bereich einer L119 Nukleinsäuresequenz oder einem Teil desselben. Die "antisense" Nukleinsäure kann aber auch zu der nichtkodierenden Region oder einem Teil derselben komplementär sein. Ausgehend von der Sequenzinformation zu einer L119 Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder einem funktionellen Äquivalent derselben, kann eine antisense Nukleinsäure unter Berücksichtigung der Basenpaarregeln von Watson und Crick in der dem Fachmann geläufigen Weise entworfen werden. Eine antisense Nukleinsäure kann komplementär zu der gesamten oder einem Teil einer L119 Nukleinsäuresequenz sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die antisense Nukleinsäure ein Oligonukleotid mit einer Länge von zum Beispiel 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden.
Eine antisense Nukleinsäure kann auf chemische und/oder enzymatische Weise mittels dem Fachmann geläufigen Verfahren hergestellt werden. Dabei können natürliche oder nicht-natürliche Nukleotidbausteine zum Einsatz kommen. Nicht-natürliche Nukleotidbausteine umfassen modifizierte Nukleotide, deren Einbau die biologische Stabilität der antisense Nukleinsäure oder die physikalische Stabilität der gebildeten Duplex zwischen antisense und sense Nukleinsäure steigert. Beispielhaft seien Phosphorothioatderivative und Acridin-substituierte Nukleotide genannt. Beispielhaft seien genannt: 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Chlorouracil, 5-Iodouracil, Hypoxanthin, Xantin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-(Carboxymethylaminomethyl)-2-thiouridin, 5-(Carboxymethylaminomethyl)-uracil, Dihydrouracil, β-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-iso- pentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5- essigsäure, 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil und 2,6-Diaminopurin.
Alternativ kann eine antisense Nukleinsäure auch auf biologische Art unter Verwendung eines Expressionsvektor erzeugt werden, in den die entsprechende Nukleinsäure in antisense Orientierung hinter einen geeigneten Promotor insertiert wurde. Um entsprechende intrazelluläre Konzentrationen zu erreichen kann die zu exprimierende antisense Nukleinsäure unter Kontrolle starker Promotoren wie beispielsweise dem pol II oder pol III Promoter gestellt werden. Bevorzugt wird dieses Verfahren in Kombination mit den für einen gentherapeutischen Ansatz geeigneten Verfahren eingesetzt.
Die antisense Nukleinsäure umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform α-anomere Nukleinsäuremoleküle. α-Anomere Nukleinsäuremoleküle bilden besondere doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in denen im Unterschied zu den normalen β-Einheiten die Stränge parallel zu einander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641).
Die antisense Nukleinsäure umfasst ferner 2'-o-Methylribonukleotide (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) oder chimäre RNA-DNA Analoga (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215: 327-330).
Ebenso umfasst ist die Verwendung der oben beschriebenen Sequenzen in sense-Orientierung, was wie dem Fachmann geläufig ist, zu einer Kosuppression führen kann, als auch die Verwendung der Sequenzen im Rahmen von Verfahren wie der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("double-stranded RNA interference"). Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt und im Detail beschrieben (z. B. Matzke M. A. et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Auf die in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird ausdrücklich Bezug genommen.
Vorteilhaft kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym- Verfahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Sequenzen, die gekoppelt an die antisense Sequenzen, die Zielsequenzen katalytisch spalten (Tanner N. K., FEMS Microbiol Rev. 1999; 23 (3): 257-75). Dies kann die Effizienz einer antisense Strategie erhöhen. Die Expression von Ribozymen zur Verminderung bestimmter Proteine ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in EP-A1 0 291 533, EP-A1 0 321 201 und EP-A1 0 360 257. Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460) beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley C. C. et al., Plant Mol Biol. 1992; 18(2): 353-361; Lloyd A. M. und Davis R. W. et al., Mol Gen Genet. 1994 Mar; 242(6): 653-657). Beispielhaft sind "hammerhead"-Ribozyme zu nennen (Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334: 585-591). Bevorzugte Ribozyme basieren auf Derivaten der Tetrahymena L-19 IVS RNA (US 4,987,071; US 5,116,742). Weitere Ribozyme mit Selektivität für eine L119 mRNA können selektioniert werden (Bartel D. und Szostak J. W. (1993) Science 261: 1411-1418).
In einer weiteren Ausführungsform kann eine L119 Expression unter Verwendung von Nukleinäuresequenzen bewirkt werden, die komplementär zu regulativen Elementen der endogenen L119 Gene sind, mit diesen eine triple-helikale Struktur ausbilden und so die Gen-Transkription verhindern (Helene C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene C. et al. (1992) Ann N.Y. Acad Sci 660: 27-36; Maher L. J. (1992) Bioassays 14(12): 807-815).
In einer weiteren Ausführungsform können L119 Nukleinsäuren oder zu ihnen komplementäre antisense Nukleinsäuren an der Basen-, Zucker- oder Phosphatuntereinheit modifiziert werden, um beispielsweise die Stabilität, Hybridisierung oder Löslichkeit zu verbessern. Beispielsweise können Peptid- Nukleinsäuren ("peptide nucleic acids" PNAs) zum Einsatz kommen (Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23). In diesen ist das Deoxyribosephosphat-Grundgerüst durch ein pseudopeptidisches Grundgerüst ersetzt. Lediglich die vier natürlichen Nukleobasen bleiben erhalten. Die Synthese derartiger Verbindungen ist dem Fachmann geläufig (Hyrup B. et al. (1996) s. o; Perry-O'Keefe et al. Proc Natl Acad Sci USA 93: 14670-675). Derartige PNAs können in diagnostischen und therapeutischen Verfahren zum Einsatz kommen.
In einer weiteren Ausführungsform können an einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen weitere Gruppen wie beispielsweise Peptide angefügt werden (z. B. um den Transport über die Zellmembran (Letsinger et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc Natl Acad Sci. USA 84: 648-652; WO 88/09810), die Bluthirnschranke (WO 89/10134) oder das "targeting" bestimmter Zellarten über bestimmte Rezeptoren zu erreichen).
Weitere Methoden sind die Einführung von Nonsense-Mutationen oder Mutationen, die eine Verminderung einer L119 wesentlichen Eigenschaft bewirken, in endogene L119 Gene mittels z. B. gentherapeutischer Ansätze beispielsweise unter Verwendung von RNA/DNA-Oligonukleotiden.
Ferner ist eine Verminderung einer L119 Genexpression auch mit spezifischen DNA-bindenden Faktoren z. B. mit Faktoren vom Typus der Zinkfingertranskriptionsfaktoren möglich. Diese Faktoren lagern sich an die genomische Sequenz des endogenen Zielgens, bevorzugt in den regulatorischen Bereichen, an und bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder Repression des endogenen Gens. Die Verwendung eines solchen Verfahrens ermöglicht die Verminderung der Expression eines endogenen L119 Gens, ohne das dessen Sequenz gentechnisch manipuliert werden muss. Entsprechende Verfahren zur Herstellung entsprechender Faktoren sind beschrieben und dem Fachmann bekannt (Beerli R. R. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97 (4): 1495-1500; Beerli R. R., et al., J Biol Chem 2000; 275(42): 32617-32627; Segal D. J. und Barbas C. F., 3rd., Curr Opin Chem Biol 2000; 4(1): 34-39; Kang J. S. und Kim J. S., J Biol Chem 2000; 275(12): 8742-8748; Beerli R. R. et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95(25): 14628-14633; Kim J. S. et al., Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94(8): 3616-3620; Klug A., J Mol Biol 1999; 293(2): 215-218; Tsai S. Y. et al., Adv Drug Deliv Rev 1998; 30(1-3): 23-31; Mapp A. K. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(8): 3930-3935; Sharrocks A. D. et al., Int J Biochem Cell Biol 1997; 29(12): 1371-1387; Zhang L. et al., J Biol Chem 2000; 275(43): 33850-33860). Die Selektion dieser Faktoren kann unter Verwendung eines beliebigen Stückes des Gens eines L119 Proteins erfolgen. Bevorzugt liegt dieser Abschnitt im Bereich der Promotorregion. Für eine Genunterdrückung kann er aber auch - Im Unterschied zur Genaktivierung - im Bereich der kodierenden Exons oder Introns liegen. Die entsprechenden Abschnitte sind für den Fachmann mittels Datenbankabfrage aus der Genbank oder anhand der im Rahmen dieser Erfindung bereitgestellten L119 Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 bzw. ausgehend von einer L119 cDNA, deren Gen nicht in der Genbank vorhanden ist, durch Durchmusterung einer genomischen Bibliothek nach korrespondierenden genomischen Klonen erhältlich. Die dazu erforderlichen Verfahren sind dem Fachmann geläufig. Faktoren können beispielsweise durch Verwendung eines Reportersystems gewonnen werden, bei dem die Promotorregion eines L119 Gen mit einem Marker beispielsweise Luciferase oder GFP (green fluorescence protein) verknüpft wird und dessen Expression anstelle der eines L119 Proteins steuert. Mit derartigen erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten können nach Einbringung in ein geeignetes Expressionssystem Verbindungen hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Expressionsaktivität des L119 Promotors bewertet werden.
Die regulatorischen Sequenzen der erfindungsgemäßen L119 Nukleinsäuren, insbesondere der Promotor, die Enhancer, locus control regions und silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon, können für die gewebespezifische Expression von diesem und weiteren Genen verwendet werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit, endothelspezifische Genexpression von Nukleinsäurekonstrukten durchzuführen. Bevorzugter Verwendungszweck ist der Einsatz als Angriffspunkt zur Herstellung oder Selektion von erfindungsgemäßen anti-L119 oder pro-L119 Verbindungen.
Um ein DNA-Fragment zu isolieren, das die Bereiche enthält, die die Transkription der Sequenzen SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 regulieren, wird zunächst der Bereich vor dem Transkriptionsstart mit einem Reportergen wie z. B. β-Galactosidase oder GFP (= green fluorescent protein) verknüpft und in Zellen oder in transgenen Tieren wie z. B. Mäusen daraufhin getestet, ob er zu dem für Sequenz SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 spezifischen Expressionsmuster führt (Ausubel F. M. et al., (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Da sich cis-regulatorische Sequenzen u. a. auch in sehr großer Entfernung von der Startstelle der Transkription befinden können, ist es vorteilhaft, wenn man sehr große genomische Bereiche in die Analyse einschließt. Zur Klonierung kann es vorteilhaft sein, Vektorsysteme mit sehr hoher Klonierungskapazität, wie z. B. BACs oder YACs (Bacterial artificial chromosome, yeast artificial chromosome) zu benutzen. Dabei kann das Reportergen über homologe Rekombination in den Vektor inseriert werden und auf seine Expression hin untersucht werden (siehe z. B. Hiemisch H. et al. (1997) EMBO J 16, 3995-4006). Mittels geeigneter Deletionen im Konstrukt und anschließender Untersuchung der Auswirkungen auf die Expression des Reportergenes können wichtige regulatorische Elemente identifiziert werden (siehe z. B. Montoliu L. et al. (1996) Embo J 15, 6026-6034).
Die so identifizierten regulatorischen Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere der Promotor, die Enhancer, locus control regions und silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon können die Auffindung von spezifischen pro-L119 oder anti-L119 Verbindungen verwendet werden. Ferner können diese Sequenzen für die gewebespezifische Expression von Sequenzen SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 und weiteren Genen verwendet werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit, endothelspezifische Genexpression von Nukleinsäurekonstrukten durchzuführen. Das Konstrukt mit den regulatorischen Sequenzen kann mit anderen cDNAs verknüpft werden, um Tiermodelle zu erstellen, in denen die jeweilige cDNA regionspezifisch exprimiert wird (siehe beispielsweise Oberdick J. et al. (1990) Science 248, 223-226). Dabei kann es sich auch um die Expression von Sequenz-spezifischen DNA-Rekombinasen wie CRE-Rekombinase, FLP-Rekombinase oder deren Derivate handeln.
So identifizierte Kontrollregionen sind bevorzugte Angriffspunkte für pro-L119 oder anti-L119 Verbindungen nach einer der obigen Definitionen.
Ferner können Faktoren in eine Zelle oder einen Organismus eingebracht werden, die ein L119 Zielprotein selber inhibieren oder gezielt eine wesentliche Eigenschaft vermindern. Die proteinbindenden Faktoren oder Bindefaktoren können z. B. Aptamere (Famulok M. und Mayer G., Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 243: 123-36) oder Antikörper bzw. Antikörperfragmente oder einzelkettige Antikörper sein. Die Gewinnung dieser Faktoren ist beschrieben und dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wurde ein cytoplasmatischer scFv Antikörper eingesetzt, um die Aktivität des Phytochrom A Proteins in gentechnisch veränderten Tabakpflanzen zu modulieren (Owen M. et al., Biotechnology (N.Y.). 1992; 10(7): 790-794; Franken E. et al., Curr Opin Biotechnol. 1997; 8(4): 411-416; Whitelam Trend Plant Sci 1996, 1, 286-272). Entsprechende Verfahren sind in allen Zellen realisierbar. Auf die oben beschriebenen Druckschriften und die darin offenbarten Methoden zur Regulation der Genexpression wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Die entsprechenden Faktoren wie auch ihre Expressionssysteme oder Vehikelsysteme zur Einschleusung in einen Organismus, die eine Verminderung mindestens einer wesentliche Eigenschaft eines L119 Proteins direkt oder indirekt bewirken, sind als anti-L119 Verbindungen im Sinnen der Erfindung zu verstehen.
Eine anti-L119 Verbindung im Sinne der vorliegenden Erfindung ist somit insbesondere ausgewählt unter:

a) antisense-Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt antisense L119 Nukleinsäuresequenzen;
b) antisense-Nukleinsäuresequenzen kombiniert mit einem Ribozym-Verfahren
c) Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt L119 Nukleinsäuresequenzen, die eine Genregulation mittels doppelsträngiger RNA bewirken.
d) Nonsense-Mutanten von endogenen L119 kodierenden Nukleinsäuresequenzen;
e) für Knockout-Mutanten kodierende Nukleinsäuresequenzen;
f) zu homologer Rekombination geeignete Nukleinsäuresequenzen;
g) Nukleinsäuresequenzen kodierend für spezifische DNA- oder Protein-bindende Faktoren mit anti-L119 Aktivität

In einer bevorzugten Ausführungsform können pro-L229 oder anti-L119 Verbindungen oder auch Bindefaktoren gegen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Proteine mittels Durchmusterung kombinatorischer Bibliotheken kodierend für niedermolekulare Verbindungen, Peptide oder Nukleinsäuresequenzen (z. B. für Aptamere) identifiziert werden. Die Herstellung derartiger Bibliotheken für Nukleinsäuresequenzen oder Peptide basiert beispielsweise auf der Verwendung degenerierter Nukleotidsequenzen oder degenerierter Oligonukleotide, die gegebenenfalls im Falle von Peptidbibliotheken in Form von "Phage Display"-Bibliotheken zur Expression gebracht werden. Verfahren zur Herstellung derartiger degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (s. z. B. Narang S. A. (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu Rev Biochem 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res 11: 477). Peptid-Bibliotheken können durch Klonierung besagter Bibliotheken an Nukleinsäuresequenzen in geeignete Expressionsvektoren, Transformation der Expressionsvektoren in einen geeigneten Wirt und Expression des Peptids unter den jeweils auf Expressionsvektor und Wirt abgestimmten geeigneten Bedingungen erhalten werden.
"Recrusive ensemble mutagenesis" (REM) ist ein weiteres Verfahren um Nukleinsäure- oder Peptidbibliotheken zu erzeugen (Arkin und Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).
Gemäß der unterschiedlichen Natur der oben beschriebenen Ansätze kann die anti-L119 Sequenz seine Funktion direkt ausüben (zum Beispiel durch Insertion in ein endogenes L119 Gen). Die Funktion kann aber auch indirekt nach Transkription in eine RNA (zum Beispiel bei antisense Ansätzen) oder nach Transkription und Translation in ein Protein (zum Beispiel bei Bindefaktoren) ausgeübt werden. Sowohl direkte als auch indirekt wirkende anti-L119 sind erfindungsgemäß umfasst.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der an eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Proteine bindenden oder zur Modulation oder Normalisierung mindestens einer wesentlichen Eigenschaft oder der Expression eines L119 Proteins geeigneten Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln. Solche Verbindungen sind nach einem der oben genannten Verfahren erhältlich.
Bevorzugt werden die Verbindungen zur Behandlung und Prophylaxe von menschlichen und tierischen Erkrankungen eingesetzt. Besonders zur Behandlung und Prophylaxe von endothelialen Erkrankungen. Je nach Art einer Erkrankung kann eine Steigerung oder Verminderung einer wesentliche Eigenschaft oder der Expression eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine vorteilhaft sein.
"Endotheliale Erkrankungen" im Rahmen dieser Erfindung meint zunächst allgemein all solche Erkrankungen bei denen eine Steigerung oder Verminderung einer wesentliche Eigenschaft oder der Expression eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine vorteilhaft ist. Bei diesen Erkrankungen kann das Endothel direkt oder indirekt involviert sein. "Endotheliale Erkrankungen" umfasst beispielsweise Tumorerkrankungen, Erkrankungen mit veränderter Angiogenese oder Vaskulogenese, Erkrankungen des Herz-, Kreislaufsystems, Gefäßerkrankungen, Erkrankungen mit entzündlichen Prozessen, Erkrankungen mit hypoxischen oder ischämischen Zellen oder Geweben, Erkrankungen mit veränderten Zuständen von Blut- oder Lymphgefäßen. Zu diesen Erkrankungen zählen unter anderem verschiedene feste Tumore, Hämangiome, Hämangiosarkome, Kaposi's Sarkoma, Prostatakrebs, Glioblastoma, Metastasierung und Wachstum mesenchymaler Tumore, verschiedene Retinopathien, Herzinfarkt, Herzinsuffizienz, koronare Herzerkrankungen, Kardiomyopathien, Hypertonie, Angina Pectoris, Arrythmie, akutem oder chronischem Nierenversagen, chronischer Herzinsuffizienz, Niereninsuffizienz, Subarachnoidalblutungen, Migräne, pulmonäre Hypertonie, Raynaud- Syndrom, zerebrale Vasospasmen, benigne Prostatahyperplasie. Erektionsstörungen, Glaucoma, ischämisches oder durch Intoxikation verursachtes Nierenversagen, Pankreatitis, gastrointestinale Ulcera, Asthma, Arteriosklerose, septischer oder endotoxischer Schock, endotoxin-induziertem Organversagen, intravaskulärer Koagulation, Restenose nach Angioplastie und by-pass Operationen, Hyperlipidämien, Homocyteinurie, Störungen des Haarwuchses oder der Wundheilung, Menstruationsstörungen, Ischämie, Schlaganfall, akuter Myokardinfarkt, CADASIL, Epilepsien, Gangräne, Rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Diabetes, diabetische Retinopathie, Lungenerkrankungen, Nierenerkrankungen sowie chronische Geschwüre, Amputationen, Wunden und Gefäßveränderungen. Ferner sind Mangelversorgungen der Plazenta und andere Störungen während der Schwangerschaft umfasst. Bevorzugt sind allgemein solche Erkrankungen bei denen eine Hochregulation der L119 mRNA erfolgt oder eine Hochregulation einen positiven Effekt bewirkt.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Teilen davon, der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte sowie der erfindungsgemäßen pro-L119 bzw. anti-L119 Verbindungen zur Gentherapie.
Bevorzugt wird diese auf Säugetiere besonders bevorzugt auf den Mensch angewendet. Bevorzugt verwendet werden die durch SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 beschriebenen Nukleinsäuresequenzen und die von ihnen abgeleiteten transgenen Nukleinsäurekonstrukte. Auch zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Teilen davon komplementäre Sequenzen können bevorzugt zur Gentherapie verwendet werden.
"Gentherapie" umfaßt allgemein alle Verfahren, die geeignet sind mindestens eine wesentliche Eigenschaft oder die Expression eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine zu modulieren oder zu normalisieren.
"Normalisieren" meint, dass mindestens eine wesentliche Eigenschaft oder die Expression eines der erfindungsgemäßen L119 Proteine in dem gentherapeutisch behandelten Organismus einem Normalwert, erhalten aus einem gesunden Individuums oder aus einem Mittelwert mehrerer gesunder Individuen, zu mindestens 20%, bevorzugt zu mindestens 50%, besonders bevorzugt zu mindestens 90% entspricht oder diesen um nicht mehr als 500%, bevorzugt um nicht mehr als 200%, besonders bevorzugt um nicht mehr als 100%, ganz besonders bevorzugt um nicht mehr als 50% übersteigt.
Umfasst sind alle Therapieformen, die entweder Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder ihre funktionellen Äquivalente oder Teile davon in einen Organismus, beispielsweise einen menschlichen Körper, einbringen, oder eine wesentliche Eigenschaft oder die Expression eines erfindungsgemäßen Proteins gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder einer Nuleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder ihrer funktionellen Äquivalente modulieren oder normalisieren.
Bevorzugt ist ferner die Verwendung von pro-L119 oder anti-L119 Verbindungen, soweit sie Nukleinsäuresequenzen darstellen oder durch Transkription und gegebenenfalls auch Translation aus Nukleinsäuresequenzen erhältlich sind. Dazu können beispielsweise zählen: Oligonukleotide, z. B. antisense- oder Hybrid- RNA-DNA Oligonukleotide oder doppelsträngige RNA Moleküle, mit beliebigen Modifikationen, die beispielsweise Teile der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder ihrer funktionellen Äquivalente enthalten. Ebenfalls können virale Konstrukte, enthaltend beispielsweise eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder ihrer funktionellen Äquivalente oder Teile davon benutzt werden. Ebenso kann nackte DNA, enthaltend beispielsweise eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder ihrer funktionellen Äquivalente oder Teile davon, benutzt werden.
Ebenso können Nukleinsäurestücke mit enzymatischer Aktivität (z. B. Ribozyme s. o.) für gentherapeutische Zwecke benutzt werden. Weitere Möglichkeiten für im Rahmen der Gentherapie bevorzugte pro-L119 oder anti-L119 Verbindungen sind oben genannt.
Zwei verallgemeinerte genterapeutische Ansätze umfassen

a) die Applikation von "nackter", lipid-komplexierter, in Liposomen formulierter oder auf eine andere Art formulierter DNA oder
b) die Applikation der heterologen Nukleinsäuresequenzen mittels viraler Vektoren.

Gegebenenfalls ist für die Ansätze eines der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte hinsichtlich einer optimalen Expression anzupassen (z. B. Einbau eines Intron in den 5'-untranslatierten Bereich, Elimination unnötiger oder inhibitorischer Sequenzen (Felgner, et al. (1995) Ann N.Y. Acad Sci 126-139). Formulierungen der DNA unter Verwendung verschiedener Lipide oder Liposomen können anschließend für die Applikation zum Einsatz kommen und sind dem Fachmann bekannt (s. o.).
Verschiedene virale Vektoren können bei der zweiten Applikationsart zu Einsatz kommen. Bevorzugt sind retrovirale, AAV und adenovirale Systeme (Dubensky et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7529-7533; Kaneda et al., (1989) Science 243,375-378; Hiebert et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3594-3598; Hatzoglu et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 17285-17293; Ferry, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8377-8381). Ebenfalls bevorzugt sind Systeme basierend auf Herpes simplex virus (HSV).
Retroviren sind eine Klasse von RNA Viren bei denen die RNA in der infizierten Zelle revers zu DNA transkribiert wird. Das retrovirale Genom kann in das der Wirtszelle integrieren. Die drei viralen Gene gag, pol und env als auch virale "long terminal repeats (LTRs) sind für die Funktion eines Retrovirus essentiell. LTRs können auch als Enhancer und Promoter viraler oder heterologer Gene fungieren. Zur Expression heterologer Nukleinsäuresequenzen können die viralen Gene partiell durch die zu exprimierenden Sequenzen ersetzt werden. Nach Transfektion in eine sogenannte Verpackungszelllinie ("packaging line"), die die Verpackungskomponenten zur Bildung infektiöser Viruspartikel enthält, wird ein verpackter Virus generiert und in das Zellkulturmedium abgegeben. Da Retroviren nur in der Lage sind, teilende Zelle zu infizieren, werden sie zumeist in der ex vivo Gentherapie verwendet.
Besonders bevorzugt sind Adeno-assoziierte Viren (AAV). Sie sind besonders als Vehikel für die Gentherapie an zahlreichen Geweben wie Lunge oder Muskelgewebe und v. a. für eine Therapie endothelialer Erkrankungen geeignet. AAV Vektoren infizieren Zellen und integrieren in deren Genom mit hoher Effizienz. AAVs können auch in Zellen integrieren, die einem Wachstumsstopp unterliegen (wie beispielsweise dem Lungenepithel) und sind zudem nichtpathogen. AAV-basierte Expressionsvektoren beinhalten im allgemeinen die aus 145 Nukleotiden bestehenden "AAV inverted terminal repeats (ITRs)", die i. a. eine Restriktionsschnittstelle zur Aufnahme heterologer Nukleinsäuresequenzen (wie beispielsweise zur Expression von L119 Proteinen, pro-L119 bzw. anti-L119 Verbindungen geeignete Nukleinsäurekonstrukte) flankieren. Die Kapazität liegt bei ca. 4,4 kb. AAV-Vektoren sind zur Expression verschiedener Proteine erfolgreich in der Gentherapie eingesetzt worden (Kotin R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801, Table I). Als geeignete Promotoren kommen die oben genannten oder aber auch ein AAV Promotor infrage (ITR selbst oder AAV p5; Flotte et al. (1993) J Biol Chem 268: 3781-3790). Ein derartiger Vektor kann in der dem Fachmann bekannten Weise in AAV Virionen verpackt werden (Carter B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Kotin R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801). Verschiedene Methoden zur Erhöhung von Virustiter sind bekannt. Ferner kann die Effizienz der Virus-Transduktion erhöht werden (WO 96/39530). Verschiedene Verfahren zur Aufkonzentration und Reinigung der Viren sind dem Fachmann bekannt und umfassen Dichtegradientenzentrifugation (Flotte et al. (1993) J Biol Chem 268: 3781-3790) oder chromatographische Aufreinigung (WO 97/08298). Detaillierte Methoden der AAV-Technologie, welche im Rahmen eines der erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommen können und sich auf Einbau einer transgenen Nukleinsäuresequenz, Vermehrung und Aufreinigung des AAV Vektors und dessen Verwendung zur Transfektion von Zellen und Säugern beziehen sind dem Fachmann bekannt (z. B. US 4,797,368; US 5,139,941; US 5,173,414; US 5,252,479; US 5,354,678; US 5,436,146; US 5,454,935; WO 93/24641; US 5,658,776).
Verschiedene adenovirale Vektoren haben ihren Nutzen in der Gentherapie am Säuger (einschließlich des Menschen) unter Beweis gestellt. Replikationsdefiziente adenovirale Vektoren wurden beispielsweise verwendet um CFTR im pulmonaren Epithel zu exprimieren. Die erste Generation an E1a deletierten adenoviralen Vektoren wurde dahingehend verbessert, dass die zweite Generation nunmehr ein temperatursensitives E2a Virusprotein enthält, dass einer geringeren Expression viraler Proteine dient und die infizierte Zelle weniger zum Ziel einer Immunantwort macht (Goldman et al., Human Gene Therapy 6: 839-851, 1995). Ferner wurden virale Vektoren ohne jeden viralen "open reading frames" (ORF) berichtet (Fisher et al. (1996) Virology 217: 11-22). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, das eine Expression von viralem IL-10 eine Immunantwort gegen ein adenovirales Antigen unterdrückt (Qin et al. (1997) Human Gene Therapy 8: 1365-1374).
DNA-Sequenzen einer Vielzahl von Adenoviren sind aus der Genbank erhältlich. Diverse Stämme sind von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., USA oder aus zahlreichen kommerziellen wie auch akademischen Quellen erhältlich. Die Konstruktion eines adenoviralen Vektors erfolgt analog zu der jedes anderen Vektors wie oben beschrieben. Hybride Adenovirus- AAV Vektoren bestehend aus einem Adenovirus-Capsid enthaltend ausgewählte Anteile von adenoviralen Sequenzen, 5'- und 3' AAV ITR Sequenzen, die das Transgen flankieren und ggf. weitere regulatorische Elemente können ebenfalls verwendet werden (WO 96/13598).
Detaillierte Informationen zur Adenovirus-Technologie, welche im Rahmen eines der erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommen können und sich auf Einbau einer transgenen Nukleinsäuresequenz, Vermehrung und Aufreinigung des adenoviralen Vektors und dessen Verwendung zur Transfektion von Zellen und Säugern beziehen, sind dem Fachmann bekannt (WO 94/28938, WO 96/13597 und WO 96/26285, sowie die darin genannten Zitate).
Im allgemeinen werden DNA oder Viruspartikel in eine biologisch- kompatible Lösung oder ein pharmazeutisch-akzeptables Lösemittel, wie beispielsweise eine sterile Salzlösung oder eine sterile wässrige oder nicht-wässrige, isotone Injektionslösung oder Suspension überführt. Dem Fachmann sind zahlreiche Beispiele bekannt wie z. B. Ringers Lösung, PBS ("phosphate buffered sahne") etc. Bevorzugt wird zum Zwecke der Gentherapie die DNA oder der rekombinante Virus in einer Menge appliziert, die zum Erzielen eines therapeutischen Effektes ausreichend ist ohne zugleich unerwünschte Nebenwirkungen zu bewirken. Diese optimale Dosis hängt von verschiedenen Faktoren ab und kann von Patient zu Patient variieren. Therapeutisch effektive Dosen können beispielsweise in einem Bereich von 1 bis 50 ml einer Salzlösung mit einer Viruskonzentration von ungefähr 1 × 10⁷ bis ungefähr 1 × 10¹⁰ pfu Virus/ml, bevorzugt 1 × 10⁸ bis ungefähr 1 × 10⁹ pfu Virus/ml liegen.
Die Anwendung von gentherapeutischen Verfahren, bevorzugt von solchen basierend auf AAV oder adenoviralen Systemen, ist ein bevorzugtes Verfahren zur Behandlung endothelialer Erkrankungen.
Das Endothel ist als Therapieort den genannten Verfahren besonders gut zugänglich.
Die Erfindung umfasst ferner Verfahren geeignet zum Einsatz in der Vorsorgemedizin beispielsweise als diagnostische Tests, prognostische Tests sowie zur Verfolgung und Beurteilung klinischer Versuchsreihen. Diese Verfahren haben das Ziel ein Individuum prophylaktisch oder gezielt therapeutisch zu behandeln.
Die Erfindung umfasst ein Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der Gegenwart, des Fehlens, der fehlregulierten Expression oder einer Fehlfunktion eines erfindungsgemäßen L119 Protein oder einer erfindungsgemäßen L119 Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfaßt:

a) Gewinn einer biologischen Probe aus einer Testperson
b) Inkubation der biologischen Probe mit einem Reagenz, das zum Nachweis eines erfindungsgemäßen L119 Protein oder einer erfindungsgemäßen L119 Nukleinsäuresequenz geeignet ist, in einer Weise, dass die Gegenwart, das Fehlens, die fehlregulierte Expression oder eine Fehlfunktion eines erfindungsgemäßen L119 Protein oder einer erfindungsgemäßen L119 Nukleinsäuresequenz detektiert werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an erfindungsgemäßer Nukleinsäure oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet sind,
b) Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation,
c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure mit einem Mengenstandard.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis eines erfindungsgemäßen Proteinheteromers oder eines erfindungsgemäßen Proteins in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der spezifisch gegen das Proteinheteromer oder gegen das erfindungsgemäße Protein gerichtet ist,
b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes,
c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard.

"Biologische Probe" umfasst Gewebe, Zellen, biologische Flüssigkeiten gewonnen aus oder vorhanden in einer Testperson. Die obengenannten erfindungsgemäßen Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis können in vitro als auch in vivo ausgeführt werden. In vitro Techniken zum Nachweis einer L119 mRNA umfassen beispielsweise Northern Hybridisierungen und in situ Hybridisierungen. In vitro Verfahren zum Nachweis eines L119 Proteins umfassen ELISAs ("enzyme linked immunosorbent assays"), Western-Blots (Immunoblots), Immunopräzipitationen und Immunofluoreszenz. In vitro Verfahren zum Nachweis einer L119 genomischen DNA umfassen Southern-Hybridisierungen. In vivo Verfahren zum Nachweis eines L119 Proteins umfassen beispielsweise die Einbringung eines markierten anti-L119 Antikörpers in eine Testperson. Die Markierung kann beispielsweise radioaktiv erfolgen und die Lokalisation und Menge des Antigens durch dem Fachmann bekannte Bildgebungsverfahren detektiert werden.
Bevorzugte Reagenzien zum Nachweis einer Nukleinsäure (mRNA oder genomische DNA) ist eine markierte Nukleinsäure, die in der Lage ist als Sonde mit der nachzuweisenden L119 Nukleinsäure zu hybridisieren. Diese Nukleinsäure-Sonde kann beispielsweise eine L119 Nukleinsäuresequenz, bevorzugt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23, ganz besonders bevorzugt eine humane L119 Nukleinsäuresequenz, am meisten bevorzugt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder 22 umfassen. Ferner umfasst sind Teile der vorgenannten, wie beispielsweise Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 15, 30, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotiden, welche unter ausreichend stringent Bedingungen mit einer L119 Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren vermögen oder zu einem Nachweisverfahren basierend auf der Technik der Polymerasekettenreaktion in Form von Oligonukleotid- Primern zum Einsatz gelangen können.
Ein bevorzugtes Reagenz zum Nachweis eines L119 Proteins ist ein Antikörper, der ein L119 Protein zu binden vermag, bevorzugt ein markierter Antikörper. Diese Antikörper können polyklonal oder - bevorzugt - monoklonal sein. Umfasst sind vollständige Antikörper als auch Fragmente derselben (z. B. Fab oder F(ab')2- Fragmente). Herstellverfahren für besagte Antikörper sind oben beschrieben und dem Fachmann bekannt.
"Markiert" meint die direkte oder indirekte Verbindung beispielsweise einer Sonde, einem Oligonukleotid-Primer oder einem Antikörper mit detektierbaren Substanzen. Derartige detektierbare Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende oder lumineszierende oder biolumineszierende oder radioaktive Materialien. Beispiele für Enzyme umfassen Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase oder Acetylcholinesterase. Geeignete prosthetische Gruppierungen umfassen beispielsweise Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin. Beispiele für geeignete fluoreszente Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlorotriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin. Beispielhaft genannt seien für lumineszierende Materialien Luminol, für biolumineszierende Materialien Luciferase, Luciferin und Aequorin, für radioaktive Materialien die Isotope ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³³P, ³⁵S oder ³H. Sowohl direkte Verfahren der Markierung durch beispielsweise eine physikalisch-chemische Verbindung als auch indirekte Verfahren mit Substanzen, die wiederum direkt markiert sein können, sind umfasst. Indirekte Verfahren können z. B. die Detektion eines Antikörpers mit einem markierten sekundären Antikörper oder die End-Markierung einer Sonde mit Biotin und deren Detektion mit markiertem Streptavidin umfassen.
Üblicherweise werden die obengenannten Verfahren parallel zu einem Verfahren unter Verwendung einer biologischen Probe aus einer Kontrollperson durchgeführt. Als Standard wird üblicherweise eine biologische Probe aus einem gesunden Organismus entnommen.
Die sogearteten erfindungsgemäßen Verfahren bzw. die für ihre Durchführung nötigen Reagentien und Hilfsstoffe können in Form vorbereiteter Tests zusammen mit Ausführungsbestimmungen bereitgestellt werden.
Ziel einer solchen Untersuchung kann es sein, festzustellen, ob ein Individuum von einer Erkrankung betroffen ist oder dem Risiko unterliegt eine Erkrankung zu entwickeln, die mit einer Störung mindestens einer wesentlichen Eigenschaft eines L119 Proteins direkt oder indirekt zusammen hängt.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der Gegenwart, des Fehlens, der fehlregulierten Expression oder einer Fehlfunktion eines erfindungsgemäßen L119 Proteins oder einer erfindungsgemäßen L119 Nukleinsäuresequenz umfasst beispielsweise den Nachweis von genetischen Änderungen ("Mutationen") eines L119 Gens in einer biologischen Probe. Diese Verfahren können beispielsweise der Vorhersage des Risikos einer Person an beispielsweise einer L119 mediierten endothelialen Erkrankung zu erkranken dienen.
Mutationen von L119 Genen können verschiedener Natur sein. Dabei kann es sich entweder um Mutationen größerer Bereiche oder um kleinere Veränderungen der Nukleinsäuresequenz handeln. Beispiele für beide Möglichkeiten sind dem Fachmann vertraut und beinhalten unter anderem Deletionen, Insertionen, Rearrangements, die die Nukleinsäuresequenz von L119 betreffen, aber auch Basenaustausche/Punktmutationen. Die Mutationen können den für die Proteinsequenz kodierenden Bereich von L119 verändern. Dadurch kann es zu Veränderungen der Proteinsequenz (Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten) und damit zu neuen Eigenschaften des veränderten Proteines (Gain-of-function Mutation) kommen. Alternativ können Mutationen vorliegen, die die Regulation der Genexpression (Transkription, Translation, posttranslationelle Modifikationen) von L119 verändern. Diese Mutationen können den 5'- oder 3'-untranslatierten Bereich des L119 Genes betreffen, können (flankierende) regulatorische Sequenzen (z. B. Promotoren, Intronische Sequenzen, Spleisssequenzen, Enhancer, Silencer, Locus control regions, matrix attachment regions u. a.) verändern/deletieren. Dysregulation der Expression kann auch zu hypomorphen Allelen von L119 führen. Es kann zu Deletionen, Insertionen oder Rearrangements des L119 Locus kommen die zu einem Funktionsverlust des Genes (Loss-of-function) führen. Weiterhin möglich sind Mutationen, die eine Benutzung von im Wildtypallel nicht genutzten offenen Leserastern zur Folge haben. Chromosomale Mutationen können auch zur Rekombination neuer funktionaler Einheiten führen. Dabei kann ein Fusionstranskript aus Teilen von L119, rekombiniert mit einem zweiten Gen, entstehen. Dieses Fusionsgen kann für ein Protein mit neuen Eigenschaften kodieren. Alternativ kann die kodierende Sequenz des einen Fusionspartners (z. B. ohne selbst in der Sequenz verändert zu sein) unter die Kontrolle von regulatorischen Elementen des zweiten Partners geraten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Detektion einer genetischen Änderung in einer Zellprobe einer Person. Dabei meint "genetische Veränderung"

a) die Deletion eines oder mehrerer Nukleotide in einem L119 Gen, oder
b) die Addition eines oder mehrerer Nukleotide zu einem L119 Gen, oder
c) die Substitution eines oder mehrerer Nukleotide in einem L119 Gen, oder
d) eine chromosomale Umordnung innerhalb eines L119 Gens
e) eine Veränderung in der Menge der exprimierten mRNA eines L119 Gens
f) eine abweichende Modifikation eines L119 Gens, wie beispielsweise eine Veränderung des Methylierungsmusters der genomischen L119 DNA, oder
g) Auftreten eines vom Wildtyp abweichenden "Splicing"-Musters der mRNA eines L119 Gens, oder
h) eine Veränderung in der Menge eines exprimierenden L119 Proteins
i) der allelische Verlust eines L119 Gens, oder
j) eine vom Wildtyp abweichende post-translationale Modifikation eines L119 Proteins.

Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren bekannt, um derartige Veränderungen zu bestimmen und zu analysieren. Diese Verfahren können spezifische Sonden oder Primer in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) umfassen (s. US 4,683,195 und US 4,683,202). Auch abgewandelte Formen der PCR sind möglich wie z. B. "anchor PCR", "RACE PCR", "ligation chain reaction (LCR)" (Landegran et al. (1988) Science 241: 1077-1080; Nakazawa et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 360-364), wobei letztere besonders vorteilhaft bei der Detektion von Punktmutationen in einem L119 Gen eingesetzt werden kann (Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675-682). Alternative Amplifikationsverfahren umfassen: "self sustained sequence replication" (Guatelli J. C. et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 1874-1878), Transkriptions/Amplifikationssysteme (Kwoh D. Y. et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 1173-1177), Q-Beta Replikase (Lizardi P. M. et al. (1988) Bio- Technology 6: 1197) oder andere Amplifikationsmethoden gefolgt von einer Detektion der amplifizierten Nukleinsäuremoleküle mit dem Fachmann bekannten Verfahren.
Veränderungen in einem L119 Gen können ferner durch Veränderungen in Restriktionsenzymspaltungsmustern detektiert werden. Dabei können beispielsweise Kontroll- und Proben-DNA isoliert, (optinal) amplifiziert und mit einer oder mehr Restriktionsendonukleasen behandelt werden, wobei anschließend die entstandenen Fragmentlängen z. B. durch Gelelektrophorese bestimmt und verglichen werden. Fragmentlängenunterschiede weisen auf eine Veränderung in dem L119 Gen hin.
Ferner kann die Verwendung sequenzspezifischer Ribozyme zur Detektion bestimmter Mutationen aufgrund der Entstehung und/oder Entfernung einer spezifischen Schnittstelle detektiert werden (s. US 5,498,531).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können Mutationen in einem L119 Gen durch Hybridisierung von Probe- und Kontroll- Nukleinsäuremolekülen (beispielsweise DNA oder RNA-Molekülen) auf hochdichten Anordnungen ("high density arrays") von hunderten oder tausenden von verschiedenen Oligonukleotiden detektiert werden (Cronin M. T. et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal M. J. et al. (1996) Nature Medicine 2: 753-759).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können Mutationen mittels einer der zahlreichen dem Fachmann geläufigen Sequenzierverfahren durch Ermittlung der Nukleinsäuresequenz und Vergleich derselben mit einer "wild-Typ" Kontrolle ermittelt werden.
Beispielhaft seien die Methoden von Maxam und Gilbert (Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74: 560) oder Sanger (Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74: 5463) oder Methoden basierend auf Massenspektroskopie (s. WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36: 127-162; Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38: 147-159) genannt.
Verfahren zur Detektion von Mutationen in L119 Genen beinhalten Methoden, bei denen die Detektion von Paarungsfehlern in RNA/RNA, DNA/DNA oder RNA/DNA-Duplexen aufgrund des fehlenden Schutzes gegen spaltende Reagenzien ermittelt wird ("mismatch cleavage"; Myers et al. (1985) Science 230: 1242). RNA/DNA-Duplexes können beispielsweise mit RNase und DNA/DNA-Hybride mit S1 Nuklease behandelt werden, wobei die Spaltung jeweils in der Region der Fehlpaarung erfolgt. Das behandelte Material kann anschließend z. B. mittels Gelelektrophorese hinsichtlich seiner Fragmentgrößen analysiert werden, wodurch die Lokalisation der Mutation bestimmt werden kann (s. Cotton et al. (2988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217: 286-295). Dazu kann in einer bevorzugten Ausführungsform die Kontroll- RNA oder -DNA z. B. radioaktiv oder mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. In einer solchen Reaktion können ferner auch Enzyme eingesetzt werden, die spezifische Basenfehlpaarungen erkennen und spalten (z. B. E. coli mutY Enzym; Thymidin DNA Glycosylase (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662); US 5,459,039).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können Mutationen in L119 Genen auch aufgrund von Veränderungen in der elektrophoretischen Mobilität detektiert werden. Sogenannte Einzelstrang-Konformationspolymorphismen ("single strand conformation polymorphism (SSCP)") können zur Detektion von Unterschieden in der elektrophoretische Mobilität zwischen mutierter und Kontroll- Probe herangezogen werden. Verschiedene Ausführungsformen sind dem Fachmann bekannt (Orita et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA: 86: 2766, Cotton (1993) Mutat Res 285: 125-144; Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9: 73-79; (Keen et al. (1991) Trends Genet 7: 5; Myers et al. (1985) Nature 313: 495; Rosenbaum und Reissner (1987) Biophys Chem 265: 12753).
Weitere Verfahren zur Auffindung von Punktmutationen umfassen beispielhaft aber nicht einschränkend: Selektive Oligonukleotid- Hybridisierung, selektive Amplifikation oder selektive "Primer- Extension". Selektive Hybridisierung umfasst die Verwendung von Oligonukleotidprimern die lediglich bei einer perfekten Komplementarität mit einer Probe hybridisieren nicht aber, wenn diese eine Punktmutation beinhaltet (Saiki et al. (1986) Nature 324: 163; Saiki et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 6230). Analyog funktioniert die Methode der selektive Amplifikation (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res 17: 2437-2448) und selektive "Primer-Extension" (Prossner et al. (1993) Tibtech 11: 238).
Ferner können die erfindungsgemäßen Verfahren dem Nachweis der Wirksamkeit einer Verbindung dienen, die mindestens eine wesentliche Eigenschaft oder die Expression eines L119 Proteins moduliert. Diese Verfahren können im Rahmen klinischer Untersuchungen zur Wirksamkeit besagter Verbindungen ihre Anwendung finden.
Die im Rahmen der Erfindung zur Verfügung gestellten Nukleinsäuresequenzen oder Nukleinsäurekonstrukte oder Teile derselben können vielfältige Anwendung finden:

a) Zur Auffindung der korrespondierenden L119 Gene auf einem Chromosom ("chromosome mapping") und damit ggf. Lokalisierung einer mit einer genetisch-bedingten Erkrankung verbundenen Region. Die Techniken des "chromosom mapping" sind dem Fachmann bekannt (D'Eustachio P. et al. (1983) Science 220: 919-924, Fan Y. et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA, 87: 6223-27, Verma et al. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York). Sobald eine Sequenz mittels bekannter Techniken (z. B. FISH; fluorescence in situ hybridisation) auf einem bestimmten Chromosom lokalisiert wurde, kann diese Position mit Daten einer genetischen Karte verglichen werden. Diese werden beispielsweise durch die OMIM-Datenbank (s. o.) zur Verfügung gestellt. Die Beziehung zwischen Gen und Krankheit kann beispielsweise durch eine sogenannte "linkage analysis" hergestellt werden (Egeland J. et al. (1987) Nature, 325: 783-787). Ferner können Unterschiede in der Sequenz zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen analysiert werden.
b) In einem Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in einer biologischen Probe.

Die im Rahmen der Erfindung zur Verfügung gestellten diagnostischen Verfahren können ferner verwendet werden, um das Risiko einer Person, an einer der genannten endothelialen Erkrankungen zu erkranken, die auf ein L119 Protein, Nukleinsäureexpression oder Aktivität zurückzuführen ist, vorherzusagen. Bevorzugt wird ein solcher Test unter Verwendung einer aus einer Testperson gewonnenen Protein- oder Nukleinsäureprobe (mRNA oder genomische DNA) realisiert. Eine solche Probe kann aus einer biologischen Flüssigkeit (z. B. Serum), Zellen oder Gewebe beispielsweise im Rahmen einer Biopsie gewonnen werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die diagnostischen Methoden dazu verwendet, die Erfolgswahrscheinlichkeit bzw. die Behandlungsmöglichkeit eines an einer endothelialen Erkrankung leidenden Patienten mit L119 modulierenden oder normalisierenden Substanzen (z. B. pro-L119 oder anti-L119 Verbindungen) vorherzusagen.
Die erfindungsgemäß umfassten Verfahren können beispielsweise in Form von vorbereiteten Diagnose-"Kits" zum Einsatz kommen. Ferner können die diagnostischen Verfahren auch während klinischer Untersuchungen zur Wirksamkeit von L119 modulierenden oder normalisierenden Verbindungen herangezogen werden, um beispielsweise die Expressionshöhe eines L119 Proteins zu untersuchen oder ein geeignetes Patientenkollektiv für einen bestimmten L119 modulierenden oder normalisierenden Ansatz auszuwählen.
Weiterhin können die cDNA, die genomische DNA, die regulatorischen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in rekombinanter oder nichtrekombinanter Form zur Ausarbeitung eines Testsystems verwendet werden. Dieses Testsystem ist geeignet, die Aktivität des Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz zu messen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Messmethoden (kolorimetrische, luminometrische, auf Fluoreszenz beruhende oder radioaktive), die die schnelle Messung einer Vielzahl von Testsubstanzen erlauben (Böhm, Klebe, und Kubinyi. 1996). Wirkstoffdesign (Heidelberg: Spektrum-Verlag). Die beschriebenen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemischen oder biologischen Bibliotheken nach Substanzen, die agonistische oder antagonistische Wirkungen auf SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder den Komplex, bestehend aus einem in Tabelle 1 genannten Protein und dem in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 beschriebenen Protein, haben.
Ein alternativer Weg zur Entwicklung von Wirkstoffen, die an L119 angreifen, besteht im rationalen Drug Design (Böhm et al., 1996). Hier wird die Struktur oder eine Teilstruktur des in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 dargestellten Proteins, soweit sie vorliegt, oder ein von Computern erstelltes Strukturmodell, benutzt, um mit Unterstützung von Molecular Modelling Programmen Strukturen zu finden, für die sich eine hohe Affinität an L119 vorhersagen läßt. Diese Substanzen werden dann synthetisiert und getestet. Hochaffine, selektive Substanzen werden auf ihre Verwendung als Medikamente gegen endotheliale Erkrankungen gemäß obiger Definition getestet.
Die Bestimmung von Menge, Aktivität und Verteilung des in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 dargestellten Proteins oder seiner zugrundeliegenden mRNA im menschlichen Körper kann zur Diagnose, Erfassung der Prädisposition und zum Monitoring bei bestimmten Erkrankungen dienen. Desgleichen kann die Sequenz der cDNA der Sequenzen SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 sowie der genomischen DNA zu Aussagen über genetische Ursachen und Prädispositionen bestimmter Erkrankungen herangezogen werden. Dazu können sowohl DNA/RNA- Proben als auch Antikörper verschiedenster Art benutzt werden. Dabei dient die beschriebene Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder Teile davon in Form geeigneter Proben zur Aufdeckung von Punktmutationen oder Deletionen/Insertionen/Rearrangements.
Die vorliegende Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23, ihre funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate, das von ihr kodierte Protein (SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24) oder das erfindungsgemäße Proteinheteromer mit einem der in Tabelle 1 dargestellten Proteine sowie davon abgeleitete Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) können zur Diagnose und Therapie von endothelialen Erkrankungen gemäß obiger Definition eingesetzt werden.
Weiterhin kann ein Monitoring der Behandlung von Erkrankungen durchgeführt werden. Dies betrifft z. B. die Verlaufsbeurteilung von Krankheiten, die Beurteilung von Therapieerfolgen, die Graduierung einer Krankheit. Spezifisch kann eine L119 Mengenbestimmung in Zellen oder Körperflüssigkeiten zur Verlaufskontrolle von Gefäßerkrankungen, Hypertonie-Formen, oder von bestimmten Tumoren benutzt werden.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 bzw. an eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 binden und dadurch hemmende oder aktivierende funktionelle Effekte auf die L119-Signalweiterleitung in vaskulären Endothelzellen hervorrufen.
In Situationen, in denen ein Mangel an der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins mit SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder eines ihrer funktionellen Äquivalente herrscht, können mehrere Methoden zur Substituierung oder zur Steigerung eingesetzt werden. Prinzipiell sind dazu alle bereits oben beschriebenen Verfahren unter Einsatz einer pro-L119 Verbindung geeignet. Zum einen kann das Protein - natürlich oder rekombinant - direkt oder durch geeignete Maßnahmen in Form seiner kodierenden Nukleinsäure (d. h. DNA oder RNA) appliziert werden. Dazu können sowohl virale, als auch nichtvirale Vehikel zum Einsatz kommen, wie bereits oben beschrieben. Ein weiterer Weg bietet sich durch die Stimulation des endogenen, körpereigenen Gens durch geeignete Substanzen. Solche Substanzen lassen sich beispielsweise auffinden, indem man ihre Wirkung auf die Transkriptionselemente des L119 Genes ermittelt.
In Situationen, in denen ein Überschuss an Aktivität eines Proteins mit der Sequenz SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder eines ihrer Äquivalente herrscht, können prinzipiell alle oben beschriebenen Verfahren unter Einsatz einer anti-L119 Verbindung zum Einsatz kommen. Vor allem können spezifische, synthetische oder natürliche, kompetitive und nicht-kompetitive Antagonisten gegen das Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder einem ihrer funktionellen Äquivalente oder Antikörper oder Antikörperfragmente gegen das Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder gegen das Proteinheteromer einem der funktionellen Äquivalente der vorgenannten eingesetzt werden. Des weiteren kann sowohl durch Antisense Moleküle oder Ribozyme oder Oligonukleotide als auch durch niedermolekulare Verbindungen eine Inhibition der L119-Aktivität bzw. der Aktivität des Proteins mit der Sequenz SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 einem ihrer funktionellen Äquivalente erreicht werden.
Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 oder eines ihrer funktionellen Äquivalente oder daraus abgeleitete komplementäre Nukleinsäuresequenzen können zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden. Diese dienen bevorzugt der Therapie und Prophylaxe von menschlichen und tierischen Erkrankungen, besonders bevorzugt der Therapie und Prophylaxe von menschlichen Erkrankungen, ganz besonders bevorzugt der Therapie und Prophylaxe von endothelialen Erkrankungen nach obiger Definition, die durch Modulation oder Normalisierung der Genexpression von L119 positiv beeinflußt werden können.
Ebenso verwendet werden können Proteine, Proteinfragmente oder Peptide mit der Sequenz SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder Teilen davon oder einem ihrer funktionellen Äquivalente. Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten oder Antikörpergemischen gegen das Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder gegen das Proteinheteromer zur Herstellung von Arzneimitteln. Diese dienen bevorzugt der Therapie und Prophylaxe von menschlichen und tierischen Erkrankungen. Besonders bevorzugt der Therapie und Prophylaxe von menschlichen Erkrankungen, ganz besonders bevorzugt der Therapie und Prophylaxe von endothelialen Erkrankungen nach obiger Definition, die durch Modulation oder Normalisierung der Aktivität oder Menge von L119 Protein positiv beeinflußt werden können.
Verbindungen, die spezifisch an ein Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder eines ihrer funktionellen Äquivalente bzw. an eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2,4, 5, 22 oder 23 oder eines ihrer funktionellen Äquivalente binden, oder wenigstens eine wesentliche Eigenschaft oder die Expression eines L119 Proteins gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 oder eines ihrer funktionellen Äquivalente modulieren oder normalisieren, können zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden. Diese dienen bevorzugt der Therapie und Prophylaxe von menschlichen und tierischen Erkrankungen. Besonders bevorzugt der Therapie und Prophylaxe von menschlichen Erkrankungen, ganz besonders bevorzugt der Therapie und Prophylaxe von endothelialen Erkrankungen nach obiger Definition, die durch Modulation oder Normalisierung der Aktivität oder Menge von L119 Protein positiv beeinflußt werden können.
Eine Modulation oder Normalisierung von L229 bzw. eine Therapie und Prophylaxe von Erkrankungen, die durch Modulation oder Normalisierung der Aktivität oder Menge von L119 Protein positiv beeinflußt werden können unter Verwendung eines der oben beschriebenen Ansätze unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte, Proteine oder Verbindungen, läßt sich mit weiteren therapeutischen Ansätzen sinnvoll kombinieren. Sinnvolle Kombinationen umfassen solche mit Endothelinrezeptor-Antagonisten, Inhibitoren des Renin- Angiotensin-Systems wie Reninhemmern, Angiotensin II-Antagonisten und Angiotensin-Converting-Enzyme (ACE) Hemmern, Beta-Blockern, Diuretika oder VEGF Antagonisten. Sequenzen

Abbildungen

Fig. 1 Schematische Darstellung (nicht maßstabsgerecht) der Exon-Intron-Struktur des L119 Genes, basierend auf dem Sequenzvergleich der genomischen Sequenz der Maus mit den beiden neuen cDNA Spleißvarianten der Ratte. Die Exongrenzen in der genomischen Sequenz der Maus sind überhalb der schematisierten Darstellung von SEQ ID NO: 4 angegeben (A). Die cDNAs der Ratte sind als graue Vierecke dargestellt; der schwarze Teil repräsentiert das offene Leseraster (ORF). Über den Vierecken sind die Nukleotidpositionen, die den Exongrenzen entsprechen, eingezeichnet. In (B) ist SEQ ID NO: 1 schematisch dargestellt; in (C) ist SEQ ID NO: 2 schematisch dargestellt.
Fig. 2 Sequenzvergleich des L119 Proteins (human; SEQ ID NO: 6) mit den Proteinen ApoL und CG12_1.
Fig. 3 (A) Northern-Analyse, die ursprünglich die Induktion im Hippocampus und im Cortex mit MECS und Cycloheximid bestätigen sollte. Nach Stimulation wurde zu den angegebenen Zeitpunkten Gesamt-RNA aus dem Hippocampus oder dem Cortex der Ratte gewonnen. Die Konzentration und Reinheit der RNA wurde überprüft; für die Analyse wurden 20 µg RNA auf einem denaturierenden Gel aufgetrennt. Man beachte die gleiche Induktion bei der Kontrolle nur mit Cycloheximid. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet.
(B) Northern Analyse zur Untersuchung der Induktion von L119 durch entweder MECS oder Cycloheximid allein. Nach der Stimulation wurde zu den angegebenen Zeitpunkten Gesamt-RNA aus dem Hippocampus oder dem Cortex der Ratte gewonnen. Die Konzentration und Reinheit der RNA wurde überprüft; für die Analyse wurden 20 µg RNA auf einem denaturierenden Gel aufgetrennt. Man beachte die schnelle und transiente Induktion von L119 mRNA mit MECS und die Superinduktion mit Cycloheximid (mmecs = multipler massiver elektrokonvulsiver Schock).
Fig. 4 Nachweis eines spezifischen, induzierbaren Signals in Ratten mittels In situ-Hybridisierung unter Verwendung einer Digoxigenin-markierten Antisense-Ribonukleotidsonde. Die linke obere Hälfte eines jeden Schnittes stellt ein Kontroll-Rattengehirn dar, die rechte untere Hälfte ist das Gehirn einer Ratte nach 4-stündiger mehrfacher Gabe von MECS und Cycloheximid (CHX).
(A) Das Signal wird im stimulierten Tier erzeugt.
(B) Das Signal lässt sich durch Vorbehandlung des Objektträgers mit RNase A zerstören.
(C bis F) Das Signal lässt sich durch steigende Konzentrationen an unmarkierter Ribonukleotidsonde (C: 2x, D: 5x, E: 20x, F: 50x) zum Verschwinden bringen.
Fig. 5 L119 mRNA Induktion im Gehirn der Ratte. Gyrus dentatus (A) und Cerebellum (B) einer Kontrollratte zeigen keine spezifische Anfärbung mit einer L119-spezifischen Sonde in der In situ Hybridisierung. Ein Signal kann sowohl in Gyrus Dentatus (C) als auch Cerebellum (D) durch Behandlung mit Cycloheximid (CH) induziert werden. (E, F): Nähere Untersuchung der in situ Hybridisierung eines Rattengehirns zeigt, dass das Färbemuster einer Expression in den Blutgefäßen entspricht. (Vergrößerung: A bis D 50x; E, F 125x)
Fig. 6 In situ Hybridisierung an einer Gewebepräparation angereichert mit Mikrogefäßen aus dem Rattenhirn. Die Präparation wurde sowohl aus Kontroll-Ratten (A, B) als auch aus Ratten, die zuvor mit Cycloheximid (CHX) behandelt wurden, (C bis F) durchgeführt. (Vergrößerung: 125x)
Fig. 7 Die Expression von L119 ist nicht auf das Blutgefäßendothel des Gehirns beschränkt. Die mRNA ist mittels in situ-Hybridisierung auch nachweisbar in der Nebenniere (A), der Niere (B), der Leber (C), der Milz (D), der Lunge (E) und der Retina (F) von mit Cycloheximid (CHX) behandelten Ratten (rechte Seite), währenddessen sich keine Signale in den entsprechenden Geweben von Kontrollratten nachweisen ließen (linke Seite)([i: Kontrollratte; ii: Cycloheximid-stimulierte Rattel (Vergrößerung: A bis E 50x, F 125x).
Fig. 8 L119 wird basal während der Ontogenese exprimiert. Hirne 10 Tage alter Ratten, die mit Cycloheximid (CHX) stimuliert worden waren, zeigten sehr starke Signale in vaskulärem Endothelium (B). Im Gegensatz zu adulten Tieren war bei diesen Tieren aber eine signifikante basale Expression von L119 mRNA zu beobachten (A).
Fig. 9 Northern Blot Analysen von Rattenhirnen verschiedenen Alters (Embryo-Tag 9,5 bis adult) detektierten basale L119 mRNA Expression in allen analysierten Stadien. Die stärksten Signale wurden erhalten zwischen postnatalen Tagen 8 und 21.
Fig. 10 Untersuchung des L119 mRNA Expressionsmuster in humanen Organen im basalen Zustand. Ein Blot mit poly(A)⁺ RNA von 12 verschiedenen Organen (Clontech) wurde mit radioaktiven Sonden für L119 und S26 (ribosomales Protein der kleinen Untereinheit) hybridisiert. Signale wurden von allen untersuchten Organen erhalten, darunter starke von Herz, Skelettmuskulatur, Placenta, Lunge und Niere. Die Größe der detektierten L119 mRNA in allen Organen war etwa 4,5 kb. In den Spuren mit den stärksten Signalen (Skelettmuskulatur, Herz und Plazenta) waren zusätzliche Banden anderer Größe zu sehen (Größen von etwa 5 bis 6 kb bzw. 3 kb). Beladung der Spuren des Blots 1: Hirn, 2: Herz, 3: Skelettmuskel, 4: Colon, 5: Thymus, 6: Milz, 7: Niere, 8: Leber, 9: Dünndarm, 10: Placenta, 11: Lunge, 12: Periphere Blutleukozyten.
Fig. 11 Die L119-mRNA Expression wird in 9L-Glioblastom-Tumoren, die im Unterschenkel von Ratten wachsen, nach oben reguliert (A, C). Die L119-Expression lässt sich in diesen Tumoren durch Vorbehandlung des Tiers mit Cycloheximid weiter induzieren (B, D). Die L119 Expression in diesen Tumoren lokalisiert offensichtlich im Blutgefäßendothel (Pfeile in E bis H).
Fig. 12 Die L119-mRNA Expression wird in 9L-Glioblastom-Tumoren nach oben reguliert, die in Gehirne adulter Ratten implantiert wurden. Winzige Tumormassen wurden in den linken Ventrikel der Gehirne adulter Ratten implantiert und 8 (A, C) oder 18 (B, D) Tage vor der Tötung der Tiere wachsen gelassen. Die Schnitte wurden entweder einer Nissl-Färbung (A, B) oder einer in situ-Hybridisierung (C, D) unter Verwendung einer L119-Antisense-Ribonukleotidsonde unterworfen. (Vergrößerung: 50x)
Fig. 13 Subzelluläre Fraktionierung von rL119 nach Expression in HEK 293 Zellen. 48 h nach Transfektion von HEK 293 Zellen mit L119-myc-His (A) bzw. Flag-L119 (B) sowie den entsprechenden leeren Kontrollplasmiden pcDNA- mycHis und pRK5 wurden die Zellen nach hypotonem Schock durch 25maliges Aufziehen der Zellsuspension durch eine 23 Gauche Kanüle aufgeschlossen und ein Zellkern- haltiges 1000 g Präzipitat, ein 100 000 g Präzipitat (Mem) und ein 100 000 g Überstand (Cyto) hergestellt. Aus dem 1000 g Präzipitat wurde ein nuklearer Extrakt (NE) durch Extraktion mit 0,42 M NaCl-Puffer gewonnen (Zellfraktionierung beschrieben in: Scheek S. et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 94, 11179-83). Die subzellulären Fraktionen wurden mittels Western-Blot Analyse auf ihren L119-Gehalt untersucht. Als Antikörper wurden ein Antimyc-Antikörper (Invitrogen) sowie ein anti-M2-Flag-Antikörper (SIGMA-Aldrich) verwendet. Eine L119-spezifische Bande wurde ausschließlich in der 100 000 g Membranfraktion detektiert.
Fig. 14 COS-7-Zellen wurden transient entweder mit einem leeren pRK5-Vektor (A) oder mit pRK-5-FL-L119 (B, C) transfiziert. Die Zellen wurden für 48 h weiterkultiviert, anschließend mit 4% PFA fixiert und mit Triton X-100 permeabilisiert. Die Zellen wurden mit einem Kaninchen-anti-L119-Primär-AK und darauffolgend mit einem anti-Kaninchen-FITC-Sekundär-AK gefärbt.
Fig. 15 L119 interagiert in vitro mit myc-Notch 1. Diese Wechselwirkung hängt von der Kotransfektion der Transgen- Konstrukte in die gleiche Zellpopulation ab. HEK 293- Zellen wurden mit L119 und entweder myc-Notch 1 oder leerem Vektor kotransfiziert. Eine Koimmunfällung mit Notch1-AK wurde durchgeführt. Der Western-Blot wurde mit einem Kaninchen-anti-L119-AK sondiert.
Fig. 16 L119 interagiert in vitro mit myc-Neuropilin 1. Ein Immunfällungsexperiment wurde an transient transfizierten COS-7 Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden mit L119 und entweder dem leeren Vektor (A), myc-FL-Npn-1 (B), myc-ΔA- Npn-1 (C), myc-ΔB-Npn-1 (D) oder myc-ΔC-Npn-1 (E) kotransfiziert. Eine Koimmunfärbung unter Verwendung von anti-myc-mAK wurde durchgeführt. Der Western-Blot wurde mit einem Kaninchen-anti-L119-AK sondiert. Das unten stehende Neuropilin 1-Schema (F) zeigt die Art der Deletionen.
Fig. 17 Expression von L119-myc in HEK 293 Zellen. HEK 293 Zellen wurden 48 h nach der Transfektion mit L119-myc-His geerntet und nach Zellaufschluss eine 1000 g Zentrifugation durchgeführt. Der erhaltene Überstand wurde in einem denatuierenden Proteingel aufgetrennt. Je drei Gelspuren wurden mit Präimmunserum (A), dem erhaltenen Immunserum (7340) (B) und als Kontrolle mit einem Kaninchen-anti- myc-AK (Upstate Biotechnology) (C) sondiert.
Fig. 18 Identifizierung von ES-Zellen mit einem mutierten L119 Allel nach erfolgreicher homologer Rekombination mit einem L119 Knockout Konstrukt mittels PCR und Agarosegelelektrophorese. Eine Bande der erwarteten Größe wurde von genomischer DNA der ES-Zelllinien #308 und #341 amplifiziert, aber nicht von #307. In der ersten Spur wurde eine Negativkontrolle analysiert (PCR-Reaktion ohne ES-Zell-DNA). Als Marker wurde die 1-kb-Leiter von MBI Fermentas geladen. In den ES-Zellklonen #308 und #341 hat die gewünschte homologe Rekombination stattgefunden.
Fig. 19: Induktion der L119 mRNA Expression nach 1,5-stündiger Behandlung mit Cycloheximid (CHX) in den jeweils angegebenen Konzentrationen in primären mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC-L; Clonetics). ES wurden 350 000 Zellen pro 10 cm Platte ausgesät und in EGM-2MV Medium (Clonetics) kultiviert. Bis zum Erreichen der Konfluenz erfolgte jeweils nach 24 h ein Mediumwechsel. Die Zellen wurden für 24 h (A) bzw. 48 h (B) ohne Mediumwechsel weiterkultiviert und je drei Platten mit den angegebenen Konzentrationen an CHX für 90 min inkubiert. Nach RNA Präparation mit dem RNeasy Kit (Qiagen) wurden je 10 µg Gesamt-RNA durch Northern Blot Analyse hinsichtlich der L119 mRNA Expression untersucht. Als L119-Sonde wurde ein 2070 XhoI-HindIII cDNA-Fragment verwendet. Der Blot wurde mit einer S26-Sonde normalisiert (Daten nicht gezeigt).
Fig. 20 Induktion der L119 mRNA Expression nach Behandlung mit Cycloheximid (CHX), TNF-α und IL-1β in primären mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC-L). A: 250 µg/ml CHX, B: 25 nN TNFα, C: 10 ng/ml IL-1β, D: 100 ng/ml IL-1β. Die Zellen wurden mit 140 000 Zellen je 6 cm Platte in EGM-2-MV Medium ausgesät, für drei Tage kultiviert (Mediumwechsel nach jeweils 24 h) und für weitere 20 h in serumfreien EGM-Basalmedium (Clonetics) inkubiert. Die Zellen wurden 0, 30 bzw. 90 min mit CHX, TNF-α und IL-1β in den angegeben Konzentrationen behandelt und mittels Northern Blot Analyse hinsichtlich der L119 mRNA Expression untersucht. Als L119-Sonde wurde ein 2070 bp XhoI-HindIII cDNA-Fragment verwendet. Der Blot wurde mit einer S26-Sonde normalisiert (Daten nicht gezeigt).
Fig. 21 Stimulation der L119 mRNA Expression in Endothelzellen durch Hypoxie. A: L119 Expression in HMVE Zellen. B: Expression in RBE4 Zellen. Die Zellen wurden mit 140 000 Zellen je 6 cm Platte ausgesät, für drei Tage kultiviert (Mediumwechsel nach jeweils 24 h) und für weitere 20 h in serumfreien Basalmedium inkubiert. Anschließend wurden sie zwischen 0 und 180 min in einer Hypoxiekammer bei 37°C mit einem Gasgemisch aus 90% N₂, 5% CO₂ und 5% H₂ in Anwesenheit eines Katalysators (BBL GasPak Replacement Charges; Becton Dickinson, Kat. Nr. 4370303) begast. Nach RNA Präparation mit dem RNeasy Kit (Qiagen) wurden je 10 µg Gesamt-RNA durch Northern Blot Analyse hinsichtlich der L119 mRNA Expression untersucht. Als humane L119-Sonde wurde ein XhoI-HindIII cDNA-Fragment verwendet, als Rattensonde diente ein PCR-Fragment aus dem 3'-untranslatierten Bereich der L119 cDNA (Pos. 2260 bis 2920 der SEQ ID NO: 1). Der Blot wurde mit einer S26-Sonde normalisiert.
Fig. 22 Subzelluläre Lokalisation von L119-myc in YPEN-1 Zellen nach transienter Transfektion.
A: Transfektion mit einem L119-myc-His exprimierenden pEGFPΔEGFP-Vektor.
B: Transfektion mit pEGFPΔEGFP-Vektor (Vektorkontrolle).
Die Zellen wurden nach Lipofektion der Plasmide mit Lipofectamine Plus (GibcoBRL) für weitere 36 h in EGM-2-MV Medium kultiviert und anschließend in 3% Paraformaldehyd für 30 min fixiert. Die Immunfärbung wurde nach Permeabilisierung mit 0,15% Triton X-100 mit einem polyklonalen Antikörper gegen Ratten L119 (rL119) (2892), gefolgt von einem anti-Kaninchen IgG-FITC Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) durchgeführt.
Fig. 23 Subzelluläre Lokalisation von EGFP-L119 (A) und L119-EGFP (B) in YPEN-1 Zellen nach transienter Transfektion. Die Zellen wurden nach Lipofektion der Plasmide (A: pEGFPC1-L119 und B: pEGFPN1-L119) mit Lipofectamine Plus (GibcoBRL) für weitere 36 h in Vollmedium kultiviert und anschließend in 3% Paraformaldehyd für 30 min fixiert. Die Immunfärbung wurde nach Permeabilisierung mit 0,15% Triton X-100 mit einem polyklonalen Antikörper gegen rL119 (2892), gefolgt von einem anti-Kaninchen IgG- FITC Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) durchgeführt.
Fig. 24 Subzelluläre Lokalisation von EGFP-L119 (A) und L119-EGFP (B) in RBE4 Zellen nach transienter Transfektion. Die Zellen wurden nach Lipofektion der Plasmide (A: pEGFPC1-L119 und B: pEGFPN1-L119) mit Lipofectamine Plus (GibcoBRL) für weitere 36 h in Vollmedium kultiviert und anschließend in 3% Paraformaldehyd für 30 min fixiert. Die Immunfärbung wurde nach Permeabilisierung mit 0,15% Triton X-100 mit einem polyklonalen Antikörper gegen rL119 (2892), gefolgt von einem anti-Kaninchen IgG- FITC Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) durchgeführt.
Fig. 25 Western Blot Analyse mit verschiedenen polyklonalen L119-Antiseren. Die Seren der Kaninchen (Peptidantikörper: 2892 bis 2895; GST-Fusionsproteine 3841 und 3843) wurden in Western Blot Experimenten auf eine spezifische Reaktion mit heterolog exprimiertem L119 Protein getestet. Dazu wurden HEK 293 Zellen mit rL119-myc-His und humL119-myc-His (lange Form) und parallel mit dem entsprechenden Kontrollvektor (pcDNA3.1-myc-His-A) transient transfiziert. Die Zellen wurden nach 48 Stunden geerntet und ein 1000 g Überstand hergestellt. Diese Proteinfraktion wurde auf einem denaturierenden Proteingel aufgetrennt und geblottet. Als Zweitantikörper für die polyklonalen L119-Seren diente ein HRP-konjugierter anti-Kaninchen IgG Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc). ES wurde eine Kontrollhybridisierung mit einem anti-myc Antikörper (Biomol) durchgeführt, um die L119-spezifischen Banden zu identifizieren.
Fig. 27 Panel 1 bis 7 DNA-Sequenzvergleich von L119 genomischer Sequenz der Maus (obere Sequenz; SEQ ID NO: 4) mit cDNA Sequenz der Ratte (untere Sequenz; SEQ ID NO: 2).
Fig. 28 DNA-Sequenzvergleich von L119 genomischer Sequenz der Maus (obere Sequenz; SEQ ID NO: 4) mit Teilen der cDNA Sequenz der Ratte (untere Sequenz; SEQ ID NO: 1).
Fig. 29 Panel 1 bis 18 DNA-Sequenzvergleich von L119 genomischer Sequenz des Menschen (obere Sequenz; SEQ ID NO: 22) und der Maus (untere Sequenz; SEQ ID NO: 4).

Beispiele

Die Erfindung wird in den folgenden Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher erläutert.

Allgemeine Methoden

Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, Biochemistry, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 oder Ausubel F. M. et al., (1998) Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley & Sons) beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz- DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).
Als weitere Methoden kamen routinemäßig zum Einsatz:

a) Polymerase-Kettenreaktionen
Polymerase-Kettenreaktionen wurden in einem GeneAmp PCR System 9700 der Firma PE Applied Biosystems (Norwalk, CT, USA) durchgeführt. Taq-DNA Polymerase (Cat. No. 10342-020) wurde von Life Technologies GmbH (Eggenstein, Deutschland) bezogen. PCR-Bedingungen wurden nach den Empfehlungen des Taq Polymerase-Herstellers im Begleitheft (Basic PCR Protocol) unter Benutzung der mitgelieferten "10X PCR Buffer minus Mg" gewählt. Die Endkonzentration des Buffers war 1 ×, die Konzentration der dNTP-Mischung (Cat. No. 1969064, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) war jeweils 0,2 mM, die MgCl₂ Konzentration war 1,5 mM, die Konzentration der beiden PCR-Primer war je 0,5 W. Das Endvolumen der PCR- Reaktion betrug 50 µl.
b) Reverse Transkription
Reverse Transkription zur Herstellung von Erststrang-cDNA wurde mit SUPERSCRIPT II RNase H-Reverse Transcriptase (Cat. No. 18064-014; Life Technologies GmbH, Eggenstein, Deutschland) nach dem im Begleitheft angegebenen Protokoll ("First strand cDNA synthesis using SUPERSCRIPT II for RT-PCR" durchgeführt. Zur Synthese wurde 5 µg Gesamt-RNA eingesetzt.
c) RNA-Extraktion
Gesamt-RNA aus Zellen und Geweben wurde nach dem Protokoll "Single step RNA isolation from cultured cells or tissues: Basic Protocol" in Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, Supplement 36 (1996), S. 4.2.1.-4.2.2. und 4.2.6-4.2.7. (John Wiley and Sons) isoliert.
d) Northern Blot
Für Northern Blot Experimente wurden 10 µg Gesamt-RNA verwendet. Die RNA wurde auf einem denaturierenden Agarose- Formaldehyd-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und danach auf eine Nylon-Membran (Hybond N+, Cat. No. RPN2222B, Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) übertragen. ES wurde nach den Protokollen in Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, Supplement 37 (1997), Seiten 4.9.2.-4.9.8. (John Wiley and Sons) verfahren.
e) Southern Blot
Für Southern Blot Experimente wurden 10 µg DNA verwandt. Die DNA wurde auf einem Agarose Gel elektrophoretisch aufgetrennt und danach auf eine Nylon-Membran (Hybond N+, Cat. No. RPN2222B, Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) übertragen. ES wurde nach den Protokollen in Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, Supplement 21 (1993), S. 2.9.2.-2.9.6. (John Wiley and Sons) verfahren.
f) Radioaktive Markierung von DNA Fragmenten
Geeignete DNA Fragmente (20 ng) wurden mit dem Rediprime II Kit (Kat. Nr. RPN 1633, Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) unter Einbau von ³²P-αdCTP (Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) nach dem Protokoll im Begleitheft des Kits radioaktiv markiert. Das markierte DNA-Fragment wurde von nicht inkorporierter Radioaktivität mittels Biospin P6 (Kat. Nr. 732-6002; BioRad Laboratories GmbH München) Chromatographie nach dem Protokoll im Begleitheft gereinigt.
g) Hybridisierung von Nylon-Filtern mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten
Nylon-Filter mit immobilisierter DNA oder RNA wurden nach den Protokollen in Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, Supplement 21 (1993), S. 2.10.2.-2.10.3. (John Wiley and Sons) mit den folgenden Änderungen hybridisiert. Als Hybridisierungspuffer wurde verwendet: 7% SDS, 250 mM Natriumphosphat (pH 7,2), 1 mM EDTA. Die Hybridisierung wurde bei 68°C über Nacht in einem Hybridisierungsofen (OV3, Biometra) in einer rotierenden Glasröhre durchgeführt. Die Filter wurden in der Röhre mit auf 68°C vorgewärmten Lösungen gewaschen: zweimal 10 min mit 5 × SSC/0,1% SDS und zweimal 10 min mit 2 × SSC/0,1% SDS. Die gewaschenen Filter wurden in SaranWrap-Folie eingeschlagen und auf Imaging Plates (Fujifilm, BAS-IP MS 2040) exponiert und in einem Phosphoimager gescannt (FLA 2000, Fuji) und anschließend quantifiziert.
h) Digoxygenin-markierte Riboproben
Zur Herstellung der Antisense-Riboproben wurde pBS(SK)-L119 mit Not I linearisiert, für die Sense-Probe wurde mit Acc651I geschnitten. Die linearisierten DNA-Fragmente wurden zweimal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, gefolgt von einer Extraktion mit Chloroform/Isoamylalkohol. Die DNA wurde über Nacht mit Ethanol präzipitiert, zweimal mit 70% Ethanol gewaschen und auf 0,5 mg/ml in TE resuspendiert. Die in vitro Transkription wurde mit dem Ambion Maxiscript T3/T7 Kit (Kat. Nr. 1324) und dem Digoxigenin RNA Labeling Mix (Roche Diagnostics; Kat. Nr. 1277073) durchgeführt. Für eine 20-µl- Markierungsreaktion (entsprechend den Angaben des Herstellers) wurden 1 µg Template-DNA eingesetzt und der Reaktionsansatz für 2 h bei 37°C inkubiert. Die Template DNA wurde anschließend durch Zugabe von 2 µl RNase-freier DNase I (Roche Diagnostics; Kat. Nr. 776785) für 20 min bei 37°C abgebaut. Nicht eingebaute NTPs wurden über eine Quant G-50 Spin Column (Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH; Kat. Nr. 27-5335-01) abgetrennt. Zur Qualitätskontrolle sowie zur Mengenbestimmung wurde 1/10 der Riboproben auf einem 1% TBE-Agarosegel aufgetragen.
i) In situ-Hybridisierungen
Gewebepräparation
Das Gewebe wurde in Tissue-Tek/OCT (Sakura; Kat. Nr. 4583) eingebettet und in einem Ethanol-Trockeneisbad schockgefroren. Anschließend wurden 20 µm Kryoschnitte angefertigt und auf Superfrost-Plus Objektträger aufgezogen. Die Schnitte wurden für 20 min luftgetrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
Die Schnitte wurden darauffolgend in 4% Paraformaldehyd-PBS (PFA von Sigma-Aldrich; Kat. Nr. P6148) für 20 min fixiert, anschließend dreimal für 5 min bei RT mit PBS und einmal mit H₂O gewaschen. Zur Acetylierung wurde eine 1%ige (v/v) Triethanolamin-Lösung (TEA von Sigma-Aldrich; Kat. Nr. T1377) in Wasser hergestellt und die Objekträger eingetaucht. Sofort anschließend wurde tropfenweise Acetanhydrid (Sigma-Aldrich; Kat. Nr. A6404) bis zu einer Endkonzentration von 0,25% zugegeben. ES wurde danach zweimal für 5 min mit PBS und zweimal mit 2 × SSC gewaschen.
Prähybridisierung
Die Schnitte wurden zunächst für 2 Stunden bei RT mit je 100 µl Hybridisierungspuffer (Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Kat. Nr. RPN3310) unter einer Parafilm-Abdeckung inkubiert.
Hybridisierung
Zu 100 µl Hybridisierungspuffer wurden 100 ng der markierten Riboprobe gegeben, für 7 min bei 85°C denaturiert und für 10 min auf Eis abgeschreckt. Die Schnitte wurden über Nacht bei 55°C in Hybridisierungslösung unter Parafilm inkubiert. Danach wurde für 10 min mit 2 × SSC bei RT und einmal für 10 min bei 55°C gewaschen. Anschließend wurde für 30 min. mit, 2 × SSC/50% Formamid bei 55°C und darauf folgend für 5 min. mit 0,2 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
Immunologische Detektion
Die Schnitte wurden für 20 min bei Raumtemperatur in Puffer 1 (100 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, pH 7,5) äquilibriert und anschließend für 1 h mit 0,5% Casein (NEN, Kat. Nr. 734A) in Puffer 1 geblockt. Nach 5-minütigem Waschen in Puffer 1 wurde für 2 h mit einem Alkalische Phosphatase gekoppelten anti-DIG-Antikörper (Roche Diagnostics, Kat. Nr. 1093-274) in einer 1 : 5000 Verdünnung inkubiert. Nach zweimaligem 15-minütigem Waschen mit Puffer 1 wurden die Schnitte für 10 min in Puffer 2 (100 mM Tris-HCl, 100 mM Nacl, 5 mM MgCl₂, pH 9,5) äquilibriert. ES wurden 10 ml Puffer 2 mit 34 µl NTB (Roche Diagnostics, Kat. Nr. 1383-213), 35 µl BCIP (Roche Diagnostics, Kat. Nr. 1383-221), 2,4 mg Levamisole (Sigma-Aldrich, Kat. Nr. L9756) gemischt und die Gewebeschnitte bis zur Farbentwicklung (über Nacht) in dieser Lösung inkubiert. Zur Dehydratisierung wurden die Schnitte in folgender Weise gewaschen: 2 min mit PBS, 2 min in H₂O, 2 min in 30% Ethanol, 2 min in 70% Ethanol, 2 min in 95% Ethanol, 2 × 2 min in 100% Ethanol und 2 × 2 min in Xylen. Die Schnitte wurden danach mit Permount (Fisher Scientific, Kat. Nr. SP15-10) unter Deckgläsern eingebettet.
j) Nissl-Färbung
Gewebeschnitte wurden für 2 min in 0,5% wässriger Cresylviolet-Lösung (EM Sciences, Kat Nr. CX2065-1) inkubiert und danach überschüssiger Farbstoff durch 3 maliges Eintauchen des Objekträgers in H₂O ausgewaschen. Anschliesend wurde in 70% Ethanol bis zur gewünschten Farbintensität entfärbt. Zur Dehydratisierung der Schnitte wurde in folgender Weise gewaschen: 2 min mit PBS, 2 min in H₂O, 2 min in 30% Ethanol, 2 min in 70% Ethanol, 2 min in 95% Ethanol, 2 × 2 min in 100% Ethanol und 2 × 2 min in Xylen. Die Schnitte wurden anschließend mit Permount (Fisher Scientific, Kat. Nr. SP15-10) unter Deckgläsern eingebettet.
k) Transiente Transfektionen
Calcium-Phosphat-Transfektionen von COS und HEK 293 Zellen
Für die Transfektionen wurden 10 µg DNA mit 50 µl 2,5 M CaCl₂ und 450 µl H₂O gemischt. Die DNA-Lösung wurde unter Mischen tropfenweise zu 500 µl 2 × BBS (50 mM BES (Sigma-Aldrich; B9879 o. B6266), 280 mM NaCl; 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,03 bei RT) pipettiert. Die DNA-Lösung wurde tropfenweise auf eine 60 bis 70% konfluente 10 cm Schale mit 10 ml Kulturmedium gegeben. Die Zellen wurden für 8 bis 20 h in einem 3% CO₂-Inkubator und anschließend bis zur Verwendung für weitere 24 bis 48 h in einem 5% CO₂-Inkubator kultiviert.
l) Western Blot Analyse
Proteinproben wurden in 12%igen denaturierenden SDS-Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt und mittels einer Semi-Dry- Blottingkammer (Biometra) in Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, 150 mM Glyzin, 10% Methanol, pH 8,3) für 60 bis 90 min auf eine Nitrozellulosemembran (Protran BA79, Schleicher und Schuell) geblottet. Die Membran wurde zur Kontrolle mit Ponceau S-Lösung reversibel gefärbt und für 60 min in PBS/0,02% Tween20 mit 5% Magermilchpulver geblockt. Polyklonale L119-Antikörper wurden in einer 1 : 1000 Verdünnung eingesetzt, der anti-myc Antikörper (Invitrogen, Kat. Nr. R950-25), sowie der anti-Flag-M2 Antikörper (Sigma- Aldrich, Kat. Nr. F3165) wurden in einer 1 : 2000 Verdünnung verwendet. Die Inkubationen wurden für 1 h in Blocking-Puffer durchgeführt. Nach dreimaligem Waschen für jeweils 10 min in PBS/0,02% Tween20 wurden die Membranen mit HRP-konjugierten anti-Kaninchen bzw. anti-Maus-IgG Antikörpern (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) für 20 min in einer 1 : 4000 Verdünnung in Blocking-Puffer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen für 15 bis 20 min in PBS/0,02% Tween20 wurden die Membranen für 5 min in SuperSignal (Pierce, Kat. Nr. 34080) geschwenkt. Die Detektion der Chemilumineszenz-Signale erfolgte mit Hyperfilm-ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Kat. Nr. RPN2103K).

Beispiel 1

L119 genomische Sequenz der Maus

Mit zwei Primern (SEQ ID NO: 8 und 9) aus dem kodierenden Bereich von L119 der Ratte wurde ein 329 bp langes Fragment aus Hirn-cDNA der Maus amplifiziert. Zur Gewinnung der cDNA wurde Maushirn- Gesamt-RNA nach dem Protokoll "RNA-Extraktion" (s. o.) gewonnen und 5 µg davon nach dem Protokoll "Reverse Transkription" (s. o.) in cDNA umgeschrieben. Die zur Amplifikation der Maus-Sonde benutzten Primer waren:
Die PCR wurde nach dem Protokoll "Polymerase-Kettenreaktionen" mit folgenden Modifikationen durchgeführt: 50 ng cDNA, mit 3 min 96°C initialer Denaturierung und 30 Zyklen mit 30 sec 96°C Denaturierung, 30 sec 64°C Annealing und 30 sec 72°C Elongation.
Das erhaltene Fragment wurde nach dem Protokoll "Radioaktive Markierung von DNA Fragmenten" (s. o.) markiert und zur Hybridisierung einer genomischen Cosmid-Bibliothek der Maus (RZPD library No. 121; 129/ola mouse cosmid, RZPD Berlin; Deutschland) eingesetzt. Die Hybridisierung erfolgte nach dem Protokoll "Hybridisierung von Nylon-Filtern mit radioaktiv markierten DNA- Fragmenten". Ein Klon gab ein stark positives Signal mit der verwendeten Sonde. Von einem positiven Klon wurde Cosmid-DNA isoliert (large construct kit; Cat. No. 12462; Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) nach dem Protokoll im Begleitheft des Kits (Version 06/99). Dieser Klon wurde als L119-positiv verifiziert mittels verschiedener Restriktionsverdaus und Hybridisierungen mit L119 Sonden (durch Vergleiche der erhaltenen Bandenmuster mit denen von genomischer DNA von Mäusen). Aus dem Cosmid wurden verschiedene Fragmente in einen Plasmidvektor subkloniert und mittels eines Transposon-Insertionsverfahrens (GPS-1, New England Biolabs, Beverly, MA; USA) sequenziert und die Sequenzen mit dem Programm SeqMan (Lasergene, Madison, WI, USA) assembliert.
Die genomische Sequenz von L119 der Maus ist in SEQ ID NO: 4 dargestellt. Die Proteinsequenz von L119 der Maus ist in SEQ ID NO: 24 dargestellt. Aus dem Vergleich der genomischen Sequenz der Maus und der cDNA-Sequenz der Ratte geht hervor, dass der kodierende Bereich für das L119 Protein der Maus (längstes offenes Leseraster; vom Startcodon bei Position 10736 bis 10738 bis zum Stoppcodon bei Position 11474 bis 11476 in SEQ ID NO: 4) nicht durch Introns unterbrochen ist. Während der kodierende Bereich zwischen Maus und Ratte sehr stark konserviert ist, finden sich im 3'-flankierenden Bereich teilweise sehr hohe Sequenzunterschiede (s. Fig. 27).
Beispielsweise findet man beim Vergleich der Sequenzen bei Position 11645 der SEQ ID NO: 4 eine Insertion von 275 bp in der cDNA der Ratte, für die es keine Entsprechung in der genomischen Sequenz der Maus (SEQ ID NO: 4) gibt. Der Bereich von Position 12004 bis 12076 ist ebenfalls nicht konserviert. Interessanterweise sind dennoch 7 der 8 in der Ratten cDNA gefundenen AUUUA- Motive (siehe oben) in der Maus konserviert.

Beispiel 2

Neue Spleißvarianten von L119 der Ratte

Zur Suche nach neuen Spleißvarianten von L119 wurde eine Ratten- Hippocampus λ-Phagen Bibliothek (im Vektor Lambda ZAP II; Firma Stratagene) von Tieren nach MECS-Stimulation und Gabe von Cycloheximid; beschrieben bei Worley et al. (WO 99/40225) mit dem oben genannten 329 bp langen Fragment aus dem kodierenden Bereich von L119 durchmustert. Etwa 500 000 Klone der Phagenbank wurden nach dem Protokoll "Plating and transferring bacteriophage libraries: Basic protocol" in Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, Supplement 34 (1996), S. 6.1.1.-6.1.4. (John Wiley and Sons) auf Nylonmembranen übertragen und mit der L119-spezifischen Sonde (Herstellung und Markierung siehe oben) nach dem Protokoll "Hybridisierung von Nylon-Filtern mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten" (s. o.) hybridisiert. Aufgrund der Stimulation der Tiere mit Cycloheximid enthält die Bank eine Vielzahl an L119-Klonen. Die in der Hybridisierung positiven Klone wurden nach dem Protokoll "Purification of bacteriphage clones: Basic protocol" in Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, Supplement 13 (1987), Seiten 6.5.1.-6.5.2. (John Wiley and Sons) vereinzelt. Die die cDNA enthaltenden Phagemiden wurden mittels Rapid excision kit (Cat. No. 211204; Stratagene, CB Amsterdam Zuidoost) nach dem Protokoll im Begleitheft in vivo ausgeschnitten. Die Inserts wurden mittels eines Transposon- Insertionsverfahrens (GPS-1, New England Biolabs, Beverly, MA; USA) sequenziert, und die Sequenzen mit dem Programm SeqMan (Lasergene, Madison, WI, USA) assembliert und einer Sequenzanalyse unterworfen. Sequenzvergleiche mit der L119 cDNA der Ratte zeigten, dass zwei Klone signifikant längere 5'-Enden hatten (die beide voneinander verschieden waren; SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2). Interessanterweise zeigten die beiden 5'-Enden sehr hohe Sequenzhomologie zu zwei Regionen genomischer Sequenz der Maus (SEQ ID NO: 4), die sich weiter 5' upstream von der kodierenden Sequenz befinden (Fig. 27 und Fig. 28; vergleiche auch Fig. 1). Dabei fanden sich perfekte Spleißdonor und -Akzeptorsequenzen (vergleiche Alberts B. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, New York) an den Abbrüchen der Sequenzhomologien der genomischen Sequenz der Maus mit den Ratten cDNA Klonen. Demzufolge stellen die beiden isolierten cDNA Sequenzen zwei alternative Spleißvarianten von L119 der Ratte dar. Im 3'-untranslatierten Bereich wurde im cDNA Klon SEQ ID NO: 1 eine 76 bp lange Insertion (Positionen 2427 bis 2502) gefunden, die bei den anderen cDNA Klonen der Ratte nicht enthalten ist. Folgende Sequenzunterschiede wurden in SEQ ID NO: 1 gefunden, verglichen mit der Sequenz in WO 99/40225: Position 1443: A statt G, Position 1557: A statt G, Position 1882; C statt T, Position 2884: C statt T, Position 2973: A statt G, Position 3090: C statt T sowie eine Insertion von 8 Nukleotiden bei Position 2531 (die Angaben der Positionen beziehen sich auf SEQ ID NO: 1).
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung (nicht maßstabgerecht) der Exon-Intron-Struktur des L119 Genes, erhalten aufgrund des Sequenzvergleichs der genomischen Sequenz der Maus (Fig. 1A; SEQ ID NO: 4) mit den beiden neuen cDNA Spleißvarianten der Ratte (SEQ ID NO: 1 in Fig. 1B und SEQ ID NO: 2 in Fig. 1C). Die Exons wurden mit 1 bis 3 durchnumeriert entsprechend ihrer Lage in der genomischen L119 Sequenz der Maus (SEQ ID NO: 4). Wie aus der Abbildung ersichtlich ist, wird Exon 2 in der cDNA SEQ ID NO: 1 benutzt, in SEQ ID NO: 2 dagegen nicht. Die Exongrenzen in der genomischen Sequenz der Maus sind überhalb der schematisierten Darstellung von SEQ ID NO: 4 angegeben. Die cDNAs der Ratte sind als graue Vierecke dargestellt; der schwarze Teil repräsentiert das offene Leseraster (ORF). Über den Vierecken sind die Nukleotidpositionen, die den Exongrenzen entsprechen, eingezeichnet.
Die translatierte Sequenz des längsten offenen Leserasters der beiden neuen Spleißvarianten des Ratten L119 (die in beiden Spleissvarianten SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 identisch ist) ist in SEQ ID NO: 3 dargestellt. Profildatenbank-Suchen ergaben signifikante Identitäten (26%) über einen Bereich von 97 Aminosäuren mit humanem Apolipoprotein L, einem neuen HDL Lipoprotein (ApoL, Duchateau P. N. et al. (1997) J Biol Chem 272, 25576-25582; EMBL-Datenbankeintrag AF019225) und 28% zu einem TNFalpha- induzierbaren Gen (CG12_1; Horrevoets A. J. et al. (1999) Blood 93, 3418-3431; EMBL-Datenbankeintrag AF070675). In Fig. 2 dargestellt ist ein multiples Alignment der Bereiche von Aminosäuren 114 bis 210 von ApoL mit den Aminosäuren 73 bis 166 von CG12 1 und Aminosäuren 58 bis 154 von SEQ ID NO: 6. Die konservierten Aminosäuren sind schwarz, die Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften grau umrandet. Das gezeigte Alignment ist trotz der nicht sehr hohen Identitäten von Relevanz, da sich die konservierten Aminosäuren in einer Gruppe von bisher unbeschriebenen menschlichen Proteinen wiederfinden. Das Alignment wurde erstellt mit der Clustal- Methode des Programmes MegAlign in DNASTAR, Version 4.0.1., und dargestellt mit Boxshade von Dr. K. Hofmann (Köln). Programme zur Vorhersage von Transmembranregionen detektierten drei signifikante "Hits" mit unterschiedlichen "Scores": Aminosäuren 77 bis 93 (Programm PSORTII; WWW-Version 1. 12. 1998 von Dr. K. Nakai) bzw. Aminosäuren 77-110 (Hofmann K. und Stoffel W. (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347, 166) sowie Aminosäuren 55 bis 85 und 157 bis 173 (Hofmann K. und Stoffel W. (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347, 166). Des weiteren finden sich signifikante Scores zu einem Leucine-Zipper Motiv (Aminosäuren 15 bis 36 bzw. 22 bis 43. Für die Aminosäuren 37 bis 50 und 189 bis 220 wurden Coiled-Coil Strukturen vorhergesagt.

Beispiel 3

L119 kodierende Sequenz des Menschen

Mit der in SEQ ID NO: 4 dargestellten Sequenz wurde eine Homologiesuche der EMBL-Nukleotiddatenbank durchgeführt. Dabei wurde eine sehr hohe Ähnlichkeit mit einem Eintrag (AC007215; Release 62, last updated, Version 21; dated 21. Feb. 2000) von 131 ungeordneten Sequenzstücken des humanen BAC-Klones RPCI11-59H1 festgestellt. ES stellte sich nun die Frage, ob es sich bei der gefundenen Sequenz tatsächlich um das homologe Gen des Menschen handelt. Mit der bloßen Sequenzinformation des Datenbankeintrages AC007215 kann diese Frage nicht eindeutig beantwortet werden. Wenn man diese Sequenz mit der L119 genomischen Sequenz der Maus (SEQ ID NO: 4) vergleicht, stellt man fest, dass neben der kodierenden Sequenz vor allem im 5'-flankierenden Bereich Regionen mit teilweise sehr hoher Sequenzähnlichkeit zur Maus vorliegen. Einen weiteren Hinweis für die Identifizierung der humanen Sequenz als humanes L119 erhält man, wenn man die L119 Spleißvarianten der Ratte (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2) mit in den Sequenzvergleich einbezieht. Aus diesem Vergleich geht hervor, dass Exon 1 auch zwischen Maus und Mensch mit etwa 78% stark konserviert ist (inklusive der Spleißdonor- und -Akzeptorsequenzen) und sich im etwa gleichen Abstand zum kodierenden Exon, verglichen mit der genomischen Sequenz der Maus, befindet. Würde es sich bei der Sequenz in AC007215 um ein Pseudogen handeln, so dürfte dieses Exon in der AC007215-Sequenz nicht durch ein Intron von der kodierenden Sequenz getrennt sein. Die Identifizierung von Exon 1 ist aber aus der Sequenzinformation von AC007215 allein nicht möglich. Die Translatierung des zur kodierenden Sequenz der Maus homologen Sequenzabschnittes in AC007215 ergab ein offenes Leseraster von 297 Aminosäuren und damit 51 Aminosäuren länger in aminoterminaler Richtung als die Proteine in Maus und Ratte. Eine Überprüfung der Sequenzen aus Maus und Ratte ergab in diesen Spezies kein derartiges, im Aminoterminus verlängertes offenes Leseraster. Zur Überprüfung, ob die zu L119 ähnliche Sequenz im Datenbankeintrag AC007215 tatsächlich exprimiert wird, wurden PCR-Primer entworfen, die den gesamten kodierenden Bereich überspannen. Die zur Amplifikation der humanen L119 cDNA benutzten Primer waren:
Damit wurde eine RT-PCR aus cDNA von humaner Plazenta (aus mRNA der Firma Clontech) durchgeführt. Zur Erststrang-cDNA-Synthese wurde der SMART-RACE cDNA Amplification Kit von Clontech (Kat. Nr. K1811-1) entsprechend den Angaben des Herstellers (Protokoll Nr. PT3269-1; Version PR88571) verwendet. Dazu wurde als RNA-Template 1 µg der im Kit enthaltenen humanen Gesamt-RNA aus Placenta eingesetzt. Als Primer wurde der 3'-RACEcDNA Synthesis Primer (3'CDS: 5'-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3') verwendet. Das Reaktionsprodukt der Erststrangsynthese wurde 1 : 10 mit Tricine-EDTA-Puffer (SMART-RACE-Kit) verdünnt und als Template für die anschließende PCR-Reaktion verwendet. Dazu wurde ein 50 µl Ansatz aus 5 µl 10 × Cloned Pfu-Buffer (Stratagene); 2 µl dNTP-Mischung (5 mM; Cat. No. 1969064, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland); je 1 µl der Primer SEQ ID NO: 10 und 11 (Stock-Konz. 5 µM); 5 µl Erststrang-cDNA Template, 35 µl H₂O und 1 µl Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Stratagene) hergestellt und nach 3 minütiger Inkubation bei 96°C, 30 PCR-Zyklen entsprechend dem Temperaturprogramm: 30 sec Primer-Annealing bei 58°C, 70 sec Strangverlängerung bei 72°C und 30 sec Aufschmelzen der DNA- Doppelstränge bei 96°C, mit einem abschließenden Extensions- Schritt von 7 min bei 72°C durchgeführt. Danach wurden 1 µl des PCR-Reaktionsansatzes als Template für eine weitere PCR-Reaktion eingesetzt. Die Reaktion wurde analog zur ersten PCR-Reaktion durchgeführt. Das erhaltene PCR-Produkt wurde gelgereinigt, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI geschnitten, in den Expressionsvektor pcDNA3.1-myc/His-A (Invitrogen) subkloniert und sequenziert. Die Sequenz enthielt tatsächlich ein offenes Leseraster von 297 Aminosäuren (SEQ ID NO: 6). Das den Proteinen von Maus und Ratte entsprechende humane Protein mit 246 Aminosäuren ist in SEQ ID NO: 7 dargestellt. Verglichen mit der AC007215-Sequenz finden sich in SEQ ID NO: 5 ein Basenaustausch T statt C an Position 132, sowie ein Basenaustausch C statt T in Position 171, die aber nicht zu einer veränderten Proteinsequenz führen.
Zur Verifizierung der Expression der untersuchten humanen Sequenzen im 3'-flankierenden Bereich wurden verschiedene Primerpaare aus diesem Bereich in RT-PCR Reaktionen mit humaner Hippocampus-cDNA (aus mRNA der Firma Clontech) eingesetzt. In allen untersuchten Fällen wurden Banden amplifiziert, die die Expression der unterliegenden DNA-Sequenzen im humanen Hippocampus demonstrierten. Für die RT-PCR wurde humane Hirn-Gesamt- RNA (Cat. No. 64020-1; Firma Clontech Heidelberg, Deutschland) in cDNA umgeschrieben (Protokoll "Reverse Transkription". Alle PCR-Reaktionen wurden nach dem Protokoll "Polymerase-Kettenreaktionen" (s. o.) mit folgenden Bedingungen durchgeführt: 0,2 µl der cDNA in 15 µl Reaktionsvolumen mit 3 min 96°C initialer Denaturierung und 35 Zyklen mit 30 sec 96°C Denaturierung, 30 sec 62°C Annealing und 30 sec 72°C Elongation. Als Enzym wurde Advantage cDNA Polymerase Mix (Cat. No. 8417-1; Firma Clontech Heidelberg, Deutschland) unter Benutzung des mitgelieferten Reaktionspuffers (der bereits MgCl₂ enthielt) verwendet (keine Zugabe von zusätzlichem MgCl₂).

Die verwendeten Primerkombinationen und die entsprechend erhaltenen Fragmentgrößen waren:

a) hL119-1s und hL119-1as	416 bp
b) hL119-1s und hL119-2as	243 bp
c) hL119-2s und hL119-1as	438 bp
d) hL119-2s und hL119-2as	265 bp
e) hL119-3s und hL119-3as	405 bp
f) hL119-3s und hL119-4as	445 bp
g) hL119-4s und hL119-3as	316 bp
h) hL119-4s und hL119-4as	356 bp.

Benutzte Primer zur Amplifikation der humanen cDNA waren:

Beispiel 4

Flankierende genomische Sequenzen mit hohem Grad der Konservierung während der Evolution

Bestimmte Gensequenzen unterliegen während der Evolution im Vergleich zu anderen Abschnitten des Genomes einer geringeren Mutationsrate. Es kann davon ausgegangen werden, dass es sich dabei um funktionell besonders wichtige Sequenzen handelt, gegen deren Mutation ein besonderer Selektionsdruck herrscht. Wenn man nun Sequenzen eines genomischen Locus aus zwei verschiedenen Spezies vergleicht, so kann man auf diese Art die stärker konservierten Regionen finden. Im nichtkodierenden und flankierenden Teil wird es sich dabei u. a. um wichtige regulatorische Sequenzen handeln (siehe zum Beispiel Göttgens B. et al. (2000) Nat Biotechnol 18, 181-186). Diese schließen unter anderem ein: Elemente, die die Stabilität des Transkriptes und/oder die Translation beeinflussen; intronische Regulationselemente (Spleißregulatoren, Enhancer, Silencer); flankierende Enhancer, Silencer, Locus control regions, matrix attachment regions. Ein Sequenzvergleich der genomischen Sequenz der Maus von L119 (SEQ ID NO: 4) mit Teilen des EMBL Sequenzeintrages AC007215, der den humanen L119 Locus enthält (SEQ ID NO: 22), zeigte ausgedehnte konservierte Bereiche direkt 5' upstream von Exon 1 (Fig. 29). Es kann angenommen werden, dass es sich dabei um Promoterelemente und wichtige cis-regulatorische Bereiche handelt. Auch im 3'-flankierendem Bereich ließen sich konservierte Sequenzen finden.

Beispiel 5

Expression von L119 nach MECS und Cycloheximid- Applikation

Nach der Entdeckung der Induzierbarkeit der L119 Genexpression nach krampfauslösenden Stimuli wie multiple MECS unter Gabe von Cycloheximid (siehe Patentanmeldung Worley et al., WO 99/40225) sollte untersucht werden, welchen Einfluß Cycloheximid auf die Induktion der L119 mRNA Expression hat. Dazu wurden multiple MECS/Cycloheximid-behandelte Ratten mit Ratten, die entweder nur mit Cycloheximid (50 mg/kg Körpergewicht i. p.) oder mit MECS behandelt worden sind, nach der Induzierbarkeit von L119 verglichen. Nach Durchführung des Stimulationsprotokolls an Ratten mit MECS (massive electroconvulsive shock) (Worley P. F. et al. (1993) J Neurosci 13, 4776-4786) in Kombination mit Cycloheximid (Cole A. J. et al. (1990) J Neurochem 55, 1920-1927; Lanahan A. und Worley P. (1998) Neurobiol Learn Mem 70, 37-43) (oder nur eines der beiden Stimuli) wurde mRNA aus Hippocampus und Cortex aus diesen und Kontrolltieren nach dem Protokoll "RNA-Extraktion" (s. o.) gewonnen. Northern Blot Analysen (durchgeführt nach den Protokollen "Northern Blot" sowie "Radioaktive Markierung von DNA Fragmenten" und "Hybridisierung von Nylon-Filtern mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten"; s. o.) mit Sonden für L119 und GAPDH zeigten, dass sich in Kontrolltieren nur kaum detektierbare Mengen an L119 mRNA finden ließen. Als Sonde für L119 diente ein 329 bp langes PCR-Fragment (Beschreibung siehe oben). Eine GAPDH- Sonde für die Hybridisierung wurde mittels RT-PCR aus Ratten-Hirn Gesamt-RNA unter Anwendung der Protokolle "RNA-Extraktion", "Reverse Transkription" und "Polymerase-Kettenreaktionen" (s. o.) hergestellt. Bei der Polymerasekettenreaktion kamen nachfolgende Primer zum Einsatz:
Es galten ferner nachfolgende Bedingungen: 50 ng cDNA, mit 3 min 96°C initialer Denaturierung und 30 Zyklen mit 30 sec 96°C Denaturierung, 30 sec 56°C Annealing und 30 sec 72°C Elongation.
Überraschenderweise war die Induktion in den beiden untersuchten Geweben 4 Stunden nach Cycloheximid vergleichbar mit der Stimulation nach Kombination von Cycloheximid und multiplen MECS (Fig. 3A). In Fig. 3B ist ein vergleichender Northern Blot von L119 mRNA Expression nach einfacher MECS-Stimulation bzw. nach Gabe von Cycloheximid gezeigt. RNA von Hippocampus (links) und Cortex (rechts) der Ratten wurde zu den angegebenen Zeitpunkten nach Stimulation gewonnen. Die Analyse zeigte, dass jeder Stimulus für sich in der Lage war, L119 mRNA Expression in den angegebenen Organen zu induzieren. MECS-induzierte L119- Expression war sehr schnell, mit einem transienten Peak nach etwa 20 bis 30 Minuten nach dem Krampf und Rückkehr zur basalen Expression nach etwa 1 Stunde. Die Induktion nach Cycloheximid war ebenso schnell, stieg aber bis zum längsten analysierten Zeitpunkt von 6 Stunden nach Applikation weiter an und erreichte insgesamt wesentlich höhere Signalstärke.
Die zelluläre Auflösung der Expression von L119 nach systemischer Applikation von Cycloheximid war qualitativ identisch zur Induktion nach endogenen Stimuli (z. B. nach Auslösung von Krampfanfällen) und war nur in Blutgefäßen detektierbar. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung wurde keinerlei Induktion der L119 Genexpression in Zellkulturen nicht-endothelialen Ursprungs nach Cycloheximid-Applikation gesehen. Damit läßt sich L119- Induzierbarkeit als Markerfärbung für vaskuläre endotheliale Zellen verwenden. Eine weitere Anwendung der L119-Induzierbarkeit besteht darin, dass man beispielsweise in diesen Zellen geeignete (endogene) Stimuli zur Induktion der L119 Expression finden kann.
Eine Digoxygenin-markierte L119 Antisense Riboprobe, die nach den Angaben des Protokolls "Digoxygenin-markierte Riboproben" hergestellt wurde (s. o.), gab ein starkes, spezifisches und Cycloheximid-induzierbares Signal im Rattenhirn (Fig. 4A, rechte untere Hälfte). Die In situ Hybridisierungen für L119 erfolgten nach dem Protokoll "In situ Hybridisierungen" (s. o.).
Eine L119 Induktion im Hirn nach Cycloheximid ist in allen Hirnarealen nachweisbar. Fig. 5 zeigt exemplarische Färbungen mit Schnitten des Gyrus Dentatus (C, E) und Cerebellum (D, F). Dabei wurden alle auf den Schnitten befindlichen Kapillaren sowie auch Gefäße größeren Durchmessers (siehe Fig. 5E) angefärbt. Dieser Befund wurde auch durch L119 In situ Hybridisierungen von Hirn-Mikrogefäßpräparationen von Cycloheximid-behandelten und Kontrollratten bestätigt. Rattenhirne wurden vorsichtig in Medium (mit 5 mg/ml BSA) in einem Glass-Teflon Douncer homogenisiert und in Anwesenheit von 13% Dextran zentrifugiert. Das Pellet wurde vorsichtig resuspendiert und durch feine Netze (183 µm Porengröße) gefiltert. Gefäße, die von einem Filter mit 53 µm Porengröße zurückgehalten wurden, wurden konzentriert und auf Objekträgern gefriergetrocknet und einer In situ Hybridisierung entsprechend dem Protokoll "In situ Hybridisierungen" (s. o.) unterzogen. Präparationen von Kontrolltieren zeigten keine L119 Signale (Fig. 6A und B), währenddessen Gefäßpräparationen von Cycloheximid-behandelten Ratten sehr starke Signale in allen untersuchten Gefäßen, d. h. sowohl in größeren Gefäßen als auch Endstromgefäßen, gaben (Fig. 6C und D). Es wurde gezeigt, dass sich Zellen mit Induktionspotential von L119 durch Cycloheximid-Applikation und anschließenden L119 mRNA Nachweis identifizieren lassen können.
Als nächster Schritt wurde untersucht, ob Cycloheximid die L119 mRNA auch in anderen Organen außer dem Hirn induzieren kann. Dazu wurden nicht-radioaktive In-situ Hybridisierungen entsprechend dem Protokoll "In situ Hybridisierungen" (s. o.) an Organen Cycloheximid-behandelter Ratten und an Kontrollratten durchgeführt. L119 Signale sind spezifisch für den induzierten Zustand und für vaskuläres Endothelium in allen untersuchten Organen (Nebenniere, Niere, Leber, Milz, Lunge, Retina; Fig. 7). Neben Kapillaren färben auch Gefäße größeren Durchmessers in allen untersuchten Geweben (siehe besonders Fig. 7 Cii und Dii). In Nierenschnitten werden unter anderem Vas afferens, Vas efferens, Kapillaren innerhalb der Bowmann'schen Kapsel und auch Kapillaren, die sich entlang der Henle'schen Schleife ziehen, angefärbt, aber nicht die Epithelzellen selber. Mit diesen Nieren-Blutgefäßen, den Endothelzellen von Lunge (siehe Fig. 7 Eii) und Nebennierenrinde (Fig. 7 Aii) ist L119 in allen wichtigen Organen des Renin-Angiotensin-Aldosteron- Systems, einem wichtigen Regulator des Blutdruckes, exprimiert.
L119 wird basal während der Ontogenese exprimiert. Hirne 10 Tage alter Ratten, die mit Cycloheximid stimuliert worden waren, zeigten sehr starke Signale im vaskulären Endothelium. Im Gegensatz zu adulten Tieren war bei diesen Tieren aber eine signifikante basale Expression von L119 mRNA zu beobachten (Fig. 8). Systematische Northern Blot Analysen von Rattenhirnen verschiedenen Alters (Embryo-Tag 9,5 bis adult) detektierten Expression in allen Stadien. Die stärksten Signale wurden erhalten zwischen postnatalen Tagen 8 und 21 (Fig. 9).
Es sollte untersucht werden, wie das L119 mRNA Expressionsmuster in humanen Organen im basalen Zustand aussieht. Dafür wurde ein Blot mit poly(A)⁺ RNA von 12 verschiedenen Organen (Human 12 lane MTN Blot, Cat. No. 7780-1; Firma Clontech GmbH Heidelberg, Deutschland) mit radioaktiven Sonden für L119 und S26, einem ribosomalen Protein der kleinen Untereinheit hybridisiert. Die Durchführung erfolgte nach den Protokollen "Radioaktive Markierung von DNA Fragmenten" und "Hybridisierung von Nylon-Filtern mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten" (s. o.). Als Sonde für L119 diente ein 329 bp langes PCR-Fragment (Beschreibung siehe oben). Die S26-Sonde für die Hybridisierung wurde mittels RT-PCR aus Ratten-Hirn Gesamt-RNA hergestellt (Protokolle "RNA-Extraktion", "Reverse Transkription" und "Polymerase-Kettenreaktionen"; s. o.). Es kamen folgende Primer zum Einsatz:
Bei der Polymerasekettenreaktion galten nachfolgende Bedingungen: 50 ng cDNA, mit 3 min 96°C initialer Denaturierung und 30 Zyklen mit 30 sec 96°C Denaturierung, 30 sec 56°C Annealing und 30 sec 72°C Elongation.
Signale wurden erhalten von allen untersuchten Organen, darunter starke von Herz, Skelettmuskulatur, Placenta, Lunge und Niere (Fig. 10). Die Größe der detektierten L119 mRNA in allen Organen war etwa 4,5 kb. In den Spuren mit den stärksten Signale (Skelettmuskulatur, Herz und Plazenta) waren zusätzliche Banden anderer Größe zu sehen (Größen von etwa 5 bis 6 kb bzw. 3 kb).
Eine Reihe von Stimuli kann L119 mRNA Expression im Hippocampus stimulieren. Dazu gehören akute Krampfanfälle, ausgelöst durch systemische Applikation von Kainat (10 mg/kg Körpergewicht, intraperitoneal injiziert in 300 bis 350 g schwere männliche Sprague-Dawley Ratten) oder Pentylentetrazol (50 mg/kg Körpergewicht, intraperitoneal injiziert in 300 bis 350 g schwere männliche Sprague-Dawley Ratten), aber auch globale Ischämie (ausgelöst durch eine 15-minütige bilaterale Okklusion der A. carotis bei zusätzlicher Hypotonie von 35 mm Hg arteriellem Blutdruck) (Patentanmeldung Worley, WO 99/40225). L119 mRNA Expression wird auch in einem Tiermodell der fokalen cerebralen Ischämie (ein valides Modell für den humanen ischämischen Schlaganfall) induziert. Zur Herbeiführung der fokalen cerebralen Ischämie wurde das sog. Fadenmodell benutzt, bei dem ein beschichteter Nylonfaden durch die A. carotis interna an den Abgang der A. cerebri media vorgeschoben wird und einen ischämischen Schlaganfall induziert (Clark W. M. et al. (1997) Neurol. Res. 19, 641-648). Die Regulation der Genexpression spielt bei der cerebralen Ischämie eine entscheidende Rolle für den Ablauf und das Ausmaß des Neuronenschadens (Koistinaho J. und Hokfelt T. (1997) Neuroreport 8, i-viii; Schneider A. et al. (1999) Nat Med 5, 554-559). Insbesondere immediate early genes spielen dabei eine Rolle (Atkins P. T. et al. (1996) Stroke 27, 1682-1687), wie z. B. cox-2 (Yamagata K. et al., (1993) Neuron 11, 371-386; Nogawa S. et al. (1997) J. Neurosci. 17, 2746-2755).
In situ Hybridisierungen, die an Hirnen nach 60 min Ischämie und 23 h Reperfusion entsprechend dem Potokoll "In situ Hybridisierungen" (s. o.) durchgeführt wurden, zeigten starke Signale für L119 mRNA sowohl in der Infarktregion als auch im Peri-Infarktbereich (Penumbra) verglichen mit der Kontrollseite des gleichen Tieres.

Beispiel 6

Expression von L119 mRNA im vaskulären Endothelium von Tumoren

L119 mRNA Expression wurde detektiert in Endothelzellen und konnte während der Entwicklung des Organismus in Phasen mit aktiver Angiogenese nachgewiesen werden (s. o.). Es sollte untersucht werden, ob L119 auch in Geweben mit pathologischer Angiogenese exprimiert wird. Dazu wurden ca. 100 000 Tumorzellen eines 9L Glioblastoms subkutan in die Flanke von Ratten injiziert. Das Wachstum der Tumorzellen wurde verfolgt und nach Umfangzunahme auf ca. 1 g wurden die Tumore entnommen. Es wurden Schnitte angefertigt und nach dem Protokoll "In situ-Hybridisierung" (s. o.) mit Sonden für L119 hybridisiert (beschrieben unter "Digoxygeninmarkierte Riboproben"). Sehr starke L119-Expression konnte in Kapillaren (Fig. 11A und C) und größeren Gefäßen (E bis H) nachgewiesen werden. Es ist deutlich zu erkennen, dass in den größeren Gefäßen nur die Endothelschichten L119-positiv sind (Pfeile in E bis H). Die Expression von L119 konnte noch verstärkt werden, wenn den Ratten vor der Entnahme der Tumoren systemisch Cycloheximid verabreicht worden war (vgl. oben; Fig. 11B und D).
Sehr starke L119 mRNA Expression konnte in Tumor-Blutgefäßen während der Tumorangiogenese beobachtet werden. Dazu wurden kleine Tumormengen (9L Glioblastom; etwa 1 mm Durchmesser) in einer stereotaktischen Operation unilateral in den Seitenventrikel transplantiert (Methode beschrieben in: Guerin C. et al. (1992) Am. J. Pathol. 140: 417-425). Weiteres Größenwachstum des Tumors war von der Ausbildung neuer Blutgefäße abhängig. Nach 8 bzw. 18 Tagen mit entsprechend gewachsenen Tumoren wurden In situ Hybridisierungen der Hirne mit den implantierten Tumoren durchgeführt, dazu wurde entsprechend dem Protokoll "In situ Hybridisierungen" verfahren (s. o.). Fig. 12 zeigt sehr starke L119 Signale im vaskulären Endothel des Tumors nach 8 Tagen (C) 1 bzw. 18 Tagen (D), währenddessen sich im angrenzenden gesunden Hirngewebe (links und rechts neben dem Tumorgewebe auf der Figur) keine L119 Expression nachweisen läßt. In (A) und (B) sind Kontroll-Nissl-Färbungen angrenzender Schnitte dargestellt (durchgeführt nach dem Protokoll "Nissl-Färbung"; s. o.). Als Nächstes wurde untersucht, ob L119 mRNA Expression während der Tumorangiogenese spezifisch für Glioblastome ist. Dazu wurde von verschiedenen humanen Tumoren und Metastasen des Kopfes Gesamt-RNA extrahiert und mittels Northern-Blot-Analyse auf Expression von L119 untersucht (durchgeführt nach den Protokollen "RNA-Extraktion", "Northern Blot", "Radioaktive Markierung von DNA Fragmenten" und "Hybridisierung von Nylon-Filtern mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten"). Als Sonde für L119 diente ein 329 bp langes PCR-Fragment (Beschreibung siehe oben). In allen analysierten Tumoren konnte L119 mRNA Expression nachgewiesen werden, allerdings in unterschiedlichem Maße, wenn man für den Vergleich das Verhältnis der Signalstärke von L119 zu der von Ubiquitin benutzt. Ein besonders hohes Expressions-Verhältnis von L119 zu Ubiguitin zeigte sich zum Beispiel in einer Metastase eines Rhabdomyosarkomes eines 5-jährigen Jungens.

Beispiel 7

Expression von L119 mRNA in kultivierten Endothelzellen

An primären humanen mikrovasculären Endothelzellen aus Lungengewebe (HMVEC-L; Clonetics/BioWhittaker) wurde mittels Northern Blot-Analysen untersucht, ob sich die L119 mRNA Expression durch die bereits beschriebenen Stimuli in Kulturzellen induzieren lässt. HMVE-Zellen wurden mit 350 000 Zellen/10 cm Platte in EGM-2-MV-Medium (Clonetics/BioWhittaker) ausplattiert. Nach jeweils 24 h wurde frisches Medium auf die Zellen gegeben. Nach 48 h waren die Zellen konfluent und wurden für 24 h bzw. 48 h ohne Medienwechsel weiterkultiviert und anschließend durch Zugabe von 0 bis 250 µg/ml Cycloheximid (CHX) für 90 min stimuliert. Die Präparation der Gesamt-RNA erfolgte mit Hilfe des RNeasy RNA-Präparations Kits (Cat. No. 74104, Firma Qiagen; Hilden, Deutschland) nach dem Protokoll im Begleitheft des Kits). Es wurden je 10 µg RNA je Spur auf ein Northern-Gel aufgetragen und die geblottete Membran durch Hybridisierung mit einer humanen L119-Sonde (XhoI/HindIII 2070 bp-Fragment) (Protokolle "Northern Blot", "Radioaktive Markierung von DNA Fragmenten" und "Hybridisierung von Nylon-Filtern mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten"; s. o.) analysiert (Fig. 19). Zur Stimulierung der Zellen mit TNF-α (25 nM) und Interleucin 1-β (10 bis 100 ng/ml) wurde analog verfahren, wobei die Zellen vor Zugabe der Reagenzien für 24 h konfluent in serumfreien Basalmedium (EBM-2-MV; Clonetics) kultiviert wurden. Eine 2 bis 5 fache Induktion der L119 mRNA Expression wurde nach Inkubation mit Cycloheximid (250 µg/ml) sowie nach IL-1β Gabe (100 ng/ml) beobachtet. Die Zugabe von TNF-α hatte dagegen keinen Effekt auf die L119 mRNA Expression (Fig. 20).
Da gezeigt werden konnte, dass im Tiermodell durch cerebrale Ischämie eine starke Induktion der L119 mRNA Expression sowohl in der Infarktregion als auch im Peri-Infarktbereich erfolgt, wurde an kultivierten Endothelzellen untersucht, ob die Expression der L119 mRNA durch hypoxische Kulturbedingungen beeinflusst werden kann. Dazu wurden subkonfluente (ca. 80 bis 90% konfluent; 4 ml EGM-2-MV Medium/10 cm Platte) HMVE-Zellen sowie RBE4 Zellen (immortalisierte mikrovaskuläre Endothelzellen aus Rattenhirn; Roux F. et al., (1994) J Cell. Physiol. 159: 101-113) für 3 h in einer Hypoxiekammer bei 37°C mit einem Gemisch aus 90% N₂, 5% CO₂ und 5% H₂ in Anwesenheit eines Palladium-Katalysators (bewirkt Reduktion des freien O₂ zu H₂O; BBL GasPak Replacement Charges; Becton Dickinson, Kat. Nr. 4370303) begast. Anschließend wurde eine RNA-Präparation durchgeführt (RNeasy Kit; Qiagen) und je 10 µg Gesamt-RNA pro Spur durch Northern Blotting analysiert. Die RNA aus HMVE-Zellen wurde dazu mit einer humanen L119-Sonde (XhoI/HindIII 2070 bp-Fragment, s. u.) hybridisiert und die aus RBE4-Zellen gewonnene RNA mit einer Sonde aus dem 3'-untranslatierten Bereich der L119-cDNA der Ratte (Pos. 2260 bis 2920 der SEQ ID No: 1) (Fig. 21a und b). In beiden Zelltypen bewirkten die hypoxischen Kulturbedingungen nach Normalisierung mit dem ribosomalen Faktor S26 eine Induktion der L119 mRNA Expression um das ca. 2- bis 3fache. Für die Gewinnung der humanen Sonde wurden Filter mit einer humanen BAC Bibliothek (High density CITB human BAC colony DNA membranes; Cat. No. 96055; Firma Research Genetics) mit einer L119-spezifischen Sonde hybridisiert (Protokolle "Radioaktive Markierung von DNA Fragmenten" und "Hybridisierung von Nylon-Filtern mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten"). Die L119-Sonde für die Hybridisierung wurde mittels RT-PCR aus humaner Hirn-Gesamt-RNA (Cat. No. 64020-1; Firma Clontech Heidelberg, Deutschland) hergestellt (Protokolle "Reverse Transkription" und "Polymerase-Kettenreaktionen"; s. o.). Dabei kamen die Primer hL119-45 (SEQ ID NO: 15) und hL119-4as (SEQ ID NO: 19) zum Einsatz (Sequenzen siehe oben). Ferner galten nachfolgende Bedingungen: 50 ng cDNA, mit 3 min 96°C initialer Denaturierung und 35 Zyklen mit 30 sec 96°C Denaturierung, 30 sec 62°C Annealing und 30 sec 72°C Elongation). Zwei Klone gaben starke positive Signale mit der verwendeten Sonde. Von einem positiven Klon wurde BAC-DNA isoliert (large construct kit; Cat. No. 12462; Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) nach dem Protokoll im Begleitheft des Kits (Version 06/99). Dieser Klon wurde als L119-positiv verifiziert mittels verschiedener Restriktionsverdaus und Hybridisierungen mit L119 Sonden. Aus dem BAC wurden verschiedene EcoRI-Fragmente in einen Plasmidvektor subkloniert. Aus einem L119-positiven EcoRI-Plasmidklon wurde ein ca. 2070 bp langes XhoI/HindIII Fragment in einen Plasmid-Vektor subkloniert. Das XhoI/HindIII-Insert dieses Klones wurde mittels Gelelektrophorese und anschließender Reinigung der DNA (mittels QiaexII; Cat. No. 20021; Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.

Beispiel 8

Protein-Expressionsstudien

Intrazelluläre Lokalisation von L119

Der kodierende Bereich der rL119 cDNA wurde in den Vektor pcDNA3.1-myc-His (Invitrogen) mit einem carboxterminalen Myc-Histidin-Tag fusioniert sowie in dem Vektor pRK5 mit einem aminoterminalen Flag-"Tag" versehen. Dazu wurde der L119 ORF mit den Primerpaaren der SEQ ID NO: 25 und 26 bzw. SEQ ID NO: 27 und 28 mittels PCR amplifiziert. Es wurde ein 50 µl Ansatz aus 5 µl 10 × Cloned Pfu-Buffer (Stratagene); 2 µl dNTP-Mischung (5 mM; Cat. No. 1969064, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland); je 2 µl der genannten Primerpaare (Stock-Konz. 10 µM); 100 ng rL119-cDNA Template, 35 µl H₂O und 1 µl Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Stratagene) hergestellt und nach 3-minütiger Inkubation bei 94°C, 28 PCR-Zyklen entsprechend dem Temperaturprogramm: 30 sec Primer-Annealing bei 60°C, 70 sec Strangverlängerung bei 72°C und 30 sec Aufschmelzen der DNA- Doppelstränge bei 94°C, mit einem abschließenden Extensions- Schritt von 7 min bei 72°C durchgeführt. Die erhaltenen PCR- Produkte wurden gelgereinigt, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI geschnitten und in die ebenfalls mit EcoRI und XbaI geschnittenen Expressionsvektoren pcDNA3.1-myc/His-A (Invitrogen) und pRK5-Flag subkloniert und seguenziert. Beide Konstrukte wurden transient in HEK293 Zellen transfiziert (entsprechend dem Protokoll "Transiente Transfektion"; s. o.) und die Zellen nach 48 Stunden geerntet. In Fraktionierungsexperimenten wurden die Proteine der Zellen in eine nukleäre, eine membranständige und eine cytosolische Fraktion aufgetrennt (Scheek S. et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 94, 11179-83) und einer Western Blot Analyse unterzogen. Die Filter wurden entsprechend dem Protokoll "Western Blot Analyse" (s. o.) mit Antikörpern gegen die jeweiligen "Tags" der L229-Konstrukte hybridisiert (monoklonaler anti-myc Antikörper, Invitrogen; monoklonaler anti-Flag M2-Antikörper, Sigma-Aldrich). In beiden Fällen wurden Signale in der membranständigen 100 000-g-Fraktion erhalten (Fig. 13). Parallel wurden immunohistochemische Analysen an COS7-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden dazu mit einem pRKS-L119-Expressionskonstrukt (kodierender Bereich der L119 cDNA im Vektor pRK5) transfiziert. Zur Herstellung des Konstruktes wurde wie oben beschrieben eine PCR mit den Primern der SEQ ID NO: 29 und 30 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Nach 3 minütiger Denaturierung bei 94°C wurden 25 PCR-Zyklen entsprechend dem Temperaturprogramm: 1 min Primer-Annealing bei 56°C, 1 min Strangverlängerung bei 72°C und 1 min Aufschmelzen der DNA-Doppelstränge bei 94°C, mit einem abschließenden Extensions-Schritt von 7 min bei 72°C durchgeführt. Das erhaltene PCR-Produkt wurde gelgereinigt, mit den Restriktionsenzymen SalI und NotI geschnitten und in den ebenfalls mit SalI und NotI geschnittenen Expressionsvektor pRK5 subkloniert und zur Verifizierung sequenziert. Zur immunhistochemischen Analyse wurde L119 und der Kontrollvektor pRK5 in COS-7 Zellen entsprechend dem Protokoll "Transiente Transfektion" transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen für 2 × 15 min in 4% Paraformaldehyd fixiert, mit 0,25% Triton X-100 für 15 min permeabilisiert und für 1,5 h bei RT mit 10% NGS/PBS (Normal Goat Serum, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Kat. Nr. 005-000-121) geblockt. Die Antikörperreaktionen mit einem polyklonalen Antikörper gegen Ratten rL119, gefolgt von einem anti-Kaninchen IgG-FITC Antikörper wurden für jeweils 1,5 h bei RT in 3% NGS/PBS durchgeführt. Nach jeder Antikörper-Inkubation wurde jeweils 3 × für 10 min mit PBS gewaschen. Die Deckgläser wurden mit Permaflout (Immunon/Shandon, Kat. Nr. 434990) auf Objektträger aufgezogen. Die Mehrheit des überexprimierten L119 Proteins wurde in vesikulären Strukturen detektiert. Durch Doppelfärbung konnte nachgewiesen werden, dass es sich hierbei um Bestandteile des sekretorischen Pathways, insbesondere des Golgi-Apparates handelt (Fig. 14B und C).
Das leere pRK5 Kontrollplasmid gab keine spezifischen Signale (Fig. 14A). Zelloberflächen-Biotinylierungsstudien von pRK5-L119 transient transfizierten COS-7 Zellen zeigten, dass sich L119 Protein auch an der Zelloberfläche nachweisen ließ.
Die subzelluläre Lokalisation des L119 wurde zusätzlich an transient transfizierten RBE4 und YPEN-1 Zellen untersucht. Die RBE4 Zelllinie entstammt der Immortalisierung von mikrovaskulären Endothelzellen aus Rattenhirn (Roux F. et al. (1994) J. Cell. Physiol. 159, 101-13), YPEN-1 Zellen wurden aus Endothelzellen der Rattenprostata durch Immortalisierung mittels eines Adenovirus-12SV40-Hybridvirus gewonnen (Yamazaki K. et al. (1995) In Vivo 9, 421-6). Dazu wurden die Zellen auf Fibronektin beschichteten Deckgläsern mit 30 000 bis 40 000 Zellen/24er Well in EGM-2-MV Medium ausgesät. Am nächsten Tag wurde die Lipofektion von L119-Konstrukten mit Lipofectamine Plus (GibcoBRL) durchgeführt (pro 24er Well: 400 ng DNA, 4 µl Plus Reagenz und 1 µl Lipofectamine in je 50 µl serumfreien EBM-2). Nach 3 h Inkubation in 500 µl serumfreiem EBM-2-MV Medium wurden die Zellen für weitere 36 bis 48 h in Vollmedium inkubiert und anschließend in 3% Paraformaldehyd/PBS für 30 min fixiert. EGFP-L119 und L119-EGFP transfizierte Zellen wurden zusammen mit der entprechenden Vektorkontrolle (pEGFPΔEGFP) nach mehrmaligem Waschen in 10 mM Tris-HCl pH 8,0 mit AqaPolyMount (Polysciences Inc., Kat. Nr. 18606) auf Objektträger aufgezogen. Immuncytochemische Analysen wurden nach Permeabilisierung mit 0,15% Triton X-100 mit einem polyklonalen Antikörper gegen rL119 (2892), gefolgt von einem anti-Kaninchen-IgG-FITC Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), durchgeführt. Zur Überexpression von L119 in Endothelzellen wurden die folgenden Expressionskonstrukte transfiziert: pRK5-L119, pRK5-FlagL119, pEGFPN1ΔEGFP-L119myc, pEGFPN1-L119, pEGFPC1-L119. Die Fusionen von L119 mit dem Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) wurden durch PCR mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO: 31 und 32 bzw. SEQ ID NO: 33 und 34 erhalten. Dazu wurde je ein 50 µl Ansatz aus 5 µl 10 × Cloned Pfu-Buffer (Stratagene); 2 µl dNTP-Mischung (5 mM; Kat. Nr. 1969064, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland); je 2 µl der genannten Primerpaare (Stock-Konz. 10 µM); 100 ng rL119-cDNA Template, 35 µl H₂O und 1 µl Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Stratagene) hergestellt und nach 3 minütiger Inkubation bei 94°C, 28 PCR-Zyklen entsprechend dem Temperaturprogramm: 30 sec Primer-Annealing bei 62°C, 70 sec Strangverlängerung bei 72°C und 30 sec Aufschmelzen der DNA-Doppelstränge bei 94°C, mit einem abschließenden Extensions-Schritt von 7 min bei 72°C durchgeführt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden gelgereinigt, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI geschnitten und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen der Vektoren pEGFP-N1 und pEGFP-C1 kloniert. Eine L119 spezifische Immunfärbung wurde unabhängig vom Zelltyp und Expressionskonstrukt in vesikulären Strukturen detektiert (Fig. 22 bis 24). Durch Doppelfärbung konnte gezeigt werden, dass diese Strukturen im Gegensatz zur L119-Färbung an Zellen nicht endothelialen Ursprungs keine Golgi-Elemente darstellen. Folglich sollte es sich hierbei um Organellen handeln, die zu den Post- Golgi-Kompartimenten des sekretorischen Pathways gezählt werden.

Beispiel 9

Identifizierung von interagierenden Proteinen von L119 in vitro

Zur Identifizierung von interagierenden Proteinen von L119 wurde ein Hefe-Two Hybrid Screen durchgeführt. Der gesamte kodierende Bereich der L119 cDNA wurde in einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifiziert und in den Vektor pPC86 kloniert. Dazu wurden die Oligonukleotidprimer mit der SEQ ID NO: 35 und 36 verwendet. Es wurde ein 50 µl PCR-Ansatz aus 5 µl 10 × Cloned Pfu-Buffer (Stratagene); 2 µl dNTP-Mischung (5 mM; Kat. Nr. 1969064, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland); je 2 µl der genannten Primerpaare (Stock-Konz. 10 µM; 100 ng rL119-cDNA Template, 35 µl H₂O und 1 µl Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Stratagene) hergestellt und nach 3 minütiger Inkubation bei 94°C, 28 PCR-Zyklen entsprechend dem Temperaturprogramm: 1 min Primer-Annealing bei 56°C, 1 min Strangverlängerung bei 72°C und 1 min Aufschmelzen der DNA-Doppelstränge bei 94°C, mit einem abschließenden Extensions-Schritt von 7 min bei 72°C durchgeführt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden gelgereinigt, mit den Restriktionsenzymen SalI und NotI geschnitten und in die enstprechenden Restriktionsschnittstellen des pPC86 kloniert. Das so entstandene DNA-Konstrukt kodiert für ein Protein, in dem die Gal4-DNA-Bindungsdomäne mit dem L119-Protein fusioniert ist. Mit diesem Konstrukt wurde der Hefestamm Y190 (Flick J. S. und Johnston M. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 4757-4769; Harper J. et al. (1993) Cell 75, 805-816) (Firma Life Technologies) transformiert. Der resultierende Hefestamm wurde mit einer Rattenhirn-cDNA Bank (aus Cortex und Hippokampus-RNA, nach maximalem elektrokonvulsivem Schock (MECS) (Antony Lanahan und Paul Worley)) im Vektor pPC86 (Firma Life Technologies) transformiert und 3 × 10⁶ Transformanden ausplattiert. Nach 3 bis Tagen Wachstum bei 30°C wurden Kolonien mit einem Durchmesser von mehr als 2 mm vereinzelt und einer X-Gal-Färbung unterzogen (Protokoll: ProQuest™ Two-Hybrid System, Cat. Series 10835, Life Technologies). Insgesamt 14 Kolonien erwiesen sich als His3 und lacZ positiv. Aus diesen wurde die jeweilige cDNA mit vektor- spezifischen Primern amplifiziert und das Amplikon sequenziert (Protokoll: ProQuest™ Two-Hybrid System, Cat. Series 10835, Life Technologies). Die Sequenzanalyse ergab 8 verschiedene putative interagierende Proteine (Tabelle 1): Tabelle 1 Aus dem Hefe-"Two-Hybrid"-System gefischte Interaktoren von L119
Es wurde mittels Koimmunpräzipitierung exemplarisch untersucht, ob die in dem Hefe-Two Hybrid Screen identifizierten Interaktionen physiologisch relevant sind. Ein Expressionskonstrukt für den Transmembranrezeptor Notch 1 (mit einem myc-Tag versehen; zur Verfügung gestellt von J. Nye, Northwestern University; beschrieben bei Nye J. S. et al. (1994) Development 120, 2421-30) bzw. eine Leervektorkontrolle wurde zusammen mit einem pRK5-L119-Expressionskonstrukt in HEK 293 Zellen entsprechend dem Protokoll "Transiente Transfektion (s. o.) kotransfiziert. Die Expression der beiden Proteine wurde mittels Western Blot Analyse bestätigt (Daten nicht gezeigt). Die Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion in PBS/1% Triton X-100 und Protease Inhibitoren durch Sonifizierung lysiert. Nach einer Zentrifugation mit 16 000 g für 20 min bei 4°C wurde der Überstand für Koimmunpräzipitationen eingesetzt. Ein monoklonaler Maus anti-myc Antikörper (Calbiochem, Kat. Nr. OP10) wurde als immunpräzipitierender Antikörper benutzt. Dazu wurde 0,5 µg des Antikörpers zu 300 µl Lysat pipettiert und für 2 h bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden 40 µl Protein A-Agarose (Pierce, Kat. Nr. 20333) zugegeben und für 30 min bei 4°C inkubiert. Es wurde 3 × mit PBS/1% Triton X 100/Protease Inhibitoren gewaschen und 2 × mit PBS/1% Triton X 100/Protease Inhibitoren/500 mM NaCl. Die Agarose-Beads wurden mit Laemmli-Proben-Puffer eluiert und auf einem denaturierenden SDS-Gel aufgetrennt. Die Koimmunpräzipitation wurde durch ein Western Blot Experiment (s. Protokoll "Western Blot Analyse"; s. o.) mit einem anti-L119 Antikörper (2894) nachgewiesen. Fig. 15 zeigt, dass der anti-Notch1 Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Kat. Nr. sc-6015), der gegen den C-Terminus von Notch1 gerichtet ist, nur in der Lage war L119 Protein zu kopräzipitieren, wenn Notch1 Protein anwesend war. In einem Kontrollexperiment wurde zusätzlich ein den Notch1-Antikörper blockierendes Peptid zugegeben (Santa Cruz Biotechnology, Kat. Nr. sc-6015p), was zum Verschwinden der immunpräzipitierten spezifischen Bande führte (Spuren "IP blocked Notch 1 AB" in der Fig. 15). Somit wurde eine Interaktion von L119 und Notch 1 Proteinen in heterolog transfizierten Zellen nachgewiesen. Verifizierungen der Interaktionen mit den anderen im Hefe Two Hybrid Assay gefundenen Proteinen können ohne weiteres mit der oben beschriebene Methode durchgeführt werden.
Es wurde mittels Koimmunpräzipitation untersucht, ob L119 Protein mit Membranrezeptoren, die in vaskulären Endothelzellen exprimiert sind, interagieren kann. Neuropilin-1 (Npn-1) wurde identifiziert als Isoform-spezifischer (165-)VEGF-Rezeptor in Endothelzellen. Npn-1 scheint dabei als Korezeptor für den VEGF-Rezeptor KDR zu fungieren und vermittelt Mitogenitäts- und Migrationssignale in VEGF-165 stimulierten Endothelzellen (Soker S. et al., (1998) Cell 92, 735-745). Npn-1 wurde auch beschrieben als Zelloberflächenrezeptor für sekretiertes Semaphorin Semalil (He Z. und Tessier-Lavigne M. (1997) Cell 90, 739-751; Kolodkin A. L. et al. (1997) Cell 90, 753-762). Ein Expressionskonstrukt für den Transmembranrezeptor Npn-1 (mit einem myc-Tag versehen; FL-Npn-1; zur Verfügung gestellt von D. Ginty, Johns Hopkins University, Baltimore; beschrieben bei Giger R. J. et al. (1998) Neuron 21, 1079-92) bzw. eine Leervektorkontrolle wurde zusammen mit einem pRK5 L119-Expressionskonstrukt in COS-7 Zellen kotransfiziert (durchgeführt nach Protokoll "Transiente Transfektion"). Die Expression der beiden Proteine wurde mittels Western Blot Analyse bestätigt (Daten nicht gezeigt). Die Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion mit PBS/1% Triton X-100/- Protease Inhibitoren durch Sonifizierung lysiert und die Immunpräzititation analog zur Notch1-Koimmunpräzipitation durchgeführt (vergl. oben). Ein monoklonaler Maus anti-myc Antikörper (Calbiochem, Kat. Nr. OP10) wurde als immunpräzipitierender Antikörper benutzt. Die Koimmunpräzipitation wurde nachgewiesen durch eine Western Blot Analyse mit einem L119 Antikörper (2894)(durchgeführt nach Protokoll "Western Blot Analyse"). Fig. 16 (obere Reihe) zeigt, dass der anti-myc Antikörper nur in der Lage war L119 Protein zu kopräzipitieren, wenn myc-Npn-1 Protein anwesend war. In einem Kontrollexperiment wurde zusätzlich ein den myc- Antikörper blockierendes Peptid zugegeben, was zum Verschwinden der immunpräzipitierten spezifischen Bande führte (Spuren "IP control" in der Figur). Somit wurde eine Interaktion von L119 und Npn-1 Proteinen in heterolog transfizierten Zellen nachgewiesen.
Npn-1 ist ein Typ I transmembranes Protein mit einer großen extrazellulären Region und einem kurzen zytoplasmatischen Schwanz (siehe beispielsweise Fujisawa H. et al. (1997) Cell Tissue Res 290, 465-470). Die extrazelluläre Region umfaßte 5 Domänen: zwei Komplement-bindende Domänen (genannt a1 und a2; siehe Fig. 16), zwei Koagulationsfaktor (V/VIII)-Domänen (b1 und b2) und eine sogenannte MAM-Domäne (c) (siehe Fig. 16 unten für eine schematische Darstellung). Die Domänen a1, a2, b1 und b2 sind essentiell für die SemaIII-Bindung, die Domänen b1 und b2 für die Bindung von VEGF-165 (Giger R. J. et al. (1998) Neuron 21, 1079-1092). Es wurde spekuliert, dass die MAM-Domäne für Di- oder Multimerisierung von Npn-1 verantwortlich sein könnte.
Zur Identifizierung der mit L119 Protein interagierenden Domänen von Npn-1 wurden verschiedene Deletionskonstrukte von Npn-1 (als myc-tag-Fusionsprotein; zur Verfügung gestellt von D. Ginty, Johns Hopkins University, Baltimore; beschrieben bei Giger R. J. et al. (1998) Neuron 21, 1079-92) in einer Koimmunpräzipitierung mit L119 getestet. Folgende extrazelluläre Domänen von Npn-1 wurden deletiert: a1 und a2 in ΔA-Npn-1; b1 und b2 in ΔB-Npn-1; c in ΔC-Npn-1 (vergleiche Fig. 16, unten). Koimmunpräzipitationen in COS-7 Zellen mit diesen Expressionskonstrukten wurden wie für Notch1 oben beschrieben durchgeführt. Die mittlere Reihe in Fig. 16 zeigt, dass die Deletion der Domänen a und b keinen Einfluss auf die Interaktion von Npn-1 mit L119 Protein hatte, währenddessen die Deletion der Domäne c aus dem Npn-1 Expressionskonstrukt die Interaktion verhinderte.

Beispiel 10

Antikörper gegen L119 Protein

Zur Herstellung polyklonaler Antikörper gegen das L119 Protein (Ratte) wurde ein Peptid, bestehend aus Aminosäuren 8 bis 20 (entsprechend der Sequenz in SEQ ID NO: 3) synthetisiert, über ein zusätzliches endständiges Cystein an Keyhole Limpet Hemacyanin (KLH) gekoppelt und in Kaninchen zur Antikörperproduktion injiziert (durchgeführt von der Firma Eurogentec). Die Antigen- Injektionen erfolgten entsprechend dem "Standard-Immunisierungsschema" in Freudschem Adjuvants am Tag 0, 14, 28 und 56, den Tieren wurden am Tag 0 (Präimmunserum), 38, 66, und 80 Blut abgenommen. Die Seren der Kaninchen wurden in Western Blot Experimenten auf eine spezifische Reaktion mit heterolog exprimiertem L119 Protein getestet. HEK293 Zellen wurden mit einem Expressionskonstrukt einer Fusion aus myc-Tag und gesamten offenen Leseraster von L119 transient transfiziert (pcDNA3.1-rL119-myc-His). Die Zellen wurden nach 48 Stunden geerntet, lysiert und das Proteinextrakt in Triplikaten auf einem denaturierenden Proteingel aufgetrennt und geblottet. Die Western Blot Analyse mit dem Präimmunserum ergab keine Signale, währenddessen das L119-Antiserum 7340 ein spezifisches Signal der erwarteten Größe ergab (Fig. 17, A und B). Eine Kontrollhybridisierung mit einem anti-myc Antikörper (Invitrogen) (Fig. 17 C) markierte eine Bande der gleichen Größe, was die Spezifität des Antikörpers 7340 für das L119 Protein unterstreicht.
Für zwei weitere Peptidantikörper wurden Peptide bestehend aus den N-terminalen 19 Aminosäuren (MEKWTAWEPQGADALRRFQC) und den C-terminalen 20 Aminosäuren (CTKAGRGHNLRNSPDLDAALFF) der L119 Rattensequenz (entsprechend der Sequenz in SEQ ID NO: 3) über ein zusätzliches endständiges Cystein an Thyroglobulin (Sigma- Aldrich, Kat. Nr. T1001) gekoppelt. Dazu wurden 10 mg Thyroglobulin in 0,5 ml 0,1 M Phophat-Puffer pH 6,8 gelöst, sowie 2,5 mg MBS (Pierce, Kat Nr. 22311ZZ) in 0,1 ml Dimethylformamid (Sigma-Aldrich, Kat. Nr. D4254). 50 µl der MBS-Lösung wurden unter Rühren zur Thyroglobulin Lösung getropft und für weitere 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufreinigung des MBS- Thyroglobulins erfolgte über eine PD-10 Säule (Amersham Pharmacia Biotech, Kat. Nr. 17-0851-01) nach den Angaben des Herstellers. Die MBS-Thyroglobulin-haltigen Fraktionen wurden durch Messung der Absorption bei 280 nm ermittelt und vereinigt. Es wurden 1 mg/ml Lösungen der N- und C-terminalen Peptide in 0,1 M Phosphat-Puffer pH 6,8/20 mM EDTA hergestellt und 3 ml der MBS- Thyroglobulin-Lösung mit 3 ml Peptid-Lösung unter Schutzgas (N₂) gemischt und für 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Kopplungsprodukte wurden über Nacht gegen PBS dialysiert und als Immunogen eingesetzt. Darüber hinaus wurde ein GST-L119-Fusionsprotein zur Immunisierung eingesetzt. Zur Herstellung des Fusionsproteins wurde ein PCR-Fragment, bestehend aus den C-terminalen 67 Aminosäuren des L119 der Ratte, hergestellt (entsprechend der Sequenz in SEQ ID NO: 3). Dazu wurden die Oligonukleotidprimer mit der SEQ ID NO: 37 und 38 verwendet. Es wurde ein 50 µl PCR-Ansatz aus 5 µl 10 × Cloned Pfu-Buffer (Stratagene); 2 µl dNTP-Mischung (5 mM; Kat. Nr. 1969064, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland); je 2 µl der genannten Primerpaare (Stock-Konz. 10 µM); 100 ng rL119-cDNA Template, 35 µl H₂O und 1 µl Pfu-Turbo- DNA-Polymerase (Stratagene) hergestellt und nach 3 minütiger Inkubation bei 94°C, 28 PCR-Zyklen entsprechend dem Temperaturprogramm: 1 min Primer-Annealing bei 62°C, 1 min Strangverlängerung bei 72°C und 1 min Aufschmelzen der DNA-Doppelstränge bei 94°C, mit einem abschließenden Extensions-Schritt von 7 min bei 72°C durchgeführt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden gelgereinigt und in die BamHI und SalI Klonierungsstellen des Vektors pGEX-4T2 kloniert (Amersham Pharmacia Biotech, Kat. Nr. 27-4581-01). Die GST-Fusionsproteine wurden sequenziert, nach Standardprotokoll des Herstellers in E. coli BL21 Zellen exprimiert (Zellwachstum bis zu einer OD₆₀₀ von 0,8; Induktion mit IPTG (Amersham Pharmacia Biotech, Kat. Nr. US 17884-5g) für 2 h), das Bakterienpellet durch Sonifizierung in PBS/1% Triton-X100 lysiert, für 30 min bei 25000 g (4°C) zentrifugiert und der erhaltene Überstand mit Glutathion-Agarose Beads für 2 h bei 4°C inkubiert. Die Beads wurden 4 × mit PBS/Triton-X100 gewaschen, das Fusionsprotein mit 2 ml 10 mM Glutathion/50 mM Tris-HCl pH 8,0 eluiert (durch Inkubation für 1 h bei 4°C) und anschließend gegen PBS dialysiert. Die dialysierte Proteinlösung wurde als Antigen eingesetzt. Die Immunisierung von je zwei Kaninchen wurde von der Firma Covance Research Products Inc. durchgeführt. (Antigen- Injektionen erfolgten entsprechend der "Master-Schedule-List" in Freudschem Adjuvants am Tag 0, 14, 35 und 56, 77 und 98 den Tieren wurden am Tag 0 (Präimmunserum), 25, 46, 67, 88 und 109 Blut abgenommen). Die Seren der Kaninchen (Peptidantikörper: 2892-2895; GST-Fusionsproteine 3841 und 3843) wurden in Western Blot Experimenten auf eine spezifische Reaktion mit heterolog exprimiertem L119 Protein getestet. Dazu wurden HEK293 Zellen mit Expressionskonstrukten einer Fusion aus myc-Tag und dem gesamten offenen Leseraster von L119 der Ratte bzw. des Menschen und parallel mit dem entsprechenden Vektorkonstrukt transient transfiziert. Die Zellen wurden nach 48 Stunden geerntet, nach 15 min auf Eis in einem hypotonen Puffer (10 mM HEPES pH 7,6, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 1 mM EDTA) durch 30maliges Aufziehen durch eine 22 Gauche Kanüle aufgeschlossen und für 10 min bei 1000 g zentrifugiert (4°C). Der 1000 g Überstand wurde auf einem denaturierenden Proteingel aufgetrennt und geblottet. Der Western Blot wurde entsprechend dem Protokoll "Western Blot Analyse" durchgeführt. Es wurde eine Kontrollhybridisierung mit einem anti-myc Antikörper (Biomol) durchgeführt, um die L119-spezifischen Banden zu identifizieren. Die Seren 2892 bis 2895 zeigten eine spezifische Reaktion mit dem L119 Protein der Ratte, wohingegen keine Immunreaktion mit dem humanen L119-Protein nachzuweisen war (Abb. 25a und b). Die Seren 3841 und 3843 wurden analog auf eine Imunreaktion getestet, als Kontrolle diente wiederum die Inkubation mit einem anti-myc-Antikörper. Es wurde hierbei für beide L119-Antikörper eine starke Reaktion mit dem L119 Protein der Ratte und eine schwache Immunreaktion mit dem humanen L119 detektiert (Fig. 25c).

Beispiel 11

Herstellung von L119-transgenen Tieren

Durch die zielgerichtete Mutation des L119 Genes in der Keimbahn der Maus und die Analyse des resultierenden Phänotypes kann man wichtige weitere Informationen über die (patho)- physiologischen Mechanismen gewinnen, in denen das L119 Gen beteiligt ist. Zur Herstellung einer sogenannten Knock Out Maus, d. h. einer Maus ohne funktionelles L119 Protein, wurde zunächst ein sogenanntes Targeting-Konstrukt hergestellt. Dabei wurden zwei den kodierenden Bereich von L119 flankierende genomische Fragmente (entsprechend Positionen 2820 bis 10736 und 13536 bis 14986 in der erfindungsgemäßen Sequenz SEQ ID NO: 4) als Homologiearme für die homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen (Es) in den Vektor pHM2 (Kaestner K. H. et al. (1994) Gene 148, 67-70; EMBL-Datenbank Accession No. X76683) kloniert. Dieser Vektor trägt eine Neomycin-Resistenzkassette und erlaubt das Einsetzen eines Reportergens in das zu mutierende Allel. Dafür wurde das lacZ-Reportergen des Vektors mit dem 5'-untranslatierten Bereich von L119 fusioniert und war somit unter der Kontrolle des endogenen L119 Promoters. Im einzelnen wurde ein ca. 1400 bp langes Maus-genomisches HindIII/EcoRI Fragment aus dem 3'-untranslatierten Bereich von L119 (entsprechend Positionen 13536 bis 14986 in der erfindungsgemäßen Sequenz SEQ ID NO: 4) in den entsprechend geschnittenen Vektor pBluescriptIIKS-Minus (Firma Stratagene) kloniert. Das Insert wurde mit SalI/SpeI wieder aus dem Konstrukt isoliert und in den mit SalI und XbaI geschnittenen Vektor pHM2 kloniert. Damit war der 3'-Homologiearm für die homologe Rekombination kloniert. Der 5'-Homologiearm wurde in 2 Teilschritten kloniert. Als Erstes wurde das Konstrukt für die anschließende Klonierung mit NotI und PmlI verdaut. Zur Generierung des einzuklonierenden Inserts wurde eine PCR mit den Primern

aus 10 ng Maus L119 Cosmid-DNA mit folgenden Bedingungen durchgeführt: 25 Zyklen mit 3 min 96°C initialer Denaturierung und 25 Zyklen mit 30 sec 96°C Denaturierung, 30 sec 65°C Annealing und 4 min 72°C Elongation. Das PCR-Produkt wurde mit NotI verdaut und in das vorbereitete Konstrukt (geschnitten mit NotI und PmlI) kloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit NotI und XhoI verdaut und das dazwischen liegende etwa 730 bp lange Fragment (stammend aus dem 5'-Bereich des vorher klonierten PCR-Produktes inklusive der NotI Schnittstelle des für die PCR verwendeten Primers) durch ein etwa 6600 bp langes NotI/XhoI Fragment ersetzt. Das eingefügte NotI/XhoI Fragment wurde aus einem Plasmid mit einem L119 genomischen EcoRI-Fragment, in das nach Transposon-Insertion (GPS-1, New England Biolabs, Beverly, MA, USA; durchgeführt nach dem Protokoll im Begleitheft des Kits) eine zusätzliche NotI-Schnittstelle eingefügt worden war, gewonnen. Durch die Einfügung des NotI/XhoI Fragmentes wurde der genomische Kontext von L119 der Maus (entsprechend Position 2820 bis 10736 in der erfindungsgemäßen Sequenz SEQ ID NO: 4) im Knockout Konstrukt wiederhergestellt. Nach Linearisierung des Targeting- Konstruktes mit SmaI wurde die DNA in embryonale Stammzellen elektroporiert und wurden G418-resistente Klone selektioniert (von der Firma EUROGENTEC durchgeführt). Von diesen Klonen wurde genomische DNA isoliert (nach dem Protokoll "Preparation of genomic DNA from mammalian tissue: Basic Protocol" in Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, Supplement 42 (1998), Seiten 2.2.1.-2.2.3. (John Wiley and Sons)) und mittels PCR auf homologe Rekombination zwischen Targeting- Konstrukt und endogenem L119 Allel untersucht. Für die PCR wurde ein Primerpaar ausgewählt, von dem ein Primer (pHM2-7s) an spezifische Sequenzen des Targeting-Konstruktes bindet (entsprechend Position 7727 bis 7750 von pHM2; EMBL-Accession Number X76683), währenddessen der zweite Primer (mgL119-15as) aus der 3'-flankierenden Sequenz des genomischen L119 Allel ausgewählt wurde (entspechend Position 15116 bis 15093 von SEQ ID NO: 4):
Verwendete Primer für die PCR waren:
Die PCR wurde nach dem Protokoll "Polymerase-Kettenreaktionen" mit folgenden Bedingungen durchgeführt: 50 ng genomische DNA, mit 4 min 96°C initialer Denaturierung und 40 Zyklen mit 15 sec 96°C Denaturierung, 30 sec 60°C Annealing und 3 min 72°C Elongation. Die beiden Primer können ein PCR-Produkt (2217 bp) nur nach erfolgreicher homologer Rekombination des L119 Targeting- Konstruktes mit dem endogenen L119 Allel amplifizieren. Fig. 18 zeigt ein Foto eines Agarosegeles einer solchen PCR-Amplifikation. Eine Bande der erwarteten Größe wurde von genomischer DNA der ES-Zellen #308 und #341 amplifiziert, aber nicht von #307. In der ersten Spur wurde eine Negativkontrolle analysiert (PCR-Reaktion ohne ES-Zell-DNA). Als Marker wurde die 1-kb-Leiter von MBI Fermentas geladen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass in den ES-Zellklonen #308 und #341 die gewünschte homologe Rekombination stattgefunden hat. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Protein, enthaltend

a) eine der in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 dargestellten Aminosäuresequenzen, oder

b) eine durch Substitution, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 erhältliche Sequenz, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen Eigenschaften der in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 dargestellten Proteine erhalten bleibt, oder

c) ein funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil eines der in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 dargestellten Proteine.

12. Isoliertes Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eines der folgenden Sequenzmotive umfasst:

a) DALRRFQGLLLDRRGRLH

b) QVLRLREVARRLERLRRRSL

c) GALAAIVGLSLSPVTLG

d) SAVGLGVATAGGAVTITSDLSLIFCNSRE

e) RRVQEIAATCQDQMRE

f) ALYNSVYFIVFFGSRGFLIPRRAEG

g) TKVSQAVLKAKIQKL

h) ESLESCTGALDELSEQLESRVQLCTK

3. Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2.

4. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie

a) für ein Protein kodiert, das wenigstens 60% Identität mit der in SEQ ID NO: 3, 6, 7 oder 24 dargestellten Sequenz hat, oder

b) eine Identität von wenigstens 60% zu einer der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 hat, oder

5. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie die in SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 22 oder 23 dargestellte Sequenz enthält.

6. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 verknüpft mit mindestens einem genetischen Regulationselement.

7. Transgener nicht-menschlicher Organismus, transformiert mit einer funktionellen oder nicht funktionellen transgenen Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 oder einem funktionellen oder nicht funktionellen transgenen Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 6.

8. Transgener nicht-menschlicher Organismus nach Anspruch 7, wobei es sich um einen tierischen Organismus handelt.

9. Transgene nicht-menschlichee Tiere, in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen, oder in deren Keimzellen und der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen die Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 durch gentechnische Verfahren transgen verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurde.

10. Verfahren zum Auffinden von Verbindungen mit spezifischer Bindungsaffinität zu einem Protein nach einem der Ansprüche 1 oder 2, das folgende Schritte umfaßt:

a) Inkubation des Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 mit der zu testenden Verbindung,

b) Detektion der Bindung der zu testenden Verbindung an das Protein.

11. Verfahren zum Auffinden von Verbindungen mit spezifischer Bindungsaffinität zu einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, das folgende Schritte umfaßt:

a) Inkubation einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 mit der zu testenden Verbindung,

b) Detektion der Bindung der zu testenden Verbindung an die Nukleinsäure.

12. Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die mindestens eine wesentliche Eigenschaft oder die Expression eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 modulieren oder normalisieren, das folgende Schritte umfaßt:

a) Inkubation eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 oder einem Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 6 oder einem transgenen Organismus gemäß Anspruch 7 oder 8 oder einem transgenen Tier gemäß Anspruch 9 mit der zu testenden Verbindung,

b) Bestimmung der Modulation oder Normalisierung einer wesentlichen Eigenschaft oder der Expression eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Modulation oder Normalisierung einer wesentlichen Eigenschaft durch direkte Bindung der zu testenden Verbindung an besagtes Protein, Nukleinsäuresequenz oder Nukleinsäurekonstrukt ermittelt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass dabei zum Einsatz kommen

a) eine Immunpräzipitation, oder

b) ein "N-Hybrid" System, oder

c) eine Phagen Display System, oder

d) eine Bibliothek niedermolekularer Verbindungen, oder

e) ein Reporter-System, oder

f) Antikörperselektionstechniken, oder

g) Immuno-Assays wie ELISA oder Western-Blot, oder

h) "molecular modelling" unter Verwendung von Strukturinformationen eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder einer Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Ansprüche 3 bis 5, oder

i) Affinitätschromatographie, oder

j) Mikrophysiometer.

15. Verbindung erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14.

16. Verbindung nach Anspruch 15, bei der es sich um

a) ein Protein, oder

b) eine Nukleinsäure, oder

c) eine niedermolekulare Verbindung mit einem Molekuargewicht unter 1000 g/Mol.

handelt.

17. Verbindung nach Anspruch 15 oder 16, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus poly- oder monoklonalen Antikörper, Antikörpergemische, einzelkettigen Antikörpern oder Antikörperfragmenten, Aptameren, natürlichen oder künstlichen Transkriptionsfaktoren, antisense Nukleinsäuren, doppelsträngige RNA-Moleküle, α-anomeren Nukleinsäuren, niedermolekulare Verbindungen und Ribozymen.

18. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, eines Nukleinsäurekonstruktes gemäß Anspruch 6 oder eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Identifizierung von Proteinen, die zu einem Protein gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zu einem Protein gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen.

19. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 oder eines Fragmentes davon zur Isolierung einer genomischen Sequenz über Homologiescreening.

20. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 als

a) Marker für humane Erbkrankheiten oder

b) zum Nachweis von Sequenzpolymorphismen, die mit Prädispositionen für Erkrankungen korrelieren.

21. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, einer komplementären Nukleinsäuresequenz zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis eines Nukleinsäurekonstruktes gemäß Anspruch 6 oder eines transgenen Organismus gemäß Anspruch 7 oder 8 oder Teilen davon zur Gentherapie von humanen Erkrankungen.

22. Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der Gegenwart, des Fehlens, der fehlregulierten Expression oder einer Fehlfunktion eines Protein gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 in einer biologischen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfaßt:

a) Gewinn einer biologischen Probe aus einer Testperson

b) Inkubation der biologischen Probe mit einem Reagenz, das zum Nachweis eines Protein gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 geeignet ist, in einer Weise, dass die Gegenwart, das Fehlens, die fehlregulierte Expression oder eine Fehlfunktion eines Protein gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 detektiert werden kann.

23. Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 in einer biologischen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfaßt:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 geeignet sind oder Mischungen davon,

b) Nachweis der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation,

c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 mit einem Standard.

24. Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 in einer biologischen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfaßt:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der spezifisch gegen Proteine gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 gerichtet ist,

b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes,

c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard.

25. Verwendung von Proteinen gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder von diesen abgeleiteten Proteinfragmenten oder Peptiden, von Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 oder daraus abgeleiteter komplementärer Nukleinsäuresequenzen oder Teilen derselben, von Nukleinsäurekonstrukten gemäß Anspruch 6 oder von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17 zur Herstellung von Arzneimitteln.