DE10100587C1 - Inhibiting expression of target genes, e.g. oncogenes, in cells, by introduction of complementary double-stranded oligoribonucleotide, after treating the cell with interferon - Google Patents
Inhibiting expression of target genes, e.g. oncogenes, in cells, by introduction of complementary double-stranded oligoribonucleotide, after treating the cell with interferonInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Verwendung und ei nen Kit zur Hemmung der Expression eines Zielgens.The invention relates to a method, a use and egg NEN kit for inhibiting the expression of a target gene.
Aus der WO 99/32619 und der WO 00/44895 sind Verfahren zur Hemmung der Expression von medizinisch oder biotechnologisch interessanten Genen mit Hilfe eines doppelsträngigen Oligori bonukleotids (dsRNA) bekannt. Die bekannten Verfahren sind nicht besonders effektiv.WO 99/32619 and WO 00/44895 describe processes for Inhibition of medical or biotechnological expression interesting genes with the help of a double-stranded oligori bonucleotides (dsRNA) known. The known methods are not particularly effective.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere ein möglichst wirksames Verfahren, eine möglichst wirksame Verwendung und ein Kit angegeben werden, mit denen eine noch effizientere Hemmung der Expression eines Zielgens erreichbar ist.The object of the present invention is to overcome the disadvantages to eliminate the state of the art. It should in particular the most effective method, the most effective Use and a kit can be specified with which one is still more efficient inhibition of the expression of a target gene can be achieved is.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 36 und 71 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 35, 37 bis 70 und 72 bis 99.This object is achieved by the features of claims 1, 36 and 71 solved. Advantageous configurations result from the Features of claims 2 to 35, 37 to 70 and 72 to 99.
Mit den erfindungsgemäß beanspruchten Merkmalen wird überra schenderweise eine drastische Erhöhung der Effektivität der Hemmung der Expression eines Zielgens erreicht. Die genauen Umstände dieses Effekts sind noch nicht geklärt.With the features claimed according to the invention is surprising Schenderend a drastic increase in the effectiveness of Inhibition of expression of a target gene achieved. The exact Circumstances of this effect have not yet been clarified.
Nach einem Ausgestaltungsmerkmal weist zumindest ein Ende des Oligoribonukleotids zumindest ein nicht nach Watson & Crick gepaartes Nukleotid auf. Es wird angenommen, dass durch die besondere Ausbildung zumindest des einen Endes des Oligoribo nukleotids die Stabilität desselben erhöht wird. Durch die Erhöhung der Stabilität wird die wirksame Konzentration in der Zelle erhöht. Die Effektivität ist gesteigert.According to one design feature, at least one end of the Oligoribonucleotide at least one not according to Watson & Crick paired nucleotide. It is believed that through the special training of at least one end of the oligoribo nucleotide the stability of the same is increased. Through the Increasing stability will result in effective concentration the cell increases. The effectiveness is increased.
Die Effektivität kann weiter gesteigert werden, wenn das Ende einen aus 1 bis 4 Nukleotiden gebildeten einsträngigen Ab schnitt und/oder ungepaarte Nukleotide aufweist. Eine beson dere Erhöhung der Stabilität des erfindungsgemäßen Oligoribo nukleotids ist beobachtet worden, wenn das Ende das 3'-Ende eines Strangs der doppelsträngigen Struktur ist.The effectiveness can be further increased when the end a single-stranded Ab formed from 1 to 4 nucleotides cut and / or unpaired nucleotides. A special their increase in the stability of the oligoribo according to the invention nucleotide has been observed when the end is the 3 'end one strand of the double-stranded structure.
Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal wird die Effektivi tät des Verfahrens erhöht, wenn zumindest ein weiteres, vor zugsweise nach den vorangegangenen Merkmalen ausgebildetes, Oligoribonukleotid in die Zelle eingeführt wird, wobei ein Strang oder zumindest ein Abschnitt des Strangs der doppel strängigen Struktur des Oligoribonukleotids komplementär zu einem ersten Bereich des Zielgens ist, und wobei ein Strang oder zumindest ein Abschnitt des Strangs der doppelsträngigen Struktur des weiteren Oligoribonukleotids komplementär zu ei nem zweiten Bereich des Zielgens ist. Die Hemmung der Expres sion des Zielgens ist in diesem Fall deutlich gesteigert.According to a further design feature, the effectiveness Activity of the procedure increased, if at least one more, before preferably designed according to the preceding features, Oligoribonucleotide is introduced into the cell, a Strand or at least a portion of the strand of double stranded structure of the oligoribonucleotide complementary to is a first region of the target gene, and being a strand or at least a portion of the strand of the double strand Structure of the further oligoribonucleotide complementary to egg is a second region of the target gene. Inhibition of express The target gene is significantly increased in this case.
Es hat sich weiter als vorteilhaft erwiesen, wenn das weitere Oligoribonukleotid eine doppelsträngige, aus mindestens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur auf weist. Nach einem weiteren besonders bevorzugten Ausgestal tungsmerkmal kann das Oligoribonukleotid und/oder das weitere Oligoribonukleotid eine doppelsträngige aus weniger als 25 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur auf weisen. It has also proven to be advantageous if the further Oligoribonucleotide is a double-stranded, at least 49 successive nucleotide pairs formed structure has. According to another particularly preferred embodiment The oligoribonucleotide and / or the other can be a feature Oligoribonucleotide is a double-stranded from less than 25 successive nucleotide pairs formed structure point.
Der erste und der zweite Bereich können abschnittsweise über lappen, aneinandergrenzen oder auch voneinander beabstandet sein.The first and the second area can over sections rag, adjoin one another or also spaced apart his.
Die erfindungsgemäßen Oligoribonukleotide können dann beson ders einfach in die Zelle eingeschleust werden, wenn sie in micellare Strukturen, vorteilhafterweise in Liposomen, einge schlossen werden. Es ist auch möglich das/die Oligoribonu kleotid/e in virale natürliche Kapside oder in auf chemischem oder enzymatischem Weg hergestellte künstliche Kapside oder davon abgeleitete Strukturen einzuschließen.The oligoribonucleotides according to the invention can then in particular which are simply introduced into the cell when they are in micellar structures, advantageously in liposomes be closed. It is also possible that the Oligoribonu Kleotid / e in viral natural capsids or in chemical or artificial capsids or enzymatically produced including structures derived therefrom.
Das Zielgen kann nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal eine der in dem anhängenden Sequenzprotokoll wiedergegebenen Sequenzen SQ001-SQ140 aufweisen. Es kann auch aus der fol genden Gruppe ausgewählt sein: Onkogen, Cytokin-Gen, Id- Protein-Gen, Entwicklungsgen, Priongen.The target gene can have a further design feature one of the reproduced in the attached sequence listing Sequences SQ001-SQ140 have. It can also be from the fol selected group: oncogene, cytokine gene, Id- Protein gene, development gene, prion gene.
Das Zielgen wird zweckmäßigerweise in pathogenen Organismen, vorzugsweise in Plasmodien, exprimiert. Es kann Bestandteil eines Virus oder Viroids, insbesondere eines humanpathogenen Virus oder Viroids, sein. Das Virus oder Viroid kann auch ein tier- oder pflanzenpathogenes Virus oder Viroid sein.The target gene is conveniently found in pathogenic organisms, preferably expressed in plasmodia. It can be part a virus or viroid, especially a human pathogen Virus or viroids. The virus or viroid can also be a animal or phytopathogenic virus or viroid.
Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal ist vorgesehen, dass die ungepaarten Nukleotide durch Nukleosidthiophosphate substituiert sind.According to a further design feature, that the unpaired nucleotides by nucleoside thiophosphates are substituted.
Die doppelsträngige Struktur der erfindungsgemäßen Oligoribo nukleotide kann weiter durch eine chemische Verknüpfung der beiden Stränge stabilisiert werden. Die chemische Verknüpfung kann durch eine kovalente oder ionische Bindung, eine Wasser stoffbrückenbindung, hydrophobe Wechselwirkungen, vorzugsweise van-der-Waals- oder Stapelungswechselwirkungen, oder durch Metall-Ionenkoordination gebildet werden. Es hat sich weiter als zweckmäßig und die Stabilität erhöhend erwiesen, wenn die chemische Verknüpfung in der Nähe des einen oder in der Nähe der beiden Enden des erfindungsgemäßen Oligoribonukleotids gebildet ist. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen hinsicht lich der chemischen Verknüpfung können den Merkmalen der An sprüche 23 bis 29 entnommen werden, ohne dass es dafür einer näheren Erläuterung bedarf.The double-stranded structure of the oligoribo according to the invention nucleotides can be further linked by chemically linking the both strands are stabilized. The chemical link can by a covalent or ionic bond, a water bridging, hydrophobic interactions, preferably van der Waals or stacking interactions, or by Metal ion coordination are formed. It has continued proven to be expedient and increase the stability if the chemical link near or near one the two ends of the oligoribonucleotide according to the invention is formed. Further advantageous refinements Lich the chemical linkage can the characteristics of the An Proverbs 23 to 29 are taken without it further explanation is required.
Zum Transport des/der erfindungsgemäßen Oligoribonukleotids/e hat es sich ferner als vorteilhaft erwiesen, dass diese an mindestens ein von einem Virus stammendes, davon abgeleitetes oder ein synthetisch hergestelltes virales Hüllprotein gebun den, damit assoziiert oder davon umgeben werden. Das Hüllpro tein kann vom Polyomavirus abgeleitet sein. Das Hüllprotein kann insbesondere das Virus-Protein 1 und/oder das Virus- Protein 2 des Polyomavirus enthalten. Nach einer weiteren Ausgestaltung ist vorgesehen, dass bei Bildung eines Kapsids oder kapsidartigen Gebildes aus dem Hüllprotein die eine Sei te zum Inneren des Kapsids oder kapsidartigen Gebildes ge wandt ist. Ferner ist es von Vorteil, dass das/die Oligoribo nukleotid/e zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär ist/sind. Die Zelle kann eine Ver tebratenzelle oder eine menschliche Zelle sein.To transport the oligoribonucleotide (s) according to the invention it has also proven to be advantageous that these at least one derived from a virus or a synthetically produced viral coat protein the one associated with or surrounded by. The envelope pro tein can be derived from the polyomavirus. The coat protein can in particular virus protein 1 and / or virus Contain protein 2 of the polyomavirus. After another Design is provided that when a capsid is formed or capsid-like structure from the coat protein is one te to the inside of the capsid or capsid-like structure turns. It is also advantageous that the oligoribo nucleotide (s) for the primary or processed RNA transcript of the target gene is / are complementary. The cell can have a ver tebratenzell or a human cell.
Erfindungsgemäß ist weiterhin die Verwendung eines Oligoribo nukleotids zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle vorgesehen, wobei das Oligoribonukleotid eine doppel strängige aus höchstens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaa ren gebildete Struktur aufweist, wobei ein Strang oder zumin dest ein Abschnitt des Strangs der doppelsträngigen Struktur komplementär zum Zielgen ist, in Kombination mit einer vorherigen Behandlung der Zelle mit Interferon. Hinsichtlich der Vorteile und der vorteilhaften Ausgestaltungen wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen.The use of an oligoribo is also in accordance with the invention nucleotide for inhibiting the expression of a target gene in a Cell provided, the oligoribonucleotide a double stranded from a maximum of 49 consecutive nucleotide pairs ren formed structure, wherein one strand or at least least a section of the strand of the double-stranded structure is complementary to the target gene, in combination with a previous one Treatment of the cell with interferon. With regard to the Advantages and the advantageous embodiments is based on the referenced previous statements.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung wird die Aufgabe außerdem gelöst durch einen Kit mit mindestens einem Oligoribonukleo tid mit einer doppelsträngigen aus höchstens 49 aufeinander folgenden Nukleotidpaaren gebildeten Struktur, wobei ein Strang oder zumindest ein Abschnitt eines Strangs der doppel strängigen Struktur komplementär zum Zielgen ist, und Inter feron. Hinsichtlich der Vorteile und der vorteilhaften Ausge staltungen wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwie sen.According to another aspect of the invention, the object is also solved by a kit with at least one oligoribonucleo tid with a double strand consisting of a maximum of 49 on top of each other following nucleotide pairs formed structure, wherein a Strand or at least a portion of a strand of double stranded structure is complementary to the target gene, and Inter feron. With regard to the advantages and the advantageous Ausge events is referred to the previous statements sen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen bei spielhaft erläutert. Es zeigen:The invention is described below with reference to the drawings explained in a playful way. Show it:
Fig. 1a - c schematisch ein erstes, zweites und drittes Oligoribonukleotid und Fig. 1a - c shows schematically a first, second and third oligoribonucleotide and
Fig. 2 schematisch ein Zielgen. Fig. 2 shows schematically a target gene.
Die in den Fig. 1a bis c gezeigten Oligoribonukleotide dsRNA I, dsRNA II und dsRNA III weisen jeweils ein erstes Ende E1 und ein zweites Ende E2 auf. Das erste Oligoribonukleotid dsRNA I und das dritte Oligoribonukleotid dsRNA III weisen an ihren Enden E1 und E2 einzelsträngige aus etwa 1 bis 4 unge paarten Nukleotiden gebildete Abschnitte auf. Beim zweiten Oligoribonukleotid dsRNA II handelt es sich um ein langes Oligoribonukleotid mit mehr als 49 Nukleotidpaaren.The oligoribonucleotides dsRNA I, dsRNA II and dsRNA III shown in FIGS . 1a to c each have a first end E1 and a second end E2. The first oligoribonucleotide dsRNA I and the third oligoribonucleotide dsRNA III have at their ends E1 and E2 single-stranded sections formed from about 1 to 4 unpaired nucleotides. The second oligoribonucleotide dsRNA II is a long oligoribonucleotide with more than 49 nucleotide pairs.
In Fig. 2 ist schematisch ein auf einer DNA befindliches Zielgen gezeigt. Das Zielgen ist durch einen schwarzen Balken kenntlich gemacht. Es weist einen ersten Bereich B1, einen zweiten Bereich B2 und einen dritten Bereich B3 auf.A target gene located on a DNA is shown schematically in FIG . The target gene is identified by a black bar. It has a first area B1, a second area B2 and a third area B3.
Jeweils ein Strang S1, S2 und S3 des ersten dsRNA I, zweiten dsRNA II und dritten Oligoribonukleotids dsRNA III ist kom plementär zum entsprechenden Bereich B1, B2 und B3 auf dem Zielgen.One strand each S1, S2 and S3 of the first dsRNA I, second dsRNA II and third oligoribonucleotide dsRNA III is com complementary to the corresponding area B1, B2 and B3 on the Target gene.
Die Expression des Zielgens wird dann besonders wirkungsvoll gehemmt, wenn die kurzkettigen ersten dsRNA I und dritten Oligoribonukleotide dsRNA III an ihren Enden E1, E2 einzel strängige Abschnitte aufweisen. Die einzelsträngigen Ab schnitte können sowohl am Strang S1, S3 als auch am Ge genstrang oder am Strang S1, S3 und am Gegenstrang ausgebil det sein. Es hat sich weiter gezeigt, dass ab einer bestimm ten Länge der Oligoribonukleotide, z. B. ab einer Länge von mehr als 49 Nukleotidpaaren, eine einzelsträngige Ausbildung der Enden E1, E2 weniger stark zur Unterdrückung der Expres sion des Zielgens beiträgt. Bei langen Oligoribonukleotiden, hier beim zweiten Oligoribonukleotid dsRNA II, ist eine ein zelsträngige Ausbildung an den Enden E1, E2 nicht unbedingt erforderlich.The expression of the target gene then becomes particularly effective inhibited when the short chain first dsRNA I and third Oligoribonucleotides dsRNA III at their ends E1, E2 individually have stringy sections. The single-stranded Ab cuts can be made on strand S1, S3 as well as on Ge trained in the opposite strand or on strand S1, S3 and on the opposite strand det be. It has also been shown that from a certain th length of the oligoribonucleotides, e.g. B. from a length of more than 49 nucleotide pairs, a single-stranded formation the ends E1, E2 less strong to suppress the express sion of the target gene. With long oligoribonucleotides, here with the second oligoribonucleotide dsRNA II, is a single-stranded training at the ends E1, E2 not necessarily required.
Die Bereiche B1, B2 und B3 können, wie in Fig. 2 gezeigt, von einander beabstandet sein. Sie können aber auch an einander grenzen oder überlappen.The areas B1, B2 and B3 can, as shown in FIG. 2, be spaced apart from one another. But you can also border or overlap each other.
Im Falle der einzelsträngigen Ausbildung der Enden E1, E2 sind alle denkbaren Permutationen möglich, d. h. es können ein Ende oder beide Enden des Strangs S1, S2, S3 oder ein Ende oder beide Enden des Gegenstrangs überstehen. Der einzel strängige Abschnitt kann 1 bis 4 gepaarte Nukleotide aufwei sen. Es ist auch möglich, dass ein Ende oder beide Enden E1, E2 mindestens ein nicht nach Watson & Crick gepaartes Nukleo tidpaar aufweisen.In the case of single-strand formation of the ends E1, E2 all possible permutations are possible, d. H. it can be a End or both ends of the string S1, S2, S3 or one end or protrude both ends of the opposite strand. The single stranded section can have 1 to 4 paired nucleotides sen. It is also possible that one end or both ends E1, E2 at least one nucleo not paired according to Watson & Crick tidpaar exhibit.
Soweit es sich bei der vorliegenden Erfindung um menschliche Zellen handelt, sind menschliche embryonale Stammzellen oder menschliche Keimzellen ausgeschlossen.As far as the present invention human cells are human embryonic stem cells or human Germ cells excluded.
Es wurden Fibroblasten mit Interferon-γ vorbehandelt. An schließend wurden aus Sequenzen des Grün-fluoreszierenden Proteins (GFP) der Alge Aequoria victoria abgeleitete doppel strängige RNAs (dsRNAs) zusammen mit dem GFP-Gen in Fibrobla sten mikroinjiziert. Schließlich wurde die Fluoreszenzabnahme gegenüber Zellen ohne dsRNA ausgewertet.Fibroblasts were pretreated with interferon-γ. to inferred from sequences of green fluorescent Protein (GFP) of the alga Aequoria victoria derived double stranded RNAs (dsRNAs) together with the GFP gene in Fibrobla micro-injected. Eventually the decrease in fluorescence evaluated against cells without dsRNA.
Mittels eines RNA-Synthesizer (Typ Expedite 8909, Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) und herkömmlicher che mischer Verfahren wurden die aus den Sequenzprotokollen SQ141 und SQ142 ersichtlichen RNA-Einzelstränge und die zu ihnen komplementären Einzelstränge synthetisiert. Die Hybridisie rung der komplementären Einzelstränge zum Doppelstrang er folgte durch Aufheizen des stöchiometrischen Gemischs der Einzelstränge in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 100 mM NaCl, auf 90°C und nachfolgendes langsames Abkühlen über 6 Stunden auf Raumtemperatur. Anschließend erfolgte Reinigung mit Hilfe der HPLC.Using an RNA synthesizer (type Expedite 8909, Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany) and conventional che Mixing methods were those from the sequence listing SQ141 and SQ142 visible RNA single strands and those to them complementary single strands synthesized. The hybridisie the complementary single strands to the double strand followed by heating the stoichiometric mixture Single strands in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8, 100 mM NaCl, to 90 ° C and subsequent slow cooling over 6 Hours at room temperature. This was followed by cleaning with the help of HPLC.
Als Testsystem für diese in vivo-Experimente diente die muri ne Fibroblasten-Zellinie NIH/3T3. Mit Hilfe der Mikroinjekti on wurde das GFP-Gen in die Zellen eingebracht. Die Expressi on des GFP in mit Interferon-γ vorbehandelten Zellen wurde unter dem Einfluß gleichzeitig mittransfizierter sequenzhomo loger dsRNA untersucht. Die Auswertung unter dem Fluoreszenz mikroskop erfolgte 3 Stunden nach Injektion anhand der grünen Fluoreszenz des gebildeten GFP. The muri served as the test system for these in vivo experiments ne fibroblast cell line NIH / 3T3. With the help of micro-injections the GFP gene was introduced into the cells. The Expressi on the GFP in cells pretreated with interferon-γ under the influence of simultaneously transfected sequence homo loger dsRNA examined. The evaluation under the fluorescence microscope was done 3 hours after injection using the green Fluorescence of the GFP formed.
Die Zellen wurden in DMEM mit 4,5 g/l Glucose, 10% fötalem Rinderserum unter 7,5% CO2-Atmosphäre bei 37°C in Kultur schalen inkubiert und vor Erreichen der Konfluenz passagiert. Das Ablösen der Zellen erfolgte mit Trypsin/EDTA. Zur Vorbe reitung der Mikroinjektion wurden die Zellen in Petrischalen überführt und bis zu Bildung von Mikrokolonien weiter inku biert. Anschließend wurde murines Interferon-γ (mIFN-γ) in einer Konzentration von 500 IU/ml zugegeben. Nach 20 Minuten wurde das Interferon-haltige Medium durch Interferon-freies Medium ausgetauscht. Die Mikroinjektion wurde nach weiteren 20 Minuten durchgeführt.The cells were incubated in DMEM with 4.5 g / l glucose, 10% fetal bovine serum under 7.5% CO 2 atmosphere at 37 ° C. in culture dishes and passaged before reaching confluence. The cells were detached using trypsin / EDTA. To prepare the microinjection, the cells were transferred to Petri dishes and incubated until microcolonies were formed. Murine interferon-γ (mIFN-γ) was then added at a concentration of 500 IU / ml. After 20 minutes, the interferon-containing medium was replaced by interferon-free medium. The microinjection was carried out after a further 20 minutes.
Die Kulturschalen wurde zur Mikroinjektion für ca. 10 Minuten aus dem Inkubator genommen. Es wurde in ca. 50 Zellen pro An satz innerhalb eines markierten Bereiches unter Verwendung des Mikroinjektionssystems FemtoJet der Firma Eppendorf, Deutschland, einzeln injiziert. Anschließend wurden die Zel len weitere drei Stunden inkubiert. Für die Mikroinjektion wurden Borosilikat-Glaskapillaren der Firma Eppendorf mit ei nem Spitzeninnendurchmesser von 0,5 µm verwendet. Die Mikro injektion wurde mit dem Mikromanipulator 5171 der Firma Ep pendorf durchgeführt. Die Injektionsdauer betrug 0,8 Sekun den, der Druck ca. 80 hPa. Die in die Zellkerne injizierten Proben enthielten 0,01 µg/µl pGFP-C1 (Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, Deutschland) sowie an Dextran-70000 gekop peltes Texas-Rot in 14 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM KPO4, pH 7,5. Zusätzlich wurden in ca. 100 pl folgende dsRNAs zugegeben: Ansatz 1: 10 µM dsRNA (Sequenzprotokoll SQ141); Ansatz 2: 10 µM dsRNA (Sequenzprotokoll SQ142); Ansatz 3: 10 µM dsRNA (Se quenzprotokoll SQ141; mit Interferon vorinkubierte Zellen); Ansatz 4: 10 µM dsRNA (Sequenzprotokoll SQ142; mit Interferon vorinkubierte Zellen); Ansatz 5: ohne dsRNA (mit Interferon vorinkubierte Zellen).The culture dishes were removed from the incubator for about 10 minutes for microinjection. It was injected individually into approximately 50 cells per batch within a marked area using the FemtoJet microinjection system from Eppendorf, Germany. The cells were then incubated for a further three hours. Borosilicate glass capillaries from Eppendorf with an internal tip diameter of 0.5 µm were used for the microinjection. The microinjection was carried out with the micromanipulator 5171 from Ep pendorf. The injection time was 0.8 seconds, the pressure was approximately 80 hPa. The samples injected into the cell nuclei contained 0.01 µg / µl pGFP-C1 (Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, Germany) and Texas coupled to dextran-70000 Red in 14 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM KPO 4 , pH 7.5. In addition, the following dsRNAs were added in about 100 μl: batch 1: 10 μM dsRNA (sequence listing SQ141); Batch 2: 10 μM dsRNA (sequence listing SQ142); Batch 3: 10 μM dsRNA (sequence protocol SQ141; cells preincubated with interferon); Batch 4: 10 µM dsRNA (sequence listing SQ142; cells pre-incubated with interferon); Approach 5: without dsRNA (cells pre-incubated with interferon).
Die Zellen wurden bei Anregung mit Licht der Anregungswellen länge von Texas-Rot, 568 nm, bzw. von GFP, 513 nm, mittels eines Fluoreszenzmikroskops untersucht. Die Fluoreszenz aller Zellen im Gesichtsfeld wurde bestimmt und in Relation zur Zelldichte (ausgedrückt durch deren Gesamtproteinkonzentrati on) gesetzt.The cells were excited with light from the excitation waves length of Texas red, 568 nm, or of GFP, 513 nm, by means of of a fluorescence microscope. The fluorescence of everyone Cells in the visual field were determined and in relation to the Cell density (expressed by their total protein concentration on).
Bei beiden dsRNAs konnte bei vorangegangener Inkubation der Zellen mit Interferon-γ ein deutlich stärkerer hemmender Ef fekt auf die Expression des GFP-Gens in Fibroblasten beobach tet werden als bei den nicht mit Interferon behandelten Zel len (Tabelle 1). Darüber hinaus war bei vorbehandelten Zellen bereits bei einer Konzentration von 10 µM eine Hemmung der Genexpression zu erreichen, was ohne Vorbehandlung nicht mög lich war. Auch eine geringfügige Hemmung der Genexpression durch Interferon allein wurde beobachtet, die allerdings nicht Gen-spezifisch ist.In the case of both dsRNAs, the Cells with interferon-γ a significantly stronger inhibitory Ef observed for the expression of the GFP gene in fibroblasts than in the cells not treated with interferon len (Table 1). In addition, pretreated cells an inhibition of the already at a concentration of 10 µM To achieve gene expression, which is not possible without pretreatment was. Also a slight inhibition of gene expression by interferon alone was observed, however is not gene-specific.
Die vor der Applikation von dsRNAs durchgeführte Behandlung mit Interferon-γ ermöglicht somit eine stärkere Hemmung der Genexpression in Säugerzellen bereits bei niedrigeren Konzen trationen als dies nur mit dsRNA allein erreichbar ist. The treatment performed before the application of dsRNAs with interferon-γ thus enables a greater inhibition of the Gene expression in mammalian cells even at lower concentrations trations than can only be achieved with dsRNA alone.
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Claims (99)
Einführen mindestens eines Oligoribonukleotids (dsRNA I) in einer zur Hemmung der Expression des Zielgens ausreichenden Menge,
wobei das Oligoribonukleotid (dsRNA I) eine doppelsträngige aus höchstens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebil dete Struktur aufweist, und wobei ein Strang (S1) oder zumin dest ein Abschnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur komplementär zum Zielgen ist,
wobei vor dem Einführen des Oligoribonukleotids die Zelle mit Interferon behandelt wird.1. A method for inhibiting expression of a target gene in a cell comprising the following steps:
Introducing at least one oligoribonucleotide (dsRNA I) in an amount sufficient to inhibit expression of the target gene,
wherein the oligoribonucleotide (dsRNA I) has a double-stranded structure formed from a maximum of 49 successive pairs of nucleotides, and wherein one strand (S1) or at least a portion of the strand (S1) of the double-stranded structure is complementary to the target gene,
wherein the cell is treated with interferon before the introduction of the oligoribonucleotide.
wobei ein Strang (S1) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur des Oligoribonu kleotids (dsRNA I) komplementär zu einem ersten Bereich (B1) des Zielgens ist,
und wobei ein Strang (S2) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S2) der doppelsträngigen Struktur des weiteren Oli goribonukleotids (dsRNA II) komplementär zu einem zweiten Be reich (B2) des Zielgens ist.6. The method according to any one of the preceding claims, wherein at least one further, preferably formed according to one of the preceding claims 2-5, oligoribonucleotide (dsRNA II) is introduced into the cell,
wherein a strand (S1) or at least a portion of the strand (S1) of the double-stranded structure of the oligoribonucleotide (dsRNA I) is complementary to a first region (B1) of the target gene,
and wherein one strand (S2) or at least a portion of the strand (S2) of the double-stranded structure of the further oligoribonucleotide (dsRNA II) is complementary to a second region (B2) of the target gene.
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