DD279962A1

DD279962A1 - CONFOCAL LASER GRID MICROSCOPE

Info

Publication number: DD279962A1
Application number: DD32545289A
Authority: DD
Inventors: Tobias Damm; Uwe Stamm; Peter Fischer; Karl-Heinz Geier; Guenter Schoeppe
Original assignee: Zeiss Jena Veb Carl
Priority date: 1989-02-02
Filing date: 1989-02-02
Publication date: 1990-06-20
Also published as: DE3936646A1; DD279962B5

Abstract

Konfokales Laserrastermikroskop, bei dem die durch die punktförmige Bestrahlung einer Probe ausgelöste physikalische Wechselwirkung mit einem geeigneten Empfänger erfasst und ortsabhängig zum Aufbau eines digitalen Bildes der Objekteigenschaften verwandt wird. Seine Abbildungsqualität (Auflösung) ist weitgehend unabhängig von äußeren mechanischen oder thermischen Störeinflüssen bei vergleichsweise geringem Aufwand. Dieses wird erreicht, indem eine Blende im Strahlaufweitungssystem des Beleuchtungsstrahlenganges derart angeordnet ist, dass diese Blende Modenblende des Beleuchtungsstrahlenganges und gleichzeitig Detektorblende des Abbildungsstrahlenganges ist. Figur{konfokales Laserrastermikroskop; Strahlablenkung; fotoelektrischer Empfänger; Modenblende; Detektorblende; gemeinsame Blende}Confocal laser scanning microscope, in which the physical interaction, which is triggered by the punctiform irradiation of a sample, is recorded with a suitable receiver and used in a location-dependent manner to construct a digital image of the object properties. Its imaging quality (resolution) is largely independent of external mechanical or thermal interference with relatively little effort. This is achieved by arranging a diaphragm in the beam expansion system of the illumination beam path such that this diaphragm is the mode diaphragm of the illumination beam path and at the same time the detector diaphragm of the imaging beam path. Figure {confocal laser scanning microscope; Beam deflection; photoelectric receiver; Mode aperture; Detector diaphragm; common aperture}

Description

Hierzu 1 Seite ZeichnungFor this 1 page drawing

Field of application of the invention

Die Erfindung ist für die Anwendung in Laserrastermikroskopen vorgesehen. Im Gegensatz zur konventionellen Lichtmikroskopie wird bei der Laser-Raster-Mikroskopie das Objekt mit einem fokussieren Laserstrahl beleuchtet. Jede durch punktförmige Bestrahlung des Objektes ausgelöste physikalische Wechsf !wirkung kann mit einem geeigneten Empfänger erfaßt und ortsabhängig zum Aufbau eines digitalen Bildes der Objekteigenschaften (z. B. Reflexion, Fluoreszenz, ausgelöster Photostrom) verwendet werden.The invention is intended for use in laser scanning microscopes. In contrast to conventional light microscopy, laser scanning microscopy illuminates the object with a focused laser beam. Each physical interaction caused by point-like irradiation of the object can be detected with a suitable receiver and used in a location-dependent manner to build up a digital image of the object properties (eg reflection, fluorescence, triggered photocurrent).

Characteristic of the known state of the art

Laserrastermikroskope können in ihrer allgemeinen Form als optische Systeme aufgefaßt werden, die eine punktförmige Lichtquelle auf das Objekt abbilden. Das vom Objektpunkt ausgehende Signal wird durch einen geeigneten Detektor erfaßt. Ein entsprechendes Bild wird durch rasterförmige Abtastung des Objektes (Relativbewegung zwischen Objekt und Beleuchtungsstrahl) aufgenommen (Wilson, Sheppard: „Theory and Practice of Scanning optical Microscopy", Academic PressLaser scanning microscopes, in their general form, can be understood as optical systems that image a point light source onto the object. The signal originating from the object point is detected by a suitable detector. A corresponding image is taken by scanning the object (relative movement between the object and the illumination beam) (Wilson, Sheppard: "Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy", Academic Press

Ein hervorstechendes Merkmal sogenannter konfokaler Anordnungen ist die hohe Tiefenauflösung. Bei diesen Anordnungen wird die wirksame Empfängerfläche kleiner als der Durchmesser des bei Abbildung eines punktförmigen Objektes entstehenden Beugungsscheibchens gehalten. Man kann von einem P jnktdetektor sprechen. Damit wird eine kohärente Übertragung gewährleistet.A salient feature of so-called confocal arrangements is the high depth resolution. In these arrangements, the effective receiver area is kept smaller than the diameter of the diffraction disk resulting from imaging a point-like object. One can speak of a pnn detector. This ensures a coherent transmission.

Anordnungen dieser Art werden auch als Laserrastermil.roskope vom Typ Il bezeichnet.Arrangements of this type are also referred to as type II laser scanning microscopes.

Der grundlegende Aufbau einer solchen Anordnung ist in dem US-Patent 3013467 beschrieben. Nachteilig bei allen derartigen Einrichtungen ist die hohe Empfindlichkeit der Justierung der drei ineinander abzubildenden Punkte: Punktlichtquelle Objektpunkt - Punktdetektor. Bereits geringste laterale Verlagerungen besonders der Pi nktlichtquelle gegenüber dem Punktde- ;Ktor verändern einschneidend oie Bildinformation. Das dabei angewandte Ob: jktscanning ist relativ langsam und erfordert jn die Scanniiigeinrichtung und deren Parameter angepaßte Objekte.The basic structure of such an arrangement is described in U.S. Patent 3,013,467. A disadvantage of all such devices is the high sensitivity of the adjustment of the three points to be mapped into each other: point light source object point - point detector. Even the slightest lateral displacements, especially of the subject light source, in relation to the point end gate, drastically change the picture information. The object inspection used is relatively slow and requires objects adapted to the scanning device and its parameters.

in einer weiteren bekannten Anordung (DE OS 3422143) sind bereits erste praktische Ansätze erkennbar, durch geeignete Strahlführung das sog. Strahlscanning durchzuführen und dabei die Empfindlichkeit des Mikroskopaufbaues gegenüber Instabilitäten zu reduzieren. In dieser Anordnung wird das zu untersuchende Licht erst kurz vor der Ebene, in der der Punktdetektor angeordnet ist, vom beleuchtenden getrennt, so daß Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang die gleichen Elemente durchlaufen und aufgrund der Umkehrbarkeit des Lichtweges sich Auswirkungen geringer Instabilität wieder kompensieren. Erst nach einem Teilungselement (in Untersuchungsrichtung gesehen) werden unterschiedliche Wege durchlaufen, in denen Abweichungen von der exakten Zentrierung auftreten.In a further known arrangement (DE OS 3422143), the first practical approaches are already recognizable to carry out the so-called beam scanning by means of suitable beam guidance, thereby reducing the sensitivity of the microscope setup to instabilities. In this arrangement, the light to be examined is not separated from the lighting until shortly before the plane in which the point detector is arranged, so that illumination and observation beam pass through the same elements and due to the reversibility of the light path compensate for effects of low instability again. Only after a dividing element (seen in the examination direction) are different paths through which deviations from the exact centering occur.

Die genannte Anordnung verwendet beleuchtungsseitig eine Punktlichtquelle (Punktblende, Lasertaille), die als „Sonde" in das Objekt und von dort auf dem Abbildungsweg in eine Punktblende abgebildet wird. Das Bild der beleuchtungsseitigen Blende, dessen Durchmesser wenige pm beträgt, muß konstant auf Bruchteile seines Durchmessers zur abbildungsseitigen Blende justiert bleiben. Dabei ist der Justiervorgang recht aufwendig und die Sicherung der exakten Justierung über längere Zeiträume, auch aufgrund von Umwelteinflüssen, äußerst schwierig, da die beiden von der Strahlentei'ung aus getrennt laufenden Strahlengange durch Alterung von Bauteilen, thermische Veränderungen, Luftschlieren zeitweilig oder ständig dejustiert werden.The said arrangement uses on the illumination side a point light source (spot stop, laser waist), which is imaged as a "probe" into the object and from there on the imaging path into a point stop The image of the illumination side stop, whose diameter is a few pm, must be constant at fractions of its The adjustment process is rather complicated and the adjustment of the exact adjustment over longer periods of time, also due to environmental influences, is extremely difficult, since the two beam paths separated from the radiation emission due to aging of components, thermal changes , Air streaks are temporarily or permanently misadjusted.

Weiterhin wirkt sich ein anderer Umstand ebenfalls nachteilig aus. Verändert sich z.B. durch Höhenunterschiede im Objekt die Lage der Objektebene, so entsteht auf dem Objekt ein Zerstreuungskreis des Bildpunktes der beleuchtungsseitigen Punktblende.Furthermore, another circumstance also has a disadvantageous effect. If, for example, due to differences in height in the object, the position of the object plane, so arises on the object a circle of confusion of the pixel of the lighting side point diaphragm.

In die beobachtungsseitige Blende fällt dann sin geringerer Lichtstrom, woraus eine hohe Tiefenauflösung resultier'. 'Jm wieder optimale Abbildungsverhältnisse zu erzeugen, muß das Objekt selbst axial so verschoben werden, bis es seine alte Lage wiederIn the observation-side aperture then falls sin lesser luminous flux, resulting in a high depth resolution result '. In order to produce optimal reproduction ratios again, the object itself must be shifted axially until it returns to its old position

einnimmt. Die dazu erforderlichen Feinbewegungen im O,1-pm-Bereich sind mit hohem technischen Aufwand verbunden. Mit Hilfe eines aktiven Spiegels wird die Auswirkung der Defokussierung bezüglich der Intensität kompensiert. Es wird ein Fokus der beleuchtungsseitigen Blende in der beobachtungsseitigen Punktblende bzw. auf dem Punktdetektor erzeugt. Das Objekt liegt dabei aber nicht mehr im Fokus, so daß die laterale Auflösung reduziert wird.occupies. The required fine movements in the O, 1-pm range are associated with high technical complexity. With the help of an active mirror, the effect of the defocusing on the intensity is compensated. A focus of the illumination-side diaphragm is generated in the observation-side point diaphragm or on the point detector. The object is no longer in focus, so that the lateral resolution is reduced.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist ein konfokales Laserrastermikroskop, bei dem die Nachteile der bisher bekannten Lösungen nicht auftreten, insbesondere soll d>e Stabilität der Abbildungsgüte quantitativ und qualitativ erhöht werden.The aim of the invention is a confocal laser scanning microscope, in which the disadvantages of the previously known solutions do not occur, in particular, the stability of the imaging quality should be increased quantitatively and qualitatively.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein konfokales Laserrastermikroskop zu schaffen, bei dem die Zentrierung der beleuchtungs- und abbildungsseitigen Blenden zueinander invariant gegen äußere Einflüsse und Alterung ist und bei geringem zusätzlichen Aufwand eine automatische Scharfeinstellung der Objektebene ermöglicht wird. Die Aufgabe wird durch ein konfokales Laserrastermikroskop für Auflichtmikroskopie, mindestens eine Laserlichtquelle, eine Strahlablenkeinrichtung mit mindestens einem Objektiv, sowie Umlenkelemente und mindestens einen fotoelektrischen Empfänger aufweisend, erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine Blende im Strahlaufweitungssystem des Beleuchtungsstrahlenganges derart angeordnet ist, daß die Blende Modusblende des Beleuchtungsstrahlenganges und gleichzeitig Detektorblende eines Abbildungsstrahlenganges ist, wobei das Strahlaufweitungssystem mindestens aus einer ersten Linse und einer zweiten verschiebbaren Linse besteht.The invention has for its object to provide a confocal laser scanning microscope, in which the centering of the illumination and image-side aperture each other is invariant to external influences and aging and with little additional effort automatic focusing of the object plane is possible. The object is achieved by a confocal laser scanning microscope for reflected light microscopy, at least one laser light source, a beam deflecting device having at least one objective, as well as deflecting elements and at least one photoelectric receiver, according to the invention, that an aperture in the beam expansion system of the illumination beam path is arranged such that the aperture mode of the Illumination beam path and at the same time detector aperture of an imaging beam path, wherein the beam expansion system consists of at least a first lens and a second displaceable lens.

Vorteilhafte erfindungsgemäße Ausführungsformen bestehen darin, daß Mittel, wie Polarisatoren, ein Chopper, mindestens ein Sperrfilter, zur Trennung der Signalstrahlung von der Störstrahlung vorgesehen sind, und daß eine axiale Verschiebung einer zweiten verschiebbaren Linse des Strahlaufweitungssystemes zur Aufnahme des Höhenprofils eines Objektes durchführbar ist. Durch die erfindungsgemäße Trennung von beleuchtender und abbildender Strahlung, in Abbildungsrichtung gesehen hinter der Blende, sind Modenblende und Empfängerblende identisch. Lageveränderungen der Blende gegenüber der Optik führt das Blendenbild in gleicher Größe und Richtung mit aus, so daß das Bild der Modenblende zwangsläufig zur Punktblende zentriert bleibt. Dadurch ist stets eine exakte räumliche Zuordnung von Punktlichtquelle, Objektpunkt und Punktdetektor gegeben. Zur erforderlichen Trennung der Signalstrahlung von Strahlungskomponenten, die durch Reflexion an der Blende oder Streuung an Elementen im Strahlengang entstehen, werdenAdvantageous embodiments of the invention are that means such as polarizers, a chopper, at least one barrier filter, are provided for separating the signal radiation from the interference, and that an axial displacement of a second displaceable lens of the beam expansion system for receiving the height profile of an object is feasible. Due to the inventive separation of illuminating and imaging radiation, as seen in the imaging direction behind the aperture, mode aperture and receiver aperture are identical. Changes in position of the aperture relative to the optics performs the aperture image in the same size and direction, so that the image of the mode aperture inevitably remains centered to the point aperture. As a result, an exact spatial assignment of point light source, object point and point detector is always given. For the necessary separation of the signal radiation of radiation components, which arise by reflection at the diaphragm or scattering of elements in the beam path are

• polarisationsoptische Elemente (Pol-Filter λ/4-PlaUdn),Polarization-optical elements (Pol filter λ / 4 plates),

• interferenzoptische Methoden,• interference optical methods,

• ein Choppern des Signalstrahlenganges,A chopper of the signal beam path,

• zeitempfindliche Signaldetektoren (gating, Laufzeit) oder• time-sensitive signal detectors (gating, running time) or

• spektrale Filter bei Fluoieszenzverfahren vorgesehen.• Spectral filters provided in Fluoieszenzverfahren.

Die axiale Verstellung einer zweiten verschiebbaren Linse im Strahlengang wird zur Fokussierung auf die Objektebene bzw. zur Aufnahme des Höhenprofils des Objektes verwendet. Das konfokale Laserrastermikroskop wird im folgenden näher erläutert, es ist zur Aufnahme von Auflicht- oder Fluoreszenzbildern geeignet. Beleuchtungsseitig ist eine körperliche Blende angeordnet, die gegebenenfalls im Fokus eines Teleskopsystems steht und als Mittel zur K-Raum-Filterung dient. Diese Blende entspricht der punktförmigsn Lichtquelle, die üb jr eine entsprechende Optik auf das Objekt abgebildet wird. Ein in der Erfindung wahlweise vorgesehener Referenzdetektor bi mittelt die Intensität des beleuchtenden Laserlichtes. Das bei der Beleuchtung des Objektes vom Objekt ausgehende Signallich'. (Reflexion, Streuung Fluoreszenz) durchläuft alle optischen Elemente des Beleuchtungsstrahlenganges in entgegengesetzter Richtung wie der Beleuchtungsstrahl selbst. Im Unterschied zu bekannten konfokalen Anordnungen trifft das Signallicht auf die erwähnte, im Beleuchtungsstrahlengang stehende Blende, die aufgrund der Anordnung stets zentriert bleibt. Nur das Zentrum des Beugungsscheibchens des Signallichts kann die Jlende passieren. Das durch die Blende tretende Signallicht wird durch geeignete Mittel vom Beleuchtungsstrahlengang separiert (Strahlteiler) und tfuf den Signaldetektor gerichtet.The axial adjustment of a second displaceable lens in the beam path is used for focusing on the object plane or for recording the height profile of the object. The confocal laser scanning microscope is explained in more detail below, it is suitable for recording incident light or fluorescence images. On the illumination side, a physical diaphragm is arranged, which optionally stands in the focus of a telescope system and serves as a means for K-space filtering. This diaphragm corresponds to the punctiform light source which is imaged onto the object via a corresponding optical system. A reference detector bi optionally provided in the invention averages the intensity of the illuminating laser light. The signal light emanating from the object when illuminating the object. (Reflection, scattering fluorescence) passes through all the optical elements of the illumination beam path in the opposite direction as the illumination beam itself. In contrast to known confocal arrangements, the signal light strikes the mentioned, standing in the illumination beam path aperture, which always remains centered due to the arrangement. Only the center of the diffraction disk of the signal light can pass the end. The signal light passing through the diaphragm is separated from the illumination beam path by suitable means (beam splitter) and directed to the signal detector.

Eine Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses wird durch die in der Erfindung wahlweise vorgesehene Unterdrückung ungewünschter Polarisationskomponenten, durch Intensitätsmodulations und damit Lock-in-Nachweis, durch langzeitempfindliche Signaldetektoren (gating), oder durch Wellenlängsenelektion bei Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Zur automatischen Fokussierung auf die Objektebene kann in der erfindungsgemäßen Lösung eine der zwischen Blende und Objekt stehenden Linsen, im einfachsten Fall die der Blende am nächsten stehende, eingesetzt werden. Hierfür ist in der Erfindung eine Lösung zur axialen Translation der entsprechenden Linsen vorgesehen. Der Abstand Linse - Blende wird damit so eingestellt, daß die jeweils am Signaldetektor ankommende Lichtintensität maximal ist, womit eine Scharfstellung auf die Objektebene automatisch gewährleistet ist. Wird zusätzlich der Abstand zwischen Blende und der zweiten verschiebbaren Linse bei der Abtastung des Objektes an jedem Punkt ermittelt, erhält man das Höhenprofil des Objektes.An increase in the signal-to-noise ratio is made possible by the optionally provided in the invention suppression of unwanted polarization components, by intensity modulation and thus lock-in detection, by long-term sensitive signal detectors (gating), or by wavelength selection in fluorescence measurements. For automatic focusing on the object plane, in the solution according to the invention one of the lenses standing between the diaphragm and the object can be used, in the simplest case the lenses closest to the diaphragm. For this purpose, a solution for the axial translation of the corresponding lenses is provided in the invention. The lens-aperture distance is thus adjusted so that the light intensity arriving at the signal detector is at a maximum, thus automatically ensuring focus on the object plane. If, in addition, the distance between the diaphragm and the second displaceable lens is determined during the scanning of the object at each point, the height profile of the object is obtained.

Im Gegensatz zu bisher bekannten konfokalen Anordnungen tritt bei der erfindungsgemäßen Lösung bei dieser Vorgehensweise der Ermittlung von Höhenprofilen des Objektes kein lateraler Auflösungsverlust ein, da Punktlichtquelle und Punktempfänger identisch sind und, sobald die Lichtquelle in die Objektebene abgebildet wird, der Punktempfänger automatisch in der konjugierten Ebene liegt.In contrast to previously known confocal arrangements occurs in the inventive solution in this approach, the determination of height profiles of the object no loss of resolution since point light source and point receiver are identical and, as soon as the light source is imaged in the object plane, the point receiver automatically in the conjugate plane lies.

Ausführungsbeispielembodiment

Die Erfindung wird anhand eines Ausführungsbeispieles näher erläutert. In der Zeichnung ist schematisch das konfokale Laserrastermikroskop dargestellt.The invention will be explained in more detail with reference to an embodiment. In the drawing, the confocal laser scanning microscope is shown schematically.

Ein Laser 1 wird über einen ersten Polarisator 2, einen ersten Strahlteiler 3 und die erste λ/4-Platte 4 mit Hilfe der ersten Lins« 5A laser 1 is connected via a first polarizer 2, a first beam splitter 3 and the first λ / 4 plate 4 with the aid of the first lens 5

auf eine körperliche Blende 6 fokussiert. Diese Blende dient in der erfindungsgemäßen Lösung gleichzeitig als K-Raum-Filter und als Modenblende. Mit der zweiten verschiebbaren Linse 7 wird die Strahlung kollimiert und durch das Laserrastermikroskop 10 auf die Objektebene 11 fokussiert. Um die vom Objekt den gleichen Lichtweg zurückkommende Signalstrahlung, die über den ersten Strahlenteiler 3 auf den Signaldetektor 13 gelangt, von der an der K-Raumblende zurückgesteuerten Störstrahlung zu unterscheiden, sind auffiabenabhängig verschiedene Mittel vorgesehen:focused on a physical aperture 6. This aperture serves in the inventive solution simultaneously as a K-space filter and as a mode aperture. With the second displaceable lens 7, the radiation is collimated and focused by the laser scanning microscope 10 on the object plane 11. In order to differentiate the signal radiation coming back from the object, the same light path, which reaches the signal detector 13 via the first beam splitter 3, from the interference radiation returned to the K-space screen, different means are provided depending on the case:

- Die Polarisationsrichtung der Signalstrahlung wird mit der λ/4-Platte 4 so gedreht, daß sie den zweiten Polarisator 14 passieren kann. Da sich die λ/4-Platte 4 unmittelbar über dem Objektiv 8 befindet, erfolgt für die Störstrahlung zwischen erstem Strahlteiler 3 und λ/4-Platte 4 keine Drehung der Polarisationsrichtung, so daß diese Störstrahlung am Polarisator 14 unterdrückt wird.The polarization direction of the signal radiation is rotated with the λ / 4 plate 4 so that it can pass through the second polarizer 14. Since the λ / 4 plate 4 is located directly above the lens 8, there is no rotation of the polarization direction for the interference between the first beam splitter 3 and λ / 4 plate 4, so that this interference is suppressed at the polarizer 14.

- Ein Chopper 15 im Abbildungsstrahlengang A ermöglicht einen Lock-in-Nachweis des Signales.- A chopper 15 in the imaging beam path A allows lock-in detection of the signal.

- Bei Fluoreszenz der Probe wird das Fluoreszenzsignal durch ein Sperrfilter 17, das die Laserwellenlänge sperrt, vor dem Signaldetektor 13 unterdrückt. Zur Korrektur von Schwankungen der Laserleistung im Laserrastermikroskop ist der zweite Strahlteiler 9 und der Referenzdetekor 12 vorgesehen. Eine automatische Fokussierung des Laserrastermikroskopes läßt sich durch Registrieren der maximalen Signalintensität bei axialer Verschiebung beispielsweise der zweiten verschiebbaren Linse 7 erreichen. Damit ist auch eine Betriebsart zur Vermessung der Höhenstruktur der Proben möglich, indem die Lage der zweiten verschiebbaren Linse 7 bei maximaler Signalintensität in Abhängigkeit vom Objektort aufgetragen wird.In the case of fluorescence of the sample, the fluorescence signal is suppressed by a blocking filter 17, which blocks the laser wavelength, in front of the signal detector 13. In order to correct fluctuations in the laser power in the laser scanning microscope, the second beam splitter 9 and the reference detector 12 are provided. An automatic focusing of the laser scanning microscope can be achieved by registering the maximum signal intensity at axial displacement, for example, the second displaceable lens 7. Thus, an operating mode for measuring the height structure of the samples is possible by the position of the second displaceable lens 7 is applied at maximum signal intensity as a function of the object location.

Claims

1. confocal laser scanning microscope for incident light microscopy, at least one laser light source, a beam deflecting device having at least one lens, as well as deflecting elements and at least one photoelectric receiver, characterized in that a diaphragm (6) in the beam expansion system, consisting of the elements (5,7) of the illumination beam path (B) is arranged such that the diaphragm (6) mode aperture of the illumination beam path (B) and at the same time detector aperture of a training beam path (A) i & t.

2. confocal laser scanning microscope according to claim 1, characterized in that means, such as polarizers (2,14), a chopper (15), at least one barrier filter (17), are provided for separating the signal radiation from the interference.

3. confocal laser microscope according to claim 1, characterized in that an axial displacement of a second displaceable lens (7) of the beam expansion system (5,7) for receiving the height profile of an object is feasible.