DD279267A1 - PROCESS FOR PRODUCING MICROBIAL LIPASE - Google Patents
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Abstract
Das Verfahren betrifft die mikrobielle Herstellung von Lipase mittels Hefen. Durch die Verwendung des neuen Hefestammes Yarrowia lipolytica IMET 43896 in einem aeroben Kultivierungsverfahren mit kostenguenstigen und verfuegbaren Neutralfetten als eine oder alleinige C-Quelle kann eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute an extrazellulaerer Lipase realisiert werden.The method relates to the microbial production of lipase by means of yeasts. By using the new yeast strain Yarrowia lipolytica IMET 43896 in an aerobic cultivation process with inexpensive and available neutral fats as sole or sole C source, a high space-time yield of extracellular lipase can be realized.
Description
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Lipase durch Kultivierung eines neuen Hefestammes. Sie kann in entsprechenden mikrowellen Enzymsyntheseanlagen Verwendung finden.The invention relates to the production of lipase by culturing a new yeast strain. It can be used in corresponding microwave enzyme synthesis systems.
Zur Herstellung von Lipasen mittels Mikroorganismen sind verschiedene Verfahren bakannt, in welchen Bakterien, Hefen oder Pilze als mikrobielle Produzenten auf verschiedenen Nährmedien, wie Maisquellwasser, Molke, Bouillon u. ä. gezüchtet werden.For the production of lipases by means of microorganisms various methods are bakannt in which bacteria, yeasts or fungi as microbial producers on various nutrient media, such as corn steep liquor, whey, bouillon u. Ä. be bred.
Aber auch andere kohlehydrathaltige Medien, die Glucose, Saccarose, Mannitol, Sorbitol, Dextrin, Cellulose oder Stärke enthalten, werden verwendet. Darüber hinaus werden wasserlösliche Fettsäureester als C-Quelle in der Fermentation eingesetzt.However, other carbohydrate containing media containing glucose, sucrose, mannitol, sorbitol, dextrin, cellulose or starch are also used. In addition, water-soluble fatty acid esters are used as C source in the fermentation.
Der Nachteil der bisherigen Verfahren besteht im allgemeinen darin, daß bei Verwendung von Pilzen, aufgrund ihrer geringen Wachstums- und Enzymbildungsgeschwindigkeiten, sehr lange Fermentationszeiten erforderlich sind. So liegt die Kultivierungsdauer bei Verwendung von Rhizopus chinensis Hl-S zwischen 3 und 7 Tagen (US 4665029). Die Enzymbildungsgeschwindigkeit beträgt dabei 4χ 102EE/lxh. Auf der anderen Seite haben Bakterien, die meist mit relativ guter Geschwindigkeit wachsen, den Nachteil, daß sie nur geringe Volumenaktivitäten an extracellular Lipase ergeben.The disadvantage of the previous methods is generally that when using fungi, due to their low growth and enzyme formation rates, very long fermentation times are required. Thus, the cultivation time when using Rhizopus chinensis HI-S is between 3 and 7 days (US 4665029). The enzyme formation rate is 4χ 10 2 EE / lxh. On the other hand, bacteria which usually grow at a relatively good rate have the disadvantage that they give only low volume activities on extracellular lipase.
Beispielsweise wird gem. EP 204204 bei der Kultivierung von Pseudomonas fragi 22.39 B bei einer Kultivierungsdauer von 48 Stunden nur eine geringe Volumenaktivität von 2 Enzymeinheiten pro ml erreicht (eine Enzymeinheit EE entspricht der Menge Fettsäure in umol, die in 1 Minute aus einer Triacylglycerol-Emulsion freigesetzt wird). Die entsprechende Enzymbildungsgeschwindigkeit betrug in diesem Fall 0,4χ 102EE/lxh.For example, gem. EP 204204 in the cultivation of Pseudomonas fragi 22.39 B achieved a low volume activity of 2 units of enzyme per ml at a culture time of 48 hours (one unit of enzyme EE corresponds to the amount of fatty acid in umol, which is released in 1 minute from a triacylglycerol emulsion). The corresponding enzyme formation rate in this case was 0.4χ 10 2 ee / lxh.
Mit verschiedenen Stämmen von Staphylococcus capitis werden bei Fermentationszeiten von 24 bis 72 Stunden maximale Volumenaktivitäten von 6-12EE pro ml erreicht (EP 187869).With various strains of Staphylococcus capitis, maximum volume activities of 6-12EE per ml are achieved at fermentation times of 24 to 72 hours (EP 187869).
Weiterhin ist bekannt, daß der Bakterienstamm Acinetobacter calcoaceticus unter Verwendung wasserlöslicher Fettsäureester (Tween) als teurer C-Quelle Lipase produziert (DD 249712). Die dabei erreichte Enzymbildungsgeschwindigkeit lag bei nur 2x 102EE/lxh.Furthermore, it is known that the bacterial strain Acinetobacter calcoaceticus using water-soluble fatty acid esters (Tween) as expensive C-source lipase produced (DD 249712). The enzyme formation rate achieved was only 2 × 10 2 IU / lxh.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, Lipase in einem mikrobiellen Verfahren mit hohen Produktivitäten auf der Grundlage verfügbarer Rohstoffe zu produzieren.The object of the invention is to produce lipase in a microbial process with high productivities based on available raw materials.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Hefestamm zu selektiern und einzusetzen, der eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute an extrazellulärer Lipase lealisiert und dabei nicht die Verwendung von wasserlöslichen Fettsäureestern als C-Substrat erfordert.The invention has for its object to select and use a yeast strain, which lealisiert a high space-time yield of extracellular lipase and does not require the use of water-soluble fatty acid esters as C substrate.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Kultivierung des neuen Hefestammes Yarrowia lipolytica IMET 43896 im pH-Bereich von 3-7 und im Temperaturbereich von 15-4O0C unter Verwendung von Neutralfetten als eine oder alleinige C-Quelle gelöst.The object is achieved by culturing the new yeast strain Yarrowia lipolytica IMET 43896 in the pH range of 3-7 and in the temperature range of 15-4O 0 C using neutral fats as a single source or C-source.
Vorzugsweise ist dabei ein pH-Wert von 4-5 und ein Temperaturbereich von 20-3O0C einzustellen.Preferably, a pH of 4-5 and a temperature range of 20-3O 0 C is set.
Die Kultivierung erfolgt dabei diskontinuierlich bei einer Kultivierungsdauer von 6 bis 18 Stunden.The cultivation is carried out batchwise at a cultivation time of 6 to 18 hours.
Als Neutralfette können Glycerolester, Fette und Öle, vorzugsweise Rapsöl, sowie Gemische derselben eingesetzt werden, wobei ihr Anteil am Kultivierungsmedium 0,1 bis 10Ma.-% beträgt. Sie können als alleinige C-Quelle dienen, andererseits aber auch in Kombination mit kohlehydrdthaltigen oder n-alkanhaltigen Substraten verwendet werden.Glycerol esters, fats and oils, preferably rapeseed oil, and mixtures thereof can be used as neutral fats, their proportion of the culture medium being 0.1 to 10% by mass. They can serve as sole C source, but on the other hand can also be used in combination with carbohydrate-containing or n-alkane-containing substrates.
Unter den erfindungsgemäßen Kultivierungsbedingungen werden Enzymbildungsgeschwindigkeiten über 105 EE/I χ herreicht, was dem 5 bis 250fachen der gemäß Stand der Technik erraichten Leistung entspricht.Under the cultivation conditions according to the invention, enzyme formation rates above 10 5 IU / l are achieved, which corresponds to 5 to 250 times the performance determined according to the prior art.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnene Lipase ist wie folgt zu charakterisieren:The lipase obtained by the method according to the invention is characterized as follows:
Die Lipase besitzt ein Temperaturoptimum bei 40°C und ist über einen Beroich von 15 bis GO°C aktiv.The lipase has a temperature optimum at 40 ° C and is active over a range of 15 to GO ° C.
Die Lipase ist im pH-Bereich von 3 bis 11 aktiv, wobei das pH-Optimum im schwach alkalischen Bereich liegt. Bei einer Temperatur von 5°C ist das Enzym lagerstabil und weist im Zeitraum bis 6 Monate keinen Aktivitätsverlust auf.The lipase is active in the pH range of 3 to 11, the optimum pH being in the weakly alkaline range. At a temperature of 5 ° C, the enzyme is storage stable and has no loss of activity in the period up to 6 months.
Die neue Lipase ist in der Lage, natürliche und synthetische Triglycerole, Fette und Öle (Triolein 100% bei T = 37°C) zu hydrolysieren:The new lipase is able to hydrolyze natural and synthetic triglycerols, fats and oils (triolein 100% at T = 37 ° C):
Triolein 100Triolein 100
Tributyrin 114Tributyrin 114
Olivenöl 125Olive oil 125
Rapsöl 104Rapeseed oil 104
Leinöl 85Linseed oil 85
Rindertalg 80Beef tallow 80
Rinderfußöl 108Beef foot oil 108
Die Lipase vermag weiterhin. Ester wie ρ Nitrophenylacetat und -plamital zu hydrolisieren.The lipase can continue. To hydrolyze esters such as ρ nitrophenyl acetate and plamital.
Der neue Hefestamm Yarrowia lipolytica IMET 43869 wurde in der IMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR hinterlegt.The new yeast strain Yarrowia lipolytica IMET 43869 was deposited at the IMET microorganism depository at the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the AdW in the GDR.
DeV neue Stamm ist wie folgt zu charakterisieren:DeV new strain is characterized as follows:
Kreideweiß, stark gefaltete OberflächeChalk white, strongly folded surface
- Zellen überwiegend sehr langgestreckt, wenig ovale Zellen- Cells mostly very elongated, few oval cells
- nach 3 Tagen Hautbildung (Inseln! und Sediment im flüssigen Medium- Skin formation after 3 days (islands and sediment in liquid medium
- Blastosporen +- Blastospores +
- Pseudomycel +- pseudomycel +
Wachstum bei:Growth in:
2O0C mittleres Wachstum auf Agar 3O0C gutes Wachstum auf Agar 370C mittleres Wachstum auf Agar Assimilation von:2O 0 C medium growth on agar 3O 0 C good growth on agar 37 0 C medium growth on agar assimilation of:
Erythritol, D-Mannitol, D-Galactosidase, Glycerin, L-Sorbitose, Succinat, D-^'ücitol, D-Glucose, Ethanol, Lactat, Citrat, D-Ribose keine Assimilation von:Erythritol, D-mannitol, D-galactosidase, glycerol, L-sorbitose, succinate, D -''citol, D-glucose, ethanol, lactate, citrate, D-ribose no assimilation of:
Maltose, Cellobiose, Inositol, Lactose, Saccharose, Melibiose, Raffinoso, D-Xylose, Stärke, Salicin, D-Arabinose, Melizitose, Inulin, L-Arabinose, Trehalose, L-Rhamnose, Nitrat Die Erfindung wird durch folgendes Beispiel näher erläutert:Maltose, cellobiose, inositol, lactose, sucrose, melibiose, raffinoso, D-xylose, starch, salicin, D-arabinose, meliticose, inulin, L-arabinose, trehalose, L-rhamnose, nitrate. The invention is further illustrated by the following example:
Ein flüssiges Nährmedium (pH = 5), das 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Rapsöl und 0,03% Tween 80 enthält, wird mit dem Hefestamm IMET 432869 beimpft und 6 Stunden bei 250C im Schüttelkolben kultiviert. 3,51 Nährmedium, das folgende Zusammensetzung pro Liter aufweist:A liquid nutrient medium (pH = 5) containing 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, 1.0% rapeseed oil and 0.03% Tween 80 is inoculated with the yeast strain IMET 432869 and 6 hours at 25 0 C. cultivated in a shake flask. 3.51 nutrient medium having the following composition per liter:
werden mit 0,5i Vorkultur in einem 12-1 Rührfermentor beimpft. Die Temperatur beträgt 250C und der pH-Wert 5,0. Als Stickstoffqi'elle wird eine 5%ige Ammoniaklösung verwendet, die gleichzeitig zur pH-Regelung dient.are inoculated with 0.5i preculture in a 12-1 stirred fermentor. The temperature is 25 ° C. and the pH is 5.0. As Stickstoffqi'elle a 5% ammonia solution is used, which also serves for pH control.
Nach einer Zeitdauer von 10 Stunden wird der Fermontorinhalt zentrifugiert und die zeilfreie Rohenzymlösung steht für weitere Untersuchungen und Aufarbeitungen zur Verfügung.After a period of 10 hours, the contents of the fermontor are centrifuged and the cell-free crude enzyme solution is available for further investigations and workup.
Die extrazelluläre Volumenaktivität beträgt 105EE/ml.The extracellular volume activity is 105EU / ml.
Claims (5)
und- in the temperature range of 15-40 0 C
and
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD32482489A DD279267A1 (en) | 1989-01-05 | 1989-01-05 | PROCESS FOR PRODUCING MICROBIAL LIPASE |
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| DD32482489A DD279267A1 (en) | 1989-01-05 | 1989-01-05 | PROCESS FOR PRODUCING MICROBIAL LIPASE |
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|---|---|
| DD279267A1 true DD279267A1 (en) | 1990-05-30 |
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ID=5606483
Family Applications (1)
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| DD32482489A DD279267A1 (en) | 1989-01-05 | 1989-01-05 | PROCESS FOR PRODUCING MICROBIAL LIPASE |
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| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD279267A1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996038389A1 (en) * | 1995-05-29 | 1996-12-05 | Biorem Ag | Use of the yeast yarrowia lipolytica for the industrial biodegradation of oils and fats in sewage and biodegradation process using it |
| WO2006055322A2 (en) | 2004-11-04 | 2006-05-26 | E.I. Dupont De Nemours And Company | High arachidonic acid producing strains of yarrowia lipolytica |
| EP2392665A2 (en) | 2003-05-07 | 2011-12-07 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts |
-
1989
- 1989-01-05 DD DD32482489A patent/DD279267A1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO1996038389A1 (en) * | 1995-05-29 | 1996-12-05 | Biorem Ag | Use of the yeast yarrowia lipolytica for the industrial biodegradation of oils and fats in sewage and biodegradation process using it |
| EP2392665A2 (en) | 2003-05-07 | 2011-12-07 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts |
| EP2392664A2 (en) | 2003-05-07 | 2011-12-07 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts |
| EP2402448A2 (en) | 2003-05-07 | 2012-01-04 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts |
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| EP2458000A1 (en) | 2004-11-04 | 2012-05-30 | E. I. du Pont de Nemours and Company | High arachidonic acid producing strains of yarrowia lipolytica |
| EP2649887A2 (en) | 2004-11-04 | 2013-10-16 | E. I. du Pont de Nemours and Company | High eicosapentaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica |
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