DD159569A1

DD159569A1 - Test agent and method for the determination of glycosylated proteins

Info

Publication number: DD159569A1
Application number: DD23066881A
Authority: DD
Inventors: Manfred Kuehn; Peter Mohr
Original assignee: Manfred Kuehn; Peter Mohr
Priority date: 1981-06-05
Filing date: 1981-06-05
Publication date: 1983-03-16

Abstract

Es wird ein Verfahren beschrieben, nach dem es möglichen ist, glykosylierte Proteine in einfacher Weise zu bestimmen. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß Membranen oder Filmschichten mit darin immobilisierten zuckerbindenden Proteinen (Lektinen) verwendet werden. Farbige glykosylierte Proteine werden nach diesem Verfahren sofort sichtbar, farblose Proteine werden vor der Reaktion mit z.B. Fluoreszenzfarbstoffen behandelt. Angewendet werden kann das Verfahren in der Medizin und in der Analytik.A method is described according to which it is possible to determine glycosylated proteins in a simple manner. This method is characterized in that membranes or film layers having sugar-binding proteins (lectins) immobilized therein are used. Colored glycosylated proteins become immediately visible by this method, colorless proteins are allowed to react with e.g. Treated with fluorescent dyes. The method can be used in medicine and analytics.

Description

Dr. Kphn Prof. Dr* MohrDr. Kphn Prof. Dr * Mohr

"Testmittel und Verfahren zur Bestimmung glykosylierter Proteine""Test Agents and Methods for the Determination of Glycosylated Proteins"

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung glykosy-Üerter Proteine mit Hilfe von Proteinmembranen, die mit den glykosylierten Proteinen in.Wechselwirkung treten. Anwendungsgebiete für diese Erfindung sind Medizin und Analytik.The invention relates to a method for the determination of glycosylated proteins with the aid of protein membranes which interact with the glycosylated proteins. Areas of application for this invention are medicine and analytics.

Üharakt.erist^ LösungenÜharakt.erist ^ Solutions

Für die qualitative und quantitative Bestimmung von glykosylierten Proteinen stehen eine ganze Reihe von physiko~ch.em.ischen, chemischen, biochemischen und immunologischen Methoden zur Verfügung (s. A. Gottschalk in "Glycoproteins", Elsevier Publ. Compc Amsterdam, New York, London, 1972, Part A). Diese Methoden erfordern aber neben einem umfangreichen apparativen Aufwand auch komplizierte präparative Aufarbeitungs- und Gewinnungsschritte der glykosylierten Proteine₅ einschließlich chromatographischer Methoden, wodurch der Nachweis der glykosylierten Proteine sehr erschwert wird. Mr eine ganze Reihe von glykosylierten Proteinen, vor allem von solchen mit medizinischem Interesse, besteht aber die Notwendigkeit ihrör schnellen Bestimmung auch im Eotitinebetrieb» In den letzten Jahren ist verschiedentlich versucht worden, immobilisierte Enzyme zur Bestimmung von Substratkonzentrationen in Membranen zu verwenden. Diese Systeme zeichnen sich durch ihre Schnelligkeit der Lieferung·analytischer Daten aus. Ihre Nachteile bestehen jedoch darin, daß zum Erkennen der Bnzymaktivität und Bestimmen der Substratkonzentration Farbstoffkomponenten in den Membranen mit immobilisiert wer-For the qualitative and quantitative determination of glycosylated proteins, a whole series of physical, chemical, biochemical and immunological methods are available (see A. Gottschalk in "Glycoproteins", Elsevier Publ. Compc Amsterdam, New York, London, 1972, Part A). However, in addition to extensive equipment, these methods also require complicated preparative work-up and recovery steps of the glycosylated proteins _5, including chromatographic methods, which makes the detection of the glycosylated proteins very difficult. A whole range of glycosylated proteins, especially those of medical interest, are also needed for their rapid determination in eotitin mode. "In recent years, various attempts have been made to use immobilized enzymes to determine substrate concentrations in membranes. These systems are characterized by their rapid delivery of analytical data. Their disadvantages, however, are that dye components are immobilized in the membranes in order to detect enzyme activity and to determine the substrate concentration.

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den müssen. Dadurch werden die Nachweis sy st eine sehr kompliziert, schwierig herstellbar und teuer in der Gewinnung. Darüber hinaus besitzen die entstehenden Farbstoffkomponenten und die daraus entstehenden Farben, die als Maß für die Enzymaktivitäten und Substratkonzentratlonen herangezogen werden, oft keine ausreichende Stabilität. Pur die Bestimmung bzw. den Nachweis von glykosylierten Proteinen fehlen dagegen geeignete Schnellmethoden, um das Vorliegen dieser modifizierten Proteine auch unter Routinebedingungen nachzuweisen.have to. This makes the detection sy st a very complicated, difficult to manufacture and expensive in the extraction. In addition, the resulting dye components and the resulting colors, which are used as a measure of the enzyme activities and Substratkonzentratlonen often do not have sufficient stability. Purely the determination or the detection of glycosylated proteins, however, lack appropriate rapid methods to detect the presence of these modified proteins even under routine conditions.

Ziel der Erfindung:Object of the invention:

Ziel der Erfindung ist es₅ eine Methode zum Nachweis von glykosylierten Proteinen unter Verwendung von Membranen zu entwickeln, die keine zum Nachweis der glykosylierten Proteine notwendigen Färbstoffkomponenten enthalten und die eine schnelle Bestimmung glykosylierter Proteine im Routinebetrieb erlaubt.The aim of the invention is ₅ to develop a method for the detection of glycosylated proteins using membranes containing no need to demonstrate the glycosylated proteins Färbstoffkomponenten and the rapid determination of glycosylated proteins allowed in routine operation.

Darlegung des Wesens der Erfindung; He d Principle of E rfindung;

Die erfindungsgemäße Methode ist dadurch gekennzeichnet, daß zuckerbindende Proteine, im allgemeinen als Lektine oder lektinahnliche Proteine bezeichnet, in einer Membran immobilisiert werden und diese Membran mit einer Lösung eines Proteingemisches, das das glykosylierte Protein zusammen mit nicht glykosylierten Proteinen enthält, in Kontakt gebracht · wird. Nach einer Einwirkzeit der zu bestimmenden Proteinlösung auf diese Membran wird die überschüssige Proteinlösung mit proteinfreien Lösungen von der-Membran abgespült und das gebundene glykosylierte Protein nachgewiesen. Im Falle farbiger glykosylierter Proteine ist der Nachweis sofort visuell möglich. Nicht gefärbte glykosylierte Proteine müssen dagegen vor ihrer Einwirkung auf die Membran markiert werden, indem z. B. das glykosylierte Protein oder das dieses modifizierte Protein enthaltende Proteingemisch mit einem Fluorescenzfarbstoff markiert wird. Nach seiner Bindung anThe method according to the invention is characterized in that sugar-binding proteins, generally referred to as lectins or lectin-like proteins, are immobilized in a membrane and this membrane is contacted with a solution of a protein mixture containing the glycosylated protein together with non-glycosylated proteins , After a reaction time of the protein solution to be determined on this membrane, the excess protein solution is rinsed with protein-free solutions of the membrane and detected the bound glycosylated protein. In the case of colored glycosylated proteins, the detection is immediately visually possible. However, unlabelled glycosylated proteins must be labeled prior to their action on the membrane, e.g. For example, the glycosylated protein or protein mixture containing this modified protein is labeled with a fluorescent dye. After his attachment

die Membran kann das glykosylierte Protein dann fluorescenz™ spektroskopisch nachgewiesen werden. Aber auch andere bekannte Methoden der Markierung von.Proteinen aus der Immunologie und Histoehemie können in diesem Falle herangezogen werden. Zur Herstellung der die zuckerbindenden Proteine.enthaltenden Membranen können sowohl bioorganische als auch organische Ausgangsmate.rialien verwendet werden. Die zuckerbindenden Proteine können sowohl durch kovalente Bindung als auch nichtkovalenten Einschluß in Membranen aus den bioorganischen oder organischen Ausgangsmaterialien'immobilisiert werden. Zum nichtkovalenten Einschluß der zuckerbindenden Proteine können z. B. Membranen mit Kollagen, Gelatine, Polyvinylalkohol oder Akrylamid hergestellt werden, aber auch Membranen durch Vernetzung von Albumin oder aus Alginatgelen. Besonders vorteilhaft sind diese Ausgangsmaterialien,,wenn sie auf einer transparenten, durchsichtigen Unterlage.· in eine BÄembranform gebracht werden. Solche Membranen müssen eine ausreichende Quellbarkeit mit Wasser besitzen, damit eine Wechselwirkung zwischen den immobilisierten zuckerbindenden Proteinen und den glykosylierten Proteinen eintreten kann. Zu ihrer Stabilisierung können sie auch mit bifunktionellen Reagenzien vernetzt werden. Membranen zur kovalenten Bindung der zuckerbindenden Proteine können durch Funktionalisierung und Aktivierung von Membranen aus den genannten bioorganischen Materialien gewonnen werden, aber auch aus synthetischen, organischen, ungesättigten Verbindungen, An die Membranen aus den organischen' Monomsren wird die Voraussetzung geknüpft, daß sie modifiziert werden können,- damit sie die zur Immobilisierung der zuckerbindenden Proteine notwendigen funktionell en Gruppen besitzen. Diese Membranen zur kovalenten Bindung der zuckerbindenden Proteine können sowohl mikroporös als auch.makroporös sein.the membrane can then be detected by fluorescence spectroscopy of the glycosylated protein. However, other known methods of labeling proteins from immunology and histohememia can be used in this case. For the preparation of the membranes containing the sugar-binding proteins, both bioorganic and organic starting materials can be used. The sugar binding proteins can be immobilized by both covalent bonding and noncovalent entrapment in membranes from the bioorganic or organic starting materials. For non-covalent inclusion of the sugar-binding proteins z. As membranes are made with collagen, gelatin, polyvinyl alcohol or acrylamide, but also membranes by crosslinking of albumin or alginate gels. These starting materials are particularly advantageous if they are placed on a transparent, transparent base in a membrane form. Such membranes must have sufficient swellability with water to allow interaction between the immobilized sugar binding proteins and the glycosylated proteins. To stabilize them, they can also be crosslinked with bifunctional reagents. Membranes for covalently binding the sugar-binding proteins can be obtained by functionalizing and activating membranes from said bio-organic materials, but also from synthetic, organic, unsaturated compounds. The membranes from the organic monomers are conditioned to be modified - so that they possess the functional groups necessary for the immobilization of the sugar-binding proteins. These membranes for covalently binding the sugar binding proteins can be both microporous and macroporous.

Die Methode- zum Nachweis glykosylierter Proteine mit in Membranen immobilisierten zuckerbindenden Proteinen erfordert bei Verwendung farbiger Glykoproteine keine zusätzlichenThe method for detecting glycosylated proteins with sugar-binding proteins immobilized in membranes requires no additional use when using colored glycoproteins

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Indikatorsysteme, da in diesen Fällen ein sofortiger visueller Nachweis möglich ist» Die Nachweisreaktionen werden bei Ö - 40⁰C, vorzugsweise bei Raumtemperaturen' und bei pH-Werten von 4-9, vorzugsweise um den Neutralpunkt, durchgeführt. Die erfindungsgemäße Nachweismethode für glykosylierte Proteine zeichnet sich durch eine höhe Stabilität und die leichte Zugänglichkeit der dazu benötigten Membranen aus. Sie ist leicht und schnell ohne großen apparativen Aufwand durchführbar. Damit eignet sich das Verfahren gut zur Routinebestimmung von glykosylierten Proteinen und, wie,die nachfolgend aufgeführten, aber das Verfahren nicht einschränkenden Beispiele zeigen, besonders zur schnellen Bestimmung abnormaler - weil glykosylierter - Hämoglobine.Indicator systems, since in these cases immediate visual detection is possible »The detection reactions are carried out at temperatures of 40 ^° C., preferably at room temperatures, and at pH values of 4-9, preferably around the neutral point. The detection method according to the invention for glycosylated proteins is characterized by a high stability and easy accessibility of the membranes required for this purpose. It is easily and quickly feasible without great expenditure on equipment. Thus, the method is well suited for the routine determination of glycosylated proteins and, as shown below, but not limiting the method, particularly for the rapid determination of abnormal - because glycosylated - hemoglobins.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Exemplary embodiments Example 1

3 ml einer wäßrigen 3 %igen Gelatinelösung werden bei Raumtemperatur unter Rühren mit 3 mg eines -sich an Fucose bindenden Lektins aus Ulex europaeus (Stechginster), versetzt. Diese Gelatinelösung wird auf einer Glasplatte oder .einem Film verstrichen und so lange bei Umgebungstemperatur aufbewahrt, bis sich eine Membran gebildet hat. Auf diese Membran wird eine Probe einer Lösung eines Gemisches von 5 mg unmodifiziertem Hämoglobin und einem Milligramm mitc£-L-Fucose modifiziertem Hämoglobin aufgetragen. Nach 2 Minuten wird die Membran mit destilliertem V/asser gewaschen, worauf eine rote Färbung an der Auftropfstelle das gebundene fucosylierte Hämoglobin anzeigt. . '- 3 ml of an aqueous 3% gelatin solution are added at room temperature while stirring with 3 mg of a lectin-binding lectin from Ulex europaeus (gorse). This gelatin solution is spread on a glass plate or film and stored at ambient temperature until a membrane has formed. To this membrane is applied a sample of a solution of a mixture of 5 mg unmodified hemoglobin and one milligram of C-L-fucose modified hemoglobin. After 2 minutes, the membrane is washed with distilled water, whereupon a red coloration at the point of application indicates the bound fucosylated hemoglobin. , '-

Example 2

Nach der gleichen im Beispiel 1 beschriebenen Art wird Glukoseoxidase in einem Gemisch von 2 mg Glukoseoxidase und 5.mg Katalase mit einer Membran nachgewiesen, die aus 5 ml einer 2 %igen Lösung von Polyvinylalkohol in destilliertem Wasser' und 3 mg Concanavalin A gebildet wurde,.Die gebundeneGlucose oxidase is detected in a mixture of 2 mg glucose oxidase and 5.mg catalase with a membrane formed from 5 ml of a 2% solution of polyvinyl alcohol in distilled water and 3 mg concanavalin A by the same method as described in Example 1, .The bound

Glukoseoxidase wird durch eine, gelbe Anfärbung an der Auf-.tropfstelle des gelösten Proteingemisches angezeigt.Glucose oxidase is indicated by yellow staining at the top of the dissolved protein mixture.

Beispiel 3 '· ·Example 3 '· ·

An einer nach Beispiel 2-hergestellten Membran wird mit Fluoresceinisothiocyanat markiertec^-Amylase nachgewiesen, indem die Membran nach der Inkubation mit der modifizierten mit ultraviolettem Licht bestrahlt wird.On a membrane prepared according to Example 2, fluorescein isothiocyanate labeled C ^ amylase is detected by irradiating the membrane with ultraviolet light after incubation with the modified one.

Hach bekannten und beschriebenen Verfahren wird eine Membran aus Akrylamid und dem Sojabohnenlektin hergestellt. Auf diese Membran wird ein Tropfen eines gelösten Gemisches von 5 mg unmodifiziertem Hämoglobin und 1 mg eines Hämoglobins getropft, an das Galaktose kovalent gebunden wurde. Nach 2 Minuten wird die Membran· mit destilliertem Wasser gewaschen, an der Auftropfstelle zeigt eine Rotfärbung das galaktosylierte Hämoglobin^an.Hach known and described method is made of a membrane of acrylamide and soybean lectin. Onto this membrane is dropped one drop of a dissolved mixture of 5 mg unmodified hemoglobin and 1 mg hemoglobin to which galactose has been covalently bound. After 2 minutes, the membrane is washed with distilled water, at the dropping point a red coloration indicates the galactosylated hemoglobin.

O,'5 g nitriertes Polystyrol vrerden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird nach dem Filtrieren auf einer ebenen Flache gleichmäßig verteilt, danach wird das Lösungsmittel verdampft. Die litrogruppen der Membran ..werden mit Zinn (II)-chlorid in konzentrierter Salzsäure reduziert und die entstandenen Aminogruppen in Salzsäure (0,5 Mol/l) mit Natriumnitrit diazotiert. Diese modifizierte Membran wird bei O - 4⁰C 24 Stunden mit einer Lösung von 5 mg Concanavalin A in 5 ml Boratpuffer (0,1 Mol/l) vom pH-Wert 9 behandelt. Nach der Immobilisierung des Concanavalin A wird die Membran mit Phosphatpuffer (0,1 Mol/l) pH 7 gewaschen. Mt Hilfe dieser Membran kann glc^kosyliertes Hämoglobin in Gegenwart von unmodifiziertem Hämoglobin nachgewiesen werden.O, '5 g of nitrated polystyrene are dissolved in 5 ml of dimethylformamide. This solution is evenly distributed after filtering on a flat surface, then the solvent is evaporated. The lithro groups of the membrane are reduced with stannous chloride in concentrated hydrochloric acid and the resulting amino groups are diazotised in hydrochloric acid (0.5 mol / l) with sodium nitrite. This modified membrane is maintained at O - treated 4 ⁰ C for 24 hours with a solution of 5 mg Concanavalin A in 5 ml of borate buffer (0.1 mol / l) of pH. 9 After immobilization of concanavalin A, the membrane is washed with phosphate buffer (0.1 mol / l) pH 7. By using this membrane, glucosylated hemoglobin can be detected in the presence of unmodified hemoglobin.

Beispiel 6 . · Example 6 . ·

Aus Hydroxyäthylmethacrylat und Äthylendimethacrylat wird 'durch Kopolymerisation zwischen zwei Glasplatten eine Membran hergestellt. Diese Membran wird im Boratpuffer (pH 10, 0,1 m/l) mit Bromcyan aktiviert. Concanavalin A wird bei pH im Boratpuffer (0,1 m/l) kovalent an die Membran gebunden. Die Kupplungsdauer beträgt 20 Stunden. Danach wird die Membran mit kaltem destilliertem Y/asser und Phosphat puff er (0,1 Mol/l) pH 7 gewaschen. Mit einer solchen Membran läßt sich ein Gemisch von 1 mg Peroxidase und 5 mg Myoglobin in 5 ml Phosphatpuffer (0,1 Mol/l) pH 7 die Peroxidase durch eine braune Anfärbung der Auftropfsteile nach dem Abwaschen der überschüssigen Proteinlösung nachweisen.From hydroxyethyl methacrylate and Äthylendimethacrylat 'is produced by copolymerization between two glass plates, a membrane. This membrane is activated in the borate buffer (pH 10, 0.1 m / l) with cyanogen bromide. Concanavalin A is covalently bound to the membrane at pH in the borate buffer (0.1 m / l). The coupling time is 20 hours. The membrane is then washed with cold distilled water / phosphate and phosphate buffer (0.1 mol / l) pH 7. With such a membrane, a mixture of 1 mg of peroxidase and 5 mg of myoglobin in 5 ml of phosphate buffer (0.1 mol / l) pH 7, the peroxidase by a brown staining of the dripping after washing off the excess protein solution can be detected.

Beispiel 7 Example 7

2 ml einer Lösung von 0,5 g Natriumalginät und 5 mg Ooncana- valin A in 10 ml destilliertem Wasser wird auf einer ebenen transparenten Fläche gleichmäßig verteilt. Dieses Material wird dann in eine Lösung von Calcium- oder Bariumchlorid in destilliertem Y/asser (0,1 Mol/l)' eingetaucht, .worauf sich eine Membran bildet. Diese.Membran ist zum Nachweis von glukosyliertem Hämoglobin in einem Gemisch mit Myoglobin und normalem unmodifiziertem Hämoglobin geeignet.2 ml of a solution of 0.5 g of sodium alginate and 5 mg of oconcanvaline A in 10 ml of distilled water are evenly distributed on a flat transparent surface. This material is then immersed in a solution of calcium or barium chloride in distilled water (0.1 mol / l), before which a membrane is formed. This membrane is useful for detecting glucosylated hemoglobin in a mixture with myoglobin and normal unmodified hemoglobin.

Claims

Erfindungsansprach

la method for the determination and detection of glycated proteins, characterized in that sugar-containing membrane-containing proteins or film layers with a solution of a giykosylierten protein or glycosylated protein containing this solution of a protein mixture, optionally after staining z. B. with a Pluoreszenzfarbstoff, at 0 - 4O ⁰ C, preferably at ambient temperature, and at pH values of 4 - S, but preferably around the neutral point, are treated, the excess protein solution is removed with a protein-free aqueous solution and that of his Color or color mark recognizable protein is then qualitatively or quantitatively determined.

2. test agent for carrying out the method according to item 1, characterized in that the sugar-binding proteins' immobilized by covalent bond. Or non-covalent inclusion in membranes of bioorganisehen and organic-synthetic starting materials v / earth.

3. test agent according to item 2, characterized in that the membranes are optionally crosslinked with their bifunctional reagents for their stabilization.

4. test agent according to item 2 and 3, characterized in that as sugar-binding proteins lectins or proteins with.

-lithin-like properties are used.